VYUŽITÍ PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE V HEMATOONKOLOGII

Univerzita Palackého v Olomouci Přírodovědecká fakulta

VYUŽITÍ PRŮTOKOVÉ CYTOMETRIE V HEMATOONKOLOGII Rigorózní práce Autor: Mgr. Martin Novák

Pracoviště: Hemato-onkologická klinika FN Olomouc Olomouc 2010

Bibliografická identifikace Jméno a příjmení autora : Mgr. Martin Novák Název rigorózní práce: Využití průtokové cytometrie v hematoonkologii Pracoviště: Hemato-onkologická klinika FN Olomouc Rok rigorózní zkoušky: 2010 Abstrakt: Průtoková cytometrie je bioanalytickou metodou schopnou poskytnout komplexní kvalitativní i kvantitativní informace o charakteru vyšetřovaných buněk. Využívá fluorescenčně značených monoklonálních protilátek k detekci komplementárních antigenů na povrchu i uvnitř analyzovaných buněk. Umožňuje včasnou diagnostiku hematologických malignit a stavů s nimi sdružených a poskytuje validní data pro klinické rozhodovací procesy. Průtoková cytometrie se v hematoonkologii stala jednou z klíčových diagnostických metod poskytujících informace o biologických charakteristikách nádorových buněk, které jsou zásadní pro cílenou a efektivní léčbu. Klíčová slova : hematoonkologie, průtoková cytometrie, imunofenotypizace, lymfoproliferace, akutní leukémie

Rigorózní práce byla zpracována v rámci řešení výzkumného grantu MSM 6198959205 Souhlasím s půjčováním rigorózní práce v rámci knihovních služeb

2

Bibliographical identification Autor’s first name and surname: Mgr. Martin Novák Title of doctoral thesis: Utilization of flow-cytometry in hemato-oncology. Department: Department of Hemato-oncology, Teaching Hospital, Olomouc Supervisor: Doc. MUDr. Edgar Faber, CSc. The year of presentation: 2010 Abstract: Flow-cytometry is bioanalytical metod able to give komplex qualitative and quantitative information about character of investigated cells. It employs fluoresceinconjugated antibodies to detect complementary antigens on the surfaře and inside of analyzed cells. It enables timely diagnosis of hemato-oncological malignancies and associated states and gives valid data for clinical decisions. Flow-cytometry has become one of the key methods of diagnosis giving information on biological characteristics of tumor cells, what is fundamental for targeted and effective treatment. Key words: hemato-oncology, flow-cytometry, imunophenotyping, lymphoproliferation, acute leukemia

Doctoral thesis was supported by the grant of the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (MSM 6198959205). I agrese the thesis paper to be lent within the library service.

3

Prohlašuji, že jsem rigorózní práci zpracoval pod vedením doc. MUDr. Edgara Fabera, CSc., uvedl všechny použité literární a odborné zdroje a dodržoval zásady vědecké etiky. V Olomouci dne 17. září 2010

4

Poděkování: Za vedení práce děkuji docentu MUDr. Edgaru Faberovi, CSc. Profesoru MUDr. Karlu Indrákovi, DrSc. děkuji za umožnění vědecké práce na Hemato-onkologické klinice FN Olomouc. Děkuji také RNDr. Zuzaně Pikalové, od níž jsem získal základy průtokové cytometrie Vděk dále zaslouží MUDr. Vít Procházka a MUDr. Peter Rohoň Ph.D. za cenné připomínky ke klinickým aspektům hematologických malignit. Teoretický fyzik RNDr. Jiří Kvita Ph.D. laskavě zrevidoval kapitolu o fluorescenci a interakcích záření a analytu. Fraňo Sabbath Travěnec pomohl formulovat kapitoly pojednávající o technických detailech cytometrie.

5

Obsah 1. Úvod…………………………………………………………………………………8 2. Principy průtokové cytometrie…………………………………………………….9 2.1. Obecný úvod.………………………………………………..…………………..9 2.2. Konstrukční celky……………………………………………………………...10 2.2.1 Systém fluidiky…………………………………………………………..11 2.2.2. Optické cesty…..…………………………………………………….…..12 2.2.3. Detekce a zpracování signálu………………………………………….14 2.2.4. Sortování………………………………………………………………....15 2.3. Fluorescence…………………………………………………………………..16 2.4. Interakce záření a analytu……………………………………………………19 2.5. Protilátky…………………………………………………………………..……21 3. Využití……………………………………………………………………………….22 3.1. Biomedicínské vědy………………………………………………………...…22 3.2. Aplikace v hematoonkologii………………………………………….……….24 3.3. Imunofenotypizace…………………………………………………..………24 4. Hematologické malignity…………………………………………………………27 4.1. Základní rozdělení………………………………………………….…………27 4.2. Akutní leukémie……………………………………………………………….27 4.2.1 Akutní myeloidní leukémie………………………………………….…..28 4.2.2. Akutní lymfoblastická leukémie…………………………………..……31 4.3. Lymfoproliferativní onemocnění………………………………………….…..33 4.3.1. B-lymfoproliferace……………………………………………….………33 4.3.1.1. Difúzní velkobuněčný lymfom…………………………….……35 4.3.1.2. Chronická lymfatická leukémie………………………………..35 4.3.1.3. Lymfom plášťových buněk………………………………..……36 4.3.1.4. Folikulární lymfom………………………………………………36 4.3.1.5. Burkittův lymfom……………………………………...…………36 4.3.1.6. Leukémie vlasatých buněk………………………….…………37 4.3.2. Lymfoproliferace z T-buněk……………………………………..……….38 4.3.2.1. Periferní T-buněčný lymfom nespecifikovaný……..…………39 4.3.2.2. Anaplastický velkobuněčný T-lymfom………………..……….40

6

4.3.3. Postižení plazmatických buněk………………………………………….40 4.3.3.1 Mnohotný myelom……………………………………………….40 4.4. Chronické myeloproliferace…………………………………………….….…41 5. Stanovení minimální reziduální nemoci………………………………….….…..42 6. Detekce hematopoetických kmenových buněk…………………………….…..44 7. Diskuse……………………………………………………………………….…….45 8. Závěr………………………………………………………………………………..46 9. Literatura……………………………………………………………………………54 10. Seznam zkratek…………………………………………………………………..58 11. Autorovy publikace k tématu……………………………………………………60 12. Autorovy přednášky k tématu………………………..…………………………62

7

1. Úvod Průtoková cytometrie je bioanalytická metoda spojující v sobě principy fluorescenční mikroskopie a hematologického analyzátoru. Využívá fluorescenčně značených monoklonálních protilátek k detekci komplementárních antigenů na povrchu i uvnitř analyzovaných buněk. Vzhledem k vysoké senzitivitě, rychlosti laboratorní odezvy, široké paletě analytických možností a v neposlední řadě i díky relativně nízké ceně za vyšetření se stala zlatým standardem v mnoha oborech biomedicínských analýz. Pravděpodobně nejširšího využití dosáhla v diagnostice hematologických malignit a stavů s nimi spojených, kde právě rychlá a přesná diagnostika dává klinickému lékaři stěžejní indicie ke správnému stanovení diagnózy a následně mu umožňuje sledovat průběh léčby takřka v reálném čase. Konkrétně se jedná především o identifikaci jednotlivých typů lymfomů, leukémií a dalších malignit včetně stanovení minimální reziduální nemoci po léčbě, o sledování imunologických charakteristik pacientů během léčby i rekonstituce imunity po transplantaci a v neposlední řadě o kontrolu kvality štěpů hematopoetických kmenových buněk u auto- i allotransplantací. Indikace k vyšetření průtokovou byly definovány pracovní skupinou expertů v roce 2006 v Bethesdě1 (Bethesda International Consensus Conference on Flow Cytometric Immunophenotyping of Hematolymphoid Neoplasia). Dle tohoto konsenzu jsou indikací k cytometrickému vyšetření kvantitativní poruchy v krevním obraze typu leukocytózy nejasné etiologie, cytopenie, lymfocytózy, monocytózy, eosinofilie, přítomnost atypických buněk případně

blastů v periferní krvi či kostní dřeni a při

klinikem vyjádřeném podezření na hematologickou chorobu: suspektní uzlinový syndrom, hepatomegalie, splenomegalie, monoklonální gamapatie, defekt funkce trombocytů,

trombocytóza

s přítomností

abnormálních

trombocytů,

klinický

imunodeficit, atd. Další vývoj biomedicínsky orientované průtokové cytomerie se ubírá směrem vícebarevných stanovení (projekt Euroflow 2), kvantitativních analýz a především ke standardizaci jednotlivých metod, která by umožnila mezilaboratorní kontrolu kvality.

8

2. Principy průtokové cytometrie 2.1. Obecný úvod Průtoková cytometrie je založena na měření a následné analýze fyzikálních charakteristik vyšetřovaných částic unášených nosnou kapalinou a interagujících se světelným zářením. Základními analyzovanými veličinami jsou velikost částic, denzita jejich vnitřního obsahu (granularita) a intenzita fluorescence. Vzorek je vnášen do kapiláry s laminárně proudící nosnou kapalinou, kde hydrodynamická isofokusace zajišťuje stabilní pozici a rychlost analyzovaných částic. K vlastnímu procesu stanovení, tedy interakci buněk s laserovým paprskem, dochází v měřící komoře. Po průchodu komorou jsou buňkám přiřazeny naměřené hodnoty a tato data jsou uložena k dalšímu zpracování ve formě datového souboru, tzv. listmode. Ten umožňuje naměřená data opakovaně

analyzovat a kombinovat za použití

booleovských operátorů (tzv. gatování). Analyzovaný materiál musí být připraven ve formě jednobuněčné suspenze, respektive suspenze částic menších než průměr trysky v měřící komoře. V medicínských aplikacích je tedy průtoková cytometrie nejčastěji využívána pro stanovení z periferní krve, kostní dřeně, likvorů, punktátů a dalších tekutých materiálů.

9

2.2. Konstrukční celky Průtokový cytometr sestává ze tří, respektive čtyř technických celků: 1. Optického systému, skládajícího se ze zdroje záření (různé typy laserů, UV lampa) k měření v rovině procházejícího světla (FSC) a odraženého světla (SSC) a k aktivaci fluorochromu a optické cesty zrcadel a filtrů vedoucích a rozdělujících signál na příslušné detektory. 2. Systému fluidiky, který definovaným a uživatelsky ovlivnitelným způsobem transportuje analyzované částice do měřící komory. 3. Výpočetního systému umožňujícího změny nastavení parametrů cytometru, převádějícího světelný signál na elektrický, analog-digitálního převodníku a modulu zobrazení, analýzy a archivace naměřených hodnot. 4. Sortovacího modulu, který bývá součástí specializovaných cytometrů. Sortování umožňuje oddělit z analyzovaného vzorku zájmovou populaci. Nejčastěji používanou metodou je vychylování elektricky nabitých kapek obsahujících cílové buňky v elektrostatickém poli.

10

2.2.1. Systém fluidiky Jak již název napovídá, průtoková cytometrie je založena na transportu analyzovaných částic kapalinou. Tato tzv. nosná kapalina (kterou bývá modifikovaný fyziologický roztok) unáší analyzované částice definovanou a ovlivnitelnou rychlostí a směřuje je do ideální pozice vzhledem k senzorům 3. Pozice jednotlivých částic je kontrolována hydrodynamickou isofokusací nosné kapaliny. Její proud je usměrněn do konické části měřící komory, čímž dojde ke zrychlení průtoku vlivem zmenšení plochy kapiláry. Do takto upravené, laminárně proudící nosné kapaliny je vstřikován vzorek tak, aby nedošlo k jeho smísení s nosnou kapalinou, ale k vytvoření koaxiálního proudu. Průměr kapiláry je dále zúžen tak, aby měřícím bodem procházela v okamžiku analýzy právě jedna buňka. Rychlost průtoku nosné kapaliny a tedy i počet analyzovaných buněk za časovou jednotku lze uživatelsky upravovat, se zvyšující se rychlostí analýzy však roste i míra nepřesnosti měření (počet dublet v měřícím bodě atd.).

Obr. 2) Schéma systému fluidiky

Podle Stovel, R. (2001) 3

11

2.2.2. Optické cesty Principem vyšetření metodou průtokové cytometrie je záznam interakce analyzovaných částic s excitovaným fluorochromem a elektromagnetického vlnění emitovaného laserem či UV lampou. Optický systém cytometru sestává z excitační optiky a sběrných optických cest. Excitační optiku tvoří zdroj záření a optické členy, které transportují a zaostřují paprsek do bodu měření. Zdroj musí být schopen stabilní emise fotonů, které jsou následně usměrněny do paprsku o průměru většinou 0,5–2mm a použity k osvětlení vzorku 4. Naprostá většina komerčně dostupných cytometrů je vybavena laserem či lasery, nejčastěji vzduchem chlazeným argonovým laserem o výkonu 10-25W vyzařujícím na 488nm jako základním zdrojem záření. Výhodou tohoto typu je především to, že jeho vlnová délka umožňuje excitaci několika důležitých fluorochromů současně (FITC-fluorescein isothiokyanát, PE-phycoerythrin, PerCP-peridinin chlorophyll protein, atd.). Především v cytometrech pro pokročilé aplikace se využívají i jiné typy laserů včetně jejich kombinací ( Kr, He-Ne, He-Cd, neodym-YAG, polovodičové lasery atd.) pro aktivaci více fluorochromů jinými vlnovými délkami. Zvláštním typem excitačního zdroje je rtuťová oblouková lampa. Sběrnou optiku tvoří sestava čoček, které koncentrují fotony emisního záření a light scatteru a sady zrcadel a filtrů rozdělujících a usměrňujících světlo různých vlnových délek na příslušné detektory. K rozdělení signálu pro jednotlivé detektory se používají filtry dvojího typu: 1) barevná skla, která umožňují průchod jen určitým vlnovým délkám tím, že absorbují nechtěné vlnové délky . 2) interferenční filtry, které dále dělíme na: a) Band pass filtry (BP) umožňující průchod pouze úzkému rozmezí vlnových délek, které odpovídají emisnímu vrcholu konkrétního fluorochromu. b) Long pass filtry (LP) propouštějící záření o vlnové délce delší nebo rovné nastavené hodnotě

12

c) Short pass filtry (SP) propouštějící záření o vlnové délce kratší nebo rovné nastavené hodnotě.

Specifickým typem interferenčního filtru jsou dichroické filtry (tzv. beam splitters), které v závislosti na vlnové délce rozdělují přicházející světlo různých barev do dvou směrů, většinou pod úhlem 90°. Celý optický systém tvoří tzv. optickou lavici. Obr. 3) Schéma optické lavice

Převzato z Shapiro, H.M., (2003) 4

13

2.2.3. Detekce a zpracování signálu Signál vzniklý interakcí analyzovaných částic s fotony generovanými laserem je detekován dvěma způsoby v závislosti na jeho hodnotách. Intenzivnější signál, tedy signál generovaný forward scatterem bývá měřen fotodiodou, kdežto signál nižší intenzity, zde signál side scatteru a fotony emitované fluorochromem, je zpracováván pomocí fotonásobiče. Fotony dopadající na detektor (fotodioda nebo fotonásobič) jsou převedeny na tok elektronů sekundární emise, signál je proporčně zesílen (vynásoben) na měřitelné hodnoty elektrického proudu, který je v následujícím derivátoru převeden na napěťový pulz. Jeho nejvyšší hodnota odpovídá pozici měřené částice ve středu laserového paprsku a tedy nejvyšší hodnotě fluorescence či scatteru, jinak řečeno, amplituda pulzu odpovídá počtu detekovaných fotonů. Zesílení signálu lze provést zvýšením napětí mezi katodou a anodou fotonásobiče, tedy generováním vyššího proudu, nebo navýšením zisku zesilovače, což se v praxi kombinuje. Také je možno využít fotonásobič s vyšším počtem elektrod (dynod). Zesilovač může být nastaven tak, aby jeho zesílení probíhalo lineárně nebo logaritmicky. Lineární způsob je využíván k zesílení hodnot FSC, SSC a fluorescenčního signálu, logaritmický způsob je obvykle potřebný k odlišení slabého signálu od šumu pozadí. V následném kroku je v ADC převodníku (Analog-to-Digital Convertor) přidělena napěťovému pulzu digitální proměnná tak, že pulzu o napětí 0 – 1000 mV je přidělen digitální kanál 0-1000.4 Číslo kanálu je pomocí interface GPIO (General Purpose In/Out) převedeno do počítače, zobrazeno v odpovídající poloze na data plotu a uloženo do paměti. Uložená data mohou být zobrazena různými způsoby v závislosti na metodě analýzy.

14

2.2.4. Sortování Pokročilou nadstavbou specializovaných cytometrů je možnost oddělit ze vzorku cílovou populaci pomocí sortování. Nejpoužívanější technické řešení spočívá v roztříštění proudu nosné kapaliny kmitajícím piezoelektrickým krystalem do uniformních kapek, z nichž každá nese právě jednu buňku.4 Vlastní cytometrická analýza je provedena před tímto krokem a buňkám jsou přiřazeny naměřené hodnoty. Splňuje –li analyzovaná buňka předem nastavené parametry a je tedy vybrána pro sortování, pak je kapka ji obsahující v okamžiku svého formování nabita elektrickým nábojem, dle potřeby pozitivním či negativním, což umožňuje souběžný sorting dvou populací. V průběhu pádu se kapky dostávají mezi dvě vodivé, elektricky nabité desky, kdy efekt elektrostatické deflekce vede k vychýlení nabitých kapek do sběrných nádob. Kapky, které nenesou zájmovou populaci buněk nejsou nabity, deflekce se tedy neprojeví.5 Obr.1) Schema sortovacího modulu

Podle Dean, P. N., Hoffman, R. A. (2007) 5

15

2.3. Fluorescence Fluorescence je kvantově mechanický jev spočívající v uvolnění části excitační energie elektronu ve formě fotonu.6 Elektrony fluorochromu jsou v případě průtokové cytometrie excitovány laserovým zářením specifické vlnové délky, která odpovídá absorbčnímu maximu užitého fluorochromu. Tím dojde k přechodu elektronu na vyšší energetický stav, popřípadě na stav valenční. Část excitační energie je spotřebována na změny rotačně vibračního stavu molekuly, nicméně většina této energie je při návratu elektronu na původní energetickou hladinu vyzářena do okolí ve formě fotonů o nižší energii, tedy větší vlnové délce, než fotony excitující.4 Rozdíl mezi vlnovou délkou excitujícího a emitovaného záření nazýváme Stokesův posun, jehož hodnoty u jednotlivých fluorochromů jsou zásadní při sestavování vícebarevného experimentu.

intenzita

Obr. 4) Stokesův posun

Podle Klessinger, M., Michl, J. (1995) 6

V praxi se používají fluorochromy s absorbčními maximy dosažitelnými excitací komerčně dostupnými lasery, a to buď jako fluorochromy samostatné nebo tandemové, u kterých je využito přenosu energie (FRET- Förster (fluorescence) resonant energy transfer) mezi fluorochromem sloužícím jako donor

16

a fluorochromem akceptorovým. To vede k navýšení hodnoty Stokesova posunu, což umožňuje využít širší paletu fluorescenčních barviv.

Použití více fluorochromů v jednom experimentu (zkumavce) umožňuje detekci několika znaků na jedné buňce současně, což dramaticky zvyšuje výpovědní hodnotu analýzy. Některá klinicky zásadní stanovení (např. sledování MRD) by nebyla bez vícebarevné průtokové cytometrie vůbec možná. Užití více fluorochromů však s sebou přináší zásadní komplikaci, jejíž vyřešení je u mnohobarevných stanovení nezbytné. Jedná se o problematiku kompenzace fluorescenčního přesahu. Jak bylo uvedeno výše, excitované fluorochromy vyzařují v intervalu vlnových délek označovaném jako emisní spektrum. Jádro problému spočívá ve skutečnosti, že emisní spektra jednotlivých fluorochromů se mohou výrazně překrývat, jak je patrno z obr. 5, což v nekompenzovaném experimentu vede k detekci emisního záření jednoho fluorochromu více detektory a tak k závažné chybě měření. Cílem kompenzace je tedy matematická korekce signálu detektorů tak, aby byl emisní přesah korigován.

emise

Obr. 5) Překryv emisních spekter fluorochromů

Podle Shapiro, H.M., (2003) 4

17

Emisní a absorpční spektra některých běžně používaných fluorochromů a parametry nejčastěji užívaných laserů jsou uvedeny v tabulce 1. Tab. 1.) Excitační a emisní spektra některých fluorochromů

Podle Shapiro, H.M., (2003) 4

18

2.4. Interakce záření a analytu Interakce analyzovaných částic se světelným zářením jsou dvojího typu: 1) interakce záření s navázanou značenou protilátkou 2) jevy ohybu, odrazu a absorpce - tzv. light scatter ad1) Při excitaci fotony o energii odpovídající absorbčnímu maximu použitého fluorochromu dojde k přechodu elektronů v horních vrstvách molekuly na vyšší energetické hladiny. Část dodané energie je transformována v rámci nezářivých procesů, tedy při jevech, které nejsou spojeny s emisí fotonů (změny rotačně-vibračního stavu, atd.), zbytek se při přechodu na původní energetický stav uvolní ve formě fluorescence a případně fosforescence.6 V obou případech jde o kvantově mechanické jevy spojené s přechody z vyšších orbitalů na nižší, respektive základní energetický stav. Pro praktickou cytometrii má význam pouze fluorescence. Jevy spojené s výše uvedenými změnami stavů demonstruje Jablonského diagram: Obr.6) Jablonského diagram

Převzato z Klessinger, M., Michl, J., (1995) 6

19

ad 2) Jevy souhrnně označované jako light scatter závisejí na fyzikálních parametrech buňky, především na její velikosti a vnitřní komplexitě, zejména pak na denzitě vnitřního obsahu ( velikost jádra, membránové organely, granulární materiál) Light scatter dále dělíme na dva typy: a) Forward scatter (FCS) označuje měření v rovině procházejícího světla a jeho velikost odpovídá povrchu buňky, popř. jiné analyzované částice. FCS je měřen fotodiodou umístěnou v rovině procházejícího světla. b) Side scatter (SSC) odpovídá měření interference světla s denzními strukturami uvnitř buňky. Jedná se zejména o jevy ohybu a odrazu světelného paprsku, z tohoto důvodu je SSC měřen detektorem umístěném v úhlu 90° od roviny procházejícího světla. Sloučením hodnot FSC a SSC do prostoru definovaného osami x a y , které odpovídají hodnotám FSC a SSC, získáme dvojrozměrné uspořádání analyzovaných částic dle jejich velikosti a denzity vnitřního obsahu. V případě analýzy tělních tekutin se buňky rozdělí do tzv. třípopulačního diferenciálu, ve které je možno rozlišit populace lymfocytů, monocytů a granulocytů od případného debris. Obr. 7) Scattergram FSC x SSC

20

2.5. Protilátky Fluorochromy jsou v naprosté většině konjugovány s monoklonální protilátkou, která zajišťuje specifickou vazbu na cílovou strukturu. Pro diagnostické účely se používají komerčně syntetizované monoklonální protilátky, získávané většinou ze specificky imunizovaných myší. Imunizovaný organizmus syntetizuje paletu polyklonálních protilátek, odpovídající množství aktivovaných lymfocytů, které jsou v následném kroku izolovány ex vivo, imortalizovány fúzí s plazmatickými buňkami a pěstovány v čisté kultuře.6 Tato tzv. hybridomová technologie, umožňuje využít jediný aktivovaný lymfocyt ke komerční produkci imunoglobulinů, identických jak v antigenní determinantě, tak ve všech dalších biologických, fyzikálních a chemických vlastnostech. Vhodné klony jsou poté separovány a použity k produkci monoklonálních protilátek. Tyto protilátky, naplňující představu prof. Ehrlicha o „kouzelné střele“ schopné nalézt cílovou buňku mezi mnoha podobnými, mají přesně definovanou třídu i podtřídu, specifické zaměření proti cílovému epitopu a definovanou specificitu, čímž umožňují standardizaci metody včetně vnější i vnitřní kontroly kvality a tím přispívají k možnosti mezilaboratorní kontroly výsledků.

V rutinní praxi se využívají dvě imunofluorescenční metody: Přímá imunofluorescence, monoklonální protilátka značená fluorochromem se zde váže přímo na cílový antigen. Nepřímá imunofluorescence, kdy se na cílový antigen váže protilátka neznačená a teprve na ni nasedají „protilátky proti protilátce“.

21

3. Využití 3.1. Biomedicínské vědy Průtoková cytometrie je analytickou metodou využívanou v mnoha odvětvích biologických a medicínských věd. Mnoho diagnostických postupů, zejména v hematoonkologii a nádorové biologii, imunologii a molekulární patologii, je v současné době postaveno na multiparametrických analýzách buněčných populací prováděných pomocí průtokové cytometrie. V hematoonkologii se jedná především o imunofenotypizaci, tedy o vyšetření kvalitativní i kvantitativní přítomnosti specifických markerů jak na povrchu buněk, tak v cytoplazmě či v jádře a dále o stanovení minimální reziduální nemoci, respektive sledování zastoupení nádorových buněk v různých tělesných kompartmentech nemocného.7 Imunologické analýzy se zaměřují na sledování aktivity lymfocytárních subpopulací, např. na problematiku

ADCC, tedy cytotoxických reakcí závislých na protilátkách,

na aktivaci jednotlivých T-lymfocytárních populací (CD4+, CD8+, NK buňky), imunitní reakce ( enzymy oxidativního vzplanutí, atd.) a další stanovení. 8 Molekulární

biologie,

molekulární

patologie

a

nádorová

biologie

využívá

cytometrických metod například pro analýzu buněčného cyklu a buněčné kinetiky stanovením nukleových kyselin, pro vyšetření a případně sortování chromozomů, velký význam má cytometrie pro výzkum mechanizmů apoptózy (mitochondriální membránové potenciály, změny permeability membrán, aktivace apoptotických drah, degradace DNA, atd.),4 klinicky významné je sledování vzniku lékových rezistencí u nádorových buněk , zvláště tzv. MDR – multidrug resistance . Ve vědecko-výzkumných aplikacích se setkáváme např. s analýzou exprese a lokalizace proteinů v proteomických experimentech, s měřením fosforylace a jiných forem značení, s využitím fluorescenčních proteinů a podobně. Rozsáhlé je použití cytometrických metod u rostlin a mikroorganizmů, v oblasti buněčné a molekulární biologie rostlin bylo dosaženo značného pokroku v oblasti sledování velikosti a struktury genomu, ploidie, analýzách plastidů, atd. Výsledky nacházejí praktické uplatnění např. ve šlechtitelství a fytopatologii.9

22

Cytometrické metody detekce a kvantifikace pronikají i do bakteriologie a virologie , ať jako součást biotechnologických procedur, tak v medicínském, případně vojenskobezpečnostním uplatnění. Kruh se uzavírá analýzami fytoplanktonu, jehož fotosyntetické pigmenty stály u počátku používání fluorochromů v cytometrii.

Tab. 2) Některá využití průtokové cytometrie Typ analýzy

příklad

Povrchové antigeny

Imunofenotypizace v CD systému, receptory pro interleukiny, HLA-typizace, detekce MRD

Intracelulární antigeny

cy Ig, cy CD3, cy CD22, gen BCR/ABL, FoxP3,

DNA

Stupeň ploidie, kinetika buněčného cyklu, sortování chromozomů

Apoptóza

Rhodamin 123, TRAIL, kaspázy, atd.

Protilátky

Stanovení autoprotilátek proti erytrocytů, trombocytům, granulocytům, crossmatching, atd

Funkční studie

Funkce neutrofilů, fagocytóza, cytotoxické reakce, markery zánětuCD64, cytokiny

Buněčné prostředí

Intracelulární Ca 2+, Intracelulární pH, membránový potenciál

Průnik léčiv do buňky

Adriamycin, anthracyklin, methotrexát

Testování alergií

Test degranulace bazofilů

Buněčná signalizace

Fosforylace a defosforylace proteinů

Ostatní

Fetomaternální transfuze, cirkadiánní periodicita, viabilita spermatu

Nelékařská biologie

autofluorescence chlorofylu, detekce mikroorganizmů, palynologické analýzy, plankton, rostlinné chromozomy, atd.

Podle Shapiro, H.M., (2003) 4, Keren, D.F., Hanson,C.A., Hurtubise, P.E., (1994) 7, Dolezel, J. (2007)9

23

3.2. Aplikace v hematoonkologii V klinické praxi je hematoonkologie spolu s imunologií nejvýznamnějším uživatelem průtokové cytometrie, mnohé skórovací tabulky diagnostických postupů jsou pak přímo postaveny na výsledcích cytometrických analýz. Metoda umožňuje provádět stanovení z mnoha kompartmentů, nejlepších výsledků však dosahuje u analýz tekutých tkání, tj. krve, kostní dřeně, mozkomíšního moku, ascitu a podobně. Analýze lze podrobit i tuhé tkáně jako solidní tumory, lymfatické uzliny, slezina atd., avšak tyto je nutno nejprve dezintegrovat na buněčnou suspenzi, čímž se pochopitelně ztrácí část informace, zejména o charakteru postižení (nodulární versus difúzní) Cytometrická analýza v hematookologii poskytuje odpovědi na mnoho klinicky významných otázek, umožňuje mimo jiné 8, 7: -

odlišit maligní lymfoproliferace od benigních

-

klasifikovat onemocnění dle exprese povrchových či cytoplazmatických markerů

-

hodnotit specifické markery mající vztah k prognóze nemocného

-

stanovovat minimální reziduální nemoc a monitorovat léčebnou odpověď

-

sledovat kvalitu štěpu krvetvorných buněk

3.2.1. Imunofenotypizace Imunofenotypizace je postavena na detekci specifických povrchových i cytoplazmatických markerů. V případě vyšetřování hematologických malignit se zaměřuje na analýzu leukocytárních antigenů, pro které používáme souhrnné označení HLDA (Human Leucocyte Differentiation Antigens), respektive nově HCDM (Human Cell Differentiation Molecules). 10 Lidské membránové antigeny zařazené v systému HCDM jsou definovány pomocí monoklonálních protilátek a pro přehlednost jsou zařazeny do klasifikačního systému, kde je jednotlivým antigenům přiděleno označení CD (Cluster Designation) a pořadové číslo.10

24

Proti klinicky významným CD markerům jsou dostupné komerčně vyráběné monoklonální protilátky, často konjugované s několika různými fluorochromy pro sestavení vícebarevného experimentu. Mimo CD nomenklaturu však existuje mnoho dalších diagnosticky významných epitopů, proti kterým jsou k dispozici klinicky důležité protilátky (myeloperoxidáza, terminální deoxynukleotid transferáza, Ki-67, atd.).8 Obr. 8) Schéma myeloidní diferenciace s typickými markery

Převzato z Swerdlow, S.H., (2008)11

25

Principem imunofenotypizační diagnostiky je kvantitativní i kvalitativní analýza zastoupení diagnosticky významných markerů. Srovnáním výsledku měření se skórovacími tabulkami lze přiřadit zjištěný imunofenotyp konkrétní nozologické jednotce. Známe-li z primodiagnózy imumofenotyp onemocnění daného nemocného, můžeme v průběhu léčby sledovat kvantitativní i kvalitativní změny v zastoupení nádorové populace a informovat klinika o reakci pacienta na léčbu. Důležitou prognostickou roli zde hraje i vyšetření minimální reziduální nemoci, která odpovídá počtu neoplastických buněk perzistujících po léčbě v organizmu.12 Na našem pracovišti se nejčastěji setkáváme s diagnostikou hematologických malignit. Jedná se o klonální proliferativní onemocnění vycházející z hematopoetických kmenových buněk a lymfoidních tkání v různém stupni maturace. V současné chvíli je všeobecně přijímanou hypotézou, že všechna tato onemocnění mají svůj původ v genetických abnormalitách, byť ne všechny jsou k dnešnímu datu objasněny.13 Rozmanitosti původu odpovídá i široká paleta genetických, imunofenotypových, cytologických a dalších charakteristik, které se dále odrážejí v nejednotnosti projevů nemocí, v různém stupni malignity, reakci na léčbu, prognóze, atd. Společným znakem a biologickým podkladem těchto onemocnění je vznik aberantních proteinů, jejichž regulační vlastnosti jsou vlivem odlišné funkce (např. chimerické proteiny u leukemií) či hypo- nebo hyperexprese (lymfomy ) změněny natolik, že se postižená buňka vymaní z regulačních mechanizmů a dojde k nastartování procesu onkogeneze. 14 Komplexní diagnostika hematologických malignit zahrnuje širokou paletu vyšetření, které dohromady skládají informace vedoucí k identifikaci a klasifikaci onemocnění a umožňuje tak zahájení cílené léčby. Cílem vyšetření je zjistit maximum validních informací o expresi diagnosticky relevantních markerů. Jedná se buď o kombinaci pozitivity a negativity běžně se vyskytujících znaků, které tvoří tzv. pattern typický pro konkrétní onemocnění (např. CD19+/CD20+/CD22-/CD23+/CD5+ u B-CLL), nebo o detekci nádorově specifických markerů (např. DBA-44 u leukémie vlasatých buněk).

26

4. Hematologické malignity 4.1. Základní rozdělení Hematologické malignity dělíme dle diferenciačního stádia primární nádorové buňky do tří základních skupin:13

-

leukemie, které vznikají maligní transformací hematopoetické kmenové buňky

-

lymfomy, mající svůj původ v klonální expanzi periferního lymfocytu v různém stupni maturace.

-

nádory z plazmatických buněk, tedy konečného vývojového stádia diferenciace B-lymfocytů.

4.2. Akutní leukémie Charakterizujeme je jako rychle progredující onemocnění vzniklá maligní transformaci hematopoetické kmenové buňky. Typickou biologickou podstatou nádorové transformace u leukémií jsou chromozomální změny ve smyslu translokace části genetického materiálu, což má za následek vznik chimérických proteinů s významně odlišnou biologickou funkcí. Klasickým příkladem je vznik chimérického proteinu s funkcí promotoru, mající za následek konstitutivní aktivaci tyrozinových kináz, což v konečném důsledku vede k uvolnění buňky z kontrolních mechanizmů regulace buněčného cyklu a k nekontrolované proliferaci. 14 Podle postižené krevní řady dělíme akutní leukémie na: 8 -

akutní myeloblastické leukémie

-

akutní lymfoblastické leukémie

-

bifenotypické leukémie a leukémie s atypickou expresí.

27

4.2.1 Akutní myeloidní leukémie Akutní myeloidní leukémie je způsobena klonální proliferací nádorově transformovaných myeloidních, popř. erytroidních či megakaryocytárních blastů s útlumem jejich vyzrávání a apoptózy a jejich následným hromaděním v kostní dřeni a krvetvorných orgánech s útlumem normální krvetvorby .14 Jedná se o nejčastější AL dospělých s incidencí 3,5-5/100 000 obyvatel/1 rok. 13 Dle imunologické (EGIL) klasifikace se dělí na 6 typů.11 Pro imunofenotypizaci je klíčové vyšetření myeloidních markerů, typicky CD33, CD13, CD65, CD14, CD15, CD11b, HLA-DR, CD117, CD34, MPO, TdT, Ki-67 a dalších znaků v případě suspektní erytroleukemie či megakaryocytární leukémie (CD 71, CD42b, CD36, CD41, CD61, glykoforin A, atd.) 8 Tab. 3) Typické imunofenotypy u subtypů AML Subtyp

Imunofenotyp

Myelomonocytární

MPO, CD33, CD13,Cd65,CD117

Erytroidní nezralé

Nelze imunologicky klasifikovat

Erytroidní zralé

Glykoforin A

Megakaryocytární

CD41 a/nebo CD61 (cytoplazmatický nebo membránový)

Nediferencovaná

MPO, CD13,CD33,CD65,CD117 (přítomny nejméně 2 antigeny)

AML

Negativní cyCD3, cyCD22, CD79a, negativní cytochemie

TdT+ AML

Pozitivní TdT plus markery AML, nesplňuje podmínky pro dg. bifenotypické leukémie

AML s lymfoidními

Markery AML plus jeden nebo více lymfoidních markerů, ale

markery

nesplňuje podmínky pro bifenotypickou leukémii

Podle Rothke, G., Schmitz,G., Adolf, D., et al. (1996) 15

Zvláštní formou jsou leukémie bifenotypické, které mohou exprimovat rozličné kombinace markerů ze všech leukocytárních řad. Pro jejich diagnostiku byl vytvořen skórovací systém, leukémie je klasifikována jako bifenotypická při skóre minimálně 2 bodů v myeloidní řadě a 1 bodu v lymfoidní řadě. 15

28

Tab. 4) Skórovací systém pro diagnostiku bifenotypických leukémií Body

B-řada

T-řada

Myeloidní řada

2

CD79a, cy IgM,

CD3 cy/m ,TCR α/β,

MPO

cyCD22

TCR γ/δ

1

CD19,CD10,CD20

CD2,CD5,CD8,CD10

CD117,CD13,CD33,CD65

0,5

TdT, CD24

TdT, CD7, CD1a

CD14, CD15,CD64

Podle Rothke, G., Schmitz,G., Adolf, D., et al. (1996) 15

Podstatou nemoci jsou změněné biologické funkce chimérických proteinů produkovaných fúzními geny. Typické genetické změny u AML: Flt3/ITD Interní tandemová duplikace genu pro receptor III. typu tyrozinových kináz způsobuje konstitutivní aktivaci této kinázy v důsledku abnormálně zvýšené syntézy FLT3 receptoru. Důsledkem je nekontrolovaný růst a dlouhodobé přežívaní nádorových buněk 14. Přestavby MLL genu. Gen MLL (Mixed Lineage Leukemia) fúzuje s mnoha partnerskými geny, nejčastěji s AF4, AF6, AF9. Chimérické proteiny vzniklé těmito fúzemi působí jako aberantní chromatin-remodelující faktory působící na expresi hox genů během hemopoezy.14 Zásahy do regulace hox genů mají pro organizmus závažné důsledky, leukémie s MLL přestavbou jsou spojovány se špatnou prognózou. 13

29

AML1/ETO Protein AML1 (neboli Core Binding Factor Alfa) je transkripčním aktivátorem kritickým pro regulaci exprese dalších genů. Chimérický protein vzniklý fúzí s ETO způsobuje odlišnou funkci jaderného represorového komplexu, což vede k chybné regulaci AML1 dependentních promotorů.14

PM/RARα Je fúzním genem typickým pro akutní promyelocytární leukémii. Nukleární regulační faktor PML fúzuje s alfa receptorem pro kyselinu retinovou za vzniku chimérického proteinu s efektem velmi silného represorového komplexu, důsledkem pro postiženou buňku je snížená citlivost receptoru na fyziologické koncentrace kyseliny retinové.14

30

4.2.2. Akutní lymfoblastická leukémie Jedná se o maligní onemocnění způsobená transformací hematopoetické kmenové buňky diferencované do úrovně lymfoblastu v různém stupni vyzrávání.13 Incidence ALL má výrazně bimodální charakter s prvním vrcholem kolem 3. – 5. roku, kdy tvoří 25% všech dětských nádorů a druhým vrcholem kolem 65. roku věku.14 Dle typu neoplastických lymfocytů rozlišujeme: 8 1) prekurzorovou B-buněčnou ALL 2) prekurzorovou T-buněčnou ALL Imunotypizace má zcela zásadní význam pro klasifikaci akutních leukémií, které dělíme dle stupně maturace neoplastických lymfoblastů. Tab. 5) Diagnostické markery akutních leukémií Antigeny B-řada

CD19 a/nebo CD22 a/nebo CD79a (minimálně dva ze tří znaků)

Pro-B-ALL

Žádné další

Common B-ALL

CD10

Pre-B-ALL

cy IgM

Zralá B-ALL

Membránová nebo cytoplazmatická kappa či lambda

T-řada

Membránová nebo cytoplazmatická CD3

Pro-T-ALL

CD7

Pre-T-ALL

CD2 a/nebo CD5 a/nebo CD8

Kortikální T-ALL

CD1a

Zralá T-ALL

Membránová CD3

α/β + T-ALL

TCR α/β

γ/δ + T-ALL

TCR γ/δ

ALL s expresí

1 nebo 2 myeloidní antigeny

myeloidních antigenů Podle Rothke, G., Schmitz,G., Adolf, D., et al. (1996) 15

31

Molekulární podstatou akutních leukémií jsou nejčastěji následující genetické změny: BCR/ABL Je fúzní gen vzniklý translokací genu BCR (Breakpoint Cluster Region) neznámé fyziologické funkce ve zlomovém bodě m-BCR na chromozom 9 do oblasti genu ABL (Abelson Murine Leukemia). Protein ABL je proteinem z rodiny nereceptorových tyrozinových kináz řídících buněčný cyklus.14 Chimérický protein BCR/ABL se projevuje konstitutivní aktivitou tyrozinkinázy, což vede k hyperaktivaci mnoha signálních drah a v konečném důsledku k leukemogenezi.

MLL/AF4 Je výše popsaný chimérický protein chybně regulující aktivitu hox genů.14

PBX1/E2A Transkripční faktor E2A aktivuje protein PBX1, který za fyziologického stavu není v pre B-lymfocytech transkribován. 14 Jeho aktivace spouští aberantní aktivaci hox genů a potažmo tak leukemogenezi.

32

4.3.

Lymfoproliferativní onemocnění

Jsou maligní onemocnění odvozená od periferního B- nebo T-lymfocytu, vzácně z NK buněk, v různém stupni diferenciace. Maligní lymfoproliferace původem z B-lymfocytů tvoří 80% všech lymfomů, zbytek tvoří onemocnění odvozená od T-lymfocytů a NK buněk. 13 Jedná se o velké množství nozologických jednotek, jejichž hranice nejsou vždy zcela jasně vyjádřeny, mnohá onemocnění transformují a mění tak své biologické i klinické charakteristiky. 4.3.1. B-lymfoproliferace Maligní B-buněčné lymfoproliferace jsou odvozeny od B-lymfocytů v různých stádiích diferenciace od prekurzorových neoplázií až k nádorově změněným paměťovým buňkám. Významnou roli v onkogenezi B-buněčných neoplázií pravděpodobně hraje proces somatické hypermutace, tvořící fyziologickou součást aktivace B-lymfocytů, kdy uvnitř germinálních centrech aktivovaných B-lymfocytů dochází k opakovaným zlomům DNA a kumulaci somatických bodových mutací v těžkých a lehkých řetězcích imunoglobulinů. 14 Obr. 9) Schéma vztahů mezi diferenciací B-lymfocytu a B-buněčnými neopláziemi

Převzato z Swerdlow, S.H., (2008)11

33

Úloha imunotypizace je v případě klasifikace lymfomů obtížnější než u akutních leukémií, s výjimkou několika typických imunofenotypů (B-CLL, MCL, FL) sice spolu s cytogenetickými a molekulárně genetickými metodami poskytuje důležité informace, diferenciální diagnostika však spočívá v morfologii nádoru a jeho klinických projevech. Tab. 6) Diagnosticky významné markery B-lymfoproliferací

Převzato z Evens, A. M., et al. (2009) 16

Vzhledem k vysoké diverzitě B-lymfoproliferativních onemocnění budou níže uvedeny pouze klinicky nejvýznamnější z nich a probrány jen klíčové molekulární mechanizmy jejich vzniku:

34

4.3.1.1. Difúzní velkobuněčný lymfom Difúzně rostoucí lymfoidní nádor z velkých B-lymfocytů exprimuje poměrně nespecifický imunofenotyp z pan B- markerů (CD19, CD20, CD22, CD79a, většina případů exprimuje povrchové Ig, plazmablastická varianta nese navíc znak CD138).11 Dle recentních výzkumů byl metodou transkripčního profilu DLBCL rozdělen do tří skupin (konsensuálních klastrů) dle molekulární podstaty onemocnění :14 1) konsensuální klastr oxidativně fosforylační (OxPhos), který je charakterizován změněnou expresí regulačních genů pro apoptózu, tvorbu proteazomu, elektronový transport a mitochondriální funkce a dále delecí FAS domény. 2) Konsensuální klastr B-buněčného receptoru / proliferační (BCR), který je identifikovatelný podle změněné exprese regulačních genů buněčného cyklu, genů pro signalizaci B-cell receptoru, reparaci DNA a pro regulaci exprese specifických B-buněčných transkripčních faktorů. 3) Konsensuální klastr hostitelské odpovědi (HR), který je typický imunitně zánětlivou reakcí v těle nemocného s infiltrací nádorového prostředí imunitními buňkami, avšak bez efektivní protinádorové reakce.

4.3.1.2. Chronická leukemie z B-lymfocytů Jedná se o nejčastější hematologickou malignitou dospělých.14 B-CLL je velmi heterogenní onemocnění vycházející z antigenně stimulovaného zralého Blymfocytu. Imunofenotyp je velmi stabilní a dobře odlišitelný ( CD19+, CD20+, CD22-, CD23+, CD5+) 11 přesto se však může měnit, zvláště při transformaci onemocnění do agresivnější formy.13 V takových případech se nejčastěji setkáváme s aberantní expresí znaků CD38, CD22 a FMC-7. V klinické praxi se B-CLL dělí do dvou prognosticky odlišných jednotek dle stupně aktivace B-lymfocytu. Biologickou podstatou je přítomnost nebo nepřítomnost mutace IgVH genu, kdy B-CLL s nemutovanýcm IgVH genem je onemocněním pregerminálního nebo aktivovaného B-lymfocytu, který neprošel změnami v germinálním centru, oproti tomu B-CLL s mutovanou formou IgVH genu vzniká klonální proliferací postgerminálního paměťového B-lymfocytu.14 Z pohledu průtokové cytometrie je důležité, že mutované a nemutované formy IgVH genu

35

lze odlišit stanovením ZAP 70 (zeta asociovaný protein 70), jehož exprese se považuje za konkordantní s mutačním stavem IgVH genu. 17, 26

4.3.1.3. Mantle cell lymfom MCL , neboli lymfom z plášťových buněk, je další lymfoproliferací s typickým imunofenotypem. Je charakterizován expresí CD19+, CD20+,CD22+, CD23-, CD5+. Diagnosticky významná je i silná exprese povrchových Ig, což zvláště vynikne ve srovnání s B-CLL. 11 Biologickou podstatou onemocnění je interchromozomální translokací indukovaná chyba ve spojení V-D-J genu pro IgH, která vede k deregulaci protoonkogenu PRAD1 kódujícího syntézu cyklinu D1.14 Tento cyklin je „kontrolorem“ přechodu buňky z G1 do S fáze a hraje tak klíčovou roli v regulaci buněčného cyklu.

4.3.1.4. Folikulární lymfom FL je onemocnění málo diferencovaných B-lymfocytů, které nesou imunofenotyp CD10/CD19/CD20 a silně exprimovaný některý z povrchových Ig. 11 Postižená lymfatické tkáni je typická shluky nádorových buněk. 13 Biologickou podstatou onemocnění je inhibice apoptózy cestou hyperexprese genu BCL2, který se vlivem interchromozomové translokace t (14;18) (q32;q21) dostává pod kontrolu zesilovače genu pro IgH. 14 Samotná tato změna však nevede k nádorovému růstu, je nutná přítomnost dalších mutací. Vlivem nestability genomu pak dochází ke kumulaci genových postižení a progresi onemocnění. 13

4.3.1.5. Burkittův lymfom Je vysoce agresivní nádor B-lymfocytů nesoucích imunofenotyp CD10/CD19/CD20/CD22, které jsou typické až 100% proliferační frakcí.11 Těžištěm výskytu je východní Afrika, což odpovídá poznatkům o jeho etiopatogenezi. V současné době se předpokládá, že se na vzniku endemického Burkittova lymfou podílí infekce virem Epstein-Barrové v dětství, následovaná chronickou malarickou

36

infekcí. Souběh těchto onemocnění vede ke snížení počtu cytotoxických T-lymfocytů, které za fyziologických podmínek blokují pool EBV postižených B-lymfocytů s aktivovaným onkogenem c-myc.14 Deplece cytotoxických T-lymfocytů má za následek jejich proliferaci a nastartování růstu nádoru. Biologickou podstatou onemocnění je pak translokace t (8;14).11

4.3.1.6. Leukémie vlasatých buněk HCL je onemocnění aktivovaných paměťových B-lymfocytů, typických vláskovitými až cárovitými výběžky cytoplazmy. 13 Nádorové buňky charakteristicky větších rozměrů nesou kromě obvyklých B-lymfocytárních markerů specifický imunofenotyp CD25, CD103, CD11c, DBA-44. 8 Biologická podstata onemocnění zůstává nejasná. Zcela raritně jsou popisovány případy vlasatobuněčné leukémie odvozené od T-lymfocytů. 11

37

4.3.2. Lymfoproliferace z T-buněk Vycházejí z maturujících T-lymfocytů, převážně CD4+ nebo CD8+.13 Imunofenotypově jsou charakteristické expresí pan T-markerů CD2,CD3,CD5,CD7, dle původního určení jsou pak CD4 nebo CD8 pozitivní. Vzácně se setkáváme i s dvojitě pozitivními či dvojitě negativními případy (CD4+/CD8+ nebo CD4-/CD8-).11 Dále lze v rámci diagnostiky identifikovat klonalitu T-buněčného receptoru (TCR), jehož přestavba je spolu se strukturálními i numerickými chromozomálními aberacemi jednou z mnoha možných změn vyvolávajících onemocnění. 14 Obr. 10) Schéma vztahů mezi diferenciací T-lymfocytu a T-buněčnými neopláziemi

Převzato z Swerdlow, S.H., (2008)11

38

Tab. 7) Diagnosticky významné markery T-lymfoproliferací

Převzato z Evens, A. M., et al (2009)16

T-lymfocytární lymfomy jsou relativně vzácná onemocnění tvořící 10-20% lymfoproliferací, nejvyšší incidenci má periferní T-lymfom nespecifikovaný a anaplastický velkobuněčný T-lymfom.13 4.3.2.1. Periferní T-buněčný lymfom nespecifikovaný Zahrnuje heterogenní skupinu T-lymfoproliferací vycházejících ze zralého Tlymfocytu. Jde o nejčastější typ T-lymfoproliferativního onemocnění v Evropě, kde tvoří 60-70% všech T-lymfomů a přibližně 5-7% všech non hodgkinských lymfomů. 13 Imunofenotyp bývá značně variabilní, buňky exprimují pan-T markery CD3, CD5, CD7, ztráty exprese CD5 a/nebo CD7 jsou však časté. Převládá exprese CD4 nad CD8, setkáváme se však i s CD4+/CD8+ či CD4-/CD8- variantami.11, 16

39

4.3.2.2. Anaplastický velkobuněčný T-lymfom Zahrnuje dvě podskupiny lišící se přítomností specifické tyrozinové kinázy ALK (anaplastic lymphoma kinase). Onemocnění pravděpodobně vychází z aktivovaných zralých cytoxických T-lymfocytů s funkcí pozměněnou fúzí genu ALK. 13 Imunofenotyp je typický expresí znaku CD30, epiteliálního membránového antigenu (EMA) a T-buněčného intracelulárního antigenu TIA-1. 13,16 Často bývají pozorovány ztráty pan-T buněčných markerů .11

4.3.3. Postižení plazmatických buněk Zahrnují skupinu onemocnění vzniklých klonální proliferací a následnou kumulací změněných plazmatických buněk, typických produkcí imunoglobulinů.17 Z tohoto důvodu se onemocnění s produkcí aberantních imunoglobulinů, tzv. paraproteinu, nazývají monoklonální gamapatie. Řadíme sem jak onemocnění nádorová (mnohotný myelom, plazmocytom, morbus Waldenström), tak imunodeficity (Wiskott-aldrichův syndrom, diGeorgův syndrom) a další postižení.13 Za klinicky nejvýznamnější je z této skupiny považován mnohotný myelom. 4.3.3.1 Mnohotný myelom Monohotný myelom je onemocněním vzniklým klonální proliferací a následnou kumulací plazmocytů v kostní dřeni za vzniku osteolytických ložisek.14 Typickým a diagnosticky zásadním znakem je stanovení monoklonálního imunoglobulinu, tzv. paraproteinu, secernovaného nádorovou populací. 18 Imunofenotyp odpovídá plazmatickým buňkám typickým expresí markerů CD38 a CD138, někdy s aberantní expresí dalších znaků (CD19, CD56, CD27,CD28, atd.), což lze s úspěchem využít pro sledování minimální reziduální nemoci. 19 Příčina onemocnění není doposud známa, předpokládají se dvě cesty patogeneze: 14 1) chyby při V-D-J rekombinaci genu pro IgM, které způsobí translokaci onkogenu před zesilovače transkripce genu IgM 2) vliv hyperdiploidie, nejčastěji trizomie

40

4.4. Chronické myeloproliferace Do této skupiny řadíme myeloproliferativní onemocnění vzniklá klonální proliferací nádorově transformovaného myeloidního prekurzoru. Řadíme se chronickou myeloidní leukémii, pravou polycytémii, esenciální trombocytémii a idiopatickou myelofibrózu. 13 Imunofenotypizace se v diagnostice těchto onemocnění příliš neuplatňuje, zejména pro nepřítomnost specifických markerů či nádorově specifického imunofenotypu, který by mohl být použit k odlišení patologické populace. Cytometrické stanovení fúzního genu BCR/ABL, ač metodologicky zvládnuté, se zatím v klinické praxi neuplatňuje, prakticky je využívána detekce blastického zvratu 20 a vzrůstá role průtokové cytometrie pro detekci imunologicky relevantních buněčných subpopulací ovlivněných léčbou na bázi inhibitorů tyrozinových kináz. Klíčovou roli v diagnostice hrají molekulárně biologické metody, konkrétně detekce fúzního genu BCR/ABL u chronické myeloidní leukémie a bodové mutace V617F tyrozinové kinázy JAK2 u pravé polycytemie, esenciální trombocytemie a idiopatické myelofibrózy.14

41

5. Stanovení minimální reziduální nemoci Jako minimální reziduální nemoc označujeme subklinickou úroveň onemocnění, neidentifikovatelnou běžnými cytologickými metodami, tedy kompletní klinickou remisi.8 Počet neoplastických buněk perzistujících po léčbě v organizmu pacienta je klíčovým faktorem jeho další prognózy, což bylo ověřeno mnoha klinickými studiemi.17 Obr. 11) Délka přežití pacientů s B-CLL v závislosti na dosažení MRD negativity

Převzato z Moreton, P., et al. (2005) 21

Zásadním problémem, se kterým se při stanovení minimální reziduální nemoci setkáváme, je velmi nízké zastoupených nádorových buněk ve vyšetřovaných kompartmentech, což je často komplikováno obtížnou odlišitelností nádorových buněk od fyziologické populace. Řešením je nutnost použití velmi senzitivních a specifických diagnostických metod, v praxi nejčastěji průtokové cytometrie a molekulárně biologických metod, zvláště různých variant PCR. Srovnání cytometrické analýzy a alelově specifické PCR v reálném čase je uvedeno v následující tabulce. Obecně lze říci, že molekulárně biologické metody dosahují vyšší senzitivity než průtoková cytometrie, tento výsledek je však vykoupen jednak delší dobou laboratorní odezvy, vysoce specifickými požadavky na kvalitu preanalytické fáze a v neposlední řadě i vysokou cenou za vyšetření.

42

Tab. 8) Srovnání stanovení MRD pomocí průtokové cytometrie a RQ ASO-PCR

cytometrie

RQ ASO-PCR

použitelnost

nad 95%

85-95%

senzitivita

10 -4

10 –5

rozlišení

0,1 – 0,01%

0,01%

cena

střední

vysoká, follow-up nižší

kvalita materiálu, preanalytická bez specifických fáze

požadavků

čas odezvy

hodiny

zásadní dny až týdny

Z nutnosti identifikovat zřídkavé nádorové buňky mezi převažující fyziologickou populací vyplynula potřeba vícebarevné průtokové cytometrie, která umožnila dosáhnout senzitivity až 10-4 , přesto se v praxi setkáváme s analýzami na hranici technických možností cytometru. Další komplikací bývá nestabilita imunologických profilů leukemických buněk jak v průběhu onemocnění, tak především během léčby. 22 Výběr vhodné kombinace markerů aberantního imunofenotypu sdruženého s leukemií (LAIP - leukemiaassociated aberrant immunophenotype) pak bývá u jednotlivých pacientů odlišný. Selekční tlak vytvářený protinádorovou terapií však může vést k selekci původně zcela minoritních aberantních klonů a následné změně imunologických charakteristik nádoru, což nemusí být při analýze MRD vycházející z imunofenotypu stanoveného při diagnóze zjištěno a může vést k chybné interpretaci výsledku.

43

6. Detekce hematopoetických kmenových buněk. Transplantace HSC je jedním z nejobtížnějších medicínských zákroků, který spočívá v náhradě patologické krvetvorby zdravými progenitorovými buňkami dárce (allogenní transplantace) nebo samotného nemocného (autologní transplantace). Klíčovým se stal objev znaku CD34,23 který je do dnešních dob používán jako univerzální marker hematopoetických progenitorových buněk a jeho stanovení během přípravných předtransplantačných procedur je jedním ze základních vyšetření. Jedná se o silně glykosylovaný monomerní 111–115 kD receptorový protein exprimovaný na povrchu kmenových buněk, který prodělává receptorem zprostředkovanou endocytózu a reguluje adhezi, diferenciaci a proliferaci hematopoetických kmenových buněk a jiných progenitorů. 24 Klinicky používaná metodika stanovení CD34+ buněk pro účely transplantace hematopoetických kmenových buněk vychází z doporučení ISHAGE 25 a spočívá v použití protilátky CD45 k diskriminaci non-leukocytárních buněk, izotypové kontroly IgG1 k nastavení cut-off a CD34 k vlastní detekci hematopoetických kmenových buněk. Dle recentních výzkumů in vitro je však schopnost regenerovat krvetvorbu ve všech řadách vyhrazena pouze subpopulaci CD34 pozitivních progenitorů, a to konkretně těm, které navíc exprimují marker BB9.26 Tato CD34+/BB9+ populace je cílem zájmu mnoha pracovišť včetně našeho, neboť zjištění, že marker BB9 skutečně lépe definuje hematopoetické kmenové buňky, by pravděpodobně vedlo ke změně paradigmatu jejich detekce a kvantifikace.

44

7. Diskuse Klinická hematologie je oborem postaveným z velké části na výsledcích sofistikovaných biomedicínských analýz. Data získaná z molekulárně biologických, cytogenetických, cytometrických a dalších vyšetření umožňují včasnou diagnostiku hematologických malignit a stavů s nimi sdružených, prognostickou stratifikaci nemocných a s tím související individualizovaný přístup k pacientovi, sledování zbytkové nemoci po prodělané léčbě, přípravu a vhodné načasování transplantace hematopoetických krevních buněk a poskytují tak validní data pro klinické rozhodovací procesy. Průtoková cytometrie hraje mezi moderními vyšetřovacími metodami významnou roli, zvláště pro svou rychlost, senzitivitu a vysokou diagnostickou hodnotu. Aplikovaný výzkum v oblasti laserových technologií a především praktické využití hybridomových buněk k produkci monoklonálních protilátek (Nobelova cena 1984 - Milstein a Köhler) umožnily rozšířit možnosti cytometrických analýz a mnohé vyšetřovací postupy vytvořené na jejich bázi se staly zlatým diagnostickým standardem. Velkou výhodou je možnost provádět analýzy na úrovni jednotlivých buněk prakticky ze všech kompartmentů za potřeby relativně malého množstvím biologického materiálu, což šetří pacienta a v neposlední řadě i příznivá ekonomika metody. Průtoková cytometrie se v hematoonkologii stala jednou z klíčových diagnostických metod poskytujících informace o biologických charakteristikách nádorových buněk, které jsou zásadní pro cílenou a efektivní léčbu. Ve vědecko-výzkumných aplikacích se podílí na rozkrývání problematiky onkogeneze, lékové rezistence nádorů, problematiky kmenových buněk a v dalších odvětvích nádorové biologie s cílem rozšiřovat obzory vědomostí o nádorových chorobách a přiblížit se tak jejich efektivní léčbě.

45

8. Závěr V laboratoři průtokové cytometrie Hemato-onkologické kliniky LF/FN Olomouc se autor věnuje především diagnostice hematologických malignit a stavů s nimi spojených. Mimo to se podílí na vědecko-výzkumném programu kliniky, který spočívá především v aplikovaném výzkumu v oblasti nádorů krvetvorných a lymfoidních tkání. Níže jsou uvedena abstrakta nejdůležitějších publikovaných prací, na nichž se autor podílel: PROCHÁZKA V., NOVÁK M., PIKALOVÁ Z., PAPAJÍK T., INDRÁK K., Rituximab enthances cellular mediated cytotoxicity in patients with B-cell lymphoma: in vivo study of NK/T-cells aktivity – Haematologica, 2007, 92(1),107 PROCHÁZKA V., PAPAJÍK T., KUBOVÁ Z., NOVÁK M., PIKALOVÁ Z., ROŽMANOVÁ Š., JAROŠOVÁ M., INDRÁK K., Význam polymorfismu buněčné protinádorové imunity u pacientů s B-nehodgkinským lymfomem léčeným Rituximabem. – Transfuze a Hematologie dnes, 2009,15:224-228 NOVÁK M., PROCHÁZKA V., PIKALOVÁ Z., Sledování aktivace cytotoxických Tlymfocytů po podání Rituximabu u pacientů s B-NHL metodou vícebarevné průtokové cytometrie - In: XXI. olomoucké hematologické dny s mezinárodní účastí : Sborník abstrakt, Olomouc 2007 Rituximab je chimerická monoklonální protilátka sestávající z lidského těžkého řetězce IgG1, z lidské konstantní části lehkého řetězce kappa a variabilní části lehkého řetězce kappa myšího původu (Adam 2003). Rozeznává znak CD20, který je typickým pan B-lymfocytárním markerem exprimovaným od pre B-lymfocytu po paměťové B-lymfocyty. Této specifické exprese bylo využito k terapii CD20 pozitivních lymfoproliferací, což vedlo ke změně léčebného paradigmatu pro tento typ hematologických malignit. Receptor CD20 je optimálním místem zásahu, a to hned z několika příčin: 1)jeho výskyt je omezen prakticky výhradně na B-lymfocyty 2) po vazbě protilátky nedochází k internalizaci receptoru 3) neuvolňuje se v solubilní formě.

46

Po vazbě Rituximabu dochází k aktivaci cytotoxické reakce závislé na protilátkách (ADCC) a na komplementu (CDC), přímé indukci apoptózy a inhibici proliferace Blymfocytů. Uvedený komplex reakcí vede k zničení označené buňky . Výzkumy in vitro a ex vivo (Weng et al., JCO 2003) dokumentují, že efekt terapeutického působení spočívá především v aktivaci cytotoxických mechanizmů nemocného (ADCC), a to konkrétně cestou aktivace NK buněk, která vede k degranulaci efektorových T-lymfocytů a k sekreci cytotoxických vezikul. Průvodním jevem sekrece vezikul je inkorporace původně intracelulárního proteinu LAMP-1 (Penack et al., Leukemia 2005) do buněčné membrány, což jej činí snadno detekovatelným pomocí průtokové cytometrie. Náš výzkum probíhal u 44 pacientů s primodiagnostikovaným CD20+ lymfomem, kteří byli léčeni R-chemoterapií. Vzorky periferní krve byly odebírány ve 4. cyklu chemoterapie, před podáním a do 1 hodiny po podání Rituximabu. Kontrolní kohorta byla tvořena zdravými dárci krve. Materiál byl vyšetřován na přístroji FACSCalibur za použití monoklonálních protilátek CD3-FITC/CD(16+56+)-PE, CD4-FITC/CD8-PE, CD16-FITC/CD56-PE/ CD3-EDC a CD107a - PE-Cy5 a získané výsledky byly analyzovány v programu CellQuest Pro. Po podání Rituximabu byly zjištěny statisticky významné změny v T/NK populacích. Byl pozorován vzestup CD16+ a CD16+/ CD56+ buněk (CD16+ 12,8± 9,1 vs. 20,8± 14,4 , P = 0,007; CD16+/ CD56+ 14,9 ± 7,4 vs. 23,1 ± 13 , P = 0,03 ), zastoupení CD8+ lymfocytů se nezměnilo, počet CD4+ poklesl (14,5 ± 2,2 vs. 12,1 ±1,8 , P = 0,01) Exprese LAMP-1 (míra degranulace cytotoxických T-lymfocytů) se zvýšila více než dvakrát (CD107a+ 3,07 ± 1,9 vs. 6,37 ± 3,8 , P = 0,001). Výsledky ukazují, že podávání Rituximabu má přímý vliv na ADCC, zejména na degranulaci cytotoxických T- lymfocytů, spojenou s povrchovou expresí LAMP-1. Míra aktivace ADCC u jednotlivých nemocných je variabilní, což odpovídá i rozdílné reakci na léčbu. Klíčovým faktorem bude pravděpodobně heterogenita NK buněk daná Fcγ III polymorfismem a z něj vyplývající rozdílná aktivita ADCC.

47

NOVÁK M., JURÁŇOVÁ J., PROCHÁZKA V., PIKALOVÁ Z., INDRÁK K., Zastoupení subpopulace BB9+ v populaci CD34+ buněk u pacientů stimulovaných filgrastimem ke sběru periferních kmenových buněk. – Transfuze a Hematologie dnes, 2009,15(1):69 Autologní transplantace hematopoetických krevních buněk umožňuje podání vysoce dávkované chemoterapie s následnou restitucí krvetvorby a je jedinou kurativní léčebnou modalitou u mnoha hematologických malignit. Hematopoetické krevní buňky schopné obnovy krvetvorby jsou v rutinní praxi identifikovány pomocí markeru CD34. Recentní práce však ukazují , že schopnost diferenciace do všech krevních řad je omezena pouze na podskupinu CD34+ buněk, a to konkrétně na buňky exprimující spolu s CD34 i receptor pro ACE, označovaný jako BB9. Pouze tuto subpopulaci lze proto označit jako hematopoetické kmenové buňky sensu stricto. Toto zjištění by mohlo mít vážný dopad jak na laboratorní stanovení HSC, tak na klinickou praxi transplantací kmenových buněk. Cílem naší práce bylo metodou vícebarevné průtokové cytometrie určit procentuální zastoupení CD34+/ BB9+ populace u nemocných v přípravě k autologní transplantaci periferních hematopoetických krevních buněk. Bylo provedeno celkem 35 vyšetření u 17 nemocných ( 6x mnohotný myelom, 5x difúzní velkobuněčný lymfom, 2x anaplastický velkobuněčný lymfom, 2x Hogdkinův lymfom, 1x Sézaryho syndrom, 1x periferní T-Nehodgkinův lymfom). Vzorky periferní krve byly vyšetřeny metodou lyse-wash na průtokovém cytometru BD FACSCalibur za použití protilátek anti-CD45 PerCP, anti CD34 APC,anti BB9 PE a izotypové kontroly IgG1 PE. Jako gate byla zvolena populace CD34+ a bylo napočítáno vždy minimálně 1000 CD34+ buněk. Analýza byla provedena v programu Cell Quest Pro. Medián procentuálního zastoupení periferních hematopoetických krevních buněk sensu stricto, tedy CD34+ / BB9+, byl 39,44%. Zbývajících 60,56% buněk neslo imunofenotyp CD34+ / BB9-. Je tedy zřejmé, že CD34+ / BB9+ tvoří pouze subpopulaci všech CD34+ buněk, vyplavených po primingu do periferního oběhu nemocných. Je pravděpodobné, že zastoupení BB9+ subpopulace bude rozdílné u jednotlivých diagnóz a zřejmě i u různých metod primingu. Problematice hematopoetických kmenových buněk a jejich využití při transplantacích se autor dále věnuje v doktorském studiu.

48

Lužná P, Kylarová D, Novák M, Lichnovský V., Hematopoietic Stem Cell Separation for Experimental Purposes – Metodic Limitations, Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2009, 153(2):121-124 Protoonkogen CD117 (C-kit) je cytokinový receptor exprimovaný na povrchu hematopoetických kmenových buněk , který se podílí na signalizační kaskádě regulující buněčnou proliferaci, diferenciaci a dalších buněčných funkcích zásadního významu. Jeho hyperexprese, popř. jiné postižení mutací pak může nastartovat proces karcinogeneze. Měření exprese markeru CD117 je proto součástí vyšetřovacího panelu pro cytometrickou analýzu leukemických buněk. CD117 pozitivní buňky jsou dále důležitým modelem pro výzkum, například v oblasti proteinů regulujících apoptózu. Cílem práce bylo ověřit možnosti imunomagnetické separace CD117+ buněk z lidské a myší kostní dřeně a stanovení exprese proteinů rodiny BCl-2 ve vzorcích lidské kostní dřeně. Experiment byl proveden na 120 vzorcích kostní dřeně získaných od pacientů s nově diagnostikovanou chronickou myeloidní leukémií (biopsie kostní dřeně byla provedena jako součást rutinních diagnostických postupů a byla schválena etickou komisí) a zdravých myší kmene C57/BL6. Separace byla provedena na magnetickém separačním systému StemCell Technologies a výnos byl kontrolován pomocí průtokové cytometrie na přístroji FACSCalibur. Znaky CD117, BCL-2, BAX a CD33 byly značeny metodou nepřímé imunofluorescence. Cytometrická analýza odhalila, že koncentrace cílových buněk po magnetické separaci je nepostačující pro další experimenty. Lidské CD117+ buňky tvořily v separátu pouze 2,6 % , zastoupení myších buněk bylo ještě nižší (1%). Alternativně byl se koncentraci buněk použit cytospin, z důvodu fragility cílových buněk byla i tato metoda neúspěšná. Použitelným se ukázalo být zpracování suspenze mononukleárů, vzhledem k vysokému zastoupení nízce diferencovaných buněk u pacientů s CML byla pozitivita CD117 zjištěna na 70% populace, pozitivita myeloidního markeru CD33 pak na 60%. Vyšetření proteinů rodiny BCL odhalilo 80% expresi antiapoptotického genu BCl-2, oproti tomu antiapoptotický BAX byl exprimován jen velmi slabě (5%). Lze se tedy oprávněně domnívat, že vysoké zastoupení CD117+ buněk vysvětlit leukemickým původem buněk.

49

PIKALOVÁ Z., NOVÁK M., PROCHÁZKA V., Postižení CNS u nemocných s hematologickými malignitami – In: XX. olomoucké hematologické dny s mezinárodní účastí : Sborník abstrakt, Olomouc 2006 Infiltrace nádorových buněk do CNS zásadně mění léčebnou strategii i prognózu pacientů s hematologickými malignitami. Metodou volby při suspektní infiltraci likvoru je vyšetření vícebarevnou průtokovou cytometrií. Díky vysoké citlivosti metody lze potvrdit přítomnost maligního klonu i v počátečním stádiu postižení CNS a rychlá laboratorní odezva pak umožňuje zahájit terapii v nejkratším možném čase. Cílem práce bylo kriticky zhodnotit diagnostický přínos a limity průtokové cytometrie v kontextu ostatních diagnostických metod u neselektovaného souboru pacientů ve vysokém riziku postižení CNS. V období let 2003–2005 bylo vyšetřeno průtokovou cytometrií, cytologicky a biochemicky 166 vzorků likvoru (109 pacientů). Při neurologických projevech bylo indikováno vyšetření CNS zobrazovací metodou (CT, NMR). Vzorky likvoru byly koncentrovány centrifugací, poté inkubovány se spektrem monoklonálních protilátek dle známého imunofenotypu nádoru. Měření probíhalo na flowcytometru Coulter Epics XL. Výsledky jsme klasifikovali do 4 kategorií: jisté pozitivní, suspektní, jisté negativní a reaktivní. Hodnotitelná populace buněk byla zastižena u 29 pacientů z toho: jednoznačné postižení likvoru 13 (14 %) pacientů (AML=3, ALL=3, NHL=7), 6 vzorků bylo hodnoceno jako suspektní a v 10 případech byla zastižena populace polyklonálních reaktivních T-lymfocytů. Průtoková cytometrie je suverénní metodou diagnostikující infiltraci CNS a je považována za zlatý standard detekce nádorových buněk v tomto kompartmentu. Limity metody však nacházíme ve skupině T-lymfoproliferací s variantním fenotypem, high grade B-lymfomů s minimální infiltrací CNS a v případě zastižení reaktivní populace T-lymfocytů u virových infekcí nebo u pacientů po alogenní transplantaci periferních kmenových buněk. Ve sporných případech je výsledek nutno hodnotit v kontextu ostatních metod, doplnit vyšetření virologické (PCR herpesvirů), parazitologické (PCR toxoplasma) a molekulárně-genetické (chimerismus, vyšetření klonality TCR).

50

NOVÁK M., PIKALOVÁ Z., INDRÁK K., Využití průtokové cytometrie pro detekci buněčných subpopulací v likvoru. – In: 6.Olomoucké neuroimunologické sympozium s mezinárodní účastí: Sborník abstrakt, Olomouc 2010, v tisku Identifikace a kvantifikace buněčných subpopulací v mozkomíšním moku je významnou informací, která může mít přímý dopad na léčebnou strategii a prognózu nemocného. Multiparametrická průtoková cytometrie je bioanalytickou metodou schopnou v relativně krátkém čase poskytnout velmi komplexní kvalitativní i kvantitativní informace o charakteru buněk infiltrujících likvor. Sclerosis multiplex je autoimunitní neurodegenerativní onemocnění, vyznačující se postupnou demyelinizací CNS. Klíčovou roli v patogenezi hraje cytotoxické působení aktivovaných T-lymfocytů, iniciální faktory onemocnění však doposud nejsou jednoznačně prokázány. Náš základní panel pro vyšetření likvoru u pacientů s roztroušenou sklerózou zahrnuje z následující sestavy: BD Multitest CD3/CD16+CD56/CD45/CD19 s mikrosférami BD Trucount pro stanovení absolutního počtu buněk a BD Multitest CD3/CD4/CD45/CD8, doplněných o stanovení hematopoetických kmenových buněk CD34/CD45. V případě potřeby je možno tento panel rozšířit o další stanovení, např. RA/RO T-lymfocytů, T-regulačních lymfocytů, klonalitu Ig či TCR, sledování infiltrace nádorovými buňkami atd. Průtoková cytometrie je suverénní metodou sledování infiltrace CNS v hematoonkologii a díky svému značnému potenciálu se jistě stane zlatým standardem i v dalších oborech, kde rychlá a přesná cytologická diagnostika hraje klíčovou roli.

51

JURÁŇOVÁ J., NOVÁK M., PIKALOVÁ Z., Analysis of precision determination of hematopoietic progenitor cells (HPC) level. Comparative study between hematology analyzer Sysmex XE-2100 and flow-cytometer. - In: Sysmex Outstanding Science Award 2009 JURÁŇOVÁ J., NOVÁK M., PIKALOVÁ Z., Kvantitativní stanovení hematopoetických progenitorových buněk na hematologickém analyzátoru krevních buněk – Transfuze a Hematologie dnes, 2008,14(2): 20 Plně diferencované krevní buňky všech hematologických vývojových linií mají jen omezenou životnost a jsou kontinuálně nahrazovány buňkami proliferujícími z poolu pluripotentních hematopoetických kmenových buněk, které označujeme jako primitivní hematopoetické progenitorové buňky (HPC). Historicky prvním diferenciačním markerem rozpoznaným na lidských hematopoetických buňkách byl marker CD34, na základě jehož přítomnosti jsou HPC dodnes rutinně identifinovány. Kvalitativní a kvantitativní analýza HPC je základním stanovením nutným pro klinickou rozvahu autologních i allogenních transplantací krvetvorných buněk. Za fyziologických podmínek se hematopoetické kmenové buňky nacházejí v červené kostní dřeni a do periferního krevního oběhu jsou vyplavovány jen v minimálním množství. Pro účely sběru HPC cestou separace z periferní krve je proto nutná stimulace pacienta nebo dárce růstovými faktory, které umožňují řízenou proliferaci kmenových buněk a jejich uvolňování z kostní dřeně. Stanovení jejich počtu je využíváno jako marker indikující optimální čas sběru periferních kmenových buněk k jejich následné transplantaci. V současné době je zlatým standardem pro kvantifikaci těchto buněk průtoková cytometrie, v současné době se objevila možnost stanovení počtu HPC pomocí upgrade automatického hematologického analyzátoru Sysmex XE-2100. Průtoková cytometrie pracuje s monoklonálními protilátkami zaměřenými proti definovaným epitopům (zde CD34, CD45, BB9 a izotypová kontrola IgG1 ) a zajišťuje velmi přesné výsledky díky velkým souborům analyzovaných buněk, klade však vysoké nároky na odbornou erudici obsluhy a zkušenost při interpretaci výsledku.

52

Automatický hematologický analyzátor Sysmex XE-2100 využívá analytický software HPC MASTER a příslušnou lyzační reagencii. Progenitorové buňky jsou dle firemních materiálů definovány vyšší rezistentní k lýze a analyzátorem rozpoznávány v IMI kanálu (Immature Myeloid Information), metoda má být způsobilá pro klinické využití. Cílem naší práce bylo porovnání těchto analytických přístupů, vyhodnocení přijatelnosti pro předtransplantační vyšetření pacientů a dárců, stanovení cut-off počtu HPC k určení optimálního času sběru pro získání kvalitního štěpu. Bylo vyšetřeno celkem 168 vzorků, z toho 155 analýz materiálu pro autologní transplantaci a 13 vzorků od zdravých dárců, určených k transplantaci allogenní. Medián absolutního počtu buněk označených analyzátorem Sysmex XE-2100 jako HPC byl 1,52 x nižší než počet CD34+ buněk kvantifikovaných pomocí průtokové cytometrie. Vzhledem k tomu, že výsledky cytometrických analýz naší laboratoře jsou verifikované externími hodnoceními kvality, lze je považovat za správné a odpovídající faktickému zastoupení HPC. Použití automatického hematologického analyzátoru Sysmex XE-2100 pro stanovení HPC nelze ve světle těchto výsledků doporučit, neboť vede k signifikantnímu zkreslení skutečného zastoupení progenitorových buněk a v konečném důsledku by mohlo vést k poškození pacienta z důvodu promeškání vhodné doby sběru HPC.

53

9. Literatura: 1. WOOD, B.L., ARROZ, M., BENNET, D., ET AL., 2006 Bethesda International Consensus recommendations on the immunophenotypic analysis of hematolymphoid neoplasia by flow cytometry. Cytometry Part B Clin Cytometry, 2007; 72B: 14-22

2. http://euroflow.org/ 3. STOVEL, R., (2001) Fluidics. Curr Protocol Cytom 1.2.1-1.2.7..

4. SHAPIRO, H.M., (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley & Sons, Inc.

5. DEAN, P. N., HOFFMAN, R. A. ( 1997) Overview of Flow Cytometry Instrumentation Curr Protocol Cytom 1.1.1.-1.1.8

6. KLESSINGER, M AND MICHL, J., (1995) Excited States and Photo-Chemistry of Organic Molecules, John Wiley & Sons, Inc. 7. KEREN, D.F., HANSON,C.A., HURTUBISE, P.E., (1994) Flow cytometry and clinical diagnosis, ASCP Press, Chicago

8. ECKSCHLAGER, T. A KOL.,(1999) Průtoková cytometrie v klinické praxi; Grada Publishing a.s, Praha 9. DOLEZEL, J., GREILHUBER, J., SUDA, J., (2007) Flow Cytometry with Plant Cells: Analysis of Genes, Chromosomes and Genomes. John Wiley & Sons, Inc. 10. ZOLA H., SWART B., NICHOLSON I., VOSS E., (2007) Leukocyte and stromal cell molecules: the CD markers;, John Wiley & Sons, Inc.

54

11. SWERDLOW S.H., CAMPO E., HARRIS N.L., ET. AL., (2008) WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues; IARC Press, Lyon 12. ADAM Z., VORLÍČEK J., VANÍČEK J. A KOL., (2004) Diagnostické a léčebné postupy u maligních chorob; druhé, aktualizované a doplněné vydání, Grada Publishing, a.s, Praha 13. ADAM Z, KREJČÍ M, VORLÍČEK J, ET AL., (2008) Hematologie, přehled maligních hematologických nemocí, Grada Publishing a.s, Praha 14. ROHOŇ, P., (2009) Molekulární biologie v hematoonkologii – od základních vyšetřovacích metod ke klinické praxi, UP Olomouc 15. ROTHKE, G., SCHMITZ,G., ADOLF, D., ET AL., Consensus protocol for tfe flow cytometric immunophenotyping of hematopoietic malignancies. Leukemia ,1996 10, s.77 16. EVENS, A. M., ET AL., (2009) Non-Hodgkin lymphoma in PAZDU, R., ET AL., Cancer Management Handbook 12th Edition, CMP 17. DAMLE, R.N., WASIL, T., FAIS, F., ET AL., IgV gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood 1999, 94: 1840-1847. 18. ADAM Z., VORLÍČEK J., VANÍČEK J. A KOL., (2004) Diagnostické a léčebné postupy u maligních chorob; druhé, aktualizované a doplněné vydání, Grada Publishing, a.s, Praha 19. PAIVA, B., VIDRIALES, M. B., CERVERO, J., ET AL., Multiparameter flow cytometric remission is the most relevant prognostic factor for multiple myeloma patients who undergo autologous stem cell transplantation. Blood, 2008, 112:40174023

55

20. HIROSE, M.Y., SHIMOYAMA, K., FURKUSHIMA, T., ET AL., Immunophenotypic analysis of various blastic crisis in chronic myeloid leukemia: correlation between CD7 expression and response to chemotherapy. Int J Hematol. 2003; 77: 420-422.

21. MORETON, P., KENNEDY, B., LUCAS, G., ET AL., Eradication of minimal residual disease in B-cell chronic lymphocytic leukemia after alemtuzumab therapy is associated with prolonged survival. J Clin Oncol 2005,23 (13): 2971-9 22. ADAM Z., VORLÍČEK J., KOPTÍKOVÁ J. ( 2003): Obecná onkologie a podpůrná léčba, Grada Publishing, a.s, Praha 23. SCHLINGEMANN, R.O., RIETVELD, F.J., DE WAAL, R.M., BRADLEY, N.J., SKENE, A.I., DAVIES, A.J., GREAVES, M.F., DENEKAMP, J., RUITE, D.J., Leukocyte antigen CD34 is expressed by a subset of cultured endothelial cells and on endothelial abluminal microprocesses in the tumor stroma. Lab Invest. 1990 Jun;62(6):690-6. 24. KRAUTER, J., HARTL, M., HAMBACH, L., KOHLENBERG, A., GUNSILIUS, E., GANSER, A., HEIL ,G., Receptor-mediated endocytosis of CD34 on hematopoietic cells after stimulation with the monoclonal antibody anti-HPCA-1. J Hematother Stem Cell Res. 2001 Dec;10(6):863-71 . 25. SUTHERLAND, D.R., ANDERSON, L., NAYAR, R., CHIN-YEE,I., The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry, J. Hematology 1996, 5, 213-226. 26. RAMSHAW, H. S., HAYLOCK, D., SWART, B., GRONTHOS, S., HORSFALL, M. J., NIUTTA, S., SIMMONS, P. J., Monoclonal antibody BB9 raised against bone marrow stromal cells identifies a cell-surface glycoprotein expressed by primitive human hemopoietic progenitors, Experimental Hematology, 29: 8, 981 – 992

56

26. HAMBLIN T.J., DAVIS Z., GARDINER A., OSCIER D.G., STEVENSON F.K. : Unmutated Ig VH genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia; Blood 1999; 94, 1848-1854

57

10. Seznam zkratek ABL

Abelson murine leukemia

ACE

angiotensin-converting enzyme

ADCC

antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity

AL

akutní leukemie

ALK

anaplastic lymphoma kinase

ALCL

anaplastický velkobuněčný lymfom

ALL

akutní lymfoblastická leukemie

AML

akutní myeloidní leukemie

B-CLL/ SLL

chronická B-lymfocytární leukemie, lymfom z malých lymfocytů

BCR

breakpoint cluster region

BL/ BLL

Burkittův lymfom/ Burkitt-like lymfom

BP

band pass

B-PLL

prolymfocytární leukemie B-lymfocytů

CD

cluster of designation

CNS

centrální nervový systém

CT

výpočetní tomografie

Cy

cytoplasmatický

DLBCL

difúzní velkobuněčný lymfom z B-lymfocytů

EBV

virus Epstein-Barrové

EDC

1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) karbodiimid

EGIL

European Group of Immunophenotyping Leukemia

EMA

epiteliální membránový antigen

FITC

fluorescein isothiokyanát

FL

folikulární lymfom

FRET

Förster (fluorescence) resonant energy transfer

FSC

forvard scatter

HCDM

human cell differentiation molecules

HCL

leukémie vlasatých buněk

HLA

human leucocyte antigen

HLDA

human leucocyte differentiation antigens

HSC

hematopoietic stem cell

LAIP

leukemia-associated aberrant immunophenotype

58

LP

long pass

LPL

lymfoplazmatický lymfom

MALT

mucosa-associated lymphoid tissue

MCL

lymfom plášťové zóny

MM

mnohotný myelom

MPO

myeloperoxidáza

MRD

minimal residual disease

NK

natural killer

NMR

nukleární magnetická rezonance

PCR

polymerase chain reaction

PE

phycoerythrin

PerCP

peridinin chlorophyll protein

PC5

R phycoerythrincyanin 5.1

RQ ASO-PCR

real-time quantitative allele-specific oligonucleotide PCR

sIg

povrchové imunoglobuliny

SP

short pass

SSC

side scatter

T-PLL

prolymfocytátní leukemie T-lymfocytů

TCR

T-cell receptor

TdT

terminální deoxynukleotid transferáza

TRAIL

TNF-related apoptosis inducing ligand

UV

ultra violet

WHO

World Health Organization

YAG

yttrium aluminium garnet

59

11. Autorovy publikace k tématu NOVÁK M., PIKALOVÁ Z., INDRÁK K., Využití průtokové cytometrie pro detekci buněčných subpopulací v likvoru. – In: 6.Olomoucké neuroimunologické sympozium s mezinárodní účastí: Sborník abstrakt, Olomouc 2010, v tisku PIKALOVÁ Z., NOVÁK M., TURCSÁNYI P., INDRÁK K., Lymfoproliferace s atypickou expresí CD znaků-kazuistiky z našeho pracoviště, Transfuze a Hematologie dnes, 2010, 16(2):108-109 LUZNA P, KYLAROVA D, NOVAK M, LICHNOVSKY V., Hematopoietic Stem Cell Separation for Experimental Purposes – Metodic Limitations, Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 2009, 153(2):121-124 PROCHÁZKA V., PAPAJÍK T., KUBOVÁ Z., NOVÁK M., PIKALOVÁ Z., ROŽMANOVÁ Š., JAROŠOVÁ M., INDRÁK K., Význam polymorfismu buněčné protinádorové imunity u pacientů s B-nehodgkinským lymfomem léčeným rituximabem. – Transfuze a Hematologie dnes, 2009,15:224-228 NOVÁK M., JURÁŇOVÁ J., PROCHÁZKA V., PIKALOVÁ Z., INDRÁK K., Zastoupení subpopulace BB9+ v populaci CD34+ buněk u pacientů stimulovaných filgrastimem ke sběru periferních kmenových buněk. – Transfuze a Hematologie dnes, 2009,15(1):69 JURÁŇOVÁ J., NOVÁK M., PIKALOVÁ Z., Analysis of precision determination of hematopoietic progenitor cells (HPC) level. Comparative study between hematology analyzer Sysmex XE-2100 and flow-cytometer. In: Sysmex Outstanding Science Award 2009 JURÁŇOVÁ J., NOVÁK M., PIKALOVÁ Z., Kvantitativní stanovení hematopoetických progenitorových buněk na hematologickém analyzátoru krevních buněk – Transfuze a Hematologie dnes, 2008,14(2): 20

60

JURÁŇOVÁ J., NOVÁK M., PIKALOVÁ Z., Kvantitativní stanovení hematopoetických progenitorových buněk na hematologickém analyzátoru krevních buněk – Vnitřní lékařství, 2008, 54(5): 48 PROCHÁZKA V., NOVÁK M., PIKALOVÁ Z., PAPAJÍK T., INDRÁK K., Rituximab enthances cellular mediated cytotoxicity in patients with B-cell lymphoma: in vivo study of NK/T-cells aktivity – Haematologica, 2007, 92(1):107 NOVÁK M., PROCHÁZKA V., PIKALOVÁ Z., Sledování aktivace cytotoxických Tlymfocytů po podání Rituximabu u pacientů s B-NHL metodou vícebarevné průtokové cytometrie – In: XXI. Olomoucké hematologické dny s mezinárodní účastí : Sborník abstrakt, Olomouc 2007 PIKALOVÁ Z., NOVÁK M., PROCHÁZKA V., Postižení CNS u nemocných s hematologickými malignitami – In: XX. Olomoucké hematologické dny s mezinárodní účastí : Sborník abstrakt, Olomouc 2006

61

12. Autorovy přednášky k tématu Využití průtokové cytometrie pro detekci buněčných subpopulací v likvoru. 6. neuroimunologický kongres s mezinárodní účastí, Olomouc, září 2010 Nálezy atypických lymfoproliferací v roce 2009 – Laboratoř průtokové cytometrie, Celoústavní seminář FNOL, únor 2010 Stanovení MRD u Ly+ AML metodou čtyřbarevné průtokové cytometrie, Celoústavní seminář FNOL, říjen 2009 BB9 – nový marker kmenových buněk, Celoústavní seminář FNOL, červen 2009 Duplicity hematologických malignit z pohledu průtokové cytometrie, Celoústavní seminář FNOL, březen 2009 Analýza MRD u B-CLL metodou vícebarevné průtokové cytometrie, Celoústavní seminář FNOL, únor 2008 a Moravské lymfomové symposium 2008 Přínos průtokové cytometrie pro sortování jaderných krevních elementů, Celoústavní seminář FNOL, květen 2006

62