VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE A TECHNOLOGIE OCHRANY ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF CHEMISTRY AND TECHNOLOGY OF ENVIRONMENTAL PROTECTION

MOŽNOSTI IDENTIFIKACE SILIC V ENVIRONMENTÁLNÍCH MATRICÍCH POSSIBILITIES OF IDENTIFICATION OF ESSENTIALS OILS IN ENVIRONMENTAL MATRIXES

BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BACHELOR’S THESIS

AUTOR PRÁCE

LUCIE PLAČKOVÁ

VEDOUCÍ PRÁCE

prof. RNDr. MILADA VÁVROVÁ, CSc.

AUTHOR

SUPERVISOR

BRNO 2009

Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12

Zadání bakalářské práce Číslo bakalářské práce: Ústav: Student(ka): Studijní program: Studijní obor: Vedoucí bakalářské práce: Konzultanti bakalářské práce:

FCH-BAK0318/2008 Akademický rok: 2008/2009 Ústav chemie a technologie ochrany životního prostředí Lucie Plačková Chemie a chemické technologie (B2801) Chemie a technologie ochrany životního prostředí (2805R002) prof. RNDr. Milada Vávrová, CSc.

Název bakalářské práce: Možnosti identifikace silic v environmentálních matricích

Zadání bakalářské práce: − vypracovat rešerši z dané oblasti − identifikovat obsahové látky typu silic v jehlicí pomocí TLC − vybrané vzorky analyzovat pomocí rozhodčí metody GC/MS

Termín odevzdání bakalářské práce: 29.5.2009

Bakalářská práce se odevzdává ve třech exemplářích na sekretariát ústavu a v elektronické formě vedoucímu bakalářské práce. Toto zadání je přílohou bakalářské práce.

--------------------Lucie Plačková Student(ka)

V Brně, dne 1.12.2008

----------------------prof. RNDr. Milada Vávrová, CSc. Vedoucí práce

----------------------doc. Ing. Josef Čáslavský, CSc. Ředitel ústavu

----------------------doc. Ing. Jaromír Havlica, DrSc. Děkan fakulty

ABSTRAKT V této práci jsou charakterizovány obsahové látky typu silic ve vzorcích rostlinného původu, a to v jehličí a mechu, jejich chemické rozdělení, popis účinků na zdraví člověka a jejich využití v lékařství. Práce dále popisuje metody izolace a identifikace silic z rostlin. Pro izolaci silic jsou použity metody extrakce rozpouštědlem, mikroextrakce tuhou fází (SPME) a destilace vodní parou, pro identifikaci pak tenkovrstvá chromatografie (TLC) a plynová chromatografie (GC/MS).

ABSTRACT Contained substances type of essentials oils in samples of phytogenic are characterized in this thesis, namely in tree needles and in moss, theirs chemical fission, description effects on human health and theirs use in medicine. Thesis describes method of isolation and identification of essentials oils from plants. For isolation of essentials oils there are used methods solvent extraction, solid phase microextraction (SPME) and steam distillation, for identification there are thin layer chromatography (TLC) and gas chromatography (GC/MS).

KLÍČOVÁ SLOVA Bioindikátory, silice, extrakce, mikroextrakce pevnou fází SPME, destilace vodní parou, tenkovrstvá chromatografie TLC, plynová chromatografie GC.

KEYWORDS Bioindicators, essentials oils, extraction, solid phase microextraction SPME, steam distillation, thin layer chromatography TLC, gas chromatography GC.

3

PLAČKOVÁ, L. Možnosti identifikace obsahových látek typu silic v environmentálních matricích. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2009. 91 s. Vedoucí bakalářské práce prof. RNDr. Milada Vávrová, CSc.

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně a že všechny použité literární zdroje jsem správně a úplně citovala. Bakalářská práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brně a může být využita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana FCH VUT. ................................................ podpis studenta

DECLARATION I declare that the bachelor’s thesis has been worked out by myself and that all the quotations from the used literary sources are accurate and complete. The content of the bachelor’s thesis is the property of the Faculty of Chemistry of Brno University of Technology and all commercial uses are allowed only if approved by both the supervisor and the dean of the Faculty of Chemistry, BUT. ................................................ student’s signature

PODĚKOVÁNÍ Ráda bych poděkovala své vedoucí práce prof. RNDr. Miladě Vávrové, CSc. za cenné rady a odbornou pomoc při zpracování výsledků této bakalářské práce. Dále bych ráda poděkovala Ing. Ludmile Mravcové za odbornou pomoc v laboratoři.

OBSAH 1

ÚVOD ........................................................................................................................................................... 6

2

TEORETICKÁ ČÁST ................................................................................................................................ 7 2.1 VYBRANÉ JEHLIČNANY A MECHY.......................................................................................................... 7 2.2 SILICE ................................................................................................................................................. 11 2.2.1 Historie.......................................................................................................................................... 11 2.2.2 Izolace silic z rostlin...................................................................................................................... 11 2.2.3 Chemické složení silic ................................................................................................................... 12 2.2.4 Použití silic.................................................................................................................................... 18 2.3 SEPARAČNÍ METODY ........................................................................................................................... 18 2.3.1 Extrakce ........................................................................................................................................ 19 2.3.1.1 2.3.1.2 2.3.1.3

2.3.2

Extrakce z kapaliny do kapaliny.......................................................................................................... 19 Extrakce pevné fáze do kapaliny ......................................................................................................... 20 Extrakce pevnou fází - SPE................................................................................................................. 20

Chromatografie ............................................................................................................................. 23

2.3.2.1 2.3.2.2

Plynová chromatografie GC ................................................................................................................ 23 Tenkovrstvá chromatografie TLC ....................................................................................................... 27

3

CÍL PRÁCE ............................................................................................................................................... 30

4

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST .................................................................................................................... 31 4.1 MATERIÁL .......................................................................................................................................... 31 4.2 PŘÍSTROJE, PRACOVNÍ POMŮCKY, CHEMIKÁLIE A ROZTOKY ............................................................... 32 4.2.1 Přístroje ........................................................................................................................................ 32 4.2.2 Pracovní pomůcky......................................................................................................................... 32 4.2.3 Chemikálie a roztoky..................................................................................................................... 33 4.2.3.1 4.2.3.2

Extrakce............................................................................................................................................... 33 TLC ..................................................................................................................................................... 33

4.3 PRACOVNÍ POSTUP .............................................................................................................................. 33 4.3.1 Zpracování rostlinného materiálu a extrakce ............................................................................... 33 4.3.2 TLC................................................................................................................................................ 33 4.3.3 GC/MS........................................................................................................................................... 34 4.3.4 Destilace vodní parou ................................................................................................................... 34 5

VÝSLEDKY A DISKUZE ........................................................................................................................ 35 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6

TLC: ŘEDĚNÉ EXTRAKTY – OBJEM 10 CM3 – JEHLIČÍ........................................................................... 36 TLC: KONCENTROVANÉ EXTRAKTY – OBJEM 1 CM3 – MECHY ............................................................. 46 TLC: STANDARDY – OLEJE ................................................................................................................. 53 TLC – SILICE ZÍSKANÉ DESTILACÍ VODNÍ PAROU ................................................................................ 54 GC/MS: JEHLIČÍ, MECHY .................................................................................................................... 56 GC/MS: STANDARDY – OLEJE............................................................................................................. 64

6

ZÁVĚR ....................................................................................................................................................... 67

7

POUŽITÁ LITERATURA ....................................................................................................................... 68

8

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ...................................................................................................... 70

9

SEZNAM PŘÍLOH ................................................................................................................................... 71

10

PŘÍLOHY .................................................................................................................................................. 72

5

1

ÚVOD

Silice jsou velmi rozmanitou skupinou látek, a proto je jejich jednotná definice chemické podstaty dosti složitá. Lze snad říci, že silice jsou směsi ve vodě obtížně rozpustných, lipofilních, prchavých látek, které jsou často vonné, ale mohou být též bez vůně. Množství a kvalitu silic ovlivňují podmínky prostředí, tj. množství světla, povětrnostní vlivy, množství srážek, živin atd. [12] Silice se mohou ukládat v některém rostlinném orgánu – podle toho rozlišujeme silici květů, listů a podobně. Někdy silice prostupují celou rostlinu, což je případ jehličnanů. Zajímavým poznáním je, že rostliny, které obsahují alkaloidy, mají málo silic nebo silice vůbec neobsahují a naopak. Silice mohou mít pro rostlinu různý význam, často je silice rostlinou používána k odpuzování potenciálních predátorů, pro něž je vůně nesnesitelná [12]. Tyto rostliny však mohou sloužit i jako bioindikátory životního prostředí. Bioindikátory jsou tedy matrice, které mohou obsahovat podstatně vyšší obsah některých polutantů, než je obsažen v ovzduší, vodě a půdě. Proto jsou celosvětově využívány v rámci monitoringu a kontroly reziduální kontaminace starých ekologických zátěží [13]. Bioindikátorem mohou být vyšší rostliny, mechorosty, lišejníky, houby, řasy a sinice, suchozemští obratlovci, ryby nebo hmyz i ostatní bezobratlí. Z obratlovců to jsou především ptáci, drobní zemní savci a lovná zvěř. Bioindikátor je tedy živý organismus nebo společenstvo organismů, z jejichž přítomnosti, kondice nebo chování je možno usuzovat na přítomnost určitého faktoru prostředí i na stav a změnu prostředí. Bioindikátory lze dělit na [14]: hlídky (sentinely) – citlivé organismy, které do prostředí zavádíme úmyslně, aby ukazovaly jeho okamžité změny; detektory – organismy, které se vyskytují přirozeně a reagují na změny prostředí; exploatátory (vykořisťovatelé) – organismy, jejichž přítomnost signalizuje narušení a znečištění prostředí; akumulátory (hromadiči) – organismy, které přijímají a hromadí chemické látky. Silice jsou obsaženy v mnohých rostlinných drogách a patří k významným léčivům. Některé rostliny vynikají svou intenzivní specifickou vůní a používají se v potravinářství, parfumerii a kosmetice [12].

6

2

TEORETICKÁ ČÁST

2.1 Vybrané jehličnany a mechy Borovice (borovice lesní, Pinus sylvestris) Popis: Vždy zelený, až 40 m vysoký jehličnatý strom dožívající se věku až 350 let. Borka brázditá, v horní části kmene červenooranžová, v dolní části šedavá. Jehlice umístěné po dvou, tuhé, špičaté, dlouhé 8 cm a široké do 2 mm, opadávají po 2 až 3 letech. Samčí šištice tvoří shluky na konci mladých letorostů, vejcovité, 4 až 8 mm dlouhé, světle žluté, samičí jsou vesměs po 1 až 2, vzpřímené, 5 až 6 mm dlouhé, růžové, tmavě červené nebo fialové. Šišky jsou na krátkých stopkách, na podzim se stáčejí směrem dolů, zprvu zelené, za zralosti dřevnatějící; semena dozrávají na jaře 3. roku, kdy se šiška otvírá a po vysemenění vcelku opadává. Cyklus se opakuje každých 3 až 5 let. Strom začíná kvést ve stáří 15 až 70 let dle stanoviště (nejdříve kvetou samostatně rostoucí stromy) [17]. Stanoviště: Světlé lesy, skály, písčiny, okraje rašelinišť, stanoviště světlé nebo jen slabě přistíněné, na půdách písčitých, kamenitých, chudých, vápnitých i rašelinných [17]. Účinné látky: silice (a v ní terpeny pinen, phellandren, limonen, camphen, cadinen, myrcen, sylvestren, caren, cymen, bornylacetát aj.), pryskyřice, třísloviny, hořčiny, aromatické kyseliny, vitamín C a další látky [15]. Účinky: Zlepšuje prokrvení sliznic, napomáhá rozpouštění sekretu a dezinfikuje naše dýchací cesty, zlepšení dýchání v případě astma, lék na kašel a rýmu, pomáhá při zánětu ledvin nebo močového měchýře, zlepší náladu a navodí vnitřní klid, doporučuje se proti stresu, depresi, nespavosti a podobně. Úžasným lékem je v případě bolestí svalů a při jejich celkově únavě, dále na bolesti spojené s revma a dnou. Používají se různá alkoholová mazání, oleje a krémy s výtažkem, olejový odvar z jehličí a výhonků borovic, dále šampóny a pěny do koupele [16]. Smrk ztepilý (Picea abies) / Smrk pichlavý (Picea pungens) / Popis: Strom vysoký až 50 m, s kuželovitou korunou, v horských oblastech a rozvolněných porostech zavětvenou často až k zemi. Větve jsou mírně vztyčené nebo mírně ohnuté k zemi (zejména u starších stromů), jen ve vrcholových partiích vždy mírně vztyčené, větvičky převislé. Jehlice tmavě zelené, až 2 cm dlouhé. Samčí šištice jsou červené, až 2 cm dlouhé, samičí jsou červené nebo zelené, do 6 cm dlouhé. Zralé šišky jsou hnědé, převislé, až 15 cm dlouhé. Kvete od května do června v pravidelných čtyřletých cyklech [18]. Stanoviště: Původně roste v horských lesích, inverzních údolích, v rašeliništích a lokalitách s vyšší půdní vlhkostí, především na kyselých půdách. V uplynulých staletích byl vysazován na různá stanoviště, a proto monokulturní porosty vykazují velkou ekologickou nestabilitu [18]. Účinky: Dodává energii a je účinným antiseptikem pro dýchání a močové cesty. Vhodný při všech infekcích a revmatických potížích [19], jako lék povzbuzující činnost sliznic a močového ústrojí, proti špatnému zažívání, vodnatelnosti, hostci, příjici a svrabovitým vředům [20]. Jedle bělokorá (Abies alba) Popis: Velký strom s plnodřevným válcovitým kmenem, kuželovitou až válcovitou, velmi pravidelnou korunou. Ve vysokém věku boční větve přerůstají terminál a na vrcholu koruny vzniká tzv. „čapí hnízdo“. Dorůstá do výšky 30–60 m a do průměru kmene 1–2 m. Kořen je kůlový až srdcovitý s hluboko sahajícími panohovými upevňovacími kořeny. Kůra má pryskyřičnaté kanálky, je hladká, bělošedá, později podélně rozpukaná, šedá. Dřevo je nažloutle bělavé, s ostře ohraničenými letokruhy, bez pryskyřičných kanálků. Letorosty hladké, hnědé s výraznými tmavými chlupy. Pupeny jsou vejčité, hnědé, bez pryskyřice. Jehlice dvouřadě uspořádané, u plodonosných větví kryjí výhon,

7

18–30 mm dlouhé, asi 2 mm široké, ploché, na líci tmavě zelené, lesklé s rýhou, na rubu se 2 světlými pruhy, na vrcholu většinou slabě vykrojené, u plodonosných větví oblé až špičaté [21]. Stanoviště: Roste převážně na hlubších středně živných až bohatších čerstvě vlhkých až podmáčených půdách, výjimečně také na půdách rašelinných až kamenitých. V nižších polohách se objevuje spíše v chladnějších a vlhčích pánvích a kotlinách, na severní hranici areálu také v luzích. Svým opadem, který se rychle rozkládá na mírně kyselý humus, udržuje kvalitu půdy v dobrém stavu. Spolu s bukem lesním a smrkem ztepilým tvoří tzv. hercynskou směs. Směs buku s jedlí bývala nejobvyklejší skladbou přirozených porostů našich středních a horských poloh, výše to byla směs smrku a jedle [21]. Účinné látky: Bornylacetát (charakteristická jedlová vůně), kafr, α-pinen, borneol, limonen, bisabolen, kadinen, humulen (α-karyofylen), kimonen, fytoncidy [22]. Účinky: Podporuje antibakteriální, antimykotickou a antivirovou léčbu, má antiseptický účinek, usnadňuje vykašlávání a používá se k inhalacím při nemocech horních cest dýchacích. Doporučuje se rovněž k léčbě revmatismu, zmírňuje zánětlivé stavy a bolesti různého původu. Zvyšuje odolnost organismu, upravuje metabolismus a celkový zdravotní stav. Některé terpeny, jako například limonen nebo borneol, odpuzují komáry a roztoče [22]. Kostrbatec větevnatý (Rhytidiadelphus subpinnatus) Popis: Rostliny statné, tvoří zelené až žlutozelené nebo nahnědlé koberce. Lodyhy až 12 cm dlouhé, červenohnědé, spíše poléhavé, špičky lodyh nejsou vzpřímené, lodyhy i s listy až 4 mm silné, téměř pravidelně 1–2 × zpeřené, na příčném řezu oválné, s úzkým středním svazkem. Větve až 2 cm dlouhé. Lodyžní listy nejsou tak hustě natěsnané (takže lodyha je mezi listy přímo vidět), silně kostrbatě odstálé, 2,2–4,0 × 1,3–1,8 mm, hladké, na bázi ± trojboké až srdčité, náhle zúžené do kanálkovité dlouhé špičky, čepel na okraji plochá, zubatá. žebro dvojité, dosahuje 1/5–1/3 délky listu. Větevní listy podobné lodyžním ale užší [23]. Stanoviště: Vlhká až bažinatá místa mezi trávou, na lesní půdě, humusu, tlejícím dřevě, vlhkých skalách, na březích potoků či v okolí vodopádů, zejména v horských lesích, na vhodných místech (např. ledovcové kary) může vystoupit až do subalpínských poloh, vzácněji se vyskytuje i v nižších nadmořských výškách v inverzních polohách nebo na rašelinných místech, hlavně na člověkem nenarušených stanovištích [23]. Ploník ztenčený (Polytrichum formosum) Popis: Lodyhy tohoto vrcholoplodého mechu jsou i přes 10 cm vysoké, na průřezu s centrálním svazkem (nedokonalé vodní pletivo složené z hydroidů – buněk rozvádějících vodu a leptoidů – buněk transportujících asimiláty). Listy jsou neprůsvitné, kopinatě šídlovité, se širokým žebrem s četnými deskovitými (několik buněk vysokými) asimilačními lištami neboli lamelami (v počtu i několik desítek) probíhajícími v podélném směru a vyjma úzký jednovrstevný, zubatý okraj a bázi pokrývající téměř celý povrch listu (listy jsou proto není možné pozorovat žebro). Koncová buňka deskovitých lamel je na průřezu mírně zvětšená, oválná. Často plodný; na až 8 cm dlouhém štětu sedí čtyřhranná tobolka, po odpadnutí víčka je obústí kryto blankou (epifragmou). Tobolka je poměrně dlouho zcela zakryta nápadnou chlupovitou čepičkou (odtud pochází i latinské rodové jméno) [24]. Stanoviště: Roste obecně (na rozdíl od ploníku obecného!) v lesích na zemi nebo na humusem pokrytých balvanech a skalkách od nížin do hor. Jde o našeho nejběžnějšího zástupce rodu ploník (celkově roste v ČR 10 druhů tohoto rodu) [24].

8

Obrázek 1 Borovice lesní (Pinus sylvestris)

Obrázek 2 Borovice lesní (Pinus sylvestris)

Obrázek 3 Borovice černá (Pinus nigra)

Obrázek 4 Jedle bělokorá (Abies alba)

Obrázek 5 Jedle bělokorá (Abies alba)

9

Obrázek 6 Smrk ztepilý (Picea abies)

Obrázek 8 Smrk pichlavý (Picea pungens)

Obrázek 7 Smrk ztepilý (Picea abies)

Obrázek 9 Smrk pichlavý (Picea pungens)

Obrázek 10 Ploník ztenčený (Polytrichum formosum)

Obrázek 11 Kostrbatec větevnatý (Rhytidiadelphus subpinnatus)

10

2.2 Silice Silice jsou organické sloučeniny s heterogenní strukturou, které obsahují těkavé a lipofilní látky. Jsou to látky prchavé, aromatické , ale i bez vůně. V čerstvém stavu jsou bezbarvé, olejovité, ve vodě nerozpustné, ale dobře rozpustné v ethanolu a dalších polárních organických rozpouštědlech. Při skladování podléhají nepatrně oxidaci, dochází ke změně jejich hustoty a také jejich zabarvení, které je tmavší. Rovněž dochází k polymeraci a hydrolýze esterů. Chemické změny jsou podporovány vzdušným kyslíkem, teplem, světlem a vlhkem. Nejrychleji se mění silice s vysokým obsahem nenasycených terpenových uhlovodíků. V silicích s vysokým obsahem esterů (Oleum levandulae) se v procesu skladování zvyšuje obsah kyselin a to v důsledků částečného zmýdelnění esterů. K menším změnám dochází i u silic s vysokým obsahem aldehydů a fenolů. Relativně stálé jsou silice s obsahem alkoholů. Z celkového počtu 295 rostlinných čeledí obsahuje asi jedna třetina rostlin průmyslově využitelné silice. Pro některé čeledě je výskyt silic charakteristický, např. Pinaceae, Lamiaceae, Lauraceae, Asteraceae, Apiaceae, Myrtaceae, Rutaceae. Silice se tvoří v protoplazmě sekrečních buněk a jsou deponovány v siličných útvarech, odkud se již zpětně neresorbují. Jejich vylučování je tedy ireverzibilní. Ukládání silic je pro různé čeledi specifické, tj. povrchové žlázky (žlázové trichomy) u čeledi Lamiaceae, siličné kanálky u čeledi Apiaceae, siličné buňky např. u čeledí Piperaceae, Zingiberaceae a speciálně uspořádané mezibuněčné prostory apod. Silice se mohou koncentrovat v některém rostlinném orgánu nebo prostupují celou rostlinu [4, 8, 9, 10].

2.2.1

Historie

Tradice využívání aromatických prchavých látek a jim příbuzných sloučenin sahá daleko do starověku, kdy jejich vlastností dovedly využít již národy starověkého Egypta, Číny a Indie. V té době byly tyto specifické produkty rostlin vysoce ceněny a často byly součástí receptur na léčebné a omlazující přípravky. Na egyptských papyrusových svitcích jsou dochovány zmínky o tom, že silice byly součástí kosmetiky a stávaly se nepostradatelnou součástí jídel ve formě koření. Sloužily nejen k léčbě, ale i k balzamování mrtvých [5]. Zhruba na přelomu letopočtu položil řecký lékař Theophrastos základy aromaterapie (nauky zkoumající a popisující účinky aromatických přírodních látek na lidský organismus). Již tehdy bylo zcela spolehlivě potvrzeno, že silice mají příznivý vliv na dýchací systém [5]. Přibližně na počátku 6. století byla v arabském světě zdokonalena technika destilace, která byla vhodnou metodou pro získávání silic z rostlinného materiálu. Tato metoda byla v průběhu následujících století neustále zdokonalována [5]. Za první světové války používal francouzský chemik a kosmetik prof. René-Maurice Gattefose silice jako slabé antiseptikum na čištění ran. Nahradil tehdy používaný fenol levandulovou silicí a zjistil, že rány se lépe a rychleji zahojí. Tato vlastnost byla ještě lépe uplatňována za druhé světové války [5].

2.2.2

Izolace silic z rostlin

Silice se v rostlinách nacházejí velice často. Je známo asi 3000 druhů, z kterých je důležitých asi 150. Pro některé čeledi je výskyt siličnatých látek typický. Silice buď volně prostupují celou rostlinou, nebo je jejich výskyt zúžen na určitou část rostlinného těla – květ, list, nať nebo plod. Rovněž fylogenetický vývoj výrazně ovlivňuje výskyt silic v rostlinách. U mladých rostlin převažují spíše jednodušší uhlovodíkové terpenické látky, zatímco ve starších kyslíkaté deriváty. Z hlediska cirkadiánního se v horkých dnech vypařují a vytvářejí tak kolem rostliny ochranný obal, který je chrání před vlivy vnějšího prostředí (živočišní škůdci, bakterie a houby) [2, 5]. K jejich izolaci se používá několik postupů:

11

2.2.3

Destilace vodou – slouží k získání relativně stálých silic z rostlinných materiálů (k získání terpentýnu z Terebinthinae etheroleum); dnes se od ní upouští pro změny ve složení silice [2]. Destilace vodní parou – tato metoda je mnohem šetrnější; většinou se takto dělí látky, které jsou málo rozpustné a při bodu varu vody mají znatelný tlak nasycených par. Vodní pára s sebou strhává složky silice a ta je v destilační nádobě jímána jako olejovitá vrstva, kterou je nutné frakcionovat, sušit a čistit. Vydestilovaná silice se svým složením částečně liší od extrahované, ale získá se větší množství silic [2, 7]. Extrakce organickými rozpouštědly – slouží k získání méně prchavých nebo netěkavých složek v rostlinném materiálu [2]. Lisování – používá se pouze u rostlin s vysokým obsahem silic vyskytujících se v povrchových částech rostlin – citrusové plody (citrónová a pomerančová silice). Významné zvlášť pro parfumerii spolu s anfleráží [7, 11]. Extrakce tuky (enfleurage [anfleráž]) – nejšetrnější, ale zároveň velmi zdlouhavý postup. Používá se k izolaci silic z květů – čerstvé květy se pokládají na skleněný plát pokrytý směsí tuků, která pohlcuje silici uvolněnou z květů. Květy se vyměňují tak dlouho, dokud se tuk silicí nenasytí (vzniká pomáda). Pomáda se extrahuje ethanolem, extrakt se vymrazí, filtruje a vzniklý produkt se nazývá laváž. Po oddestilování ethanolu se získá čistá silice [7, 11].

Chemické složení silic

Silice lze v podstatě rozdělit do dvou chemických skupin podle základní struktury v rámci biogenese přírodních látek, a to na isoprenoidy a na fenylpropanoidy [1]. Fenylpropanoidy Fenylpropanoidy obsahují ve své struktuře skelet C6C3 (benzenové jádro a tříuhlíkatý zbytek). Biogeneticky se vychází přes kyselinu šikimovou, která je základním prekurzorem pro tvorbu fenylpropanoidů. Z kyseliny šikimové se přes fenylalanin dostáváme ke kyselině skořicové, která je významným meziproduktem biogenese fenylpropanoidů [3]. Kyselina skořicová a její deriváty podléhají dále různým redukčním postupům, jejichž výsledkem je četná skupina fenylpropanoidů, jež jsou součástí silic a balzámů. Podle struktury je dělíme na: aldehydy – skořicový aldehyd; deriváty fenylpropenu – anetol, dianetol, eugenol, β- asaron, fenikulin, apiol a jiné. COOH COOH HO

COOH

NH2

OH OH

kyselina šikimová

fenylalanin

kyselina skořicová

12

CH3O

CHO

CH3O

CH3O anetol

skořicový aldehyd

CH3O

β−asaron

CH3O

CH3O

HO

O

isoeugenol

eugenol

Isoprenoidy Strukturálně druhou chemicky odlišnou skupinou silic jsou isoprenoidy (nazývané též terpeny, terpenoidy). Tato skupina je strukturálně a početně nejobsáhlejší a nejrozmanitější v celém systému biogenese přírodních látek. Lze sem totiž zahrnout nejen chemii prchavých látek, ale i chemii iridoidů, karotenoidů, rostlinných steroidů a terpenických alkaloidů [3]. Základní strukturní jednotkou je isopren (2-methylbutadien), což je látka vznikající pyrolytickým rozkladem terpenů. V přírodě ho jako samostatně se vyskytující látku nenalezneme, a proto se celý systém terpenů od isoprenové jednotky odvozuje pouze formálně. Ve skutečnosti je základním stavebním kamenem isoprenoidů kyselina (R)-mevalonová (kyselina 2,5-dihydroxy-2methylpentanová), která vzniká kondenzací tří jednotek acetylkoenzymu A [3].

HOOC

OH OH

kyselina mevalonová Z kyseliny mevalonové vznikají dále systémem reakcí dva isomery isopentenyldifosfát (IPP) a dimethylallyldifosfát (DAPP). Kondenzací těchto dvou molekul se utváří geranyldifosfát, který je základem monoterpenů (C10). Po přidání jedné molekuly IPP se vytváří farnesyldifosfát, který je zase prekurzorem seskviterpenů (C15). Z farnesyldifosfátu mohou vznikat kondenzací pata-pata steroidy a triterpeny (C30) nebo kondenzací hlava-pata s IPP geranylgeranyldifosfát, který je základem pro diterpeny (C20). Kondenzací dvou geranylgeranyldifosfátů vznikají tetraterpeny (karotenoidy, C40) [3].

13

Schéma č.1 [2, 3, 4]: kyselina mevalonová

DAPP + IPP h-p geranyldifosfát

monoterpeny C10

h-p

IPP seskviterpeny C15

farnesyldifosfát p-p

h-p

skvalen C30

IPP geranylgeranyldifosfát p-p

triterpeny C30

steroidy

diterpeny C20

tetraterpeny C40

h-p (IPP)n polyterpeny

Dělení isoprenoidů je vzhledem k jejich strukturální rozmanitosti velmi složité. Musíme si proto stanovit určitá kritéria. Lze je dělit podle: počtu uhlíků, skeletu molekuly – cyklické a necyklické, funkčních skupin – alkoholy, aldehydy, ketony, kyseliny, estery, apod. Tato dělení lze i volně kombinovat. a) Monoterpeny Jsou desetiuhlíkaté sloučeniny, které vznikají z geranyldifosfátu po vzájemné kondenzací IPP a DAPP systémem hlava-pata. Jsou hlavní složkou prchavých silic. Lze je proto dělit podle výše zmíněných kritérií na acyklické a cyklické. Jak acyklické, tak rovněž cyklické se v přírodě vyskytují jako uhlovodíky, ale ještě častěji jako jejich kyslíkaté deriváty, tj. alkoholy, aldehydy a ketony [3, 5]. Acyklické uhlovodíky

ocimen

Monocyklické uhlovodíky

limonen

α-terpinen

α-phellandren

14

Bicyklické uhlovodíky

Acyklické alkoholy

α  −pinen

geraniol

linalool

citronellol OH

OH

OH

Monocyklické alkoholy

menthol

thymol

OH

Bicyklické alkoholy

OH

borneol

eukalyptol O

HO H

Aldehydy

citral

geranial

H O

H O

Ketony

iron

menton

kafr

O H

O

O

b) Iridoidy Tvoří zvláštní podskupinu; počtem uhlíků v základním skeletu připomínající monoterpeny, ale svými vlastnostmi naprosto jiné sloučeniny. V přírodě jsou to látky poměrně rozšířené, vyskytující se ve formě glykosidů. Název dostaly podle sloučenin izolovaných z mravenců rodu Iridomyrmex.

15

Později byly tyto látky prokázány rovněž v rostlinách, a to jako produkty sekundárního metabolismu. Biogenese vychází z geranyldifosfátu přes citronelal, u něhož dochází k cyklizaci a vzniku základního iridoidu – loganinu. Ten je potom prekurzorem tvorby dalších iridoidů, ale i hořčin čeledi Gentianaceae a valepotriátů (Valeriana officinalis) [4].

COOCH3 HO

HO

O O

O HO

Glc

loganin

O

Glc

aukubin

c) Seskviterpeny Obsahují patnáctiuhlíkatý řetězec (tři isoprenoidní jednotky). Tyto látky patří k nejrozšířenějším v přírodě. Průkaz seskviterpenů je z velké míry vázán na jejich taxonomický výskyt. Některé jsou vyloženě specifické pro určité čeledě nebo i druhy. Dělí se na acyklické a cyklické, přičemž významnější jsou právě cyklické. Acyklické seskviterpeny biogeneticky vznikají z farnesyldifosfátu po jeho defosfataci (farnesol, neridol) a dehydrataci (farneseny). Cyklické seskviterpeny vznikají intramolekulární kondenzací farnesyldifosfátu za vzniku mono- nebo bicyklické sloučeniny.

CH2OH

OH

cis-farnesol

nerolidol

β− farnesen

α - bisabolen

d) Diterpeny Sloučeniny obsahující dvacetiuhlíkatý řetězec. Acyklické sloučeniny jsou velmi vzácné a mají snahu cyklizovat, tj. zaujmout co nejmenší prostorový objem. Přesto v přírodě najdeme acyklický diterpenický řetězec – geranyllinalol v jasmínové silici a nenasycený fytol, který je součástí molekuly chlorofylu ve formě esteru. Nasycený diterpenický řetězec je rovněž součástí vitamínů E a K. Jak již bylo řečeno, mají diterpeny spíše snahu zaujmout cyklickou podobu. Mohou proto tvořit monocyklické (retinol a dehydroretinol), bicyklické až tetracyklické molekuly hořčinové povahy (pikrosalvin, marubiin).

16

OH

OH

geranyllinalol

fytol

OH

vitamín A1 (retinol)

OH

OH

vitamín A2 (3-dehydroretinol) O

HO O O

O

O

marubiin

pikrosalvin

e) Triterpeny Sloučeniny mající ve svém řetězci třicet uhlíků. Biogeneticky je to nesmírně obsáhlá a důležitá skupina přírodních látek. Řadí se sem totiž látky steroidní povahy (steroly, žlučové kyseliny, rostlinné steroidy, hormony, aglykony kardioaktivních glykosidů, apod.) a triterpenoidy (saponiny, apod.). Prekurzorem triterpenů je skvalen, který vzniká kondenzací dvou jednotek farnesyldifosfátu systémem pata-pata. Skvalen je acyklický třicetiuhlíkatý terpen, jehož cyklizací vznikají již zmíněné steroidy a triterpenoidy.

skvalen

f) Tetraterpeny Sloučeniny mající ve svém řetězci čtyřicet uhlíků. Jsou nazývány karotenoidy, obsahují žlutá až červená barviva lipofilního charakteru. Jejich barevnost je způsobena systémem konjugovaných dvojných vazeb. Biogenese jde přes geranylgeranyldifosfát, kdy kondenzací těchto dvou molekul vzniká fytoén, z něhož posléze sledem reakcí vzniká α- nebo β-karoten.

β-karoten

17

g) Polyterpeny Opakovanou polymerací geranylgeranyldifosfátu s IPP vzniká buď trans- nebo cis-polyterpen. Nejvýznamnějšími zástupci jsou kaučuk (all-cis) a gutaperča (all-trans).

n

gutaperča

2.2.4

n

kaučuk

Použití silic

Největší uplatnění nacházejí silice v kosmetickém průmyslu, kde se využívá jejich éterických vlastností při výrobě parfémů, šampónů, pěn do koupelí a jiných kosmetických přípravků. Dalším významným odvětvím, kde nacházejí silice uplatnění, je potravinářský průmysl. Zde se používají jako stomachika, tj. látky, jež mírně dráždí sliznici žaludku a tím dochází ke zvýšení sekrece žaludečních šťáv. Používají se např. radix et folium levistici, radix petroselini a jiné. U jiných silic se zase využívá karminativního účinku (spasmolytické ovlivnění trávicího traktu) nebo cholagogického účinku (zvýšení vylučování žluče do tenkého střeva). V neposlední řadě se silice používají jako korigencia chuti a vůně [1, 5, 12]. Pro nás je však nejdůležitější použití silic ve farmacii a lékařství. Protože celá skupina silic je strukturálně rozmanitá, tak i účinky jednotlivých látek nebo skupin látek jsou rozdílné. Kromě již zmíněných účinků jako stomachika, karminativa, cholagoga, působí celá skupina látek jako antiflogistika. Takto například účinkují seskviterpeny v heřmánkové silici (bisabol, β-farnesen, chamazuleny…). Velká skupina monoterpenů má účinky jako expektorancia a používají se k inhalacím (α-pinen, β-pinen, menthol, thymol, 1,8-cineol…). Podobný účinek se dá prokázat i ve skupině fenylpropanoidů (anetol, dianetol, eugenol, aj.) [4, 5, 12]. Rovněž byly prováděny preklinické studie na antitusický účinek mentholu, který již byl prokázán [6]. Současně s expektoračním účinkem se dá využít i jejich antiseptický účinek; u rodu Thymus byl antimikrobiální účinek potvrzen. Kromě toho také u rostlin jiných čeledí lze prokázat antiseptický, dezinfekční a antimikrobiální účinek. Mezi ně patří peruánský balzám, cineol, eugenol, menthol, citronellol a jiné. Některé silice mají účinek insekticidní (skořicová silice, pyretriny, myristicin, kafr), nebo se používají jako přírodní anthelmintikum (askaridol) [5, 12]. Velkou farmakologickou skupinou, kde se nacházejí siličnaté látky, jsou diuretika. Silice mírně dráždí epitel ledvin, čímž podporují vylučování moče urogenitálním systémem, přičemž většina silic se rovněž vyloučí. Vysoké dávky mohou způsobit přílišné podráždění sliznice, což vede k anúrii (zástavě močení). V praxi se uplatňují jako rostliny vyznačující se léčivým účinkem plody borůvky, petrželový kořen a plod, kořen libečku, jalovcový plod a jiné [1, 5, 12]. Jako rubefaciencia (látky dráždící pokožku) se využívá menthol, kafr a terpentýnová silice (Oleum terebinthinae). Jejich hřejivého a prokrvujícího účinku se využívá k léčbě revmatizmu, různých neuralgických bolestí a všude tam, kde je třeba zvýšit prokrvení pokožky [5].

2.3 Separační metody Separace je proces, při kterém se vzorek dělí alespoň na dva podíly odlišného složení. Separační metody jsou založeny právě na tomto principu, který probíhá na mezifázovém rozhraní [25]. Separační metody můžeme charakterizovat z několika hledisek [26]:

18

Selektivita metod – vyjadřuje schopnost separovat látky na základě jejich jedné nebo více specifických vlastností, mohou se využívat vlastnosti fyzikální (velikost molekul, teplota varu) nebo chemické (polarita molekul). Rozsah použitelnosti – charakterizuje, jaké typy vzorků mohou být určitou metodou separovány. Frakcionační kapacita – udává maximální počet složek, které mohou být separovány v jedné operaci. Podle procesu separace dělíme separační metody na membránové separace (ultrafiltrace, obrácená osmóza, dialýza a elektrodialýza), separace polem (elektroforéza, izotachoforéza, termodifúze, frakcionace tokem v silovém poli, hmotnostní spektrometrie, ultracentrifuga) a metody založené na rovnovážné distribuci složek mezi dvě fáze (destilace, sublimace, nejpoužívanější extrakce a chromatografie) [26].

2.3.1

Extrakce

Extrakce je čistící a dělící operace, při které přechází složka nebo složky ze směsi látek z jedné fáze (plynná, kapalná nebo pevná) do fáze druhé (kapalná, pevná) přes fázové rozhraní [27]. Extrakční soustavy můžeme rozdělit podle skupenství fází, mezi kterými přechází složky [26]: Z pevné fáze do kapaliny. Z pevného materiálu se rozpouští ve vhodném rozpouštědle požadovaná složka, ostatní se nepřevedou, např. Soxhletův extraktor. Z kapaliny do kapaliny. Extrakce je založena na rozdělovací rovnováze v soustavě dvou nemísitelných kapalin. Složka z větší části přechází do rozpouštědla, ve kterém je lépe rozpustná. Z kapaliny na pevnou fázi. Extrakce pevnou fází z roztoku selektivně zachycuje požadované složky, ty se pak uvolní teplem, nebo se vymyjí roztokem. Z kapaliny nebo plynu na pevnou fázi. Mikroextrakce pevnou fází, zde nastává zakoncentrování analytu adsorpcí na polymer pokrývající křemenné vlákno.

2.3.1.1 Extrakce z kapaliny do kapaliny Extrakce látek z vodných roztoků je důležitou základní operací. Látky mohou být ve vodné fázi rozpuštěny, emulgovány či suspendovány a lze je získat extrakcí jiným rozpouštědlem, které se nemísí s původním roztokem – vzorek s analytem (fází), takže se vytvářejí dvě zřetelně ohraničené vrstvy. Nejčastější způsob je extrakce z vody do organického rozpouštědla, které musí být s vodou nemísitelné. Obecně lze však říci, že jde o extrakci látek z polárnějšího rozpouštědla do méně polárního. Fáze se mísí jen omezeně a poměr, který udává, jaké je zastoupení analytu v obou fázích, popisuje Nernstův zákon, který definuje rozdělovací koeficient KD:

KD =

corg c aq

, kde corg (caq) je molární koncentrace v organické fázi (vodné fázi) [25, 27].

Čím je organická fáze více polárnější, tím více se v ní rozpouští voda a je proto nutné, aby byla před použitím vodou nasycena, jinak dochází k odvodňování vytřepávaného extraktu, vylučuje se olejovitý nebo práškový podíl, zvyšuje se viskozita vodné fáze a zhoršuje se ustalování rovnováhy. Vždy je účelnější při vytřepávání pracovat několikrát s menším objemem rozpouštědla než jednou s velkým množstvím, organické fáze se pak spojí, vysuší a zahustí [25]. Základní způsoby provedení extrakce [25]: Diskontinuální (vytřepávání) – používá se tehdy, lze-li snadno dosáhnout rozdělovacího koeficientu žádané látky. Pak postačí pouze tři vytřepávání, aby se látka z 99 % izolovala. Extrakce se provádí v dělících nálevkách.

19

Kontinuální (perforace) – organické rozpouštědlo je v neustálé cirkulaci = prostupuje vodnou fází, hromadí se v oddělené baňce, varem se z ní odpařuje a po kondenzaci prochází opět vodnou fází. Extrahovaná látka se hromadí v destilačním zbytku. Výhodou je jejich automatický provoz, který umožňuje pracovat řadu dní nepřetržitě bez výrazné obsluhy.

Popis obrázku [30]: A – rezervoár, B – separátor, C – kapilára, E – nádobka, H – píst, S – víčko. Vpravit vzorek a extrakční činidlo do rezervoáru A (obr. 1); vložit píst separátoru B do rezervoáru A; uzavřít víčko S; „zapumpovat“ separátorem čtyřikrát nebo vícekrát (obr. 2) pohyb „nahoru - dolů“; vytáhnout separátor těsně nad hladinu a uvolnit víčko; po separaci ponořit separátor do rezervoáru tak, aby se horní fáze dostala do nádobky E; nastavit hladinu spodní fáze v kapiláře C (obr. 3); nyní může být horní fáze bezpečně odebrána, zatímco spodní fáze zůstane v kapiláře.

Obrázek 12 Extrakce z kapaliny do kapaliny Systém MAXXOR

2.3.1.2 Extrakce pevné fáze do kapaliny Tímto postupem se selektivně převádějí některé složky směsi tuhých látek do vhodných rozpouštědel a to buď na základě fyzikálního principu rozpouštění, nebo v kombinaci s chemickou reakcí. Dochází k oddělení nízkomolekulárního podílu od nerozpustného podílu. Provádí se [25]: eluotropní řadou rozpouštědel (tzv. stupňovitá extrakce, např. petrolether-chloroformethylacetát-nižší alkohol), formou totální extrakce (použití nejpolárnějšího rozpouštědla, které lze v daném případě použít). Macerace: diskontinuální extrakce drogy za protřepávání či míchání s rozpouštědlem (až dny). Digesce: je macerace prováděná za zvýšené teploty (až hodiny). Kontinuální extrakce: je realizována protiproudým extrakčním principem, kdy na materiál nejbohatší extraktivními látkami přichází nejkoncentrovanější extrakt. Způsob je velmi účinný, používá se stejné množství rozpouštědla a hmotnost extraktu je vyšší než u diskontinuálních extrakcí.

2.3.1.3 Extrakce pevnou fází - SPE Extrakce pevnou fází (Solid Phase Extraction) je dnes nejvýkonnější technikou dostupnou pro rychlou a selektivní přípravu vzorku. Principem je zachycení molekul látky na tuhém porézním sorbentu, přes který protéká vzorek. Analyty jsou ze sorbentu eluovány příslušným rozpouštědlem. Při extrakci se využívá chemických vlastností molekul, které v důsledku mezimolekulových interakcí (polární, nepolární a iontové interakce) ulpívají na sorbentu [26]. Kolony pro SPE jsou různých velikostí s různými sorbety, s velikostí částic v průměru 50 µm; nejčastěji se používají na bázi chemicky modifikovaných částic silikagelu. Dále lze také aplikovat aluminy (oxid hlinitý), gel oxidu hořečnatého a křemičitého (Florisil), grafitizovaný uhlík, modifikovaný polystyren a syntetická pryskyřice. Sorbenty kladou protékající kapalině odpor (snižují 20

rychlost průtoku). Tento průtok lze urychlit třemi způsoby – vakuem na výstupu z kolony, tlakem na vstupu kolony a centrifugací [25, 28]. Postup práce při SPE lze rozdělit do tří fází [26]: příprava kolonky – aktivace sorbentu, nanesení vzorku na kolonu, selektivní eluce.

Obrázek 13 Metoda SPE

Metoda má značné výhody oproti jiné extrakci, např. kapalina-kapalina. Především to je dobrá selektivita a úspora organických rozpouštědel, nízká ekonomická a časová náročnost. Univerzálnost SPE ji dovoluje užívat pro různé účely, jako je čištění látek, zakoncentrování stopových množství látek, výměnu rozpouštědel nebo derivatizaci. Používá se pro aplikace v oblasti farmacie, biochemie, analýzy potravin, analýz životního prostředí, petrochemie, agrochemie...[26, 28]. Mikroextrakce pevnou fází - SPME SPME je modifikace extrakce pevnou fází; je to jednoduchá a účinná sorpčně/desorpční technika zakoncentrování analytu, vhodná pro izolaci těkavých a středně těkavých látek. Hlavní výhodou je rychlost a odbourání manipulace s extrakčními činidly. Analyty mohou být absorbovány přímo ze vzorku, popřípadě formou head-space, dokud není dosaženo rovnováhy (rozmezí 2 až 30 minut) [24, 29]. Principem je expozice malého množství sorbentu (extrakční fáze) nadbytkem vzorku. Vlákno z taveného křemene pokryté zakotvenou fází je ponořeno do kapalného vzorku nebo umístěno nad kapalný vzorek (popř. pevný vzorek) do prostředí nasyceného těkavými analyty. Po určitou dobu se nechá probíhat sorpce na tuhou fázi. Následuje analytický stupeň, kterým je obvykle plynová chromatografie. Vlákno se nechá v dávkovacím zařízení termicky resorbovat při teplotách kolem 300 °C, poté analyty vstupují do chromatografické kolony, kde se provádí jejich separace [26]. Nevýhodou metody je křehkost vlákna, jeho omezená životnost a nutnost dodržovat standardní podmínky – během běžné manipulace s držákem musí být vlákno vždy zasunuté, během expozice se vlákno nesmí dotknout stěny láhve ani pevné částice, jehla držáku se do chromatografu vkládá rotačním pohybem, po každé analýze je nutné čistit vlákno zvýšenou teplotou (nepřesáhnout však max. povolenou teplotu) nebo ponechání vlákna v nástřiku chromatografu během analýzy po dobu 20 minut, zařazení několika slepých analýz do sledované řady vzorků (odezva čistého vlákna proměřena za podmínek běžné metody) [24].

21

Obrázek 14 SPME

Obrázek 16 Držák SMPE vlákna

Obrázek 15 Tepelná desorpce

Obrázek 17 Poškození vlákna SPME

22

2.3.2

Chromatografie

Chromatografie je separační metoda, při které se oddělují (separují) složky obsažené ve vzorku; je tedy určena pro kvalitativní a kvantitativní analýzy. Vzorek je vnášen mezi dvě nemísitelné fáze – stacionární (nepohyblivou) a mobilní (pohyblivou). Pohybem mobilní fáze je vzorek unášen po stacionární fázi. Složky vzorku vytvářejí se stacionární fází fázové rovnováhy, které neustále vznikají a zanikají, a výsledkem celého procesu je zachycování a uvolňování složek ze stacionární fáze. Složky, které mají větší vztah ke stacionární fázi, jsou k ní více poutány, jsou zpomalovány a tak separovány [1, 26]. Chromatografických metod je velké množství, rozdělujeme je podle několika hledisek [26]: a) Podle skupenství mobilní fáze Kapalinová chromatografie (Liquid Chromatography –LC) – mobilní fáze je kapalina. Plynová chromatografie (Gas Chromatography – GC) – mobilní fází je plyn. b) Podle uspořádání stacionární fáze Kolonová chromatografie – stacionární fáze je umístěna v trubici (koloně). Plošné techniky: Papírová chromatografie (Paper Chromatography – PC) – stacionární fáze je součástí chromatografického papíru. Tenkovrstvá chromatografie (Thin Layer Chromatography – TLC) – stacionární fáze je umístěna na pevném podkladu (např. skleněná deska, hliníková fólie) c) Podle povahy děje, který při separaci převládá Rozdělovací chromatografie – o separaci rozhoduje odlišná rozpustnost složek vzorku ve stacionární fází (kapalina) a mobilní fází (kapalina nebo plyn). Adsorpční chromatografie – o separaci rozhoduje různá schopnost poutat se (adsorbovat) na povrch stacionární fáze (tuhá látka). Iontově-výměnná chromatografie – o separaci rozhodují různě velké elektrostatické přitažlivé síly mezi funkčními skupinami stacionární fáze (iontoměnič) a ionty vzorku. Gelová chromatografie – složky se separují podle velikosti na pórovité stacionární fázi (gelu). Menší molekuly vzorku se v pórech gelu zdržují déle (molekulově sítový efekt). Afinitní chromatografie – stacionární fáze je schopna vázat ve vzorku právě určité složky, ke kterým má úzce selektivní vztah (afinitu).

Obrázek 18 Princip separace složek vzorku v chromatografii

2.3.2.1 Plynová chromatografie GC Plynová chromatografie je metoda vhodná především pro analýzu těkavých látek, které je možné převést do plynného stavu. Vzorek se dávkuje do proudu nosného plynu, který jej dále unáší chromatografickou kolonou umístěnou v termostatu. Aby vzorek mohl být transportován, musí se 23

ihned přeměnit na plyn. V koloně se pak složky separují na základě různé schopnosti poutat se na stacionární fázi. Složky opouštějící kolonu indikuje detektor. Signál z detektoru se vyhodnocuje a z časového průběhu intenzity signálu se určí druh a kvantitativní zastoupení složek. Vzorek může být jak pevný, tak kapalný [26, 31].

Obrázek 19 Schéma plynového chromatografu

Popis chromatografu [26]: Stacionární fáze – měly by dobře rozpouštět separované látky a samy být teplotně stálé a málo těkavé. Měly by pevně ulpívat na nosiči, aby nedocházelo k jejich vymývání z kolony. Možné využívané řešení je zesíťování stacionární kapaliny a navázání kovalentní vazbou na nosič. Mobilní fáze (nosný plyn) je tlaková láhev obsahující dusík, helium nebo argon. Je inertní jak k analytu, tak ke stacionární fázi. Při volbě mobilní fáze hraje roli druh kolony a detektoru, viskozita, účinnost, reaktivita, bezpečnost práce a nižší cena. Čistící zařízení zachycuje vlhkost a nečistoty v nosném plynu, nežádoucí stopy ostatních plynů, odstraňuje stopy reaktivního kyslíku, který nevratně poškozuje stacionární fázi. Regulační systém zajišťuje stálý nebo programově se měnící průtok a tlak nosného plynu při průchodu kolonou a detektorem bez ohledu na typ nosného plynu, teplotu a rozměry kolony. Dávkovač slouží k zavedení vzorku do proudu nosného plynu; technika dávkování musí zajistit odpaření vzorku v co nejkratším čase. Vzorek se dávkuje injekčními stříkačkami přes pryžové septum (odděluje vnitřek injektoru od vnějšího prostoru). Metody nastřikování: Do kolony (on column) – základní metoda náplňových kolon, vhodných pro kolony o vnitřním průměru do 0,25 mm, nastřikuje se 1–10 µl do ústí kolony spolu s nosným plynem. Pomocí děliče toku (split injection) – tenčí kapilární kolony mají malou kapacitu, proto se zejména u koncentrovaných vzorků musí pomoci děliče toku jeho část s nosným plynem oddělit. Do kolony se dostává jen definovaný zlomek nastřikovaného množství (zpravidla 0,1 - 10 %). Skleněná vata v odpařovací trubici zajišťuje homogenní odpařování a účinné promíchání vzorku před vstupem do kolony. Bez děliče toku (splitless injection) – metoda vhodná pro relativně velké objemy (0,5– 5 µl), které je nutno použít pro stopovou analýzu. Používá se stejné zařízení jako s děličem toku, ale odvod děliče je uzavřen. Vzorek se dávkuje pomalu do odpařovací trubice. Koncentrátor na počátku kolony – vzorek z adsorbentu (pórovitý polymer) je termicky resorbován přímo do kolony.

24

Kolona – zde je umístěna stacionární fáze (pevná nebo kapalná fáze) a dochází v ní k separaci složek. Kolony v plynové chromatografii rozlišujeme na náplňové a kapilární. Náplňové – trubice o průměru 1 až 3 mm ze skla nebo nerezové oceli, obsahují adsorbent (silikagel, oxid hlinitý – alumina, grafitizované saze) nebo nosič se zakotvenou kapalnou fází (křemelina – oxid křemičitý). Délka náplňových kolon bývá od desítek centimetrů do několika metrů. Kapilární – využívají jako nosiče stacionární fáze své vnitřní stěny (polysiloxany). Jsou obvykle z taveného křemene a kvůli pevnosti jsou potaženy filmem polyimidu, vnitřní průměr mezi 0,1 a 0,6 mm, délka 15–60 m. Podle uložení stacionární fáze na vnitřní stěně kolony rozlišujeme tři typy: WCOT (kapalná fáze jako tenký film na stěně), SCOT (vrstva nosiče se zakotvenou kapalinou) a PLOT (tenká vrstvička pórovitého materiálu jako adsorbentu).

Obrázek 20 Kapilární kolona v GC

Detektory – slouží k detekci látek v nosném plynu. Sledují takovou vlastnost plynu z kolony, která závisí na druhu a koncentraci složek (analytická vlastnost). Musí mít dostatečnou citlivost a jeho odezva by měla být lineární funkcí obsahu analytu. Důležitým požadavkem je vysoká selektivita pro stanovované analyty. Teplota detektoru by měla být vyšší než je teplota plynu vycházejících z kolony, aby se zabránilo kondenzaci látek na stěnách detektoru. Nejpoužívanější jsou tepelně-vodivostní detektor, plamenový ionizační detektor a detektor elektronového záchytu. Tepelně-vodivostní detektor TCD – je univerzálním typem. Nosný plyn proudí přes vlákno žhavené stálým elektrickým proudem a ochlazuje se na určitou teplotu. Přítomnost složky mění tepelnou vodivost prostředí kolem žhaveného vlákna, a tím jeho teplotu a elektrický odpor. Obvykle se pracuje se dvěma žhavenými vlákny, přes jedno proudí čistý nosný plyn a přes druhé proudí plyn z kolony. Plamenový ionizační detektor FID – molekuly plynu se ionizují v kyslíko-vodíkovém plameni a vedou ionizační proud mezi elektrodami. Nosný plyn se před vstupem do hořáku mísí s vodíkem, vzduch je přiváděn z vnějšku. Přítomnost složky zvýší ionizaci a elektrický proud se zvětší. Detekuje prakticky vše s výjimkou anorganických par a plynů. Obzvlášť citlivý je na uhlovodíky. Detektor elektronového záchytu ECD – selektivní ionizační detektor citlivý na elektronegativní atomy, zejména na halogeny. Nosný plyn (dusík) je vlivem β záření v detektoru ionizován, vzniká konstantní proud. Atomy halogenu (elektronegativní atomy) zachytávají pomalé elektrony a dochází ke snížení ionizačního proudu. Zdrojem ionizace je 3H nebo 63Ni, emitující částice β. Nejmenší detekované množství je o několik řádu nižší než u FID, asi 10-12. Detektor je velmi vhodný pro stopovou analýzu pesticidu v životním prostředí. Detektor s hmotnostním spektrometrem MS –univerzální a všestranný, nepostradatelný ve spojení s plynovou chromatografií (GC-MS) – umožňuje nejen detekci přítomnosti

25

analytu, ale také jeho identifikaci na základě hmotnostního spektra a porovnání jej s knihovnou spekter sloučenin uloženou v počítači. Termostat – zajišťuje dostatečně vysokou teplotu dávkovače, kolony a detektoru, aby byl vzorek udržen v plynném stavu. Běžně se pracuje při teplotách 50–300 °C. Vyhodnocovací zařízení – zpracovává signál z detektoru, zakresluje chromatografickou křivku (chromatogram) a provádí její vyhodnocení. Pracovní techniky: Eluční – je založena na vymývání látek inertním nosným plynem. Vzorek je jednorázově vnesen nosným plynem na začátek kolony. Z kolony vychází nejdříve ta složka, která se nejméně zachycuje na stacionární fázi. Čas za který složka vyjde z kolony je pro ni charakterický. Proto se tento časový údaj využívá k její identifikaci. Mobilní fázi označujeme jako eluent, z kolony pak vychází eluát. Je to nejčastěji používaná technika [26]. Frontální – metoda je založena na kontinuálním přivádění vzorku do kolony. První z kolony začne vycházet nejméně sorbovaná látka, postupně se k ní přidávají další až po nejvíce sorbovanou a nakonec z kolony vychází směs vzorku s nosným plynem o původním složení [26]. Vytěsňovací – vzorek je jednorázově vnesen nosným plynem do kolony. Jednotlivé složky jsou na počátku poutány adsorbentem různou silou, pak se ale aplikuje vytěsňovací činidlo, které obsahuje látku, sorbující se na adsorbent silněji než kterákoliv složka vzorku [25,26].

Obrázek 21 Eluční metoda

Obrázek 22 Vytěsňovací metoda

Obrázek 23 Frontální metoda

26

Popis chromatogramu [26]: Ideální chromatogram pro vzorek složený z inertu a složky A.

Obrázek 24 Chromatogram při eluční metodě

h….….výška píku h½ …...polovina výšky píku Y….….šířka píku v základně Y½……šířka píku v polovině výšky A.…….plocha píku tR….…retenční čas (čas složky strávené v koloně) tM……mrtvý retenční čas (doba, kterou molekula setrvává v mobilní fázi) tR’……redukovaný retenční čas (čas strávený ve stacionární fázi) Pro identifikaci látky je podstatné umístění maxima píku v chromatogramu. Plocha píku a jeho výška roste s obsahem složky ve vzorku. Výška píku lze snadněji změřit, ale je mnohem více ovlivnitelná malými změnami podmínek při průběhu stanovení. Plocha píků se určuje počítačovou integrací.

2.3.2.2 Tenkovrstvá chromatografie TLC Typ kapalinové chromatografie, avšak v plošném uspořádání. Dělení směsi látek probíhá na základě kapilárního nasávaní rozpouštědla stacionární fází, která je ponořena do eluční soustavy v chromatografické nádobě [25, 26]. Stacionární soustava je tenká vrstva sorbentu (0,1 – 0,3 mm) nanesená na skleněnou nebo hliníkovou desku. Sorbentem může být oxid křemičitý (alumina), nebo na bázi silikagelu, méně se užívá celulóza nebo křemelina. Ke stacionární fázi se ještě přidávají látky zvyšující soudržnost a látky k usnadnění detekce – fluorescenční přísady. Mobilní fází je pak rozpouštědlo nebo směs rozpouštědel, při jejichž výběru vycházíme z polarity sledovaných látek. Pokud je separační schopnost dané mobilní fáze nedostatečná, je potřeba zvýšit její polaritu. Naopak stoupají-li látky k čelu, je třeba snížit polaritu. Při výběru vhodných rozpouštědel k tvorbě mobilní fáze se vychází z eluotropní řady [3, 26]. Řazení od nejmenší eluční síly po největší eluční sílu: petrolether – tetrachlormethan – toluen – benzen – ether – dichlormethan – chloroform – aceton – ethylacetát – 1-propanol – ethanol – methanol – voda – kyselina octová - pyridin

27

Proces probíhá ve skleněné kyvetě, ve které je na dně umístěno v malé množství mobilní fáze. Tento systém se uzavře a nechá se nasytit do vzniku rovnovážné tenze par. Vzorek se nanáší na desku se stacionární fází pomocí kapiláry nebo mikropipety na start a ta se následně vloží do chromatografické nádoby, kde se nechá vyvíjet. Mobilní fáze začne vzlínat působením kapilárních sil rovnoměrně po tenké vrstvě do vzdálenosti, kterou si předem určíme (tzv. čelo). Během vzlínání dochází k neustálému vzniku a zániku fázových rovnováh mezi složkami vzorku a stacionární fází. Čím jsou interakce mezi složkou a stacionární fází větší, tím je složka více brzděna. Míru těchto interakcí můžeme ovlivňovat vhodně zvolenou mobilní fázi. V okamžiku, kdy mobilní fáze dosáhne čela, chromatografická deska se vyjme, dobře vysuší (vzduch, Ir-lampa) a provede detekce [3, 25, 26]. K detekci se využívají metody založených na třech obecných principech: Chemická detekce - postřik aerosolem činidla - nespecifická činidla, selektivní nebo specifická činidla (pro silice se používá např. difenylpikrylhydrazyl), které se složkami reaguje na barevné sloučeniny. Fyzikální detekce - pozorování pod ultrafialovou lampou, kdy fluoreskující látky se nám jeví jako světlé skvrny na tmavém pozadí. Biologická detekce - velmi zřídka užívaná v TLC, probíhá přímo na vrstvě, otisku chromatogramu nebo po vyškrabávání zón, např. inhibice růstu mikroorganismů. Počet skvrn na chromatogramu, které se vytvoří z jednoho vzorku látky, může odpovídat počtu sloučenin obsažených v látce, ale může být i menší, neboť některé sloučeniny se za daných podmínek chromatograficky nerozdělí. Pokud jsou skvrny špatně patrné, je potřeba chromatografii opakovat s větším vzorkem látky. Naopak velké množství látky je příčinou vzniku protáhlé skvrny (chvostu) a špatného rozlišení jednotlivých skvrn [32]. Polohu skvrny určujeme poměrem vzdálenosti středu skvrny od startu a ke vzdálenosti čela od startu b. Tento poměr se nazývá retenční (retardační) faktor Rf. V daném systému a za daných podmínek je tento faktor pro určitou látku konstantou. Retenční faktor známé složky určíme pomocí standardu a podle této hodnoty se vyhledá v neznámém vzorku, tím určíme kvalitativní analýzy [26]. RF =

vzdálenost skvrny od startu a = vzdálenost čela od startu b

Obrázek 25 Chromatogram TLC

Kvantitativní analýza – pro dosažení relativně přesných výsledků je třeba pracovat s tenkými vrstvami vysoké kvality, za standardních dobře definovatelných podmínek. V tomto případě se vyhodnocuje intenzita skvrny denzitometricky. Čím je skvrna tmavší, tím je výsledná koncentrace složky ve skvrně vyšší [26].

28

Obrázek 26 Nanášení vzorku na desku

Obrázek 27 Vyvíjející se deska

29

3

CÍL PRÁCE

Vypracovat rešerši na téma obsahové látky v environmetálních matricích (jehličí, mechy). Vypracovat rešerši o významu silic. Provést extrakci silic z jehličí a mechů, jejich detekci a identifikaci pomocí tenkovrstvé chromatografie (TLC). U vybraných vzorků provést destilaci vodní parou a identifikovat získané silice metodou tenkovrstvé chromatografie. Provést ověření metody TLC pro vybrané vzorky pomocí plynové chromatografie s hmotnostním spektrometrem (GC/MS).

30

4

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

4.1 Materiál Silice byly izolovány z následujících rostlinných materiálů: z jehličnanů (borovice, smrk, jedle) a z mechů (kostrbatec, ploník). Všechny pocházejí z různých lokalit, jak je zřejmé z uvedených tabulek 1 až 5: Tabulka 1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Smrk ztepilý / pichlavý Hartvíkovice, před mostem 420 m 11 Mohelno Hartvíkovice, za mostem 424 m 12 Horní Lipová, Jeseníky Přední Arnoštov 13 Horní Bludovice, č.p. 540 Zadní Arnoštov 14 Brušperk Brno - Ořešín 15 Žermanice Skorotice, Vysočina 16 Rychaltice Doubravník 17 Stříbrnice, paseky - Chřiby Letovice, přehrada 18 Palkovice Ostrava - Bartovice 19 Měnín Krokočín - Velká Bíteš 20 Bojkovice

Tabulka 2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Kramolín Hartvíkovice Mohelno, Skryjský mlýn Přední Arnoštov Skorotice, Vysočina Letovice, přehrada Plzeň Krokočín Brušperk Žermanice

Borovice lesní 11 Palkovice 12 Staříč 13 Borová, okr. Jin. Hradec 14 Kopřivnice - Mniší 15 Stříbrnice, paseky - Chřiby 16 Horní Lipová, Jeseníky 17 Brno - Veveří, ul. Úvoz 18 Blatnice pod svatým Antonínkem 19 Bojkovice 20 Horní suchá

Tabulka 3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Jedle bělokorá Doubravník 11 Mohelno Žermanice 12 Brušperk Borová, okr. Jin. Hradec 13 Blatnice pod svatým Antonínkem Brno - Židenice 14 Bojkovice Stříbrnice, paseky 15 Šternberk Krokočín - Velká Bíteš 16 Fryčovice, "U Sauny" Zadní Arnoštov 17 Chlebovice Horní Bludovice, č.p. 7 18 Hukvaldy Lelekovice, Babí lom "U Jelínka" 19 Hukvaldy - Dolní Sklenov Považská Bystrica, SK 20 Staříč

31

Tabulka 4

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tabulka 5

Kostrbatec větevnatý Doubravník Plzeň Zadní Arnoštov Milotice nad Opavou Horný Moštenec, SK Ondřejov Jamartice Dětřichov Tylov Horní Loděnice

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ploník ztenčený Doubravník Zadní Arnoštov Jamartice Milotice nad Opavou Komárov Ondřejov Malá Morávka Šterberk Horní Loděnice Dětřichov

4.2 Přístroje, pracovní pomůcky, chemikálie a roztoky 4.2.1

Přístroje

4.2.2

analytické váhy vakuová odparka fy BÜCHI (Německo) topné zařízení Evaterm fy LABICOM (Česká republika) magnetická míchačka s ohřevem MK 418, fy NÜVE zdroj UV-záření 254 nm a 366 nm – Camag fy MANEKO plynový chromatograf fy AGILENT TECHNOLOGIES (USA) SPME vlákno PDMS-DVB, 60 µm, fy SUPELCO (USA)

Pracovní pomůcky

chromatografické desky AlugramSil G pro TLC, 0,20 mm Silica gel, fy MACHEREY-NAGEL (Německo) chromatografické kyvety se zabroušeným víkem baňky 50 ml, 250 ml se zábrusem 29/32 Erlenmayerovy baňky se zábrusem 29/32 kádinky nálevky odměrné baňky 10 ml se zábrusem… vialky 10 ml mikropipety 2-20 µl pipety filtrační papíry rozprašovače stojan držáky teploměr míchadlo topné hnízdo destilační baňka 1000 ml se zábrusem speciální destilační nástavec (podle Českého lékopisu 2002)

32

4.2.3

Chemikálie a roztoky

4.2.3.1 Extrakce

ethanol fy MERCK petrolether fy MERCK dusík stlačený 4.6 MESSER

4.2.3.2 TLC

vyvíjecí soustava – toluen : ethylacetát (93 : 7) detekční činidlo – 1% vanilín v ethanolu + ethanol : kyselina sírová (95:5), poměr k postřiku 1 : 1 standardy (fy Sigma-Aldrich): Rosemary oil, Anise oil, Cardamom oil, Origanum oil

4.3 Pracovní postup 4.3.1

Zpracování rostlinného materiálu a extrakce

Jednotlivé vzorky jehličí a mechů byly nastříhány na délku asi 0,5 cm. Z každého vzorku bylo odebráno množství po 1 g do baněk a extrahováno zvlášť s 10 cm3 ethanolu a 10 cm3 petroletheru. Po třech dnech extrahování byl roztok slit do vialek, případně přefiltrován (aby se jehličí nedostalo do vialek). Extrakty mechů byly koncentrovány na 1 cm3, neboť na 1 g mechu bylo potřeba většího množství extrahovadla a nebyl odměřován. Extrahovadlo bylo odpařeno na vakuové odparce, pomocí dusíku bylo vysušeno do sucha, poté přidáno množství 1 cm3 ethanolu nebo petroletheru a opět byl extrakt přelit do vialek. Standardy (oleje): množství 0,5 cm3 oleje bylo odpipetováno do 10 cm3 odměrné baňky a doplněna ethanolem nebo petroletherem po rysku.

4.3.2

TLC

Pro analýzu silic tenkovrstvou chromatografií byly použity chromatografické desky 20×20 cm. Na tyto desky bylo nanášeno mikropipetou množství vzorku 10 a 20 µl z každé vialky podle následujícího schématu: b a…start = 15 mm b…čelo = 15 mm c…vzdálenost naneseného vzorku od okraje ≡ 15 mm a c Na jednu chromatografickou desku bylo takto naneseno 10 až 12 skvrn. Desky byly po uschnutí vzorků vloženy do vyvíjecí soustavy toluen : ethylacetát (93:7). Po ukončení vyvíjení (dosažení vyvíjecího činidla 15 mm pod okraj) byly desky vyjmuty z vyvíjecí nádoby. Desky pak byly vysušeny na vzduchu a skvrny byly nejprve pozorovány pod UV-zářením, poté postříkány detekčním činidlem a při 105 °C sušeny v sušárně po dobu 15 minut, která je nutná pro zobrazení skvrn.

33

Pro porovnávání a nalezení možných silic byly vypočteny retenční faktory jednotlivých skvrn podle následujícího vzorce: RF =

a, b

a…vzdálenost skvrny od startu, b…vzdálenost čela od startu.

4.3.3

GC/MS

Pro extrakci látek pro plynový chromatograf bylo zvoleno SPME vlákno. Pro jeho optimalizaci byly použity následující podmínky: extrakce 5 min., t = 25 °C, 100 ot./min., extrakce 10 min., t = 25 °C, 100 ot./min., extrakce 15 min., t = 25 °C, 100 ot./min., extrakce 5 min., t = 40 °C, 100 ot./min., extrakce 5 min., t = 60 °C, 100 ot./min. Nakonec byla zvolena podmínka s dobou extrakce 5 minut, teplotou 40 °C a mícháním 100 ot/min.; pomocí této metody lze získat nejlepší dosažené výsledky. Podmínky plynového chromatografu: GC/MS-TOF (Pegasus IV D, firma LECO, USA) Kolona: HT-5 (30 m × 250 µm; 0,1 µm). Nástřik splitless; SPME; He 1 ml⋅min-1. 250 °C inlet Teplotní program: 40°C po dobu 2 min; 10 °C/min do teploty 220 °C; 15 °C/min do teploty 320 °C. MS Rozmezí hmot 35 – 500. Scanovací rychlost 3 sp/s. Napětí na detektoru 1850 V. Teplota iontového zdroje 250 °C. Software: LECO Chroma TOFTH optimalized for Pegasus 4D.

4.3.4

Destilace vodní parou

Destilace vodní parou byla další z možností, jak získat silice z rostlinných materiálů. Pro destilaci silic byl použit speciální nástavec (viz příloha E.1.) uvedený v Českém lékopise 2002. Do destilační baňky o objemu 1000 cm3 bylo vpraveno 50 g rostlinného materiálu, varné kamínky a 250 cm3 destilované vody. Byla sestavena aparatura (viz příloha E.2.). Obsah byl přiveden k varu a destilace probíhala dvě hodiny. Získané silice byly zachytávány v hexanu (rozpouštědlo silic) umístěného v kalibrované trubici ve speciálním nástavci. Hexan spolu se silicemi byl nanesen na chromatografické desky (viz kapitola 4.3.2).

34

5

VÝSLEDKY A DISKUZE

Výsledky mé bakalářské práce byly pro větší přehlednost zpracovány do následujících tabulek. Pro analýzu obsahových látek izolovaných ze silic byly zvoleny tři druhy jehličí (borovice, smrk, jedle) z každého 20 vzorků a dva druhy mechů (kostrbatec, ploník) z každého 10 vzorků. Jako standardy silic byly použity a analyzovány éterické oleje z kardamomu, oregana, anýzu a rozmarýnu. Pro exaktní identifikaci obsahových látek přítomných v silicích izolovaných z jehličí různých jehličnanů (borovice, smrk a jedle), mechů a standardů éterických olejů by byly zapotřebí standardy všech obsahových látek, jejichž přítomnost lze na základě literárních údajů předpokládat. Protože jsme neměli příslušné standardy k dispozici, bylo pro identifikaci obsahových látek v rámci této screeningové metody použito porovnání našich chromatogramů s atlasem spekter [34]. Spektra, která byla zobrazena v příslušné literatuře, byla prováděna za stejných chromatografických podmínek. Tenkovrstvá chromatografie byla použita jako screeningová metoda, protože je pro danou identifikaci velmi vhodná a je doporučována rovněž Českým farmaceutickým kodexem [33]. Obsahové látky silic byly zjišťovány v neředěných extraktech (u mechů), ve zředěných extraktech (u jehličí) a v silicích izolovaných z jehličí a mechů pomocí destilace s vodní parou. Kromě toho byly obsahové látky identifikovány také ve vybraných vzorcích éterických olejů. Výsledky prezentované v tabulkách jsou zpracovány následovně: pokud byla obsahová látka jednoznačně identifikována, je v tabulce uveden její název. Nebyla-li identifikace jednoznačná, je název příslušné obsahové látky napsán kurzívou. Pokud nedošlo porovnáním spekter vůbec k identifikaci, je v tabulce uvedeno „nd“, tj. nedetekováno (respektive neidentifikováno). Pokud nebyla detekována žádná skvrna, není v tabulce žádné označení. Porovnáním s publikovanými spektry bylo zjištěno, že v silicích izolovaných z jehličí byly vesměs identifikovány následující obsahové látky: borneol, terpineol, linalool, limonen, pinen, caren a linalyl acetát. Identifikace se však výrazně odlišovala u jednotlivých druhů jehličnanů i mechů. Také nebyly prokázány shodné výsledky u stejného druhu jehličnanu odebraného v různých lokalitách. Tyto obsahové látky přítomné v silicích byly vesměs identifikovány již v ethanolových extraktech; některé z nich, které tvoří v silici majoritní podíl, přecházely i do dalších extraktů. V jehličí borovic byly identifikovány borneol, terpineol, linalool, limonen, pinen a caren (tabulky 6 – 25), v jehličí smrků (tabulky 26 – 45) borneol, terpineol, linalool, limonen a pinen, v jehličí jedlí (tabulky 46 – 65) borneol, terpineol, linalool, limonen a pinen. V jehličí některých jehličnanů byly identifikovány pouze jedna až dvě obsahové látky, v jiných byly naopak přítomny všechny výše citované. Na základě toho lze konstatovat, že bioklimatologické podmínky mohou hrát určitou roli i v eliminaci těkavých přírodních látek obsažených ve sledovaných matricích. V následujících tabulkách 66 – 75 jsou prezentovány identifikované obsahové látky, které byly prokázány v koncentrovaných extraktech izolovaných z mechu „kostrbatec“. Také v tomto případě byly identifikovány borneol, terpineol, linalool, limonen, caren a linalyl acetát. Obdobné výsledky byly prokázány také u dalšího druhu mechu (ploník); u tohoto mechu sice nebyl identifikován caren, ale byl naopak detekován pinen. V posledních čtyřech tabulkách týkajících se této analýzy pomocí TLC (tabulky 86 – 89) jsou uvedeny identifikované obsahové látky zjištěné ve vzorcích éterického oleje z kardamomu, oregana, anýzu a rozmarýnu. V kardamomu byly identifikovány borneol, linalool, cineol a linalyl acetát, v oreganu borneol, cineol a caren, v anýzovém oleji pouze linalool a v rozmarýnovém oleji borneol, linalool, cineol a pinen. I v tomto případě se porovnáním s atlasem spekter podařilo prokázat, že ve vzorcích bylo obsaženo více obsahových látek, které však nebylo možné jednoznačně identifikovat. Je to patrně způsobeno tím, že příslušné obsahové látky mohou mít více struktur, které však nelze prokázat pomocí TLC jako screeningové metody. Poslední výsledky (tabulky 90 – 98) shrnují údaje o identifikaci obsahových látek v silicích izolovaných z daných matric destilací s vodní parou. Tento postup byl převzat z českého lékopisu. Destilační aparatura je znázorněna v příloze této bakalářské práce (viz příloha E.2.). Tato analýza byla

35

provedena pouze u zástupce každého bioindikátoru rostlinného původu a u jednotlivých éterických olejů. Z výsledků vyplývá, že v silici izolované z borovice byly identifikovány terpineol, linalool, limonen a caren. V porovnání se zředěným extraktem nebyly identifikovány borneol a pinen. Méně identifikovaných obsahových látek bylo zjištěno také v silici izolované ze smrku, kde byl identifikován pouze terpineol, limonen a pinen (ve zředěném extraktu byl navíc prokázán také borneol a linalool). Naproti tomu v silici izolované z jehličí jedle se nám tímto způsobem podařilo identifikovat více látek, a to terpineol, linalool, limonen, pinen, caren a linalyl acetát; ve zředěném extraktu nebyl identifikován caren a linalyl acetát, navíc však byl detekován borneol. V silicích izolovaných z mechů kostrbatec a ploník pomocí destilace s vodní parou nebyla detekována žádná obsahová látka. Pokud bychom hodnotili identifikaci u silic, tak v kardamomové silici byl zjištěn borneol, linalool a cineol, v oreganové silici borneol, linalool a cineol, v anýzové pouze linalool a v rozmarýnové borneol, linalool, cineol, pinen a linalyl acetát. Také při analýze éterických olejů nebylo dosaženo shody s extrakčním postupem. Z předložených výsledků vyplynulo, že i screeningová metoda TLC umožnila identifikaci některých obsahových látek. Pokud bychom měli k dispozici také údaje o detekci ostatních obsahových látek ve zvolené chromatografické soustavě, bylo by možné provést kompletní identifikaci.

5.1 TLC: ředěné extrakty – objem 10 cm3 – jehličí Tabulka 6 Borovice: Kramolín

ethanol n/RF 1 2

10 µl 0,21 -

20 µl 0,21 0,44

petrolether 10 µl 20 µl -

identifikace borneol limonen

20 µl 0,21 0,43



petrolether 10 µl 20 µl 0,47 0,47 0,51 0,51 0,99 0,99

identifikace terpineol limonen pinen caren nd


identifikace nd terpineol limonen caren

Tabulka 7 Borovice: Hartvíkovice

ethanol n/RF 1 2

10 µl 0,22 0,44

Tabulka 8 Borovice: Mohelno, Skryjský mlýn

ethanol n/RF 1 2 3 4 5

10 µl 0,24 0,50 0,54 0,99

20 µl 0,25 0,51 0,54 1,00

Tabulka 9 Borovice: Přední Arnoštov

ethanol n/RF 1 2 3 4

10 µl 0,25 0,47 0,53

20 µl 0,07 0,25 0,45 0,53

36

Tabulka 10 Borovice: Skorotice, Vysočina

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7

10 µl 0,03 0,21 0,55 0,98


identifikace nd nd borneol linalool pinen caren nd

20 µl 0,04 0,22 0,55 0,98

petrolether 10 µl 20 µl 0,19 0,19 0,35 0,34 0,52 0,52 0,99 0,99

identifikace nd nd borneol linalool pinen caren nd

20 µl -


identifikace -

20 µl 0,05 0,23 0,36 0,55 0,71 0,98

petrolether 10 µl 20 µl 0,33 0,34 -

identifikace nd borneol linalool caren nd nd

20 µl 0,22 0,43



20 µl 0,22


identifikace borneol

20 µl 0,05 0,22 0,54 0,98

Tabulka 11 Borovice: Letovice, přehrada

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7

10 µl 0,04 0,22 0,55 0,98

Tabulka 12 Borovice: Plzeň

ethanol n/RF 1

10 µl -

Tabulka 13 Borovice: Krokočín

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6

10 µl 0,04 0,22 0,35 -

Tabulka 14 Borovice: Brušperk

ethanol n/RF 1 2

10 µl 0,21 -

Tabulka 15 Borovice: Žermanice

ethanol n/RF 1

10 µl 0,22

37

Tabulka 16 Borovice: Palkovice

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7

10 µl 0,04 0,24 0,51 0,71 0,98

20 µl 0,05 0,24 0,51 0,70 0,98

petrolether 10 µl 20 µl 0,03 0,20 0,49 0,49 -

identifikace nd borneol terpineol nd pinen nd nd

20 µl 0,05 0,24


identifikace nd terpineol

Tabulka 17 Borovice: Staříč

ethanol n/RF 1 2

10 µl 0,04 0,24

Tabulka 18 Borovice: Borová, okr. Jindřichův Hradec

ethanol n/RF 1 2 3

10 µl -

20 µl -


identifikace pinen caren nd


identifikace borneol terpineol linalool pinen nd nd


identifikace borneol terpineol linalool caren nd linalyl acetát nd nd

Tabulka 19 Borovice: Kopřivnice - Mniší


10 µl 0,23 0,52 0,91 0,98

20 µl 0,23 0,52 0,98

Tabulka 20 Borovice: Stříbrnice, paseky

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8

10 µl 0,22 0,77 0,98

20 µl 0,22 0,53 0,77 0,90 0,98

38

Tabulka 21 Borovice: Horní Lipová, Jeseníky

ethanol n/RF 1 2 3

10 µl 0,06 0,23 0,46

20 µl 0,06 0,22 0,47


identifikace nd borneol limonen


identifikace -

Tabulka 22 Borovice: Brno - Veveří, ul. Úvoz

ethanol n/RF 1

10 µl -

20 µl -

Tabulka 23 Borovice: Blatnice pod svatým Antonínkem

ethanol n/RF 1

10 µl -

20 µl -


identifikace -

20 µl 0,24


identifikace terpineol

20 µl 0,06 0,23


identifikace nd terpineol

Tabulka 24 Borovice: Bojkovice

ethanol n/RF 1

10 µl -

Tabulka 25 Borovice: Horní suchá

ethanol n/RF 1 2

10 µl -

Tabulka 26 Smrk: Hartvíkovice, před mostem 420 m

ethanol n/RF 1 2

10 µl 0,24 -


identifikace terpineol limonen

20 µl 0,23 0,48


identifikace terpineol limonen

20 µl -


identifikace -

20 µl 0,23 0,48

Tabulka 27 Smrk: Hartvíkovice, za mostem 424 m

ethanol n/RF 1 2

10 µl 0,23 0,48

Tabulka 28 Smrk: Přední Arnoštov

ethanol n/RF 1

10 µl -

39

Tabulka 29 Smrk: Zadní Arnoštov

ethanol n/RF 1

10 µl -

20 µl -


identifikace -

20 µl -


identifikace -

20 µl 0,05 0,19 0,40 0,51 0,91 0,97


identifikace nd borneol nd pinen nd nd

20 µl -


identifikace -


identifikace -


identifikace nd borneol linalool

20 µl -


identifikace -

20 µl 0,25



Tabulka 30 Smrk: Brno - Ořešín

ethanol n/RF 1

10 µl -

Tabulka 31 Smrk: Skorotice, Vysočina


10 µl 0,04 0,19 0,51 0,97

Tabulka 32 Smrk: Doubravník

ethanol n/RF 1

10 µl -

Tabulka 33 Smrk: Letovice, přehrada

ethanol n/RF 1

10 µl -

20 µl -

Tabulka 34 Smrk: Ostrava - Bartovice

ethanol n/RF 1 2 3

10 µl 0,04 0,20 0,33

20 µl 0,05 0,20 0,34

Tabulka 35 Smrk: Krokočín - Velká Bíteš

ethanol n/RF 1

10 µl -

Tabulka 36 Smrk: Měnín

ethanol n/RF 1

10 µl 0,25

40

Tabulka 37 Smrk: Brušperk

ethanol n/RF 1

10 µl 0,03

20 µl 0,05


identifikace nd

20 µl 0,06 0,24 0,45


identifikace nd terpineol limonen

20 µl 0,06 0,24 0,45


identifikace nd terpineol limonen

20 µl 0,05 0,20


identifikace nd borneol

20 µl -

petrolether 10 µl 20 µl 0,24



identifikace -

20 µl 0,25



20 µl -


identifikace -

20 µl -


identifikace -

Tabulka 38 Smrk: Žermanice

ethanol n/RF 1 2 3

10 µl 0,24 -

Tabulka 39 Smrk: Horní Bludovice, č.p. 540

ethanol n/RF 1 2 3

10 µl 0,06 0,24 0,45

Tabulka 40 Smrk: Palkovice

ethanol n/RF 1 2

10 µl 0,04 0,20

Tabulka 41 Smrk: Rychaltice

ethanol n/RF 1

10 µl -

Tabulka 42 Smrk: Stříbrnice, paseky

ethanol n/RF 1

10 µl -

20 µl -

Tabulka 43 Smrk: Horní Lipová, Jeseníky

ethanol n/RF 1

10 µl 0,25

Tabulka 44 Smrk: Mohelno

ethanol n/RF 1

10 µl -

Tabulka 45 Smrk: Bojkovice

ethanol n/RF 1

10 µl -

41

Tabulka 46 Jedle: Doubravník


10 µl 0,22 0,39 0,44

20 µl 0,06 0,24 0,40 0,44


identifikace nd terpineol nd limonen

20 µl 0,06 0,24 0,40 0,44



20 µl 0,05 0,21 0,39 0,45 0,54 0,67 0,73 0,97


identifikace nd borneol terpineol nd limonen pinen caren nd linalyl acetát nd

20 µl 0,11 0,22 0,44 0,54 0,67 0,72 0,87 0,97

petrolether 10 µl 20 µl 0,23 0,28 0,28 0,51 0,50 0,65 0,65 0,98 0,98

identifikace nd borneol terpineol limonen pinen caren nd nd nd nd

Tabulka 47 Jedle: Žermanice


10 µl 0,24 0,40 0,44

Tabulka 48 Jedle: Borová, okr. Jindř. Hradec

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

10 µl 0,05 0,20 0,39 0,44 0,53 0,96

Tabulka 49 Jedle: Brno - Židenice

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

10 µl 0,11 0,22 0,44 0,54 0,67 0,88 0,97

42

Tabulka 50 Jedle: Stříbrnice, paseky

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

petrolether 10 µl 20 µl 0,23 0,30 0,66 0,98

identifikace nd terpineol nd linalool nd limonen nd nd nd nd nd

20 µl 0,06 0,24 0,40 0,44



20 µl 0,22 0,42 0,50 0,96

petrolether 10 µl 20 µl 0,49 0,99

identifikace borneol nd pinen nd


identifikace nd linalool nd nd

10 µl 0,33 0,40 0,45 0,67 0,72

20 µl 0,05 0,34 0,39 0,44 0,67 0,72

0,87 0,97

0,87 0,98

-

Tabulka 51 Jedle: Krokočín - Velká Bíteš


10 µl 0,24 0,40 0,44

Tabulka 52 Jedle: Zadní Arnoštov


10 µl 0,22 0,41 0,50 0,96

Tabulka 53 Jedle: Horní Bludovice, č.p. 7


10 µl 0,05 0,32 0,40 0,97

20 µl 0,05 0,32 0,40 0,96

Tabulka 54 Jedle: Lelekovice, Babí lom "U Jelínka"


10 µl 0,04 0,30 0,41 0,97

20 µl 0,05 0,30 0,41 0,97


identifikace nd linalool nd nd

43

Tabulka 55 Jedle: Považská Bystrica, SK

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 µl 0,05 0,23 0,45 0,67 0,73 0,88 0,98

20 µl 0,06 0,22 0,44 0,67 0,72 0,87 0,98

petrolether 10 µl 20 µl 0,28 0,66 0,97 0,97

identifikace nd borneol terpineol limonen nd nd nd nd nd

20 µl 0,07 0,26 0,33 0,39 0,44 0,67 0,71 0,87 0,97

petrolether 10 µl 20 µl 0,23 0,30 0,30 0,66 0,66 0,97 0,97

identifikace nd borneol terpineol linalool nd nd limonen nd nd nd nd

20 µl 0,06 0,25 0,41 0,45



Tabulka 56 Jedle: Mohelno

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

10 µl 0,06 0,26 0,33 0,39 0,44 0,67 0,72 0,87 0,98

Tabulka 57 Jedle: Brušperk


10 µl 0,06 0,25 0,40 0,44

Tabulka 58 Jedle: Blatnice pod svatým Antonínkem


10 µl 0,06 0,24 0,40 0,45

20 µl 0,07 0,25 0,40 0,45



20 µl 0,07 0,41 0,45


identifikace nd nd limonen

Tabulka 59 Jedle: Bojkovice

ethanol n/RF 1 2 3

10 µl 0,06 0,41 0,45

44

Tabulka 60 Jedle: Šternberk


10 µl 0,04 0,21 0,41 0,50 0,96 -

petrolether 10 µl 20 µl 0,49 0,99 0,99

identifikace nd borneol nd pinen nd nd

20 µl 0,06 0,22 0,40 0,45


identifikace nd borneol nd limonen

20 µl 0,06 0,23 0,41 0,44


identifikace nd borneol nd limonen

20 µl 0,06 0,24 0,40 0,44



20 µl 0,07 0,25 0,41 0,45



20 µl 0,06 0,25 0,41 0,45



20 µl 0,05 0,22 0,42 0,50 0,96 -

Tabulka 61 Jedle: Fryčovice, "U Sauny"


10 µl 0,20 0,40 0,45

Tabulka 62 Jedle: Chlebovice


10 µl 0,06 0,23 0,40 0,45

Tabulka 63 Jedle: Hukvaldy


10 µl 0,05 0,24 0,40 0,45

Tabulka 64 Jedle: Hukvaldy - Dolní Sklenov


10 µl 0,06 0,24 0,41 0,45

Tabulka 65 Jedle: Staříč


10 µl 0,06 0,25 0,41 0,46

45

5.2 TLC: koncentrované extrakty – objem 1 cm3 – mechy Tabulka 66 Kostrbatec: Doubravník

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8

10 µl 0,20 0,32 0,42 0,61 0,69 0,97

20 µl 0,21 0,33 0,42 0,45 0,69 0,97

petrolether 10 µl 20 µl 0,32 0,94 0,94 -

identifikace borneol linalool nd limonen nd nd nd nd

20 µl 0,05 0,14 0,22 0,26 0,33 0,36 0,41 0,44 0,69 0,96 0,99

petrolether 10 µl 20 µl 0,22 0,23 0,32 0,32 0,39 0,40 0,94 0,94 0,99 0,99

identifikace nd nd borneol terpineol nd nd nd limonen nd nd nd nd

petrolether 10 µl 20 µl 0,32 0,32 0,93 0,94 -

identifikace nd nd terpineol linalool nd nd limonen caren nd nd nd nd

Tabulka 67 Kostrbatec: Plzeň

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

10 µl 0,05 0,13 0,22 0,33 0,36 0,41 0,44 0,69 0,97 0,99

Tabulka 68 Kostrbatec: Zadní Arnoštov

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

10 µl 0,19 0,23 0,26 0,33 0,37 0,41 0,44 0,57 0,61 0,69 0,96

20 µl 0,20 0,23 0,26 0,33 0,37 0,41 0,44 0,57 0,60 0,69 0,96

46

Tabulka 69 Kostrbatec: Milotice nad Opavou

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

10 µl 0,05 0,07 0,14 0,24 0,26 0,33 0,36 0,42 0,44 0,69 0,96 -

petrolether 10 µl 20 µl 0,24 0,24 0,32 0,32 0,39 0,39 0,43 0,68 0,67 0,94 0,93 1,00 0,99

identifikace nd nd nd borneol terpineol nd nd nd nd limonen nd nd nd nd

20 µl 0,24 0,34 0,42 0,70 0,95 -


identifikace borneol nd nd nd limonen nd nd nd nd

20 µl 0,05 0,15 0,23 0,33 0,36 0,42 0,69 0,94 0,99

petrolether 10 µl 20 µl 0,13 0,13 0,22 0,21 0,30 0,30 0,36 0,36 0,93 0,92 0,99 0,99

identifikace nd nd borneol nd linalool nd nd nd nd nd

20 µl 0,05 0,07 0,15 0,23 0,27 0,34 0,36 0,42 0,45 0,69 0,96 -

Tabulka 70 Kostrbatec: Horný Moštenec, SK

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 µl 0,24 0,34 0,41 0,69 0,95 -

Tabulka 71 Kostrbatec: Ondřejov

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

10 µl 0,04 0,15 0,23 0,33 0,36 0,41 0,70 0,94 0,99

47

Tabulka 72 Kostrbatec: Jamartice

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

10 µl 0,04 0,16 0,25 0,28 0,35 0,38 0,42 0,45 0,74 0,95 0,97 0,99

20 µl 0,04 0,16 0,24 0,28 0,35 0,38 0,42 0,45 0,74 0,96 0,98 0,99


identifikace nd nd borneol terpineol linalool nd nd nd limonen linalyl acetát nd nd nd

20 µl 0,04 0,09 0,25 0,35 0,38 0,42 0,74 0,96 0,98 0,97


identifikace nd nd borneol terpineol nd linalool nd nd linalyl acetát nd nd nd nd

20 µl 0,04 0,25 0,35 0,42 0,73 0,96 0,97 0,99


identifikace nd borneol terpineol nd nd nd limonen nd nd nd nd nd

Tabulka 73 Kostrbatec: Dětřichov

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

10 µl 0,04 0,08 0,24 0,35 0,38 0,42 0,74 0,95 0,97 0,98

Tabulka 74 Kostrbatec: Tylov

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

10 µl 0,04 0,24 0,35 0,42 0,73 0,96 0,98 0,99

48

Tabulka 75 Kostrbatec: Horní Loděnice

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

10 µl 0,04 0,16 0,24 0,28 0,35 0,38 0,43 0,45 0,73 0,96 0,98 0,99

20 µl 0,05 0,17 0,25 0,28 0,35 0,38 0,43 0,45 0,73 0,95 0,97 0,99


identifikace nd nd borneol terpineol nd linalool nd nd limonen nd linalyl acetát nd nd nd

20 µl 0,05 0,25 0,28 0,35 0,42 0,45 0,73 0,95 0,97 0,99


identifikace nd nd borneol terpineol nd linalool nd nd nd limonen nd nd nd nd nd

Tabulka 76 Ploník: Doubravník

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

10 µl 0,03 0,05 0,25 0,28 0,35 0,36 0,39 0,73 0,95 0,97 0,99

49

Tabulka 77 Ploník: Zadní Arnoštov

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

10 µl 0,04 0,17 0,24 0,29 0,35 0,42 0,45 0,73 0,95 0,98 0,99

20 µl 0,04 0,17 0,24 0,29 0,35 0,42 0,45 0,72 0,95 0,97 0,99

petrolether 10 µl 20 µl 0,01 0,19 0,20 0,29 0,29 0,36 0,36 0,68 0,96 -

identifikace nd nd nd borneol terpineol nd linalool nd limonen nd linalyl acetát nd nd nd

20 µl 0,03 0,06 0,20 0,26 0,32 0,38 0,42 0,47 0,50 0,62 0,65 0,97 0,99


identifikace nd nd borneol terpineol nd nd linalool nd nd limonen nd pinen nd nd nd nd nd nd

Tabulka 78 Ploník: Jamartice

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

10 µl 0,03 0,05 0,19 0,25 0,37 0,39 0,46 0,48 0,63 0,66 0,93 0,99

50

Tabulka 79 Ploník: Milotice nad Opavou

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

10 µl 0,25 0,32 0,38 0,42 0,47 0,96 1,00

20 µl 0,25 0,33 0,38 0,43 0,48 0,65 0,97 1,00


identifikace nd terpineol nd nd nd nd limonen nd nd nd nd

20 µl 0,04 0,06 0,25 0,33 0,38 0,49 0,51 0,65 0,96 -


identifikace nd nd nd borneol terpineol nd nd linalool nd nd nd nd nd nd nd nd

20 µl 0,03 0,05 0,25 0,34 0,39 0,49 0,51 0,66 0,96 -


identifikace nd nd nd terpineol nd linalool nd nd pinen nd nd nd nd

Tabulka 80 Ploník: Komárov

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

10 µl 0,03 0,04 0,25 0,38 0,49 0,51 0,66 0,97 -

Tabulka 81 Ploník: Ondřejov

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

10 µl 0,02 0,05 0,25 0,38 0,49 0,51 0,66 0,97 -

51

Tabulka 82 Ploník: Malá Morávka

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

10 µl 0,03 0,05 0,25 0,34 0,39 0,49 0,51 0,63 0,66 0,95 -

20 µl 0,04 0,06 0,25 0,34 0,39 0,44 0,49 0,51 0,62 0,66 0,94 -


identifikace nd nd borneol terpineol nd nd nd nd limonen nd pinen nd nd nd nd

20 µl 0,04 0,06 0,25 0,37 0,41 0,47 0,65 0,94 0,98


identifikace nd nd nd borneol terpineol nd nd limonen nd nd nd nd

20 µl 0,05 0,14 0,22 0,26 0,32 0,34 0,40 0,43 0,67 0,94 0,99


identifikace nd nd nd terpineol nd linalool nd nd limonen nd nd nd nd

Tabulka 83 Ploník: Šterberk

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

10 µl 0,03 0,05 0,25 0,38 0,49 0,65 0,95 -

Tabulka 84 Ploník: Horní Loděnice

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

10 µl 0,05 0,14 0,22 0,24 0,33 0,35 0,41 0,43 0,67 0,94 0,99

52

Tabulka 85 Ploník: Dětřichov

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

10 µl 0,03 0,18 0,22 0,25 0,33 0,34 0,40 0,41 0,68 0,94 1,00


identifikace nd nd nd terpineol nd linalool nd nd nd nd limonen nd nd nd nd

20 µl 0,19 0,30 0,44 0,68 0,93

petrolether 10 µl 20 µl 0,11 0,11 0,18 0,18 0,32 0,32 0,36 0,37 0,39 0,39 0,43 0,43 0,68 0,70 0,93 0,93

identifikace nd borneol nd linalool nd cineol linalyl acetát nd

20 µl 0,21 0,32 0,47 0,55 0,93


identifikace nd borneol nd nd cineol caren nd

20 µl 0,31 0,85 0,94


identifikace linalool nd nd

20 µl 0,04 0,18 0,22 0,26 0,33 0,35 0,40 0,43 0,67 0,95 0,99

5.3 TLC: standardy – oleje Tabulka 86 Cardamom oil

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8

10 µl 0,18 0,30 0,43 0,68 0,93

Tabulka 87 Organum oil

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7

10 µl 0,21 0,31 0,45 0,53 0,93

Tabulka 88 Anise oil

ethanol n/RF 1 2 3

10 µl 0,31 0,84 0,93

53

Tabulka 89 Rosemary oil

ethanol n/RF 1 2 3 4 5 6 7

10 µl 0,19 0,31 0,42 0,51 0,69 0,93

20 µl 0,19 0,31 0,44 0,52 0,70 0,93


identifikace borneol linalool cineol pinen nd nd nd

5.4 TLC – silice získané destilací vodní parou Tabulka 90 Borovice: Blatnice pod svatým Antonínkem

hexan n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8

10 µl 0,18 0,24 0,31 0,41 0,48 0,58 0,83 0,96

20 µl 0,18 0,25 0,31 0,42 0,48 0,59 0,84 0,95

identifikace nd terpineol linalool limonen nd caren nd nd

20 µl 0,18 0,27 0,43 0,50 0,69 0,78 0,94

identifikace nd terpineol limonen pinen nd nd nd

20 µl 0,16 0,25 0,34 0,40 0,53 0,59 0,67 0,74 0,92 0,95 0,98

identifikace nd terpineol linalool limonen pinen caren nd linalyl acetát nd nd nd

Tabulka 91 Smrk: Horní Bludovice, č.p. 540

hexan n/RF 1 2 3 4 5 6 7

10 µl 0,18 0,26 0,43 0,49 0,94

Tabulka 92 Jedle: Brušperk

hexan n/RF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

10 µl 0,17 0,24 0,33 0,40 0,53 0,59 0,66 0,74 0,92 0,94 -

54

Tabulka 93 Kostrbatec:Zadní Arnoštov

hexan n/RF 1 2

10 µl 0,59 0,94

20 µl 0,94

identifikace nd nd

20 µl 0,93 0,95

identifikace nd nd

20 µl 0,19 0,30 0,44 0,68 0,93

identifikace borneol linalool cineol nd nd

20 µl 0,21 0,32 0,47 0,55 0,93

identifikace borneol linalool cineol nd nd

20 µl 0,31 0,39 0,86 0,93

identifikace linalool nd nd nd

20 µl 0,19 0,31 0,44 0,52 0,70 0,93 0,93

identifikace borneol linalool cineol pinen linalyl acetát nd nd

Tabulka 94 Ploník: Jamartice

hexan n/RF 1 2

10 µl 0,93 0,95

Tabulka 95 Cardamom oil

hexan n/RF 1 2 3 4 5

10 µl 0,18 0,30 0,43 0,68 0,93


hexan n/RF 1 2 3 4 5

10 µl 0,21 0,31 0,45 0,53 0,93


hexan n/RF 1 2 3 4

10 µl 0,31 0,39 0,85 0,92


hexan n/RF 1 2 3 4 5 6 7

10 µl 0,19 0,31 0,42 0,51 0,71 0,93 0,93

55

5.5 GC/MS: jehličí, mechy V následujících tabulkách a chromatografických záznamech je prezentována identifikace obsahových látek pomocí metody GC/MS s chromatografickým záznamem TIC. Identifikace byla provedena pomocí retenčních časů a knihovny spekter, které byly součástí přístrojového zařízení použitého k měření. Příslušná spektra jsou uvedena v přílohách této bakalářské práce. Z tabulek 99 – 112 vyplývá, že bylo použitou rozhodčí metodou identifikováno více obsahových látek, z nichž některé se od sebe liší strukturou a polohou substituentu. Z tabulek vyplývá, že oběma postupy byly vesměs identifikovány limonen, pinen, caren a terpinolen; pomocí TLC byla u některých identifikována pouze alkoholická forma příslušného uhlovodíku. Opět to neplatí pro všechny borovice odebrané na různých místech České republiky a Slovenska; z jednotlivých tabulek vyplývá, že obsahové látky silic izolované z jehličí stejného druhu jehličnanu nejsou stejné. U borovice bylo identifikováno 12, 13, 14 a 16 obsahových látek, u smrku 6, 8 a 12 obsahových látek, u jedle 13, 14, 16 a 19 obsahových látek, opět se lišících strukturou i polohou substituentů. U mechů nebylo prokázáno mnoho obsahových látek. U kostrbatce z lokality Doubravník se jednalo pouze o jednu identifikovanou látku, naopak u dalších dvou kostrbatců z lokalit Zadní Arnoštov a Plzeň nebyly identifikovány žádné silice. U druhého mechu, ploníku, bylo identifikováno 6 obsahových látek, ale i v tomto případě nebyly v meších ze dvou lokalit, Zadní Arnoštov a Jamartice, identifikovány žádné obsahové látky silic.

Tabulka 99 Borovice: Kramolín

R.T. (s) 540,125 554,125 582,625 609,875 634,125 660,375 844,625

Název d-camphene a-pinene 3-carene limonene à-phellandrene terpinolene isobornyl acetate

R.T. (s) 872,875 885,625 915,625 924,125 957,625 984,625 1010,63

Název c-elemene à-cubebene copaene β-elemene caryophyllene à-caryophyllene a-muurolene

Chromatogram 1 Borovice: Kramolín

56

Tabulka 100 Borovice: Hartvíkovice

R.T. (s) 502,163 524,488 538,149 547,145 551,81 580,799 602,457 632,111

Název 1R-à-pinene camphene d-camphene sabinene á-pinene 3-carene limonene à-phellandrene

R.T. (s) 658,101 842,361 870,683 913,665 921,662 955,315 982,305 1008,63

Název terpinolene isobornyl acetate c-elemene copaene β-elemene caryophyllene à-caryophyllene à-muurolene

R.T. (s) 759,077 842,71 913,681 955,331 982,654 1008,64

Název camphor isobornyl acetace copaene caryophyllene à-caryophyllene a-muurolene

Chromatogram 2 Borovice: Hartvíkovice

Tabulka 101 Borovice: Mohelno, Skryjský mlýn

R.T. (s) 552,493 562,822 581,148 602,806 632,461 658,783

Název á-pinene sabinene 3-carene limonene à-phellandrene terpinolen

Chromatogram 3 Borovice: Mohelno, Skryjský mlýn

57

Tabulka 102 Borovice: Přední Arnoštov

R.T. (s) 502,83 538,482 548,145 552,143 581,132 603,123 632,778

Název 1R-à-pinene d-camphene sabinene á-pinene 3-carene limonene à-phellandrene

R.T. (s) 659,101 913,999 922,329 955,649 982,971 1008,96

Název terpinolene copaene b-elemene caryophyllene à-caryophyllene à-muurolene

R.T. (s) 603,359 613,609 760,859 844,109

Název limonene eucalyptol camphor isobornyl acetate

Chromatogram 4 Borovice: Přední Arnoštov

Tabulka 103 Smrk: Hartvíkovice, před mostem 420 m

R.T. (s) 503,359 522,359 539,859 581,609

Název 1R-à-pinene camphene d-camphene 3-carene

Chromatogram 5 Smrk: Hartvíkovice, před mostem 420 m

58

Tabulka 104 Smrk: Hartvíkovice, za mostem 424 m

R.T. (s) 502,497 521,489 538,149 580,465

Název 1R-à-pinene camphene d-camphene 3-carene

R.T. (s) 602,79 659,767 759,061 842,361

Název limonene terpinolene camphor isobornyl acetate

R.T. (s) 602,457 605,789 759,061

Název limonene o-cymene L-camphor

Chromatogram 6 Smrk: Hartvíkovice, za mostem 424 m

Tabulka 105 Smrk: Přední Arnoštov

R.T. (s) 502,83 522,489 552,143

Název 1R-à-pinene camphene á-pinene

Chromatogram 7 Smrk: Přední Arnoštov

59

Tabulka 106 Smrk: Zadní Arnoštov

R.T. (s) 522,155 547,145 552,143 612,786 632,445 659,101

Název camphene sabinene á-pinene eucalyptol à-phellandrene terpinolen

R.T. (s) 759,394 842,694 873,681 922,329 955,649 982,971

Název L-camphor isobornyl acetate piperitone β-elemene caryophyllene à-caryophyllene

R.T. (s) 675,625 691,625 844,375 949,125 954,875 984,875

Název p-cymene cis-sabinenehydrate isobornyl acetate trans-à-bergamotene longifolene à-caryophyllene

Chromatogram 8 Smrk: Zadní Arnoštov

Tabulka 107 Jedle: Doubravník

R.T. (s) 535,875 553,875 582,375 603,875 606,875 633,875 660,375

Název sabinen á-pinene 3-carene D-limonene o-cymene terpinene terpinolene

Chromatogram 9 Jedle: Doubravník

60

Tabulka 108 Jedle: Žermanice

R.T. (s) 503,163 538,149 554,143 580,799 602,457 606,122 632,778 658,767 674,761 689,755

Název 1R-à-pinene d-camphene sabinene 3-carene limonene o-cymene terpinene terpinolene p-cymene cis-sabinenehydrate

R.T. (s) 756,395 842,694 883,677 913,665 921,995 935,323 947,319 955,649 982,971

Název 4-terpineol isobornyl acetate à-cubebene copaene á-elemen à-gurjunene trans-à-bergamotene caryophyllene à-caryophyllene

R.T. (s) 674,428 842,361 952,317 953,316 955,315 982,305 1012,29

Název p-cymene isobornyl acetate longifolene himachala-2,4-diene caryophyllene à-caryophyllene aromadendrene

Chromatogram 10 Jedle: Žermanice

Tabulka 109 Jedle: Borová, okr. Jin. Hradec

R.T. (s) 502,163 520,823 537,816 551,81 579,799 602,123 660,1

Název 1R-à-pinene camphene d-camphene á-pinene 3-carene limonene terpinolene

61

Chromatogram 11 Jedle: Borová, okr. Jin. Hradec

Tabulka 110 Jedle: Brno - Židenice

R.T. (s) 502,179 520,839 547,832 552,159 602,139 632,127 659,45 842,71

Název 1R-à-pinene camphene sabinene á-pinene limonene à-phellandrene erpinolene isobornyl acetate

R.T. (s) 883,693 913,348 935,006 952,333 955,331 976,989 982,321 1012,64

Název à-cubebene copaene (-)-à-gurjunene longifolene caryophyllene à-himachalene à-caryophyllene aromadendrene

Chromatogram 12 Jedle: Brno - Židenice

62

Tabulka 111 Ploník: Doubravník

R.T. (s) 552,61 760,61 844,11

Název á-pinene camphor isobornyl acetate

R.T. (s) 936,86 957,11 984,36

Název gurjunene caryophyllene à-caryophyllene

R.T. (s)

Název

Chromatogram 13 Ploník: Doubravník

Tabulka 112 Kostrbatec: Doubravník

R.T. (s) 844,109

Název isobornyl acetate

Chromatogram 14 Kostrbatec: Doubravník

63

5.6 GC/MS: standardy – oleje V následujících tabulkách 113 až 116 jsou prezentovány obsahové látky identifikované pomocí metody GC/MS v kardamomové silici, oreganové silici, anýzové silici a rozmarýnové silici. Z hodnot zde uvedených i z doložených chromatogramů TIC vyplývá, že v kardamomové silici bylo identifikováno 16 obsahových látek, v oreganové 12 obsahových látek, v anýzové 10 obsahových látek a v rozmarýnové silici 19 obsahových látek. Některé identifikované obsahové látky se od sebe rovněž odlišují po strukturní stránce i v poloze substituentů.

Tabulka 113 Cardamom oil

R.T. (s) 503,496 521,489 552,81 604,123 608,787 616,451 632,778 659,434

Název 1R-à-pinene b-ocimene á-pinene m-cymene limonene eucalyptol terpinene terpinolen

R.T. (s) 722,075 729,406 756,062 843,027 849,691 897,339 965,311 1011,29

Název limonene oxide, cislimonene oxide, trans4-terpinenol isobornyl acetate 4-carene, (1S,3R,6R)-(-)camphene terpineol à-muurolene

R.T. (s) 658,767 755,729 775,721 913,665 955,649 982,638

Název terpinolene 4-terpineol anisole, p-allylcopaene aaryophyllene à-caryophyllene

Chromatogram 15 Cardamom oil


R.T. (s) 502,83 537,483 568,803 606,122 609,454 637,443

Název à-pinene d-camphene á-myrcene m-cymene o-cymene terpinene

64

Chromatogram 16 Organum oil


R.T. (s) 502,83 552,48 603,12 632,45 660,1

Název 1R-à-pinene á-pinene limonene terpinene lerpinolene

R.T. (s) 675,43 772,06 948,32 955,98 675,43

Název p-cymene anisole, p-allyltrans-à-bergamotene caryophyllene p-cymene

Chromatogram 17 Anise oil

65


R.T. (s) 536,15 555,142 570,136 581,132 602,79 613,785 616,451 632,445 640,108 658,767

Název d-camphene á-pinene á-myrcene 3-carene D-limonene carveol eucalyptol terpinene à-phellandrene terpinolene

R.T. (s) 673,761 742,734 759,061 795,379 820,703 842,694 884,011 913,999 955,982

Název p-cymene isoborneol camphor borneol camphenol, 6isobornyl acetate à-cubebene copaene caryophyllene

Chromatogram 18 Rosemary oil

Na závěr zhodnocení získaných výsledků lze konstatovat, že oba dva postupy, tj. screeningová TLC i rozhodčí metoda GC/MS, jsou postupy použitelné pro identifikaci obsahových látek v silicích izolovaných z rostlinných matric. Pokud by byly k dispozici všechny standardy předpokládaných obsahových látek silic izolovaných z dané matrice, přispělo by to k lepší identifikaci především screeningové metody TLC.

66

6

ZÁVĚR

V práci byla řešena problematika identifikace obsahových látek izolovaných ze silic rostlinných bioindikátorů, tj. jehličí tří jehličnanů (borovice, smrk a jedle) a dvou mechů (kostrbatec a ploník). Kromě toho byly zjišťovány tyto obsahové látky také v éterických olejích izolovaných z kardamomu, oregana, anýzu a rozmarýnu. Při řešení BP byly získány následující poznatky:

Byly získány extrakty silic z borovice, ve kterých bylo identifikováno šest obsahových látek, a to borneol, terpineol, linalool, limonen, pinen a caren; po izolaci silic pomocí destilace s vodní parou byly identifikovány pouze čtyři obsahové látky, a to terpineol, linalool, limonen a caren. Byly získány extrakty ze smrku, ve kterých bylo identifikováno pět obsahových látek, a to borneol, terpineol, linalool, limonen a pinen; po izolaci silic pomocí destilace s vodní parou byly identifikovány pouze tři obsahové látky, a to terpineol, limonen a pinen. Byly získány extrakty silic z jedle, ve kterých bylo identifikováno pět obsahových látek, a to borneol, terpineol, linalool, limonen a pinen; po izolaci silic pomocí destilace s vodní parou bylo identifikováno šest obsahových látek, a to terpineol, linalool, limonen, pinen, caren a linalyl acetát. Byly získány extrakty silic z mechu kostrbatec, ve kterých bylo identifikováno šest obsahových látek, a to borneol, terpineol, linalool, limonen, caren a linalyl acetát; po izolaci silic pomocí destilace s vodní parou nebyly identifikovány žádné obsahové látky. Byly získány extrakty silic z mechu ploník, ve kterých bylo identifikováno šest obsahových látek, a to borneol, terpineol, linalool, limonen, pinen a linalyl acetát; po izolaci silic pomocí destilace s vodní parou nebyly identifikovány žádné obsahové látky. V éterických olejích izolovaných z kardamomu byly identifikovány čtyři obsahové látky (borneol, linalool, cineol a linalyl acetát); v oreganové silici byly identifikovány borneol, linalool, cineol a caren; v anýzové silici pouze linalool a v rozmarýnové silici borneol, linalool, cineol, pinen a linalyl acetát. Pomocí metody GC/MS bylo identifikováno větší množství obsahových látek, rozlišených strukturně i polohou substituentů. U borovice bylo identifikováno 12, 13, 14 a 16 obsahových látek, u smrku 6, 8 a 12 obsahových látek, u jedle 13, 14, 16 a 19 obsahových látek, opět se lišících strukturou i polohou substituentů. U mechů nebylo prokázáno mnoho obsahových látek; u kostrbatce se jednalo pouze o jednu identifikovanou látku, u ploníku o 6 obsahových látek. Pomocí metody GC/MS bylo v kardamomové silici identifikováno 16 obsahových látek, v oreganové 12 obsahových látek, v anýzové 10 obsahových látek a v rozmarýnové silici 19 obsahových látek.

67

7 [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7]

[8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23]

[24] [25]

POUŽITÁ LITERATURA SUCHÝ V.: Farmakognosie, část speciální I. Universita Komenského, Bratislava, 1994, (vysokoškolská skripta). SUCHÝ V.: Farmakognosie, všeobecná část. Universita Komenského, Bratislava, 1994, (vysokoškolská skripta). KUBIŠ I., KOUTNÝ, T., PÁRAL, V.: Stanovení silic v koření pomocí separačních postupů. SPŠCH, Brno 2008, 58 s. Středoškolská odborná činnost. TOMKO J. a kol.: Farmakognósia. Osveta Martin, 1999. KRESÁNEK, J., KRESÁNEK, J.(1999): Zázrak zvaný silice. Liečivé rostliny, 36: 190-197. LAUDEA, E. A.m MORICE, A. H., GRATTAN, T. J. (1994): Antitusické účinky mentholu a cineolu u morčat za plného vědomí. Pulm pharmacol, 7: 179-184. STONAWSKA, B. Analýza senzoricky aktivních látek bylin. Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, 2007, 58 s. Bakalářská práce. Dostupný z WWW: STARÝ, F. – POSPÍŠIL, F. – HLAVSA, B.: Rostliny v kosmetice. Praha, Artia, 1987. JIRÁSEK, V – STARÝ, F. – SEVERA, F.: Kapesní atlas léčivých rostlin. Praha, SPN 1989. MIKA, K.: Fytoterapia pre lekárov. Matrin, Osveta, 1988. Parfémy a kosmetika Vůně pro tebe [online]. [cit. 2008-11-18]. Dostupný z WWW: . KYSILKA, Jiří. Silice [online]. 2007 [cit. 2008-11-18]. Dostupný z WWW: . Využití bioindikátorů při hodnocení starých zátěží terestrického ekosystému [online]. [cit. 200811-18]. Dostupný z WWW: . Box 4. Bioindikátory [online]. [cit. 2008-11-18]. Dostupný z WWW: . Borovice lesní [online]. c2004-2008 [cit. 2008-11-18]. Dostupný z WWW: . Borovice léčí naše tělo i mysl [online]. c2005-2008 [cit. 2008-11-18]. Dostupný z WWW: . Pinus sylvestris, Borovice lesní, Borovica lesná [online]. [cit. 2008-11-18]. Dostupný z WWW: . Botany.cz : PICEA ABIES (L.) Karsten - smrk ztepilý / smrek obyčajný [online]. Botany.cz, c2007-2008 [cit. 2008-11-18]. Dostupný z WWW: . Aromaterapie a esence (m-z) [online]. A.R.X., c2004-2007 [cit. 2008-11-18]. Dostupný z WWW: . Smrk, smrk ztepilý, Picea abies [online]. 2005 [cit. 2008-11-18]. Dostupný z WWW: . Botany.cz : ABIES ALBA Mill. - jedle bělokorá / jedľa biela [online]. Botany.cz, c2007-2008 [cit. 2008-11-18]. Dostupný z WWW: . Olej ze sibiřské jedle bělokoré KOUPIT LEVNĚJI, Prozdravi.cz [online]. [cit. 2008-11-18]. Dostupný z WWW: . HRADÍLEK, Z. Rhytidiadelphus (Limpr.) Warnst. – kostrbatec [online]. Verze 1.0. 13.3.2006 [cit. 2008-11-18]. Dostupný z WWW: . HLAVÁČKOVÁ, Ilona. Stanovení těkavých látek obsažených v jehličí a v mechu. VUT Brno, 2007. 73 s. Bakalářská práce. OPLETAL, L., DRAŠAR, P.: Fytochemické metody, 1. Izolace obsahových látek. Univerzita Karlova, Praha, 1994, (vysokoškolská skripta).

68

[26] [27] [28]

[29]

[30] [31] [32] [33] [34]

KLOUDA, P.: Moderní analytické metody. Nakladatelství Pavel Klouda, Ostrava, 2003. Etrakce [online]. 2003 [cit. 2008-11-20]. Dostupný z WWW: . SPE [online]. Sigma-Aldrich Co., c2008 [cit. 2008-11-20]. Dostupný z WWW: . SPME - Supelco Products [online]. Sigma-Aldrich Co., c2008 [cit. 2008-11-20]. Dostupný z WWW: . Labicom - Extrakce rozpouštědlem [online]. Labicom s.r.o., c2004 [cit. 2008-11-20]. Dostupný z WWW: . Plynová chromatografie (GC) [online]. [cit. 2008-11-21]. Dostupný z WWW: . Chromatografie na tenké vrstvě [online]. [cit. 2008-11-21]. Dostupný z WWW: . Český farmaceutický kodex, 1994 Wagner, H., Bladt, S., Zgainski, E. M. (1984): Plant drug analysis. Springer – Verlag, Berlin – Heidelberg – New York – Tokio

69

8

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK

DAPP ECD FCH FID GC h-p IPP Ir KD LC MS PC PLOT p-p RF SCOT SPE SPME TCD TIC TLC UV VUT / BUT WCOT

dimethylallyldifosfát Detektor elektronového záchytu Fakulta chemická / Fakulty of Chemistry Plamenový ionizační detektor Gas Chromatography / Plynová chromatografie zapojení hlava-pata isopentenyldifosfát Infra-Red / Infračervený rozdělovací koeficient Liquid Chromatography / Kapalinová chromatografie Mass Spektrometry / Hmotnostní spektrometr Paper Chromatography / Papírová chromatografie Porous Layer Open Tubular zapojení pata-pata Retenční čas Support Coated Open Tubular Solid Phase Extraction / Extrakce pevnou fází Solid Phase Microextraction / Mikroextrakce pevnou fází Tepelně vodivostní detektor Total Ion Current / Celkový iontový proud Thin layer chromatography / Tenkovrstvá chromatografie Ultra-Violet / Ultrafialový Vysoké učení technické / Brno University of Technology Wall Coated Open Tubular

70

9

SEZNAM PŘÍLOH

A. Obecné A.1. Anýzový plod...........................................................................................................................72 A.2. Anýzová droga v detailu. .........................................................................................................73 A.3. Vyznačené lokality odebraných vzorků – smrku. ....................................................................74 A.4. Vyznačené lokality odebraných vzorků – borovice. ................................................................75 A.5. Vyznačené lokality odebraných vzorků – jedle. ......................................................................76 B. Úprava vzorků B.1. Extrakce jehličí. .......................................................................................................................77 B.2. Extrakce mechů........................................................................................................................77 B.3. Filtrace. ....................................................................................................................................78 B.4. Odpařování extrahovadla. ........................................................................................................78 B.5. Sušení dusíkem. .......................................................................................................................79 B.6. Vialka, extrakt jehličí – Smrk (Stříbrnice, paseky – Chřiby), ethanol, objem 10 ml...............79 B.7. Vialka – extrakt mechu – Ploník (Dětřichov), ethanol, objem 1 ml. .......................................79 C. TLC C.1. Chromatografická deska – jedle...............................................................................................80 C.2. Chromatografická deska – mechy............................................................................................81 C.3. Chromatografická deska – mechy, UV – 366 nm. ...................................................................82 C.4. UV box Camag fy MANEKO..................................................................................................82 C.5. Chromatografické desky – standardy, extrahovadlo ethanol, (zleva: Cardamom oil, Origanum oil, Anise oil, Rosemary oil), objem 10 µl a 20 µl...................................................................83 C.6. Chromatografické desky – standardy, extrahovadlo petrolether, (zleva: Origanum oil, Cardamom oil, Anise oil, Rosemary oil), objem 10 µl a 20 µl. ...............................................84 D. Plynová chromatografie GC/MS D.1. Adsorpce SPME vlákna. ..........................................................................................................85 D.2. Desorpce SPME vlákna. ..........................................................................................................85 D.3. Plynový chromatograf..............................................................................................................85 E. Destilace vodní parou E.1. Destilační nástavec podle Českého lékopisu 2002...................................................................86 E.2. Destilační aparatura..................................................................................................................87 F. Spektra a vzorce vybraných silic F.1. Spektrum a vzorec látky: alpha-pinene. ...................................................................................88 F.2. Spektrum a vzorec látky: isobornyl acetáte. ............................................................................88 F.3. Spektrum a vzorec látky: limonene..........................................................................................89 F.4. Spektrum a vzorec látky: camphor...........................................................................................89 F.5. Spektrum a vzorec látky: terpinene..........................................................................................90 F.6. Spektrum a vzorec látky: terpinolene.......................................................................................90 F.7. Spektrum a vzorec látky: 3-carene...........................................................................................91 F.8. Spektrum a vzorec látky: eucalyptol........................................................................................91

71

10 PŘÍLOHY

A.1.

Anýzový plod.

72

A.2.

Anýzová droga v detailu.

73

A.3.

Vyznačené lokality odebraných vzorků – smrku.

74

A.4.

Vyznačené lokality odebraných vzorků – borovice.

75

A.5.

Vyznačené lokality odebraných vzorků – jedle.

76

B.1. Extrakce jehličí.

B.2. Extrakce mechů.

77

B.3. Filtrace.

B.4. Odpařování extrahovadla. 78

B.5.

Sušení dusíkem.

B.6. Vialka, extrakt jehličí – Smrk (Stříbrnice, paseky – Chřiby), ethanol, objem 10 ml.

B.7. Vialka – extrakt mechu – Ploník (Dětřichov), ethanol, objem 1 ml.

79

C.1.

Chromatografická deska – jedle.

80

C.2.

Chromatografická deska – mechy.

81

C.3.

Chromatografická deska – mechy, UV – 366 nm.

C.4.

UV box Camag fy MANEKO.

82

C.5. Chromatografické desky – standardy, extrakční činidlo ethanol, (zleva: Cardamom oil, Origanum oil, Anise oil, Rosemary oil), objem 10 µl a 20 µl.

83

C.6. Chromatografické desky – standardy, extrakční činidlo petrolether, (zleva: Origanum oil, Cardamom oil, Anise oil, Rosemary oil), objem 10 µl a 20 µl.

84

D.1.

Adsorpce SPME vlákna.

D.3.

D.2.

Desorpce SPME vlákna.

Plynový chromatograf.

85

E.1.

Destilační nástavec podle Českého lékopisu 2002.

86

E.2.

Destilační aparatura.

87

F.1.

Spektrum a vzorec látky: alpha-pinene.

F.2.

Spektrum a vzorec látky: isobornyl acetáte.

88

F.3.

Spektrum a vzorec látky: limonene.

F.4.

Spektrum a vzorec látky: camphor

89

F.5.

Spektrum a vzorec látky: terpinene

F.6.

Spektrum a vzorec látky: terpinolene

90

F.7.

Spektrum a vzorec látky: 3-carene

F.8.

Spektrum a vzorec látky: eucalyptol

91

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

Recommend Documents