Vliv sericinů na kvalitu hedvábného vlákna

Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích Přírodovědecká fakulta Katedra medicínské biologie

Bc. Barbora Sedláčková

Vliv sericinů na kvalitu hedvábného vlákna Magisterská diplomová práce

Vedoucí práce: Prof. RNDr. František Sehnal, CSc. České Budějovice, 2009

Sedláčková, B. (2009): Vliv sericinů na kvalitu hedvábného vlákna [The effect of sericines on quality of silk fibre], Mgr. Thesis in Czech – 67 p., Faculty of Biological Sciences, University of South Bohemia, České Budějovice, Czech Republic.

Annotation: The silk produced by caterpillars is a composite polymer of several proteins. H-fibroin, L-fibroin and P25 glycoprotein form the silk filament, the inner sericines join the fillaments and the surface sericines glue the fibers together when a cocoon is spun. Composition of silk filaments seems to remain identical during the development, as indicated by sustained expression of the L-fibroin, P25 and H-fibroin genes. However, the change in fiber function occurs concurrently with a transition of the expression profile of the sericine genes. The study demonstrates that silk fiber properities are changed throughout larval life of Galleria mellonella.

Finanční podpora: Grant ME 907 programu Kontakt „Integrovaný výzkum hmyzího hedvábí umožněný mezinárodní spoluprací“. Magisterská práce byla vypracována v Entomologickém ústavu Biologického centra AV ČR a v laboratořích Department of Biology na University of California v Riverside s použitím přístrojů těchto pracovišť.

Prohlašuji, v souladu s §47b zákona č. 111/1998 Sb. v platném znění souhlasím se zveřejněním své diplomové práce, a to v nezkrácené podobě elektronickou cestou ve veřejně přístupné části databáze STAG provozované Jihočeskou univerzitou v Českých Budějovicích na jejích internetových stránkách.

Prohlašuji, že jsem předloženou magisterskou diplomovou práci vypracovala samostatně, pouze s použitím uvedené literatury.

V Českých Budějovicích dne 30. dubna 2009

….................................... Barbora Sedláčková

Moje poděkování patří Prof. RNDr. Františku Sehnalovi, CSc. za odborné vedení této práce a pracovníkům jeho laboratoře. Dále bych chtěla poděkovat Prof. Cheryl Y. Hayashi a Matthew A. Collinovi, oba Department of Biology, University of California, Riverside za milé přijetí a umožnění práce v jejich laboratořích, Ing. Oxaně Habuštové PhD. za poskytnutí prostor na přípravu vzorků, pracovníkům laboratoře elektronové mikroskopie pod vedením Ing. Jany Nebesářové, CSc., v neposlední řadě děkuji také Bc. Davidu Markovi za velkou pomoc při statistickém hodnocení výsledků. Oceňuji možnost práce v Entomologickém ústavu Biologického centra Akademie věd ČR a v laboratořích Department of Biology na University of California v Riverside.

Obsah 1 Úvod .............................................................................................................................. 6 2 Literární přehled – základní informace k problematice ......................................................... 7 2.1 Hedvábí .................................................................................................................... 7 2.1.1 Syntéza a sekrece hedvábí u housenek ................................................................ 7 2.1.2 Struktura hedvábného vlákna .............................................................................. 7 2.1.3 Hedvábnictví – produkce a využití hedvábí člověkem ........................................... 10 2.1.4 Fyzikální vlastnosti hedvábí ............................................................................... 11 3 Materiál a metodika ....................................................................................................... 12 3.1 Modelové organismy ................................................................................................ 12 3.1.1 Chov Galleria mellonella .................................................................................... 12 3.1.2 Stáří larev a výběr larev Galleria mellonella ......................................................... 12 3.1.3 Chov Bombyx mori ........................................................................................... 14 3.1.4 Stáří a výběr larev Bombyx mori ........................................................................ 14 3.1.5 Juvenoidy........................................................................................................ 15 3.2 Měření mechanických vlastností hedvábí..................................................................... 15 3.2.1 Metodika odběru a uchycení vlákna ................................................................... 15 3.2.2 Měření průměru vláken..................................................................................... 16 3.2.3 Mechanické vlastnosti vláken............................................................................. 18 3.2.4 Tensile testing – namáhání v tahu ..................................................................... 19 3.3 Statistika................................................................................................................. 21 3.3.1 Analýza variance .............................................................................................. 21 3.3.2 Kruskal-Wallisův test ........................................................................................ 22 3.3.3 T-test a Mann-Whitney U test............................................................................ 23 3.4 Elektronová mikroskopie ........................................................................................... 23 3.4.1 Transmisní elektronová mikroskopie (TEM)......................................................... 23 3.4.2 Skenovací elektronová mikroskopie (SEM) .......................................................... 25 4 Výsledky....................................................................................................................... 26 4.1 Statistické vyhodnocení ............................................................................................ 26 4.1.1 Fyzikální vlastnosti vláken Galleria mellonella ...................................................... 28 4.1.2 Fyzikální vlastnosti vláken Bombyx mori ............................................................. 43 4.2 Elektronová mikroskopie ........................................................................................... 48 4.2.1 TEM................................................................................................................ 48 4.2.2 SEM................................................................................................................ 48

5 Diskuse ........................................................................................................................ 51 5.1 Měření fyzikálních vlastností hedvábí.......................................................................... 51 5.1.1 Smysl měření................................................................................................... 51 5.1.2 Měření hedvábných vláken housenek ................................................................. 52 5.2 Analýza výsledků měření........................................................................................... 53 5.2.1 Průměr vlákna ................................................................................................. 53 5.2.2 Maximální napětí.............................................................................................. 53 5.2.3 Relativní deformace.......................................................................................... 54 5.2.4 Houževnatost .................................................................................................. 54 5.2.5 Tuhost ............................................................................................................ 54 5.3 Pravděpodobné příčiny vývojových změn vlastností vlákna ........................................... 55 6 Závěry.......................................................................................................................... 57 7 Literatura a zdroje ......................................................................................................... 58 7.1.1 Literatura ........................................................................................................ 58 7.1.2 Internetové zdroje ........................................................................................... 61 8 Přílohy

1 Úvod Hmyz vytváří celou řadu produktů, které mohou sloužit k užitku člověka. Mezi nejdůležitější patří hedvábí, med, vosky, laky a jedy. Člověk je na hmyzu také nepřímo závislý jako na opylovačích, v některých částech světa je hmyz také důležitou složkou lidské potravy. Hmyz je důležitým modelovým objektem základního i aplikovaného výzkumu (Kodrík, 2004). Hedvábí je popisováno jako polymer proteinů, který je spřádán do vláken. Tuto schopnost má řada zástupců terestrických členovců, např. pavouci, roztoči, snovatky a také larvy několika řádů hmyzu s proměnou dokonalou např. motýlů, chrostíků, včel, pilatek, pakomárů aj. (Craig, 2003). Schopnost produkovat hedvábí se vyvinula u několika hmyzích rodů (Sehnal et Akai, 1990; Craig, 1997). Hedvábí je produkt u hmyzu relativně rozšířený, produkovaný ve žlázách různého původu, ale nejčastěji se s ním setkáváme u larev chrostíků a motýlů. Nejznámějším zástupcem, který produkuje komerčně využitelné hedvábí je bourec morušový (Bombyx mori) (Kodrík, 2004). Do Evropy se hedvábí dostalo z Číny, kde bylo hedvábnictví založeno. Hedvábná stezka byla starověká trasa, která začínala v Číně a pokračovala přes centrální Asii až do Egypta a Evropy. Obchod po hedvábné stezce byl důležitým faktorem při rozvoji velkých starověkých civilizací v Číně, Mezopotámii, Persii, Indii a Itálii a pomohl položit základy moderního světa (Hyde, 1984). Využití pavoučích vláken není novinkou pro tradiční kultury, polynéští rybáři používali vlákna pavučin jako rybářský vlasec a domorodci na Nové Guiney si dávají pavučiny na hlavu, aby se chránili před slunečními paprsky (Vesmír.info, 2008). S objevením umělých vláken silonu, nylonu atd. začátkem 40. let 20. století klesl o hedvábné vlákno zájem, ale produkce hedvábí má několika tisíciletou tradici a v zemích, které patří k jeho tradičním producentům (Čína, Japonsko, Korea) je i přes existenci umělých vláken zcela nezastupitelné. Jak se ale časem ukázalo, hedvábí má unikátní vlastnosti a získalo si proto znovu oblibu. Bílkoviny přírodního hedvábí se uplatňují v různých oblastech medicíny (chirurgické nitě, náhrady pojiv, zmírnění imunitní odpovědi, potlačení infekcí) a kosmetiky (Sehnal, 2008). Využití vychází ze znalostí jednotlivých komponent hedvábí. Osa vlákna je tvořena třemi bílkovinami, jejichž složení se během vývoje nemění, zatímco lepivý povrch je ze sericinů, jejichž složení se mění (Fedič et al., 2002).

Cílem práce je zjistit, jak tyto změny ovlivní fyzikální vlastnosti vlákna, potažmo zjistit, které sericiny jsou pro pevnost, pružnost a roztažnost vlákna nejlepší.

6

2 Literární přehled - základní informace k problematice 2.1 Hedvábí 2.1.1 Syntéza a sekrece hedvábí u housenek Larvy většiny Lepidopter sekretují vláknité proteiny, které jsou souhrnně označovány jako hedvábí. U některých druhů obsahují esenciální aminokyseliny a intenzita produkce hedvábí je závislá na jejich přítomnosti v potravě (Jindra et Sehnal, 1989). Hedvábí je u larev motýlů produkováno ve snovacích žlázách. Tubulární snovací žlázy (obr. 2.1) jsou přeměněné labiální žlázy, jejichž původní funkcí byla produkce slin a jsou dobře přizpůsobeny své nové funkci. Hedvábí je využíváno na budování chodbiček nebo zámotků, které larvám slouží jako úkryt, a na tvorbu kokonů, které chrání vyvíjející se kuklu (Fedič et al., 2002). Časový průběh produkce hedvábí během larválního vývoje a jeho množství jsou u různých druhů velmi odlišné (Sehnal et Akai, 1990). Snovací žlázy jsou morfologicky i funkčně rozděleny na zadní (posterior – PSG), střední (middle – MSG) a přední (anterior – ASG) oddíl. Na rozdíl od zadního a středního oddílu nevytváří přední oddíl žádné strukturální bílkoviny hedvábí, ale je důležitý pro přeměnu hustého roztoku bílkovin v pevné vlákno. Tento proces není zcela objasněn, důležitá je resorpce vody a změna iontových poměrů. Přední oddíly pravé a levé snovací žlázy se spojují a ústí ven snovací bradavkou. Ta funguje jako lis, který housenka uzavírá nebo otevírá. Dotykem bradavky se hedvábí přichytí a při oddálení hlavy od podložky vzniká vlákno. Při předení kokonu je tvorba vlákna kontinuální a nepřerušené vlákno je u některých druhů více než kilometr dlouhé. Činnost snovacích žláz je řízena hormonálně. Uplatňují se zde juvenilní hormony, ekdysteroidy i neurohormony. Po aplikaci juvenilního hormonu či juvenoidu dochází k primární inhibici snovacích žláz, ale aplikovaný hormon prodlouží larvální instar, a tedy i žír larev, snovací žlázy jsou déle udržovány v tzv. akumulační fázi, kdy hromadí více živin a po odeznění vlivu hormonu produkují větší larvy se zvětšenými snovacími žlázami více hedvábí. Těchto poznatků se využívá v komerční produkci hedvábí, kdy jsou larvy vhodného stáří ve velkochovech ošetřeny juvenoidy, které zvyšují produkci hedvábí asi o 10 % (Kodrík, 2004). 2.1.2 Struktura hedvábného vlákna Hedvábí produkované housenkami je polymer složený z proteinů pocházejících z dvojice snovacích žláz (Fedič et al., 2002). Těžký řetězec fibroinu (H-fibroin; heavy chain fibroin) se spojuje s lehkým řetězcem (L-fibroin; light chain fibroin) a P25 glykoproteinem a tvoří hedvábný filament. Tyto tři proteiny jsou produkovány a sestavovány v zadním oddíle snovacích žláz a ve formě gelu se hromadí ve středním oddíle, kde jsou obaleny vrstvou sericinového gelu. Fibroinové sloupce (budoucí filamenty) a nad nimi uložené sericinové vrstvy jsou skladovány v lumen žlázy několik dní až týdnů jako separované a vysoce koncentrované gely. Během předení jsou proteiny

7

z PSG přeměňovány na pevný a pružný filament, ve kterém jsou H-fibroin, L-fibroin a P25 zastoupeny v poměru 6:6:1 (Inoue et al., 2000; 2004). Pár filamentů (z pravé a levé žlázy) je ihned po vypředení spojen v jedno vlákno pomocí „vnitřních“ sericinů (obr. 2.2 a 2.3). Povrchové sericiny lepí vlákna dohromady během předení kokonu (Michaille et al., 1986).

Obr. 2.1: Snovací žlázy Lepidopter (podle Akai, 1965)

f s Obr. 2.2: Příčný řez hedvábným vláknem f – fibroinové filamenty; s – sericinová vrstva

8

Obr. 2.3: Příčný řez hedvábným vláknem kokonu Bombyx mori (Akai, 2000) pf – pár filament; f – fibroinové filamenty; s – sericinová vrstva

Středová část hedvábného vlákna (fibroiny, P25) Shimura et al. (1976), Gamo et al. (1977) a další objevili, že osa hedvábí, tj. dva filamenty, jsou sekretem zadního oddílu snovacích žláz (PSG) Bombyx mori a obsahují dvě hlavní složky, které jsou od sebe oddělitelné rozštěpením disulfidických můstků. Později byla objevena třetí složka nazvaná P25. PSG sekretuje velké množství vysokomolekulárního (200 – 500 kDa) H-fibroinu, nízkomolekulárního L-fibroinu a chaperoninu P25, který se objevuje ve dvou formách (27 a 31 kDa), které se liší obsahem cukrů (Tanaka et al., 1999). L-fibroin je připojen ke karboxylovému konci H-fibroinu pomocí disulfidického můstku, který je zásadní pro sekreci obou komponent (Takei et al., 1987). Fibroin má charakteristickou strukturu i aminokyselinové složení, které zajišťuje jeho obrovskou pevnost a pružnost (Žurovec et Sehnal, 2002). Sericiny Další složkou hedvábí jsou bílkoviny sericiny, syntetizované ve středním oddíle žláz. Fungují jako tmel, postupně se nabalují na fibroin, který postupuje ze zadního do středního oddílu žláz, zpevňují ho a později se také podílí na stmelování fibroinových filamentů z levé a pravé snovací žlázy (Kodrík, 2004). Vysoký obsah serinu (16 – 42 %) a velký podíl dalších hydrofobních aminokyselin (Komatsu, 1975; Gamo et al., 1977) činí povrchové sericiny rozpustné v horké alkalické vodě (Fedič et al., 2002). Studie prováděné na Bombyx mori ukazují, že distální, centrální a proximální části MSG produkují sericiny o molekulové hmotnosti 150 kDa, 400 kDa a 250 kDa (Takasu et al., 2002). Z hedvábí bylo získáno nejméně šest (Gamo et al., 1977) ale až patnáct (Sprague, 1975) typů sericinů, některé jsou zřejmě ze stejných peptidů lišících se stupněm glykosylace. Většina těchto 9

sericinů nebyla přiřazena ke specifickým genům. Protože každá MSG část produkuje rozdílnou směs sericinů, liší se jejich vrstvy kolem vláken. Zastoupení sericinů v sekretovaném hedvábí dosahuje 20 – 30 % váhy kokonu u komerčního producenta hedvábí bource morušového (Michaille et al., 1986). Nestrukturální komponenty hedvábí Kromě fibroinu se v zadním oddíle žláz syntetizuje několik bílkovin o malé molekulové hmotnosti, jejichž funkce není zcela jasná, zdá se, že hrají roli při přeměně tekutého fibroinu na pevné vlákno. Některé z těchto bílkovin vykazují aktivitu inhibitoru proteáz a pravděpodobně tak chrání hedvábí proti mikrobiálnímu rozkladu (Nirmala et al., 2001). 2.1.3 Hedvábnictví – produkce a využití hedvábí člověkem Archeologické nálezy svědčí o tom, že kokony byly sbírány již v době kamenné, ale naši předci pravděpodobně využívali kukly jako potravu, ale ne kokony jako zdroj hedvábí. Zpracování kokonů pro textilní výrobu bylo objeveno kolem roku 2700 př.n.l. v Číně, kdy podle legendy spadl kokon bource do čaje princezny Hsi Ling Shi, která tak mohla pozorovat jak se z plovoucího kokonu uvolňuje vlákno (Park et al., 2002). Splétáním několika vláken pak vznikla hedvábná nit, resp. tkanina. Číňané přísně střežili umění hedvábnictví stovky let a v případě vyzrazení postupu zpracování kokonů by následoval trest smrti. Během let se toto třpytivé vlákno stalo měřítkem hodnoty a mělo cenu zlata. Stále více lidí znalo tajemství technologie, a tak se při úpadku císařství na začátku čtvrtého století vajíčka bource dostala do Korey a později i do Japonska (Hyde, 1984). K obchodování s Evropou sloužila, jak už bylo řečeno, Hedvábná stezka. Komerční hedvábí je získáváno převážně z domestikovaného bource morušového

(Bombyx mori), ale částečně i z jiných druhů motýlů (Peigler, 1993). Výroba hedvábí sestává ze čtyř částí: pěstování morušovníku, chov bourců morušových, namotávání hedvábných nitek ze zámotku na cívky a tkaní hedvábných látek. Při přípravě komerčního surového hedvábí se využívá rozpustnosti sericinů. Kokony se povaří ve vodě, povrchové sericiny se rozpustí a 4 – 7 uvolněných vláken se sericiny na jejich povrchu slepí v nit, která se používá na výrobu hedvábných tkanin. Surové hedvábí se skládá převážně z fibroinu. Z jednoho kokonu bource morušového lze získat vlákno o délce 300 – 1200 m. Člověkem je hedvábí využíváno především v oděvnictví, ale má použití i v průmyslu, medicíně, farmacii a kosmetice. Využití fibroinu Hedvábné vlákno má výborné mechanické vlastnosti, které z něj před vynalezením nylonu udělalo mj. materiál pro výrobu padáků (Sponner, 2007). Použití přírodních hedvábných vláken jako šití v chirurgii ukázalo, že jsou velmi dobře snášena imunitním systémem. Fibroin byl proto také vybrán jako látka pro růst buněk a tkání. Materiály založené na fibroinu a zpracované do

10

filmů, vláken, membrán a hydrogelů podporují proliferaci a diferenciaci různých typů buněk. Jsou považovány za ideální materiál pro regeneraci tkání a práci s kmenovými buňkami (Wang et al., 2006). Využití sericinů Sericiny představují objemný odpad při přípravě textilních vláken. Odhaduje se, že světové zpracování kokonů poskytuje asi 50 000 tun sericinů ročně (Zhang, 2002). Používání sericinových extraktů pro kosmetické účely má dlouholetou tradici založenou na základě praktických zkušeností. Dnes víme, že sericiny zvlhčují (Padamwar et al., 2005), absorbují UV záření, mají antioxidační účinky a některé mají též antimikrobiální vlastnosti (Sarovat et al., 2003; Zhaorigetu et al., 2003) pro které jsou přidávané do pleťových krémů a produktů péče o vlasy. Tvrdí se, že sericiny předcházejí vzniku vrásek a dalším příznakům stárnutí pleti (Padamwar et Pawar, 2004). 2.1.4 Fyzikální vlastnosti hedvábí Vlastnosti hedvábí, které jsou důležité pro textilní průmysl (např. pevnost a pružnost), byly měřeny u různých druhů, ale přispění sericinů těmto vlastnostem nebylo adekvátně stanoveno. Měření byla většinou prováděna na hedvábných vláknech získaných uvolněním z kokonu v horké alkalické vodě. Jednotlivá vlákna jsou uvolňována, když je rozpuštěna vnější sericinová vrstva, zatímco vnitřní vrstva přetrvává a drží fibroinové filamenty pohromadě (Sehnal et Žurovec, 2004). Více k měřeným veličinám v kapitole Materiál a metodika.

11

3 Materiál a metodika 3.1 Modelové organismy Jako modelové organismy byly použity larvy zavíječe voskového (Galleria mellonella) a bource morušového (Bombyx mori). 3.1.1 Chov Galleria mellonella Larvy zavíječe voskového se chovají na uměle připravované půdě. Výhodou zavíječe voskového je jeho kontinuální chov ve standardních laboratorních podmínkách, larvy se chovají při 30 °C a trvalé tmě. Půdu připravíme tak, že sypké složky (tabulka 3.1) dáme do misky a zahřejeme asi na 80 °C. Obdobně rozehřejeme vosk a odděleně med s glycerinem. Suchou směs zalejeme voskem a promícháme, potom přidáme med s glycerinem a opět důkladně promícháme. Hotovou potravu uchováváme v chladu při 15 °C. Tabulka 3.1: Složení půdy pro zavíječe voskového Složka

Hmotnost v g

Složka

Hmotnost v g

Kukuřičný šrot

660

Sušené kvasnice

165

Pšeničný šrot

330

Včelí vosk

525

Pšeničná mouka

330

Med

330

Sušené mléko

330

Glycerin

330

3.1.2 Stáří a výběr larev Galleria mellonella Čerstvě svlečené housenky posledního (VII.) instaru se poznají podle velikosti hlavové schránky a zbarvení. Čerstvě svlečené housenky jsou bílé, ale během čtyř hodin ztmavnou v důsledku melanizace exokutikuly. Nad každou epidermální buňkou je sloupec nepoddajné exokutikuly, mezi sloupce se ukládá světlá a poddajná endokutikula. Při pohledu pod mikroskopem se exokutikula jeví jako tmavé terčíky na světlém pozadí. Po svlečení jsou terčíky u sebe a proto jsou housenky tmavě zbarvené. Když housenky rostou, zvětšují se ukládáním endokutikuly mezery mezi terčíky a housenky se při zběžném pohledu jeví jako šedé. Pátý den posledního instaru přestávají housenky přijímat potravu a hledají místo k předení kokonu (wandering stage). Na začátku předení je nazýváme pohyblivé prepupy (6,5. den posledního instaru). Ty se po dokončení kokonu mění na takzvané nepohyblivé prepupy (farátní kukly), které se osmý den svlékají do kukel. Pro naše pokusy byly housenky roztříděny do skupin podle věku. Aby byl zajištěn dostatek vzorků pro statistické vyhodnocení, byla každá skupina složena z jedné nebo více podskupin. V první sadě bylo hodnoceno 187 vzorků rozdělených do 6 skupin. Pokus byl opakován nezávisle na první sadě. Celkem 90 vzorků druhé sady bylo rozděleno do 4 skupin, některá měření nebyla

12

opakována (tabulka 3.2). Vlákna první sady byla odebírána v červenci a měřena v prosinci 2007, vzorky druhé sady byly odebrány v říjnu a měřeny v listopadu 2008. První sada vzorků Galleria mellonella (2007) G1a

Skupina G1a zahrnuje čerstvě svlečené housenky do posledního instaru (VII/1), pracovně označené jako GB, hmotnost larev v této skupině byla 145 ± 30 mg.

G2a

Do skupiny G2a patří housenky posledního instaru 36 hodin po svlečení (VII/2) označené původně jako GC, hmotnost larev v této skupině byla 169 ± 25 mg.

G5a

Ve skupině G5a se jedná o housenky 5. den posledního instaru (VII/5), hmotnost larev byla 280 ± 25 mg v podskupině GF a 245 ± 31 mg v GH.

G7a

Do skupiny G7a patřily housenky 7. dne posledního instaru (VII/7), předoucí středně silné kokony, hmotnost larev v této skupině byla 372 ± 27 mg. Hedvábí odebrané housenkám bylo označeno jako GA.

G5a-J

Ve skupině G5a-J byly housenky kontaminované juvenoidem ZR 515 (1% roztok v acetonu, topicky aplikovány 2 µl na jedince) během jednoho dne po svlečení do posledního instaru a znovu za 24 hodin dávkou 1 µl na jedince. Hedvábí označené GJ bylo odebráno 5. den posledního instaru (VII/5). Housenky v té době ještě nebyly svlečené a jejich hmotnost byla 270 ± 41 mg.

G6a-J

Ve skupině G6a-J byly housenky ošetřené juvenoidem stejně jako skupina G5a-J, ale hedvábí označené GL bylo odebráno až 6. den posledního instaru (VII/6). Housenky nebyly svlečené a jejich průměrná hmotnost byla 268 ± 21 mg.

Druhá sada vzorků Galleria mellonella (2008) G1b

Skupina G1b zahrnuje čerstvě svlečené housenky do posledního instaru (VII/1), označené jako E, hmotnost larev v této skupině byla 199 ± 31 mg. Housenky jsou stejného stáří jako ve skupině G1a první sady.

G5b

Do skupiny G5b patří housenky 5. den posledního instaru (VII/5), hmotnost larev byla 261 ± 11 mg. Odebrané hedvábí je označováno jako F a odpovídá skupině G5a.

G7b

Do skupiny G7b jsou zařazeny housenky předoucí středně silné kokony (VII/7), hmotnost larev v této skupině byla 220 ± 16 mg. Hedvábí odebrané housenkám je označováno jako K. Srovnatelné se skupinou G7a.

G5b-J

Ve skupině G5b-J jsou housenky 5. den posledního instaru s aplikovaným juvenoidem (1% ZR 515) ve dvou dávkách 24 hodin po sobě: 2 µl a druhá 1 µl na jedince. Housenky nebyly do odběru svlečené, za další 3 dny se však polovina svlékla do nadpočetného larválního instaru a druhá polovina vypředla kokony. Hmotnost larev v době odběru hedvábí byla 382 ± 51 mg; odebrané hedvábí je označováno jako M. Odpovídá dřívější skupině G5a-J.

13

Tabulka 3.2: Přehled doby odběru vláken jednotlivých skupin Galleria mellonella Skupina

G1a; G1b

G2a

G6a-J

G7a; G7b

Odběr Hodiny Dny

36 1

2

172 3

4

5

6

7

8

G5a; G5a-J;G5b; G5b-J

3.1.3 Chov Bombyx mori Larvy bource morušového jsou monofágní a živí se jen listím moruše bílé (Morus alba L.) nebo černé (Morus nigra L.). Kromě čerstvého morušového listí je možné bource morušové chovat na umělé potravě. Její základ tvoří prášek ze sušeného morušového listí a agar, doplněný o vitaminy a minerály. Vyrábí ji např. Nippon Nosan Co., Ltd., Yokohama, Japan. Pouze larvální stádia rapidně rostou a konzumují listy moruše, ostatní vývojová stadia potravu nepřijímají. Normální teploty pro chov bourců jsou mezi 20 – 28°C. Velkochov bource morušového má i své nevýhody, hlavně snadné šíření nemocí. 3.1.4 Stáří a výběr larev Bombyx mori Životní cyklus bource trvá 6 – 8 týdnů v závislosti na rase a podmínkách chovu. Existuje pět larválních instarů, mezi kterými se housenky svlékají. Larvy, které se vylíhnou, jsou drobné, černé či tmavě hnědě zbarvené, pokryté jemnými štětinkami, které do 24 hodin opadají. Ihned po vylíhnutí hledají potravu. Toto období trvá 3 dny a čtvrtý den se začínají svlékat. Období druhého instaru trvá 2 dny, třetí instar trvá 3 až 4 dny, čtvrtý 4 až 5 dní a váha housenky vzroste až 380krát. Období pátého instaru trvá 6 až 8 dní, váha larev vzroste 10 000krát od doby co se vylíhly. Housenky dorůstají délky 6 cm, po ukončení žíru krátce migrují (hledají vhodné místo k uchycení kokonu) a pak se začínají zapřádat. Zapřádání trvá 2 až 3 dny a za další 2 až 3 dny dojde k přeměně na kuklu uvnitř kokonu (Kislingová, 2006). Pro naše pokusy jsem housenky opět rozdělila do skupin podle stáří. Na rozdíl od zavíječe voskového začínají housenky bource morušového příst hedvábí až po ukončení žíru. Ani uměle se mi nepodařilo odebrat vzorky hedvábí od žeroucích housenek. Po ukončení žíru byly odběry možné, avšak vzorky odebrané 7. den, tj. těsně po ukončení žíru (podskupiny BS a BT) nebyly měřeny, protože odebraná vlákna byla nekvalitní, s nerovnoměrnými kapičkami sericinu na povrchu (zjištěno použitím polarizačního mikroskopu). Měřeno bylo pouze 48 vzorků rozdělených do dvou skupin.

14

Vzorky Bombyx mori (2008) BW

První skupina BW (wandering) zahrnuje housenky asi 8. den posledního instaru po ukončení žíru. Hedvábí je označeno stejně jako skupina BW, hmotnost larev byla 1615 ± 53 mg.

BK

Do skupiny BK patří housenky předoucí slabé kokony (asi 1 den předení), označené také BK, hmotnost larev v této skupině byla 896 ± 69 mg.

3.1.5 Juvenoidy Bioanalogy juvenilního hormonu, které mají i úplně odlišnou strukturu a chemické složení, ale stejné účinky jako juvenilní hormony nazýváme juvenoidy. Některé juvenoidy (methopren, hydropren, phenoxycarb, pyriproxyphen) jsou prodávány komerčně a využívají se především k hubení a kontrole populací hmyzích škůdců, někdy však ke zcela specifickým účelům (zvýšení produkce hedvábí u bource morušového). Mechanismus kontroly hmyzích populací juvenoidy spočívá v tom, že juvenoidy zasahují do vyvážených a přesně řízených hormonálních poměrů v těle. Způsobují tak poruchy svlékání, vznik přechodných forem neschopných života nebo nadpočetných instarů, zasahují do reprodukce. Výhody juvenoidů spočívají v tom, že tyto látky jsou specifické nejen pro hmyz, ale i pro určitý druh nebo jeho stadium a rychle se v přírodě rozkládají (Kodrík, 2004). Použitý juvenoid methopren, též nazývaný altosid nebo ZR 515, byl rozpuštěn v acetonu a 1% roztok aplikován na povrch těla v odstupu 24 hodin. První dávka byla 2 µl a druhá 1 µl roztoku na jedince.

3.2 Měření mechanických vlastností hedvábí Odebírání hedvábných vláken a jejich další měření jsem prováděla podle metodiky popsané v práci Blackledge et al. (2005). Vlákna byla odebírána v Biologickém centru AV ČR, vlastní měření probíhala během stáží v laboratoři Prof. Cheryl Hayashi na University of California, Riverside. 3.2.1 Metodika odběru a uchycení vlákna Pro odběr a uchycení vlákna jsou používány papírové držáky černé barvy o velikosti 75 x 25 mm se dvěma otvory (23 x 10 mm), přes které je vlákno nataženo. Vlákno je na držák fixováno pomocí kyanoakrylátového (vteřinového) lepidla, které musí asi hodinu schnout.

15

Příprava pro tensile testing (tahové testování) Hlava vybrané housenky je zlehka přiložena na horní okraj papírového držáku, do té doby než se hedvábné vlákno lepivým povrchem k držáku přichytí. Některé housenky se přichytí okamžitě, jindy je úspěšný druhý odběr provedený za několik minut. Po uchycení vlákna je housenka lehce tažena směrem dolů podél nakloněného držáku rychlostí asi 75 mm (délka držáčku) za 3 sekundy. Uprostřed je vlákno rotováno dorso-ventrálním otočením předoucí larvy. Na dolním konci držáku je hlavička housenky opět jemně přitlačena, aby se vlákno přichytilo i na druhém konci. Vlákno je fixováno pomocí kyanoakrylátového lepidla. Na držák je vždy připevněno jedno vlákno (obr. 3.1). Příprava pro transmisní elektronový mikroskop Vlákna jsou namotávána přes kratší stranu držáku, co nejblíže vedle sebe, namotaná jako na cívku, na obou koncích držáčku jsou vlákna opět přilepena pomocí vteřinového lepidla. Příprava pro skenovací elektronový mikroskop Vlákna jsou natahována přes kratší stranu držáku (jako pro transmisní mikroskop), cca pět vláken na jeden otvor (obr. 3.1). Vlákno není rotováno, ale jinak postup odpovídá přípravě vláken pro tensile testing.

A

B

Obr. 3.1: Způsob upevnění hedvábného vlákna na papírový držák A - pro tensile testing; B - pro skenovací elektronový mikroskop

3.2.2 Měření průměru vláken Vlákna jsou nejprve pozorována pomocí polarizačního mikroskopu (Leica DMLB, McBain instruments) při zvětšení 1000krát. Vlákno je oválné (obr. 3.2) a proto je pro zjištění plochy průřezu vlákna nutné měřit délku dlouhé i krátké osy oválu. Vedle vlákna (dva fibroinové filamenty a sericinový obal) jsem měřila i filamenty, které jsou na průřezu také oválné (obr. 3.2). Při pohledu na dlouhou osu vlákna je vidět krátká osa obou filamentů a při pohledu na krátkou osu vlákna je vidět dlouhá osa jednoho z filamentů. Místa, kde je možno vlákno pozorovat kolmo na dlouhou nebo krátkou osu jsou pečlivě vybrána a zachycena digitálním fotoaparátem (Canon

16

PowerShot S40). Díky přetočení housenky při odběru vlákna je možné najít pohledy na obě osy. Každá osa je měřena na různých částech vlákna nejméně třikrát. Fotografie jsou pořizovány s rozlišením 180 dpi (pixelů na palec) a délky os vlákna i filamentů jsou následně měřeny pomocí programu ImageJ (Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997 – 2008). Při měření jsou pomocí úseček označena místa měření os filamentů i celého vlákna (obr. 3.3 a 3.4). Měří se vždy na třech místech každého preparátu. Z naměřené délky úseček v pixelech se pomocí přepočítávacího faktoru (93,588) vypočtou délky os filamentů a vlákna v µm. Výsledky měření jsou převedeny na plochu průřezů filamentů a vlákna.

d

k

f s Obr. 3.2: Vzájemné postavení fibroinových filament v hedvábném vlákně d – dlouhá osa vlákna; k – krátká osa vlákna; f – fibroinové filamenty; s – sericinová vrstva

Obr. 3.3: Pohled na krátkou osu vlákna (vzorek GA 5.5) A - úsečka měřící delší osu fibroinového filamentu; B – úsečka měřící krátkou osu vlákna (tj. filament a sericinový obal vlákna)

17

Obr. 3.4: Pohled na dlouhou osu vlákna (vzorek GA 1.5) A, B - úsečky měřící krátkou osu filamentů; C – úsečka měřící dlouhou osu vlákna (tj. filamenty a sericinový obal)

3.2.3 Mechanické vlastnosti vláken Mechanické vlastnosti vláken se projevují jako odezva na mechanické namáhání vnějšími silami. Podle působení vnějších sil lze hovořit o namáhání v tahu, tlaku, ohybu a kroucení (Militký, 2008). V našem případě byla vlákna laboratorně testována v tahu. Během mechanického namáhání dochází ke změně tvaru – deformaci, která je závislá na velikosti zatížení, rychlosti a době trvání namáhání. Při zkoušení mechanických vlastností jde většinou o zjištění meze pevnosti. Vlákno je zatěžováno až do destrukce, tj. přetrhu vzorku (Militký, 2008). Výsledkem měření je řada charakteristik, které jsou popsány v následujících odstavcích. Naměřené hodnoty jsou vztahovány na plochu průřezu vlákna, počítanou z počátečního průměru (v případě eliptického průřezu z délky os). Při stanovení tzv. „engineering“ hodnot, se považuje průřez za neměnný během měření, zatímco při měření „true“ hodnot se bere v úvahu zmenšení průřezu při protažení vlákna. Protože průřez (ve skutečnosti rozměry os) nelze během měření kontinuálně sledovat, počítají se změny na základě změn délky vlákna. Předpokládá se, že objem vlákna se nemění, tj. při protažení se zákonitým způsobem zmenší jeho průřez. V této práci uvádím „true“ hodnoty měřených fyzikálních veličin. Mechanické napětí (stress) σ [MPa] Napětí je absolutní síla F [N] přepočítaná na plochu průřezu vlákna S [m2] (v angličtině se používá A; area). Přepočet absolutní síly na napětí se provádí proto, aby bylo možné porovnávat vlákna s různými průměry (Blackledge, 2005) a rozdílné materiály. Napětí do přetrhu vzorku je nazýváno pevností v tahu (Militký, 2008). Maximální mechanické napětí (ultimate stress) odpovídá mezi pevnosti. σ = F / S [MPa] 18

Relativní deformace (strain) ε [mm/mm] Při natahování se vlákno prodlužuje, čili deformuje. Relativní deformace je deformace materiálu zapříčiněná působením napětí. Má-li být deformace různých materiálů srovnávána je ji nutno přepočítat na relativní jednotky. Relativní deformaci do přetrhu zveme tažnost, vyjadřuje se v % počáteční délky (Militký, 2008). εtr = loge (l-l0) [mm/mm] tr – „true“; e - „engineering“; l - délka po natažení; l0 - počáteční délka (podle Blackledge, 2005)

Houževnatost (toughness) [MJ × m-3] nebo [MPa] Houževnatost vyjadřuje odolnost materiálu vůči lomu a zpravidla je charakterizována velikostí mechanické práce, nutné k lomu (Vlach, 2003). Udává spotřebu energie potřebnou k přetržení vlákna. Spočítá se jako plocha pod deformační křivkou (stress-strain curve) (Blackledge, 2005). Jednoduše řečeno, tahová houževnatost je dána velikostí plochy pod tahovým diagramem (Vlach, 2003). Youngův modul pružnosti (Young's modulus) E [GPa] a tuhost (stiffness) Tuhost je fyzikální veličina, která je charakteristická pro každé stlačitelné těleso a vyjadřuje míru odolnosti vůči deformaci způsobené vnější silou. Tuhost zkoumaného materiálu bez ohledu na měřené těleso, se vyjadřuje jako Youngův modul (E), který udává pružnost materiálu při namáhání v tahu. Vypočítá se ze sklonu regrese křivky vyjadřující změny poměru napětí-deformace a to v oblasti lineárního průběhu křivky (úsek mezi body O a P křivky na obr. 3.6). Konec lineárního průběhu vztahu napětí-deformace je bodem, ve kterém se mění mechanické chování vlákna z elastického na viskózní. E = σ / ε [Pa]

3.2.4 Tensile testing – namáhání v tahu Pro testování mechanických vlastností vláken byl používán Nano Bionix® Universal Testing System (MTS Systems Corp.,Oak Ridge, TN, USA), přístroj je softwarově kompatibilní s MS Windows XP. Nano Bionix je schopný získat data z velmi tenkých vláken s rozlišením zatěžování od 50 nN a prodloužení od 35 nm. Jedná se o přístroj s konstantním přírůstkem deformace, tyto přístroje vyvozují napětí ve vzorku posuvem hlavice, která se pohybuje konstantní rychlostí, ale přerušovaně. Přerušování, při konstantním měření délky a napětí, umožňuje přesně zjistit tuhost a pružnost vlákna (Blackledge, 2005). Vstupními údaji jsou zejména upínací délka, rychlost zatěžování a průměr vlákna (Militký, 2008).

19

Papírový držák je upevněn mezi dvě hlavice tak, aby vlákno v jeho otvoru bylo napnuté, ale nevystavené napětí. Boční strany držáku se před začátkem měření odstřihnou, takže jsou hlavice přístroje spojeny jen měřeným vláknem (obr. 3.5). Po spuštění přístroje se hlavice od sebe oddalují. Vlákna jsou natahována rychlostí 1 % deformace za sekundu dokud se nepřetrhnou. Tato rychlost deformace je zvolena proto, aby se zachovala maximální porovnatelnost výsledků, protože stejná rychlost byla použita už u předchozích měření (Blackledge, 2005). Prvotní data jsou transformována do hodnot napětí a relativní deformace, aby bylo možné srovnání vzorků hedvábí s různým průměrem vlákna. Jak již bylo uvedeno měření síly na plochu příčného průřezu vlákna (napětí) dovoluje porovnání relativního zatížení vláken s různým průměrem. Upínací délka (l0) vlákna pro naše měření odpovídá velikosti otvoru v držáku, tj. 23 mm.

Obr. 3.5: Upevnění vlákna mezi hlavice přístroje Nano Bionix

Deformace elastická a plastická Přerušované působení napětí a kontinuální měření délky vlákna umožňuje odlišit elastické (vratné) a plastické (nevratné) deformace. Vratné deformace lze očekávat pouze v oblasti malých sil a deformací, jejich vztah je popisován Hookeovým zákonem a vyjádřen Youngovým modulem pružnosti. Plastické (nevratné) deformace se začínají projevovat za mezí pružnosti (obr. 3.6). Pro plastickou deformaci platí, že rychlost deformace je úměrná působícímu napětí (Militký, 2008).

20

Obr. 3.6: Deformační křivka 0 – počátek; P - mez pružnosti; A - bod destrukce, mez pevnosti 0 - P - oblast elastických deformací; P - A - oblast plastických deformací

3.3 Statistika Ke statickému zpracování hodnot získaných z empirických měření byl použit program SPSS verze 15.0 společnosti SPSS Inc. 3.3.1 Výběr metodiky Počet prvků (N) je ve většině srovnávaných skupin první sady zavíječe poměrně vyrovnaný. Výjimku tvoří larvy 1. dne posledního instaru (skupina G1a), u kterých se odběr hedvábí podařil jen u menšího počtu jedinců. Počet prvků ve skupinách druhé sady je také vyrovnaný, což platí i u dvou samostatně hodnocených skupin bource (tabulka 4.1, 4.2). Vzhledem k povaze shromážděných dat byla pro statistické hodnocení použita analýza rozptylů (ANOVA), resp. obecný lineární model (GLM). V případě GLM je možné uvažovat vliv více než jednoho faktoru, tj. mimo stáří i aplikaci juvenoidu. Všechny testy byly prováděny na 95% intervalu spolehlivost, tzn. s maximální pravděpodobností chyby 5 %. Před samotným testováním hypotéz bylo třeba ověřit splnění požadovaných podmínek, tj. nezávislost dat, jejich normální rozložení a podobné rozptyly dat uvnitř vytvořených skupin. Vzájemná nezávislost dat vyplývá už z povahy jejich sběru. Normální rozdělení bylo ověřeno grafickou metodou z histogramu a provedením Kolmogorov–Smirnovova testu. Homogenita rozptylů byla zjišťována pomocí Levenova testu. Ve většině případů byly tyto podmínky splněny. V případě nesplnění všech podmínek bylo možné spoléhat se na robustnost ANOVA, resp. GLM, vůči nesplnění požadavků

21

normality a homogenity rozptylů, která je při podobné velikosti skupin poměrně značná. Jako potvrzení byl přesto v takovýchto situacích proveden ještě neparametrický Kruskal-Wallisův test, který některé uvedené podmínky nevyžaduje. Pro zachování přehlednosti výsledků jsou u všech veličin uváděny pouze výsledky GLM. Testování pomocí analýzy rozptylů bylo využito u Galleria

mellonella (dvě nezávislé série pokusů v letech 2007 a 2008). Data pro Bombyx mori (rok 2008) jsou rozdělena pouze do dvou skupin a proto zde bylo možné použít hodnocení pomocí jednoduššího t-testu, resp. Mann-Whitney U testu. 3.3.2 Analýza variance Pro porovnání několika souborů dat, v konkrétním případě mechanických vlastností vláken produkovaných housenkami různého stáří, popřípadě ještě s aplikací juvenoidu byla použita analýza variance (angl. Analysis of Variance, ANOVA). Obecně spočívá základní funkce analýzy rozptylu v posouzení hlavních a interakčních efektů kategoriálních nezávislých proměnných na závisle proměnnou kvantitativního typu. Nezávisle proměnné nazýváme faktory. Nejjednodušším případem je analýza rozptylu jednoduchého třídění, kdy analyzujeme efekt jednoho faktoru na závisle proměnnou (Hendl, 2004). To znamená, že jsou pokusné objekty klasifikované (zařazené do skupin) podle jednoho faktoru, proto se tato analýza nazývá one-way ANOVA (Lepš, 1996). V našem případě je ale klasifikačním faktorem stáří housenek a ošetření juvenoidem, proto jsme použili metodu vícefaktorového třídění – obecný lineární model (GLM, General Linear Model). Princip analýzy variance spočívá v porovnání variability uvnitř skupin s variabilitou mezi skupinami (Lepš, 1996). Základní statistikou v analýze rozptylu je F-testovací statistika rozdílnosti skupinových průměrů, pomocí níž se testuje hypotéza, zda průměry ve skupinách určených kombinacemi faktorů se od sebe liší více než na základě působení náhodného kolísání. Testovací F-statistika musí zohlednit rozdílnosti ve výběrových průměrech a zároveň přirozenou variabilitu závisle proměnné.

Aby analýza rozptylu byla validní, musí být splněny následující předpoklady: 1. Všechna měření musí být vzájemně nezávislá uvnitř skupin i mezi skupinami. 2. Měření v každé skupině jsou normálně rozdělená s průměrem µi. 3. Ve všech skupinách mají měření stejný rozptyl kolem průměru.

Obecně lze říci, že největší vliv na validitu F-testu má předpoklad o statistické nezávislosti všech měření. Vůči poruchám ostatních předpokladů je analýza rozptylu poměrně robustní (Hendl, 2004). Síla testu roste s velikostí výběru, s rozdíly mezi skupinami a klesá s variabilitou materiálu uvnitř skupin a s počtem skupin (Lepš, 1996).

22

3.3.3 Kruskal-Wallisův test Data můžeme testovat také pomocí neparametrického testu založeného na pořadí. Jedná se o podobný test jako je F-test a použijeme ho jestliže nemůžeme vycházet z předpokladu, že měření jsou normálně rozdělená. Nulová hypotéza předpokládá, že měření ve skupinách mají stejné mediány (Hendl, 2004). Při tomto testu nejprve přiřadíme každému pozorování jeho pořadí mezi všemi pozorováními bez ohledu na zařazení do skupiny, potom spočteme statistiku (Lepš, 1996). 3.3.4 T-test a Mann-Whitney U test T-test je parametrický test, který používáme pro porovnání svou průměrů, a proto vyžaduje normální rozložení dat. Mann-Whitneyův test je neparametrickou obdobou t-testu. Tento test porovnává každé měření z první skupiny s každým měřením ze druhé skupiny a lze jej použít při narušení normality dat.

3.4 Elektronová mikroskopie Elektronová mikroskopie je metoda umožňující studium mikrostruktury zkoumaných objektů. Mikrostruktura je studována ve vakuu pomocí elektronového svazku, který vzniká emisí elektronů z katody jež jsou dále urychlovány k anodě. Svazek je fokusován vhodně upraveným elektrickým, magnetickým nebo elektromagnetickým polem, aby bylo dosaženo požadovaného zvětšení. Elektronový svazek vytváří obraz interakcemi s pozorovaným preparátem. Podle fyzikální tvorby obrazu dělíme elektronovou mikroskopii na dva základní druhy, transmisní elektronovou mikroskopii a skenovací elektronovou mikroskopii (Bílý, 2007). 3.4.1 Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) Transmisní elektronový mikroskop umožňuje pozorování preparátů do tloušťky 100 nm při vysokém zvětšení a s velkou rozlišovací schopností (Nebesářová, 2001). Elektrony pronikají pozorovaným preparátem a interakcemi s ním jsou odchylovány od původního směru, jímž se pohyboval hlavní svazek. Většina odchýlených elektronů je pomocí clony ze svazku vyloučeno. Obraz je tvořen dopadem převážně neodchýlených elektronů na zobrazovací systém. Zobrazovacím systémem může být stínítko z luminiscenčního materiálu, na kterém se vytvoří kruhový obraz (Bílý, 2007). Pro naše pozorování byl používán TEM JEOL JEM-1010 (JEOL Ltd., Japan) v laboratoři EM, PaÚ AV ČR v Českých Budějovicích.

23

Příprava preparátů pro TEM Vzorky pro transmisní elektronovou mikroskopii nesmí obsahovat vodu, protože v mikroskopu jsou vystaveny vysokému vakuu a z mokrých preparátů by se voda bouřlivě uvolňovala. To by vedlo jednak jejich degradaci a za druhé i ztěžovalo práci urychleným elektronům, které by se srážkami s molekulami vody brzdily. Proto je nutné biologický materiál, který obsahuje vysoké procento vody, před pozorováním v mikroskopu upravit tak, aby žádnou vodu neobsahoval. Druhou podmínkou, která vyplývá z nízké penetrační schopnosti elektronů, je, že tloušťka preparátu nesmí překročit 100 nm. Silnějšími preparáty elektrony neprojdou a pokud ano, je obraz zatížený značnou chromatickou vadou a nelze jej zaostřit. Příprava vzorků se skládá ze šesti základních fází. Prvním krokem přípravy preparátů pro TEM je v naprosté většině případů fixace. Jejím cílem je zachovat buněčnou ultrastrukturu s minimem změn oproti nativnímu stavu, zabránit degradačním procesům a stabilizovat vzorek do dalších kroků přípravy. K fixaci biologických objektů se používají chemické nebo fyzikální metody, nejčastěji změna teploty nebo záření. Při chemické fixaci se nejčastěji používá oxid osmičelý (OsO4). Po fixaci a promytí preparátu následuje jeho zalití do vhodné pryskyřice. Většina zalévacích médií rutině používaných pro přípravu vzorků pro TEM není mísitelná s vodou, a proto je nutné po fixaci nahradit volnou vodu ve vzorku kapalinou, která je mísitelná jak s vodou, tak se zalévacím médiem. K tomuto účelu slouží dehydratace, kdy vzorek je postupně umisťován do roztoků s rostoucím podílem dehydračního činidla, až je jím všechna voda v systému nahrazena. Nejčastěji se jako dehydratační činidla používají etanol a aceton. Účelem zalévání je dát zpracovávanému vzorku takové vlastnosti, aby ho bylo možné nakrájet na ultratenké řezy. Na pryskyřice, které se pro zalévání používají, je kladeno velké množství požadavků. Preparáty pro TEM by měly mít optimálně tloušťku 60 – 70 nm. Dalším krokem přípravy je tedy krájení zalitých preparátů na řezy této tloušťky, které jsou označované jako ultratenké. Obecně platí, že čím tenčí jsou ultratenké řezy, tím lepší je rozlišení struktur v obraze, ale slabší kontrast. K pohodlné manipulaci s ultratenkými řezy slouží síťky. Vyrábějí se z mědi, niklu, zlata a dalších materiálů elektrogalvanickým leptáním, jejich průměr se v současnosti ustálil na 3 mm. Biologický materiál zalitý do pryskyřice je z hlediska interakcí se svazkem elektronů značně homogenní a proto mají ultratenké řezy v TEM minimální kontrast. Z tohoto důvodu je nutné biologický materiál kontrastovat, tj. diferenciálně nasytit látkami, které s elektrony reagují. Způsobem, který se pro kontrastování používá nejvíce, je selektivní adsorpce těžkých kovů na buněčné organely. Protože těžké kovy více rozptylují primární elektrony, zvyšují tak kontrast struktur, na které se adsorbovaly. K prvnímu kontrastování vlastně dochází při fixaci OsO4. V ostatních případech se řezy kontrastují buď před zalitím, tzv. v bloku, nebo po nakrájení na ultratenké řezy přímo na síťkách (Nebesářová, 2001). 24

3.4.2 Skenovací elektronová mikroskopie (SEM) Skenovací elektronový mikroskop (dále SEM) je přístroj určený k pozorování povrchů nejrůznějších objektů. Je ho možné do jisté míry považovat za analogii světelného mikroskopu v dopadajícím světle, na rozdíl od něho je výsledný obraz tvořen pomocí sekundárního signálu – odražených nebo sekundárních elektronů (Nebesářová, 2001). Elektrony dopadají na pozorovaný preparát a interakcí s hmotou vyráží ze vzorku elektrony. Ty jsou pomocí vhodného potenciálu přitahovány na detektory, které vytváří signál upravený pro zpracování v zobrazovacím systému. Zobrazovacím systémem může být obrazovka, na které se vytváří příslušný obraz vzniklý rastrováním elektronového paprsku po snímané ploše. Výsledným obrazem je snímek, který zachycuje povrchovou strukturu preparátu (Bílý, 2007). Pro naše pozorování byl používán SEM JEOL JSM-6300 nebo JEOL JSM-7401F (JEOL Ltd., Japan) v laboratoři EM, PaÚ AV ČR v Českých Budějovicích. Příprava preparátů pro SEM Stejně jako v případě TEM ani v SEM většinou nelze biologické materiály prohlížet bez jejich úpravy. Preparát vhodný pro prohlížení v mikroskopu musí totiž splňovat následující kritéria: na jeho povrchu by se neměly vyskytovat cizorodé částice např. prach, měl by být stabilní ve vakuu, stabilitu by měl vykazovat i při ozáření elektronovým paprskem, měl by produkovat dostatečné množství požadovaného signálu např. sekundárních elektronů, při expozici primárním elektronům by nemělo docházet k jeho nabíjení. Některé biologické objekty tyto předpoklady bez problémů splňují, jako např. různé mineralizované struktury, zuby, kosti apod. Ve většině případů však biologické vzorky obsahují vodu, která z nich musí být před prohlížením odstraněna, což znamená jejich úpravu. Výběr metody závisí na typu preparátu a informacích, které o něm chceme získat. Živočišné tkáně a orgány, rostlinné tkáně představují preparáty, které jsou dosti choulostivé a vyžadují jemné zacházení. Jejich příprava začíná kvalitní fixací. Po každém kroku musí být tyto vzorky centrifugovány, což je nebezpečný zdroj tvarových změn. Východiskem může být jejich přilepení na vhodnou podložku, např. krycí sklíčko, nebo zachycení na filtr, se kterým se pak dále pracuje. Přípravě preparátů pro SEM musí být věnována náležitá pozornost, neboť často bývá zdrojem artefaktů (Nebesářová, 2001).

25

4 Výsledky 4.1 Přehled výsledků fyzikálních měření Tabulka 4.1 ukazuje průměrné hodnoty měřených fyzikálních veličin v hodnocených skupinách Galleria mellonella, které jsou podstatné pro interpretaci výsledků inferenční statistiky a srovnání vláken různých typů (dle stáří housenek, popř. s aplikací juvenoidu nebo bez ní). Označení skupin u G. mellonella je vyjádřením stáří ve dnech posledního instaru (označení hedvábí velkými písmeny je arbitrární). Označení skupin B. mori vychází z vývojových fází housenek, kterým bylo hedvábí odebíráno – BW: housenky po ukončení žíru „wandering“ a BK: předoucí slabé kokony. Jednotlivé měřené parametry jsou podrobně popsány a vyhodnoceny v následujících odstavcích. Pro lepší orientaci znázorňuji výsledky graficky pomocí krabicového grafu (box plot) a bodového průměrového grafu. Box plot popisuje variabilitu dat uvnitř skupin, tučně je zvýrazněn medián skupiny, obdélník vymezuje kvartilové rozpětí, úsečky ukazují odlehlá pozorování (do vzdálenosti 3/2 kvartilového rozpětí, dále bodově). Bodový graf zobrazuje průměrné hodnoty pro danou veličinu s kategoriemi dle stáří ve dnech posledního instaru. Barevně a tvarem znaku je odlišena aplikace juvenoidu. Výsledky jednotlivých měření jsou uvedeny v příloze (tabulka 8.1, 8.2 a 8.3).

26

11

27

44

40

27

38

24

23

21

22

G1a (GB)

G2a (GC)

G5a (GF, GH)

G7a (GA)

G5a-J (GJ)

G6a-J (GL)

G1b (E)

G5b (F)

G7b (K)

G5b-J (M)

382 ± 51

220 ± 16

261 ± 11

199 ± 31

268 ± 21

270 ± 41

372 ± 27

280 ± 25; 245 ± 31

169 ± 25

145 ± 30

Hmotnost [mg]

N

22

26

Skupina (ozn. hedvábí)

BW (BW)

BK (BK)

896 ± 69

1615 ± 53

Hmotnost [mg]

2,70 ± 0,12

3,55 ± 0,21

2,69 ± 0,44

2,43 ± 0,42

Průměr vlákna [µ µm]

5,49 + 0,30

6,30 ± 0,40

556,54 ± 199,48

688,11 ± 246,18

555,82 ± 197,81

525,33 ± 194,42

500,80 ± 162,02

375,94 ± 141,95

1092,70 ± 217,62

998,87 ± 239,24

Odběr a měření 2008

Max. napětí [MPa]

710,04 ± 288,58

984,12 ± 234,40

770,84 ± 300,15

816,49 ± 258,85

0,20 ± 0,04

0,21 ± 0,05

Relat. deformace [mm/mm]

0,23 ± 0,07

0,24 ± 0,05

0,25 ± 0,07

0,22 ± 0,04

0,23 ± 0,05

0,27 ± 0,08

0,30 ± 0,06

0,28 ± 0,07

0,22 ± 0,05

0,19 ± 0,04

Relat. deformace [mm/mm]

Druhá sada, odběr a měření 2008

2,90 ± 0,64

2,39 ± 0,34

3,58 ± 0,40

2,81 ± 0,51

2,31 ± 0,29

2,03 ± 0,31

Max. napětí [MPa]

První sada, odběr a měření 2007

Průměr vlákna [µ µm]

Tabulka 4.2: Fyzikální vlastnosti vláken Bombyx mori

N

Skupina (ozn.hedvábí)

Tabulka 4.1: Fyzikální vlastnosti vláken Galleria mellonella

169,49 ± 54,16

151,60 ± 44,15

Houževnatost [MPa]

108,41 ± 60,04

136,85 ± 40,44

120,95 ± 52,34

117,51 ± 46,06

88,42 ± 30,04

121,54 ± 54,96

97,17 ± 35,97

97,42 ± 42,72

74,49 ± 32,95

50,32 ± 21,71

Houževnatost [MPa]

35,91 ± 3,23

29,91 ± 5, 88

Tuhost [GPa]

15,23 ± 3,45

13,42 ± 3,51

15,14 ± 4,58

14,46 ± 3,39

12,05 ± 2,69

14,50 ± 3,00

9,67 ± 2,48

11,18 ± 2,53

11,75 ± 2,86

9,71 ± 2,93

Tuhost [GPa]

27

4.1.1 Fyzikální vlastnosti vláken Galleria mellonella Průměr vlákna Z naměřených hodnot jsem pro potřeby této práce využila jen výsledky měření vlákna, tj. obou filamentů s jejich sericinovým obalem. Rozpětí mezi minimální a maximální hodnotou průměru vlákna je uvnitř skupin i mezi skupinami značné. Hodnoty průměru vlákna, které postupně rostou se stářím larev, naznačují pozitivní korelaci mezi těmito veličinami (tabulka 4.3). GLM potvrdil vliv stáří a aplikace juvenoidu na průměr vlákna (tabulka 4.4). V první sadě (2007) tento závěr platí plně, v sadě z roku 2008 byl zcela potlačen vliv aplikace juvenoidu (průměrový graf 4.4). Ve druhém případě neexistují statisticky významné rozdíly mezi stejně starými housenkami s aplikací a bez aplikace juvenoidu. Tento fakt můžeme pravděpodobně přičíst vyššímu titru endogenního juvenilního hormonu (JH), ke kterému může dojít např. působením chladového šoku. Nelze ani vyloučit kontaminaci všech skupin housenek juvenoidem. Při detailnějším pohledu na první sadu je z dílčí Eta-statistiky zjevná větší role stáří než juvenoidu. Z průměrového grafu 4.3 (sada 2007) je patrné, že hodnota průměru vlákna je při aplikaci juvenoidu bližší hodnotě druhého dne, než hodnotě u stejně starých housenek (pátý den) bez juvenoidu. Otestováním této hypotézy byl jev na 95% intervalu spolehlivosti také potvrzen. Tabulka 4.3: Základní charakteristiky – průměr vlákna [µm] Skupina

N

Minimum

Maximum

Průměr

Sm. odchylka

Rozptyl

První sada, odběr a měření 2007 G1a

11

1,600

2,540

2,032

0,314

0,099

G2a

27

1,770

2,760

2,312

0,287

0,082

G5a

44

1,880

3,700

2,810

0,511

0,262

G7a

40

2,980

4,340

3,578

0,395

0,156

G5a-J

27

1,920

3,200

2,391

0,343

0,118

G6a-J

38

1,720

4,170

2,898

0,635

0,403

G1b

24

1,730

3,060

2,433

0,416

0,173

G5b

23

1,860

3,460

2,689

0,443

0,197

G7b

21

3,190

3,820

3,549

0,213

0,045

G5b-J

22

2,540

2,960

2,698

0,122

0,015


Tabulka 4.4: Test vlivu faktorů (GLM) – průměr vlákna Faktor

St. volnosti

F-statistika

Sig.

Dílčí Eta-statistika

První sada, odběr a měření 2007 Skupina

5

39,501

0,000

0,522

Stáří

4

47,489

0,000

0,512

Juvenoid

1

13,873

0,000

0,071

Druhá sada, odběr a měření 2008 Skupina

3

46,546

0,000

0,619

Stáří

2

67,757

0,000

0,612

Juvenoid

1

0,008

0,928

0,000

28

Graf 4.1: Box plot – průměr vlákna (2007)

Graf 4.2: Box plot – průměr vlákna (2008)

29

Graf 4.3: Bodový průměrový graf – průměr vlákna (2007)

Graf 4.4: Bodový průměrový graf – průměr vlákna (2008)

30

Maximální napětí Zatímco poměr rozpětí mezi minimální a maximální hodnotou průměru vlákna odpovídal zhruba dvounásobku, u maximálního napětí je variabilita hodnot uvnitř skupin až čtyřnásobná. U poslední skupiny z druhé sady (2008) se rovněž vyskytují velmi vysoké odlehlé hodnoty (tabulka 4.5). Z testu je patrná slabší závislost max. napětí na stáří housenky, než tomu bylo u průměru vlákna, přesto je i zde v obou sadách statisticky významná. V sadě odebrané v roce 2008 opět nemá na rozdíly v max. napětí vliv aplikace juvenoidu (tabulka 4.6), podobně jako v případě průměru vlákna. Podíváme-li se na průkaznější první sadu, je v průměrovém grafu (graf 4.7) opět patrný rostoucí trend, avšak aplikace juvenoidu zde má interakční efekt (s rostoucím stářím max. napětí při aplikaci juvenoidu klesá), u stejně starých housenek je pak průměrná hodnota max. napětí značně vyšší. Tabulka 4.5: Základní charakteristiky – max. napětí [MPa] Skupina

N

Minimum

Maximum

Průměr

Sm. odchylka

Rozptyl


11

243,805

630,398

375,940

141,949

20149,400

G2a

27

287,880

1001,109

500,795

162,021

26250,790

G5a

44

188,714

930,548

525,333

194,417

37798,120

G7a

40

196,007

961,499

555,861

197,812

39129,650

G5a-J

27

252,681

1176,628

688,109

246,175

60601,890

G6a-J

38

307,699

922,225

556,543

151,326

22899,660

G1b

24

440,185

1492,742

816,489

258,849

67002,857

G5b

23

359,478

1234,181

770,842

300,145

90086,840

G7b

21

590,844

1340,178

984,115

234,396

54941,649

G5b-J

22

343,965

1295,562

710,043

288,582

83279,533


Tabulka 4.6: Test vlivu faktorů (GLM) – max. napětí Faktor

St. volnosti

F-statistika

Sig.

Dílčí Eta statistika


5

5,288

0,000

0,127

Stáří Juvenoid

4

3,942

0,004

0,080

1

12,425

0,001

0,064


3

3,992

0,010

0,122

Stáří

2

3,701

0,029

0,079

Juvenoid

1

0,561

0,456

0,006

31

Graf 4.5: Box plot – max. napětí (2007)

Graf 4.6: Box plot – max. napětí (2008)

32

Graf 4.7: Bodový průměrový graf – max. napětí (2007)

Graf 4.8: Bodový průměrový graf – max. napětí (2008)

33

Relativní deformace Naměřené hodnoty relativní deformace jsou uvnitř skupin i mezi skupinami velmi vyrovnané (tabulka 4.7). Testování vlivu faktorů (tabulka 4.8) potvrdilo závislost relativní deformace na stáří housenky pouze u první sady odběrů. Statisticky významná role aplikace juvenoidu nebyla potvrzena ani v jednom případě. Přesto je při pohledu na bodový graf odběrů první sady (graf 4.11) viditelný interakční efekt, který mění směr pravidelnosti mezi stářím a relat. deformací po aplikaci juvenoidu. Ve všech případech došlo po aplikaci juvenoidu ke snížení hodnot relat. deformace oproti kategoriím, kde juvenoid přítomný nebyl. Platí jednostranná hypotéza, že hodnota relativní deformace (2007) je při aplikaci juvenoidu bližší hodnotě skupiny stejně starých housenek (pátý den) bez juvenoidu, než hodnotě u housenek druhého dne. Tabulka 4.7: Základní charakteristiky – relat. deformace [mm/mm] Skupina

N

Minimum

Maximum

Průměr

Sm. odchylka

Rozptyl


11

0,134

0,238

0,190

0,035

0,001

G2a

27

0,155

0,314

0,216

0,046

0,002

G5a

44

0,156

0,407

0,284

0,072

0,005

G7a

40

0,163

0,426

0,304

0,062

0,004

G5a-J

27

0,118

0,373

0,265

0,076

0,006

G6a-J

38

0,131

0,326

0,231

0,048

0,002

Druhá sada, odběr a měření 2008 G1b

24

0,152

0,293

0,221

0,044

0,002

G5b

23

0,077

0,333

0,245

0,070

0,005

G7b

21

0,163

0,312

0,241

0,047

0,002

G5b-J

22

0,096

0,354

0,228

0,068

0,005

Tabulka 4.8: Test vlivu faktorů (GLM) – relat. deformace Faktor

St. volnosti

F-statistika

Sig.



5

12,873

0,000

0,262

Stáří

4

14,738

0,000

0,246

Juvenoid

1

1,711

0,192

0,009


3

0,879

0,455

0,030

Stáří

2

1,184

0,311

0,027

Juvenoid

1

1,020

0,315

0,012

34

Graf 4.9: Box plot – relat. deformace (2007)

Graf 4.10: Box plot – relat. deformace (2008)

35

Graf 4.11: Bodový průměrový graf – relat. deformace (2007)

Graf 4.12: Bodový průměrový graf – relat. deformace (2008)

36

Houževnatost Výrazným znakem hodnot této vlastnosti je rozkolísanost. U obou sad měření byly velké rozdíly mezi minimální a maximální hodnotou houževnatosti podle skupin (tabulka 4.9). Značná variabilita hodnot celkově snižuje reálnou vypovídací schopnost testů (tabulka 4.10), což se promítlo i v nízkých hodnotách dílčí Eta-statistiky. Trend průměrných hodnot je v obou sadách rostoucí se stářím housenky, v první sadě silněji s výjimkou hodnoty poslední skupiny. Statisticky významné rozdíly v houževnatosti vlákna dle stáří housenky byly testem prokázány pouze u první sady. Vliv aplikace juvenoidu se podařilo na zvolené hladině testu prokázat pouze u první sady. Z grafického znázornění je patrné rozporuplné chování vzorků z obou sad. V první sadě je hodnota houževnatosti u housenek pátého dne s juvenoidem výrazně vyšší než u jejich ekvivalentu bez juvenoidu, ve druhé sadě je to naopak. Tabulka 4.9: Základní charakteristiky – houževnatost [MPa] Skupina

N

Minimum

Maximum

Průměr

Sm. odchylka

Rozptyl


11

27,140

86,419

50,315

21,708

471,250

G2a

27

33,990

178,821

74,491

32,953

1085,919

G5a

44

24,652

173,764

97,418

42,724

1825,310

G7a

40

30,114

182,132

97,166

35,970

1293,853

G5a-J

27

28,028

238,215

121,542

55,960

3131,526

G6a-J

38

42,508

156,865

88,424

30,039

902,344


24

56,438

211,573

117,513

46,064

2121,929

G5b

23

27,102

193,017

120,946

52,338

2739,315

G7b

21

70,096

207,623

136,851

40,443

1635,612

G5b-J

22

30,964

270,960

108,407

60,042

3605,061

Tabulka 4.10: Test vlivu faktorů (GLM) – houževnatost Faktor

St. volnosti

F-statistika

Sig.



5

7,017

0,000

0,162

Stáří

4

7,379

0,000

0,140

1

6,369

0,012

0,034

Juvenoid


3

1,193

0,317

0,040

Stáří

2

0,922

0,402

0,021

Juvenoid

1

0,699

0,405

0,008

37

Graf 4.13: Box plot – houževnatost (2007)

Graf 4.14: Box plot – houževnatost (2008)

38

Graf 4.15: Bodový průměrový – houževnatost (2007)

Graf 4.16: Bodový průměrový graf – houževnatost (2008)

39

Youngův modul (tuhost) Rozptyly hodnot Youngova modulu uvnitř skupin jsou dosti podobné (tabulka 4.11). Z testování faktorů pomocí GLM (tabulka 4.12) vyšlo u obou sad jako významné stáří housenky. Vliv juvenoidu se podařilo potvrdit pouze v první sadě, kde jeho aplikace výrazně zvýšila hodnoty Youngova modulu. Sledujeme-li průměrné hodnoty Youngova modulu při zohlednění stáří, roste jejich velikost z nízkých hodnot v prvním dni, maxima je dosaženo ve druhém, resp. pátém dni, pak se směr závislosti obrací, velikost Youngova modulu u starších housenek opět klesá. Tabulka 4.11: Základní charakteristiky – Youngův modul [GPa] Skupina

N

Minimum

Maximum

Průměr

Sm. odchylka

Rozptyl


11

5,625

14,208

9,713

2,930

8,587

G2a

27

6,371

18,331

11,753

2,860

8,182

G5a

44

4,695

19,843

11,176

2,527

6,388

G7a

40

5,044

15,769

9,666

2,478

6,139

G5a-J

27

9,220

20,163

14,504

2,995

8,968

G6a-J

38

7,822

18,221

12,054

2,687

7,221


24

7,732

22,480

14,462

3,385

11,457

G5b

23

9,219

31,134

15,140

4,576

20,938

G7b

21

8,904

20,149

13,416

3,513

12,342

G5b-J

22

6,773

20,267

15,233

3,454

11,932

Tabulka 4.12: Test vlivu faktorů (GLM) – Youngův modul Faktor

St. volnosti

F-statistika

Sig.



5

11,895

0,000

0,247

Stáří

4

6,486

0,000

0,125

1

25,549

0,000

0,124

Juvenoid


3

3,992

0,010

0,122

Stáří

2

3,701

0,029

0,079

Juvenoid

1

0,561

0,456

0,006

40

Graf 4.17: Box plot – Youngův modul (2007)

Graf 4.18: Box plot – Youngův modul (2008)

41

Graf 4.19: Bodový průměrový graf – Youngův modul (2007)

Graf 4.20: Bodový průměrový graf – Youngův modul (2008)

42

4.1.2 Fyzikální vlastnosti vláken Bombyx mori Průměr vlákna Hodnoty průměru vlákna nemají ve skupinách bource normální rozdělení. Nerovnoměrné rozdělení hodnot okolo mediánu je patrné i z box plotu (graf 4.21). Pro testování hypotézy o významnosti rozdílů mezi skupinami byl proto použit neparametrický Mann-Whitney U test (tabulka 4.14). Mann-Whitney U test potvrdil statisticky významné rozdíly mezi skupinami. S přihlédnutím k průměrům lze tedy konstatovat, že s rostoucím stářím (skupina BK) klesá průměr vlákna. Tabulka 4.13: Základní charakteristiky – průměr vlákna [µm] Skupina

N

Minimum

Maximum

Průměr

Sm. odchylka

Rozptyl

BW

22

5,610

7,020

6,300

0,404

0,163

BK

26

4,840

5,850

5,487

0,301

0,091

Celkem

48

4,840

7,020

5,860

0,537

0,289

Tabulka 4.14: Mann-Whitney U – průměr vlákna Skupina BW BK Celkem

N 22 26 48

Střední pořadí 35,773 14,962

Součet pořadí

Testová statistika

787 Mann-Whitney U 389 Sig.

38 0,000

Graf 4.21: Box plot – průměr vlákna

43

Maximální napětí V případě max. napětí jsou hodnoty ve skupinách rozděleny normálně, proto můžeme použít t-test. Minimální i maximální hodnoty jsou v obou skupinách podobné, totéž platí i pro průměr (tabulka 4.15). T-test nepotvrdil dostatečné rozdíly mezi skupinami, resp. statisticky významný vliv stáří bource na hodnoty max. napětí jeho vláken (tabulka 4.16). Tabulka 4.15: Základní charakteristiky – max. napětí [MPa] Skupina

N

Minimum

Maximum

Průměr

Sm. odchylka

Rozptyl

BW

22

593,258

1402,347

998,868

239,242

57236,925

BK

26

713,645

1580,057

1092,695

217,623

47359,725

Celkem

48

593,258

1580,057

1049,691

230,212

52997,406

Tabulka 4.16: T-test dvou nezávislých výběrů – max. napětí Levenův test homogenity rozptylů F statistika 0,908

Sig.

T-test pro stejné rozptyly t statistika

0,346

-1,422

Stupně volnosti

Sig. (T-test) 46

0,162

95% int. spolehlivosti Horní -226,627

Dolní 38,972

Graf 4.22: Box plot – max. napětí

44

Relativní deformace V obou skupinách jsou krajní hodnoty relativní deformace obdobné, ovšem skupina BW nemá hodnoty v normálním rozdělení, proto je třeba použít neparametrický Mann-Whitney U test. Stejně jako u předchozí veličiny, tak ani zde nebyly prokázány dostatečně velké rozdíly mezi skupinami, na jejichž základě by se dal uznat vliv stáří na uvedenou vlastnost vlákna (tabulka 4.18). V obou skupinách jsou vyrovnané průměrné hodnoty relativní deformace (tabulka 4.17). Tabulka 4.17: Základní charakteristiky – relat. deformace [mm/mm] Skupina

N

Minimum

Maximum

Průměr

Sm. odchylka

Rozptyl

BW

22

0,148

0,306

0,207

0,045

0,002

BK

26

0,127

0,266

0,198

0,044

0,002

Celkem

48

0,127

0,306

0,202

0,044

0,002

Tabulka 4.18: Mann-Whitney U – relat.deformace Skupina

Střední pořadí

N

Součet pořadí

Testová statistika

BW

22

25,705

565 Mann-Whitney U

259,5

BK

26

23,481

611 Sig.

0,583

Celkem

48

Graf 4.23: Box plot – relat. deformace

45

Houževnatost Situace u dat houževnatosti je obdobná jako u předchozích vlastností. Byl splněn požadavek normality, proto byl použit t-test (tabulka 4.20), avšak jeho výsledek nepotvrdil statisticky významné rozdíly mezi skupinami. Tabulka 4.19: Základní charakteristiky - houževnatost [MPa] Skupina

N

Minimum

Maximum

Průměr

Sm. odchylka

Rozptyl

BW

22

77,374

252,958

151,596

44,152

1949,408

BK

26

87,106

288,674

169,485

54,156

2932,849

Celkem

48

77,374

288,674

161,286

50,122

2512,173

Tabulka 4.20: T-test dvou nezávislých výběrů - houževnatost Levenův test homogenity rozptylů F statistika 0,792

Sig.

T-test pro stejné rozptyly t statistika

0,378

-1,239

Stupně volnosti

Sig. (T-test) 46

0,222


Dolní 11,172

Graf 4.24: Box plot - houževnatost

46

Youngův modul (tuhost) Dostatečně velké rozdíly mezi skupinami v průměrných hodnotách Youngova modulu byly potvrzeny t-testem (tabulka 4.22). Proto lze zobecnit závislost, že s rostoucím stářím housenky, resp. s přechodem od předení „lešení“ pro uchycení kokonu k předení vlastního kokonu, rostou i hodnoty Youngova modulu. Růstový trend s věkem byl pozorován i u dalších vlastností mimo průměru vlákna, ovšem s nedostatečnou intenzitou pro zobecnění těchto pravidelností. Tabulka 4.21: Základní charakteristiky - Youngův modul [GPa] Skupina

N

Minimum

Maximum

Průměr

Sm. odchylka

Rozptyl

BW

22

20,629

41,637

29,911

5,847

34,185

BK

26

29,334

40,680

35,906

3,233

10,455

Celkem

48

20,629

41,637

33,158

5,472

29,946

Tabulka 4.22: T-test dvou nezávislých výběrů - Youngův modul Levenův test homogenity rozptylů F statistika 6,963

Sig. 0,011

T-test pro nestejné rozptyly t statistika -4,286

Stupně volnosti

Sig. (T-test) 46

0,000


Dolní -3,144

Graf 4.25: Box plot - Youngův modul

47

4.2 Elektronová mikroskopie 4.2.1 TEM Bohužel se pro TEM nepodařilo připravit kvalitní preparáty. Zřejmě během odvodňování preparátů došlo k deformacím, které se na řezech vlákna projevily jako „zkrabacení“. Na fotografii 4.1 jsou nicméně vidět dva fibroinové filamenty (bílé ovály) a jejich sericinový obal (zobrazený šedě).

Obr. 4.1: TEM – Příčný řez hedvábným vláknem Galleria mellonella

4.2.2 SEM Skenovací elektronová mikroskopie zobrazila při malém zvětšení hedvábné vlákno jako hladkou „nit“. Obrázek 4.2 ukazuje vlákno zavíječe voskového, včetně ukotvení vlákna k papírové podložce. Nepravidelné provazce v dolní části obrázku jsou vlákna celulózy uvnitř povrchově hlazené podložky. Při velkých zvětšeních (17 000krát) je vidět jemná povrchová struktura vlákna (vrstva sericinů) a jsou jasně patrné obrysy filamentů pod sericinovou vrstvou. Na obrázku 4.3 je vlákno housenek zavíječe voskového 7. dne posledního larválního instaru, při pohledu na jeho dlouhou průřezovou osu (kapitola 3.2.2). Její délka byla 5,553 µm, zatímco délka krátké osy naměřená poněkud nepřesně (měla by se měřit jen kontura jednoho filamentu, do malé míry byl ale měřen i druhý) činila 3,050 µm (obr. 4.4). Průměr vlákna vypočtený z těchto hodnot je 4,302 µm, což odpovídá maximální hodnotě 4,340 µm zjištěné měřením v polarizačním mikroskopu (tabulka 4.3).

48

Obr. 4.2: SEM – Hedvábné vlákno Galleria mellonella

Obr. 4.3: SEM – Hedvábné vlákno Galleria mellonella, pohled na dlouhou průřezovou osu

49

Obr. 4.4: SEM – Hedvábné vlákno Galleria mellonella, pohled na krátkou průřezovou osu

50

5 Diskuse 5.1 Měření fyzikálních vlastností hedvábí 5.1.1 Smysl měření Znalost fyzikálních vlastností různých typů vláken je důležitá pro jejich praktické využití v různých odvětvích průmyslu či medicíny. Každé odvětví si žádá jiné vlastnosti, tak jako pavouci produkují v závislosti na potřebě použití různé typy hedvábí, které mají velmi odlišné složení i vlastnosti (tabulka 5.1). Tab. 5.1: Vlastnosti různých vláken (Sponner, 2007 podle Hinman et al., 2000) Materiál

Mechanické napětí (Pa)

Major ampullate silk*

Energie k přetržení (J/kg)

až 4 × 109

35

1 × 105

Flagelliform silk*

1 × 109

>200

1 × 105

Minor ampullate silk*

1 × 109

5

3 × 104

Kevlar

4 × 109

5

3 × 104

Guma

1 × 106

600

8 × 104

Šlachy

4 × 109

5

5 × 103

Nylon, typ 6

7 × 107

200

6 × 104

*

**

Pružnost (%)

názvy bílkovin hedvábí pavouků se odvozují od typů snovacích žláz: "major" a "minor" ampullate silk jsou hlavní a vedlejší proteiny z ampulárních ("hroznovitých") žláz; flagelliform silk je bílkovina produkovaná "nitkovitými" žlázami

**

publikovány byly hodnoty mezi 1,5 a 4 × 109

Prakticky významné je měření hedvábných vláken, která jsou komerčně využívána, tj. vlákna z kokonů asi patnácti druhů motýlů (Peigler, 1993). Hlavním cílem výzkumu je objasnění vztahu mezi chemickým složením vlákna a jeho fyzikálními vlastnostmi. Význam tohoto výzkumu roste se snahami připravit rekombinantní hedvábí bez nutnosti nákladných chovů housenek. Největšího úspěchu v tomto směru dosáhla společnost Nexia (USA a Kanada), které se podařilo připravit transgenní kozy, produkující pod kaseinovým promotorem bílkovinu blízkou hedvábí pavouků (Lazaris et al., 2002). Bílkovina se poměrně snadno získá z mléka ve formě hustého roztoku a za vhodných podmínek se dosáhne její polymerizace do pevného vlákna nazvaného biosteel. Umělá hedvábná vlákna byla získána i jinými způsoby a lze očekávat postupný vývoj komerčních vláken. Objasnění faktorů určujících fyzikální vlastnosti vláken je pro komerční využití velmi důležité.

51

5.1.2 Měření hedvábných vláken housenek Fyzikální vlastnosti hedvábných vláken bource morušového a několika dalších druhů byly mnohokrát měřeny pro potřeby textilního průmyslu. Používají se vlákna rozvolněná z kokonů po krátké lázni v horké, mírně alkalické vodě. Vlákna se z kokonu uvolní v důsledku rozpuštění povrchových sericinových vrstev. Tento proces není přesně kontrolován a také nevíme, jak se vlastnosti mění v důsledku lázně. Naměřené vlastnosti se běžně přisuzují těžkému fibroinu, který společně s lehkým řetězcem a glykoproteinem P25 vytváří filamenty (Fedič et al., 2002). Možný vliv sericinové vrstvy se ignoruje. Tento postup vedl k významným objevům, např. objasnění struktury některých bílkovin, za což dostal L. Pauling Nobelovu cenu. Postup je také dostatečný pro srovnání komerčních vzorků kokonů, nepostačuje však plně pro vysvětlení funkčních změn hedvábí během vývoje. U některých druhů, jakým je např. zavíječ voskový, jsou tyto změny nápadné. Housenky zavíječe předou kromě krátkého období kolem každého svlékání téměř nepřetržitě. Každá si vytváří hedvábnou trubičku, kterou během růstu rozšiřuje a prodlužuje (přebytečné hedvábí konzumuje). Housenky žijí v úlech a v trubičce unikají pozornosti včel, které je jinak usmrtí. Protože se housenky v trubičkách otáčejí, musí být hedvábí dostatečně pružné. Tím se zřejmě liší od hedvábí kokonů, které housenky předou na konci svého vývoje před kuklením. Kokon je pevný a hedvábí, které ho vytváří, se pravděpodobně svými fyzikálními vlastnostmi liší od hedvábí chodbiček. Potvrzení či vyvrácení tohoto předpokladu bylo cílem této magisterské práce. Abych mohla uvedeného cíle dosáhnout, musela jsem nejprve najít metodiku odběru vláken použitelnou pro housenky různého stáří. Metodika nuceného odběru je popsána v části 3.2.1, zde se však chci zmínit o úskalích, která je nutno brát v úvahu při hodnocení výsledků. Předení je vynucené a nevíme, nakolik závisí tloušťka vlákna a možná i relativní zastoupení sericinového obalu na způsobu odběru (zejména rychlost pohybu housenky) a momentálním fyziologickém stavu housenky. Variabilitě lze čelit jen zpracováním velkých souborů vzorků a kvalitním statistickým zpracováním výsledků. To klade velké nároky na čas i standardizaci celého postupu. Na základě analýzy mnoha měření (viz přílohy) jsem došla k závěru, že tato metodika je správná a výsledky jsou spolehlivé. Vlastní měření fyzikálních vlastností jsem prováděla podle metodiky (kapitola 3.2) uvedené v práci Blackledge et al. (2005), která se týká hedvábí pavouků. Protože vlákna housenek jsou na průřezu elipsoidní, měřila jsem krátkou i dlouhou osu elipsy. Dosud publikovaná měření tuto skutečnost ignorovala, mj. proto, že autoři používali normální světelný mikroskop, ve kterém nelze filamenty rozpoznat. Autoři měřili náhodně vybraná místa vlákna, tj. náhodně dlouhé i krátké poloosy elipsy a spočítali průměr. Metodika uvedená v této práci je bezesporu přesnější. Abych získala vlákna pro pozorování dlouhé i krátké osy elipsy, doplnila jsem metodiku odběru o jednu dorso-ventrální otočku předoucí larvy. Takto odebrané vlákno upevněné na podložce je na svých koncích obráceno k pozorovateli svou dlouhou osou a v jeho střední části 52

lze najít místa pro pozorování a měření krátké osy. Rotace housenky při odběru vlákna může však teoreticky způsobit přivření lisu snovací bradavky a tím změnu tloušťky vlákna i relativního zastoupení fibroinových filamentů a sericinové vrstvy. Toto nebezpečí je nutno mít na paměti, prokázat se mně ho však nepodařilo. Odebraná vlákna byla skladována různě dlouhou dobu, od několika týdnů do několika měsíců. Předpokládá se, že během skladování nedochází ke změnám fyzikálních vlastností vláken, ale s určitostí se to neví. Proto by bylo vhodné měřit vlákna v co nejkratším čase po vypředení, což ale není vždy možné vzhledem k drahé, a tím pádem obtížně dostupné měřící technice.

5.2 Analýza výsledků měření 5.2.1 Průměr vlákna Průměr vlákna byl stanoven jako součet hodnot dlouhé a krátké osy elipsy, jakou vlákno na průřezu je. Poměr dlouhé a krátké osy poněkud kolísal, protože v některých případech jsou filamenty těsně přiložené jeden ke druhému, jindy se ale stýkají jen malou plochou. Celkově však považuji hodnoty průměru vlákna za spolehlivé. Průměr vlákna se u zavíječe voskového zvětšuje v korelaci s růstem housenek (zvyšování tělesné hmotnosti) až do předení kokonu a dosahuje u plně vzrostlých larev (G5a, G5b) hodnot asi 2,7 – 2,8 µm. Předení kokonu je spojeno se zvětšením průměru na hodnoty přesahující 3,5 µm (G7a, G7b). U larev ošetřených juvenoidem a tedy nepředoucích kokony dosáhly hodnoty průměru vlákna nejvýše 2,9 µm (G5a-J, G6a-J, G5b-J). Přechod od předení trubičky na předení kokonu je tedy pro zvětšení tloušťky vlákna u housenek zavíječe voskového rozhodující. Housenky bource morušového před vytvářením kokonu nepředou. Jsou schopny vynuceného předení teprve ve stadiu „wandering“, tj. po ukončení žíru. Hedvábí produkované v této době zřejmě odpovídá typu, který je normálně předen až když larva vyprázdní střevo (hlavní faktor odpovědný za velký pokles hmotnosti mezi skupinami BW a BK). Zdá se, že tento typ má poněkud větší průměr než vlákno předené až během tvorby kokonu. Větší průměr předběžně připisujeme silnější sericinové vrstvě. Lepivý sericin 3 je součástí vlákna jen na začátku předení kokonu (Takasu et al., 2007). 5.2.2 Maximální napětí Maximální napětí, čili mez pevnosti vlákna v tahu, kolísá u zavíječe voskového bez zjevné korelace se stářím nebo vývojovým programem housenek (metamorfóza bez juvenoidu, larvální vývoj po ošetření juvenoidem). Značné rozdíly jsou zejména mezi vlákny odebranými v roce 2007 a 2008. Nejpravděpodobnějším vysvětlením je různá kvalita potravy a zejména režimu krmení. Předení závisí na dostatečném přísunu bílkovin v potravě a může se při jejich nedostatku zcela zastavit (Jindra et Sehnal, 1989). Pokud jsou housenky ponechány několik dní bez výměny potravy, částečně hladoví. Rovněž konzumují méně potravy po jejím dlouhodobém skladování a ztrátě vody. Tyto faktory asi nebyly dostatečně rigidně kontrolovány.

53

Nejvyšší hodnoty pevnosti vlákna naměřené u zavíječe jsou podobné jako hodnoty zjištěné u bource morušového. To je v souladu s výsledky dřívějších měření (Fedič et al., 2003). 5.2.3 Relativní deformace Relativní deformace vyjadřuje, nakolik se může vlákno protáhnout. Fedič et al. (2003) pomocí málo přesného postupu měření zjistili o něco vyšší hodnoty protažení u zavíječe voskového než u bource morušového. Naše přesná měření tento závěr potvrdila, i když hodnoty zjištěné u zavíječe dost kolísají. Překvapením jsou vysoké hodnoty u larev předoucích kokony (zejména G7a) a nižší hodnoty u larev ošetřených juvenoidem. Vlákna používaná k předení larválních chodeb jsou zřejmě pružnější (kapitola 5.2.5), ale celkově méně roztažná než vlákna kokonů. 5.2.4 Houževnatost Odolnost vlákna vůči přetržení neboli jeho houževnatost vzrůstá u zavíječe voskového se stářím housenek, nedosahuje ale hodnot zjištěných u bource morušového. U zavíječe byly zjištěny velké rozdíly mezi vzorky odebranými v roce 2007 a nebo o rok později. Příčina je neznámá. V obou létech houževnatost vzrůstala se stářím. Vliv juvenoidu nebyl jednoznačný a v tomto ohledu nelze učinit žádný jednoznačný závěr. 5.2.5 Tuhost Tuhost je mírou odolnosti vůči deformaci (protažení) a při přepočtu na Youngův modul pružnosti vyjadřuje pružnost vlákna při namáhání v tahu. Hodnoty Youngova modulu byly u zavíječe voskového podstatně nižší v roce 2007 než v roce 2008. V obou sériích však byl nalezen pokles mezi hedvábím předeným při ukončení žíru a hedvábím kokonů (G5a versus G7a a G5b versus G7b). Ošetření juvenoidem zvýšilo hodnoty modulu v obou pokusných sériích, tento rozdíl však byl statisticky průkazný jen v první sérii. Oproti očekávání byl modul pružnosti u bource morušového více než dvojnásobně vyšší než hodnoty zjištěné u zavíječe voskového. Na začátku předení (skupina BW) je vlákno méně pružné, než v průběhu předení kokonu (skupina BK). Tento rozdíl je v souladu se změnou funkce vlákna. První vlákna slouží jako úchyty pro kokon a pro tento účel není velká pružnost zapotřebí. Během předení kokonu housenka přímé vlákno bodově uchycuje a pohybem svého těla ho pak protahuje a zakřivuje, takže postupně vzniká ovoidní kokon. Protahování vlákna zřejmě vyžaduje pružnost, která se v této fázi předení zvyšuje.

54

5.3 Pravděpodobné příčiny vývojových změn vlastností vlákna Zjištěné vývojové změny ve vlastnostech vlákna jsou relativně malé, objasnění jejich příčin však není jednoduché. Většinu hmoty vlákna tvoří filamenty, kterým jsou běžně připisovány fyzikální vlastnosti celého vlákna. Všechny dostupné údaje svědčí o tom, že se složení filamentů z H-fibroinu, L-fibroinu a glykoproteinu P25 během vývoje nemění. Nelze vyloučit vývojové změny ve způsobu polymerizace, tj. konverze gelovitého roztoku uvedených bílkovin v pevné vlákno, pro tuto možnost však neexistují žádné doklady. Pravděpodobnější příčinou jsou dobře doložené změny ve složení a množství sericinů, které filamenty spojují do jediného vlákna. Množství sericinů není zanedbatelné, u bource morušového tvoří 20 – 30 % celkových bílkovin kokonu (Suzuki, 1977). Sericiny jsou sekretovány středním oddílem snovacích žláz a obalují sloupec H-fibroinu, L-fibroinu a P25, který sem postupuje ze zadního oddílu žláz. U bource morušového bylo dokázáno, že střední oddíl (middle silk gland, MSG) sestává nejméně ze tří funkčních jednotek, které se liší typem produkovaných sericinů. Gen Ser1 je exprimován v mediální a distální část MSG, které se však liší sestřihem transkriptu (Couble et al., 1987; Takasu et al., 2007). Produkt o velikosti 150 kDa pochází z distální části a je proto uložen těsně kolem filamentů, zatímco produkt o velikosti 400 kDa z mediální části je nad ním (Takasu et al., 2002). V proximální částí MSG se exprimují geny Ser2 a Ser3 – jejich exprese má odlišný časový průběh, nejvýznamnější je produkt Ser2 o velikosti 250 kDa. Z genu Ser1 vznikají sestřihem čtyři různě velké mRNA, jejichž relativní zastoupení se mění během vývoje (Michaille et al., 1986). Gen Ser2 je zdrojem dvou typů mRNA, jejichž poměr se rovněž mění během vývoje (Michaille et al., 1990). K různorodosti sericinů přispívá krom sestřihu transkriptu i glykosylace. Na úrovni bílkovin rozpoznal Gamo et al. (1977) šest a Sprague (1975) dokonce patnáct různých sericinů. U zavíječe voskového identifikoval Žurovec et al. (1992) sericinové geny MG1 a MG2. Detekce RNA (Northern blot) odhalila, že existuje několik transkriptů MG1 a dva transkripty MG2 jejichž podíl se mění během vývoje. Předposlední larvální instar a začátek posledního instaru se vyznačují převahou transkriptů MG1 o velikosti 1.9 kb, malým počtem 4.2 kb a stopami 3.2 kb. V průběhu posledního instaru se 4.2 kb mRNA akumulují, zejména u larev, které přestaly přijímat potravu a množství 1.9 kb mRNA se sníží. Ve fázi „wandering“ dosahuje počet 4,2 kb mRNA maxima a dočasně se objevují nové transkripty MG1 o velikosti 5.0, 7.2 a 10.0 kb. Gen MG2 tvoří převládající 3.4 kb velký produkt, který se hromadí u žeroucích larev a minoritní 5.2 kb, který je nejzřetelnější u „wanderig“ larev. Většina transkriptů vymizí během předení kokonu, jenom 4.2 kb produkt genu MG1 je detekovatelný v zanikajících snovacích žlázách nepohyblivých prepup (Yang et al., 1995). Vývojové změny exprese sericinových genů a sestřihu jejich produktů jsou u bource morušového řízeny hormonálně (Tripoulas et Samols, 1986; Hamada et al., 1987). Podrobně bylo

55

hormonální řízení studováno u zavíječe voskového. Prokázalo se, že vývojové změny profilu sericinových mRNA závisejí na ekdysteroidech a jsou podmíněny nízkým titrem JH (Kodrík et Sehnal, 1996). Po aplikaci juvenoidu na larvy posledního instaru nedojde v případě MG1 k akumulaci mRNA o velikosti 4.1 kb a neobjeví se nové mRNA o velikosti 5.0, 7.2 a 10.0 kb. V případě MG2 nedojde ke snižování 3.4 kb a zvyšování 5,2 kb. Patern mRNA zůstává na úrovni žeroucích larev. Velmi překvapivé bylo zjištění, že aplikace juvenoidu až po ukončení žíru, kdy již došlo ke změně profilu mRNA, během dvou dnů obnoví larvální typ sestřihu a ustaví se profil mRNA, který odpovídá žeroucím larvám (Yang et al., 1996).

Popsané změny profilu sericinů během vývoje a po aplikaci juvenoidů silně naznačují, že jsou příčinou vývojových změn fyzikálních vlastností hedvábného vlákna.

56

6 Závěry 1. Předložená práce je první svého druhu a proto není možné přímé srovnání s jinými publikacemi. 2. Byla vypracována metodika odběru nativních vláken od housenek a modifikována metodika měření fyzikálních vlastností vláken, která byla původně vytvořena pro hedvábí pavouků. 3. U zavíječe voskového a zčásti i u bource morušového byly v některých vlastnostech zjištěny sice malé, ale statisticky významné vývojové rozdíly. 4. Některé parametry lze ovlivnit aplikací juvenoidu, který potlačí metamorfózu a vyvolá pokračování larválního vývoje. 5. Vývojové změny fyzikálních vlastností jsou pravděpodobně způsobeny změnami ve složení a případně i množství sericinů. 6. Hedvábí bource morušového je o něco pevnější a podstatně houževnatější a pružnější než hedvábí zavíječe voskového.

57

7 Literatura a zdroje 7.1 Literatura Akai, H. (1965). Studies on the ultrastructure of the silk gland in the silkworm, Bombyx mori L. Bull. Sericult. Exp. Sta. 19: 375-484. Akai, H. (2000). Cocoon filament characters and post cocoon technology. Int. J. Silkmoth & Silk. 5: 71-84. Bílý, T. (2007). Fyzikální principy transmisní a skenovací elektronové mikroskopie. Bakalářská práce, PF JU, České Budějovice, 79 str. Blackledge, T. A., Swindeman, J. E. et Hayashi, C. Y. (2005). Quasistatic and continuous dynamic characterization of the mechanical properties of silk from the cobweb of the black widow spider Latrodectus hesperus. The Journal of Experimental Biology. 208: 1937-1949. Couble, P., Michaille, J. J., Couble, M. L. et Prudhomme, J. C. (1987). Developmental switches of sericin mRNA splicing in individual cells of Bombyx mori silkgland. Dev. Biol. 124: 431-440. Craig, C. L. (1997). Evolution of arthropod silks. Annu. Rev. Entomol. 42: 231-261. Craig, C. L. (2003). Silk production. Encyclopedia of Insects. 1038-1040. Fedič, R., Žurovec, M. et Sehnal, F. (2002). The Silk of Lepidoptera. J. Insect Biotech. Sericol. 71: 1-15. Fedič, R., Žurovec, M. et Sehnal, F. (2003). Correlation between fibroin amino acid sequence and physical silk properties. J. Biol. Chem. 278: 35255-35264. Gamo, T. (1987). Component of Silk Proteins and Their Gene Loci in the Silkworm. JARQ Japan

Agricultural Research Quarterly . 21(1): 53-58. Gamo, T., Inokuchi, T. et Laufer, H. (1977). Polypeptides of fibroin and sericin secreted from the different sections of the silk gland in Bombyx mori. Insect Biochem. 7: 285-295. Hamada, Y., Yamashita, O. et Suzuki, Y. (1987). Haemolymph control of sericin gene expression studied by organ transplation. Cell Differentiation. 20: 65-76. Hendl, J. (2004). Přehled statistických metod zpracování dat. Portál, Praha, 584 str. Hyde, N. (1984). The queen of textiles. National Geographic. 165: 3-49. Inoue, S., Tanaka, K., Arisaka, F., Kimura, S., Ohtomo, K. et Mizuno, S. (2000). Silk fibroin of

Bombyx mori is secreted, assembling a high molecular mas elementary unit consisting of H-chain, L-chain, and P25, with 6:6:1 molar ratio. Journal of Biolofical Chemistry. 275: 40517-40528.

58

Inoue, S., Tanaka, K., Tanaka, H., Ohtomo, K., Kanda, T., Imamura, M., Quan, G. X., Kojima, K., Yamashita, T., Nakajima, T., Taira, H., Tamura, T. et Mizuno, S. (2004). Assembly of the silk fibroin elementary unit in endoplasmatic reticulum and a role of L-chain for protection of α1,2-mannose residues in N-linked oligosaccharide chains of fibrohexamerin / P25. European

Journal of Biochemistry. 271: 356-366. Jindra, M. et Sehnal, F. (1989). Larval growth, food consumption, and utilization of dietary protein and energy in Galleria mellonella. J. Insect Physiol. 35: 719-724. Kislingová, I. (2006). Genetické aspekty chovu bource morušového (Bombyx mori L.). Bakalářská práce, PřF MU, Brno, 59 str. Kodrík, D. (2004). Fyziologie hmyzu (učební texty). Entomologický ústav Akademie věd České republiky a Biologická fakulta, Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, 220 str. Kodrík, D. et Sehnal, F. (1994). Juvenile hormone counteracts the action of ecdysterone on silk glands of Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae). Int. J. Insect Morphol. Embryol. 23: 39-56. Komatsu, K. (1975). Studies on dissolution behaviors and structural characteristics of silk sericin.

Bull. Seric. Exp. Stn. 26: 135-256. Lazaris, A., Arcidiacono, S., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W. et Karatzas, C. N. (2002). Spider silk fiber spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295: 472-476. Lepš, J. (1996). Biostatistika. Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, 166 str. Michaille, J. J., Couble, P., Prudhomme, J. C. et Garel, A. (1986). A single gene produces multiple sericin messenger RNAs in the silkgland of Bombyx mori. Biochemie. 68: 1165-1173. Michaille, J. J., Garel, A. et Prudhomme, J. C. (1990). Expression of Ser1 and Ser2 genes in the middle silk gland of Bombyx mori during the fifth instar. Sericologia. 30: 49-60. Nirmala, X., Mita, K., Vanisree, V., Žurovec, M. et Sehnal, F. (2001). Identification of four small molecular mass proteins in the silk of Bombyx mori. Insect Mol. Biol. 10: 437-445. Padamwar, M. N. et Pawar, A. P, (2004). Sericin and its applications: A review. Journal of

Scientific and Industrial Research. 63: 323-329. Padamwar, M. N., Pawar, A. P., Daithankar, A. V. et Mahadik, K. R. (2005). Silk sericin as a moisturizer: an in vivo study. J. Cosmet. Dermatol. 4: 250-257. Park, K. J., Jin, H. H. et Hyun, C. K. (2002). Antigenocity of peptides produced from silk fibroin.

Process Biochemistry. 38: 411-418.

59

Peigler, R. S. (1993). Wild silks of the world. American Entomologist. 39: 151-161. Sarovat, S., Sudatis, B., Meesilpa, P., Grady, B. P. et Magaraphan, R. (2003). The use of sericine as an antioxidant and antimicrobial for polluted air treatment. Review of Advanced Material

Science. 5: 193-198. Sehnal, F. et Akai, H. (1990). Insects silk glands: their types, development and function, and effects of environmental factors and morphogenetic hormones on them. Int. J. Insect

Morphol. Embryol. 19: 79-132. Sehnal,

F.

et

Žurovec,

M.

(2004).

Constitution

of

silk

fiber

core

in

Lepidoptera.

Biomacromolecules. 5: 666-674. Sehnal, F. (2008). Prospects of the practical use of silk sericins. Entomological Research. 38: S1-S8. Shimura, K., Kikuchi, A., Ohtomo, K., Katagata, Y. et Hyodo, A. (1976). Studies on silk fibroin of

Bombyx mori. I. Fractionation of fibroin prepared from the posterior silk gland. J. Biochem. 80: 693-702. Sponner, A. (2007). Spider silk as a resourcefor future biotechnologies. Entomological Research. 37: 238-250. Sprague, K. (1975). The Bombyx mori silk proteins: characterization of large polypeptides.

Biochemistry. 14: 925-931. Suzuki, Y. (1977). Differentiation of silk gland. A model system for the study of differential gene action. In: Beermann W (ed) Results and Problems in Cell Diferentiation, pp. 1-44. SpringerVerlag, Berlin/ Heidelberg. Takasu, Y., Yamada H. et Tsubouchi, K. (2002). Isolation of tree main sericin components from the cocoon of the silkworm, Bombyx mori. Bioscience Biotechnology and Biochemistry. 66: 2715-2818. Takasu, Y., Yamada, H., Tamura, T., Sezutsu, H., Mita, K. et Tsubouchi, K. (2007). Identification and characterization of a novel sericin gene expressed in the anterior middle silk gland of the silkworm Bombyx mori. Insect Bioch. Mol. Biol. 37: 1234-240. Takei, F., Kikuchi, Y., Kikuchi, A., Mizuno, S. et Shimura, K. (1987). Further evidence for importance of the subunit combination of silk fibroin in its efficient secretion from posterior silk gland cells. Joural of Cell Biology. 105: 175-180. Tanaka, K., Inoue, S. et Mizuno, S. (1999). Hydrofobic interaction of P25, containing Asn-linked oligosaccharide chains, with the H-L complex of silk fibroin produced by Bombyx mori. Insect

Biochemistry and Molecular Biology. 29: 269-276.

60

Tripoulas, N. A. et Samols, D. (1986). Developmental and hormonal regulation of sericin RNA in the silkworm, Bombyx mori. Developmental Biology. 116: 328-336. Wang, Y., Kim, H. J., Vunjak – Novakovic, G. et Kaplan, D. L. (2006). Stem cell-based tissue engineering with silk biomaterials. Biomaterials. 27: 6064-6082. Yang, C., Krishnan, M., Žurovec, M., Sehnal, F. et Scheller, K. (1995). Correlation betwen ecdysteroid titre and silk gene expression in the last instar larvae of Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae). Eur. J. Entomol. 92: 229-234. Yang, C., Sehnal, F. et Scheller, K. (1996). Juvenile hormone restores larval pattern of sericotropin gene transcripts. Arch. Insect Biochem. Physiol. 32: 353-362. Zhang, Y. Q. (2002). Applications of natural silk protein sericin in biomaterials. Biotechnology

Advances. 20: 91-100. Zhaorigetu, S., Yanaka, N., Sasaki, M., Watanabe, H. et Kato, N. (2003). Inhibitory effectsof silk protein, sericin on UVB-induced acute damage and tumor promotion by reducing oxidative stress in the skin of hairless mouse. Journal of Photochemistry and Photobiology. 71: 11-17. Žurovec, M., Sehnal, F., Scheller, K. et Kumaran, A. K. (1992). Silk gland specific cDNAs from

Galleria mellonella L.. Insect Biochem. Molec. Biol. 22: 55-67. Žurovec, M. et Sehnal, F. (2002). Unique molecular architecture of silk fibroin in the waxmoth,

Galleria mellonella. J. Biol. Chem. 277: 22639-22647.

7.2 Internetové zdroje Militký, J. (2008). Technická univerzita v Liberci, katedra textilních materiálů. Zkoušení textilií pro bakaláře 1. díl. http://www.ft.vslib.cz/depart/ktm/files/20080228/ZKB_1_dil.pdf. Staženo 20. 3. 2009. Nebesářová, J. (2001). Biologické centrum AV ČR, Parazitologický ústav, Laboratoř elektronové mikroskopie. Elektronová mikroskopie pro biology. http://www.paru.cas.cz/lem/book. Staženo 17. 3. 2009. Vesmír.info. Japonci již vědí, jak využít vlastností pavučin. http://www.vesmir.info/genetika/japonci-jiz-vedi-jak-vyuzit-vlastnosti-pavucin.htm. Staženo 8. 10. 2008. Vlach, B. (2003). Vysoké učení technické v Brně, fakulta strojního inženýrství, Ústav materiálových věd a inženýrství. Nauka o materiálu. Zkouška rázem v ohybu. http://ime.fme.vutbr.cz/files/Studijni%20opory/nomd/zkouska%20razem%20v%20ohybu.do c. Staženo 22. 3. 2009.

61

8 Přílohy Tabulka 8.1: Přehled výsledků měření Galleria mellonella (2007) Označení vzorku GB1.1.1 GB1.1.2 GB1.2.1 GB1.2.2 GB1.4.1 GB1.4.2 GB1.5.1 GB3.1.1 GB3.5.1 GB4.1.1 GB4.1.2 GC1.1.1 GC1.1.2 GC1.2.1 GC1.2.2 GC1.3.2 GC1.5.2 GC2.1.2 GC2.2.1 GC2.2.2 GC2.3.1 GC2.3.2 GC2.4.1 GC3.1.1 GC3.1.2 GC3.2.1 GC3.3.1 GC4.1.1 GC4.2.2 GC4.5.1 GC5.2.2 GC5.3.1 GC5.3.2 GC5.4.1 GC5.4.2 GC5.5.1 GC5.5.2 GC5.1.1 GF3.1.1 GF1.3.2 GF1.4.1 GF1.4.2 GF1.5.1 GF1.5.2 GH2.1.1 GH2.1.2 GH2.2.1 GH2.2.2 GH2.3.2 GH2.5.1 GF2.4.2 GF2.5.1

Skupina G1a G1a G1a G1a G1a G1a G1a G1a G1a G1a G1a G2a G2a G2a G2a G2a G2a G2a G2a G2a G2a G2a G2a G2a G2a G2a G2a G2a G2a G2a G2a G2a G2a G2a G2a G2a G2a G2a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a

Průměr vlákna [µ µm] 2,54 2,54 1,81 1,81 1,88 1,88 1,60 1,96 1,83 2,25 2,25 2,25 2,25 2,71 2,71 2,76 2,13 2,18 2,59 2,59 2,45 2,45 2,53 2,15 2,15 1,88 1,83 2,50 2,40 1,77 2,59 2,56 2,56 1,95 1,95 2,21 2,21 2,12 2,74 2,74 2,59 2,59 2,61 2,61 3,00 3,00 2,87 2,87 2,41 2,82 1,88 1,95

Max. napětí [MPa] 592,097 243,805 266,385 537,982 324,521 305,329 367,611 630,398 254,073 273,962 339,178 556,480 1 001,109 436,434 778,583 797,033 583,694 550,494 327,166 350,572 523,695 405,336 669,373 287,880 332,482 359,584 514,565 391,217 378,592 467,647 457,318 568,281 506,781 582,155 451,359 409,468 427,053 407,124 451,970 564,742 694,445 685,196 392,684 524,846 537,990 601,763 766,102 355,781 692,989 337,352 327,011 315,944

Relat. deformace [mm/mm] 0,232 0,198 0,169 0,201 0,238 0,210 0,134 0,221 0,166 0,139 0,184 0,190 0,264 0,225 0,245 0,290 0,229 0,256 0,180 0,197 0,314 0,233 0,282 0,166 0,189 0,161 0,160 0,220 0,159 0,155 0,262 0,268 0,232 0,229 0,193 0,175 0,202 0,159 0,300 0,276 0,392 0,340 0,292 0,365 0,327 0,390 0,316 0,189 0,334 0,174 0,156 0,208

Houževnatost [MPa]

Tuhost [GPa]

84,416 32,444 34,508 74,089 54,272 44,638 43,573 86,419 30,047 27,140 41,920 70,777 178,821 59,177 107,779 142,967 90,534 90,047 47,132 47,745 94,556 67,290 116,669 33,990 41,576 47,039 55,833 60,545 44,415 59,072 68,509 87,615 67,228 97,932 60,630 49,519 60,693 63,156 83,867 90,044 145,575 131,442 78,659 116,301 103,392 137,511 156,173 48,933 139,070 49,902 37,575 46,266

10,613 5,625 9,164 13,373 7,636 7,087 13,847 14,208 7,550 9,013 8,722 13,997 16,124 8,928 13,147 13,798 12,841 11,487 10,475 8,920 9,060 10,093 12,933 6,371 8,077 12,231 13,852 9,542 11,513 18,331 7,414 9,446 10,103 15,436 12,832 12,202 12,664 15,522 11,121 12,725 11,251 13,616 11,257 10,328 10,780 10,087 16,397 12,651 13,102 13,038 8,175 8,847

GF5.2.2 GF2.2.1 GF2.2.2 GF3.1.1 GF3.1.2 GF3.2.2 GF3.3.1 GF3.4.1 GF3.4.2 GF3.5.1 GF3.5.2 GH1.3.1 GH1.3.2 GH1.4.1 GH1.4.2 GH1.5.1 GH1.5.2 GH1.2.1 GH3.2.1 GH3.2.2 GH3.3.1 GH3.3.2 GH3.4.1 GH3.4.2 GH3.5.1 GH4.1.1 GH4.1.2 GH4.3.2 GH4.4.1 GH4.4.2 GA1.1.1 GA1.2.1 GA1.3.1 GA1.3.2 GA1.4.1 GA1.4.2 GA1.5.1 GA1.5.2 GA2.1.1 GA2.1.2 GA2.4.1 GA2.4.2 GA3.3.2 GA3.4.1 GA3.5.2 GA4.1.1 GA4.2.1 GA4.2.2 GA4.3.1 GA4.3.2 GA4.5.1 GA4.5.2 GA5.1.1 GA5.1.2 GA5.2.1 GA5.2.2 GA5.3.1 GA5.3.2 GA5.4.1 GA5.4.2

G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G5a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a

1,95 2,12 2,12 3,64 3,64 3,70 2,61 3,40 3,40 3,44 3,44 3,44 3,44 3,14 3,14 3,60 3,60 3,01 2,63 2,63 2,59 2,59 2,67 2,67 2,26 2,70 2,70 2,33 2,19 2,19 3,48 4,34 3,94 3,94 4,34 4,34 3,27 3,27 2,98 2,98 3,33 3,33 3,13 3,72 3,96 3,94 3,72 3,72 3,46 3,46 3,22 3,22 3,90 3,90 4,18 4,18 3,29 3,29 3,67 3,67

391,779 188,714 271,777 930,548 888,011 815,701 761,710 610,910 634,941 491,901 420,117 916,184 702,549 611,521 818,002 717,744 495,434 329,361 286,695 441,021 577,305 410,652 445,134 509,885 537,893 318,576 287,344 279,450 443,340 331,620 350,484 961,499 515,417 532,137 504,534 598,568 276,175 422,703 694,033 196,007 375,489 747,679 687,296 793,175 431,123 756,492 912,527 420,497 286,674 546,148 500,217 317,002 438,756 365,024 464,329 696,841 727,285 558,060 729,978 390,305

0,240 0,183 0,190 0,333 0,326 0,328 0,256 0,277 0,345 0,302 0,247 0,353 0,406 0,317 0,329 0,356 0,265 0,236 0,169 0,271 0,407 0,351 0,315 0,227 0,364 0,207 0,253 0,171 0,263 0,171 0,264 0,356 0,224 0,348 0,426 0,353 0,163 0,333 0,293 0,246 0,376 0,292 0,295 0,290 0,327 0,365 0,338 0,185 0,219 0,330 0,218 0,307 0,308 0,349 0,303 0,329 0,307 0,194 0,295 0,357

60,818 24,652 41,046 160,964 159,571 154,456 133,691 101,489 115,863 97,833 80,155 173,764 159,885 122,127 151,285 127,896 89,078 58,947 35,582 78,256 136,957 95,790 87,126 73,516 129,933 47,237 56,723 40,483 79,606 46,966 78,931 157,031 74,107 94,493 109,633 110,226 39,585 81,665 118,758 30,114 79,411 115,353 109,988 117,880 86,690 130,616 157,891 51,213 43,065 94,385 71,619 68,389 86,882 77,936 73,633 119,967 133,509 77,606 109,983 77,057

7,167 4,695 9,101 12,527 13,591 12,275 19,843 12,690 11,230 11,428 12,577 12,337 9,313 11,395 13,343 8,765 10,270 12,714 8,214 10,307 10,505 9,593 9,141 11,318 11,610 9,559 7,469 9,508 12,016 13,876 5,103 10,046 10,070 7,960 7,050 11,066 13,366 10,179 15,769 5,044 6,006 13,298 9,558 11,865 8,188 8,227 11,151 10,928 6,447 6,144 11,595 7,826 10,436 9,373 6,740 9,062 11,816 10,579 10,982 6,400

GA5.5.1 GA5.5.2 GA6.1.1 GA6.1.2 GA6.2.1 GA6.2.2 GA6.4.1 GA6.4.2 GA6.5.1 GA6.5.2 GJ1.2.1 GJ1.2.2 GJ1.4.1 GJ1.4.2 GJ1.5.1 GJ1.5.2 GJ2.2.1 GJ2.2.2 GJ2.4.2 GJ2.5.1 GJ3.1.1 GJ3.1.2 GJ3.3.1 GJ3.3.2 GJ3.5.1 GJ3.5.2 GJ4.2.1 GJ4.2.2 GJ4.3.2 GJ4.4.1 GJ4.4.2 GJ4.5.1 GJ4.5.2 GJ5.1.2 GJ5.2.1 GJ5.2.2 GJ5.5.1 GL1.1.1 GL1.1.2 GL1.2.1 GL1.2.2 GL1.3.1 GL1.3.2 GL1.4.1 GL1.4.2 GL1.5.1 GL1.5.2 GL2.2.1 GL2.2.2 GL2.3.1 GL2.3.2 GL2.4.1 GL2.4.2 GL3.1.1 GL3.1.2 GL3.2.1 GL3.2.2 GL3.3.1 GL3.3.2 GL4.1.1

G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G7a G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G5a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J

3,16 3,16 3,91 3,91 3,28 3,28 3,45 3,45 3,17 3,17 3,20 3,20 2,60 2,60 2,59 2,59 2,32 2,32 1,95 2,08 2,80 2,80 2,52 2,52 2,31 2,31 2,43 2,43 2,32 1,92 1,92 2,22 2,22 1,95 2,10 2,10 2,23 2,18 2,18 2,66 2,66 3,16 3,16 2,28 2,28 2,77 2,77 3,03 3,03 2,76 2,76 3,44 3,44 2,33 2,33 2,27 2,27 3,39 3,39 3,18

634,914 958,925 553,567 434,269 669,682 949,758 591,010 510,263 369,517 366,095 692,510 568,291 1 176,628 981,479 650,219 363,375 821,598 329,229 477,570 413,027 991,948 953,647 553,074 765,701 640,815 1 096,588 723,197 1 029,117 421,158 502,104 252,681 660,144 542,284 883,165 758,530 783,387 547,482 495,959 679,315 595,611 591,084 430,722 430,623 376,420 664,193 437,781 587,262 515,363 578,206 687,809 697,252 646,795 482,622 394,133 369,338 922,225 666,746 664,277 711,516 341,666

0,326 0,362 0,376 0,244 0,358 0,375 0,368 0,312 0,201 0,243 0,316 0,306 0,358 0,373 0,366 0,213 0,267 0,118 0,137 0,222 0,360 0,313 0,241 0,323 0,184 0,312 0,292 0,340 0,276 0,294 0,141 0,228 0,329 0,233 0,274 0,200 0,137 0,204 0,247 0,210 0,186 0,203 0,247 0,147 0,255 0,199 0,245 0,272 0,219 0,224 0,300 0,298 0,254 0,213 0,198 0,247 0,253 0,240 0,240 0,207

118,959 173,010 113,030 62,479 127,312 182,132 128,136 97,759 51,758 54,440 123,265 112,064 238,215 206,230 153,549 63,932 139,208 30,388 53,326 71,729 191,190 185,373 87,648 148,450 85,800 215,413 119,584 178,432 80,744 103,996 28,028 98,922 122,442 140,820 140,283 105,002 57,595 78,771 123,195 88,962 81,562 68,249 69,445 42,508 122,098 59,230 92,098 86,797 75,519 106,172 137,078 110,703 78,660 68,149 51,660 156,865 120,833 95,579 107,452 57,083

9,273 10,520 8,912 10,861 8,994 12,712 11,235 12,445 12,380 7,016 11,675 12,634 18,651 18,220 13,199 13,693 16,321 14,492 18,974 13,999 14,648 17,223 12,205 12,164 16,624 16,676 10,834 11,246 9,220 11,304 10,869 16,610 11,529 20,163 14,895 18,526 15,024 14,911 16,011 15,367 17,105 13,843 7,822 14,144 15,847 12,031 12,565 8,918 10,320 13,381 13,587 9,948 9,495 12,120 10,005 18,221 15,065 10,542 10,933 9,021

GL4.1.2 GL4.2.1 GL4.2.2 GL4.3.1 GL4.3.2 GL4.4.1 GL4.4.2 GL5.3.1 GL5.3.2 GL5.4.1 GL5.5.2 GL5.1.1 GL6.2.1 GL6.3.2 GL6.4.2

G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J G6a-J

3,18 4,17 4,17 3,94 3,94 3,01 3,01 2,74 2,74 3,58 3,14 3,45 1,72 1,79 1,81

397,766 508,845 850,930 626,276 782,811 457,116 689,627 360,261 460,796 384,305 448,402 307,699 653,983 514,405 738,511

0,212 0,199 0,293 0,326 0,308 0,176 0,310 0,260 0,260 0,280 0,199 0,173 0,135 0,131 0,226

62,531 70,824 150,480 118,069 127,842 58,871 125,444 68,164 76,473 77,345 66,022 47,326 63,437 54,364 114,253

8,786 11,000 11,669 9,391 9,889 11,795 10,890 8,313 9,495 9,276 12,186 11,045 15,544 14,831 12,726

Houževnatost [MPa]

Tuhost [GPa]

164,399 175,762 63,719 86,054 173,593 184,832 72,633 80,209 56,438 119,522 101,361 93,808 70,021 87,771 84,528 154,805 95,966 211,573 171,337 76,97 175,118 87,607 115,026 117,267 68,285 92,645 175,967 127,882 57,338 128,997 193,017 113,397 27,102 177,330 184,603

18,080 17,539 14,808 17,523 15,530 13,573 9,585 13,493 11,932 14,008 14,293 7,732 11,060 12,950 14,237 12,756 10,700 15,804 14,861 22,480 15,585 21,489 14,812 12,249 12,022 11,499 11,605 12,555 11,271 12,467 15,160 17,405 17,124 15,808 14,461

Tabulka 8.2: Přehled výsledků měření Galleria mellonella (2008) Označení vzorku E1.2.1 E1.2.2 E1.3.1 E1.3.2 E1.5.1 E1.5.2 E2.1.1 E2.1.2 E2.4.1 E2.4.2 E2.5.2 E3.1.1 E3.1.2 E3.2.2 E3.4.2 E4.1.1 E4.1.2 E4.2.1 E4.2.2 E4.3.1 E4.3.2 E4.5.1 E4.5.2 E5.1.1 F1.4.2 F2.1.2 F2.2.1 F2.2.2 F2.5.1 F2.5.2 F3.1.1 F3.1.2 F3.4.2 F3.5.1 F3.5.2

Skupina G1b G1b G1b G1b G1b G1b G1b G1b G1b G1b G1b G1b G1b G1b G1b G1b G1b G1b G1b G1b G1b G1b G1b G1b G5b G5b G5b G5b G5b G5b G5b G5b G5b G5b G5b

Průměr vlákna [µ µm] 2,57 2,57 2,06 2,06 2,49 2,49 1,75 1,75 1,73 1,73 2,02 2,74 2,74 2,50 2,25 3,06 3,06 2,54 2,54 2,76 2,76 2,82 2,82 2,57 2,77 2,86 3,03 3,03 2,69 2,69 3,02 3,02 2,42 3,09 3,09

Max. napětí [MPa] 752,922 1188,897 560,387 717,156 1030,967 1114,256 440,185 639,221 506,375 767,398 740,861 638,627 568,235 755,988 649,216 1015,177 672,641 1492,742 1040,815 616,872 1233,527 847,054 842,553 763,660 454,248 442,987 891,937 687,073 396,137 726,794 1169,457 791,849 385,243 1098,363 1206,245

Relat. deformace [mm/mm] 0,254 0,244 0,152 0,182 0,271 0,293 0,224 0,180 0,157 0,231 0,194 0,270 0,207 0,197 0,176 0,270 0,227 0,275 0,262 0,159 0,263 0,155 0,215 0,238 0,211 0,295 0,333 0,289 0,196 0,316 0,310 0,228 0,078 0,290 0,295

F4.2.1 F4.2.2 F4.3.1 F4.3.2 F4.5.1 F4.5.2 F5.1.1 F5.1.2 F5.2.1 F5.2.2 F5.3.1 F5.3.2 K1.1.2 K1.2.1 K1.4.1 K1.4.2 K1.5.1 K1.5.2 K2.2.1 K2.2.2 K2.4.1 K2.4.2 K3.2.1 K3.3.1 K3.3.2 K3.4.1 K3.5.1 K3.5.2 K4.2.1 K4.2.2 K4.3.1 K5.1.1 K5.1.2 M1.1.1 M1.1.2 M1.2.1 M1.2.2 M1.3.1 M1.3.2 M1.5.1 M1.5.1 M2.1.2 M2.2.1 M2.3.1 M2.3.2 M3.1.1 M4.1.1 M4.1.2 M4.2.1 M4.3.1 M4.3.2 M4.4.1 M4.4.2 M4.5.1 M4.5.2

G5b G5b G5b G5b G5b G5b G5b G5b G5b G5b G5b G5b G7b G7b G7b G7b G7b G7b G7b G7b G7b G7b G7b G7b G7b G7b G7b G7b G7b G7b G7b G7b G7b G5b-J G5b-J G5b-J G5b-J G5b-J G5b-J G5b-J G5b-J G5b-J G5b-J G5b-J G5b-J G5b-J G5b-J G5b-J G5b-J G5b-J G5b-J G5b-J G5b-J G5b-J G5b-J

2,46 2,46 2,73 2,73 3,46 3,46 1,86 1,86 2,12 2,12 2,44 2,44 3,64 3,31 3,39 3,39 3,37 3,37 3,75 3,75 3,72 3,72 3,59 3,55 3,55 3,19 3,78 3,78 3,23 3,23 3,57 3,82 3,82 2,63 2,63 2,55 2,55 2,65 2,65 2,67 2,67 2,71 2,54 2,79 2,79 2,96 2,84 2,84 2,71 2,63 2,63 2,88 2,88 2,58 2,58

1096,897 1206,385 595,503 559,657 359,478 661,337 529,154 807,650 1234,181 1141,854 579,501 707,434 769,768 843,349 1208,169 1122,638 1013,113 655,756 1202,013 698,295 1295,806 1340,178 590,844 1151,051 791,540 1296,785 1004,428 926,767 885,393 855,158 1210,373 690,425 1114,568 808,954 1295,562 550,250 486,230 756,355 795,859 606,965 469,607 531,388 1281,933 798,131 419,844 501,354 1256,259 1120,073 694,701 378,025 343,965 619,294 647,635 706,898 551,671

0,249 0,256 0,184 0,077 0,172 0,307 0,232 0,307 0,237 0,269 0,221 0,291 0,251 0,287 0,265 0,268 0,308 0,214 0,284 0,182 0,168 0,268 0,163 0,218 0,222 0,291 0,191 0,163 0,227 0,268 0,269 0,235 0,312 0,292 0,354 0,246 0,172 0,205 0,275 0,267 0,223 0,240 0,264 0,244 0,096 0,136 0,272 0,301 0,187 0,112 0,235 0,263 0,314 0,167 0,146

161,768 172,643 72,970 39,099 47,260 113,621 91,372 158,383 182,370 169,559 92,385 133,767 99,971 135,402 161,357 162,147 172,732 88,297 181,521 92,296 116,730 199,322 70,096 154,931 106,831 207,623 121,538 110,657 108,476 121,854 182,528 98,37 181,188 188,103 270,960 94,651 64,264 96,116 130,188 99,522 72,582 70,497 172,530 130,646 30,964 49,541 174,361 188,327 84,696 33,399 49,146 107,320 128,298 83,218 65,619

19,649 18,740 13,814 31,134 11,625 9,219 12,715 13,917 21,200 16,346 14,945 13,548 9,061 9,401 12,397 11,488 9,355 8,904 15,329 18,374 17,432 16,582 14,702 16,158 11,587 16,371 17,751 20,149 9,360 10,831 13,318 11,060 12,118 20,147 18,643 14,463 18,435 17,115 13,885 12,044 12,247 8,429 15,936 15,670 16,494 13,569 17,815 16,525 15,912 15,105 6,773 14,797 12,096 20,267 18,757

Tabulka 8.3: Přehled výsledků měření Bombyx mori (2008) Označení vzorku BW1.3.1 BW1.3.2 BW2.3.1 BW2.3.2 BW3.3.1 BW3.3.2 BW3.4.1 BW3.5.1 BW3.5.2 BW4.1.1 BW4.1.2 BW4.2.2 BW4.3.1 BW4.3.2 BW4.5.1 BW4.5.2 BW5.1.1 BW5.1.2 BW5.3.1 BW5.3.2 BW5.5.1 BW5.5.2 BK1.2.1 BK1.2.2 BK1.4.1 BK1.4.2 BK2.1.1 BK2.1.2 BK2.2.1 BK2.2.2 BK2.3.1 BK2.3.2 BK3.1.1 BK3.1.2 BK3.2.2 BK3.3.1 BK3.3.2 BK4.1.1 BK4.3.1 BK4.3.2 BK4.4.1 BK4.4.2 BK4.5.1 BK4.5.2 BK5.1.1 BK5.1.2 BK5.2.1 BK5.2.2

Skupina BW BW BW BW BW BW BW BW BW BW BW BW BW BW BW BW BW BW BW BW BW BW BK BK BK BK BK BK BK BK BK BK BK BK BK BK BK BK BK BK BK BK BK BK BK BK BK BK

Průměr vlákna [µ µm] 7,02 7,02 6,20 6,20 6,38 6,38 6,95 6,28 6,28 6,41 6,41 6,28 6,21 6,21 5,61 5,61 6,19 6,19 5,73 5,73 6,66 6,66 4,84 4,84 5,52 5,52 5,82 5,82 5,63 5,63 5,69 5,69 5,74 5,74 5,61 5,85 5,85 5,61 5,17 5,17 5,13 5,13 5,20 5,20 5,50 5,50 5,63 5,63

Max. napětí [MPa] 31,698 28,967 32,232 27,656 31,938 29,967 28,211 27,923 27,508 27,356 25,953 38,395 20,703 24,347 25,257 27,615 37,054 41,637 20,629 25,632 39,860 37,513 40,680 29,855 37,612 40,265 38,032 32,988 37,982 35,811 31,993 37,139 39,514 36,813 35,649 36,690 38,598 38,479 35,667 34,698 35,084 36,418 38,870 39,404 30,611 33,678 29,334 31,684

Relat. deformace [mm/mm] 0,188 0,171 0,173 0,177 0,270 0,306 0,245 0,262 0,217 0,269 0,255 0,163 0,218 0,176 0,244 0,188 0,174 0,172 0,171 0,160 0,148 0,207 0,202 0,202 0,230 0,202 0,237 0,129 0,127 0,141 0,256 0,237 0,260 0,246 0,211 0,185 0,171 0,184 0,207 0,163 0,129 0,155 0,188 0,176 0,256 0,266 0,154 0,237

Houževnatost [MPa]

Tuhost [GPa]

134,895 123,591 121,032 110,585 233,870 252,958 168,424 195,211 133,553 195,348 181,685 143,302 131,321 100,691 140,067 111,703 169,927 167,222 77,374 107,382 139,737 195,234 173,147 142,320 202,318 182,278 213,834 87,106 90,564 96,263 225,459 224,858 288,674 239,422 171,041 157,307 151,738 141,232 183,143 138,241 90,158 121,818 167,793 158,661 228,032 244,012 97,471 189,709

675,035 925,558 909,247 840,067 1327,693 1282,524 1044,818 1116,528 865,871 761,988 1112,930 1154,137 878,260 762,159 786,309 789,969 1402,347 1373,774 593,258 913,361 1260,809 1198,446 821,830 917,663 1209,419 1253,606 1272,312 865,503 867,870 857,197 1291,895 1407,619 1580,057 1371,070 1104,994 1125,843 1160,211 713,645 1124,147 1129,816 840,808 918,284 1184,446 1068,910 1124,579 1292,833 777,010 1128,506

Vliv sericinů na kvalitu hedvábného vlákna

Recommend Documents