Vliv podmínek prostředí na biodegradaci polyvinylalkoholu. Bc. Martin Nedbálek

Vliv podmínek prostředí na biodegradaci polyvinylalkoholu

Bc. Martin Nedbálek

Diplomová práce 2008

ABSTRAKT Abstrakt česky Práce byla věnována rozkladu polyvinylalkoholu a některým vlastnostem degradačních bakteriálních kultur. Byly provedeny experimenty k vysvětlení příčin zpomalení degradace PVA aktivovaným kalem za podmínek trvalé přítomnosti tryptonu a sacharosy. Výsledky ukázaly, že tento jev není vyvolán substrátovou kompeticí ani nedostatkem minerálních látek ani účinkem metabolitů nedegradačních bakterií. Další pokusy ukázaly, že degradační schopnost studovaných bakterií je snížena při vyšší mineralizaci prostředí.

Klíčová slova: Biodegradace, polyvinylalkohol

ABSTRACT This work was focused on biodegradation of polyvinyl alcohol and some features of degradation bacteria. Experiments were made for explanation the reasons of retardation of degradation polyvinyl alcohol by activated sludge under the conditions of permanent presence of tryptone and sucrose. Results showed that this phenomenon is not evoked by substrate competition, absence mineral susbtances or action of metabolites of undegradation germs. Another tests displayed that degradation ability of studied germs is reduced in case of higher mineralization of environment.

Keywords: Biodegradation, polyvinyl alcohol,

UTB ve Zlíně Fakulta technologická, 2007

5

Na tomto místě bych rád poděkoval svému vedoucímu doc.RNDr. Janu Růžičkovi, Ph.D. a také konzultantce Ing. Tereze Václavkové. Dále patří mé poděkování celému kolektivu Ústavu inženýrství ochrany životního prostředí za vytvoření výborných pracovních podmínek.

Prohlašuji, že jsem na diplomové práci pracoval samostatně a použitou literaturu jsem citoval. V případě publikace výsledků, je-li to uvolněno na základě licenční smlouvy, budu uveden jako spoluautor.

Ve Zlíně.14. 5. 2008 ....................................................

OBSAH ÚVOD.................................................................................................................................... 9 I

LITERÁRNÍ REŠERŠE ..........................................................................................10

1

POLYVINYLALKOHOL ....................................................................................... 11

2

1.1

CHARAKTERISTIKA A VÝROBA ..............................................................................11

1.2

POUŽITÍ ................................................................................................................12

BIODEGRADACE POLYVINYLALKOHOLU .................................................. 13 2.1

MECHANISMUS ROZKLADU ...................................................................................13

2.2

BIODEGRADACE POLYVINYLALKOHOLU JEDNOU BAKTERIÁLNÍ KULTUROU ..........14

2.3

SYMBIOTICKÁ DEGRADACE POLYVINYLALKOHOLU ..............................................14

3

SYMBIOTICKÉ VZTAHY MEZI MIKROORGANISMY ................................ 16

4

ANTAGONISTICKÉ VZTAHY MEZI MIKROORGANISMY......................... 17

4.1 KOMPETICE ..........................................................................................................17 4.1.1 Kompetice o živiny ......................................................................................17 4.1.2 Kompetice o prostor .....................................................................................18 4.2 AMENZALISMUS (ANTIBIÓZA)...............................................................................18 4.2.1 Antibiotika....................................................................................................19 4.2.2 Bakteriociny .................................................................................................20 Bakteriociny produkované G+ bakteriemi ........................................................... 21 Bakteriociny produkované G- bakteriemi............................................................ 22 Syntéza bakteriocinů ............................................................................................ 23 Způsob účinku lanthibiotik .................................................................................. 23 Způsob účinku kolicinů ....................................................................................... 24 Antibakteriální spektrum ..................................................................................... 24 Imunita producenta a rezistence vůči bakteriocinům........................................... 25 4.2.3 Parazitismus a predace .................................................................................25 5 VÝSLEDKY PŘEDCHÁZEJÍCÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE ................................... 27 II

MATERIÁL A METODIKA ..................................................................................28

6

CHEMIKÁLIE, ROZTOKY A ŽIVNÁ MEDIA .................................................. 29

7

8

6.1

CHEMIKÁLIE .........................................................................................................29

6.2

ŽIVNÁ MÉDIA........................................................................................................34

6.3

BIOLOGICKÝ MATERIÁL ........................................................................................35

PŘÍSTROJE A LABORATORNÍ POMŮCKY .................................................... 36 7.1

PŘÍSTROJOVÉ VYBAVENÍ ......................................................................................36

7.2

LABORATORNÍ POMŮCKY .....................................................................................36

PRACOVNÍ POSTUPY........................................................................................... 37

9

10

11

12

13

14

8.1

DEGRADAČNÍ LAHVOVÉ TESTY .............................................................................37

8.2

STANOVENÍ KONCENTRACE PVA NA MIKROTITRAČNÍ DESTIČCE ..........................37

8.3

STANOVENÍ KONCENTRACE ROZPUŠTĚNÉHO ORGANICKÉHO UHLÍKU (DOC) ........38

8.4

RŮSTOVÉ TESTY ...................................................................................................39

8.5

PŘÍPRAVA SUPERNATANTU KALU KULTIVOVANÉHO S PŘÍDAVKY ŽIVIN ................39

8.6

STANOVENI PH .....................................................................................................39

ZKOUŠKY ROZKLADU PVA ČISTÝMI KULTURAMI Ž-1 A OT-2 ............. 41 9.1

ÚVOD ...................................................................................................................41

9.2

ROZVRŽENÍ POKUSU .............................................................................................41

9.3

VÝSLEDKY POKUSU ..............................................................................................42

ZKOUŠKY ROZKLADU PVA NEADAPTOVANÝM KALEM ZA PŘÍTOMNOSTI MINERÁLNÍCH LÁTEK ......................................................... 44 10.1

ÚVOD ...................................................................................................................44

10.2


10.3

VÝSLEDKY POKUSU ..............................................................................................45

ZKOUŠKY ROZKLADU PVA NEADAPTOVANÝM KALEM ZA PŘÍTOMNOSTI MINERÁLNÍCH LÁTEK II ..................................................... 47 11.1

ÚVOD ...................................................................................................................47

11.2


11.3

VÝSLEDKY POKUSU ..............................................................................................48

ZKOUŠKY ROZKLADU PVA ČISTÝMI KULTURAMI JK2 A OT2 V PROSTŘEDÍ SUPERNATANTU KALU ŽIVENÉHO PŘÍDAVKY ŽIVIN ........................................................................................................................ 51 12.1

ÚVOD ...................................................................................................................51

12.2


12.3

VÝSLEDKY POKUSU ..............................................................................................52

POSOUZENÍ CITLIVOSTI PVA-DEGRADAČNÍCH KULTUR NA VYŠŠÍ KONCENTRACE FOSFOREČNANŮ ..................................................... 56 13.1

ÚVOD ...................................................................................................................56

13.2


13.3

VÝSLEDKY POKUSU ..............................................................................................57

POSOUZENÍ CITLIVOSTI PVA-DEGRADAČNÍCH KULTUR NA VYŠŠÍ KONCENTRACE FOSFOREČNANŮ II ................................................. 59

15

16

14.1

ÚVOD ...................................................................................................................59

14.2


14.3

VÝSLEDKY POKUSU ..............................................................................................59

ZKOUŠKY ROZKLADU PVA ČISTÝMI KULTURAMI OT2, JK2 A Ž1 V PROSTŘEDÍ SE ZVÝŠENOU KONCENTRACÍ FOSFOREČNANŮ .......... 64 15.1

ÚVOD ...................................................................................................................64

15.2


15.3

VÝSLEDKY POKUSU ..............................................................................................65

POSOUZENÍ CITLIVOSTI PVA-DEGRADAČNÍCH KULTUR NA VYŠŠÍ KONCENTRACE SOLÍ ............................................................................. 70 16.1

ÚVOD ...................................................................................................................70

16.2


16.3

VÝSLEDKY POKUSU ..............................................................................................71

ZÁVĚR ............................................................................................................................... 76 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY.............................................................................. 77 SEZNAM POUŽITÝCH SYMBOLŮ A ZKRATEK ..................................................... 80 SEZNAM OBRÁZKŮ ....................................................................................................... 81 SEZNAM TABULEK........................................................................................................ 82

UTB ve Zlíně, Fakulta technologická

9

ÚVOD Významným důsledkem lidských aktivit je bezesporu zanášení cizorodých látek do životního prostředí. Tato problematika se zdá být stále významnější neboť se vzrůstající životní úrovní narůstá i množství a rozmanitost látek, se kterými lidé zacházejí. Polyvinylalkohol je cizorodou látkou a může patřit k významným kontaminantům vodních toků i mořských ekosystémů. Proto je významné studovat aspekty jeho biologické rozložitelnosti včetně podmínek, za kterých biodegradace nastává či nenastává. Práce přímo navazuje na předchozí diplomovou práci, zaměřenou na vliv přídavných látek. Bylo zjištěno, že za podmínek trvalé přítomnosti lehce odbouratelných organických látek dochází ke zpomalení rozkladu PVA aktivovaným kalem.


I.

LITERÁRNÍ REŠERŠE

10


1

11

POLYVINYLALKOHOL

1.1 Charakteristika a výroba Polyvinylalkohol (PVA) je syntetický polymer se strukturu 1,3-glykolu patrnou z obrázku (Obr.1). Bílý prášek rozpustný ve vodě, kyselinách a odolný organickým rozpouštědlům. Není vyráběn polymerací odpovídajícího monomeru (vinylalkoholu) ale hydrolýzou polyvinylacetátu (PVAc). Stupeň této hydrolýzy a polymerační stupeň značně ovlivňují vlastnosti připraveného polymeru. Při 20% obsahu zbytkových acetátových skupin se jedná o orietovatelný termoplast s tendencí ke krystalizaci. Použití polyvinylalkoholu je možné v rozsahu teplot od –5oC do 140oC, nad 200oC se již rozkládá.[1, 2] PVAc je vyráběn radikálovou polymerací suspenzní i emulzní. Monomer se získává adicí kyseliny octové na acetylen. Samotný PVA se připraví hydrolýzou PVAc rozpuštěného v methanolu za katalýzy hydroxidem sodným viz obrázek (Obr. 2). Vhodně zvoleným množstvím NaOH, reakční teplotou a časem lze dosáhnout požadovaný obsah zbytkových acetátových skupin [2, 3].

Obr. 1. Idealizovaná struktura PVA

Obr. 2. Mechanismus výroby PVA z PVAc


12

1.2 Použití PVA má široké použití. Například výroba a úprava vláken v textilním průmyslu, úprava papíru, výroba barev, lepidel a kosmetiky. Zajímavé je také použití PVA jako chladící lázeň při zpracování kovů, dočasné pojivo při výrobě speciálních keramik, zahušťovadlo nebo stabilizátor suspenzí a na vnitřní výstelku benzínu-vzdorných hadic. Jinou oblast využití představuje výroba polyvinylacetalů založená na polymeranalogické kondenzaci PVA s aldehydy v prostředí minerální kyseliny. Takto se připravují polyvinylformal a polyvinylbutyral, polymery významné svou adhezí [2].


2

13

BIODEGRADACE POLYVINYLALKOHOLU Polyvinylalkohol je jeden z mála syntetických polymerů s čistě uhlíkatou kostrou, kte-

rý podléhá biodegradaci. Patří k významným kontaminantům vodních toků i mořských ekosystémů, což je dáno jeho rozpustností ve vodě a relativně širokým použitím.

2.1 Mechanismus rozkladu Při biodegradaci PVA se uplatňuje enzymová výbava některých mikroorganismů . Rozklad může probíhat s využitím symbiosy i čistou bakteriální kulturou. Předpokládá se náhodné štěpení uhlíkaté kostry, které probíhá ve dvou krocích. První krok může být oxidační nebo dehydrogenační. Kdy enzymy oxidasa nebo dehydrogenasa katalyzují vznik beta-diketonových struktur ze sousedních hydroxylových skupin na řetězci polymeru. Druhým krokem je hydrolytické rozštěpení řetězce katalyzované enzymem betadiketon-hydrolasou. K rozštěpení dochází v místě mezi oběma keto-skupinami a vznikají dva kratší fragmenty, z nichž jeden je zakončen skupinou methylketonu a druhý karboxylovou skupinou. V případě, kdy je počáteční krok rozkladu katalyzován enzymem dehydrogenasou je zapotřebí kofaktor pyrrolochinolinchinon, který může být předmětem symbiotického vztahu [4].

Obr. 3. Mechanismus rozkladu PVA [4]


14

2.2 Biodegradace polyvinylalkoholu jednou bakteriální kulturou Počáteční studie o mechanismu rozkladu PVA jsou publikovány od 70. let dvacátého století [4]. Práce Watanabeho a Suzukiho [5, 6] popisují rozklad PVA bakteriemi rodu Pseudomonas, které byly izolovány ze vzorku půdy a jsou schopné růstu za podmínek, kdy PVA je jediným zdrojem uhlíku. Degradace polymeru probíhá náhodným štěpením jeho uhlíkaté kostry v důsledku činnosti extracelulárně vylučovaného enzymu. V první fázi enzym oxidasa katalyzuje vznik β-diketonových struktur ze sousedních hydroxylových skupin na řetězci PVA, který má strukturu 1,3 glykolu. Činnost enzymů ze skupiny oxidas je spojena se spotřebou kyslíku a uvolňováním H2O2. Následnou hydrolýzou, kterou katalyzuje enzym β-diketonhydrolasa, dojde k rozštěpení řetězce polymeru za vzniku dvou kratších fragmenů, které jsou zakončeny skupinou methylketonu a karboxylovou skupinou. Jiný mechanismus rozkladu PVA představil Matsumura [7]. Kultura Alcaligenes faecalis izolovaná z říční vody je vybavena odlišným enzymem, dehydrogenasou, která v prvním kroku degradace PVA katalyzuje vznik β-hydroxyketonové struktury bez její další přeměny na β-diketon. Autor současně izoloval enzym aldolasu štěpící β-hydroxyketonové struktury. Porovnáním těchto dvou enzymů bylo zjištěno, že oba kroky rozkladu PVA katalyzuje jediný enzym, který obsahuje dehydrogenasové i aldolasové aktivní místo. Dehydrogenasová aktivita tohoto enzymu byla podmíněna specifickým kofaktorem pyrrolochinolinochinonem (PQQ) a Ca2+ ionty, které se podílejí na vazbě kofaktoru k enzymu [7, 8]. Další PVA dehydrogenasa, jejíž katalytickou aktivitu podmiňuje rovněž kofaktor PQQ, byla získána z kultury Pseudomonas sp. 113P3. Kultura byla schopná růstu v prostředí, kde PVA byl jediným zdrojem uhlíku. Autoři zjistili, že tato kultura nevylučovala enzym do prostředí. Tedy předpokládali, že vysokomolekulární řetězce PVA mohou být transportovány k membráně. PVA-dehydrogenasa byla určena jako membránově vázaná se schopností tvorby β-diketonových struktur [9].

2.3 Symbiotická degradace polyvinylalkoholu Klíčové studie v oblasti symbiotické degradace PVA provedl Shimao se svými spolupracovníky [10, 11]. Izolovali pár symbiotických partnerů se schopností rozkládat PVA.


15

Degradační bakterie byla identifikována jako Pseudomonas sp. VM15C. Tato bakterie byla schopna rozkladu PVA i v prostředí supernatantu jejího symbiotického partnera, identifikovaného jako Pseudomonas putida VM15A. Předmětem symbiosy byl přísun kofaktoru PQQ [11]. Symbiózu dvou bakterií, která je založená na přísunu kofaktoru PQQ, popsal také Kim se svými spolupracovníky. Identifikace této bakterie prokázala příslušnost k rodu Sphingomonas. Rozklad PVA touto bakterií probíhal pouze v přítomnosti symbionta nebo po přídavku PQQ 10 µg/dm3 [12]. Symbiosa při rozkladu PVA nemusí být založena pouze na předávání PQQ. Například kultura Pseudomonas vesicularis var povalolyticus rozkládá PVA jen v přítomnosti thiaminu a tří aminokyselin (cystin, isoleucin, tyrosin). Tyto látky ji může poskytnout symbiotický partner.


3

16

SYMBIOTICKÉ VZTAHY MEZI MIKROORGANISMY Symbioza při rozkladu cizorodých látek hraje pravděpodobně významnější roli než

rozklad čistými kulturami mikroorganismů. Ve smyslu pozitivních vztahů existují dvě základní možnosti. První z nich je mutualistická symbióza prospěšná pro všechny zúčastněné organismy a bývá obvykle založena na vzájemné výměně nezbytných růstových faktorů (vitamíny, aminokyseliny…). Druhá, komensalistická symbióza, představuje vztah, kdy jeden organismus má jistou výhodu a druhý není tímto ovlivněn. Například odstraňování H2O2 z prostředí, spotřeba O2 k umožnění růstu anaerobů a mnohé další. K základním principům symbiosy lze zařadit spolupráci založenou na: •

Předávání růstových faktorů

•

Odstraňování hromadících se toxických meziproduků

•

Sekvenční biodegradace

•

Spolupráce založená na shlukování

•

Zvyšování přístupnosti mikroorganismů k degradované látce

Více informací k uvedeným možným principům symbiotických vztahů je uvedeno v předchozí diplomové práci [13].


4

17

ANTAGONISTICKÉ VZTAHY MEZI MIKROORGANISMY Již v roce 1676 A. v Leeuwenhoek zdokumentoval antagonistické působení, ve kterém

produkt jednoho mikroorganismu inhibuje růst jiných. Koncem devatenáctého století Louis Pasteur společně s J.F. Joubertem prokázali inhibiční působení běžných bakterií na růst kultury Bacillus anthracis [14]. Tyto procesy a jejich kombinace jsou v mikrobiálním světě rozšířené a jejich přítomnost lze předpokládat v přirozených společenstvech. Například studie, ve které bylo prověřeno 51 různých bakterií izolovaných z organických agregátů mořské vody prokázala vzájemné inhibiční účinky po 11 dnech kultivace u více než 54 % z nich. Nejvyšší inhibiční aktivita byla zjištěna u bakterií z kmene Actinobacteria (80 %) [15]. Poznatky ze studia antagonistických vztahů mezi mikroorganismy mohou mít i průmyslový význam, např. v potravinářství. Bakterie mléčného kvašení (BMK) jsou využívány k potlačení růstu patogenních mikroorganismů přenášených potravou. BMK jsou mimořádně vhodné, inhibují růst patogenů několika různými způsoby bez nežádoucích senzorických změn [16]. Jinou význačnou oblastí využití antagonistických vztahů představuje problematika ochrany rostlin před patogenními mikroorganismy [17]. Vedle symbiotických vztahů uvedených v předchozí části nalézáme tedy četné formy antagonistiského působení mezi mikroorganismy, které může mít podobu kompetice (soutěže o nezbytné živiny či prostor), amenzalismu (antibióze), parazitismu nebo predace [18].

4.1 Kompetice 4.1.1

Kompetice o živiny Kompetice o stejné živiny je ovlivněna kvalitou enzymové výbavy uvažovaných

bakterií. Efektivnější využívání živin a schopnost rychlejšího růstu určité kultury mohou omezovat růst sousedních bakterií. Například rod Staphylococcus je znám citlivostí k vyčerpání živin a během růstu může být ovlivněn celou řadou přítomných bakterií. Koliformní bakterie působí nedostupnost nezbytných aminokyselin, rod Micrococcus roste mnohem rychleji a streptokokové inhibují stafylokoky vyčerpáním některých vitamínů [19]. Kompe-


18

tice je tak závislá na růstové rychlosti, na požadavcích po růstových faktorech a toleranci k biotickým i abiotickým faktorům. Předmětem kompetice mohou být také anorganické látky. Tato situace je dobře popsána v oblasti rhizosféry, kde dochází ke kompetici o železo. Za podmínek nedostatku železa některé bakterie (Pseudomonas spp.) produkují řadu komplexotvorných činidel, které mají vysokou afinitu k iontům železa. Takto nastává nedostupnost železa pro ostatní přítomné mikroorganismy a jejich růst je negativně omezen [17]. 4.1.2

Kompetice o prostor

Další možný způsob je soutěž o prostor. Výhodu zde poskytuje přítomnost jistých struktur na povrchu buňek. Jedná se zejména o bičíky a fimbrie, které usnadňují adhezi k povrchu a tím zlepšují schopnosti buněk využívat látky obsažené v podkladu [20, 21].

4.2 Amenzalismus (antibióza) Jedná se o interakci dvou mikroorganismů, z nich jeden (inhibitor) negativně působí na druhý (amenzál) a omezuje jeho vitalitu produkovanými látkami. Je vysoce pravděpodobné, že většina bakterií má schopnost produkce nějaké látky s protimikrobním účinkem [15, 22]. Tyto látky ovlivňují interakce v rámci jednoho bakteriálního druhu i mezidruhové interakce a jsou klíčovým faktorem při zachování rozmanitosti mikrobiálních společenstev [23]. Je možné rozlišit některé základní skupiny protimikrobních sloučenin::

•

anorganické inhibitory (sulfan, peroxid vodíku, dusitany…)

•

organické látky s malou ekologickou účinností (organické kyseliny a alkoholy…)

•

organické látky s velkou ekologickou účinností (antibiotika, bakteriociny)

I zde je možné nalézt celou řadu praktických aplikací těchto jevů, zejména v zemědělství a v potravinářském průmyslu.


19

Jako příklad lze uvést aplikaci Pseudomonas fluorescens, která je schopná produkovat 2,4-diacetylphloroglucinol. Produkce této látky umožní potlačit hnilobu brambor působenou patogenem Ervinia carotovora. Komerčně je dále využívána také aplikace Agrobacterium K84 produkující specifické antibiotikum agrocin 84 k potlačení patogenních kmenů Agrobacterium tumefaciens [17] . Další dobrý příklad poskytují bakterie mléčného kvašení aplikované v potravinářství, které jsou schopné inhibovat růst některých patogenů kyselým prostředím v důsledku produkce organických kyselin nebo produkcí různých protimikrobních látek (bakteriociny, reuterin, peroxid vodíku). Organické kyseliny produkované BMK zahrnují kyselinu mléčnou, octovou a propionovou. Tyto látky ovlivňují membránový potenciál a aktivní transport. Inhibiční účinek peroxidu vodíku je dán jeho oxidační schopností vůči membránovým lipidům a buněčným proteinům. Reuterin (3-hydroxypropionaldehyd) produkovaný druhem Lactobacillus reuteri je širokospektrální protimikrobní látka. Biosyntéza reuterinu vychází z glycerolu a je schopen inhibovat bakterie, houby, viry i prvoky [16, 24]. Pozornost je třeba věnovat méně známé produkci bakteriocinů (viz. dále). Jejich význam spočívá v širokém rozšíření (Bacteria i Archaea) a ve schopnosti působit ve velmi nízkých koncentracích proti konkrétnímu bakteriálnímu druhu [14].

4.2.1

Antibiotika K antibiotikům řadíme celou řadu látek, které lze získat z mikroorganismů, rostlin,

živočichů i pomocí chemické syntézy. Tyto látky musí být chemicky stabilní a již v nízkých koncentracích vykazovat smrtící nebo inhibiční účinky bez nežádoucích efektů. Antibiotika uplatňují svoji aktivitu různými způsoby, kdy působí na různé cíle zasažené buňky - například poškozují buněčnou stěnu, destabilizují cytoplazmatickou membránu, mění strukturu nukleových kyselin, inhibují činnost mikrobiálních enzymů nebo zasahují do syntézy proteinů či nukleových kyselin [25]. Mezi klasickými (klinickými) antibiotiky a bakteriociny lze nalézt několik odlišností. Odlišnosti spočívají ve způsobu syntézy, ve způsobu účinku a v dalších aspektech uvedených v tabulce (Tab. 1).


20

Tab. 1. Vybrané charakteristické aspekty bakteriocinů a tradičních antibiotik [25, 26]

Charakteristika

Bakteriociny

Antibiotika

Aplikace

Potravinářství, zemědělství

Klinika

Syntéza

Ribosomálně

Sekundární metabolismus

Aktivita

Limitované spektrum

Obvykle široké spektrum

Způsob působení

Především perforace membrány

Specifický cíl

Ano

Různá

Imunita producenta

4.2.2

Bakteriociny Gratia v roce 1925 dokumentoval schopnost E. coli produkovat látku, která může

inhibovat růst jiných taxonomicky příbuzných bakterií [25]. Následující pokusy, zaměřené na druh E.coli znamenaly zavedení termínu koliciny pro látky s podobným účinkem. Další provedený výzkum odhalil, že produkce těchto látek je běžná u mnohých G- i G+ bakterií. V roce 1953 byl Jacobem a jeho spolupracovníky zaveden obecnější termín bakteriociny [22]. Bakteriociny jsou antibakteriální látky bílkovinné povahy. Jsou běžně produkované mnohými bakteriemi a mají schopnost usmrtit nebo inhibovat růst jiných bakterií [26]. Základem všech bakteriocinů je různě dlouhý protein nebo více proteinů, popřípadě obsahují lipidické nebo sacharidické složky vázané k proteinu [14]. K základním charakteristikám patří také kladný náboj a hydrofobní povaha jisté části struktury bakteriocinu. Jsou také až na výjimky termostabilní, odolné vůči nízkému pH a slabým organickým rozpouštědlům. Významné je, že bakteriociny obecně působí v mnohem nižších koncentracích ve srovnání s jinou látkou produkovanou bakteriemi i ve srovnání s eukaryotními antibakteriálními


21

proteiny [27]. Například minimální inhibiční koncentrace pediocinu vůči Listeria sp. je uváděna 0,1 µg·l-1 [14]. Značně heterogenní skupina bakteriocinů může být rozdělena na produkty G- a G+ bakterií. Většina bakteriocinů G+ bakterií jsou složené jen z několika desítek aminokyselin, jsou termostabilní a jejich antibakteriální spektrum je širší než u bakteriocinů G- bakterií [28]. Produkty G- rodů jsou charakteristické úzkým spektrem účinnosti, požadavkem receptorové molekuly a vyšší molární hmotností [22].

Bakteriociny produkované G+ bakteriemi Například rody Lactococcus a Lactobacillus (a ostatní bakterie mléčného kvašení) jsou významnými producenty širokého spektra bakteriocinů. Jejich potenciál je řadu let využíván v potravinářství, kde zajišťují lepší trvanlivost produktů a potlačují rozvoj patogenních druhů. V rámci této rozmanité skupiny bakteriocinů lze rozlišovat 2 základní skupiny. První skupinu představují tzv. lanthibiotika, charakteristické posttranslační modifikací, kdy vzniká struktura lanthioninu z dehydrovaných zbytků některých aminokyselin [28]. Charakteristická je také přítomnost disulfidických vazeb. Například nisin produkovaný mléčnou bakterií Lactococcus lactis (studie 40 divokých kmenů L.lactis prokázala u 35 produkci nisinu [26] ), je běžně nacházen v kyselém mléce i jiných potravinách . Je znám jeho účinek na některé G- bakterie na celou řadu G+ bakterií včetně spór, které napadá ve stádiu bobtnání před vyklíčením [14, 29]. Strukturu nisinu tvoří 34 aminokyselin a je možné rozlišit 6 různých forem, z nichž nejvyšší aktivitu má nisin A uvedený na obrázku (Obr. 4).


22

Obr. 4. Struktura nisinu A [30]

Druhá skupina zahrnuje mnoho různých bakteriocinů, které však neobsahují lanthionin. Můžou být dvouřetězcové, známy jsou i bakteriociny s kruhovou strukturou. Širší spektrum antibakteriální aktivity v rámci této skupiny bylo prokázáno u bakteriocinů s vyšším počtem disulfidických vazeb, avšak obecně nedosahuje schopností lanthibiotik [27].

Bakteriociny produkované G- bakteriemi Nejstudovanější jsou koliciny produkované E.coli. Je to skupina asi 25 různých bakteriocinů, s relativně úzkým spektrem působnosti, které může být dáno potřebou specifického receptoru na cílové buňce [31, 32]. V následující tabulce (Tab. 2) jsou uvedeny konkrétní příklady G- producentů.

Tab. 2. Příklady G- producentů [33]


23

Počet zkoumaných druhů

Producenti bakteriocinů

Escherichia coli

27

12

Klebsiella pneumoniae

54

27

Klebsiella oxytoca

42

22

Klebsialla spp.

26

26

Enterobacter spp.

152

94

Citrobacter freundii

29

1

Serratia spp.

24

8

Hafnia alvei

42

10

396

190

Bakteriální druh

Celkem

Syntéza bakteriocinů Syntéza bakteriocinů se odehrává na ribozomech, čímž se zásadně odlišují od klasických antibiotik, které jsou sekundárními metabolity. Buňka producenta bakteriocinu vlastní geny kódující strukturní protein, proteiny působící při přípravě aktivní formy, transportní proteiny pro průchod membránou a proteiny zajišťující imunitu producenta [26]. Syntéza kolicinů nastává u malé části bakteriální populace. Je obvyklá za podmínek stresu (vyčerpání nutrientů, nedostatek prostoru) a může být indukována některými činidly [31]. Bakteriociny G+ bakterií mohou být produkovány během různých růstových fází. Streptococcus bovis produkuje bovicin jen během stacionární fáze růstu [34]. Jiné studie uvádějí, že Lactobacillus brevis produkuje bakteriociny mezi časně exponenciální a časně stacionární fází růstu [35]. Způsob účinku lanthibiotik Většina bakteriocinů G+ bakterií jsou membránově aktivní [22]. Konkrétně lanthibiotika inhibují cílovou buňku vytvořením pórů v cytoplazmatické membráně. V důsledku proděravění memrány dojde k úniku nitrobuněčného materiálu.


24

První fáze účinku zahrnuje nespecifické interakce mezi lanthibiotikem a membránou zasažené buňky. Tyto pochody jsou charakterizovány jako vratné a závislé na pH prostředí [25]. Může se uplatnit elektrostatická interakce opačných nábojů mezi kladně nabitým lanthibiotikem a záporně nabitou částí cytoplazmatické membrány. Proces je usnadněn přítomností tzv. přístavní molekuly (lipid 2-prekurzor peptidoglykanu) [26]. Během druhé fáze nastává silné přitažení hydrofobní části lanthibiotika k membráně, do které jsou vytvořeny póry asi 0,1 až 0,2 µm. Tímto je membrána depolarizována a dochází k rychlé ztrátě nezbytných iontů a látek z nitra buňky [25].

Způsob účinku kolicinů Koliciny vyžadují pro svůj účinek specifický receptor lokalizovaný na vnější membráně G- buňky. Receptorem může být bílkovina umožňující vstup specifických nutrientů (nukleosidů, vitamínu B12) [32].

Rozpoznání konkrétního kolicinu a jeho

transport do buňky jsou vysoce specifické procesy, zodpovědné zřejmě za úzké antibakteriální spektrum těchto látek. Po navázání na konkrétní receptor a po transportu do buňky (nebo k membráně) nastávají tři možnosti - tvorba pórů v membráně obdobná s působením lanthibiotik, degradace nukleových kyselin nebo inhibice proteosyntézy. Například kolicin s označením E1 inhibuje syntézu všech makromolekul bez ovlivnění respirace, kolicin E2 degraduje DNA a kolicin E3 neumožní proteosyntézu [14, 32].

Antibakteriální spektrum Může být definováno jako soubor bakterií, které jsou citlivé vůči uvažovanému bakteriocinu. Komplikace při hodnocení aktivity producenta bakteriocinu nastanou v případě syntézy několika druhů bakteriocinů jednou bakterií nebo v případě současného vlivu jiných látek. Citlivost může být ovlivněna skladbou buněčné stěny, nábojem, přítomností, dostupností nebo strukturou předpokládaného receptoru [27]. Významnou roli má také pH prostředí. Uvedené faktory působí především při počátečním kontaktu bakteriocinu s citlivou buňkou.


25

Například bakteriociny G+ bakterií inhibují mnohem více G- rodů, jejichž buněčná stěna je oslabena působením chemických činidel [22]. Výzkumy bakteriocinů v přírodních podmínkách se zástupci rodů Lactobacillus, Escherichia a Streptococcus předpokládají, že schopnost syntézy bakteriocinů je významnou kompetiční výhodou k eliminaci konkurence v rámci jedné ekologické niky. Naproti tomu většina G+ bakteriocinů eliminuje také bakteriální druhy, jejichž výskyt není pravděpodobný v nice proroducenta [14, 31].

Imunita producenta a rezistence vůči bakteriocinům Producenti bakteriocinů z G+ i G– kultur syntetizují imunitní proteiny, eliminují vliv produktu na vlastní buňku [14, 25]. V případě lanthibiotik je imunita zajištěna součinností dvou proteinů. První z nich je kotven na vnější straně cytoplazmatické membrány a pravděpodobně zabrání jejímu proděravění. Druhý protein zřejmě účinkuje v procesu navrácení molekuly lanthibiotika zpět do okolního prostředí. Tímto je v prostoru membrány udržována pod-kritická koncentrace bakteriocinu [14]. Množství publikovaných prací ukázalo, že další typ rezistence vůči působení bakteriocinů G+ kultur je založen na fyziologických změnách membrány cílové buňky [26] a třetím způsobem rezistence je produkce degradačního enzymu - v případě nisinu byla prokázána schopnost některých bakterií (Lactobacillus plantarum) produkovat enzym nisinasu, který katalyzuje jeho rozklad [29].

4.2.3

Parazitismus a predace Parazitismus je vztah dvou organismů, kde parazit získává živiny od hostitele,

obvykle jej poškozuje, ale obvykle bezprostředně nepůsobí smrt. Predace je usmrcení a požírání jednoho organismu jiným [18]. Oba vztahy existují v různých podobách mezi mikroorganismy a jinými organismy (parazitace bakterií na rostlinách či živočiších včetně člověka, predace bakterií prvoky nebo jinými mikroskopickými živočichy) a dá se předpokládat, že existují i na výhradně mikrobiální úrovni v bohatých společenstvech kalů, půd, kompostů či sedimentů. Jako příklady lze


26

uvést jednak parazitický druh bakterie Bdellovibrio bacteriovorus, který je znám svou schopností množit se v různých gramnegativních i grampozitivních buňkách, ale také predační vlastnosti některých myxobakterií, které požírají živé i mrtvé bakteriální buňky nebo kvasinky [36]. Konkrétní znalosti o vlivu těchto procesů na degradační procesy však nejsou známy.


5

27

VÝSLEDKY PŘEDCHÁZEJÍCÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE

Autor loňské diplomové práce zaměřené na vliv přídavných látek na biodegradaci polyvinyalkoholu zjistil, že v neadaptovaném aktivovaném kalu probíhá nejrychleji degradace PVA za podmínek, kdy je PVA jediným substrátem – zde proběhla úplná degradace polymeru již za cca 15 dní. Jakýkoliv přídavek dalších látek do směsi biodegradaci PVA zpomaloval. Pokud byly v degradační směsi přítomny PQQ a sekundární alkoholy, trvala úplná degradace PVA 17 dní, v případě přítomnosti tryptonu a sacharosy ve směsi proběhla degradace PVA nehledě na současnou přítomnost nebo nepřítomnost PQQ a sekundárních alkoholů za cca 28 dní. Dále byl studován mechanismus ovlivnění degradačního procesu přítomností živin. Nejprve bylo zjištěno, že přítomnost tryptonu a sacharosy růst těchto PVA degradačních kultur neinhibuje, ba naopak jim prospívá. V dalších doplňkových testech bylo zjištěno, že tyto kultury prakticky nejsou schopny ke svému růstu využívat sacharosu, jsou schopny využívat PVA a velmi dobře trypton. V závěrečných degradačních testech s neadaptovaným kalem byl prokázán inhibiční účinek organických látek na degradaci PVA i v případě samotného tryptonu a samotné sacharosy.


II. MATERIÁL A METODIKA

28


6

29

CHEMIKÁLIE, ROZTOKY A ŽIVNÁ MEDIA

6.1 Chemikálie Použité chemikálie byly čistoty p.a. Není-li uvedeno, jinak pocházejí od běžných dodavatelů jako jsou Lachema nebo Penta.

Polyvinylalkohol (PVA) Byl použit práškový PVA s obchodním označením MOWIOL 5-88. Kde první číslo značí viskozitu 4% vodného roztoku a druhé procentuální obsah odstraněných acetátových skupin.

Fyziologický roztok (FR) Bylo naváženo 8,5 g NaCl a rozpuštěno v 1000 ml destilované vody. Roztok byl vysterilizován při 125oC po dobu 20 minut.

Zásobní roztok PQQ (0,1 g·l-1) PQQ (FLUKA)……………...………………………..……………………………….2 mg 2 mg PQQ byly rozpuštěny ve 20 ml fyziologického roztoku a vysterilizovány skleněnou injekční stříkačkou přes filtr značky MILLEX GP o průměru pórů 0,22 µm.

Roztok pufru A Bylo naváženo 9,0788 g KH2PO4 a rozpuštěno v 1000 ml destilované vody.

Roztok pufru B Bylo naváženo 23,9032 g Na2HPO4.12 H2O a rozpuštěno v 1000 ml destilované vody.


30

Minerální médium (MM) Na přípravu 1000 ml minerálního média bylo použito: Roztok pufru A (KH2PO4 0,0667 mol·l-1)……..…..………….………….....................20 ml Roztok pufru B (Na2HPO4 0,0667 mol·l-1)…...….............…………….........................80 ml Destilovaná voda…………………………………..………….….……………..…….850 ml Roztok stopových prvků……………………………..………….………………………2 ml MgSO4.7H2O (10 g·l-1)………………………………...……….………………….......10 ml Fe(NH4)2(SO4)2.6 H2O (3 g·l-1)……………………………………………………......10 ml CaCl2.2 H2O (1 g·l-1)………………………………………....………………………..10 ml NaCl (50 g·l-1)………………………………………………...….…………………....10 ml NH4Cl (30 g·l-1)………………………………………………...…….………………..10 ml Příprava jednotlivých složek minerálního média: Roztoky solí MgSO4.7H2O (10 g·l-1)…………………………………....…………………..…….......1 g Fe(NH4)2(SO4)2.6 H2O (3 g·l-1)…………………….....………………………...…......0,3 g CaCl2.2 H2O (1 g·l-1)………………………………....…………………………...…...0,1 g NaCl (50 g·l-1)……………………………………………………………………...........5 g NH4Cl (30 g·l-1)……………………………………………………………………….....3 g Jednotlivé soli byly naváženy a rozpuštěny ve 100 ml destilované vody. Roztok stopových prvků Bylo naváženo: MnSO4 . 5 H2O….…………...……………………………………………………….0,043 g H3BO3……………………………………………………………………………...…0,057 g ZnSO4 . 7H2O……………...……………………………………………………...….0,043 g (NH4)6Mo7O24 . 4H2O……………………………………………………..………....0,037 g Co(NO3)2 . 6H2O……………...………………………………..…………………….0,025 g CuSO4 . 5H2O…………………...…………………………………..………………..0,040 g Navážená množství látek byla rozpuštěna v 1000 ml destilované vody.


31

Minerální média s upravenými objemy roztoků fosforečnanů Na přípravu 100 ml minerálního média bylo použito: Roztok pufru A (KH2PO4 0,0667 mol·l-1)…….………….…………...…...uvedeno v Tab. 3 Roztok pufru B (Na2HPO4 0,0667 mol·l-1)..................………………........ uvedeno v Tab. 3 Destilovaná voda…………………………………………….…….………uvedeno v Tab. 3 Roztok stopových prvků…………………………………………………..………… 0,2 ml MgSO4.7H2O (10 g·l-1)……………………………………………………...…….....…1 ml Fe(NH4)2(SO4)2.6 H2O (3 g·l-1)………………………………………...…………....…1 ml CaCl2.2 H2O (1 g·l-1)……………………………………………………………...……1 ml NaCl (50 g·l-1)………………………………………………………………………….1 ml NH4Cl (30 g·l-1)……………………………………………………………………...…1 ml

Tab. 3. Příprava minerálních médií s různou koncentrací fosforečnanového pufru Roztok A

Roztok B

Destilovaná

KH2PO4

Na2HPO4

voda

Koncentrace fosforečnanů

[ml]

[ml]

[ml]

[mmol·l-1]

MM 1F

2

8

85

6.67

MM 1,5F

3

12

80

10.0

MM 2F

4

16

75

13.3

MM 2,5F

5

20

70

16.7

MM 3F

6

24

65

20.0

Minerální médium

Minerální média se zvýšenou solností pomocí roztoků hydrogenuhličitanů

Na přípravu 100 ml minerálního média bylo použito: Roztok pufru A (KH2PO4

0,0667 mol·l-1)…….…………….……….….....................20 ml

Roztok pufru B (Na2HPO4 0,0667 mol·l-1)……................…..……………....…...........80 ml Roztok NaHCO3 (0,0667 mol·l-1).................…………….............................uvedeno v Tab.4 Roztok KHCO3 (0,0667 mol·l-1)..................………………....................…uvedeno v Tab. 4


32

Destilovaná voda…………………………………………….……………uvedeno v Tab. 4 Roztok stopových prvků…………………………………………………………….. 0,2 ml MgSO4.7H2O (10 g·l-1)………………………………………………………….....…..1 ml Fe(NH4)2(SO4)2.6 H2O (3 g·l-1)…………………………………………………..….…1 ml CaCl2.2 H2O (1 g·l-1)…………………………………………………………………...1 ml NaCl (50 g·l-1)…………………………………………………………………….……1 ml NH4Cl (30 g·l-1)………………………………………………………………………...1 ml

Tab. 4. Příprava minerálních médií se zvýšenou solností NaHCO3

KHCO3

destilovaná voda

[ml]

[ml]

[ml]

-

-

85

2Na

10

-

75

2K

-

10

75

3Na

20

-

65

3K

-

20

65

Minerální médium

1

Zásobní roztok živin tryptonu a sacharosy (TS) Bylo naváženo: Trypton (HIMEDIA)……..................................................................................................6 g Sacharosa...........................................................................................................................4 g Navážená množství látek byla rozpuštěna ve 100 ml destilované vody a roztok byl vysterilizován při 125 oC po dobu 20 minut.


33

Zásobní roztok živin se zvýšeným množstvím minerálních látek (MMTS) Na přípravu 10 ml MMTS bylo použito: Trypton …………. ……………………………….…….....………….…….………....0,6 g Sacharosa ……………………………………...……………………….….……….….0,4 g MgSO4.7H2O ………………………………….……….....………………….…......…0,4 g Fe(NH4)2(SO4)2.6 H2O ……………………...…………………………..….……..…0,12 g CaCl2.2 H2O ………………………………....…………………..………….…….…0,04 g NaCl …………………………………………………………………….……….....…...2 g NH4Cl ………………………………………………………………………….…...…1,2 g Roztok stopových prvků …...…………………………………………...…...……….0,1 ml Zásobní roztok PQQ (0,1 g·l-1) …..…………………………………………………….1 ml

Uvedené látky byly postupně rozpuštěny a nakonec doplněny na objem 10 ml destilovanou vodou. Roztok byl sterilizován při 125 oC po dobu 20 minut.

Roztok kyseliny borité (40 g·l-1) Bylo naváženo 40 g H3BO3 a rozpuštěno v 1000 ml destilované vody.

Roztok jodu s jodidem draselným V třecí misce bylo spolu s malými přídavky destilované vody důkladně rozmícháno 12,7 g I2 s 40 g KI. Tato směs byla poté kvantitativně převedena do odměrné baňky o objemu 1000 ml a byla doplněna destilovanou vodou po rysku.

Roztok hydroxidu sodného (cca 1 mol·l-1) Byly naváženy 4 g NaOH a rozpuštěny ve 100 ml destilované vody. Roztok NaOH byl využit při úpravě pH u degradačních lahvových testů.

Kyselina chlorovodíková (cca 1%) Roztok byl připraven ředěním koncentrované HCl destilovanou vodou.


34

6.2 Živná média

PVA agar s PQQ (koncentrace PVA 2 g·l-1) Na přípravu 100 ml bylo použito: Základ pro minerální agar …………………………………..................….....................1,9 g Destilovaná voda………………….........……………………….………...…………..100 ml Roztok stopových prvků …...………..………………………….….…......…………...0,2 ml PVA…...……………………...…………..…………………..….……….…..................0,2 g Zásobní roztok PQQ…..…….....…………..…………………..……………..............0,02 ml Daná množství látek byla rozpuštěna ve 100 ml destilované vody, pečlivě rozmíchána a vysterilizována při 125 oC po dobu 20 minut. Po sterilizaci a samovolném ochlazení na cca 50 oC byl agar asepticky rozlit do sterilních Petriho misek v laminárním boxu.

PVA agar s PQQ a kvasničným autolyzátem (koncentrace PVA 2 g·l-1) Na přípravu 100 ml bylo použito: Základ pro minerální agar ……………………………………............….......................1,9 g Destilovaná voda………………….........…………………………..………..………..100 ml Roztok stopových prvků……………..……………………………………...….……...0,2 ml PVA…...……………………...…………..…………………………………..................0,2 g Zásobní roztok PQQ…..……...…………..…………………………………..............0,02 ml Kvasničný autolyzát…………………………………………………………...……..0,005 g Daná množství látek byla rozpuštěna ve 100 ml destilované vody, pečlivě rozmíchána a vysterilizována při 125 oC po dobu 20 minut.


35

Trypton agar (koncentrace tryptonu 2 g·l-1) Na přípravu 100 ml bylo použito: Základ pro minerální agar …….……………………………….......................................1,9 g Destilovaná voda……………….….........……………………...……………………..100 ml Roztok stopových prvků……….……..…………………………...…………………...0,2 ml Trypton (HIMEDIA)………......…….........……………………………………………..0,2 g Daná množství látek byla rozpuštěna ve 100 ml destilované vody, pečlivě rozmíchána a vysterilizována při 125 oC po dobu 20 minut. Po sterilizaci a samovolném ochlazení na cca 50 oC byl agar asepticky rozlit do sterilních Petriho misek v laminárním boxu.

6.3 Biologický materiál

Aktivovaný kal z městské čistírny odpadních vod v Malenovicích. Kultura OT-2 izolovaná z aktivovaného kalu ČOV Otrokovice v roce 2004 v rámci DP Jiřího Riedla. Kultura JK-2 izolovaná z aktivovaného kalu ČOV Malenovice v roce 2006 Terezou Václavkovou. Kultura Ž-1 izolovaná rovněž z aktivovaného kalu v rámci předchozí DP Petra Zemana [13].


7

36

PŘÍSTROJE A LABORATORNÍ POMŮCKY

7.1 Přístrojové vybavení Analytické váhy KERN 770…….………………………………………..…………….SRN Předvážky KERN 440-47………………………………...…………..…….…….…….SRN Předvážky KERN EW……………………………………………….……..………......SRN Chlazená centrifuga MR23i………………………………….……………...Jouan, Francie Elektromagnetická míchačka MM 2A………………...…………Laboratorní přístroje, ČR Elektrická sušárna……………………………………...……………………….MORA, ČR Elektrický vařič…………………………………………...…………………...……….ETA Chladnička …………………………………………….…………………………Ardo, ČR Hlubokomrazící box Chest Freezer…………………….………….…….Bio Tech, Dánsko Třepačka 3018 GFL……………………………………….………….……………..…SRN Laboratorní autokláv……………………………………..….Sanoclav, St-MCS-203, SRN Spektrofotometr TECAN, pro mikrotitrační destičky…………......................Sunrise, USA Analyzátor uhlíku 5000A…………….…………………….………....Shimadzu, Japonsko pH metr OP – 208 + skleněná elektroda……………………..………..Radelkis, Maďarsko Aseptický laminární box……………………….…………….………….Telstar, Španělsko Termobox na 25 ˚C……………………………..…..…………………....……..ÚIOŽP, FT

7.2 Laboratorní pomůcky 96-jamková mikrodestička……………………...……………...…..Gama, Česká Republika Membránový filtr Pragopor 7, φ 50 mm, φ pórů 0,3 µm…………….………….Pragochema


8

37

PRACOVNÍ POSTUPY

8.1 Degradační lahvové testy Degradační testy byly prováděny ve skleněných lahvích s tekutým minerálním médiem, ve kterém byl rozpuštěn polyvinylalkohol (výsledná koncentrace okolo 500 mg·l1

). Lahve byly zaočkovány buďto konkrétní čistou kulturou PVA-degradéra nebo

aktivovaným kalem. Objem plynné fáze v uzavřené láhvi zaujímal přibližně čtyřnásobek objemu fáze kapalné. Kultivace probíhala na reciproké třepačce s konstantní frekvencí kmitů ve tmě při 25oC. Ve zvolených intervalech byly odebírány vzorky pro stanovení koncentrace PVA nebo vzorky pro stanovení rozpuštěného organického uhlíku. Po dobu 20 minut po odběru vzorků byly láhve provzdušňovány v laminárním boxu. Dle potřeby bylo kontrolováno a případně upraveno pH pomocí roztoku NaOH.

8.2 Stanovení koncentrace PVA na mikrotitrační destičce Bylo prováděno spektrofotometricky na mikrotitrační destičce. Vždy do šesti jamek byly dávkovány centrifugované vzorky 20 µl, dále 42 µl roztoku kyseliny borité a 10 µl roztoku jodu s jodidem draselným. Vzniká tmavě zelené zabarvení komplexu PVA s trijodidem, jehož absorbance byla měřena přístrojem TECAN při vlnové délce 660nm po 20 sekundách míchání a 5 sekundách klidu. Po odečtení absorbance prázdné destičky byly hodnoty absorbance vzorků zprůměrovány (u každého vzorku vždy provedeno minimálně 5 paralelních stanovení) a dosazeny do rovnice kalibrační přímky - viz obrázek 5 . Takto byla stanovena koncentrace PVA v mg·l-1 . Kalibrační závislost byla zjištěna proměřením připravených roztoků PVA v rozsahu koncentrací uvedených v tabulka (Tab. 5). Proložení přímkou pomocí programu Excel poskytlo rovnici uvedenou na obrázku (Obr. 5).


38

Tab. 5. Hodnoty absorbancí kalibračních roztoků PVA cPVA [mg·l-1]

0

50

125

250

500

750

1000

A [1]

0,0055

0,095

0,274

0,530

1,118

1,653

2,175

Směr.odch. 0,0022

0,0087

0,0082

0,0450

0,0373

0,0604

0,1000

2,5

Absorbance [1]

2,0

A = 0,0022 c - 0,002 R2 = 0,9997

1,5 1,0 0,5 0,0 0

200

400

600

800

1000

-1

Koncentrace PVA [mg·l ] Obr. 5. Kalibrační závislost absorbance na koncentraci PVA

8.3 Stanovení koncentrace rozpuštěného organického uhlíku (DOC) K tomuto stanovení bylo nutné ze vzorků odstranit buňky degradačních bakterií, což se provedlo centrifugací vzorku v režimu 5000 g, při 20oC, po dobu 10 minut. Získaný supenatant byl zředěn podle předpokládané koncentrace PVA na úrověň koncentrace uhlíku pod 100 mg·l-1 (kalibrace analyzátoru uhlíku Shimadzu 5000A), ředění bylo později zohledněno. Na přístroji Shimadzu byla stanovena koncentrace celkového uhlíku (TC v mg·l-1) a koncentrace anorganického uhlíku (IC v mg·l-1). Rozdíl těchto hodnot představoval kon-


39

centraci celkového organického uhlíku (TOC), vzhledem k centrifugaci vzorků však šlo o koncentraci rozpuštěného organického uhlíku.

8.4 Růstové testy Byly provedeny ve sterilních mikrotitračních destičkách se 160 µl tekutého minerálního média. Jako substrát byl použit trypton (výsledná koncentrace 3 g·l-1). Jamky byly inokulovány suspenzí PVA-degradačních kultur. Kultivace probíhala v klidu a tmě při 25 oC. Růst buněk byl sledován měřením absorbance kultivačního média při vlnové délce 600 nm.

8.5 Příprava supernatantu kalu kultivovaného s přídavky živin Aktivovaný kal byl kultivován v minerálním médiu s pravidelnými přídavky roztoků živin tryptonu a sacharosy za stejných podmínek jako při degradačních testech. Po devíti dnech kultivace byl obsah lahví zbaven biomasy a jiných částic centrifugací v režimu 4000 ot/min, při 15oC, po dobu 11 minut. Supernatant byl dále asepticky přefiltrován přes převařený membránový filtr Pragopor číslo 7, φ 50 mm, φ pórů 0,3 µm. Takto byl získán kalový supernatant s možným obsahem protimikrobních látek (antibiotika, bakteriociny), který byl použit k přípravě minerálního média pro růst PVAdegradérů.

8.6 Stanoveni pH Během pokusů byl používán pH-metr OP – 208 se skleněnou elektrodou. Před každým měřením byl přístroj kalibrován pomocí dvou pufrů o pH menším a větším než měřený vzorek Měření bylo provedeno za stálého míchání.


III.

40

VÝSLEDKY A DISKUSE


9

41

ZKOUŠKY ROZKLADU PVA ČISTÝMI KULTURAMI Ž-1 A OT-2

9.1 Úvod Na základě výsledků předchozí diplomové práce [13], která zaznamenala zpomalení rozkladu PVA aktivovaným kalem v důsledku trvalé přítomnosti lehce odbouratelných živin bylo třeba posoudit vliv přítomnosti živin na degradační schopnosti vybraných čistých kultur PVA - degradérů OT-2 a Ž-1. Tyto byly kultivovány za podmínek degradačních lahvových testů (viz kapitola 8.1) v trvalé přítomnosti a nepřítomnosti živin tryptonu a sacharosy (TS).

9.2 Rozvržení pokusu V rámci tohoto pokusu byly nasazeny čtyři série s třemi paralelními lahvemi vedle sebe, podle rozpisu: 1) Kultura Ž1 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + FR 3x týdně 2) Kultura Ž1 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + FR 3x týdně 3) Kultura Ž1 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + FR 3x týdně 4) Kultura Ž1 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + živiny TS 3x týdně 5) Kultura Ž1 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + živiny TS 3x týdně 6) Kultura Ž1 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + živiny TS 3x týdně 7) Kultura OT2 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + FR 3x týdně 8) Kultura OT2 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + FR 3x týdně 9) Kultura OT2 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + FR 3x týdně 10) Kultura OT2 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + živiny TS 3x týdně 11) Kultura OT2 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + živiny TS 3x týdně 12) Kultura OT2 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + živiny TS 3x týdně


42

Vždy v pondělí, středu a pátek bylo odebráno 250 µl vzorků z každé láhve a doplněno 250 µl sterilního fyziologického roztoku (FR) nebo roztoku živin TS. Ve zvolených intervalech byla měřena koncentrace PVA spektrofotometricky.

9.3 Výsledky pokusu Pokus byl prováděn po dobu 18 dnů. Průběh rozkladu PVA v jednotlivých sériích je patrný z obrázku (Obr. 6). Hodnoty v grafu odpovídají průměru ze tří stanovení a chybové úsečky směrodatným odchylkám, viz. tabulka (Tab. 6).

Tab. 6. Hodnoty koncentrace PVA (mg·l-1) a směrodatných odchylek v průběhu pokusu Láhev č.

Doba

Průměr

Sm.odch .

Láhev č.

Průměr

Sm.odch .

[dny]

1

0

482,3

496,4 494,2

491,0

7,59

502,7 502,6 503,3

502,9

0,35

4

502,3

510,9 477,6

497,0

17,29

494,1 511,8 502,9

502,9

8,86

7

469,5

481,4 487,3

479,4

9,03

472,4 450,9 423,5

448,9

24,54

11

483,7

491,4 498,7

491,3

7,50

242,2 167,8 161,2

190,4

44,98

14

459,3

475,0 481,2

471,8

11,28

129,9 128,8 96,2

118,3

19,17

18

469,2

494,5 486,2

483,3

12,89

113,6 111,6 82,2

102,5

17,59

Průměr

Sm.odch .

Láhev č.

Průměr

Sm.odch .

Doba

2

3

Láhev č.

4

5

6

[dny]

7

0

501,0

491,3 495,7

496,0

4,87

489,0 498,6 479,4

489,0

9,62

4

315,9

451,4 416,5

394,6

70,33

340,6 373,6 380,5

364,9

21,33

7

94,9

121,6 113,1

109,9

13,64

195,4 165,1 160,6

173,7

18,92

11

90,9

106,4 94,2

97,2

8,14

178,4 175,8 160,2

171,5

9,82

14

78,8

86,3

80,4

81,8

3,96

188,9 159,8 151,2

166,6

19,78

18

82,4

86,8

87,0

85,4

2,60

177,7 160,4 152,4

163,5

12,95

8

9

10

11

12


43

-1

Koncentrace PVA [mg·l ]

500 400 300 200 100 0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

t [d] kultura Ž-1 bez živin kultura OT-2 bez živin

kultura Ž-1 + trypton, sacharosa kultura OT-2 + trypton, sacharosa

Obr. 6. Závislost koncentrace PVA na čase

Průběh rozkladu PVA ve všech lahvích je patrný z obrázku (Obr. 6). V případě kultury s označením OT-2 proběhla degradace polymeru bez ohledu na přítomnost živin již za 7 dnů a po této době se zbytková koncentrace PVA v lahvích jednotlivých sérií již neměnila. Kultura Ž-1 degradovala PVA pouze v přítomnosti živin a koncentrace PVA již neklesala po 14ti dnech pokusu. Nerozběhnutí degradace v lahvích první série mohlo být způsobeno tím, že kultura Ž-1 zřejmě potřebuje k úspěšnému rozkladu polymeru některou aminokyselinu obsaženou v tryptonu. Na konci pokusu bylo změřeno pH v každé láhvi. U kultury Ž-1 se pH ve všech lahvích pohybovalo okolo hodnoty 7,1. U kultury OT-2 kolem pH 6,7. Závěrem pokusu je tedy, že přítomnost živin neovlivňuje degradační schopnosti použitých kultur. Tímto je potvrzeno, že zpomalení rozkladu PVA kalem v přítomnosti živin, zaznamenané v předchozí diplomové práci [13], není způsobeno upřednostněním rozkladu živin před PVA, ale jiným faktorem.


44

10 ZKOUŠKY ROZKLADU PVA NEADAPTOVANÝM KALEM ZA PŘÍTOMNOSTI MINERÁLNÍCH LÁTEK

10.1 Úvod Dalším možným důvodem zpomalení rozkladu PVA kalem v přítomnosti živin by teoreticky mohl být nedostatek minerálních látek, vyvolaný množením jiných heterotrofních bakterií. Pokus byl nasazen s cílem vyloučit nebo prokázat nedostupnost minerálních látek PVA-degradérům v důsledku kompetice mezi pomalu rostoucími degradéry a ostatními mikroorganismy aktivovaného kalu, jejichž růst je umožněn přídavky živin. Za podmínek degradačních testů (viz. kap. 8.1) byly nasazeny tři série lahví. V první sérii byl PVA jediným substrátem, v druhé sérii byla zajištěna trvalá přítomnost lehce odbouratelných živin pravidelnými přídavky roztoku tryptonu se sacharosou. V poslední sérii byly vedle tryptonu a sacharosy pravidelně dodávány minerální látky obsažené v roztoku MMTS, jehož složení je uvedeno v kapitole 6.1 .

10.2 Rozvržení pokusu V rámci tohoto pokusu připraveny tři série se třemi paralelními lahvemi vedle sebe, podle rozpisu: 1) MM + KAL 0,5g·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + FR 3x týdně 2) MM + KAL 0,5 g·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + FR 3x týdně 3) MM + KAL 0,5 g·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + FR 3x týdně 4) MM + KAL 0,5 g·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + živiny TS 3x týdně 5) MM + KAL 0,5 g·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + živiny TS 3x týdně 6) MM + KAL 0,5 g·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + živiny TS 3x týdně 7) MM + KAL 0,5 g·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + MMTS + K2HPO4 3x týdně 8) MM + KAL 0,5 g·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + MMTS + K2HPO4 3x týdně 9) MM + KAL 0,5 g·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + MMTS + K2HPO4 3x týdně


45

Vždy v pondělí, středu a pátek bylo odebráno 250 µl vzorků z každé láhve a doplněno 250 µl sterilního fyziologického roztoku, roztoku živin, nebo roztoku živin a minerálních látek. Do lahví 7, 8 a 9 byl dále dávkován pevný K2HPO4 (100 mg/100 ml). Ve zvolených intervalech byla měřena koncentrace PVA spektrofotometricky.

10.3 Výsledky pokusu Pokus trval 14 dnů. Za celou dobu se rozklad PVA nestačil rozběhnout ani v jedné sérii lahví, jak je patrné z obrázku (Obr. 7). Hodnoty v grafu odpovídají průměru ze tří stanovení a chybové úsečky směrodatným odchylkám uvedeným v tabulce (Tab. 7).

Tab. 7. Hodnoty koncentrace PVA (mg·l-1) a směrodatných odchylek v průběhu pokusu Láhev č.

Doba [dny]

1

2

Láhev č.

Průměr Sm.odch. 3

4

5

Průměr Sm.odch. 6

0

412,6 420,2 422,4

418,4

5,16

415,6 411,3 390,6

405,8

13,34

4

350,8 344,6 347,1

347,5

3,12

360,4 349,1 356,0

355,2

5,69

7

355,4 343,7 361,9

353,7

9,20

361,2 354,8 356,1

357,4

3,39

11

333,8 339,6 354,2

342,5

10,54

351,3 347,7 333,1

344,0

9,66

14

341,6 340,0 344,9

342,2

2,48

353,3 346,4 353,6

351,1

4,07

Doba

Láhev č.

[dny]

7

8

Průměr Sm.odch. 9

0

395,6 394,8 415,2

401,9

11,54

4

356,8 344,8 354,0

351,9

6,30

7

354,3 343,0 352,0

349,8

5,95

11

335,4 345,3 340,4

340,4

4,95

14

341,8 342,8 349,1

344,6

3,98


46

-1


500 400 300 200 100 0 0

2

4

6

8 t [d]

10

12

14

16

KAL + PVA KAL + PVA + trypton a sacharosa KAL + PVA + trypton a sacharosa + minerální látky


Důvodem nerozběhnutí degradace byla zanedbaná kontrola pH v průběhu pokusu. Průměrná hodnota pH naměřená před likvidací, byla nejnižší v té sérii, kde byl PVA jediným substrátem (pH = 4,40), v sérii s přídavky živin bylo zjištěno pH = 5,38 a v sérii s minerály pH = 5,92 . Tento pokles pH lze vysvětlit přítomností fosfor akumulujících bakterií v použitém kalu, neboť v případě rozkladu PVA čistými kulturami nebyl tak výrazný pokles pH zaznamenán.


47

11 ZKOUŠKY ROZKLADU PVA NEADAPTOVANÝM KALEM ZA PŘÍTOMNOSTI MINERÁLNÍCH LÁTEK II

11.1 Úvod Tento eperiment byl v podstatě zopakováním předchozího, s cílem vyloučit nebo prokázat nedostupnost minerálních látek PVA-degradérům v důsledku kompetice mezi pomalu rostoucími degradéry a ostatními mikroorganismy aktivovaného kalu, jejichž růst je umožněn přídavky živin. Byly nasazeny tři série lahví. V první sérii byl PVA jediným dostupným substrátem, v druhé sérii byla zajištěna trvalá přítomnost lehce odbouratelných živin pravidelnými přídavky roztoku tryptonu a sacharosy. V poslední sérii byly vedle tryptonu a sacharosy pravidelně dodávány minerální látky obsažené v roztoku MMTS, jehož složení je uvedeno v kapitole 6.1.

11.2 Rozvržení pokusu V rámci tohoto pokusu byly připraveny tři série se třemi paralelními lahvemi, podle rozpisu: 1) MM + KAL 0,5g·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + FR 3x týdně 2) MM + KAL 0,5g·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + FR 3x týdně 3) MM + KAL 0,5g·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + FR 3x týdně 4) MM + KAL 0,5g·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + živiny TS 3x týdně 5) MM + KAL 0,5g·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + živiny TS 3x týdně 6) MM + KAL 0,5g·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + živiny TS 3x týdně 7) MM + KAL 0,5g·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + MMTS + K2HPO4 3x týdně 8) MM + KAL 0,5g·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + MMTS + K2HPO4 3x týdně 9) MM + KAL 0,5g·l-1 + PVA 500 mg·l-1 + MMTS + K2HPO4 3x týdně


48

Vždy v pondělí, středu a pátek bylo odebráno 250 µl vzorků z každé láhve a doplněno 250 µl sterilního fyziologického roztoku, roztoku živin, nebo roztoku živin a minerálních látek. Do lahví 7, 8 a 9 byl dále průběžně přidáván pevný K2HPO4 (100 mg/100 ml). Ve zvolených intervalech byla měřena koncentrace PVA spektrofotometricky a po zkušenostech z předchozího pokusu bylo pravidelně kontrolováno a upravováno pH pomocí roztoku NaOH na hodnoty 7,5 - 7,7.

11.3 Výsledky pokusu Pokus trval 32 dnů. Průběh rozkladu PVA v jednotlivých sériích je patrný z obrázku (Obr. 8). Hodnoty v grafu odpovídají průměru ze tří paralelních stanovení a chybové úsečky směrodatným odchylkám viz. tabulky (Tab. 8). Sedmý den pokusu došlo k rozbití láhve s číslem 1 a od tohoto dne výsledky první série lahví odpovídají jen dvěma stanovením.

Tab. 8. Hodnoty koncentrace PVA (mg·l-1) a směrodatných odchylek v průběhu pokusu Doba [dny]

Láhev č. 1

2

Průměr 3

Sm.odch .

Láhev č. 4

5

Průměr

Sm.odch .

6

0

434,2 449,8 441,1

441,7

7,86

464,9 451,1 463,4

459,8

7,56

2

435,6 428,3 447,3

437,0

9,59

451,1 454,8 439,6

448,5

7,93

4

435,5 453,7 449,1

446,1

9,46

448,3 472,4 458,5

459,7

12,09

7

464,5 454,1 445,5

454,7

9,47

430,9 451,6 448,2

443,6

11,09

9

405,8 434,3

420,1

20,13

457,8 457,0 462,3

459,0

2,89

11

349,7 356,7

353,2

4,98

454,8 436,1 465,2

452,0

14,74

14

260,7 257,4

259,1

2,34

416,5 412,4 459,0

429,3

25,80

16

189,9 204,0

196,9

9,93

330,7 301,2 359,4

330,4

29,11

18

114,2 111,0

112,6

2,30

121,8 157,4 140,9

140,0

17,84

21

66,8

36,1

51,4

21,75

57,3 109,9 74,7

80,6

26,81

23

26,5

14,7

20,6

8,31

17,2

34,8

18,28

53,7

33,6


49

Tab. 8. pokračování Láhev č.

Doba [dny]

7

8

Průměr Sm.odch. 9

0

451,1 454,2 433,9

446,4

10,90

2

440,4 441,1 441,1

440,8

0,39

4

470,1 473,9 433,2

459,1

22,49

7

453,2 457,6 446,1

452,3

5,81

9

454,2 453,6 465,5

457,7

6,68

11

431,8 455,2 451,7

446,3

12,63

14

412,7 421,9 421,4

418,7

5,17

16

387,0 397,0 405,4

396,4

9,22

18

363,1 393,8 373,1

376,6

15,66

21

376,2 365,5 377,7

373,2

6,66

23

366,6 375,2 388,4

376,7

10,96

29

319,5 363,0 350,5

344,3

22,38

32

340,3 351,6 336,5

342,8

7,85

-1


500 400 300 200 100 0 0

2

4

6

8

10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 t [d]

KAL + PVA KAL + PVA + trypton a sacharosa KAL + PVA + trypton a sacharosa + minerální látky



50

Podle očekávání nejrychleji byl PVA rozložen v sérii, kde byl jediným dostupným substrátem. Rozklad v sérii s pravidelnými přídavky živin byl zpomalen, avšak toto zpomalení nebylo příliš výrazné. Pravidelné přídavky minerálních látek s živinami (MMTS) do lahví poslední série nevedly ke zlepšení rozkladu PVA v přítomnosti živin, ale naopak působily inhibičně. Z toho plyne, že nedostatek minerálních látek není příčinou zpomalení rozkladu PVA v přítomnosti živin. Během tohoto pokusu bylo také pravidelně měřeno a upravováno pH degradačních směsí. Nejvýraznější pokles hodnot pH byl zaznamenán mezi čtvrtým a sedmým dnem pokusu, kdy pH pokleslo z hodnoty 7,5 na hodnotu okolo pH = 5,2 v sérii kde byl PVA jediným substrátem i v sérii s přídavky živin.


51

12 ZKOUŠKY ROZKLADU PVA ČISTÝMI KULTURAMI JK2 A OT2 V PROSTŘEDÍ SUPERNATANTU KALU ŽIVENÉHO PŘÍDAVKY ŽIVIN

12.1 Úvod Cílem tohoto pokusu bylo ověřit, zda metabolity heterotrofních bakterií, množících se na tryptonu či sacharose, mohou ovlivňovat degradační schopnosti PVA-degradérů. Proto byl připraven supernatant kalu podle postupu uvedeného v kapitole 8.5 a tento byl použit jako prostředí degradačních testů v porovnání s rozkladem v prostředí minerálního média.

12.2 Rozvržení pokusu V rámci tohoto pokusu byly nasazeny čtyři série s třemi paralelními lahvemi, podle rozpisu: 1) Kultura JK2 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + supernatant kalu + PVA 500 mg·l-1 2) Kultura JK2 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + supernatant kalu + PVA 500 mg·l-1 3) Kultura JK2 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + supernatant kalu + PVA 500 mg·l-1 4) Kultura JK2 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 5) Kultura JK2 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 6) Kultura JK2 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 7) Kultura OT2 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + supernatant kalu + PVA 500 mg·l-1 8) Kultura OT2 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + supernatant kalu + PVA 500 mg·l-1 9) Kultura OT2 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + supernatant kalu + PVA 500 mg·l-1 10) Kultura OT2 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 11) Kultura OT2 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 12) Kultura OT2 v MM s PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1


52

V průběhu pokusu byly odebírány vzorky ke stanovení koncentrace PVA a také koncentrace rozpuštěného organického uhlíku.

12.3 Výsledky pokusu Pokus probíhal 19 dnů. Průběh rozkladu PVA pro jednotlivé degradační kultury je patrný z obrázků (Obr. 9 a Obr. 10). Hodnoty v grafech odpovídají průměrům ze tří paralelních stanovení a chybové úsečky směrodatným odchylkám - viz. tabulka 9 . Pokles koncentrace PVA byl sledován také stanovením koncentrace DOC viz obrázky (Obr. 11 a Obr. 12), stanovené hodnoty jsou uvedeny v tabulce (Tab. 10).

Tab. 9. Hodnoty koncentrace PVA (mg·l-1) a směrodatných odchylek v průběhu pokusu Doba [dny]

Láhev č. 1

2

Průměr 3

Sm.odch .

Láhev č. 4

5

Průměr

Sm.odch .

6

0

490,1 498,3 496,2

494,9

4,24

484,0 487,0 493,3

488,1

4,75

2

340,0 358,8 367,9

355,6

14,23

512,5 510,6 501,3

508,1

5,99

6

140,7 142,4 142,0

141,7

0,92

454,5 463,2 462,9

460,2

4,90

9

144,3 141,4 151,4

145,7

5,14

346,5 208,8 341,7

299,0

78,16

12

133,1 126,8 139,8

133,2

6,50

135,6 106,5 183,1

141,7

38,66

16

111,7 109,6 132,5

117,9

12,61

131,9 98,6 141,0

123,8

22,30

19

102,4 105,2 131,9

113,2

16,27

122,4 87,9 109,3

106,5

17,44

Doba

Láhev č.

Průměr

Sm.odch .

Láhev č.

Průměr

Sm.odch .

[dny]

7

8

9

10

11

12

0

496,2 506,6 495,1

499,3

6,35

497,6 493,7 481,6

491,0

8,36

2

376,2 362,5 357,3

365,3

9,76

490,1 486,5 489,4

488,7

1,89

6

183,6 150,4 164,6

166,2

16,65

416,5 379,2 450,8

415,5

35,84

9

181,6 171,6 160,8

171,3

10,41

366,9 116,4 351,1

278,1

140,32

12

175,0 144,1 141,9

153,7

18,51

231,7 61,6 168,5

154,0

85,98

16

155,4 157,7 149,5

154,2

4,21

187,5 58,4 149,5

131,8

66,37

19

141,6 136,5 140,8

139,6

2,74

189,3 57,4 139,3

128,7

66,59


53

Koncentrace PVA [mg·l-1]

500 400 300 200 100 0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

t [d] kultura JK-2

kultura JK-2 + supernatant kalu

Obr. 9. Závislost koncentrace PVA na čase pro rozklad kulturou JK-2

-1


500 400 300 200 100 0 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

t [d] kultura OT-2

kultura OT-2 + supernatant kalu

Obr. 10. Závislost koncentrace PVA na čase pro rozklad kulturou OT-2

20


54

Tab. 10. Hodnoty DOC (mg·l-1) a směrodatných odchylek na počátku a ke konci testu Doba

Láhev č.

Průměr

Sm.odc h

Láhev č.

Průměr

Sm.odc h

[dny]

1

0

251,8

296,6 334,4

294,2

41,36

296,1 284,5 261,1

280,6

17,82

12

88,0

87,9

87,2

1,27

84,1

83,2

18,52

Průměr

Sm.odc h

Průměr

Sm.odc h

Doba

2

3

85,8

Láhev č.

4

5

6

64,3 101,3 Láhev č.

7

0

330,5

305,9 313,0

316,5

12,65

230,0 251,3 272,4

251,3

21,18

12

99,0

95,8

96,7

2,02

113,6 34,5 109,3

85,8

44,49

-1

DOC [mg·l ]

[dny]

8

9

95,3

10

11

12

350 300 250 200 150 100 50 0 0

2

4

6

8

10

12

14

t [d] PVA + OT-2

PVA + OT-2 + supernatant kalu

Obr. 11. Hodnoty DOC v průběhu pokusu (kultura OT-2)

DOC [mg·l-1]

350 300 250 200 150 100 50 0 0

2

4

6

8

10

12

14

t [d]

PVA + JK-2

PVA + JK-2 + supernatant kalu

Obr. 12. Závislost DOC v průběhu pokusu (kultura JK-2)


55

Uvedené grafy (Obr. 9 a Obr. 10) jasně ukazují, že u obou kultur proběhl rozklad PVA v prostředí kalového supernatantu již během 6 dnů, zatímco v prostředí minerálního média bylo zapotřebí k rozložení polymeru delšího času. Zde se rozklad zastavil přibližně po 12-ti dnech na poněkud rozdílných koncentracích zbytkového PVA (na rozdíl od lahví se supernatantem, kde se zbytkové koncentrace PVA v rámci jedné série lahví skoro vůbec nelišily). Největší rozdíly byly zaznamenány v lahvích 10 a 11, jak je vidět v tabulce (Tab. 9). Například v 9. dni pokusu byl rozdíl koncentrací v těchto lahvích roven 250 mg·l-1. Na konci pokusu byla v láhvi 10 zbytková koncentrace PVA rovna 189 mg·l-1 (což odpovídá degradaci z 62 %) a v láhvi 11 zůstalo jen 57 mg·l-1 PVA (což odpovídá degradaci z 88 %). Tento rozdíl mohl být způsoben kontaminací jedné z těchto lahví, za předpokladu, že přítomnost kontaminující bakterie podpořila nebo naopak negativně ovlivnila degradaci PVA. V nultý a dvanáctý den pokusu bylo provedeno stanovení rozpuštěného uhlíku, k ověření výsledků spektrofotometrického stanovení koncentrace PVA a pro průkaz mineralizace degradovaného polymeru. Výsledky jsou uvedeny v tabulce (Tab. 10) a vyneseny v grafech (Obr. 11 a Obr. 12). Za předpokladu asi 50% obsahu uhlíku v PVA potvrzují výsledky spektrofotometrické metody. Závěrem tohoto pokusu je, že přítomnost rozpuštěných metabolitů heterotrofních bakterií nevyvolala žádnou inhibici použitých degradačních kultur, ale vedla zejména na začátku testu k urychlení rozkladu PVA. Tímto byla prokázána malá nebo žádná role metabolitů, jako jsou antibiotika nebo bakteriociny.


56

13 POSOUZENÍ CITLIVOSTI PVA-DEGRADAČNÍCH KULTUR NA VYŠŠÍ KONCENTRACE FOSFOREČNANŮ

13.1 Úvod Na základě výsledků předcházejících experimentů lze předpokládat, že zpomalení rozkladu PVA kalem v trvalé přítomnosti živin není způsobeno substrátovou kompeticí (upřednostnění živin před PVA), ani nedostatkem minerálních látek, ani účinkem rozpuštěných metabolitů heterotrofních bakterií. Proto se náplní zbývajících pokusů stalo posouzení citlivosti PVA-degradačních bakterií vůči zvýšeným koncentracím solí. Vedly k tomu určité zkušenosti z minulých prací s tématikou biodegradace PVA [37] a současně tomu napovídaly výsledky třetího experimentu. Za podmínek růstových testů (viz.kap.8.4 ) byl sledován růst degradačních kultur (OT 2, JK 2) na tryptonu, v prostředích o pěti různých koncentracích fosforečnanů (viz 6.1, tab. 3). Schopnost růstu PVA-degradačních kultur na tryptonu byla již ověřena v předchozí diplomové práci [13].

13.2 Rozvržení pokusu Jednotlivé typy minerálních médií, v pořadí s rostoucí koncentrací fosforečnanů, byly dávkovány vždy jeden typ do šesti jamek jednoho sloupce mikrotitrační destičky: 1) PVA-degradační kultura + MM 1F + trypton 3 g·l-1 2) PVA-degradační kultura + MM 1,5F + trypton 3 g·l-1 3) PVA-degradační kultura + MM 2F + trypton 3 g·l-1 4) PVA-degradační kultura + MM 2,5F + trypton 3 g·l-1 5) PVA-degradační kultura + MM 3F + trypton 3 g·l-1


57

13.3 Výsledky pokusu Růst jednotlivých kultur byl sledován po dobu 9 dnů a je zaznamenán v grafech (Obr. 13 a Obr. 14). Hodnoty v grafech odpovídají průměrům z měření minimálně pěti jamek mikrotitrační destičky. V tabulkách (Tab. 11 a Tab. 12) jsou uvedeny i příslušné směrodatné odchylky.

Tab. 11. Hodnoty absorbancí kultivačního média v průběhu testu s kulturou OT 2 doba [dny ]

MM 1F

MM 1,5F

MM 2F

MM 2,5F

MM 3F

sm.odc sm.odc sm.odc sm.odc sm.odc průměr h průměr h průměr h průměr h průměr h

0

0,0530 0,0041 0,0472 0,0013 0,0477 0,0033 0,0472 0,0016 0,0492 0,0023

3

0,1942 0,0173 0,1338 0,0738 0,0823 0,0661 0,0505 0,0081 0,0513 0,0085

4

0,2152 0,0117 0,1607 0,0789 0,1027 0,0989 0,0532 0,0140 0,0552 0,0206

5

0,2247 0,0194 0,1823 0,0747 0,0648 0,0285 0,0558 0,0189 0,0597 0,0306

6

0,2108 0,0245 0,1960 0,0584 0,0610 0,0246 0,0553 0,0190 0,0597 0,0311

9

0,2250 0,0160 0,2278 0,0431 0,1520 0,1801 0,0570 0,0194 0,0476 0,0025

0,25

Absorbance [1]

0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

t [d] OT-2 + MM 1F OT-2 + MM 2,5F

OT-2 + MM 1,5F OT-2 + MM 3F

OT-2 + MM 2F

Obr. 13. Závislost absorbance kultivačního média na době testu (kultura OT-2)

10


58

Tab.12. Hodnoty absorbancí kultivačního média v průběhu testu s kulturou JK-2 MM 1F

Doba [dny]

průměr

MM 1,5F

MM 2F

MM 2,5F

MM 3F

sm.odc sm.odc sm.odc sm.odc sm.odc h průměr h průměr h průměr h průměr h

0

0,0488 0,0030 0,0463 0,0026 0,0438 0,0012 0,0454 0,0005 0,0462 0,0008

3

0,1375 0,0572 0,0663 0,0372 0,0453 0,0054 0,0452 0,0008 0,0467 0,0020

4

0,1642 0,0413 0,0752 0,0494 0,0500 0,0167 0,0448 0,0008 0,0467 0,0012

5

0,1792 0,0217 0,0770 0,0507 0,0555 0,0297 0,0458 0,0010 0,0473 0,0016

6

0,1768 0,0307 0,0718 0,0460 0,0588 0,0378 0,0458 0,0012 0,0468 0,0017

9

0,1800 0,0591 0,0707 0,0446 0,0614 0,0395 0,0454 0,0009 0,0468 0,0015

0,25

Absorbance [1]

0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0

1

2

JK-2 + MM 1F JK-2 + MM 2,5F

3

4

5

6

t [d] JK-2 + MM 1,5F JK-2 + MM 3F

7

8

9

10

JK-2 + MM 2F

Obr. 14. Závislost absorbance kultivačního média na době testu (kultura JK-2)

Z grafů je patrné, že zvýšené koncentrace fosforečnanů v prostředí negativně ovlivňují růst obou degradačních kultur. Kultury OT-2 a JK-2 byly schopné růst jen v prvních dvou typech minerálního média (o koncentracích fosforečnanů 6,67 mmol·l-1 a 10 mmol·l-1). Růst v prostředích s koncentrací fosforečnanů 13,3 mmol·l-1a vyšší byl výrazně zpomalen nebo úplně znemožněn.


59

14 POSOUZENÍ CITLIVOSTI PVA-DEGRADAČNÍCH KULTUR NA VYŠŠÍ KONCENTRACE FOSFOREČNANŮ II

14.1 Úvod Tento pokus byl proveden podobně jako pokus předchozí s tím rozdílem, že bylo pracováno se třemi kulturami degradérů, při dvojnásobné intenzitě inokulaci (10 µl inokula místo 5 µl, použitých v pokusu předchozím). Byl tedy sledován růst degradačních kultur na tryptonu, v prostředích o pěti různých koncentracích fosforečnanů (viz kap 6.1, Tab. 3). Opakování bylo provedeno z důvodu potvrzení výsledků pokusu předchozího.

14.2 Rozvržení pokusu Jednotlivé typy minerálních médií, v pořadí s rostoucí koncentrací fosforečnanů, byly dávkovány vždy jeden typ do šesti jamek jednoho sloupce mikrotitrační destičky: 1) PVA-degradační kultura + MM 1F + trypton 3g·l-1 2) PVA-degradační kultura + MM 1,5F + trypton 3g·l-1 3) PVA-degradační kultura + MM 2F + trypton 3g·l-1 4) PVA-degradační kultura + MM 2,5F + trypton 3g·l-1 5) PVA-degradační kultura + MM 3F + trypton 3g·l-1

14.3 Výsledky pokusu Růst jednotlivých kultur byl sledován po dobu 17 dnů a byl zaznamenán v grafech (Obr. 15, Obr. 16 a Obr. 17). Hodnoty v grafech odpovídají průměrům z měření minimálně pěti jamek mikrotitrační destičky. V tabulkách (Tab. 13, Tab. 14 a Tab. 15) jsou uvedeny příslušné směrodatné odchylky.


60

Tab. 13. Hodnoty absorbancí kultivačního média v průběhu testu s kulturou OT-2 MM 1F

Doba [dny]

průměr

MM 1,5F

MM 2F

MM 2,5F

MM 3F

sm.odc sm.odc sm.odc sm.odc průsm.odch průměr průměr průměr h h h h měr

0

0,1078 0,0160 0,1183 0,0228 0,1140 0,0243 0,1115 0,0318 0,1045 0,0283

1

0,1905 0,0193 0,1955 0,0296 0,1865 0,0316 0,1873 0,0318 0,1888 0,0332

2

0,2820 0,0293 0,2330 0,0450 0,2133 0,0341 0,2150 0,0390 0,2260 0,0407

3

0,3405 0,0556 0,2205 0,0110 0,2353 0,0381 0,2260 0,0321 0,2170 0,0428

6

0,2553 0,0304 0,2038 0,0140 0,2025 0,0178 0,1850 0,0226 0,1970 0,0224

8

0,3783 0,0316 0,2800 0,0171 0,2888 0,0208 0,2735 0,0162 0,2748 0,0270

13

0,3908 0,0330 0,2815 0,0106 0,2720 0,0221 0,2563 0,0158 0,2573 0,0318

15

0,4038 0,0300 0,2703 0,0167 0,2485 0,0271 0,2553 0,0218 0,2400 0,0296

17

0,4050 0,0447 0,2810 0,0119 0,2653 0,0179 0,2788 0,0382 0,2603 0,0373

0,45 0,40 Absorbance [1]

0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 t [d]

OT-2 + MM1F OT-2 + MM 2,5F

OT-2 + MM 1,5F OT-2 + MM 3F

OT-2 + MM 2F

Obr. 15. Závislost absorbance kultivačního média na době testu


61

Tab. 14. Hodnoty absorbancí kultivačního média v průběhu testu s kulturou JK-2 doba

MM 1F

MM 1,5F

MM 2F

MM 2,5F

MM 3F

[dny ]

sm.odc sm.odc sm.odc sm.odc h průměr h průměr h průměr h průměr sm.odch průměr

0

0,0858 0,0036 0,0893 0,0081 0,0993 0,0245 0,1078 0,0232 0,0810 0,0061

1

0,1273 0,0033 0,1250 0,0180 0,1383 0,0293 0,1508 0,0311 0,1200 0,0050

2

0,1560 0,0026 0,1388 0,0147 0,1493 0,0281 0,1603 0,0282 0,1345 0,0048

3

0,2035 0,0042 0,1640 0,0176 0,1720 0,0228 0,1823 0,0207 0,1543 0,0038

6

0,2758 0,0072 0,1915 0,0117 0,1888 0,0010 0,1835 0,0031 0,1825 0,0026

8

0,2945 0,0064 0,1980 0,0167 0,1970 0,0116 0,1993 0,0222 0,1820 0,0022

13

0,2958 0,0100 0,1953 0,0263 0,1890 0,0227 0,1955 0,0264 0,1718 0,0019

15

0,2783 0,0188 0,1788 0,0198 0,1800 0,0141 0,1843 0,0178 0,1683 0,0024

17

0,2870 0,0131 0,1830 0,0236 0,1748 0,0118 0,1808 0,0187 0,1648 0,0022

0,35

Absorbance [1]

0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 t [d]

JK-2 + MM 1F JK-2 + MM 2,5F

JK-2 + MM 1,5F JK-2 + MM 3F

JK-2 + MM 2F

Obr. 16. Závislost absorbance kultivačního média na době testu


62

Tab. 15. Hodnoty absorbancí kultivačního média v průběhu testu s kulturou Ž-1 doba

MM 1F

MM 1,5F

MM 2F

MM 2,5F

MM 3F

[dny ]

průměr

sm.odc sm.odc sm.odc sm.odc prů- sm.odc průměr průměr průměr h h h h měr h

0

0,0838 0,0049 0,0880 0,0210 0,0758 0,0046 0,0758 0,0115 0,0778 0,0050

1

0,0903 0,0041 0,0925 0,0217 0,0820 0,0052 0,0808 0,0136 0,0813 0,0043

2

0,1050 0,0027 0,0995 0,0173 0,0883 0,0056 0,0860 0,0130 0,0850 0,0042

3

0,1220 0,0018 0,1050 0,0154 0,0903 0,0053 0,0885 0,0133 0,0893 0,0043

6

0,1393 0,0033 0,1103 0,0127 0,0913 0,0059 0,0880 0,0118 0,0893 0,0039

8

0,1558 0,0053 0,1143 0,0127 0,0930 0,0061 0,0905 0,0126 0,0890 0,0036

13

0,1720 0,0231 0,1170 0,0176 0,1193 0,0226 0,0970 0,0076 0,0880 0,0032

15

0,1698 0,0193 0,1143 0,0139 0,1205 0,0210 0,1033 0,0085 0,0908 0,0070

17

0,1980 0,0483 0,1215 0,0125 0,1283 0,0222 0,1085 0,0077 0,0960 0,0145

0,25

Absorbance [1]

0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 t [d]

Ž1 + MM 1F Ž1 + MM 2,5F

Ž1 + MM 1,5F Ž1 + MM 3F

Ž1 + MM 2F

Obr. 17. Závislost absorbance kultivačního média na době testu průběhu tohoto pokusu byl zaznamenán nejlepší růst všech tří kultur v prostředí prvního typu minerálního média s nejnižší koncentrací fosforečnanů, tj. 6,67 mmol·l-1. Tímto byly


63

potvrzeny výsledky předchozího pokusu, že vyšší koncentrace fosforečnanů v prostředí negativně ovlivňují růst PVA-degradačních kultur.


64

15 ZKOUŠKY ROZKLADU PVA ČISTÝMI KULTURAMI OT2, JK2 A Ž1 V PROSTŘEDÍ SE ZVÝŠENOU KONCENTRACÍ FOSFOREČNANŮ

15.1 Úvod Vzhledem k výsledkům předchozích dvou pokusů, ve kterých byl sledován růst PVAdegradačních kultur na tryptonu, bylo nutné potvrdit negativní vliv zvýšené koncentrace fosforečnanů i na PVA-degradační schopnosti těchto kultur. Za podmínek degradačních testů (viz. Kap. 8.1) byl sledován rozklad PVA v prostředích o pěti různých koncentracích fosforečnanů. K tomuto účelu bylo připraveno pět druhů minerálních médií podle tabulky (viz. kap. 6.1, Tab. 3).

15.2 Rozvržení pokusu V rámci tohoto pokusu byly nasazeny tři série po pěti lahvích podle rozpisu: 1) Kultura OT2 v MM 1F + PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 2) Kultura OT2 v MM 1,5F + PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 3) Kultura OT2 v MM 2F + PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 4) Kultura OT2 v MM 2,5F + PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 5) Kultura OT2 v MM 3F + PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 6) Kultura JK2 v MM 1F + PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 7) Kultura JK2 v MM 1,5F + PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 8) Kultura JK2 v MM 2F + PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 9) Kultura JK2 v MM 2,5F + PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 10) Kultura JK2 v MM 3F + PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 11) Kultura Ž1 v MM 1F + PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 12) Kultura Ž1 v MM 1,5F + PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1


65

13) Kultura Ž1 v MM 2F + PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 14) Kultura Ž1 v MM 2,5F + PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1 15) Kultura Ž1 v MM 3F + PQQ 20 µg·l-1 + PVA 500 mg·l-1

V průběhu pokusu byly ve zvolených intervalech odebírány vzorky (250 µl) pro stanovení koncentrace PVA. Na základě pozorování z prvního pokusu (viz. kap. 9) byl do lahví s kulturou Ž1 přidán trypton (výsledná koncentrace 300 mg·l-1) pro zabezpečení jejích potřeb. Toto bylo provedeno na počátku pokusu, ve čtvrtý a sedmý den.

15.3 Výsledky pokusu Pokus probíhal 16 dnů. Průběh rozkladu PVA pro jednotlivé série lahví je patrný z obrázků (Obr. 18, Obr. 19 a Obr. 20). Hodnoty v grafech odpovídají průměru z pěti paralelních stanovení koncentrace PVA. Jednotlivé hodnoty jsou uvedeny v tabulkách (Tab. 16, Tab. 17 a Tab. 18).


66

Tab. 16. Hodnoty koncentrace PVA (mg·l-1) v průběhu testu Doba

Kultura OT 2

[dny]

MM 1F MM 1,5F MM 2F MM 2,5F MM 3F

0

509,4

513,9

534,6

524,9

507,5

2

358,3

456,8

545,4

524,8

535,9

4

111,1

326,7

537,1

552,7

532,4

7

73,7

155,0

538,4

532,6

515,5

9

75,8

127,1

512,9

512,6

513,3

11

81,1

117,7

234,1

520,9

546,7

14

77,3

112,3

104,2

512,0

501,2

16

72,1

113,5

98,1

515,2

544,9

-1


600 500 400 300 200 100 0 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12 13 14 15 16 17

t [d] OT-2 + MM 1F OT-2 + MM 2,5F

OT-2 + MM 1,5F OT-2 + MM 3F

OT-2 + MM 2F

Obr. 18. Závislost koncentrace PVA na čase (kultura OT-2)


67

Tab. 17. Hodnoty koncentrace PVA (mg·l-1) v průběhu testu Kultura JK-2

Doba [dny]

MM 1F

MM 1,5F

MM 2F

MM 2,5F

MM 3F

0

537,0

546,4

545,4

527,4

532,3

2

360,1

412,2

526,0

497,0

506,5

4

68,9

159,7

535,1

518,6

500,8

7

39,5

51,5

524,8

514,4

512,3

9

39,9

49,6

534,0

525,3

530,8

11

44,4

46,7

489,9

527,9

525,2

14

29,8

25,7

58,2

526,1

528,3

16

27,5

18,7

16,6

501,8

534,6

-1


600 500 400 300 200 100 0 0

1

2

3

4

JK-2 + MM 1F JK-2 + MM 2,5F

5

6

7

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 t [d] JK-2 + MM 1,5F JK-2 + MM 2F JK-2 + MM 3F

Obr. 19. Závislost koncentrace PVA na čase (kultura JK-2)


68

Tab. 18. Hodnoty koncentrace PVA (mg·l-1) v průběhu testu Kultura Ž-1

Doba [dny]

MM 1F

MM 1,5F

MM 2F

MM 2,5F

MM 3F

0

521,5

503,5

509,9

513,6

524,7

2

476,4

464,9

518,6

503,0

533,3

4

434,4

467,8

511,3

511,5

500,8

7

392,7

463,5

512,7

529,4

531,5

9

372,2

457,4

533,4

527,5

538,6

11

381,1

416,8

-

-

-

14

325,3

420,8

533,8

539,3

543,4

16

328,8

389,2

515,8

491,8

498,3

-1


600 500 400 300 200 100 0 0

1

2

3

4

Ž1 + MM 1F Ž1 + MM 2,5F

5

6

7

8

9

10 11 12 13 14 15 16 17

t [d] Ž1 + MM 1,5F Ž1 + MM 3F

Ž1 + MM 2F

Obr. 20. Závislost koncentrace PVA na čase (kultura Ž-1)

První dva uvedené grafy (Obr. 18 a Obr. 19), které odpovídají kulturám OT-2 a JK-2, nevykazují velké rozdíly. V obou případech byl PVA nejrychleji rozložen v prostředí s nejnižší koncentrací fosforečnanů (6,67 mmol·l-1) a s malým zpožděním také v druhém typu prostředí o koncentraci fosforečnanů 10 mmol·l-1. Po čase nastal také rozklad


69

v prostředí minerálního média s označením MM2F (o koncentraci fosforečnanů 13,3 mmol·l-1). V případě kultury OT-2 se rozklad rozběhl v 9. den pokusu a u kultury JK-2 kolem 11. dne. V případě kultury Ž1 bylo zjištěno, že její degradační schopnosti v této fázi práce již nebyly příliš výrazné a že došlo jen k částečnému rozkladu polymeru. I v této situaci však bylo zřejmé, že degradace v prostředí zvýšených koncentrací fosforečnanů je zpomalena či potlačena.


70

16 POSOUZENÍ CITLIVOSTI PVA-DEGRADAČNÍCH KULTUR NA VYŠŠÍ KONCENTRACE SOLÍ

16.1 Úvod Náplní posledního pokusu bylo posoudit, jestli zaznamenaná citlivost PVA-degradačních kultur představuje konkrétní citlivost k vyšším koncentracím fosforečnanů, nebo se jedná o obecnou citlivost vůči vyšším koncentracím minerálních solí. K uskutečnění pokusu byly vybrány hydrogenuhličitany, neboť tyto soli mohou v prostředí vznikat mikrobiální mineralizací organických substrátů, jsou málo alkalické a patří k dostupným chemikáliím. Byl sledován růst degradačních kultur v prostředích o třech různých koncentracích solí. K tomuto účelu bylo připraveno pět druhů minerálních médií podle tabulky (viz. kap. 6.1, Tab. 4). Díky výhodám mikrotitrační destičky (velký počet testů) bylo možné sledovat případné odlišnosti růstu v prostředí NaHCO3 nebo KHCO3, tedy posoudit i vliv typu kationtu.

16.2 Rozvržení pokusu Jednotlivé typy minerálních médií, v pořadí s rostoucím obsahem solí, byly dávkovány vždy jeden typ do šesti jamek jednoho sloupce mikrotitrační destičky: 1) PVA-degradační kultura + MM 1 + trypton 3g·l-1 2) PVA-degradační kultura + MM 2Na + trypton 3g·l-1 3) PVA-degradační kultura + MM 2K + trypton 3g·l-1 4) PVA-degradační kultura + MM 3Na + trypton 3g·l-1 5) PVA-degradační kultura + MM 3K + trypton 3g·l-1


71

16.3 Výsledky pokusu Růst jednotlivých kultur byl sledován po dobu 14 dnů a byl zaznamenán v grafech (Obr. 21, Obr. 22 a Obr. 23). Hodnoty v grafech odpovídají průměrům z měření minimálně pěti jamek mikrotitrační destičky.


72

Tab. 19. Hodnoty absorbancí kultivačního média v průběhu testu s kulturou OT-2 Doba

MM 1

[dny ]

průměr

MM 2Na

MM 2K

MM 3Na

MM 3K

sm.odc sm.odc sm.odc sm.odc sm.odc h průměr h průměr h průměr h průměr h

0,0808 0,0063 0,0805 0,0022 0,0783 0,0052 0,0815 0,0048 0,0833 0,0041

1

0,1645 0,0029 0,1442 0,0066 0,1383 0,0027 0,1253 0,0110 0,1155 0,0128

2

0,2502 0,0063 0,1642 0,0177 0,1836 0,0100 0,1344 0,0130 0,1486 0,0077

3

0,2913 0,0148 0,1795 0,0258 0,2058 0,0116 0,1482 0,0048 0,1726 0,0082

6

0,3918 0,0107 0,2003 0,0137 0,2313 0,0176 0,1350 0,0033 0,2190 0,0080

7

0,3928 0,0207 0,1943 0,0184 0,2193 0,0142 0,1300 0,0035 0,2278 0,0132

8

0,3738 0,0262 0,1883 0,0216 0,2175 0,0241 0,1148 0,0091 0,2180 0,0098

9

0,3926 0,0253 0,1880 0,0182 0,2146 0,0189 0,1185 0,0088 0,2346 0,0128

10

0,3590 0,0071 0,1830 0,0312 0,1810 0,0198 0,1012 0,0093 0,2082 0,0208

14

0,3552 0,0239 0,1800 0,0208 0,1835 0,0396 0,1075 0,0087 0,2262 0,0166

Absorbance [1]

0

0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

t [d] OT-2 + MM 1 OT-2 + MM 3Na

OT-2 + MM 2Na OT-2 + MM 3K

OT-2 + MM 2K

Obr. 21 Závislost absorbance kultivačního média na době testu (kultura OT-2)

15


73

Tab. 20. Hodnoty absorbancí kultivačního média v průběhu testu s kulturou JK-2 MM 1

doba

MM 2Na

MM 2K

MM 3Na

MM 3K

[dny prů- sm.odc sm.odc sm.odc sm.odc sm.odc ] měr h průměr h průměr h průměr h h průměr 0

0,1028 0,0068 0,1048 0,0102 0,1025 0,0081 0,1057 0,0074 0,1018 0,0026

1

0,1357 0,0060 0,1387 0,0092 0,1345 0,0057 0,1320 0,0076 0,1266 0,0027

2

0,1588 0,0082 0,1532 0,0061 0,1537 0,0065 0,1500 0,0024 0,1426 0,0060

3

0,1783 0,0077 0,1670 0,0072 0,1658 0,0085 0,1570 0,0048 0,1455 0,0031

6

0,2106 0,0039 0,1746 0,0084 0,1782 0,0083 0,1392 0,0048 0,1796 0,0081

7

0,2044 0,0043 0,1678 0,0111 0,1707 0,0065 0,1340 0,0047 0,1708 0,0054

8

0,1947 0,0098 0,1666 0,0045 0,1677 0,0072 0,1307 0,0047 0,1693 0,0097

9

0,1913 0,0080 0,1668 0,0075 0,1668 0,0041 0,1316 0,0030 0,1695 0,0087

10 0,1904 0,0089 0,1670 0,0063 0,1700 0,0082 0,1228 0,0042 0,1558 0,0053 14 0,1860 0,0107 0,1706 0,0097 0,1713 0,0096 0,1267 0,0039 0,1677 0,0107

0,25

Absorbance [1]

0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0

1

2

3

JK-2 + MM 1 JK-2 + MM 3Na

4

5

6

7

8 t [d]

9

JK-2 + MM 2Na JK-2 + MM 3K

10

11

12

13

14

JK-2 + MM 2K

Obr. 22 Závislost absorbance kultivačního média na době testu (kultura JK-2)

15


74

Tab. 21. Hodnoty absorbancí kultivačního média v průběhu testu s kulturou Ž-1

doba [dny]

MM 1

MM 2Ma

MM 2K

MM 3Na

MM 3K

prů- sm.odc sm.odc sm.odc sm.odc sm.odc měr h průměr h průměr h průměr h h průměr

0

0,0566 0,0044 0,0548 0,0015 0,0564 0,0048 0,0578 0,0053 0,0560 0,0056

1

0,0686 0,0046 0,0604 0,0019 0,0622 0,0045 0,0608 0,0047 0,0582 0,0050

2

0,0906 0,0048 0,0730 0,0025 0,0782 0,0044 0,0668 0,0047 0,0636 0,0053

3

0,1110 0,0048 0,0816 0,0040 0,0914 0,0043 0,0680 0,0045 0,0706 0,0054

6

0, 1354 0,0039 0,0877 0,0088 0,1192 0,0313 0,0677 0,0063 0,0884 0,0054

7

0,1418 0,0112 0,0864 0,0044 0,1114 0,0089 0,0674 0,0083 0,0922 0,0057

8

0,1506 0,0192 0,0858 0,0057 0,1180 0,0210 0,0680 0,0118 0,0934 0,0061

9

0,1570 0,0261 0,0850 0,0053 0,1252 0,0367 0,0680 0,0129 0,0946 0,0070

10

0,1648 0,0302 0,0840 0,0035 0,1133 0,0156 0,0682 0,0124 0,0952 0,0078

14

0,1832 0,0391 0,0908 0,0080 0,1497 0,0585 0,0682 0,0078 0,1105 0,0289

0,25

Absorbance [1]

0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

t [d]

Ž1 + MM 1 Ž1 + MM 3Na

Ž1 + MM 2Na Ž1 + MM 3K

Ž1 + MM 2K

Obr. 23 Závislost absorbance kultivačního média na době testu (kultura Ž-1)

15


75

Z uvedených grafů je zřejmé, že nejlepší růst všech tří kultur nastal v prostředí bez přídavku uvedených hydrogenuhličitanů. V přítomnosti těchto solí byl růst do jisté míry zpomalen. Největší inhibiční účinek byl zaznamenán u všech tří kultur, kde byl navýšen obsah solí vyšším přídavkem NaHCO3. Růst v takto upraveném prostředí nebyl téměř zaznamenán u kultury Ž-1 a jen v malé míře byl zjištěn u zbývajících bakterií, na rozdíl od prostředí s přídavkem stejného množství KHCO3. Odtud plyne závěr, že kultury degradérů jsou více citlivé vůči sodným solím než k draselným. Vzhledem k tomu, že v případě kultur OT-2 a Ž-1 byl zaznamenán lepší růst s přídavky 20 ml roztoku KHCO3 než s přídavky polovičního množství NaHCO3, je možné, že citlivost vůči sodným iontům může být významnější než obecná citlivost degradérů k vyšší solnosti. Tyto závěry by však musely být ověřeny rozsáhlejšími sériemi experimentů.


76

ZÁVĚR Ve své diplomové práci jsem se zabýval rozkladem polyvinylalkoholu (PVA) čistými kulturami degradačních bakterií a také jeho rozkladem v prostředí neadaptovaného aktivovaného kalu, který pocházel z městské čistírny odpadních vod. Byly provedeny dva druhy experimentů. Vedle degradačních lahvových testů, ve kterých byl PVA buď jako jediný substrát nebo jako jeden z několika substrátů, jsme provedli také růstové testy v prostředí tryptonu. Degradační testy byly vyhodnocovány na základě sledování úbytku koncentrace PVA nebo úbytku koncentrace rozpuštěného organického uhlíku. Koncentrace PVA byla stanovována spektrofotometrickou mikrometodou, rozpuštěný uhlík byl stanoven v centrifugovaných vzorcích na analyzátoru uhlíku a růst bakterií v růstových testech byl hodnocen na základě měření absorbance kultivačního média. Počáteční pokusy byly směřovány tak, aby vysvětlily příčiny zpomalení degradace PVA aktivovaným kalem, za podmínek trvalé přítomnosti lehce odbouratelných substrátů (tryptonu a sacharosy). Získané výsledky ukázaly, že tento jev není vyvolán substrátovou kompeticí (upřednostněním využívání tryptonu či sacharosy před využíváním PVA), ani nedostatkem minerálních látek, ani účinkem rozpuštěných metabolitů rychle rostoucích heterotrofních bakterií. Naopak určité indicie ukázaly na citlivost degradačních bakterií vůči zvýšeným koncentracím fosforečnanů a proto byly další pokusy směřovány k prokázání nebo vyvrácení těchto jejich vlastností. Výsledky ukázaly, že skutečně růst všech tří testovaných degradačních kultur (OT-2, JK-2 a Ž-1) je negativně ovlivňován zvýšenou koncentrací fosforečnanů v prostředí. Stejná citlivost byla prokázána také vůči zvýšeným koncentracím hydrogenuhličitanů, což naznačilo obecnější nároky těchto bakterií na nižší iontovou sílu prostředí. V návaznosti na dosažené výsledky by bylo do budoucna zapotřebí detailněji prostudovat vlastnosti PVA-degradačních bakterií (i jiných kultur než zde použitých) ve smyslu jejich obecné citlivosti k minerálním látkám v prostředí, a také ověřit možné urychlení procesu degradace PVA v prostředí se sníženou koncentrací minerálních solí.


77

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY [1] DUCHÁČEK, V. Polymery-výroba, vlastnosti, zpracování, použití. Praha, 2006. 77 p. ISBN 80-7080-616-6. [2] ZÁMORSKÝ, Z. Nauka o polymerech II. 1980. 235 p. [3] Mowiol – příručka výrobce [4] CHIELLINI, E.; CORTI, A; D’ANTONE, S.; SOLARO, R. Biodegradation of poly(vinylalcohol) based materials. Prog.Polym.Sci., 2003, 28, 963-1014. [5] SUZUKI, T. Some characteristics of Pseudomonas O-3 which utilizes polyvinyl alcohol. Agric Biol Chem, 1973, 37, 747-756. [6] WATANABE, Y. Purification and properties of a polyvinylalcohol-degrading enzyme produced by a strain of Pseudomonas. Arch Biochem Arch Biochem 1389–91. Biophys1976;174:575–81., 1976, 174, 575-581. [7] MATSUMURA, S., et al. Novel poly(vinyl alcohol)-degrading enzyme and the degradation mechanism. In Macromolecules, 1999, 32, 7753-7761. [8] COUFALÍKOVÁ, M. Symbiotická degradace polyvinylalkoholu. Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, 2006. 89 p. [9] HATANAKA, T., et al. Purification and characterization of a poly(vinyl-alcohol) dehydrogenase from Pseudomonas sp. 113P3. Biosci Biotechnol Biochem, 1995, 59, 1813-1816. [10] SAKAZAWA, C.; SHIMAO, M. ;TANIGUCHI, Y. Symbiotic utilization of poly(vinyl alcohol) by mixed cultures. In Appl Environ Microbiol, 1981, 41, 261-267. [11] SHIMAO, M. , et al. Enhancement of pyrroloquinoline quinone production and polyvinyl alcohol utilization in mixed continuous cultures of Pseudomonas putida VM15A and Pseudomonas sp. strain VM15C with mixed carbon sources. In Appl Environ Microbiol, 1985, 49, 1389-1391. [12] KIM, B. ;SOHN, C. ; LIM, S. ; LEE, J. ; PARK, W. Degradation of polyvinyl alkohol by Sphingomonas sp. SA3 and its symbiote. J Ind Microbial Biotechnol, 2003, 30, 70-74.


78

[13] ZEMAN, P. Vliv přídavných látek na biodegradaci polyvinylalkoholu. Fakulta technologická : Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, 2007. 80 p. [14] CHEN, H.; HOOVER, D. Bacteriocins and their Food Applications. Food Science And Food Safety, 2003, 2, [15] GROSSART, H.; SCHLINGLOFF, A.; BERNHARD, M. Antagonistic activity of bacteria isolated from organic aggregates of the German Wadden Sea. FEMS Microbiology Ecology, 2004, 47 (3), 387-396. [16] KOSTRZYNSKA, M.; BACHAND, A. Use of microbial antagonism to reduce pathogen levels on produce and meat products. Can.J.Microbiol., 2006, 52, 10171026. [17] WHIPPS, J.M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere. Journal of Experimental Botany, 2001, 52, 485-511. [18] KUPEC, J. Základy ekologie. 2.nd ed. 2003. ISBN 80-7318-159-2. [19] Factors that Influence Microbial Growth. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2003, 2 (2), 21-32. [20] WATNICK, P.; KOLTER, R. Biolm,City of Microbes. Journal of Bacteriology, 2000, 182 (10), 2675-2679. [21] SCHINDLER, J. Mikrobiální biofilm. Vesmír, 2001, 80, 203-206. [22] JACK, R.; TAGG, J.; RAY, B. Bacteriocins of Gram-Positive Bacteria. Microbiological Reviews, 1995, 59 (2), 171-200. [23] GORDON, D.; O’BRIEN, C. Bacteriocin diversity and the frequency of multiple bacteriocin production in Escherichia coli. Food Sciece and Food Safety, 2006, 152, 3239-3244. [24] TALARICO, T.; DOBROGOSZ, W. Chemical Characterization of an Antimicrobial Substance Produced by Lactobacillus reuteri. Antimicrobial agents and chemotherapy, 1989, 33 (5), 674-679. [25] SOUZA, E.; SILVA, C.; SOUSA, C. Bacteriocins: Molecules of Fundamental Impact on the Microbial Ecology and Potential Food Biopreservatives. Brazilian Archives of Biology and Technology, 2005, 48 (4), 559-566.


79

[26] CLEVELAND, J.; MONTVILLE, T.; NES, I.CHIKINDAS, M. Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation. Int. Journal of Food Microbiology, 2001, 71, 1-20. [27] DRIDER, D.,FIMLAND, G.,HÉCHARD, Y.; MCMULLEN, L.;PRÉVOST, H. The Continuing Story of ClassII a Bacteriocins. Microbiology and Molecular BIiology Reviews, 2006, 70 (2), 564-582. [28] NES, I.;DIEP, D.;HOLO, H. Bacteriocin Diversity in Streptococcus and Enterococcus. Journal of Bacteriology, 2007, 189 (4), 1189-1198. [29] KYZLINK, V. Teoretické základy konzervace potravin. SNTL 1988. [30] HINDRÉ, T.; DIDELOT, S.; LEPENNEC, J. Bacteriocin Detection from Whole Bacteria by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69 (2), 1051-1058. [31] RILEY, M.; GORDON, D. The ecological role of bacteriocins in bacterial competition. Trends in Microbiology, 1999, 7 (3), 129-133. [32] CASCALES, E.; BUCHANAN, S.;DUCHÉ, D.; Colicin Biology. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2007, 71, 158-229. [33] RILEY, M.; GOLDSTONE, C.; WERTZ, J. A phylogenetic approach to assessing the targets of microbial warfare. J.Evol.Biol, 2003, 16, 690-697. [34] XAVIER, B.; RUSSELL, J. Bacterial competition between a bacteriocin-producing and a bacteriocin-negative strain of Streptococcus bovis in batch and continuous culture. FEMS Microbiol Ecol, 2006, 58, 317-322. [35] OGUNBANWO, S.; SANNI, A.; ONILUDE, A. Influence of cultural conditions on the production of bacteriocin by Lactobacillus brevis OG1. African Journal of Biotechnology, 2006, 2 (7), 179-184. [36] ROSYPAL, S. Obecná Bakteriologie. 1981. 749 p [37] RŮŽIČKA – osobní sdělení


SEZNAM POUŽITÝCH SYMBOLŮ A ZKRATEK BMK

Bakterie mléčného kvašení

DP

Diplomová práce

FR

Fyziologický roztok

FT

Fakulta technologická

PVA

Polyvinylalkohol

PVAc

Polyvinylacetát

PQQ

Pyrrolochinolinochinon

MM

Minerální médium

MMTS Roztok minerálních látek s tryptonem a sacharosou TS

Zásobní roztok živin - tryptonu a sacharosy

ÚIOŽP

Ústav inženýrství ochrany životního prostředí

80


81

SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1. Idealizovaná struktura PVA……………………………….………………… …………11 Obr. 2. Mechanismus výroby PVA z PVAc………………………………………… ………….11 Obr. 3. Mechanismus rozkladu PVA ………………………………………………… …….…..13 Obr. 4. Struktura nisinu A………………………………………………………………… ….….22 Obr. 5. Kalibrační závislost absorbance na koncentraci PVA…………………………….….38 Obr. 6. Závislost koncentrace PVA na čase………………………………………………….….43 Obr. 7. Závislost koncentrace PVA na čase………………………………………………….….46 Obr. 8. Závislost koncentrace PVA na čase………………………………………………….….49 Obr. 9. Závislost koncentrace PVA na čase pro rozklad kulturou JK-2………………….….53 Obr. 10. Závislost koncentrace PVA na čase pro rozklad kulturou OT-2……………….…..53 Obr. 11. Hodnoty DOC v průběhu pokusu (kultura OT-2) ……………………………….…..54 Obr. 12. Závislost DOC v průběhu pokusu (kultura JK-2) ………………………… …..…..54 Obr. 13. Závislost absorbance kultivačního média na době testu (kultura OT-2) … ..…..57 Obr. 14. Závislost absorbance kultivačního média na době testu (kultura JK-2) …….…...58 Obr. 15. Závislost absorbance kultivačního média na době testu……………………….…...60 Obr. 16. Závislost absorbance kultivačního média na době testu……………………….…...61 Obr. 17. Závislost absorbance kultivačního média na době testu……………………………62 Obr. 18. Závislost koncentrace PVA na čase (kultura OT-2) ………………………….…..…66 Obr. 19. Závislost koncentrace PVA na čase (kultura JK-2) …………………………..…..…67 Obr. 20. Závislost koncentrace PVA na čase (kultura Ž-1) …………………………….…….68 Obr. 21 Závislost absorbance kultivačního média na době testu (kultura OT-2) ……..…..72 Obr. 22 Závislost absorbance kultivačního média na době testu (kultura JK-2) ……..…..73 Obr. 23 Závislost absorbance kultivačního média na době testu (kultura Ž-1) …….….…74


82

SEZNAM TABULEK Tab. 1. Vybrané charakteristické aspekty bakteriocinů a tradičních antibiotik………….20 Tab. 2. Příklady G- producentů

………………………………………………………… …23

Tab. 3. Příprava minerálních médií s různou koncentrací fosforečnanového pufru ………31 Tab. 4. Příprava minerálních médií se zvýšenou solností…………………………...………...32 Tab. 5. Hodnoty absorbancí kalibračních roztoků PVA…………………………………….…38 Tab. 6. Hodnoty koncentrace PVA (mg·l-1) a směrodatných odchylek v průběhu pokusu...42 Tab. 7. Hodnoty koncentrace PVA (mg·l-1) a směrodatných odchylek v průběhu pokusu...45 Tab. 8. Hodnoty koncentrace PVA (mg·l-1) a směrodatných odchylek v průběhu pokusu...48 Tab. 9. Hodnoty koncentrace PVA (mg·l-1) a směrodatných odchylek v průběhu pokusu...52 Tab. 10. Hodnoty DOC (mg·l-1) a směrodatných odchylek na počátku a ke konci testu…..54 Tab. 11. Hodnoty absorbancí kultivačního média v průběhu testu s kulturou OT 2……….57 Tab.12. Hodnoty absorbancí kultivačního média v průběhu testu s kulturou JK-2………..58 Tab. 13. Hodnoty absorbancí kultivačního média v průběhu testu s kulturou OT-2….…...60 Tab. 14. Hodnoty absorbancí kultivačního média v průběhu testu s kulturou JK-2……….61 Tab. 15. Hodnoty absorbancí kultivačního média v průběhu testu s kulturou Ž-1…….….62 Tab. 16. Hodnoty koncentrace PVA (mg·l-1) v průběhu testu……………..…………….……66 Tab. 17. Hodnoty koncentrace PVA (mg·l-1) v průběhu testu…………………………………67 Tab. 18. Hodnoty koncentrace PVA (mg·l-1) v průběhu testu … ……………………………68 Tab. 19. Hodnoty absorbancí kultivačního média v průběhu testu s kulturou OT-2 ………72 Tab. 20. Hodnoty absorbancí kultivačního média v průběhu testu s kulturou JK-2….……73 Tab. 21. Hodnoty absorbancí kultivačního média v průběhu testu s kulturou Ž-1…………74


83

Místo uložení práce: Ústřední knihovna UTB ve Zlíně Autor práce:

Bc. Martin Nedbálek

Název práce česky:

Vliv podmínek prostředí na biodegradaci polyvinylalkoholu

anglicky: Effect of environmental conditions on biodegradation of polyvinyl alcohol Vedoucí práce: doc. RNDr. Jan Růžička, Ph.D. Vysoká škola (název a adresa): Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, Mostní 5139, 760 01 Zlín Fakulta technologická, nám. T. G. Masaryka 275, 762 72 Zlín Ústav inženýrství ochrany životního prostředí Rok obhájení práce:

2008

Počet stran, obrázků, tabulek: 82, 23, 21 Předmětová hesla: česky: Biodegradace, polyvinylalkohol anglicky: Biodegradation, polyvinyl alcohol

Souhrn česky: Práce byla věnována rozkladu polyvinylalkoholu a některým vlastnostem degradačních bakteriálních kultur. Byly provedeny experimenty k vysvětlení příčin zpomalení degradace PVA aktivovaným kalem za podmínek trvalé přítomnosti tryptonu a sacharosy. Výsledky ukázaly, že tento jev není vyvolán substrátovou kompeticí ani nedostatkem minerálních látek ani účinkem metabolitů nedegradačních bakterií. Další pokusy ukázaly, že degradační schopnost studovaných bakterií je snížena při vyšší mineralizaci prostředí. anglicky: This work was focused on biodegradation of polyvinyl alcohol and some features

of degradation bacteria. Experiments were made for explanation the reasons of retardation of degradation polyvinyl alcohol by activated sludge under the conditions of permanent presence of tryptone and sucrose. Results showed that this phenomenon is not evoked by substrate competition, absence mineral susbtances or action of metabolites of undegradation germs. Another tests displayed that degradation ability of studied germs is reduced in case of higher mineralization of environment.

Vliv podmínek prostředí na biodegradaci polyvinylalkoholu. Bc. Martin Nedbálek

Recommend Documents