UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE 2. LÉKAŘSKÁ FAKULTA Ústav lékařské chemie a klinické biochemie 2. LF UK a FN Motol
Karolína Hrušovská
Laboratorní vyšetření cystatinu C u vybraných skupin pacientů
Bakalářská práce
Praha 2013
Bakalářská práce
Autor práce: Karolína Hrušovská Vedoucí práce: Ing. Karel Kotaška, Ph.D. Oponent práce: Ing. Eva Klapková, Ph.D. Datum obhajoby: 2013
Bakalářská práce
Bibliografický záznam HRUŠOVSKÁ, Karolína, Laboratorní vyšetření cystatinu C u vybraných skupin pacientů. Praha: Univerzita Karlova, 2. Lékařská fakulta, 2013, s. 49. Vedoucí bakalářské práce Ing. Karel Kotaška, Ph.D.
Bakalářská práce
ANOTACE Cílem bakalářské práce bylo ověřit možnost stanovení koncentrace cystatinu C v moči a její využití pro diagnostiku postižení ledvin. Dále byla vyhodnocována a porovnávána glomerulární filtrace vypočtená z koncentrací kreatininu a cystatinu C u pacientů s normální funkcí ledvin a u pacientů s postižením ledvin. Koncentrace cystatinu C v séru a v moči a kreatininu v séru byly vyšetřeny u 84 pacientů rozdělených do skupin podle různého stupně postižení ledvin. První skupinu tvořili pacienti s normální funkcí ledvin charakterizovanou koncentracemi sérového kreatininu v referenčním rozmezí a druhou skupinu tvořili pacienti s postiženou funkcí ledvin charakterizovanou zvýšenou koncentrací kreatininu. Ověřili jsme základní validační charakteristiky pro stanovení cystatinu C v moči – limit detekce = 0,25 mg/l opakovatelnost – variační koeficient (CV) = 1 %, reprodukovatelnost CV = 5 %. Prokázali jsme zvýšené koncentrace Cystatinu C v séru a v moči u pacientů s postižením ledvin (0,25 mg/l vs. 0,8 mg/l v moči resp. 0,86 mg/l vs. 2,72 mg/l v séru) a sníženou glomerulární filtraci u pacientů s renální dysfunkcí (GFR cystatin C = 1,82 ml/s/1,73 m2 vs. 0,26 ml/s/1,73 m2; GFR kreatinin 1,51 ml/s/1, 73 m2 vs. 0,32 ml/s/1,73 m2). U pacientů s postižením funkcí ledvin byla prokázána zvýšená korelace GFR cystatinu C oproti GFR kreatininu (r = 0,73 vs. r = 0,31). GFR cystatinu C u pacientů s postižením ledvin negativně korelovala s GFR pro normální ledvinové funkce (r = - 0,19), zatímco korelace GFR kreatininu byla u těchto pacientů pozitivní (r = 0,01). Dále jsme zjistili pozitivní korelaci sérového cystatinu C oproti kreatininu u pacientů s renálním selháním (r = 0,71), v moči byla naopak nalezena negativní korelace (r = - 0,16). Stanovení cystatinu C v séru i v moči je vhodným ukazatelem glomerulární filtrace a postižení ledvin. Byla potvrzena snížená glomerulární filtrace u pacientů s renální dysfunkcí.
Bakalářská práce
ANNOTATION The aim of bachelor´s work was to evaluate concentration of cystatin C in urine and its use for diagnosis of renal impairment and evaluate glomerular filtration calculated from the concentration of creatinine and cystatine C in patients with normal renal function and patients with impaired renal function. The concentration of cystatin C in serum and urine and creatinine in serum were investigated in 84 patients divided into groups according to the degree of renal impairment. The first group consisted of patients with normal renal function characterized by concentrations of S-creatinine within the reference range and the second group consisted of patients with renal impairment characterized by elevated serum creatinine concentrations. We verified the basic validation characteristic for the determination of cystatin C in urine – a detection limit = 0,25 mg/l, repeatability – coefficient of variation (CV) = 1 %, reproducibility – CV = 5 %. We have demonstrated increased concentrations of cystatin C in serum and urine in patients with renal impairment (0,25 mg/l vs. 0,8 mg/l in urine or 0,86 mg/l vs. 2,72 mg/l in serum) and reduced glomerular filtration in patients with renal dysfunction (GFR cystatin C = 1,82 ml/s/1,72m2 vs 0,26 ml/s/1,72m2). Increased correlation of GFR cystatin C compared to GFR creatinine was demonstrated in patients with impaired renal function (r = 0,73 vs. r = 0,31). GFR cystatin C in patients with renal impairment negatively correlated with GFR for normal renal function (r = - 0,19), while the correlation GFR creatinine in these patients was positive (r = 0,01). We also found a positive correlation between serum cystatin C over creatinine on patients with renal failure (r = 0,71), in urine was, however found a negative correlation r = 0,16). Determination of cystatin C in serum and urine is proved to investigate of glomerular filtration and impairment. Decrease of glomerular filtration in patients with renal impairment was confirmed.
Bakalářská práce
Klíčová slova cystatin C, kreatinin, glomerulární filtrace
Keywords cystatin C, creatinine, glomerular filtration
Bakalářská práce
Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci zpracovala samostatně pod vedením Ing. Karla Kotašky, Ph.D., uvedla všechny použité literární a odborné zdroje a dodržovala zásady vědecké etiky. Dále prohlašuji, že stejná práce nebyla použita pro získání jiného akademického titulu nebo stejného akademického titulu. V Praze 22. 4. 2013
Karolína Hrušovská
Bakalářská práce
Poděkování Chtěla bych poděkovat svému školiteli Ing. Karlovi Kotaškovi Ph.D. za trpělivost, odborné vedení a cenné rady, které mi byly v průběhu celé práce poskytnuty. Dále bych chtěla poděkovat Ing. Blance Jedličkové za pomoc a podporu v praktické části práce.
Bakalářská práce
OBSAH
ANOTACE .................................................................................................................... 5 ANOTATION ................................................................................................................ 6 SEZNAM ZKRATEK ...................................................................................................11 ÚVOD ............................................................................................................................13 TEORETICKÁ ČÁST ..................................................................................................14 1. Ledviny .....................................................................................................................14 1.1. Anatomie a fyziologie ledvin ..............................................................................14 1.2. Patologie ledvin .................................................................................................16 2. Glomerulární filtrace .................................................................................................18 2.1. Mechanismus glomerulární filtrace .....................................................................18 2.1.1.Stanovení kreatininu ...................................................................................20 3. Cystatin C..................................................................................................................25 3.1. Laboratorní vyšetření cystatinu C .......................................................................26 4. CÍLE.........................................................................................................................27 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST.........................................................................................28 5. Materiál, metody a charakteristika pacientů ...............................................................28 5.1. Stanovení cystatinu C a kreatininu ......................................................................28 5.2. Přístroje a doplňkový materiál ............................................................................29 5.3. Charakteristika souboru pacientů ........................................................................30 5.4. Statistické nástroje a analýza dat.........................................................................31 6. Výsledky ...................................................................................................................32 6.1. Vyhodnocení validačních parametrů pro stanovení cystatinu C v moči ...............33 6.2. Stanovení cystatinu C u pacientů s různým stupněm dysfunkce ledvin ................35 7. Diskuze .....................................................................................................................40 ZÁVĚR ..........................................................................................................................43 SEZNAM LITERATURY.............................................................................................44
Bakalářská práce
SEZNAM ZKRATEK A SYMBOLŮ 4-AAP
4 aminoantipyrin
Abs
absorbance
ADP
adenosindifosfát
Alb
albumin
ATP
adenosintrifosfát
ClKrea
clearance kreatininu
con
koncentrace
CRDIM
kreatinindeimininasa
cys C
cystatin C
CV
variační koeficient
F
faktor
GMD
glutamátdehydrogenáza
GF
glomerulární filtrace
GFKrea
glomerulární filtrace kreatininu
GFR
rychlost glomerulární filtrace
Krea
kreatinin
LD
laktátdehydrogenasa
LN
přirozený logaritmus
LOD
mez detekce
LOQ
mez stanovitelnosti
MDRD
Modification of Diet in Renal Disease
NAD+
oxidovaná forma kation nikotinamidadenindinukleotidu
NADH
redukovaná forma nikotinamidadenindinukleotidu
NADP+
oxidovaná forma nikotinamidadenindinukleotidfosfátu
NADPH
redukovaná forma nikotinamidadenindinukleotidfosfátu
PENIA
particle enhanced immunonephelometry assay
Bakalářská práce PETIA
particle enhanced immunoturbidimetry assay
r
Spearmanův korelační koeficient
ref
referenční
S-
sérum
SAlb
albumin v séru
Scys C
cystatin c séru
SD
směrodatná odchylka
SKrea
kreatinin v séru
SUrea
močovina v séru
SOx
sarkosinoxidasa
TNP
2,4,6 - trinitrofenol (kyselina pikrová)
TOPS
N-ethyl-N-sulfopropyl-m-toluidin
U-
moč
UCysC
cystatin C v moči
UKrea
kreatinin v moči
V
objem
Bakalářská práce
ÚVOD Laboratorní vyšetření funkcí ledvin patří mezi základní diagnostické postupy. Funkce ledvin je nejčastěji charakterizována prostřednictvím glomerulární filtrace (GF). Hlavními ukazateli glomerulární filtrace jsou kreatinin a cystatin C. Koncetrace kreatininu závisí na několika faktorech (věk, pohlaví, rasa) a poměru svalové hmoty. Současné studie ukazují hyperbolickou závislost koncetrace sérového kreatininu na glomerulární filtraci. Při snížení glomerulární filtrace o méně než 50 %, stoupá koncetrace kreatininu v séru minimálně. Z tohoto důvodu roste význam využití cystatinu C jako markeru glomerulární filtrace. Cystatin C se zvyšuje již v časných stadiích poškození ledvin, tedy daleko dříve, než dochází k zvýšení koncetrace kreatininu. Při akutním selhání ledvin vzestup koncetrace sérového cystatinu C předchází o 1-2 dny vzestup sérové koncentrace kreatininu [10]. Výhoda stanovení cystatinu C spočívá v tom, že není ovlivněna analytickými interferencemi tak, jako u kreatininu. Pacientům odpadá nutnost 24 hodinového sběru moči, a tak jsou eliminovány nepřesnosti ze špatného sběru moči. Hodnoty cystatinu C nejsou závislé na pohlaví. Přítomnost cystatinu C v moči je známkou poškození glomerulů. Proto je zajímavé věnovat se laboratornímu vyšetření koncetrace cystatinu C v moči, které se dosud zcela běžně nevyužívá a mohlo by prospět ke zpestření diagnostiky ledvinového selhání. Ve své práci se budu snažit verifikovat metodu pro stanovení cystatinu C v moči, posoudit její užitečnost v diagnostice renálního selhání u vybrané skupiny pacientů a porovnat s výsledky získanými prostřednictvím kreatininu. Dále se budu zabývat vyhodnocením úrovně glomerulární filtrace u pacientů s různým stupněm postižení ledvin.
13
Bakalářská práce
TEORETICKÁ ČÁST 1.
LEDVINY Základní funkcí ledvin je vylučování odpadních, nepotřebných a toxických látek
(močovina, kyselina močová, kreatinin, metabolity hormonů a léků). Jejich funkce je důležitá z hlediska udržování stability vnitřního prostředí neboli homeostázy. Tu představují osmotický tlak, koncentrace minerálních látek a hladina vodíkových iontů (pH prostředí). Regulaci vnitřního prostředí zajišťují glomerulární filtrace, tubulární zpětná resorpce a sekrece. Ledviny se podílejí na tvorbě biologicky aktivních látek (renin, erytropoetin, kalcitriol, či prostaglandin). V ledvinách se odehrávají základní metabolické procesy glykogeneze a amoniogeneze [1, s. 119; 2, s. 205]. Ledviny především zajišťují tvorbu moči. Její složení se mění dle potřeby organismu [3, s. 99]. 1.1.
Anatomie a fyziologie ledvin Ledviny jsou párový orgán, uložený v horní části břišní dutiny po stranách páteře. Jsou
fazolovitého tvaru a červenohnědé barvy. Na povrchu je tenká vazivová blána. Tukový polštář, který ledviny obaluje, je chrání před mechanickými otřesy [3, s. 97]. Základní funkční jednotkou ledvin je nefron. Každá ledvina obsahuje asi 1,3 milionů nefronů. Nefron se skládá z části cévní a z části tubulární [4, s. 702]. Cévní část (glomerulus) je tvořena kapilárami, které jsou obklopeny tzv. Bowmanovým pouzdrem, které spolu s glomerulem tvoří Malpigiho tělísko. Bowmanovo pouzdro jednou stranou přiléhá na glomerulus a jeho druhá strana se rozevírá do tubulárního systému, který je tvořen soustavou kanálků tubulů. Hlavním kanálkem je proximální tubulus, na který navazuje sestupná a vzestupná část Henleovy kličky. Následuje distální stočený kanálek přecházející ve sběrný kanálek. Tyto části tvoří nefron, který je součástí kůry ledvin. Dřeň ledvin je tvořena pyramidovými útvary, které vycházejí ze sběracích kanálků. Ledvina je tvořena asi 7 až 9 pyramidami. Na jejich vrcholech mají vyústění sběrací kanálky. Ledvinové pyramidy se sbíhají do ledvinových kalichů a dále do ledvinové pánvičky. Ta vyúsťuje do močovodu a následně do močového měchýře [1, s. 119; 2, s. 205; 3, s. 97-98].
14
Bakalářská práce Ledviny jsou zásobovány břišní aortou, která přivádí krev do ledvinných tepen. Dělí se na menší přívodné tepénky a kapiláry. Tyto cévy přivádí krev do Bowmanova pouzdra a glomerulů. Zde se plazma rozděluje tak, že část se filtruje, vstupuje do tubulů a druhá část proudí nadále v cévní soustavě odvodných tepének. Tepénky se větví do kapilární sítě a spojují se ve venózní část cévního oběhu. V glomerulu dochází k filtraci krve. Při správné funkci
ledvin
prochází
do
proximálních
tubulů
jen
nízkomolekulární
látky.
Vysokomolekulární bílkoviny, jsou zadrženy a vzniká primární moč. Ta je v těchto kanálcích upravována a redukována. Dochází k odstraňování přebytečné vody a metabolitů z organismu. V Henleově kličce dochází k vytvoření hypertonického prostředí kolem sběracích kanálků a uskutečňuje se zde konečná úprava moči, tzv. zahušťování. Zahuštění moči je dáno osmotickým gradientem mezi obsahem tubulů a intersticiální tekutinou v dřeni ledvin. Vzniká moč definitivní. Hlavní složkou definitivní moči je močovina. Fyziologická moč je čirá tekutin, nažloutlé barvy se specifickým zápachem. Zdravý člověk vyloučí za den asi 1,5 litru moči [1, s. 119; 3, s. 99; 4, s. 702-703].
Obrázek 1: Základní struktura nefronu (http://www.samouk.cz/moodle/file.php/9/8-vylucovaci-soustava-kuze/vylucovaci-kuze4.PNG)
15
Bakalářská práce 1.2.
Patologie ledvin Poruchy funkce ledvin nastávají z důvodu nefunkčnosti či nedostatečnosti. Dochází
k poruše tubulární, nebo glomerulární části. Ve většině případů, zvláště v pozdějších stádiích onemocnění, dochází k poškození celého nefronu [1, s. 119]. Primární poškození glomerulů vede k poklesu glomerulární filtrace. Hlavním příznakem bývá patologický nález proteinů v moči. Nadměrné vylučování bílkovin do moči, tzv. proteinurie, způsobuje hypoproteinémii a hyperlipoproteinémii a vzniká nefrotický syndrom. Při diabetické nefropatii dochází k mikroalbuminurii [4, s. 730; 5, s. 119-120]. Jiná onemocnění způsobují poškození tubulární části. Mezi tato onemocnění patří nefrogenní diabetes insipidus, intersticiální nefritida, proximální či distální renální tubulární acidóza (intoxikace rtutí či kadmiem). Onemocnění se projevuje především poruchou složení vnitřního prostředí (např. metabolická acidóza) nebo abnormálním výskytem metabolitů a proteinů, které se v moči za fyziologických podmínek nevyskytují. Poruchy tubulů mohou vést až k vývoji mnohočetných cyst v ledvinách, které může přejít až v selhání ledvin [4, s. 730; 5, s. 119-120]. Onemocnění většinou postihnou obě části nefronu, jak glomerulární tak i tubulární část. Mezi onemocnění ledvin patří tzv. nedostatečnost ledvin neboli renální insuficience. Tímto termínem se označuje stav, kdy ledviny jsou schopny udržet stabilitu vnitřního prostředí jen při zachování určitých omezení. Patří sem například snížení příjmu bílkovin, regulace příjmu tekutin a minerálů [5, s. 225-226]. Nejzávažnějším případem je selhání ledvin. V tomto případě je míra poškození ledvin tak velká, že ledviny nejsou schopny udržovat stálost vnitřního prostředí ani při zachování omezujících podmínek. Selhání ledvin dělíme na akutní a chronické. Akutní selhání ledvin se rozvíjí
během několika hodin až dnů.
Příčinou
může být
rychle progredující
glomerulonefritida, hypoperfúze, obstrukční uropatie, zánět, či působení toxických jedů. Během několika dnů se začne vyvíjet oligoanurie, dojde k vzestupu močoviny a kreatininu a k poruše homeostázy. Dochází k reverzibilnímu poklesu exkrečně-metabolické funkce ledvin a k poklesu diurézy. Při chronickém selhání ledvin se ze začátku obtíže u pacientů neobjevují, selhání ledvin se postupně vyvíjí po dobu několika let. V ledvinách dokází ke kompenzačním dějům, kde reziduální nefrony účinně nahrazují funkci poškozených, či zaniklých nefronů. Tím je udržována diuréza i homeostáza minerálů. Dochází k výrazným změnám ve složení extracelulární tekutiny. Chronické onemocnění ledvin může být způsobeno diabetickou
16
Bakalářská práce nefropatií, chronickou glomerulonefritidou, ischemickou nefropatií nebo polycystickými ledvinami [5, s. 120-122; 6, s. 226; 7, s. 323-324,330; 8, s. 259; 279].
17
Bakalářská práce 2.
GLOMERULÁRNÍ FILTRACE Glomerulární filtrace (GF) je důležitá z hlediska posouzení funkce ledvin. Míra
snížení GF je významným ukazatelem stupně závažnosti poškození ledvin [9, s. 3]. GF pomáhá udržet stálost vnitřního prostředí. Její velikost je dána poměrem rozdílu tlaku v přívodné a odvodné tepénce a tlaku v Bowmanově pouzdře. Tento děj označujeme jako filtrační tlak. Velikost glomerulární filtrace závisí na propustnosti glomerulární membrány, gradientu hydrostatických a onkotických tlaků a velikosti filtrační plochy. Fyziologická hodnota velikosti glomerulární filtrace je 2 ml/s/1,73 m2 [6, s. 226; 9, s. 3]. Glomerulární filtraci stanovuje pomocí látek, které jsou vylučovány filtrací a nejsou již dále v tubulech zpětně resorbovány ani secernovány. Mezi tyto látky patří kreatinin, cystatin C, inulin a další. GF může měřit přímo. Toto měření je ale komplikované a náročné. Nejčastěji GF měříme nepřímo, a to jako tzv. renální clearanci. Velikost GF můžeme spočítat podle výpočtových vzorců. V tomto případě se jedná o odhad glomerulární filtrace. U žen je hodnota GF asi o 8 % nižší. Hodnota GF s věkem klesá. Nižší hodnoty než referenční hodnoty ukazují na sníženou funkci ledvin [5, s. 128; 6, s. 226; 7, s. 39-40]. Tabulka 1: Vzájemný vztah mezi selháním ledvin a glomerulární filtrací [10] Stupeň selhání ledvin 1. 2. 3. 4. 5.
2.1.
Pásmo GF (ml/s)
Popis
nad 1,5 1,0 – 1,49 0,5 – 0,99 0,25 - 0,49 pod 0,25 nebo dialýza
Postižení ledvin s normální nebo zvýšenou GF Postižení ledvin s mírně sníženou GF Středně snížená GF Závažně redukovaná GF Selhání ledvin
Mechanismus glomerulární filtrace Krev přiváděná do ledvin je dále distribuována pomocí cév do glomerulů a následně
filtrována přes stěny vlásečnic. Vzniká primární moč, která obsahuje kromě vody i minerály, aminokyseliny, sacharidy a další látky [3, s. 98-99]. Ledviny během dne přefiltrují až 180 litrů primární moči. Toto množství je upraveno na definitivní moč o objemu 1 – 1,5 litrů moče a dále eliminováno. Zbytek je vracen zpět do krevního oběhu [5, s. 128].
18
Bakalářská práce Hodnocení glomerulární filtrace GF můžeme nejčastěji hodnotit prostřednictvím clearance kreatininu případně cystatinu C [6, s. 226-227]. Kreatinin je konečný produkt svalového metabolismu. Vzniká ve svalových buňkách z kreatinfosfátu (fosforylovaná molekula kreatinu). Kreatin je syntetizován v játrech z methioninu, glycinu a argininu. Kreatinfosfát slouží jako pohotovostní zdroj energie (pro doplňování adenosintrifosfátu - ATP). Kreatinin vzniká neenzymovou dehydratací a defosforylací. Poté je uvolňován do krve. Je transportován do ledvin, kde je filtrován z 90 %. Za normálních okolností je 10 % kreatininu secernováno do moče v proximálním tubulu [1, s. 120; 8, s. 298; 11, s. 88; 12; 13, s. 352].
Obrázek 2: Vzorec kreatininu (http://ciselniky.dasta.mzcr.cz/CD_DS4/hypertext/AJDJX.htm) Kreatinin je produkován periodicky a relativně stálou rychlostí. Používá se jako marker glomerulární filtrace. Glomerulární filtrace je posuzována prostřednictvím výpočtu clearance kreatininu [2, s. 215]. Při poklesu glomerulární filtrace dochází ke snižování vylučování kreatininu a tím jeho hodnota v séru stoupá. Ke zvýšení hladiny koncentrace kreatininu v séru dochází při snížení glomerulární filtrace pod 50 %. K rychlému vzestupu hladiny koncetrace kreatininu může dojít při totálním selhání ledvin, při nadměrném uvolnění kreatininu ze svalů nebo při snížení objemu tekutin v těle [1, s. 120].
19
Bakalářská práce Hodnota kreatininu je ovlivnitelná několika faktory. Jeho hladina je především závislá na množství svalové hmoty, svalovém metabolismu, tělesné hmotnosti, koncentraci proteinů v těle, věku, pohlaví, rase a jiných [10]. Hodnota kreatininu v séru závisí na distribučním objemu mimobuněčné tekutiny. Při jeho zvětšování dochází ke snižování plazmatické koncentrace kreatininu. To vede k nepřesným výpočtům glomerulární filtrace [14]. Nepřesné výsledky glomerulární filtrace mohou být způsobeny špatným sběrem moče [6, s. 228]. 2.1.1. Stanovení kreatininu Kreatinin vyšetřujeme v séru, plazmě a moči. Před vyšetřením se nedoporučuje dieta s vyšším obsahem mastných kyselin a větší tělesná zátěž [15]. Jaffého reakce Jaffého reakce patří mezi základní stanovení kreatininu. Metoda je založena na principu reakce kreatininu s kyselinou pikrovou (TNP) v alkalickém prostředí. Spolu s kreatininem reaguje s kyselinou pikrovou i glukosa, kyselina močová, askorbát, acetacetát, pyruvát a léky zvyšující sérový kreatinin (cimetidin, trimetoprim). Tyto látky označujeme jako Jaffé pozitivní chromogeny. Jejich přítomnost ve vzorku snižuje specifitu stanovení [1, s. 222; 2, s. 215; 15]. Pozitivní reakce dává červenooranžové zbarvení. Intenzita zbarvení je přímo úměrná koncetraci kreatininu ve vzorku. Ten stanovujeme spektrofotometricky. Měříme při vlnové délce 340 nm [2, s. 215; 16, s. 3]. Enzymové stanovení Enzymové stanovení kreatininu je založeno na využití specifických enzymů. První variantou je Tanganelliho reakce. Kreatinin je za přítomnosti kreatindeimininasy (CRDIM) rozložen na amoniak a N-methylhydantoin. Za katalýzy glutamátdehydrogenázy (GMD) následně vzniká z amoniaku, 2-oxoglutarátu a NADPH glutamát a NADP+. Výsledná koncetrace kreatininu je přímo úměrná úbytku NADPH. Dochází ke změně absorbance, která se měří kineticky při 340nm [1, s. 223; 17].
20
Bakalářská práce Druhou variantou je přeměna kreatininu na sarkosin. Oxidací sarkosinoxidasou (SOx) vzniká glycin, formaldehyd a peroxid vodíku. Ten se stanoví Trinderovou reakcí. Reakcí s 4aminoantipyrinem (4-AAP) a N-ethyl-N-sulfopropyl-m-toluidinem (TOPS) červeně zbarvený komplex. Intenzita zbarvení komplexu je při 522 nm přímo úměrná koncetraci kreatininu v séru [1, s. 223; 17]. Třetí variantou je přeměna kreatininu na kreatinfosfát a adenosindifosfát (ADP) za pomoci hexokinasy. Za přítomnosti pyruvátkinasy a fosfoenolpyruvátu dojde k přeměně na pyruvát a adenosintrifosfát (ATP). Dále laktátdehydrogenasa (LD) oxiduje NADH na NAD+. Současně dochází k redukci pyruvátu na laktát. Úbytek absorbance je přímo úměrný koncetraci kreatininu. Měříme kineticky při 340 nm [1, s. 223; 17]. Clearance kreatininu Clearance je definována jako objem plazmy, který se očistí od dané látky za určitou časovou jednotku. Tuto látku pak můžeme vypočítat jako podíl téže látky vyloučené do moče (za jednotku času) a její koncetrací ve vzorku [5, s. 128-129]. Clearance kreatininu je vhodná pro určení GF, zejména v případě, kdy velikost GF nepřekročila ještě 50%. Její hodnota neodpovídá přesné hodnotě GF. Hodnota je vyšší o faktor 1,1 – 1,2 [2, s. 219; 18, s. 2]. Výsledná hodnota glomerulární filtrace za pomoci výpočtu clearance kreatininu je založena na předpokladu konstantní produkce kreatininu, kdy je kompletně secernován do moči, a ve vzorku nejsou žádné interferující látky. Ve většině případů nejsou tato kritéria splněna. Vzhledem k tomu, že kreatinin je částečně reabsorbován (10 %) je výsledek GF pomocí clearance nadhodnocován. Clearance kreatininu je proto o 10 – 20 % větší než je skutečná hodnota glomerulární filtrace [2, s. 215; 16, s. 2]. Clearance kreatininu se vypočítá dle rovnice:
ClKrea GFKrea
U Krea V SKrea
ClKrea
= clearance kreatininu
[ml/s/1,73m2]
GFKrea
= glomerulární filtrace kreatininu
[ml/s/1,73m2]
UKrea
= koncetrace kreatininu v moči
[mmol/l]
SKrea
= koncentrace kreatininu v séru
[µmol/l]
V
= objem moči (diuréza)
[ml]
21
Bakalářská práce Clearance kreatininu stanovujeme v moči i séru. Vyšetření se provádí jednorázově v případě, že moč je sbíraná jedno sběrné období. Nejčastěji po dobu 24 hodin, nebo děleně, kdy je moč sbírána ve více intervalech. Nejčastěji ve čtyřech tříhodinových intervalech přes den a třech čtyřhodinových intervalech přes noc [6, s. 227]. Možnosti výpočtu GFR jsou shrnuty v tabulce 2. Tabulka 2: Možnosti výpočtu glomerulární filtrace NÁZEV Odhad glomerulární filtrace podle rovnice Cockcrofta a Gaulta Odhad glomerulární filtrace u dětí podle rovnice dle Schwartze
Odhad glomerulární filtrace pomocí rovnice MDRD
Odhad glomerulární filtrace pomocí rovnice dle Grubba Leveyova rovnice
Odhad glomerulární filtrace pomocí rovnice Lund-Malmö
ROVNICE
GFR
(140 - Věk ) hmotnost ∙ F [ml/l/1,73m2] 48,8.SKrea
CITACE [11, s. 93]
(F= 1,0 pro muže, 0,85 pro ženy)
GF
F.výška [ml/l/1,73m2] S Krea
F: do 1 roku = 0,663 od 1-12 let = 0,810 věk od 12 – 18 let = 0,959 Tříparametrová (kreatinin, urea, albumin): GFR (MDRD1) = 2,83 ∙ (SKrea) ∙ 0,0113)-0,999 ∙ věk0,176 ∙ (SUrea ∙ 2,8)-0,17∙ (SAlb/10)0,318 ∙ F [ml/l/1,73m2] (F= 1,0 pro muže, 0,762 pro ženy) Dvouparametrová (Kreatinin, urea): GFR (MDRD2) = 4,5 ∙ (SKrea) ∙ 0,0113)-1,007 ∙ věk-0,180 ∙ (SUrea ∙ 2,8)-0,169 ∙ F [ml/l/1,73m2] (F= 1,0 pro muže, 0,762 pro ženy) Jednoparametrová (Kreatinin): GFR (MDRD3) = 3,1 ∙ (SKrea) ∙ 0,0113)-1,154 ∙ věk-0,203 ∙ F [ml/l/1,73m2] (F= 1,0 pro muže, 0,742 pro ženy) GFR = 1,4115 . Scyst C-1,68 . F [ml/l/1,73m2] (F= 1,0 pro muže, 0,948 pro ženy, 1,384 pro děti do 14 let) GFR = 1,278 . Scyst C-1,68 [ml/s/1,73m2]
[9, s. 9]
[11, s. 94]
[19, s. 110]
[9, s. 8]
GFR = ex-0,0124 . věk + 0,339 . (LN (věk) – 0,226 (ženy)) [ml/l/1,73m2] x = 4,62 - 0,0112 . SKrea (pro SKrea < 150µmol/l) x = 8,17 + 0,0005. SKrea – 1,07 . LN (SKrea) (kde SKrea ≥ 150µmol/l)
22
[20, s. 3]
Bakalářská práce GFR
= glomerulární filtrace
[ml/s/1,73m2]
SKrea
= koncetrace kreatininu v séru
[µmol/l]
SUrea
= koncetrace močoviny v séru
[mmol/l]
SAlb
= koncetrace albuminu v séru
[g/l]
Scys C
= koncetrace cystatinu C v séru
[mg/l]
LN
= přirozený logaritmus
Výška
[cm]
Věk
[roky]
Hmotnost
[kg]
Odhad GF podle rovnice Cockcrofta a Gaulta Clearance kreatininu dle Cockcrofta a Gaulta lze vypočítat na základě koncetrace kreatininu v séru a není již nutný sběr moči. Rovnice již zahrnuje ukazatele, které ovlivňují velikost glomerulární filtrace (věk, pohlaví a hmotnost) (Tabulka 2) [11, s. 93].
Odhad glomerulární filtrace u dětí podle rovnice dle Schwartze Výpočet glomerulární filtrace podle rovnice dle Schwartze je určena především pro děti a mladistvé do věku 18 let (Tabulka 2) [9, s. 9].
Odhad glomerulární filtrace pomocí rovnice MDRD Rovnice MDRD (Modification od Diet in Renal Disease), je v současné době doporučována pro odhad glomerulární filtrace. Pomocí této rovnice určujeme glomerulární filtraci při chronickém onemocnění ledvin. Rovnice pro odhad GF byla převzata z multicentrické studie. V této studii autoři navrhli vzorec pro predikaci glomerulární filtrace vyplývající z multivariantní regresní analýzy na podkladě sérové koncentrace kreatininu (SKrea), močoviny (SUrea) a albuminu (SAlb) a základních demografických veličin [11, s. 94]. Rovnice MDRD je uvedena v tabulce 2 a byla použita k výpočtu glomerulární filtrace v naší práci.
23
Bakalářská práce Odhad glomerulární filtrace pomocí rovnice dle Grubba Rovnice dle Grubba byla použita pro výpočet GFR cystatinu C v naší práci (Tabulka 2) [19, s. 110]. Leveyova rovnice Leveyova rovnice se používá při stanovení cystatinu C metodou PENIA (particle enhanced immunonephelometry assay) (Tabulka 2) [9, s. 8]. Odhad glomerulární filtrace pomocí rovnice Lund-Malmö Rovnice může být použita u dospělých i u dětí od 1 roku života. Je použitelná v rozsahu koncetrace kreatininu v séru od 45 do 545 µmol/l. Rovnice Lund – Malmö je uvedena v tabulce 2 [20, s.3; 21, s. 37].
24
Bakalářská práce 3.
CYSTATIN C Cystatin C patří do skupiny cysteinových proteáz. Je produkován všemi jadernými
buňkami. Molekulová hmotnost je 13,3 kDa. Je přítomen v tělních tekutinách (krev, mozkomíšní mok a mateřské mléko). Výskyt v moči je patologický [2, s. 216]. Cystatin C je vylučován periodicky. Volně prochází glomeruly a poté je resorbován proximálním tubulem zpět do oběhu a není již dále secernován [2, s. 216; 11, s. 91-93]. Struktura cystatinu C je znázorněna na obrázku 3.
Obrázek 3: Molekula cystatinu C (https://en.wikipedia.org/wiki/File:Cystatin_C_1r4c.png) Cystatin C je významným ukazatelem ledvinových onemocnění. Lze jej prokázat již v časných stádiích postižení ledvin, tedy v případech, neklesne-li glomerulární filtrace pod 50 %. Cystatin C nepodléhá cirkadiálním rytmům a jeho koncetrace není závislá na množství svalové hmoty ani jiných parametrech [11, s. 91-92]. Metabolismus a vylučování Cystatin C je filtrován z krve glomeruly, jejichž stěnou prostupuje voda a v ní rozpuštěné látky. Krevní buňky a vetší proteinové molekuly jsou zachytávány na stěnách cév. Vytváří se primární filtrát. Poté je cystatin C reasorbován spolu s glukózou a dalšími látkami.
25
Bakalářská práce Zbývající složky jsou vyloučeny do moči. Reabsorbovaný cystatin C je po vytvoření glomerulárního filtrátu odbourán a do krevního oběhu se již nevrací. Na jeho zpětné resorpci se podílí membránový přenašeč zvaný megalin. Zvýšená koncentrace cystatinu C se objevuje v důsledku snížené funkce ledvin, dochází-li ke snížení rychlosti tvorby filtrátu. Vylučování cystatinu C do moči je patologický stav, a poukazuje tak na postižení funkce ledvin [10; 15; 11, s. 91-92]. 3.1.
Laboratorní vyšetření cystatinu C Koncetrace Cystatinu C na rozdíl od kreatininu není ovlivňována množstvím svalové
hmoty, pohlavím, věkem ani rasou [11, s. 92]. Koncentrace cystatinu C roste s poklesem GF. Při poškození tubulů se koncentrace cystatinu C v moči zvyšuje. Zvýšené hodnoty cystatinu C však můžeme zaznamenat i v případě, že hodnota glomerulární filtrace je normální. Koncetraci cystatinu C vyšetřujeme v séru a plazmě [5, s. 128-130; 18, s. 264]. Cystatin C stanovujeme pomocí imunochemických metod. Metoda PENIA (particle enhanced immunoturbidimetry assay) pracuje na principu imunonefelometrie. Metoda PETIA (particle enhanced immunonephelometry assay) pracuje na principu imunoturbidimetrie. K zesílení citlivosti reakce se používá latexových částic s vázanou protilátku. Pro metodu PENIA se používá ke kalibraci purifikovaný cystatin C izolovaný z lidské moče a pro metodu PETIA se používá rekombinantní lidský cystatin C [22]. Principem reakce je aglutinace séra (plazmy) obsahujícího antigen a protilátkou navázanou částici. Intenzita vzniklého zákalu se měří při vlnové délce 545 nm [23, s. 4]. Současné studie ukazují, že stanovení cystatinu C v moči by mohlo lépe reflektovat glomerulární filtraci [10].
26
Bakalářská práce 4. CÍLE PRÁCE
1. Stanovit cystatin C v moči u zdravých jedinců a vyhodnotit základní
validační charakteristiky
(limit detekce, limit
stanovitelnosti, opakovatelnost a reprodukovatelnost)
2. Vyhodnotit korelaci koncetrace kreatininu, cystatinu C a GFR kreatininu a cystatinu C v séru a v moči ve vybrané skupině pacientů (pacienti s koncetrací sérového kreatininu v referenčním rozmezí, pacienti se zvýšenou koncetrací sérového kreatininu.) a. U pacientů s normální funkcí ledvin charakterizovanou hladinou
sérového
kreatininu
v referenčním
rozmezí
a
normální glomerulární filtrací. b. U pacientů s renální dysfunkcí charakterizovanou zvýšenou koncetrací sérového kreatininu a sníženou glomerulární filtrací.
27
Bakalářská práce
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 5.
MATERIÁL, METODY A CHARAKTERISTIKA PACIENTŮ
5.1. Stanovení cystatinu C a kreatininu Tabulka 3: Chemikálie a reagencie pro stanovení cystatinu C Název
Výrobce
Cystatin C Immunoparticles
Dako Cytomation
Reaction buffer 9
Dako Cytomation
Reagencie v setu: Reagencie R1:
reakční pufr 9
Reagencie R2:
králičí protilátka proti lidskému imunoglobulinu A
Pomocné roztoky: - 0,9% NaCl - 3,6% NaOH - kyvetový kondicionér - inkubační olej - Reagent Probe Wash 1 - Reagent Probe Wash 2 - Reagent Probe Wash 3 - deionizovaná voda Tabulka 4: Chemikálie a reagencie pro stanovení kreatininu Název
Výrobce
Enzymatic Creatinine_2
Siemens Medical Solutions
(ECRE_2)
Diagnostics
28
Bakalářská práce Reagencie v setu: Reagencie R1: (4 x 38 ml) - Kreatináza
75 U/ml
- Sarkozinoxidáza
20 U/ml
N-(3-sulfopropyl)-3-metoxy-5-metylanilin 0,9 mmol/l Reagencie R2: (4 x 15,4 ml) - Kreatinináza
400 U/ml
- A-aminoantipyrin
6,1 mmol/l
- Peroxidáza
50 U/l
- azid sodný
0,095%
Pomocné roztoky - 0,9% NaCl - 3,6% NaOH - Kyvetový kondicionér - inkubační olej - Reagent Probe Wash 1 - Reagent Probe Wash 2 - Reagent Probe Wash 3 - deionizovaná voda 5.2. Přístroje a doplňkový matriál Přístroje a přídavná zařízení - Automatický biochemický analyzátor ADVIA 1800 - Universal Rack handing Systém - Pipety - Mikropipety 100 µl, 200 µl - Vortex (Vepl scientifica)
29
Bakalářská práce Doplňkový materiál - Cup B ADVIA (Siemens) - automatické pipety - špičky žluté - zkumavky ependorf 1,5 ml - stojan na zkumavky ependorf 1,5 ml
5.3. Charakteristika souboru pacientů Do studie bylo zařazeno celkem 84 pacientů. Pacienti byli rozděleni do dvou skupin dle závažnosti poškození ledvin. První skupinu tvořili pacienti s normální funkcí ledvin, tedy s normální hodnotou glomerulární filtrace a koncetrací sérového kreatininu v referenčním rozmezí. Druhou skupinu tvořili pacienti s poruchou funkce ledvin, jejichž koncetrace sérového kreatininu byla zvýšená a hodnota glomerulární filtrace snížená. Tam, kde tyto parametry nebyly dostupné, byly doměřeny koncentrace kreatininu v moči a dopočteny hodnoty glomerulární filtrace. Charakteristika souboru pacientů je shrnuta v tabulce 5. Hodnoty jednotlivých parametrů jsou vyjádřeny jako medián ± směrodatná odchylka (SD). Tabulka 5: Charakteristika pacientů Počet (muži/ženy)
věk
S-
U-
S-
U-
(roky)
Kreatinin
Kreatinin
Cystatin
Cystatin
(rozmezí)
[µmol/l]
[mmol/l]
[mg/l]
[mg/l]
10,56 ±
0,86 ±
0,25 ±
8,24
0,11
0,00
2,72 ±
0,8 ±
1,37
2,00
GFR-K sérum [ml/s/1,73m2]
GFR-C sérum [ml/s/1,73m2]
1,51 ± 0,30
1,82 ± 0,39
0,32 ± 0,16
0,26 ± 0,17
Pacienti s normální
51
44
funkcí
(19/33)
(18-70)
s poruchou
33
53
288 ±
funkce
(27/6)
(17-87)
246,03
66 ± 13
ledvin Pacienti 4,9 ± 3,96
ledvin
S-kreatinin – kreatinin v séru, U-kreatinin – kreatinin v moči, S-cystatin C – cystatin C v séru, U-cystatin C – cystatin C v moči, GFR–K – odhad glomerulární filtrace prostřednictvím kreatininu v séru, GFR–C – odhad glomerulární filtrace prostřednictvím cystatinu C v séru.
30
Bakalářská práce Rozdíly mezi koncentracemi kreatininu a cystatinu C v séru a moči a rozdíly v hodnotách GFR v obou skupinách byly statisticky významné (p < 0,0001 – Mann Whitneyův U-test)
5.4.
Statistické nástroje a analýza dat D´Agostinův Pearsonův test byl použit k ověření normálního rozložení dat obou
souborů. Vzhledem k tomu, že rozložení dat v souborech nebylo parametrické, použili jsme k porovnání výsledků v jednotlivých skupinách neparametrický Mann-Whitneyův U-test a Spearmanův korelační koeficient. Hodnota p < 0,05 byla stanovena jako hladina významnosti. K vyhodnocení dat byl využit software GraphPad Prism verze 5.0 (San Diego, California).
31
Bakalářská práce 6.
VÝSLEDKY
6.1.
Vyhodnocení validačních parametrů pro stanovení cystatinu C v moči Validační parametry pro stanovení cystatinu C v moči byly definovány na základě
předdefinovaných parametrů pro stanovení cystatinu C v séru. Byla připravena šesti bodová kalibrace cystatinu C. Jako nulový kalibrátor byla použita destilovaná voda. Ředění standardů se provádí automaticky v analyzátoru podle definovaných parametrů metody. Stanovovali jsme následující parametry:
mez detekce, mez stanovitelnosti,
opakovatelnost a reprodukovatelnost.
Mez detekce Pro měření meze detekce byla 10krát změřena absorbance slepého vzorku. Jako slepý vzorek byla použita destilovaná voda. Z uvedených výsledků byl vypočítán průměr a směrodatná odchylka. Absorbance odpovídající mezi detekce byla vypočítána jako trojnásobek směrodatné odchylky. Hodnota koncetrace 0,25 mg/l pro mez detekce byla odečtena z kalibrační křivky (Obrázek 4). Výsledky hodnot absorbancí jsou uvedeny v tabulce 6. Tabulka 6: Hodnoty absorbancí pro mez detekce Měření 1. 2. 3. 4. 5.
Absorbance 0,75104 0,74887 0,75668 0,76021 0,75107
6. 7. 8. 9. 10.
0,75428 0,74407 0,75073 0,73853 0,74054
Průměr Směrodatná odchylka Limit detekce (LOD)
0,749602 0,006879
32
0,02
Bakalářská práce Obrázek 4 : Graf kalibrační křivky pro mez detekce
Mez stanovitelnosti Mez stanovitelnosti byla vypočítána jako desetinásobek průměrné hodnoty absorbance směrodatné odchylky. Hodnota koncetrace 0,63 mg/l pro mez stanovitelnosti byla odečtena z grafu
(Obrázek
5).
Jednotlivé
hodnoty
absorbancí
jsou
tabulce 7. Tabulka 7: Hodnoty absorbancí pro mez stanovitelnosti Měření 1. 2.
Absorbance 0,75104 0,74887
3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
0,75668 0,76021 0,75107 0,75428 0,74407 0,75073 0,73853
10.
0,74054
Průměr Směrodatná odchylka Limit stanovitelnosti (LOQ)
0,749602
33
0,006879 0,07
zaznamenány
v
Bakalářská práce Obrázek 5: Graf kalibrační křivky pro mez stanovitelnosti
Opakovatelnost Opakovatelnost byla stanovena měřením 10 vzorků směsného séra pacienta během jednoho dne v jedné sérii. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 8. Tabulka 8: Opakovatelnost Číslo měření
Koncentrace [mg/l]
1
4,09
2
4,01
3
3,99
4
4,03
5
4,06
6
3,96
7
3,99
8
4,00
9
4,02
10
3,97
Průměr
4,01
Směrodatná odchylka [%]
0,04
variační koeficient [%]
1,00
34
Bakalářská práce Reprodukovatelnost Reprodukovatelnost byla stanovena měřením stejného vzorku směsného séra jako v případě opakovatelnosti po dobu 10 dnů. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 9. Tabulka 9: Reprodukovatelnost Číslo měření 1 2
koncentrace [mg/l] 4,67 4,64
3
4,67
4
4,92
5
4,29
6
4,57
7
4,11
8
4,31
9
4,61
10
4,51
Průměr
4,53
Směrodatná odchylka [%]
0,23
Variační koeficient [%]
5,17
6.2. Stanovení cystatinu C u pacientů s různým stupněm dysfunkce ledvin Koncentrace cystatinu C v séru a v moči byly stanoveny u pacientů s normální funkcí ledvin charakterizovanou normálními hodnotami kreatininu a ve skupině pacientů s postiženou funkcí ledvin charakterizovanou zvýšenou koncetrací sérového kreatininu a sníženou glomerulární filtrací. V obou skupinách byly vypočteny hodnoty glomerulární filtrace. GFR pro cystatin C a kreatinin byly vypočteny dle rovnice uvedených v tabulce 2. Pro výpočet GFR prostřednictvím cystatinu C byla použita Grubbova rovnice: GFR = 1,4115. Scyst C-1,68 . F
[ml/s/1,73m2]
(F= 1,0 pro muže, 0,948 pro ženy, 1,384 pro děti do 14 let) Pro výpočet GFR prostřednictvím kreatininu byla využita rovnice MDRD: GFR = 3,1 ∙ (SKrea) ∙ 0,0113)-1,154 ∙ věk-0,203 ∙ F (F= 1,0 pro muže, 0,742 pro ženy)
35
[ml/s/1,73m2]
Bakalářská práce Výsledky jsou podrobně shrnuty v tabulce 5 – charakteristika pacientů. Vyhodnotili jsme korelaci kreatininu, cystatinu C a vypočtených glomerulárních filtrací v obou skupinách Výsledky jsou znázorněny v tabulce 10 a v grafech 1 – 6. Tabulka 10: Přehled korelací jednotlivých parametrů Korelační koeficient – r (Spearmanův) GFR-kreatinin-Norm./ GFR-cystatin C-Norm. [Graf 1]
0,31
GFR-kreatinin-Postiž./ GFR-cystatin C-Postiž. [Graf 2]
0,73
GFR-cystatin C-Norm./ GFR-cystatin Postiž. [Graf 3]
-0,19
GFR-kreatinin-Norm./ GFR-kreatinin-Postiž. [Graf 4]
0,01
sérum-kreatinin-Postiž./sérum-cystatin C-Postiž. [Graf 5]
0,71
moč-kreatinin-Postiž./moč-cystatin C-Postiž. [Graf 6]
-0,16
Norm. – normální funkce ledvin Postiž. – postižená funkce ledvin
Graf 1: Porovnání GFR kreatininu a GFR cystatinu C u pacientů s normální funkcí ledvin
GFR - cystatin C - Norm. - [ml/s/1,73m2]
GFR kreatinin - Norm. / GFR - cystatin C - Norm. 3,50 3,00
r = 0,31
2,50 2,00 1,50 1,00 1,00
1,50
2,00
2,50
GFR - kreatinin - Norm. [ml/s/1,73m2]
36
3,00
Bakalářská práce Graf 2: Porovnání GFR kreatininu a cystatinu C u pacientů s postižením ledvin
GFR - cystatin C -Postiž. [ml/s/1,73m2]
GFR - kreatinin - Postiž. / GFR - cystatin C - Postiž. 0,80 0,70 0,60 0,50
r = 0,73
0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
GFR - kreatinin - Postiž. [ml/s/1,73m2]
Graf 3: Porovnání GFR cystatinu C u pacientů s normální funkcí ledvin a s ledvinovou
GFR - Cysattin C - Postiž. [ml/s/1,73m2]
dysfunkcí
GFR - Cystatin C - Norm. / GFR - Cystatin C - Postiž. 0,80 0,70 0,60 0,50
r = - 0,19
0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 1,00
1,50 2,00 2,50 GFR - Cystatin C - Norm. [ml/s/1,73m2]
37
3,00
Bakalářská práce Graf 4: Porovnání GFR kreatininu u pacientů s normální funkcí ledvin a s renální dysfunkcí
GFR - Kreatinin - Postiž. [ml/s/1,73m2]
GFR - Kreatinin - Norm. /GFR - Kreatinin - Postiž. 0,70 0,60 0,50 0,40
r = 0,01
0,30 0,20 0,10 0,00 1,20
1,40
1,60
1,80
2,00
2,20
2,40
2,60
2,80
GFR - Kreatinin - Norm. [ml/s/1,73m2]
Graf 5: Porovnání koncetrace kreatininu a cystatinu C v séru u pacientů s renální dysfunkcí
Sérum - cystatin C - Postiž. [mg/l]
Sérum - kreatinin - Postiž. / Sérum - Cystatin C - Postiž. 8,00 7,00 6,00
r = 0,71
5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 100
300
500
700
Sérum - kreatinin - Postiž. [µmol/l]
38
900
1100
Bakalářská práce Graf 6: Porovnání koncentrací kreatininu a cystatinu C v moči u pacientů s renální dysfunkcí
Moč - cystatin C - Postiž. [mg/l
Moč - Cystatin C - Postiž / Moč. Kreatinin - Postiž. 7,00 6,00 5,00
r = - 0,16
4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 0,0
5,0
10,0
15,0
Moč - kreatinin - postiž. [mmol/l] .
39
20,0
Bakalářská práce 7.
DISKUZE Ověřili jsme validační parametry stanovení cystatinu C v moči. Vzhledem k tomu, že
metoda na stanovení cystatinu C v moči nebyla dosud vyvinuta, byla verifikace provedena dle parametrů dostupných pro vyšetření cystatinu C v séru. V této práci byla pro stanovení cystatinu C v moči použita metoda PETIA. Pro stanovení cystatinu C v séru jsou výrobcem definovány následující hodnoty validačních parametrů: Opakovatelnost = variační koeficient (CV) < 3 %, reprodukovatelnost = CV < 4 % při koncetraci 1 mg/l, limit detekce = 0,07 mg/l. Získané výsledky validačních parametrů pro vyšetření cystatinu C v moči (limit detekce – 0,25 mg/l, limit kvantifikace – 0,63 mg/l, CV za podmínek opakovatelnosti = 1%, CV za podmínek reprodukovatelnosti 5 % jsou vyhovující a stanovení cystatinu C v moči může být tedy využito pro diagnostiku renálního selhání. Podařilo se potvrdit významný nárůst koncetrací cystatinu C v moči i v séru u pacientů s postižením ledvin (0,25 mg/l vs. 0,8 mg/l v moči resp. 0,86 mg/l vs. 2,72 mg/l v séru). Obdobný nárůst byl zaznamenán i u sérového kreatininu (288 mmol/l vs. 66 mmol/l). Oproti tomu koncetrace kreatininu v moči u pacientů s postižením ledvin byly snížené (10,56 mmol/l vs. 4,9 mmol/l). Glomerulární filtrace vyjádřená hodnotou GFR byla snížená ve skupině pacientů s renální dysfunkcí (GFR cystatin C = 1,82 ml/s/1,73 m2 vs. 0,26 ml/s/1,73 m2; GFR kreatinin 1,51 ml/s/1, 73 m2 vs. 0,32 ml/s/1, 73 m2) (Tabulka 5). Prokázali jsme zvýšenou korelaci hodnot GFR cystatinu C oproti GFR kreatininu u pacientů s renálním selháním (r = 0,73). Korelace hodnot GFR cystatinu C oproti GFR kreatininu u pacientů s normální funkcí ledvin byla nižší (r = 0,31) (Grafy 1 a 2). Nalezli jsme negativní korelaci GFR cystatinu C u pacientů s renálním selháním (r = - 0,19), zatímco korelace GFR kreatininu byla u těchto pacientů pozitivní (r = 0,01) (Grafy 3 a 4). Obdobné výsledky byly zjištěny i pro koncetraci kreatininu a cystatinu C v séru a v moči. Zjistili jsme pozitivní korelaci sérového cystatinu C oproti kreatininu u pacientů s renálním selháním (r = 0,71), v moči byla naopak nalezena negativní korelace (r = - 0,16) (Grafy 5 a 6). Výpočet glomerulární filtrace z rovnice MDRD i odhad GF z koncentrace cystatinu C dobře korelují se standardními metodami stanovení glomerulární filtrace. V porovnání s metodami odhadu GF ze sérového cystatinu C rovnice MDRD výsledky GF nadhodnocuje a
40
Bakalářská práce vykazuje rozdíly mezi pohlavími. Rovnice byla odvozena z dat pacientů s chronickou renální insuficiencí, takže její použití v oblasti fyziologických nebo mírně snížených hodnot filtrace nelze jednoznačně doporučit. Cystatin C je filtrován glomeruly a kompletně reabsorbován a katabolizován v buňkách proximálního tubulu. Při normální glomerulární filtraci je koncetrace cystatinu C v plazmě v rozmezí 0,5 – 1,2 mg/l. Tento předpoklad byl potvrzen, protože medián souboru pacientů s normální glomerulární filtrací byl 0,86 mg/l. Při poškození tubulů nedochází k úplnému vstřebávání cystatinu C do krve, a tím se zvyšuje jeho koncetrace v moči. U pacientů s normální glomerulární filtrací a koncetraci kreatininu v séru v referenčním rozmezí je koncetrace cystatinu C v moči < 0,3 mg/l [10]. Tento předpoklad jsme potvrdili, neboť koncentrace cystatinu C v moči ve studované skupině pacientů s normální funkcí ledvin byla menší než stanovený detekční limit 0,25 mg/l. Kreatinin do moči přechází glomerulární filtraci tubulární sekrecí a zpět do krve se nevstřebává. Zvýšená koncetrace kreatininu v séru může nastat v případě sníženého vylučování kreatininu ledvinami, při uzávěru ledvinových tepen a žil. Při snížení GF je prvotní vzestup kreatininu v séru kompenzován zvýšenou tubulární sekrecí kreatininu do moči. Z toho důvodu dochází při poškození ledvin průniku cystatinu C do moči a současnému zvýšení koncetrace kreatininu v krvi, jak je ukázáno a potvrzeno v tabulce 5 - zvýšení hodnoty cystatinu C v moči (0,25 mg/l vs. 0,8 mg/l), snížení kreatininu v séru (66 mmol/l vs. 288 mmol/l) a snížení koncetrace kreatininu v moči (10,56 mmol/l vs. 4,9 mmol/l) [10]. Jak již bylo zmíněno v úvodní teoretické části, glomerulární filtrace vypočtená z hodnot kreatininu může být ovlivňována řadou faktorů (např. velikost svalové hmoty, užívání specifických léků). V těchto případech je pro stanovení glomerulární filtrace citlivějším ukazatelem cystatin C, který není těmito faktory ovlivňován [24]. Diagnostická senzitivita u kreatininu je při snížení glomerulární filtrace 52,4 % stanovení cystatinu C je ukazuje senzitivitu 71,4 % [20]. Vysoká hladina glukózy v krvi může vést k postupnému poškození ledvinových cév. Jednou z významných příčin snížené glomerulární filtrace může být např. diabetická nefropatie. Ledviny přestávají správně fungovat, snižuje se glomerulární filtrace a může dojit až k úplnému selhání ledvin. V našem souboru pacientů s postižením ledvin bylo celkem 12 pacientů s hyperglykemií (koncetrace glukózy v plazmě byly v rozmezí 6 – 9,8 mmol/l). U 5 pacientů byla potvrzena diagnóza diabetes mellitus. Podařilo se potvrdit, že pacienti s hyperglykemií mají sníženou glomerulární filtraci oproti pacientům s normální koncentrací glukózy v plazmě, jak ukazuje tabulka 11.
41
Bakalářská práce Tabulka 11: Přehled velikosti GF u pacientů s hyperglykémií a u pacientů s hodnotou glykemie v referenčním rozmezí.
GFR – Kreatinin [ml/s/1,73m2] GFR – Cystatin C [ml/s/1,73m2]
Medián koncetrace
Medián koncetrace
normální glykémie
hyperglykémie
[ml/s/1,73m2]
[ml/s/1,73m2]
0,34
0,30
- 0,11
0,25
0,17
- 0,08
42
Korelační koeficient [r - Spearmanův]
Bakalářská práce ZÁVĚR Stanovili jsme koncentraci cystatinu C v moči a na základě vyhodnocených validačních
charakteristik
(mez
detekce,
mez
stanovitelnosti,
opakovatelnost,
reprodukovatelnost) lze potvrdit využití koncentrací cystatinu C v moči pro diagnostiku renálního selhání. Vyhodnotili jsme korelaci koncentrací kreatininu, cystatinu c a GFR kreatininu a cystatinu C u pacientů s renální dysfunkcí charakterizovanou zvýšenou koncentrací kreatininu a sníženou glomerulární filtrací. Prokázali jsme zvýšené koncentrace Cystatinu C v séru a v moči a sníženou glomerulární filtraci u pacientů s postižením ledvin. U pacientů s postižením funkcí ledvin jsme nalezli zvýšenou korelaci GFR cystatinu C oproti GFR kreatininu. GFR cystatinu C u pacientů s postižením ledvin negativně korelovala s GFR pro normální ledvinové funkce, zatímco korelace GFR kreatininu byla u těchto pacientů pozitivní. Dále jsme zjistili pozitivní korelaci sérového cystatinu C oproti kreatininu u pacientů s renálním selháním, v moči byla naopak nalezena negativní korelace. Cystatin C je vhodným markerem pro stanovení glomerulární filtrace u pacientů s postižením ledvin. Potvrdili jsme vzájemnou korelaci glomerulární filtrace se stupněm postižení ledvin.
43
Bakalářská práce SEZNAM LITERATURY 1. ŠTERN, Petr. Obecná a klinická biochemie: pro bakalářské obory studia. 2., upr. vyd. Praha: Univerzita Karlova, 2011, 269 s. Učební texty Univerzity Karlovy v Praze. ISBN 978-802-4619-798. 2. MASOPUST, Jaroslav. Klinická biochemie: Požadování a hodnocení biochemických vyšetření. I. část. 1. vyd. Praha: Karolinum, 1998, 429 s. ISBN 80-718-4648-1. 3. NOVOTNÝ, Ivan a Michal HRUŠKA. Biologie člověka. 4., rozš. a upr. vyd. Praha: Fortuna, 2007, 239 s. Učební texty Univerzity Karlovy v Praze. ISBN 978-80-7373007-9. 4. GANONG, William F. Review of medical physiology. 21st ed. New York: Lange Medical Books/McGraw-Hill, 2003. ISBN 00-714-0236-5. 5. ZIMA, Tomáš. Laboratorní diagnostika. 2., dopl. a přeprac. vyd. Praha: Galén, 2007, 906 s. ISBN 978-802-4614-236. 6. RACEK, Jaroslav. Klinická biochemie. 2., přeprac. vyd. Praha: Galén, 2006, 329 s. ISBN 80-726-2324-9. 7. TEPLAN, Vladimír. Praktická nefrologie. 2., zcela přeprac. a dopl. vyd. Praha: Grada, 2006, 496 s., 12 s. barev. obr. příloh. ISBN 80-247-1122-2. 8. SCHÜCK, Ota, V TESAŘ a V TEPLAN. Klinická nefrologie. [1. vyd.]. Praha: MEDPRINT, c1995, 406 s. ISBN 80-902-0360-4. 9. ZIMA, Tomáš a Vladimír TEPLAN. Doporučení České nefrologické společnosti a České společnosti klinické biochemie Č LS JEP k vyšetřování glomerulární filtrace. 2009, s. 1-14. Dostupné z: http://www.cskb.cz/res/file/doporuceni/dopGFR.pdf 10. Encyklopedie laboratorní medicíny pro klinickou praxi. [online]. 2012. vyd. [cit. 2013-04-2]. Dostupné z: http://www.enclabmed.cz/
44
Bakalářská práce 11. TEPLAN, Vladimír. Akutní poškození a selhání ledvin. 1. vyd. Praha: Grada Publishing, 2010, 416 s. ISBN 978-802-4711-218. 12. KVASNICOVÁ, Vladimíra. [online]. 2006. vyd. [cit. 2013-03-14]. Dostupné z: http://ciselniky.dasta.mzcr.cz/CD_DS4/hypertext/AJDJX.htm 13. MURRAY, Robert K, Daryl K. Granner, Peter A. Mayes. Harperova Biochemie: a LANGE medical book. 23. vyd., V ČR 3. vyd., V nakl. H. Jinočany: H, 1998, 872 s. ISBN 80-857-8738-5. 14. Vyšetřovací metody: Laboratorní vyšetření ledvinových funkcí. [online]. 2012 [cit. 2013-02-12]. Dostupné z: http://pfyziollfup.upol.cz/castwiki2/?p=1550 15. PICK, MUDr. Pavel. Biochemická syndromologie nemocí ledvin a močových cest. [online].
[cit.
2013-04-04].
Dostupné
z:
http://www1.lf1.cuni.cz/~kocna/biochem/text4.htm 16. ZIMA, Tomáš, Vladimír TEPLAN a Vladimír TESAŘ. Doporučení odborných společností: Doporučení České nefrologické společnosti a České společnosti klinické biochemie ČLS JEP k vyšetřování glomerulární filtrace [online]. 2009 [cit. 2013-0215].
Dostupné
z:
http://www.cskb.cz/res/file/KBM-pdf/2009/2-
09/KBM0209_Dop_eGF.pdf 17. BÁRTOVÁ, Marie. Porovnání odhadu glomerulární filtrace ze sérových hladin cystatinu C a kreatininu stanoveného ezymaticky. Brno, 2010. Dostupné z: http://is.muni.cz/th/101776/lf_b/Bakalarska_prace.txt. Bakalářská práce. Masarykova univerzita v Brně, lékařská fakulta. Vedoucí práce RNDr. Hana Dobrovolná. 18. JABOR, Antonín, Antonín JABOR a Vladimíra KVASNICOVÁJABOR. Kreatinin v moči.
[online].
2006
[cit.
2013-03-10].
Dostupné
z:
http://www.prevedig.cz/pict/fotogalerie/Odborne_texty/Kreatinin%20v%20mo%C4% 8Di%20%28odpad%29.pdf
45
Bakalářská práce 19. Diabetes Health Center: Diabetic Nephropathy - Topic Overview. [online]. 2011, s. 12 [cit. 2013-02-02]. Dostupné z: http://diabetes.webmd.com/tc/diabetic-nephropathytopic-overview 20. GRUBB, Anders, Ulf NYMAN a Jonas BJÃRK. Improved estimation of glomerular filtration rate (GFR) by comparison of eGFR cystatin C and eGFR creatinine. Scandinavian Journal of Clinical [online]. roč. 72, č. 1, s. 73-77 [cit. 2013-03-12]. ISSN
0036-5513.
DOI:
10.3109/00365513.2011.634023.
Dostupné
z:
http://informahealthcare.com/doi/abs/10.3109/00365513.2011.634023 21. JABOR,
A.
[online].
[cit.
2013-03-29].
Dostupné
z:
http://web2.stapro.cz/bullfons/22010/klin2.pdf 22. Standardní operační postup Ústavu lékařské chemie a klinické biochemie 2. LF a FN v Motole: Stanovení Cystatinu C imunoturbidimetrickou metodou. 2008, 13. 23. Laboratorní příručka Ústavu lékařské chemie a klinické biochemie 2. LF UK a FN v Motole.
2011,
158
s.
[cit.
12-02-2013].
Dostupné
z:
http://www.lf2.cuni.cz/Ustavy/ukbp/laboratorni-prirucka.pdf 24. BAČÍKOVÁ, L., E. BODIŠOVÁ a L. DUBSKÁ. Abstrakta přednášek a posterů [online].
Brno,
2008[cit.
2013-03-3].
Dostupné
z:
http://www.cskb.cz/res/file/biolaby/biolab-2008-sbornik.pdf 25. LOTHAR, Thomas. Clinical laboratory diagnostics: use and assessment of clinical laboratory results. 1st ed. Editor Lothar Thomas. Frankfurt am Main: TH-Books, c1998, 1527 s. ISBN 39-805-2154-0. 26. DASTYCH, Milan a Petr BREINEK. Klinická biochemie: bakalářský obor Zdravotní laborant. 1. vyd. Brno: Masarykova univerzita, 2008, 232 s. ISBN 978-802-1045-729. 27. ČERMÁKOVÁ, Marta a Irena ŠTĚPÁNOVÁ. Klinická biochemie. 1. vyd. Brno: IDVPZ, 2003, 120 s. ISBN 80-701-3372-4.
46
Bakalářská práce 28. Cystatin C Immunoparticles [online]. 2005. vyd. 8 s. [cit. 12-03-2013]. 29. SINGH, D. a MA. WHOOLEY. Vztah mezi cystatinem C, odhadnutou hodnotou GF a zánětlivými biomarkery: studie Heart and Soul. [online]. [cit. 2013-02-05]. Dostupné z: http://www.transplant.cz/vzdelavani/2007/07_03_11.pdf 30. Laboratorní
příručka.
[online].
[cit.
2013-02-15].
Dostupné
z:
http://www.nembo.cz/lekari/HVEZDAAAWL.htm 31. ADVIA 1800 Chemistry System [online]. [cit. 2013-04-08]. Dostupné z: http://healthcare.siemens.com/clinical-chemistry/systems/advia-1800-chemistrysystem 32. Zelená hvězda: Glomerulární filtrace. [online]. 2010 [cit. 2013-04-04]. Dostupné z: http://www.zelenahvezda.cz/pacientska-sekce/p-dialyza/glomerularni-filtrace 33. Turbidimetry/Nephelometry.
[online].
2006
[cit.
2013-04-05].
Dostupné
z:
http://www.dako.com/dist/download.pdf?objectid=104967004 34. Standardní operační postup Ústavu lékařské chemie a klinické biochemie 2. LF a FN v Motole: Stanovení Cystatinu C imunoturbidimetrickou metodou. 2008, 13. 35. Standardní operační postup Ústavu lékařské chemie a klinické biochemie 2. LF a FN v Motole: Stanovení kreatininu enzymatickou kolorimetrickou metodou. 2008, 13. 36. FRIEDECKÝ, Bedřich, ŠPRONGL a Josef KRATOCHVÍLA. Česká společnost klinické biochemie: Česká lékařská společnost Jana Evangelisty Purkyně [online]. 2004 [cit. 2013-02-016]. Dostupné z: http://www.cskb.cz/cskb.php?pg=doporuceni-validace-a-verifikace-metod 37. Medixa.org.
[online].
[cit.
http://cs.medixa.org/lecba/kreatinin
47
2013-03-06].
Dostupné
z:
Bakalářská práce 38. VAN DEVENTER, Hendrick E., Janice E. PAIKER, Ivor J. KATZ a Jaya A. GEORGE. A comparison of cystatin C- and creatinine-based prediction equations for the estimation of glomerular filtration rate in black South Africans [online]. 2012 [cit. 2013-03-05].
Dostupné
z:
http://ndt.oxfordjournals.org/content/26/5/1553.full?sid=f51aae3f-66ca-4099-8efc0044389af75a 39. MACUNLUOGLU, Aydin ATAKAN, Munir DEMIRCI, Elif ARi, Ahmet TOPUZOGLU a Ali BORAZAN. A comparison of different methods for the determination of glomerular filtration rate in elderly patients with chronic renal failure. International Urology and Nephrology [online]. roč. 43, č. 1, s. 257-263 [cit. 2013-03-10]. ISSN 0301-1623. DOI: 10.1007/s11255-010-9846-0. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/s11255-010-9846-0. 40. UDY, Andrew, Robert BOOTS, Siva SENTHURAN. Anesthesia and analgesia: Augmented Creatinine Clearance in Traumatic Brain Injury. 2010, roč. 111, č. 6, s. 1505-1510. Dostupné z: http://www.anesthesia-analgesia.org/content/111/6/1505.long 41. MAILLARD, Nicolas, Manolie MEHDI, Lise THIBAUDIN. Nephrology Dialysis Transplantation [online]. roč. 25, č. 9 [cit. 2013-03-10]. ISSN 0931-0509. Dostupné z: http://ndt.oxfordjournals.org/cgi/doi/10.1093/ndt/gfq123. 42. WU, Cho-Kai, MD, Jou-Wei Lin, MD, James L. Caffrey. Journal of the American College of Cardiology: Cystatin C and Long-Term Mortality Among Subjects With Normal Creatinine-Based Estimated Glomerular Filtration Rates [online]. s. 19301936 [cit. 2013-02-11]. ISBN 0735-1097. 43. TASKAPAN, Hulya, Pliakogiannis THEODOROS, Paul TAM, Joanne BARGMAN a Dimitrios OREOPOULOS. Glomerular filtration rate (GFR) estimated from serum creatinine predicts total (urine and peritoneal) creatinine clearance in patients on peritoneal dialysis. International Urology and Nephrology [online]. roč. 42, č. 4, s. 1085-1092 [cit. 2013-03-10]. ISSN 0301-1623. DOI: 10.1007/s11255-010-9715-x. Dostupné z: http://link.springer.com/10.1007/s11255-010-9715-x.
48
Bakalářská práce 44. BAXMANN, A. C., M. S. AHMED, N. C. MARQUES, V. B. MENON, A. B. PEREIRA, G. M. KIRSZTAJN and I. P. HEILBERG. Influence of Muscle Mass and Physical Activity on Serum and Urinary Creatinine and Serum Cystatin C. Clinical Journal of the American Society of Nephrology [online]. roč. 3, č. 2, s. 348-354 [cit. 2013-03-10].
ISSN
1555-9041.
DOI:
10.2215/CJN.02870707.
Dostupné
z:
http://cjasn.asnjournals.org/cgi/doi/10.2215/CJN.02870707. 45. WAIKAR, Sushrut S, Venkata S SABBISETTI, Joseph V BONVENTRE, V. B. MENON, A. B. PEREIRA, G. M. KIRSZTAJN a I. P. HEILBERG. Normalization of urinary biomarkers to creatinine during changes in glomerular filtration rate. Kidney International [online]. roč. 78, č. 5, s. 486-494 [cit. 2013-04-20]. ISSN 0085-2538. DOI:
10.1038/ki.2010.165.
Dostupné
z:
http://www.nature.com/doifinder/10.1038/ki.2010.165. 46. LIPCSEY, M., Mia FUREBRING, Sten RUBERTSSON, Anders LARSSON, A. B. PEREIRA, G. M. KIRSZTAJN, I. P. HEILBERG a M. LIPCSEY. Significant differences when using creatinine, modification of diet in renal disease, or cystatin C for estimating glomerular filtration rate in ICU patients. Upsala Journal of Medical Sciences [online]. roč. 116, č. 1, s. 39-46 [cit. 2013-03-15]. ISSN 0300-9734. DOI: 10.3109/03009734.2010.526724.
Dostupné
z:
http://informahealthcare.com/doi/abs/10.3109/03009734.2010.526724. 47. ZABAIRI, A. M. a A. HUSASIN. Original article: The glomerular filtration rate: comparison of various predictive equations based on serum creatinine with conventional creatinine clearance test in Pakistani population. 2008, roč. 58, č. 4, s. 182-185. Dostupné z: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18655426. 48. GOLDSTEIN, Stuart L. Urinary kidney injury biomarkers and urine creatinine normalization: a false premise or not?. DOI: 10.1038/ki.2010.200. Dostupné z: http://www.nature.com/doifinder/10.1038/ki.2010.200.
49
