Diplomová práce
UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE
FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biologických a lékařských věd
DIPLOMOVÁ PRÁCE
MDOC a jeho vliv na iniciaci aterogenního procesu u experimentálních modelů aterosklerózy.
MDOC and its effects on the initiation of atherogenic process in experimental models of atherosclerosis.
Hradec Králové, 2007
Lukáš Pachman
1
Diplomová práce
Poděkování Dovoluji si poděkovat PharmDr. Petru Nachtigalovi, Ph.D. za odborné vedení diplomové práce a poskytnuté rady. Dále bych chtěl poděkovat Mgr. Nadě Pospíšilové za veškeré konzultace při práci v laboratoři.
2
Diplomová práce OBSAH 1.
ÚVOD ............................................................................................................................................. 4
2.
TEORETICKÁ ČÁST .................................................................................................................. 6 2.1.
ATEROSKLERÓZA ................................................................................................................... 7
2.1.1.
Historie a současný pohled na vznik choroby ................................................................... 8
2.1.2.
Patogeneze aterosklerózy .................................................................................................. 8
2.1.3.
Rizikové faktory aterosklerózy ........................................................................................ 13
2.1.3.1.
Neovlivnitelné faktory ............................................................................................................. 13
2.1.3.2.
Ovlivnitelné faktory ................................................................................................................. 14
2.1.4.
Endoteliální dysfunkce .................................................................................................... 17
2.1.5.
Buněčné adhezivní molekuly ........................................................................................... 17
2.1.5.1.
2.2.
Imunoglobuliny........................................................................................................................ 17
VLÁKNINA ............................................................................................................................ 18
2.2.1.
Klasifikace vlákniny ........................................................................................................ 19
2.2.1.1.
Rozpustná vláknina .................................................................................................................. 19
2.2.1.2.
Význam vlákniny ..................................................................................................................... 20
2.2.2. 2.3.
MDOC – „oxidovaná celulóza“...................................................................................... 21 MYŠÍ MODELY ...................................................................................................................... 22
3.
CÍL PRÁCE ................................................................................................................................. 24
4.
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ...................................................................................................... 26 4.1.
ZVÍŘATA A PŘEDEPSANÁ DIETA ............................................................................................ 27
4.2.
BIOCHEMICKÁ ANALÝZA ...................................................................................................... 27
4.3.
IMUNOHISTOCHEMIE............................................................................................................. 27
4.3.1. 4.4. 5.
Kvantitativní analýza imunohistochemie a velikost lézí .................................................. 29 STATISTICKÁ ANALÝZA ........................................................................................................ 30
VÝSLEDKY................................................................................................................................. 31 5.1.
BIOCHEMICKÁ ANALÝZA ...................................................................................................... 32
5.2.
IMUNOHISTOCHEMIE............................................................................................................. 33
5.2.1.
Imunohistochemické barvení VCAM-1 v oblasti aortálního sinu .................................... 33
5.2.2.
Stereologická analýza exprese VCAM-1 u ApoE deficientních myší .............................. 34
6.
DISKUZE ..................................................................................................................................... 35
7.
ZÁVĚR ......................................................................................................................................... 39
8.
ABSTRAKT ................................................................................................................................. 41
9.
LITERATURA ............................................................................................................................ 45
3
Diplomová práce
1. Úvod
4
Diplomová práce Ateroskleróza patří mezi kardiovaskulární onemocnění, které tvoří v posledních letech nejčastější příčinu morbidity a mortality ve všech ekonomicky vyspělých zemích Evropy a USA. Více než 50% všech úmrtí jsou dány aterosklerotickými komplikacemi, jakými jsou různé ischemické kardiomyopatie a mozkové cévní příhody. Stav vysoké úmrtnosti na kardiovaskulární choroby u nás není dán nedostatečnými znalostmi o ateroskleróze, nýbrž je spíše zaviněn nedůkladnou zdravotní výchovou obyvatelstva, nesprávným životním stylem, především dietetickými návyky a nedostatečnou pohybovou aktivitou. Nejméně nákladným bojem s touto nemocí by byla primární prevence, která by dbala na zdravý životní styl každého jedince. Bohužel v této „uspěchané“ době, kdy se zvyšuje náročnost životního stylu v moderní společnosti, je primární prevence nedostačující. Je to dáno také tím, že ateroskleróza se vyvíjí dlouho nepozorovaně bez varovných příznaků, proto chybí i základní motivační činitel, který by působil na obyvatelstvo, aby o své zdraví více dbalo. Cílem této diplomové práce bylo zjistit potencionální hypolipidemické a protizánětlivé účinky MDOC. Jako model byly použity apoE deficientní myši, kterým byla podávána aterogenní dieta. Byly sledovány hladiny lipidů a sérové koncentrace zánětlivých markerů v krvi. Pro zobrazení exprese VCAM-1 byly využity imunohistochemické metody a ke kvantifikaci jeho exprese stereologické metody a endoteliální exprese VCAM-1.
5
Diplomová práce
2. Teoretická část
6
Diplomová práce
2.1. Ateroskleróza Ateroskleróza je pomalu postupující zánětlivé onemocnění tepen. Je charakterizována podle WHO jako variabilní kombinace změn intimy artérií spojená s ukládáním lipidů (cholesterolu), polysacharidů a krevních elementů. V dalším vývoji tvorbou fibrózní tkáně provázenou ukládáním vápenatých sloučenin se změnami v medii artérií.(1) Nejčastějšími lokalizacemi aterosklerotických lézí jsou arteria carotis communis dextra et sinistra, oblast arcus aortae (především oblasti hlavních odstupů), arteriae coronarie, aorta thoracica, aorta abdominalis (oblast odstupů viscerálních větví), arteriae renales, arteriae iliacae a arteriae femorales.(2) Místa výskytu aterosklerózy nejsou náhodná. Lokalizace vzniku aterosklerotického plátu je silně determinována především různými vlastnostmi v jednotlivých místech cévního řečiště.(3) Obrázek 1. Predispoziční místa výskytu aterosklerotických lézí podle De Bakey et al.(4)
7
Diplomová práce
2.1.1.
Historie a současný pohled na vznik choroby
V 19. století patolog Wirchow dal vzniknout infiltrační teorii aterosklerózy, která předpokládala lipidovou infiltraci skrz endotel jako iniciační faktor vzniku aterosklerotického plátu. Ve druhé polovině 20. století byla vyslovena teorie mechanického poškození endotelu, podle které léze endotelových buněk s následným odkrytím subendotelového vaziva způsobí aktivaci krevních destiček a jejich nasednutí na poškozenou část cévní stěny. Aktivované destičky produkují řadu působků, z nichž především plateled derived growth factor (PDGF) byl pokládán za spouštěcí faktor. Tato teorie byla nakonec vyvrácena, protože nikdy nebyl prokázán defekt integrity endotelu na počátku vývoje léze. Destičky hrají roli spíše při komplikacích již vytvořené aterosklerózy a ne v jejích počátečních stádiích.(5) Díky intenzivním výzkumům v posledních letech se jednotlivé pohledy jednomyslně sjednotili v teorii zánětlivé choroby. Prvním nejrozšířenějším signálem vedoucím ke vzniku endoteliální dysfunkce jsou lipoproteiny, které z různých důvodů, nejčastěji kvůli zvýšení jejich koncentrací v krvi, vstupují ve zvýšené míře do subendotelu. Zde mají tendenci vázat se na složky extracelulární matrix a vlivem prodloužené doby jejich výskytu v tomto místě se oxidují.(6) Oxidované či jinak změněné lipoproteiny, především pak LDL, jsou velmi silným podnětem pro aktivaci endotelových buněk. Tyto oxidované LDL se váží na „scavenger“ receptory na endotelové buňce a vedou k její aktivaci přes signalizační molekuly a cesty, které nejsou ještě přesně známy. Aktivace se projevuje zvýšenou expresí adhezivních molekul na povrchu endotelu, produkcí cytokinů a chemokinů – stav usnadňující vychytání cirkulujících krevních buněk, především monocytů a lymfocytů. Endotel na počátku vývoje aterosklerózy se tedy nachází ve stavu zánětlivé aktivace, který podporuje vychytávání cirkulujících monocytů a lymfocytů. Ateroskleróza je tudíž chronické zánětlivé onemocnění velkých artérií s intimální lokalizací.(7)
2.1.2.
Patogeneze aterosklerózy
Ateroskleróza, jak již bylo několikrát řečeno, je systémové onemocnění postihující cévy tepenného řečiště (velké a střední); z klinického hlediska mají největší význam léze srdečních věnčitých tepen, extrakraniálních tepen zásobujících mozek, eventuálně dalších
8
Diplomová práce orgánů (ledviny). Na patogenezi aterosklerózy se podílí komplex po sobě jdoucích událostí, zahrnujících rozvoj chronického zánětlivého
procesu stěny artérií jako odpověď
na hemodynamické poškozování cévní stěny v nejvíce namáhaných místech, jejíž příčina nebyla odstraněna a proces nebyl neutralizován. To způsobuje nejprve dysfunkci cévního endotelu s tvorbou cytokinů, adhezivních molekul a růstových faktorů. Aktivované endotelové buňky přitahují do místa léze monocyty/makrofágy a Tlymfocyty z krevní cirkulace, buňky hladké svaloviny z medie, subendotelový prostor se postupně zvětšuje a současné zvýšení permeability endotelové výstelky umožňuje pronikání lipoproteinových částic do tohoto prostoru. Dochází v nich k lipoperoxidaci působením reaktivních forem kyslíku a dusíku, které nebyly zneškodněny antioxidačním mechanismem. Uvolněný cholesterol je pohlcován makrofágy za vzniku pěnových buněk; stěna cévy se v místě poškození ztlušťuje (migrací a proliferací buněk hladké svaloviny, tvorbou extracelulární matrix, nekrotickými depozity z rozpadlých pěnových buněk), a dostává prokoagulační vlastnosti. Celý proces vyúsťuje do tvorby aterómu (aterómového plátu). Klinické příznaky se projeví, až když se pokročilé léze cévní stěny komplikují rupturou obalu ateromového plátu, krvácením do plátu, vznikem trombózy nebo embolu.(2) Obrázek 2. Schéma ztlušťování artérie v průběhu aterogeneze (převzato z internetových stránek: http://www.zdravcentra.sk/index.php?act=k-10&did=408)
9
Diplomová práce Příčiny endotelové dysfunkce vedoucí k ateroskleróze zahrnují hemodynamickou zátěž, zvýšení a modifikaci LDL-částic, tvorbu reaktivních forem kyslíku a dusíku, zvýšený arteriální tlak, diabetes mellitus, genové alterace kódující progresi zánětlivé a reparační odpovědi, zvýšenou hladinu homocysteinu a také přítomnost infekčních agens jako jsou herpetické viry, cytomegalovirus, virus Epsteina a Barrové, Hemophilus influezae, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae nebo Helicobacter pylori. Dysfunkce endotelu, způsobená těmito vlivy, vede ke kompenzační odpovědi, která mění normální homeostatické vlastnosti cévního endotelu. Zvyšuje se adhezivita endotelových buněk vzhledem k leukocytům nebo krevním destičkám, roste permeabilita cévní stěny, endotelie získávají prokoagulační vlastnosti namísto antikoagulačních a zvyšuje se produkce vazoaktivních molekul, cytokinů, chemokinů i růstových faktorů.(8) Obrázek 3. Schéma počáteční fáze dysfunkce endotelu (převzato z internetových stránek: http://www.zdravcentra.sk/index.php?act=k-10&did=408)
Když tato zánětlivá odpověď nedokáže vyvolávající příčiny odstranit a není-li účinně neutralizována nebo potlačena obrannými mechanismy, postupuje ve svých účincích dále. Migrace a proliferace buněk hladké svaloviny pokračuje; myocyty pronikají do oblastí zánětu, dochází k jejich aktivaci, tvorbě extracelulární matrix. Dochází k nakupení makrofágů a Tlymfocytů v subendotelovém prostoru ve stěně cévy, která se takto ztlušťuje. Toto ztluštění je nejprve kompenzováno dilatací a lumen cévy zůstává zpočátku nezměněno (fenomén 10
Diplomová práce remodelace).(9) Pokračující zánět zvyšuje počet makrofágů a lymfocytů, které se sem dostávají z krevního oběhu nebo vznikají na místě léze proliferací. Makrofágy fagocytují oxidovavané LDL-částice, které pronikly do intimy a vznikají z nich pěnové buňky. Aktivace makrofágů a T-lymfocytů
vede
k
dalšímu uvolňování
cytokinů,
chemokinů
(monocytový
chemoatraktant-protein 1 = MCP-1), hydrolytických enzymů a růstových faktorů, které navozují další poškození, eventuálně způsobují ložiskovou nekrózu. A tak postupující akumulace monocytů/makrofágů, migrace a proliferace buněk hladké svaloviny a tvorba fibrózní tkáně vede k dalšímu rozšiřování a restrukturalizaci léze, která se pokrývá vazivovou čepičkou, zakrývající lipidové jádro s nekrotickými hmotami (aterómový plát). To je stádium pokročilé komplikující léze arteriální stěny.(10) Od určité doby arterie nemůže kompenzovat lézi pronikající do lumen cévy dilatací, které se zmenšuje, což vede ke snížení průtoku cirkulující krve. Na zhrubnělém povrchu léze (ateromového plátu) adherují trombocyty. Jejich aktivací se uvolňují granula obsahující cytokiny a růstové faktory, které spolu s trombinem přispívají k další migraci a proliferaci buněk hladké svaloviny a monocytů. Aktivací destiček také vzniká arachidonová kyselina, která se přeměňuje (působením cyklooxygenázy 1) na prostaglandiny jako je tromboxan A 2 , který je velice potentním vazokonstriktorem a látkou agregující trombocyty; z arachidonové kyseliny také vznikají (působením lipooxygenázy) leukotrieny, amplifikující zánětlivou reakci.(11) Pokud fibrózní čepička pokrývající aterómový plát zůstává dostatečně tlustá, nehrozí takové nebezpečí z obturace lumen artérie. Jakmile však dojde k jejímu ztenčování působením metaloproteináz (kolagenáz, elastáz, stromelyzínu) uvolňovaných z makrofágů po aktivaci Tlymfocyty, vzniká tak stádium nestabilního plátu, kdy hrozí ruptura plátu, průnik krve do jeho nitra a vznik obturujícího trombu. Uzávěr lumen cévy vede k akutní hypoxii, se všemi jejími důsledky pro zásobenou tkáň.(12)
11
Diplomová práce Obrázek 4. Schéma aterómového plátu (převzato z internetových stránek: http://www.zdravcentra.sk/index.php?act=k-10&did=408)
Obrázek 5. Schéma mechanismu rozvoje aterogeneze (převzato z internetových stránek: http://www.zdravcentra.sk/index.php?act=k-10&did=408)
12
Diplomová práce
2.1.3.
Rizikové faktory aterosklerózy
2.1.3.1.
Neovlivnitelné faktory
Věk „Člověk je tak mladý jako jeho cévy.“ Profesor Gotthard Schettler (†1996), Univerzita Heidelberg, SRN Každý člověk stárne, někdo rychleji, někdo pomaleji, ale s ním rovněž stárnou i jeho cévy. Projevuje se zde nejen fyziologické opotřebení, ale i snížená funkce reparativních procesů. Tím, že se lidská populace dnes dožívá poměrně vysokého věku, tím se také setkáváme jako zdravotníci se „staršími“ cévami. Snižují se endoteliální funkce a objevuje se ateroskleróza, což se pak projevuje zvýšeným výskytem ischemickým chorob hlavně u lidí mezi 65. a 85. rokem. Riziko mozkového apoplexu je u 85letého člověka 1000krát vyšší než u 45letého.(13)
Pohlaví Riziko aterosklerózy se prudce zvyšuje o mužů nad 45 let a u žen nad 55 let. Přitom do 60. roku věku jsou muži postiženi častěji než ženy. Po 60. roku se riziko u obou pohlaví vyrovnává a ženy začnou muže rychle dohánět, až je dokonce předeženou, takže po 75. roce je incidence koronární aterosklerózy vyšší než u stejně starých mužů! Důvodem pro tyto rozdíly specifické pro pohlaví je ženský pohlavní hormon, který ženám poskytuje přirozenou „ochranu“, tzn., že snižuje hladinu LDL a zvyšuje hladinu HDL. Ta je po přechodu stále nižší – s poklesem produkce estrogenu stoupá onemocnění žen dvakrát až třikrát. U žen kuřaček nastává pokles estrogenu přibližně o dva roky dříve a současně se v důsledku rizikového faktoru kouření zvyšuje riziko vzniku aterosklerózy.(2) Dědičnost Lidé, jejichž rodiče trpěli aterosklerózou, hypertenzí, rodinnou hypercholesterolemií nebo jinými kardiovaskulárními chorobami, mají výrazně vyšší riziko výskytu některé z těchto chorob. Potomek je pro nemoc predisponován - může ji, ale nemusí dostat. Jedna americká studie prokázala, že riziko mozkové mrtvice u mužů, jejichž matka zemřela na mozkovou mrtvici, se trojnásobně zvýšilo.(14)
13
Diplomová práce
2.1.3.2.
Ovlivnitelné faktory
Výživové faktory Cholesterol v krvi Určitá hladina cholesterolu je pro tělo zcela nezbytná, protože cholesterol je důležitou součástí membrán, je základní substancí pro hormony nadledvin, pohlavní hormony a je základní substancí pro žlučové kyseliny. Koncentruje se v nadledvinách, v mozku, v kožním tuku a ve slezině, vaječnících, v krevním séru a červených krvinkách. Ovšem toto potřebné množství si je schopné tělo syntetizovat samo. Člověk přijímá cholesterol také exogenně s potravou (v ČR průměrně 460mg!!!). Tím klesá produkce endogenně syntetizovaného cholesterolu. Tento regulační mechanismus, udržující stabilní hladinu cholesterolu, je vázán jednou podmínkou: vlastní produkce cholesterolu a exogenní přísun musí být v určité rovnováze. Jestliže přísun z venku příliš stoupne (nad 300mg/den), je možné část cholesterolu ještě odbourat v játrech, ale později dojde k poškození jaterních receptorů. Dojde ke zvyšování
cholesterolu
v krvi
a
k poruše
cholesterolové
výměny
a
nakonec
k hypercholesterolémii. Cholesterol je tedy škodlivý, pouze když je ho mnoho. Celkový cholesterol má hraniční hodnoty koncentrace v krvi 200–239 mg/dL, přičemž hodnota 200 mg/dL je hraniční mezi „normálním“ a „zvýšeným“ cholesterolem. Tato hodnota udává informace o celkovém cholesterolu a triacylglycerolech. Pokud ovšem udáváme hladinu v jiných jednotkách a to v mmol/l, musíme rozlišovat mezi údaji o cholesterolu a triacylglycerolech. Přepočet je 200mg/dL=5,2 mmol/l u cholesterolu a pro triacylglyceroly je to 200mg/dL=2,28mmol/l. Hladina LDL by se měla u dospělého člověka pohybovat v rozmezí 130–159 mg/dL. Závisí také na tom, jestli pacient vykazuje ještě některé další rizikové faktory. Velmi důležité je znát kromě hodnoty celkového cholesterolu také poměr mezi množstvím LDL a HDL. Hodnota HDL by měla být vyšší než 35 mg/dL. Hodnoty HDL se snižují také při kouření cigaret, nadváze, poruchách štítné žlázy a při zvýšených hodnotách triacylglycerolů.(15) Triacylglyceroly v krvi Triacylglyceroly (Tg) slouží buňkám těla jako zásobník energie, ochrana orgánů a tepelná izolace. Nadbytek Tg se ukládá do tukové tkáně jako deponovaný tuk. Stejně jako cholesterol si může tělo Tg vyrábět samo (v tukové tkáni nebo v játrech, také syntézou
14
Diplomová práce ze sacharidů). Mnoho Tg ale přichází společně s potravou. V krvi jsou Tg vázány hlavně na VLDL a vzniká tak jejich transportní forma. Krevní hladina Tg je optimální kolem 200 mg/dL. Hlavními rizikovými faktory pro příliš vysokou hladinu Tg jsou cukry a alkohol. Dodávají do těla příliš mnoho kalorií (1 gram alkoholu dodá 7,2 kcal). Alkohol je také velmi rychle přeměňován na tuk a zpomaluje odbourávání tuku a cholesterolu v játrech.(15) Cukry a diabetes mellitus Trvale vysoké hodnoty krevního cukru (nalačno nad 120mg/dL a po jídle nad 200mg/dL) poškozují v krátké době cévní stěny, usnadňují pronikání cholesterolu do buněk a příznivě ovlivňují proces aterosklerózy s těžkými následky. U diabetiků je také jiné složení lipoproteinů než u zdravých lidí. Vyskytují se u nich ve zvýšené míře malé aterosklerózu podporující částečky, takže zvýšení hodnot cholesterolu je u nich ještě větším rizikovým faktorem než u lidí netrpících cukrovkou. Diabetici umírají na infarkt třikrát častěji než nediabetici. Pokud není při cukrovce dobře vyregulován krevní cukr, stoupají hodnoty krevních tuků, cholesterolu a triacylglycerolů. Proto je diabetes značným rizikem aterosklerózy. Vysoké hodnoty krevního cukru podporují usazovaní cholesterolu ve velkých tepnách, které zásobují kyslíkem mozek a srdce. Ještě jednoznačnější je souvislost s onemocněním malých srdečních a mozkových artérií. Zde dochází k houstnutí spojovací tkáně, které nakonec končí uzavřením cévy.(16) Mezi osobami dlouhodobě nemocnými cukrovkou se také často vyskytuje hypertenze. U diabetiků typu 1 koreluje výskyt hypertenze s délkou onemocnění, u diabetiků typu 2 nikoliv. Redukce hmotnosti často vede nejen k úpravě diabetu, ale i hypertenze. Glukóza a produkty neenzymové glykace jsou výkonnými lapači radikálu NO. Glukóza tak může způsobit endoteliální dysfunkci a může se podílet na jejím dalším zhoršování.
Faktory mimo výživu Nedostatek pohybové aktivity – nadváha a obezita Lidé, kteří jsou pravidelně fyzicky aktivní, mají jen poloviční riziko výskytu cévních onemocnění. Vytrvalostní fyzická aktivita nejen snižuje hladinu LDL, triacylglyceroly a krevní tlak, ale i zvyšuje HDL. Výsledkem je zřetelné snížení rizika aterosklerózy.
15
Diplomová práce Nadváha vzniká, jakmile člověk přijímá více energie, než spotřebuje. Potřeba výživných látek závisí na fyzické aktivitě, věku a pohlaví. Ženy obecně potřebují o něco menší příjem než muži a starší lidé podstatně méně než mladí. Obezita je spojena s řadou metabolických poruch, jako jsou dyslipidémie, inzulinorezistence, endoteliální dysfunkce a další. Metabolické abnormality, které provázejí obezitu, jsou známými rizikovými faktory závažných organických (aterosklerotických) změn.(13) Hypertenze Tak zvaná primární neboli esenciální hypertenze (hypertenze z neznámých příčin) tvoří asi 95% všech případů. Trpí jí zhruba každý pátý dospělý občan. Vyšší hodnota krevního tlaku než je 140/90 mmHg výrazně zatěžuje srdce a poškozuje endotel cévy. Hodnota nad 160/95 mmHg je již hodnocena jako vysoký krevní tlak. Kouření Asi čtvrtina všech onemocnění cév je způsobena kouřením. Při kouření cigaret se uvolňují volné radikály, které napadají částečky LDL, vzniká tak oxidační stres, který urychluje rozvoj aterosklerózy. Kouření také podporuje proces stárnutí, což platí hlavně u žen, ty také přicházejí o dva roky dříve do přechodu. Kouření zužuje malé arterie v mozku, takže tlumí jeho zásobení krví. Kombinace kouření a vysokého krevního tlaku vede v souladu s tím ke značnému zvýšení rizika mozkové mrtvice. Je také prokázáno, že kouření zesiluje sklon krevních destiček ke shlukování a nepříznivě ovlivňuje složení krevních tuků, navíc podporuje vývoj aterosklerotických usazenin na velkých arteriích, které zásobují mozek. Následkem kouření je také vzestup krevního cholesterolu. Poměr mezi HDL a LDL cholesterolem je nižší než u nekuřáků.(17)
16
Diplomová práce
2.1.4.
Endoteliální dysfunkce
Endotel je jednovrstevný plošný epitel, který vystýlá lumen cév a odděluje tak krevní elementy od extravaskulární tkáně. Endotel se významě podílí na regulaci cévní permeability, regulaci cévního tonu, uplatňuje se v hemostáze a fibrinolýze, ovlivňuje strukturu cévní stěny a podílí se na interakci s buňkami krve.(18) Endoteliální dysfunkcí rozumíme lokalizované či generalizované postižení endotelu charakterizované zvýšením propustnosti cévní stěny a vznikem nerovnováhy mezi faktory vazorelaxačními a vazokonstrikčními, prokoagulačními a antikoagulačními, růst stimulujícími a růst inhibujícími. Výsledkem je proaterogenní účinek s převahou vazokonstrikčních, protrombotických a proliferačních pochodů se zvýšenou expresí zánětlivých markerů a adhezivních molekul. Rizikové faktory kardiovaskulárních onemocnění uvedené výše, vedou ke vzniku endoteliální dysfunkce.(19)
2.1.5.
Buněčné adhezivní molekuly
Adhezivní molekuly jsou látky proteinového charakteru, které jsou exprimované na povrchu všech tkání organismu. Nepůsobí pouze jako pasivní lepidlo, ale účastní se také přenosu signálu mezi buňkami a podílí se tak na interakci buněk s okolním prostředím. Adhezivní molekuly se účastní řady fyziologických dějů, jako jsou buněčný růst a diferenciace, embryogeneze, hojení ran a obnova tkání. Uplatňují se také při patologických procesech, kde se podílejí na interakcích mezi složkami imunitního systému.(20) Dělí se do čtyř základních skupin. A to na selektiny, integriny, imunoglobuliny a kadheriny.
2.1.5.1.
Imunoglobuliny
Tato skupina tvoří rozsáhlou rodinu povrchových buněčných molekul, která představuje 50% všech povrchových molekul leukocytů. Jde o látky glykoproteinového charakteru tvořené opakujícími se Ig doménami z beta řetězců. Zprostředkovávají jak homofilní (vazba adhezivní molekuly jedné buňky na stejnou molekulu druhé buňky), tak heterofilní interakce (vazba adhezivní molekuly jedné buňky na neidentickou molekulu druhé buňky).(21)
17
Diplomová práce Patří sem celá řada adhezivních molekul. Antigenně specifické receptory T a B lymfocytů TCR, BCR, koreceptory T - lymfocytů CD4 a CD8. Z hlediska aterosklerózy jsou nejvýznamnějšími zástupci VCAM-1 (vascular cell
adhesion molekule-1), ICAM-1
(intercellular cell adhesion molekule-1), PECAM-1 (platelet cell adhesion molekule-1).
VCAM – 1 Struktura: Transmembránový
glykoprotein
obsahující
N-konec,
sérii
Ig
domén,
transmembránovou oblast a cytoplazmatický konec. VCAM-1 má 7 extracelulárních domén, přičemž domény 1 a 4 jsou speifická vazebná místa místá pro vazbu α4β1-integrinu (VLA-4). Tento integrin exprimuje většina lekocytů. Funkce: Vytváří pevnou vazbu mezi leukocyty (exprese VLA-4 integrinu) a endoteliálními buňkami.(22) Exprese: VCAM-1 je exprimován endoteliálními buňkami, makrofágy a hladkosvalovými buňkami. U malých aterosklerotických lézí je VCAM-1 exprimován především endoteliálními buňkami, ale také buňkami hladkosvalovými, které přiléhají k aterosklerotické lézi. U pokročilejších aterosklerotických lézí je VCAM-1 exprimován již většinou buněk v intimě cév. VCAM-1 je tedy exprimován především v oblastech výskytu lézí. Na normálních endotelových buňkách je jen málo nebo není vůbec exprimován. Na zvýšenou expresi má vliv řada faktorů - diabetes mellitus, kouření, hypercholesterolémie, hyperhomocysteinémie, hemodynmický stres, TNFα a IL-1.(23)
2.2. Vláknina Vlákninou rozumíme nestravitelné zbytky rostlinného původu. Tvoří ji heterogenní směs látek různého chemického složení a biologických účinků. Pod pojem „dietní vláknina“ dnes zařazujeme nestravitelná rezidua rostlinného původu v lidské dietě a nejsou to výhradně jen složky rostlinných buněk. Definice dietní vlákniny podle Americké asociace chemiků cereálií (AACC-American Association of Cereal Chemists), přijatá v roce 2001: „Dietní vláknina je tvořena poživatelnou částí rostlinných nebo obdobných sacharidů, které jsou rezistentní trávení a absorpci v lidském tenkém střevě s kompletní nebo částečnou fermentací v tlustém střevě.“
18
Diplomová práce Dietní vláknina zahrnuje polysacharidy, oligosacharidy, lignin a ostatní podobné rostlinné substance. Ovlivňuje fyziologické děje svým prokinetickým účinkem a vyvolává pozitivní změny hladin krevního cholesterolu a glukózy.(24)
2.2.1.
Klasifikace vlákniny
Vláknina se dělí na vlákninu nerozpustnou ve vodě (IDF – insoluble dietary fibre, též tzv. hrubá vláknina). Patří sem lignin, celulóza a určitý podíl hemicelulóz. A vlákninu ve vodě rozpustnou (SDF – soluble dietary fibre, též tzv. měkká vláknina), což jsou pektiny, gumy, slizy, hemicelulózy – arabinoxylany obilovin, β-glukany ječmene, glukomannany a galaktomannany luštěnin.(25) Obrázek 6. Dělení dietní vlákniny
2.2.1.1.
Rozpustná vláknina
Absorbuje vodu, čímž „změkčuje“ stolici a udržuje obsah střev v pohybu. Také na sebe váže toxické látky a tím dochází k jejich omezenému kontaktu se sliznicí. Mírně snižuje kyselost žaludečního obsahu a zpomaluje jeho vyprazdňování. Naopak zvyšuje viskozitu náplně žaludku a střev, tudíž zpomaluje promíchávaní tohoto obsahu. Omezuje přístup pankreatických amyláz a lipáz k substrátům. Zpomalí
19
se tak průchod střevního
Diplomová práce obsahu a sníží se difúze živin, váží se minerální látky (zejména ionty Ca2+, Fe2+, Cu2+, Zn2+) a tím se modifikuje jejich dostupnost. Podmínkou je však dostatečný příjem tekutin. Část vázaných kationtů se uvolní při fermentaci v tlustém střevě. Rozpustná vláknina také ovlivňuje příznivě mikroflóru ve střevě.(14) Účinek na metabolizmus glukózy a na hladinu cholesterolu Pektiny se nacházejí v pletivech vyšších rostlin a jsou složkami všech druhů ovoce a zeleniny. Více pektinu se nachází v jablkách, rybízu, angreštu, rajčatech, mrkvi a cukrové řepě, méně v třešních, višních, bezinkách, borůvkách. Základní struktura je tvořena lineárním řetězcem D-galakturonové kyseliny, jejíž jednotky jsou do různého stupně (průměrně 70%) esterifikovány methanolem. Jejich obsah v ovocné dužnině je okolo 1%. Pro nerozpustné nativní pektiny buněčných stěn asociovaných s celulózou se používá název protopektiny. Enzymovou hydrolýzou komplexem enzymů zvaných protopektináza se přeměňují na rozpustné nízkomolekulární pektinové látky. Pektin ovlivňuje metabolismus glukózy a snižuje množství cholesterolu v krvi. Účinnější je pektin s vyšším obsahem methoxylových skupin (hrozny, broskve). Nerozpustné pektinové látky jsou příčinou tvrdosti a pevnosti nezralého ovoce a zeleniny.(26)
2.2.1.2.
Význam vlákniny
Dietní vláknina, která dosáhne tlustého střeva, podléhá fermentaci bakteriální flórou za vzniku krátkých mastných kyselin (SCFA – short chain fatty acids) – kyseliny octové 62% , propionové 25%, máselné 16% a za tvorby CO 2 , H 2 a CH 4 . Bakteriálním kvašením tak může být metabolizováno až 75% dietní vlákniny, která prochází tlustým střevem.(27) Kyselina propiónová má inhibiční účinek na jaterní 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreduktázu, klíčový enzym při syntéze cholesterolu. Přídavkem vlákniny ke stravě v experimentu na zvířatech bylo prokázáno snížení aktivity tohoto enzymu. Kvašením pektinu dochází k nejvyšší produkci mastných kyselin s krátkými řetězci.(28) Z metabolických a nutričních poruch se nedostatek vlákniny podílí na vzniku obezity, rozvoji diabetu typu 2 a hyperlipidémii. Největší účinek na snížení plazmatického cholesterolu má rozpustná vláknina (např. pektin, guarová guma). Tento pozitivní vliv je vysvětlován vychytáváním žlučových kyselin a jejich vylučováním stolicí, čímž dochází ke zvýšené tvorbě žlučových kyselin z cholesterolu v játrech a k poklesu celkových zásob cholesterolu v organismu. Vláknina mechanismem vazby žlučových kyselin přerušuje jejich
20
Diplomová práce enterohepatální cyklus a vede k mírnému poklesu cholesterolémie a ke snížení absorbce tuků z potravy.(29) Dietní vláknina také působí na metabolismus sacharidů, přičemž se uplatní vliv vlákniny zpomalením pasáže potravy, inaktivací amylázy a ovlivněním výdeje hormonů GIT. Pektin brzdí absorpci sacharidů z tlustého střeva do krve, čímž upravuje kolísání krevního cukru. Vláknina redukuje sekreci inzulínu tím, že zpomaluje střevní absorpci cukrů. Studie naznačují, že při dietě s vysokým obsahem vlákniny se zvyšuje senzitivita na inzulín. Podle výsledků studie CARDIA (The Coronary Artery Risk Development in Young Adult) lze konstatovat, že dostatečný příjem vlákniny snižuje riziko kardiovaskulárních chorob významněji než změny v množství a druhů lipidů přijímaných v potravě.(30)
2.2.2.
MDOC – „oxidovaná celulóza“
Celulóza je polyanhydroglukóza, tvořená jednotkami β -D-glukopyrynózy vázaných vazbou β-1,4 v přímé řetězce. Jemně rozptýlený, bílý nebo krémově bílý až mírně nažloutlý prášek se slabým zápachem po spálení.(31) Základem oxidované celulózy je anhydroglukuronová kyselina, která vzniká oxidací primární hydroxylové skupiny vázané na 6. uhlíku β-D-glukopyranózy. Oxidovaná celulóza může být popsána jako náhodný (statistický) kopolymer, který se skládá s anhydroglukózy a kyseliny anhydroglukuronové obecného vzorce, kde n značí stupeň polymerace, x průměrný stupeň oxidace celulózy <0,1>: [(C 6 H 10 O 5 ) 1-x (C 6 H 8 O 6 ) x ] n Když x=0 jedná se o čistou celulózu, x=1 jedná se o plně oxidovanou celulózu. X=0,5 poměr oxidované k čisté celulóze je 1:1 a můžeme ji označit vzorcem:
CH2OH O
OH O
OH
*
OH O
O OH
O
*
COOH
n
21
Diplomová práce Oxidovaná celulóza, sodnovápenatá sůl, je nerozpustná v běžných organických rozpouštědlech a ve zředěných minerálních kyselinách. Je částečně rozpustná ve vodě, rozsah rozpustnosti záleží na stupni polymerizace. Je rozpustná ve zředěných roztocích alkalických hydroxidů a v některých speciálních rozpouštědlech známých jako rozpouštědla celulózy (jako je například Schweizerovo činidlo, roztok amoniakálního oxidu mědi).(32)
2.3. Myší modely Myši jsou velmi rozšířeným modelem ke studiu aterosklerózy. Normální myši „wild type“ nevyvíjejí léze spontánně. Pokud jsou některé jejich kmeny krmeny dietou obohacenou o žlučové kyseliny a cholesterol, dochází u nich k vývoji atypických aterosklerotických lézí typu tukových proužků. Nadměrným podáváním žlučových kyselin trpí myši chronickým zánětem. Toto není moc srovnatelné s lidskou situací, což tento model v používání vylučuje.(33) Dnes se využívají především různě geneticky upravené kmeny, které vyvíjejí léze buď spontánně (apoE KO myši vyšlechtěné a popsané v roce 1992), nebo po indukci tukovou dietou (LDL KO myši vyšlechtěné a popsané v roce 1993).(34) Kmen myší s cílenou inaktivací apoE, ligandu pro LDL receptor, vyvíjí spontánní hyperlipidémii
–
především
VLDL
typu
a
zvýšené
cholesterolové
hladiny
na nízkocholesterolové/nízkotučné dietě. Hladiny cholesterolu jsou 4 až 5krát vyšší oproti normálu. ApoE KO myši vyvíjejí léze všech fází s morfologickými charakteristikami blízce podobnými člověku na stejných místech cévního stromu. Kolem čtvrtého až pátého týdne věku se u ApoE KO myši na těchto k ateroskleróze predisponovaných místech nalézá zvýšená endoteliální exprese VCAM-1. Během šestého až osmého týdne věku se začínají objevovat léze typu tukových proužků.(35) LDL-receptor KO myši mají genetický defekt LDL receptoru, což je nejlépe zdokumentovaná příčina vývoje předčasné aterosklerózy u člověka. Pokud jsou tyto myši udržovány na normální dietě, vyvíjejí jen malé patologické změny a mají jen asi dvakrát zvýšené plasmatické hladiny cholesterolu.(36) Pokud jsou však krmeny aterogenní (tukovou/cholesterolovou) dietou, vykazují masivní zvýšení hladin palzmatického cholesterolu. Rychle u nich vznikají signifikantní tukové proužky s nekrotickým centrem naplněným lipidy. Fibrózní léze nevyvíjejí.
22
Diplomová práce Více poznatků o kinetice vývoje lézí je u apoE KO myší než u LDL R KO myší. Nicméně léze, které se vyvíjí u obou kmenů, jsou obecně stejné. Vývoj začíná v proximální aortě a rozšiřuje se směrem k aortě distální. Na bázi těchto dvou kmenů bylo vyvinuto a neustále se vyvíjí spousta dalších transgenních či knockout kmenů pro studium genetických závislostí, lipoproteinového metabolismu a vývoje aterosklerotické léze.(34) Myši mají rozdílnou distribuci cholesterolu do lipoproteinových tříd oproti člověku, což může být důvodem toho, že se u „wild type“ myší nevyvíjí ateroskleróza. Dále pak nemají cholesteryl ester transfer protein (CETP) a lipoprotein (a). Jako u ostatních hlodavců se spontanní ruptura plaku u apoE KO myší nevyskytuje. Pravděpodobně je to způsobeno nižším shear stresem působícím na arteriální stěnu a/nebo absencí rizikových faktorů (kouření, hypertenze, diabetes...) Avšak tato situace se studuje a vyvíjí se přesně definované postupy vedoucí ke vzniku nestabilních lézí a rupturám (nejčastěji v arteria brachiocephalica).(37)
23
Diplomová práce
3. Cíl práce
24
Diplomová práce Cílem této diplomové práce bylo ověřit potenciální hypolipidemické a protizánětlivé účinky MDOC na experimentalním zvířecím modelu, kterým byly apoE-deficientní myši. K tomu byly sledovány parametry lipidového spektra v krvi a exprese VCAM-1 v cévním endotelu.
K
hodnocení
morfologických
nálezů
a stereologické metody.
25
byly
použity imunohistochemické
Diplomová práce
4. Experimentální část
26
Diplomová práce
4.1. Zvířata a předepsaná dieta Samci myši kmene C57BL/6J s deficitem apolipoproteinu E (apoE-/-), vážící 15-20 gramů, byli laskavě poskytnuti Prof. Polednem (IKEM, Praha, Česká Republika) a ustájeni v SEMEDu (Praha, Česká Republika). Všechny myši byly v 5-ti týdnech života odstaveny od matky, náhodně rozděleny do 2 skupin. ApoE deficientní myši (n=8) byly krmeny po odstavení aterogenní dietou s obsahem 1,25% cholesterolu po dobu 4 týdnů (kontrolní skupina). V MDOC skupině byly myši krmeny stejnou aterogenní dietou, ke které bylo přidáváno 50 mg/kg MDOC denně. Každá z myší v MDOC skupině byla chována v samostatné kleci. Dostávaly denně 6 g potravy (ve speciálně upravených granulích) a měly volný přístup k vodě po celou dobu studie. Během experimentu nebyly nalezeny změny tělesné hmotnosti v souvislosti se spotřebou potravy. Na konci experimentu byla zvířata přes noc vylačněna a byla provedena euthanasie předávkováním v parách éteru. Zvířatům byly odebrány ze srdce vzorky krve pro biochemické vyšetření. Dále byly odebrány segmenty tkáně tvořené aortou spolu s horní polovinou srdce. Tyto segmenty se ponořily do OCT media (Leica, Praha, Česká republika), následně byly zmraženy v tekutém dusíku a uskladněny při – 80°C.
4.2. Biochemická analýza Celkové koncentrace cholesterolu byly hodnoceny enzymaticky na základě konvenčních diagnostických metod (Lachema, Brno, Česká republika) a spektrofotometrické analýzy (cholesterol v 510 nm, triglyceridy v 540 nm vlnové délky) (ULTROSPECT III, Pharmacia LKB biotechnologie, Uppsala, Švédsko).
4.3. Imunohistochemie Imunohistochemická a stereologická analýza byla provedena v 1 cm aortálního sinu a části aortálního oblouku. Pro hodnocení byly nakrájeny série příčných řezů o tloušťce (7 µm) na zmrazovacím mikrotomu. Řezy byly přeneseny na sklíčka, která byla předem upravena v roztoku želatiny. Řezy se nechaly oschnout (60 minut) a pak se na 15 minut vložily do roztoku acetonu uchovávaného v –20 °C. Poté se řezy nechaly usušit (15 minut) a znovu se vložily na 15 minut do acetonu. Tímto procesem došlo k fixaci řezů a jejich lepší adhezi na podložní sklíčko. Dále se řezy po 15 minutovém usušení vložily na 10 minut do destilované vody, následně se vložily do roztoku PBS (2x5 minut). Před inkubací řezů 27
Diplomová práce s primární protilátkou bylo nutné ještě zablokovat nespecifická vazebná místa, proto se řezy na 30 minut ponořily do roztoku 10% goat séra v PBS (sigma Aldrich Chemie, Steinheim, Německo). V další fázi byly na sklíčka napipetovány roztoky anti avidinu a anti biotinu, které byly použity k zablokování reaktivity těchto látek v myší tkáni. Sklíčka se pak 1 hodinu inkubovaly s primární protilátkou při pokojové teplotě. Poté se řezy vložily do roztoku PBS (2x5minut), dále do roztoku 3% H 2 O 2 (15 minut). Po oplachu v PBS (2x5minut) se řezy inkubovaly se sekundární protilátkou (30 minut) – goat anti-hamster IgG a goat anti-rat IgG (Vector Laboratories), které byly značeny biotinem a opět se řezy vložily do roztoku PBS (2x5 minut). Dále byl na sklíčka nanesen avidin-biotinový komplex obsahující peroxidázový substrát
(Vector
Laboratoriem).
K
vizualizaci
navázaných
protilátek
se
použil
diaminobenzidin (DAB substrát-chromogen roztok, DAKO, Carpinteria, USA). Na závěr byly řezy opláchnuty ve vodě a poté odvodněny v acetonu, aceton – xylenu (10:1) asi 3 minuty, aceton – xylenu (1:10) také 3 minuty, 3x v xylenu ( po 2 minutách) a sklíčka zamontována do eukittu.
Byly použity následující primární protilátky: •
monoklonální protilátka Rat Anti-Mouse CD31 (PECAM-1) – zředění 1/100
•
monoklonální protilátka Rat Anti-Mouse CD106 (VCAM-1) – zředění 1/100
Všechny protilátky byly zakoupeny ve firmě BD Pharmingen (California, USA) Pracovní postup: oschnutí řezů
60 minut
fixace v acetonu (uschovaný v -20 stupních)
15 minut
usušení
15 minut
PBS
10 minut
10% zvířecí sérum v PBS (900 μl PBS + 100 μl séra)
30 minut
inkubace s avidin D
15 minut
oplach v PBS
5 minut
inkubace s biotinem
15 minut
PBS
oplach
primární protilátka (ředí se v BSA)
60 minut
PBS
2x5 minut
1
10% sérum v PBS (900 μl PBS + 100 μl séra)
15 minut
sekundární protilátka (+ mouse serum v PBS)
30 minut
28
Diplomová práce PBS
3
5 minut
3% H 2 0 2 (8 ml H 2 0 2 + 70 ml H 2 0)
15 minut
PBS
2x5 minut
4
ABC komplex elite
30 minut
PBS
5 minut
5
DAB (podle návodu)
nutno určit čas
destilovaná voda
oplach
aceton
oplach
aceton-xylen (10:1)
3 minuty
aceton-xylen (1:10)
3 minuty
3x xylen
2 minuty
Eukitt – montování krycího sklíčka
4.3.1.
Kvantitativní analýza imunohistochemie a velikost lézí
Plochy endoteliální exprese VCAM-1 a PECAM-1 byly kvantifikovány pomocí stereologických metod.(38) Nejprve se nakrájela série řezů o tloušťce 7 µm (0,385 mm dlouhé úseky cévy tvořící tzv. referenční objem). Byl proveden systematický náhodný výběr řezů z referenčního objemu. První řez byl pro každé imunohistochemické barvení vybrán náhodně, a pak se vybral každý jedenáctý řez, takže bylo pro každé barvení použito pět řezů ke stereologickému odhadu. Byla použita metoda bodové testovací mřížky, která se zvolila tak, abychom napočítali více než 200 průsečíků mezi body sítě a aterosklerotickým plátem na jednu cévu.(39) Odhadovaná plocha aterosklerotické léze se vypočetla podle vzorce: estA = a ∗ P kde parametr a charakterizuje plochu příslušející jednomu testovacímu bodu a P je počet průsečíků mezi body testovací sítě a aterosklerotickou lézí. Protilátka PECAM-1 byla použita jako marker přítomnosti endotelu. Takže plocha exprese VCAM-1 v endotelu byla vztažena k expresi PECAM-1 a vypočítána jako:
estP =
area ( x) ∗ 100% area ( PECAM )
kde x je plocha VCAM-1 v endotelu a plocha PECAM je plocha PECAM-1 v endotelu. Fotodokumentace a digitalizace z mikroskopu byla provedena mikroskopem Nikon Eclipse E2000, digitální kamerou Pixelink PL-A642 (Vitana Corp. USA) a za pomoci 29
Diplomová práce softwaru LUCIA verze 4.82 (Laboratory Imaging Prague, Česká republika). Stereologická analýza byla hodnocena softwarem PointGrid ELLIPSE (ViDiTo, Slovensko).
4.4. Statistická analýza Všechny hodnoty v grafech jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM (střední chyba průměru) pro 8 zvířat v každé skupině. Ke vzájemnému porovnání parametrů u MDOC a kontrolní skupiny byl použit nepárový T test. Rozdíly mezi skupinami byly statisticky významné v případě, že p≤ α, kde α=0,05. K výpočtu byl použit GraphPad Prism software (verze 4.0).
30
Diplomová práce
5. Výsledky
31
Diplomová práce
5.1. Biochemická analýza U všech myší v experimentu byly stanoveny hladiny celkového cholesterolu a jednotlivých lipidových frakcí. Výsledky ukázaly, že podávání MDOC neovlivnilo hladiny celkového cholesterolu, VLDL cholesterolu ani triacylglycerolů. Naproti tomu jsme zaznamenali statisticky významné snížení hladin LDL cholesterolu a rovněž statisticky významné zvýšení hladiny HDL cholesterolu (viz obr. 7). Obrázek 7. Lipidový profil u kontrolních a MDOC krmených myší. Čtyřtýdenní podávání MDOC statisticky významně snížilo hladiny LDL cholesterolu (*P≤0,05) a zvýšilo hladiny HDL cholesterolu (xP≤0,05).
32
Diplomová práce
5.2. Imunohistochemie 5.2.1.
Imunohistochemické
barvení
VCAM-1
v
oblasti
aortálního sinu V oblasti aortálního sinu a oblouku nebyly u žádné z myší přítomny aterosklerotické léze nebo jiné morfologické abnormality. Exprese PECAM-1 byla zjištěna v endotelových buňkách ve všech skupinách myší. Tato protilátka byla použita jako standard pro detekci intaktního endotelu, protože její exprese by neměla být změněna při změnách hladin cholesterolu. Exprese VCAM-1 byla pozorována převážně v endotelu aorty u obou skupin zvířat. Pouze velmi slabá exprese byla nalezena v kapilárách okolního myokardu. Barvení VCAM-1 bylo v obou skupinách velmi podobné svou lokalizací a také intenzitou z čehož lze usuzovat, že podávání MDOC neovlivnilo expresi VCAM-1 v endotelu zkoumaného úseku aorty (viz obr. 8).
Obrázek 8. Exprese VCAM-1 na endotelu v oblasti aortálního sinu u kontrolní (A) a MDOC skupiny (B). Z obrázku je patrná stejná lokalizace a téměř identická intenzita barvení u obou skupin. Zvětšení 100x.
33
Diplomová práce
5.2.2.
Stereologická analýza exprese VCAM-1 u ApoE
deficientních myší Stereologická analýza imunohistochemického barvení cév ze všech zvířat ukázala, že podávání MDOC signifikantně neovlivnilo expresi VCAM-1 v aortálním oblouku. Z grafu vyplývá že exprese VCAM-1 byla u MDOC skupiny statisticky nevýznamně zvýšena. (viz obr. 9).
Obrázek 9. Plocha VCAM-1 exprese v aortálním sinu a oblouku. Endoteliální exprese VCAM-1 byla po podání MDOC mírně zvýšena. VCAM-1
0.015
mm2
0.010
0.005
0.000 kontrolní skupina
MDOC skupina
34
Diplomová práce
6. Diskuze
35
Diplomová práce Ateroskleróza
jako
chronické
zánětlivé
onemocnění
je
velice
rozšířeným
onemocněním. Určitým způsobem postihuje všechny věkové skupiny obyvatelstva. Klinické příznaky aterosklerózy, které se ve většině případů objevují až v pozdějších letech života, jsou dnes velmi frekventované a ateroskleróza je v současné době příčinou téměř 50 % všech úmrtí. Rozsáhlý výzkum v oblasti aterosklerózy odhalil v posledních letech řadu nových poznatků přispívajících k pochopení dějů, ke kterým dochází během aterogenního procesu. Mnohé poznatky týkající se aterogenního procesu zdůrazňují úlohu zánětlivé reakce v procesu aterogeneze.(40) Od roku 1986 se vědecké skupiny v různých laboratořích snažily vyvolat aterosklerózu u myší za účelem zavedení nového zvířecího modelu. Myši jsou obvykle vysoce rezistentní vůči ateroskleróze. Při příjmu běžné stravy mají nízkou hladinu celkového cholesterolu a vyšší hladinu protektivního HDL cholesterolu, tudíž se u nich nevyvíjejí aterosklerotické léze. Ovšem pokud jsou myši krmeny stravou s vysokým podílem cholesterolu a tuků, která též obsahuje žlučové kyseliny, hladina jejich celkového cholesterolu roste a po několika měsících se u vybraných kmenů myší začnou tvořit vrstvy pěnových buněk, zejména v subendotelu cév v okolí aortálního sinu.(41) Ačkoli se tento model zprvu vyvíjel slibně, měl dva zásadní problémy. Oproti lidským aterosklerotickým lézím, které se vyskytují ve větvích hlavních cév, kde pláty progredují, myší léze jsou malé a vyskytují se pouze v oblastech aortálního oblouku a nedochází k jejich progresi. Strava, kterou jsou myši krmeny, je nefyziologická, obsahuje 10 – 20x více cholesterolu a žlučových kyselin. Tato strava vyvolá chronický zánět pouze u citlivých kmenů myší, nikoli u kmenů ateroskleroticky rezistentních, což zvyšuje možnost dohadu, že genetické rozdíly mezi danými kmeny myší jsou dány spíše rozdíly v reakci na podanou stravu. V roce 1992 použily dvě laboratoře speciální genovou technologii, která dala vzniknout myším deficientním v apolipoproteinu E (apoE).(34) ApoE jsou tvořeny primárně v játrech a mají na svém povrchu základní lipoproteinové částice a ligandy pro rozpoznání lipoproteinů a také pro clearance lipoproteinových receptorů. ApoE deficientní myši mají zpožděné vylučování lipoproteinů a při nízkocholesterolové stravě hladina jejich cholesterolu stoupá – jako důsledek akumulace chylomikronů a VLDL zbytků, obohacených esterifikovaným i volným cholesterolem. U těchto myší se vyvíjejí nejen lipidní proužky, ale také fibromuskulární pláty, typické pro aterosklerózu u lidí. Tyto léze se formují v aortě, v břišní aortě, v hlavních větvích karotid, interkostálních, mesenterických, renálních a iliálních arteriích a také v proximálních částech koronárních, femorálních a podklíčkových arterií. 36
Diplomová práce Lipidní proužky se objevují po deseti týdnech, léze obsahující pěnové buňky a hladkosvalové buňky se objevují po patnácti týdnech. Fibromuskulární pláty jsou patrné po dvaceti týdnech, obsahují nekrotické jádro a fibromuskulární čepičku z hladkosvalových buněk obklopených elastickými vlákny a kolagenem. U starších myší se fibromuskulární pláty vyvíjejí, u pokročilých lézí je patrná destrukce buněk medie s příležitostným vývojem aneuryzmat. Rozsáhlá proliferace fibrózní tkáně může zúžit lumen cévy, či dokonce způsobit její úplnou okluzi. Komplikované léze charakterizované trombózou se však nevyskytly.(42) V terapii hyperlipidemií a cévních komplikací (aterosklerózy) jsou dnes asi nejvýznamnějšími léky statiny. Nicméně bylo také prokázáno, že podávání dietní vlákniny má pozitivní vliv na kardiovaskulární systém a to včetně hladiny cholesterolu.(24) Dietní vláknina je tvořena poživatelnou částí rostlinných nebo obdobných sacharidů, které jsou rezistentní trávení a absorpci v lidském tenkém střevě s kompletní nebo částečnou fermentací v tlustém střevě. Dietní vláknina se vyskytuje v zelenině, ovoci, obilninách a dřevě.(25) Vlákninu můžeme rozdělit na nestravitelné oligosacharidy (inulin), trávení rezistentní škrob, nerozpustnou dietní vlákninu (celulóza, beta-glukany), a rozpustnou dietní vlákninu (pektin) (viz kapitola 2.2). Vláknina vykazuje řadu pozitivních účinků, ke kterým patří pozitivní vliv na trávicí procesy, např. urychlí střevní pasáž, pozitivně podporuje peristaltiku, absorbuje vodu, změkčí stolici, působí prevenci divertiklů a zácpy, podílí se na absorbci toxických látek. Mezi velmi důležité účinky patří také vliv na metabolismus živin. Rozpustná dietní vláknina se podílí na snížení resorpce tuků, snížení zpětné resorpce žlučových kyselin, snížení energetického obsahu diety, zpomalení resorpce sacharidů, snížení glykémie a insulinémie, potlačení syntézy cholesterolu v játrech zvýšením přívodu kyseliny propionové portálním oběhem do jater.(26) MDOC
tedy
modifikovaná
oxidovaná
celulosa
je
chemicky
de
facto
polyanhydroglukuronová kyselina. Svými vlastnostmi se pravděpodobně může řadit mezi rozpustnou vlákninu. Tato diplomová práce byla tedy zaměřena na sledování účinků MDOC, podávané apoE-deficientním myším krmeným také aterogenní dietou. V této diplomové práci jsme ukázali, že 8 týdenní aplikace MDOC apoE deficientním myším má za následek signifikantní snížení LDL cholesterolu. Dále bylo zjištěno, že MDOC významně zvyšuje hladinu HDL cholesterolu. Tyto výsledky jsou shodné s prací autorů Trias et al., kteří popsali stejné účinky na potkanech krmených guarovou gumou, což je jiná rozpustná vláknina.(43)
37
Diplomová práce U lidí i u zvířat bylo prokázáno, že rozpustná vláknina snižuje hladinu LDL cholesterolu.(44) (45) (46). Ale mnoho studií o rozpustné vláknině dokázalo, že společně s redukcí LDL cholesterolu klesá i HDL cholesterol, což je nežádoucí efekt. Snížená hladina HDL cholesterolu totiž nepřímo koreluje s výskytem koronární srdeční příhody.(43; 47-49) Avšak na druhou stranu existuje i řada studií, ve kterých byla prokázáno, markantní zvýšení HDL cholesterolu, zejména ve studiích s potkany, kterým byla podávána dieta s přídavkem rozpustné vlákniny. (50; 51) Naopak endoteliální exprese zánětlivých ukazatelů zúčastněných na počátku aterogeneze, VCAM-1 nebylo po podávání MDOC ovlivněno. VCAM-1 je silně exprimován v endotelu náchylnému k rozvoji aterosklerózy u takového modelu, jako jsou apoE deficientní myši (apoE-/-), LDL receptor – deficientní myši (LDL-R-/-) a králíci, který je krmen aterogenní dietou.(52) Bohužel, bylo prokázáno(53;
54)
, že endoteliální exprese VCAM-1 u myší
nedostatečně koreluje s hladinou cholesterolu, jako tomu tak je u králíků.(55) Tudíž v této práci změna hladiny cholesterolu není pravděpodobně adekvátní změně VCAM-1 jak v krvi, tak v cévní stěně.
38
Diplomová práce
7. Závěr
39
Diplomová práce Tato diplomová práce se zabývala existencí potencionálních hypolipidemických a protizánětlivých účinků modifikované oxidované celulózy, MDOC. Výsledky ukázaly na pozitivní vliv MDOC na hladiny LDL a HDL cholesterolu.
Na druhou stranu nebyl prokázán vliv na celkový a VLDL cholesterol.
Stereologická analýza imunohistochemického barvení dále prokázala že endoteliální exprese VCAM-1 není po podávání MDOC ovlivněna. Dosavadní výsledky studií s MDOC ukazují na jeho potenciální hypolidemické účinky u apoE-deficientního modelu aterosklerózy. Další studie však musí být zaměřeny na ověření mechanizmu účinku MDOC, na jeho vliv na aterogenní proces u pokročilejších aterosklerotických plátů a případnou kombinaci s jiným hypolipidemikem.
40
Diplomová práce
8. Abstrakt
41
Diplomová práce Ateroskleróza patří mezi kardiovaskulární onemocnění, které tvoří v posledních letech nejčastější příčinu morbidity a mortality ve všech ekonomicky vyspělých zemích Evropy a USA. Cílem této diplomové práce bylo zjistit potencionální hypolipidemické a protizánětlivé účinky MDOC jako nové potenciální substance patří do skupiny dietární vlákniny. Ve studii byl použit geneticky modifikovaný kmen ApoE deficientní myši (n=8), které byly krmeny po odstavení aterogenní dietou s obsahem 1,25% cholesterolu po dobu 4 týdnů (kontrolní skupina). V MDOC skupině byly myši krmeny stejnou aterogenní dietou, ke které bylo přidáváno 50 mg/kg MDOC denně. Zvířatům byly odebrány ze srdce vzorky krve pro biochemické vyšetření. Dále byly odebrány segmenty tkáně tvořené aortou spolu s horní polovinou srdce. Dále byla provedena biochemická analýza krve a imunohistochemická a stereologická analýza endoteliální exprese VCAM-1 v aortálním sinu a oblouku. Výsledky biochemické analýzy ukázaly, že podávání MDOC neovlivnilo hladiny celkového cholesterolu, VLDL cholesterolu ani triacylglycerolů. Naproti tomu jsme zaznamenali statisticky významné snížení hladin LDL cholesterolu a rovněž statisticky významné zvýšení hladiny HDL cholesterolu. Imunohistochemická detekce exprese VCAM-1 byla pozorována převážně v endotelu aorty u obou skupin zvířat. Pouze velmi slabá exprese byla nalezena v kapilárách okolního myokardu. Barvení VCAM-1 bylo v obou skupinách velmi podobné svou lokalizací a také intenzitou z čehož lze usuzovat, že podávání MDOC neovlivnilo expresi VCAM-1 v endotelu zkoumaného úseku aorty. Stereologická analýza imunohistochemického barvení cév ze všech zvířat ukázala, že podávání MDOC signifikantně neovlivnilo expresi VCAM-1 v aortálním oblouku. Exprese VCAM-1 byla u MDOC skupiny statisticky nevýznamně zvýšena. Tato diplomová práce se zabývala existencí potencionálních hypolipidemických a protizánětlivých účinků modifikované oxidované celulózy, MDOC. Výsledky ukázaly na pozitivní vliv MDOC na hladiny LDL a HDL cholesterolu. Stereologická analýza imunohistochemického barvení dále prokázala že endoteliální exprese VCAM-1 není po podávání MDOC ovlivněna. Dosavadní výsledky studií s MDOC ukazují na jeho potenciální hypolidemické účinky u apoE-deficientního modelu aterosklerózy. Další studie však musí být zaměřeny na ověření mechanizmu účinku MDOC, na jeho vliv na aterogenní proces u pokročilejších aterosklerotických plátů a na případnou kombinaci s jiným hypolipidemikem.
42
Diplomová práce Atherosclerosis belongs to the cardiovascular diseases, which have been the most frequent cause of the morbidity and mortality in all the economically advanced countries of Europe and the USA in the last few years. The purpose of this diploma dissertation was to find some potential hypolipidemic and antiinflammatory effects of MDOC. The new potential substance belongs to the group of dietary fibre. Genetically modified tribe of the ApoE-deficient mice (n=8) was used in the study. After the delactacion, it was fed on an aterogenic diet with 1,25% cholesterol content for 4 weeks. In MDOC group, the mice were fed on the same aterogenic diet, but just 50 mg/kg were daily added to this diet. Blood sample for the biochemical investigation were taken from animals. Then, partitions of the tissue formed by the aorta together with the upper part of the heart were taken, too. Then, a biochemical analysis of the blood was made and also in aortic sinus and arch an imunohistochemical and stereological analysis of the endothelial expression of VCAM-1 had to be done. The results of the biochemical analysis showed that serving of MDOC did not affect the total cholesterol level, VLDL cholesterol, or triglycerides. On the other hand, we noticed a statistically significant reduction of the LDL cholesterol levels and also a statistically significant increase in the HDL cholesterol level. Imunohistochemical detection of the expression of VCAM-1 was observed predominantly in endothelium of the aorta in both groups of animals. Only a very week expression was found in capillaries of the surrounding myocardium. Dyeing of VCAM-1 was very similar in its localization and also its intensity in both groups. These facts suggest that serving of MDOC did not affect the expression of VCAM-1 in endothelium in that segment of aorta, which was examined (studied). Stereological analysis of the imunohistochemical dyeing of vessels in both groups of mice proved that serving of MDOC did not significantly affect the expression of VCAM-1 in aortic arch. The expression of VCAM-1 was statistically insignificantly increased in the MDOC group. This diploma dissertation dealt with the existence of potential hypolipidemic and antiinflammatory effects of MDOC. The results showed a positive influence of MDOC on LDL cholesterol
levels
and
HDL
cholesterol
levels.
Stereological
analysis
of
the
imunohistochemical dying proved that serving of MDOC did not affect the endothelial expression of VCAM-1. The results of the MDOC studies (up to now) point to its potential hypolipidemic effects in apoE-deficient model of atherosclerosis. Subsequent studies must, however, 43
Diplomová práce concentrate on verification of MDOC effect, on its impact on atherogenic process in more advanced arteriosclerotic plague and on potential combination with another hypolipidemicum.
44
Diplomová práce
9. Literatura
45
Diplomová práce 1. Keaney JF, Jr.: Atherosclerosis: from lesion formation to plaque activation and endothelial dysfunction. Mol Aspects Med 21:99-166, 2000 2. Shantaram V: Pathogenesis of atherosclerosis in diabetes and hypertension. Clin Exp Hypertens 21:69-77, 1999 3. Tarbell JM: Mass transport in arteries and the localization of atherosclerosis. Annu Rev Biomed Eng 5:79-118, 2003 4. Underwood RS, Mohiaddin RH: Magnetic resonance imaging of atherosclerotic vascular disease. Am J Hypertens 6:335S-339S, 1993 5. Gavrish AS, Sergienko OV: [The functional morphology of the thrombocytes and their role in the pathogenesis of atherosclerosis and ischemic heart disease (a review of the literature)]. Lik Sprava:31-36, 1993 6. Gudev A: [The role of the oxidative modification of LDL in the pathogenesis of atherosclerosis]. Mol Med (Sofia) 1:31-38, 1996 7. Dargel R: [Lipoproteins and the etiopathogenesis of atherosclerosis]. Zentralbl Allg Pathol 135:501-504, 1989 8. Najemnik C, Sinzinger H, Kritz H: Endothelial dysfunction, atherosclerosis and diabetes. Acta Med Austriaca 26:148-153, 1999 9. Nitenberg A: [Endothelial dysfunction in patients with diabetes: identification, pathogenesis and treatment]. Presse Med 34:1654-1661, 2005 10. Raines EW, Ross R: Smooth muscle cells and the pathogenesis of the lesions of atherosclerosis. Br Heart J 69:S30-37, 1993 11. Asada Y, Marutsuka K, Hatakeyama K, Sato Y, Hara S, Kisanuki A, Sumiyoshi A: The role of tissue factor in the pathogenesis of thrombosis and atherosclerosis. J Atheroscler Thromb 4:135-139, 1998 12. Boyle JJ: Macrophage activation in atherosclerosis: pathogenesis and pharmacology of plaque rupture. Curr Vasc Pharmacol 3:63-68, 2005 13. Muntner P, He J, Astor BC, Folsom AR, Coresh J: Traditional and nontraditional risk factors predict coronary heart disease in chronic kidney disease: results from the atherosclerosis risk in communities study. J Am Soc Nephrol 16:529-538, 2005 14. Daubresse JC: [Atherosclerosis and nutrition]. Rev Med Brux 21:A359-362, 2000 15. Stehbens WE: The fatigue hypothesis of plaque rupture and atherosclerosis. Med Hypotheses 58:359-360, 2002 16. Semenkovich CF, Heinecke JW: The mystery of diabetes and atherosclerosis: time for a new plot. Diabetes 46:327-334, 1997 46
Diplomová práce 17. McGill HC, Jr., McMahan CA, Zieske AW, Malcom GT, Tracy RE, Strong JP: Effects of nonlipid risk factors on atherosclerosis in youth with a favorable lipoprotein profile. Circulation 103:1546-1550, 2001 18. Vanhoutte PM: [Endothelial dysfunction and atherosclerosis]. Arch Mal Coeur Vaiss 90 Spec No 6:9-19, 1997 19. Davignon J, Ganz P: Role of endothelial dysfunction in atherosclerosis. Circulation 109:III27-32, 2004 20. Joseph-Silverstein J, Silverstein RL: Cell adhesion molecules: an overview. Cancer Invest 16:176-182, 1998 21. Dansky HM, Barlow CB, Lominska C, Sikes JL, Kao C, Weinsaft J, Cybulsky MI, Smith JD: Adhesion of monocytes to arterial endothelium and initiation of atherosclerosis are critically dependent on vascular cell adhesion molecule-1 gene dosage. Arterioscler Thromb Vasc Biol 21:1662-1667, 2001 22. Cybulsky MI, Iiyama K, Li H, Zhu S, Chen M, Iiyama M, Davis V, Gutierrez-Ramos JC, Connelly PW, Milstone DS: A major role for VCAM-1, but not ICAM-1, in early atherosclerosis. J Clin Invest 107:1255-1262, 2001 23. Ley K, Huo Y: VCAM-1 is critical in atherosclerosis. J Clin Invest 107:1209-1210, 2001 24. Ryzhenkov VE, Remezova OV, Beliakov NA: [Dietary fiber and synthetic nonspecific enterosorbents: their hypolipidemic and anti-arteriosclerotic effects]. Vopr Pitan:11-18, 1991 25. Campbell AP: Health benefits of dietary fiber for people with diabetes. Diabetes Educ 27:511-514, 2001 26. Bennett WG, Cerda JJ: Benefits of dietary fiber. Myth or medicine? Postgrad Med 99:153-156, 166-158, 171-152 passim, 1996 27. Terpstra AH, Lapre JA, de Vries HT, Beynen AC: Dietary pectin with high viscosity lowers plasma and liver cholesterol concentration and plasma cholesteryl ester transfer protein activity in hamsters. J Nutr 128:1944-1949, 1998 28. Levrat-Verny MA, Behr S, Mustad V, Remesy C, Demigne C: Low levels of viscous hydrocolloids lower plasma cholesterol in rats primarily by impairing cholesterol absorption. J Nutr 130:243-248, 2000 29. Fernandez ML, Vergara-Jimenez M, Romero AL, Erickson SK, McNamara DJ: Gender differences in response to dietary soluble fiber in guinea pigs: effects of pectin, guar gum, and psyllium. J Lipid Res 36:2191-2202, 1995
47
Diplomová práce 30. Nishina PM, Lowe S, Verstuyft J, Naggert JK, Kuypers FA, Paigen B: Effects of dietary fats from animal and plant sources on diet-induced fatty streak lesions in C57BL/6J mice. J Lipid Res 34:1413-1422, 1993 31. Nachtigal P, Pospisilova N, Pospechova K, Jamborova G, Kopecky M, Jaynes R, Briestensky J, Santar I, Smahelova A, Solichova D, Zdansky P, Semecky V: MDOC and atorvastatin have potential antiinflammatory effects in vascular endothelium of apoE-/- mouse model of atherosclerosis. Life Sci 78:1983-1989, 2006 32. Jelinkova M, Briestensky J, Santar I, Rihova B: In vitro and in vivo immunomodulatory effects of microdispersed oxidized cellulose. Int Immunopharmacol 2:1429-1441, 2002 33. Breslow JL: Mouse models of atherosclerosis. Science 272:685-688, 1996 34. Nakashima Y, Plump AS, Raines EW, Breslow JL, Ross R: ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throughout the arterial tree. Arteriosclerosis and Thrombosis 14:133-140, 1994 35. Nakashima Y, Raines EW, Plump AS, Breslow JL, Ross R: Upregulation of VCAM-1 and ICAM-1 at atherosclerosis-prone sites on the endothelium in the ApoE-deficient mouse. Arterioscler Thromb Vasc Biol 18:842-851, 1998 36. Wang YX, Martin-McNulty B, Huw LY, da Cunha V, Post J, Hinchman J, Vergona R, Sullivan ME, Dole W, Kauser K: Anti-atherosclerotic effect of simvastatin depends on the presence of apolipoprotein E. Atherosclerosis 162:23-31, 2002 37. Zhang SH, Reddick RL, Piedrahita JA, Maeda N: Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science 258:468-471, 1992 38. Nachtigal P, Semecky V, Kopecky M, Gojova A, Solichova D, Zdansky P, Zadak Z: Application of stereological methods for the quantification of VCAM-1 and ICAM-1 expression in early stages of rabbit atherogenesis. Pathol Res Pract 200:219-229, 2004 39. Gundersen HJ, Bagger P, Bendtsen TF, Evans SM, Korbo L, Marcussen N, Moller A, Nielsen K, Nyengaard JR, Pakkenberg B, et al.: The new stereological tools: disector, fractionator, nucleator and point sampled intercepts and their use in pathological research and diagnosis. Apmis 96:857-881, 1988 40. Ross R: Atherosclerosis--an inflammatory disease. N Engl J Med 340:115-126, 1999 41. Paigen B, Morrow A, Holmes PA, Mitchell D, Williams RA: Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice. Atherosclerosis 68:231-240, 1987 42. Hofker MH, Breuer M: Generation of transgenic mice. Methods Mol Biol 110:63-78, 1998 43. Frias AC, Sgarbieri VC: Guar gum effects on food intake, blood serum lipids and glucose levels of Wistar rats. Plant Foods Hum Nutr 53:15-28, 1998 48
Diplomová práce 44. Naumann E, van Rees AB, Onning G, Oste R, Wydra M, Mensink RP: Beta-glucan incorporated into a fruit drink effectively lowers serum LDL-cholesterol concentrations. Am J Clin Nutr 83:601-605, 2006 45. Moreyra AE, Wilson AC, Koraym A: Effect of combining psyllium fiber with simvastatin in lowering cholesterol. Arch Intern Med 165:1161-1166, 2005 46. Grainger DJ, Kemp PR, Metcalfe JC, Liu AC, Lawn RM, Williams NR, Grace AA, Schofield PM, Chauhan A: The serum concentration of active transforming growth factorbeta is severely depressed in advanced atherosclerosis. Nat Med 1:74-79, 1995 47. Kim M, Shin HK: The water-soluble extract of chicory influences serum and liver lipid concentrations, cecal short-chain fatty acid concentrations and fecal lipid excretion in rats. J Nutr 128:1731-1736, 1998 48. Nishina PM, Freedland RA: The effects of dietary fiber feeding on cholesterol metabolism in rats. J Nutr 120:800-805, 1990 49. Vigne JL, Lairon D, Borel P, Portugal H, Pauli AM, Hauton JC, Lafont H: Effect of pectin, wheat bran and cellulose on serum lipids and lipoproteins in rats fed on a low- or highfat diet. Br J Nutr 58:405-413, 1987 50. Pal M, Pillarisetti S: HDL elevators and mimetics--emerging therapies for atherosclerosis. Cardiovasc Hematol Agents Med Chem 5:55-66, 2007 51. Rader DJ: Mechanisms of disease: HDL metabolism as a target for novel therapies. Nat Clin Pract Cardiovasc Med 4:102-109, 2007 52. Iiyama K, Hajra L, Iiyama M, Li H, DiChiara M, Medoff BD, Cybulsky MI: Patterns of vascular cell adhesion molecule-1 and intercellular adhesion molecule-1 expression in rabbit and mouse atherosclerotic lesions and at sites predisposed to lesion formation. Circ Res 85:199-207, 1999 53. Nachtigal P, Jamborova G, Pospisilova N, Pospechova K, Solichova D, Zdansky P, Semecky V: Atorvastatin has distinct effects on endothelial markers in different mouse models of atherosclerosis. J Pharm Pharm Sci 9:222-230, 2006 54. Zibara K, Chignier E, Covacho C, Poston R, Canard G, Hardy P, McGregor J: Modulation of expression of endothelial intercellular adhesion molecule-1, platelet-endothelial cell adhesion molecule-1, and vascular cell adhesion molecule-1 in aortic arch lesions of apolipoprotein E-deficient compared with wild-type mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol 20:2288-2296, 2000
49
Diplomová práce 55. Li H, Cybulsky MI, Gimbrone MA, Jr., Libby P: An atherogenic diet rapidly induces VCAM-1, a cytokine-regulatable mononuclear leukocyte adhesion molecule, in rabbit aortic endothelium. Arterioscler Thromb 13:197-204, 1993
50
