UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Přírodovědecká fakulta Studijní program: Imunologie

Autoreferát disertační práce

Vliv bakteriálních lyzátů na funkci střevní bariéry a složení mikroflóry

RNDr. Zuzana Zákostelská 2012

Doktorské studijní programy v biomedicíně Univerzita Karlova v Praze a Akademie věd České republiky

Program:

Imunologie

Předseda oborové komise:

Doc. RNDr. Vladimír Holáň, DrSc.

Školící pracoviště:

Oddělení imunologie a gnotobiologie Mikrobiologický ústav AV ČR v.v.i. Vídeňská 1083, 14220, Praha 4 Krč

Autor:

RNDr. Zuzana Zákostelská

Školitel:

Prof. MUDr. Helena Tlaskalová-Hogenová, DrSc.

Obhajoba disertační práce se bude konat v ……….od………v konferenční místnosti Mikrobiologického ústavu AV ČR v.v.i.,Vídeňská 1083, 14220, Praha 4, Krč.

S disertací je možno se seznámit v příslušných knihovnách Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy v Praze.

i

OBSAH

Obsah..............................................................................................................................................................ii Zkratky..........................................................................................................................................................iii Souhrn ...........................................................................................................................................................iv 1.

Úvod ...................................................................................................................................................... 1

2.

Hypotéza a cíle...................................................................................................................................... 2

3.

Materiál a metody ................................................................................................................................ 3 3.1

Příprava bakterií a jejich lyzátů................................................................................................... 3

3.2

Kolonizace bezmikróbních myší ................................................................................................... 4

3.3

Zvířata .......................................................................................................................................... 4

3.4

Indukce a hodnocení zánětu tlustého střeva ................................................................................. 4

3.5

Indukce a hodnocení kolorektálního karcinomu........................................................................... 4

3.6

Stanovení poškození bariérové funkce střeva ............................................................................... 5

3.7

Měření produkce cytokinů ............................................................................................................ 5

3.8

Stanovení specifických protilátek ................................................................................................. 6

3.9

Stanovení aktivity β-glukuronidázy .............................................................................................. 6

3.10

Průtoková cytometrie.................................................................................................................... 6

3.11

Protizánětlivé vlastnosti bakteriálních lyzátů stanovené in vitro ................................................. 7

3.12

Stanovení složení střevní mikroflóry............................................................................................. 7

3.13

Statistická analýza ........................................................................................................................ 7

4.

Výsledky................................................................................................................................................ 7

5.

Diskuze ................................................................................................................................................ 11 5.1

Mikrobiální expozice během neonatálního vývoje má trvalý účinek na imunitní stav hostitele . 11

5.2 Vliv interakce mezi hostitelem a střevní mikroflórou na vývoj střevního zánětu a kolorektálního karcinomu ................................................................................................................................................. 12 5.3

Snížená bakteriální zátěž chrání před kolitidou asociovanou s kolorektálním karcinomem ...... 15

6.

Závěr ................................................................................................................................................... 15

7.

Reference ............................................................................................................................................ 17

8.

Publikace............................................................................................................................................. 19

ii

ZKRATKY AOM

azoxymethan

ATB

antibiotika

CAC

karcinom vznikající v zánětem postiženém tlustém střevě

CD

Crohnova choroba

DC

dendritické buňky

DSS

dextransulfát sodný

ELISA

enzymová imunoanalýza

FITC

fluorescein isothikyanát

GF

bezmikróbní

IBD

nespecifické střevní záněty

IFN-γ

interferon gama

IRAK-M

IL-1 receptor asociovaná kináza M

Lc

lyzát z Lactobacillus casei DN-114 001

mPd

membránová frakce Parabacteroides distasonis

M2

makrofágy subsetu 2

MLN

mezenteriální lymfatické uzliny

NF-κB

jaderný faktor kappa B

NOD

oligomerizační doména vázající nukleotid

PBS

fosfátový pufr

PP

Peyerovy pláty

PCR

polymerázová řetězová reakce

PCR-DGGE

polymerázová řetězová reakce-gradientová gelová elektroforéza

SCID

těžká kombinovaná imunodeficience

SPF

bez specifických patogenů

TGF-β

transformující růstový faktor beta

TLRs

Toll-like receptory

TNF-α

faktor nekrotizujicí nádory alfa

TJs

těsná spojení

Tregs

regulační T buňky

UC

ulcerosní kolitida

ZO-1

zonula occludens-1

iii

SOUHRN Dynamické molekulární interakce, které neustále probíhají mezi střevní sliznicí a mikroflórou hrají důležitou roli ve vytvoření a následném udržení sližniční homeostázy. Aberantní odpovědi slizničního imunitního systému na jinak neškodné složky střevní mikroflóry mohou vést ke vzniku mnoha onemocnění jako například nespecifických střevních zánětů. Cílem této práce bylo popsat vliv a schopnost komensálních a probiotických bakterií na vznik patologické nebo naopak zdraví prospěšné reakce hostitele. Jedním z nejdůležitějších faktorů pro vývoj imunitního systému je kontakt s mikrobiálními komponentami. V této práci ukazujeme, ževe vývoji imunitního systému jedince existuje takzvané časové okno (u myší do tří týdnu), které umožnuje artificiální kolonizaci bezmikrobních myší perorálním podánímjedné dávky střevního obsahu. Kolonizace v pozdějším věku zbůsobí nevratné změny v reaktivitě imunitního systému. V této práci jsme popsali, že části mrtvých komensálních a probiotických bakterií na jako je například Parabacteroides distasonis (mPd) a L. casei DN-114 001 (Lc) mají protizánětlivý účinek v experimentálním modelu střevního zánětu. Mechanismus působení bakteriálního lyzátu L. casei DN-114 001 je následující a) zlepšuje bariérovou funkci střeva b) upravuje dysbiosu ve střevě a za c) moduluje slizniční imunitní odpověd´. Narozdíl od léčby experimentálního střevního zánětu Lc, léčba mPd vede ke zvýšení titru specifických protilátek v krevním sérum. Tyto komplexní imunomodulační schopnosti neživých bakteriálních lyzátů mohou vést k vývoji nových terapeutických přístupů pro léčbu chronických střevních zánětů a také poukazují na důležitost při výběru konkrétní bakterie. Navíc orální podávání bakteriálních lyzátů narozdíl od živých bakterií by mohlo být daleko bezpečnejší při léčbě těžce nemocných nebo imunokompromitovaných pacientů. Dále jsme ukázali, že metabolická aktivita komensálních bakterií ovlivňuje vývoj experimentálně indukovaného kolorektálního karcinomu. Prokázali jsme, že léčba antibiotiky mění zastoupení střevní mikroflóry a tato změna je příčinou protektivního učinku antibiotik na vznik nádoru. Pochopení vztahu mezi hostitelem a střevní mikroflórou by nám do budoucna mohlo přinést nové poznatky, které by byly využitelné při prevenci a terapii různých onemocnění, jež jsou asociovány s porušením slizniční homeostázy a dysbiozou.

iv

1. ÚVOD Většina epitelových povrchů našeho těla, jako je například kůže a sliznice, je kolonizována obrovským množstvím mikroorganismů, které tvoří takzvanou komensalní mikroflóru. Do komensalní mikroflóry patří především bakterie, ale můžeme zde nalézt i houby, prvoky a viry. Mikroflóra je složena z triliónů buněk, což je přibližně desetkrát více, než máme celkem buněk v našem těle. Většina komensalních bakterií s námi žije v symbióze, avšak při průniku skrze sliznice nebo za jiných specifických podmínek, např. při imunodeficienci, se tento vzájemně výhodný vztah může změnit na vztah patologický. Značnou část, přibližně 70% z tohoto složitého bakteriálního společenství není možné identifikovat pomocí klasických mikrobiologických technik. Mezi hostitelem a jeho mikroflórou existuje symbióza, která je výsledkem dlouholeté evoluce a vzájemného přizpůsobení se obou partnerů a která určuje schopnost přizpůsobit se okolnímu prostředí a bránit se proti cizím mikroorganismům. Působení mikroflóry na člověka začíná hned v průběhu porodu a pokračuje v postnatálním období, kdy jsou bezmikróbní (sterilní) novorozenci postupně osídlováni bakteriemi z okolí. Zastoupení jednotlivých bakteriálních populací se stabilizuje v průběhu prvních několika let. Působení bakterií má obrovský vliv na vývoj imunitního systému (Adlerberth and Wold, 2009). Efekt mikrobiální kolonizace na buňky přirozené imunity byl popsán ve studiích, které se týkaly fagocytózy u dendritických a střevních epitelových buněk (PetnickiOcwieja et al., 2009; Williams et al., 2006). Také repertoár T buněčných receptorů je ovlivněn bakteriální kolonizací (Probert et al., 2007). Idiopatické střevní záněty (ISZ), jmenovitě Crohnova choroba a ulcerosní kolitida, jsou závažná chronická onemocnění, jejichž etiologie a patogeneze není doposud dostatečně objasněna. ISZ představují skupinu multifaktoriálních chorob, které vznikají jako následek aberantní odpovědi slizničního imunitního systému na jinak neškodné složky střevní mikroflóry u geneticky predisponovaných jedinců (Sartor, 2006). Dalším mechanismem spouštějícím ISZ může být porušení rovnováhy mezi základními složkami střevní mikroflóry tzv. dysbiosa (Packey and Sartor, 2009). Změna střevní mikroflóry pomocí antibiotik, prebiotik a probiotik se ukazuje jako slibná preventivní i terapeutická alternativa či jako doplněk běžné léčby ISZ (Sheil et al., 2007). Probiotika jsou definována jako živé mikroogranismy, které, pokud jsou podávány v optimálních dávkách, mají pozitivní vliv na zdraví jedince (FAO/WHO, 2001). Probio-

1

tika byla úspěšně použita při léčbě ISZ (Bibiloni et al., 2005). S použitím zvířecích modelů střevních zánětů byly objeveny tři možné mechanismy působení probiotik. Bylo zjištěno, že každá bakterie může hostitele ovlivňovat více způsoby například tím, že moduluje jeho metabolismus nebo různé buněčné kompartmenty (Lebeer et al., 2010). Za prvé, probiotika mohou omezit růst některých patogenních bakterií (Servin, 2004). Za druhé, mohou ovlivnit funkci střevní bariéry (Gupta et al., 2000) a za třetí, mohou usměrnit slizniční nebo systémovou imunitní odpověď nebo metabolické funkce (Reiff et al., 2009). Jaký účinek nakonec probiotika budou mít, závisí také na fázi onemocnění a celkovém zdravotním stavu pacienta. Ačkoliv je užívání probiotik obecně neškodné, u těžce nemocných pacientů mohou tyto živé bakterie způsobit vážné zdravotní komplikace (Besselink et al., 2008). Prokázali jsme, že orální podávání bakteriálních lyzátů ovlivňuje vývoj experimentálně vyvolaného střevního zánětu. Podávání bakteriálních lyzátů z anaerobních bakterií snižuje tíži střevního zánětu vyvolaného dextran sulfátem sodným u myší kmene BALB/c (Verdu et al., 2000). Dále jsme zjistili, že prospěšné účinky bakterií mohou být následkem změn ve složení střevní mikroflóry a imunomodulací slizniční a systémové imunitní odpovědi (Kverka et al., 2011). Ačkoliv mechanismus protektivního a terapeutického působení bakteriálních lyzátů musí být ještě podrobně zkoumán, tento léčebný směr by mohl být v budoucnosti využit pro vývoj vakcín.

2. HYPOTÉZA A CÍLE Hlavním cílem této práce bylo popsat více detailně a za různých podmínek vztah mezi hostitelem a střevní mikroflorou. Hlavní směry našeho výzkumu se týkaly vlivu střevní mikroflóry na vývoj imunitního systému a imunomodulačního potenciálu bakteriálních lyzátů izolovaných komenzálních a probiotických bakterií v experimentálním modelu střevního zánětu.

Specifické cíle této práce byly: - lépe popsat vztah mezi hostitelem a střevní mikroflórou a dát je do souvislosti s funkčními studiemi i s metagenomickým přístupem. Pomocí zvířecích modelů lidských

2

onemocnění indukovaných v podmínkách různé mikrobiální zátěže popisujeme přímou spojitost mezi mikroflórou a rozvojem určitých onemocnění.

-studovat působení střevní mikroflóry na maturaci střevního imunitního systému a vznik slizniční rovnováhy během kolonizace krátce po narození

-studovat zda preventivní orální podávání bakteriálních komponent komensální bakterie Parabacteroides distasonis může ovlivnit vznik a vývoj experimentálního střevního zánětu

-lépe porozumět mechanismům působení bakteriálních komponent z Parabacteroides distasonis a porovnat ho s působením známé probiotické bakterie Lactobacillus casei DN-114 001 při stejných experimentálních podmínkách

-zjistit zda antibiotická léčba mění složení střevní mikroflóry a zda má vliv na závažnost experimentální kolitidy u konvečních a IRAK-M deficientních myší.

3.

3.1

MATERIÁL A METODY

PŘÍPRAVA BAKTERIÍ A JEJICH LYZÁTŮ

Lactobacillus casei DN-114 001 (Danone Institut, Francie), Lactobacillus plantarum CCDM 185 a Parabacteroides distasonis, byly kultivovány v anaerobní komoře v De Man, Rogosa a Sharpe agaru (Oxoid, Basingstoke, UK). Bakterie jsme z kultury získali centrifugací (4000x g, 30 minut) a následným promytím sterilním fosfátovým pufrem (PBS). K přípravě bakteriálního lyzátu byla použita metoda French press (přístroj k drcení buněk vysokým tlakem). Část lyzátu P. distasonis byla centrifugací (8500x g, 30 minut) rozdělena na frakci cytoplazmatickou (rozpustná) a membránovou (nerozpustná). Následně byly lyzáty a jejich frakce lyofilizovány a zředěny ve sterilním PBS na koncentraci 30g/l. Aby došlo k usmrcení všech bakterií, zahřáli jsme lyzáty na 60 °C po dobu 30 minut. Získané bakteriální lyzáty jsme použili k testování jejich účinků v modelu chemicky indukované kolitidy.

3

3.2

KOLONIZACE BEZMIKRÓBNÍCH MYŠÍ

Vyizolovali jsme obsah slepého střeva myší z firmy Taconic a jednotlivé alikvoty jsme zamrazili na -40°C. Bakteriální suspenzi jsme následně inokulovali bezmikróbním myším ve věku 1-3 týdnů.

3.3

ZVÍŘATA

K našim pokusům jsme použili myši kmene BALB/c a C57BL/6 (8-12 týdnů staré), myši s těžkým kombinovaným imunodeficitem BALB/cJHanHsd-SCID (SCID), bezmikróbní myši a IRAK-M -/- myši kmene C57BL/6.

3.4

INDUKCE A HODNOCENÍ ZÁNĚTU TLUSTÉHO STŘEVA

Imunokompetentní a imunodeficitní myši kmene BALB/c dostávaly složky bakterií v množství 1,5 mg na dávku v celkovém počtu 4 dávek na myš (1., 7., 14. a 21. den pokusu). Mezi jednotlivými dávkami byl odstup 7 dní. Sedm dní po poslední dávce jsme vyvolali akutní kolitidu podáváním 3% dextran sulfátu sodného (DSS; mol. hm. 36–50 kDa; MP Biomedicals) po dobu 8 dní. V průběhu pokusu jsme čtyřikrát (1., 14., 28. a 35. den) odebrali stolici pro detekci změn střevní mikroflóry. Při hodnocení akutní DSS kolitidy používáme standardní kritéria: zkrácení tlustého střeva, stupeň aktivity kolitidy (hubnutí, konzistence stolice a přítomnost krve ve stolici) a mikroskopické změny střevní stěny (tvorba vředů a infiltrace střevní stěny zánětlivými buňkami)(Cooper et al., 1993). K vyvolání chronické kolitidy myši dostali čtyři opakující se dávky DSS (Okayasu et al., 1990).

3.5

INDUKCE A HODNOCENÍ KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU

V experimentu byl použit zavedený model kolorektálního karcinomu Clapper et al. 2007 (Clapper et al., 2007). Myším kmene C57BL/6 byla subkutánně podána dávka azoxymethanu (10 mg/kg) a po týdnu jim byla na 4 dny vyměněna voda za 3% roztok DSS. Aby byl porovnán efekt při snížení obsahu bakterií ve střevě, byla jedné skupině myší po celou dobu pokusu podávána antibiotika (ciprofloxacin a metronidazol). Po 5 týdnech byly odebrány vzorky, byla změřena délka tlustého střeva a zvážena slezina. Distální část kolon a rektum byly poté hodnoceny histologicky a doplněny imunohistochemickým sta-

4

novením beta-kateninu a inducibilní NO syntázy. Koncentrace haptoglobinu byla stanovena pomocí ELISA testu v séru (GenWay Biotech., Inc).

3.6

STANOVENÍ POŠKOZENÍ BARIÉROVÉ FUNKCE STŘEVA

Měření střevní propustnosti in vivo Míru propustnosti střevní bariéry jsme měřili z krve detekcí fluorescence po podání dextranu konjugovaného s fluorochromem (FITC-dextran; mol. hm. 4400, Sigma-Aldrich) (Wang et al., 2001).. 440 mg FITC-dextranu na 1 kg myší váhy jsme rozpustili ve fyziologickém roztoku a pomocí gaváže ho podali myším kmene BALB/c. Koncentraci FITCdextranu v séru jsme změřili na spektrofluorimetru Safire (Tecan group Ltd., Švýcarsko) s excitační délkou 483 nm a emisní délkou 525 nm. Imunofluorescence Vybrané části kolon a terminálního ilea jsme ihned po odebrání zamrazili v tekutém dusíku a uložili do -80°C. Tkáňové kryořezy (6 µm) jsme inkubovali s králičí polyklonální protilátkou proti myšímu ZO-1 nebo okludinu. Po promytí jsme řezy inkubovali s protilátkou značenou fluorochromem (Texas Red nebo DyLight 488). Jádra buněk jsme obarvili DAPI. Nakonec jsme tkáňové řezy zamontovali a odečetli na fluorescenčním mikroskopu Olympus AX-70. Stanovení exprese mRNA pro ZO-1 a okludin ve střevě Střevní sliznici terminálního ilea a kolon jsme zamrazily ve stabilizačním roztoku – RNAlateru. Následně jsme z tkání izolovali celkovou RNA pomocí kitu RNAeasy Mini kit. Pomocí spektrofotometrie jsme změřili celkovou koncentraci RNA a ověřili její kvalitu. Kvantitativní PCR v reálném čase jsme provedli dle protokolu popsaném v publikaci Zanvit et al. 2010 (Zanvit et al., 2010)..Data byla analyzována pomocí Genex software verze 4.3.8.

3.7

MĚŘENÍ PRODUKCE CYTOKINŮ

Kultivace střevních kousků a stanovení cytokinů Části PP, ilea, céka a kolon jsme kultivovali po dobu 48 hodin při 37°C v 5% CO2 a RPMI mediu. Poté jsme v supernatantech stanovili koncentrace cytokinů TNF-α, IFN-γ, TGF-β, IL-10 a IL-6 pomocí komerčních kitů. Supernatanty byly také použity k detekci

5

cytokinů, chemokinů a růstových faktorů pomocí RayBioTM Mouse Cytokine Array II (Raybiotech, Inc.). Stanovení exprese mRNA cytokinů ve střevě Vzorky tkáně byly zpracovány jako viz Stanovení exprese mRNA pro ZO-1 a okludin ve střevě. K analýze byly použity sety pro stanovení genové exprese IL-10, IL-6, TNF-α a βaktin od Applied Biosystems. Stimulace mezenteriálních lymfocytů lipopolyssacharidem Mezenteriální uzliny jsme naředili pro kultivaci na koncentraci 1x106 buněk/mL. Buňky jsme aktivovali LPS izolovaným z Escherichia coli O26:B6 (Sigma-Aldrich), a poté jsme je kultivovali v 5% CO2 inkubátoru při 37°C po dobu 24 hodin. Koncentrace cytokinů v supernatantech jsme stanovili pomocí Th1/Th2 10plex FlowCytomix Multiplex (eBiosciences, Kanada).

3.8

STANOVENÍ SPECIFICKÝCH PROTILÁTEK

Specifické protilátky proti Lc a Pd jsme měřili v séru (třídy IgG, IgM, a IgA) a ve střevních výplaších (sekreční IgA; SIgA) pomocí nepřímé ELISA metody, kterou jsme optimalizovali v naší laboratoři.

3.9

STANOVENÍ AKTIVITY Β-GLUKURONIDÁZY

Celková β-glukuronidáza byla izolována ze vzorků stolice. Její enzymatická aktivita byla stanovena pomocí substrátu metabolizovaného na fluorescenční produkt, který jsme změřili na spektrofluorimetru (Tecan GmbH).

3.10 PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE Buněčné suspenze ze sleziny, MLN a PP jsme obarvili kitem pro stanovení intracelulárního znaku FoxP3 (eBioscience) v kombinaci s těmito protilátkami: CD3-FITC, CD4Qdot® 605, CD8-HorizonTM V500, CD25-APC a FoxP3-PE podle instrukcí daných výrobcem. Buňky RAW 264.7 jsme barvili protilátkami IL-7R-Alexa647, CD206-PE, CD11c-NC625 a F4/80-APC780. Značení pomocí Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) jsme použili ke stanovení životnosti buněk. Buněčné suspenze jsme změřili na přístroji LSRII (BD Biosciences) a data analyzovali programem FlowJo software (Tree Star Inc).

6

3.11 PROTIZÁNĚTLIVÉ VLASTNOSTI BAKTERIÁLNÍCH LYZÁTŮ STANOVENÉ IN VITRO Lipopolysacharidem aktivovaná linie makrofágů (RAW 264.7; ATCC TIB-71) byla kultivována s různými koncentracemi bakteriálních lyzátů. Makrofágy jsme kultivovali v 5% CO2 inkubátoru při 37°C po dobu 24 hodin v kompletním D-MEM mediu (SigmaAldrich). Koncentrace TNF-α v supernatantech jsme změřili pomocí ELISA testu (Invitrogen). Dále jsme vyizolovali jaderný extrakt a určili vazebnou aktivitu podjednotky p65 pomocí kitu TransAM NF-κB (Active Motif).

3.12 STANOVENÍ SLOŽENÍ STŘEVNÍ MIKROFLÓRY Ze vzorků stolice jsme vyizolovali celkovou DNA pomocí kitu ZR Fecal DNA KitTM (Zymo Research Corp.). Pomocí PCR se speciálními primery jsme získali značené sekvence bakteriální 16S rDNA. PCR produkt jsme pročistili pomocí magnetických kuliček (AMPure beads, Beckman Coulter Genomics). Stejné koncentrace výsledného produktu byly použity pro nepřímou 454 FLX pyrosekvenaci (Roche Diagnostics), pro denaturační gradientovou gelovou elektroforézu nebo pro kvantitativní PCR (Hufeldt et al., 2010).

3.13 STATISTICKÁ ANALÝZA Jednosměrná analýza rozptylu (ANOVA) s Dunnettovým srovnávacím testem byla použita ke srovnání pokusných skupin se skupinou kontrolní. Rozdíly mezi dvěma skupinami byly vyhodnoceny nepárovým studentským T-testem. Pokud není určeno jinak, výsledná data jsou znázorněna jako průměr ± standardní odchylka a rozdíly byly označeny jako signifikantní pokud P ≤ 0.05. K vyhodnocování byl použit statistický software GraphPad Prism (verze 5.0, GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA).

4. VÝSLEDKY The role of gut microbiota (commensal bacteria) and the mucosal barrier in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases and cancer: contribution of germ-free and gnotobiotic animal models of human diseases. Tlaskalová-Hogenová H, Stěpánková R, Kozáková H, Hudcovic T, Vannucci L, Tučková L, Rossmann P, Hrnčíř T, Kverka M, Zákostelská Z, Klimešová K, Přibylová J, Bártová J, Sanchez D, Fundová P, Borovská D, Srůtková D, Zídek Z, Schwarzer M, Drastich P, Funda DP. Cell Mol Immunol. 2011 Mar;8(2):110-20. Epub 2011 Jan 31. Recenze. 7

V této kapitole se zabýváme vztahem mezi hostitelem a jeho střevní mikroflórou v souvislosti s funkčními studiemi a metagenomickým přístupem. Pomocí zvířecích modelů lidských onemocnění indukovaných v podmínkách různé mikrobiální zátěže popisujeme přímou spojitost mezi mikroflórou a rozvojem určitých onemocnění.

Patterns of early gut colonization shape future immune responses of the host. Hansen CH, Nielsen DS, Kverka M, Zakostelska Z, Klimesova K, Hudcovic T, TlaskalovaHogenova H, Hansen AK. PLoS One. 2012;7(3):e34043. Epub 2012 Mar 27.

V této práci se zabýváme vlivem časného bakteriálního osídlení bezmikrobních zvířat a následných změn způsobených kolonizací na vývoj imunitního systému.

- Prokázali jsme, že inokulace bezmikróbních myší ve věku tří týdnů jedinou dávkou bakteriální suspenze vede k trvalým změnám ve složení střevní mikroflóry. Tyto změny jsme nepozorovali po inokulaci týdenních bezmikróbních myší. - Inokulované třítýdenní bezmikróbní myši také jako jediné vykazovaly zvýšenou prozánětlivou imunitní reakci. - Bezmikróbní myši, které byly kolonizovány pomocí společného chovu s myšmi s mikroflórou bez specifických patogenů v různých časových obdobích, měly následně stejné složení střevní mikroflóry jako myši s mikroflórou bez specifických patogenů. - Existuje přítomnost krátkého postnatálního období u bezmikrobních myší, během kterého kolonizace permanentně změní zastoupení T regulačních buněk, NK a NKT buněk a produkci cytokinovů.

Naše data ukazují na přítomnost ,,časového okna”, během kterého je možná artificiální kolonizace pomocí jediné dávky suspenze obsahu slepého střeva, která ovlivní následný vývoj imunitního systému jedince.

Oral administration of Parabacteroides distasonis antigens attenuates experimental murine colitis through modulation of immunity and microbiota composition. Kverka M, Zakostelska Z, Klimesova K, Sokol D, Hudcovic T, Hrncir T, Rossmann P, Mrazek 8

J, Kopecny J, Verdu EF, Tlaskalova-Hogenova H. Clin Exp Immunol. 2011 Feb;163(2):250-9. doi: 10.1111/j.1365-2249.2010.04286.x. Epub 2010 Nov 19.

Na modelu akutní kolitidy indukované 3% DSS jsme prokázali, že preventivní perorální podávání bakteriálního lyzátu běžné střevní komensální bakterie – Parabacteroides distasonis, zmírňuje průběh následně vyvolaného střevního zánětu u myší kmene BALB/c.

- Orální podávání bakteriálního lyzátu P. distasonis ovlivňuje průběh střevního zánětu. Mezi mechanismy tohoto působení patří modulace nespecifické i specifické imunitní odpovědi. - Orální podávání membránové frakce bakteriálního lyzátu P. distasonis zvyšuje hladiny specifických protilátek v séru, zvyšuje počty T regulačních buněk a mění složení střevní mikroflóry. Tyto efekty jsme neprokázali u imunodeficitních myší kmene SCID. - Protektivní efekt získaný perorálním podáváním membránové frakce bakteriálního lyzátu P. distasonis je možné přenést krevním sérem do naivních imunokompetentních myší. - Lipolysacharidem stimulované makrofágy linie RAW 264.7 po kultivaci s membránovou frakcí bakteriálního lyzátu P. distasonis produkují méně TNF-α.

Naše studie naznačuje, že určité komponenty střevních komensalních bakterií (membrány P. distasonis) mohou být užitečné při vývoji nových přístupů v léčbě chronických zánětlivých onemocnění, jakými jsou i nespecifické střevní záněty.

Lysate of probiotic Lactobacillus casei DN-114 001 ameliorates colitis by strengthening the gut barrier function and changing the gut microenvironment. Zakostelska Z, Kverka M, Klimesova K, Rossmann P, Mrazek J, Kopecny J, Hornova M, Srutkova D, Hudcovic T, Ridl J, Tlaskalova-Hogenova H. PLoS One. 2011;6(11):e27961. Epub 2011 Nov 22.

Cílem naší studie byla analýza působení lyzátu probiotické bakterie L. casei DN-114 001 (Lc) na průběh a tíži střevního zánětu v myším modelu IBD doplněná identifikací některých základních mechanismů. 9

- Preventivní perorální podávání lyzátu Lc významně snižuje tíži akutní DSS kolitidy u imunokompetentních BALB/c myší, ale je neúčinné u myší s imunodeficitem (SCID- myši s těžkým kombinovaným imunodeficitem). - Preventivní perorální podávání Lc chrání slizniční bariéru před poškozením způsobeným DSS. V zapojených mechanismech se uplatňuje ochrana těsných spojení (ZO-1 exprese) s následně naměřenou nižší střevní permeabilitou při srovnání s neléčenými myšmi. - Podávání Lc zvyšuje počty T regulačních buněk (CD4+CD25+FoxP3+) v MLN a snižuje produkci prozánětlivých cytokinů TNF-α a IFN-γ a protizánětlivého cytokinu IL-10 v PP a tlustém střevě. - Perorální podávání Lc signifikantně mění složení střevní mikroflóry v průběhu DSS kolitidy, kdy u léčených myší dochází k stabilizaci a zvýšení podílu laktobacilů ve střevním obsahu. - Lipopolysacharidem stimulované makrofágy linie RAW 264.7 po kultivaci s lyzátem Lc produkují méně TNF-α a mají nižší aktivitu prozánětlivé signalizační dráhy NF-κB. Lyzát Lc také polarizuje makrofágy do fenotypu M2.

Naše studie přinesla důkazy o tom, že i podávání neživých probiotických bakterií chrání před vznikem těžké akutní kolitidy v myším modelu. V mechanismech se uplatňuje posílení střevní bariéry a změna jak ve složení střevní mikroflóry tak v reaktivitě slizničního imunitního systému. Využití sterilních lyzátů probiotických bakterií v prevenci a léčbě tedy přináší nové a bezpečnější postupy pro těžce nemocné nebo inumokompromitované pacienty. Altered gut microbiota promotes colitis-associated cancer in IL-1 receptorassociated kinase M deficient mice.Klimesova K, Kverka M, Zakostelska Z, Hudcovic T, Hrncir T, Stepankova R, Rossmann P, Ridl J, Kostovcik M, Mrazek J, Kopecny J, Kobayashi K S, Tlaskalova – Hogenova H, Odesláno k recenzi do IBD

Tato studie se zabývá rolí negativní regulace TLR signalizace a střevní mikroflóry ve vývoji kolorektálního karcinomu v myším modelu.

10

- Podávání ATB konvenčním myším snížilo incidenci i velikost nádorů na úroveň srovnatelnou s bezmikróbními myšmi. Myši, které nevyvinuly nádor, měly signifikantně nižší počty T regulačních lymfocytů, změněné složení střevní mikroflóry a sníženou aktivitu β-glukuronidázy ve střevě. - IRAK-M -/- myši nejen, že vyvinuly invazivní nádory, ale navíc podávání ATB, které snížilo aktivitu β-glukuronidázy, nedokázalo omezit jejich tvorbu. Navíc IRAK-M -/- myši produkovaly signifikantně vyšší hladiny prozánětlivých cytokinů v nádorové tkáni než myši konvenční.

Z naší studie je patrný značný vliv mikroflóry na nádorovou přeměnu ve střevě. Metabolismus bakterií přispívá k transformaci prokarcinogenů, a tím umožňuje a prodlužuje jejich působení na střevní sliznici. Regulační efekt negativního regulátoru TLR signalizace – IRAK-M v buněčných drahách podporujících vznik zánětu a nádoru je esenciální pro rezistenci vůči nádorové indukci. Mikroflóra a její metabolismus tedy představují možné cíle pro prevenci a léčbu kolorektálního karcinomu.

5. DISKUZE 5.1 MIKROBIÁLNÍ EXPOZICE BĚHEM NEONATÁLNÍHO VÝVOJE MÁ TRVALÝ ÚČINEK NA IMUNITNÍ STAV HOSTITELE Význam komensálních bakterií na vývoj imunitního systému je nejlépe ukázán na bezmikrobních myších, které vyrůstají v prostředí prostém bakterií. Studie na lidích a gnotobiologických hlodavcích z poslední doby ukazují, že vliv bakterií na vývoj imunitního systému je trvalý a může ovlivnit zdravotní stav hostitele. Tyto účinky jsou obnovitelné a závislé na věku hostitele, což je demonstrováno tím,že pouze bezmikrobní neonatální ale už ne bezmikrobní dospělá myš po kolonizaci je schopná vykazovat normální počty iNKT buněk (Olszak et al., 2012). Naše práce se zabývá vlivem kolonizace a obdobím ,kdy ke kolonizaci u bezmikrobních myší dochází. U myší existuje takzvané časové okno ve věku tří týdnů, které je patrně způsobeno zvýšením redoxního potenciálu, změnami v peristaltice a v sekreci, dietou (Mackie et al., 1999), nebo také možná protektivním účinkem kojení a jedna jedinná bakteriální dávka potřebná ke kolonizaci není dostatečná k ovlivnění hostitele(Newburg and Walker, 2007). Jako mnoho dalších (Ivanov et al., 2008) jsme i 11

my popsali, že kolonizace v pozdějším věku ale ne způsob kolonizace zapříčinuje trvalé změny v reaktivitě imunitního systému např. v počtech tolerogenních dendritických buněk, T regulačních buněk, iNKT buněk a vmnožství produkovaných cytokinů.(Olszak et al., 2012). Tato tvrzení jsou v souladu s tím, že střevo novorozeněte je nematurované a při reakci na antigenní stimuly preferuje ustanovení regulačních mechanismů (Mold et al., 2008; Sudo et al., 1997). Tyto efekty mohou výrazně ovlivnit pokusy, které byly provedeny na první generaci kolonizovaných zvířat. Navíc ne pouze mikrobiota, ale také obsah bakteriálních komponent v dietě a také snížený obsah LPS v dietě má výrazný vliv na vývoj a funkci imunitního systému a to hlavně na produkci B a T buněk v Peyerských plátech a mezenteriálních lymfatických uzlinách (Hrncir et al., 2008). Dále stojí za to zdůraznit, že složení diety stejně jako přítomnost či absence různých bakteriálních druhů može být důležitým faktorem, který ovlivnuje hostitele (Gaboriau-Routhiau et al., 2009; Stepankova et al., 2007).

5.2 VLIV INTERAKCE MEZI HOSTITELEM A STŘEVNÍ MIKROFLÓROU NA VÝVOJ STŘEVNÍHO ZÁNĚTU A KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU Pozměněné složení a funkce střevní mikroflóry u nespecifických střevních zánětů má za následek zvýšenou stimulaci imunitního systému, dysfunkci epitelií a zvýšenou střevní propustnost. Navíc zvýšená střevní propustnost hraje důležitou roli u mnoha dalších onemocnění. V současné době je všeobecně přijímáno, že střevní mikroflóra ovlivňuje naše zdraví, avšak na hlavní objevy týkající se tohoto tématu se ještě čeká. K tomu abychom snáze dokázali odpovědět na otázky týkající se střevní mikroflóry a jejího vlivu na zdraví a onemocnění hostitele je velice důležité kombinovat použití geneticky manipulovatelných a gnotobiologických modelů. Tento přístup má potenciál poskytnout nové informace o způsobu jakým bakterie ovlivńují vývoj, vytvoření a udržení slizničního imunitního systému a funkci epitelií. Myslíme si, že bezmikrobní a geneticky manipulovatelná zvířata nám pomohou odhalit patogenezi infekčních a chronicky zánětlivých onemocnění. V této práci jsme popsali, že lyzát myší komensální bakterie Parabacteroides distasonis a jeho frakce ovlivńují střevní zánět. Ačkoliv zástupce rodu bacteroides jsou známy jako bakterie prozánětlivé (Swidsinski et al., 2002), v naší práci se ukázal bakteriální

12

lyzát a hlavně jeho membránová frakce jako úspěšný nástroj k potlačení experimentálního střevního zánětu. Cytoplazmatická frakce tento protektivní účinek nevykazovala, proto se domníváme, že hlavní komponenta, která způsobuje tento efekt, bude součástí membránové frakce. Naším cílem je nyní najít a charakterizovat konkrétní molekulu zodpovědnou za tento efekt. Dále jsme prokázali, že známé probiotikum Lactobacillus casei DN-114 001 respektivě jeho buněčný lyzát má také protektivní účinek na DSS kolitidu, ale funguje trochu jiným způsobem. Toto tvrzení je souladu se současnými poznatky, které poukazují na rozdíly v působení jednotlivých kmenů (Yan and Polk, 2010). Také způsob podání je velmi důležitý. U obou námi testovaných bakteriálních lyzátů jsme dosáhli léčebného účinku pouze v preventivním léčebném schématu tzn. ne při chronické kolitidě. Toto pozorování je v souladu s literaturou, která dokumentuje, že prevence v experimentálním střevním zánětu se dosahuje daleko lépe než léčba již rozvinutého onemocnění. (Obermeier et al., 2003). Dále jsme prezentovali , že nejenom živé bakterie ,ale i bakteriální lyzáty mohou snižovat závažnost experimentálního střevního zánětu. Toto tvrzení je podpořeno dalšími pracemi, které popisují, že metabolity bakterií mají vliv na střevní homeostázu a barierovou funkci střeva. Tyto studie nám ukazují, že bakteriální komponenty mohou mít stejné protektivní účinky jako probiotika a mohou tak být bezpečnější variantou při léčbě onemocnění. Jako první jsme ukázali, že podávání bakteriálních lyzátů ovlivńuje složení střevní mikroflóry a tyto změny jsou v přímé korelaci se závažností onemocnění, tyto studie byly zatím prováděny pouze s živými bakteriemi (Uronis et al., 2011). Zdá se, že každý bakteriální lyzát má odlišný účinek. Lyzát mPd zabraňuje změnám ve střevní mikroflóře způsobenými DSS. Lc podporuje růst kmene Lactobacillus ve střevě. Můžeme předpokládat, že tyto změny ve střevní mikroflóře mají za následek zlepšení barierové funkce střeva a snížení náchylnosti ke střevnímu zánětu a mohou být způsobeny například aktivními produkty bakterií jako například laktát a butyrát jak již bylo popsáno v pracích zabývajících se Propionibacterium freudenreichii and Faecalibacterium prausnitzii (Okada et al., 2006; Sokol et al., 2008). Dále je možné, že tyto změny mohou být pouze následkem zlepšení zánětu. Popsali jsme, že bakteriální lyzát Lc polarizuje makrofágy do M2 fenotypu. Dále že oba naše lyzáty mají schopnost snižovat produkci TNF-α u makrofágů aktivovaných lipopolyssacharidem a tlumit signální dráhu NF-κB. 13

U nespecifických střevních zánětů hraje důležitou roli poškozená střevní bariéra (Laukoetter et al., 2008), ale není doposud jisté zda je následkem dané choroby nebo její příčinou. V této práci jsme popsali, že bakteriální lyzát může snižovat střevní propustnost a zvyšovat expresi těsných spojů ZO-1 a okludinu. Tyto výsledky jsou v souladu s prací, která popisuje protektivní vliv živé i tepelně inaktivované bakterie L. rhamnosus OLL2838 na udržení střevní bariéry v modelu DSS kolitidy.Bylo by velmi zajímavé kdyby se v budoucnosti podařilo začlenit probiotické lyzáty do klinických pokusů Indukce orální tolerance na antigeny z potravy je zásadní pro udržení střevní homeostázy. Na tento mechanismus má vliv hlavně nespecifická imunita a inhibiční signální dráhy, zejména v časných fázích ontogenetického vývoje (Biswas et al., 2011). Stejně důležitá je v tomto procesu i adaptivní imunita (Barnes and Powrie, 2009), hlavně T regulační buńky (Hrncir et al., 2008; Singh et al., 2001). Mnoho prací popisuje působení probiotik prostřednictvím T regulačních buněk. Probiotická směs obsahující lactobacilli IRT5 indukuje aktivaci T regulačních buněk v zánětlivých lézích v modelu experimentální střevní kolitidy, atopické dermatitidy a revmatoidní artritidy. Podávání živé bakterie L. casei zároveň s kolagenem může podporovat vznik orální tolerance, která vede ke zvýšení koncentrace T regulačních buněk v experimentálním modelu artritidy, samotný L. casei tento účinek nemá (So et al., 2008). Také léčebné podávání probiotické směsi, která obsahuje lactobacilli zmírní experimentální autoimunitní encefalomyelitidu skrze regulaci produkce systémoveho IL-10 a indukcí T regulačních buněk v mezenteriálních lymfatických uzlinách a na periferii (Lavasani et al., 2010). Orální tolerance je jednodušší dosáhnout s mrtvými nebo inaktivovanými bakteriemi (Rubin et al., 1981), z tohoto důvodu jsme se rozhodli změřit změny v zastoupení T regulačních buněk po podání Lc a mPd. Naše výsledky potvrdily, že léčba mrtvými bakteriemi a jejich komponentami zvyšuje produkci T regulačních buněk v mezenteriálních lymfatických uzlinách jak již bylo popsáno v našich předchozích studiích (Hrncir et al., 2008) . Abychom lépe objasnili roli adaptivní imunity po podávání lyzátů, studovali jsme její vlivna myších kmene SCID, které nemají T a B lymfocyty. Ačkoliv závažnostexperimentálního střevního zánětu u SCID myší byla stejná jako u myší imunokompetentních (Dieleman et al., 1994; Hudcovic et al., 2001), nepozorovali jsme žádný preventivní efekt po podání Lc a mPd. Jedním z omezení při srovnání BALB/c a SCID myší, kromě imunodeficience, jsou také rozdíly ve složení střevní mikroflory a aktivitě imunitních buněk přirozené imunity (Keilbaugh et al., 2005). Jak jsme už naznačili v našich in vitro experimentech, buńky 14

přirozené imunity hrají důležitou roli v efektu Lc a mPd nicméně pokusy na SCID myších a indukce T regulačních buněk v MLN ukazují , že i imunita adaptivní bude mít nezastupitelnou roli v tomto protektivním efektu.

5.3 SNÍŽENÁ BAKTERIÁLNÍ ZÁTĚŽ CHRÁNÍ PŘED KOLITIDOU ASOCIOVANOU S KOLOREKTÁLNÍM KARCINOMEM

Naše experimenty na modelu střevního zánětu asociovaného s kolorektálním karcinomem ukázaly, že střevní homeostáza a vznik kolorektálního karcinomu jsou ovlivněny přítomností komensálních bakterií a složením střevní mikroflóry. V našem experimentálním modelu karcenogeneze jsme schopni změnit složení střevní mikroflóry (snížit počet bakterií ve střevě) a následný vývoj karcinomu pomocí snížení lokální produkce β- glukoronidázy, která je způsobena změnou složení střevní mikroflóry po léčbě antibiotiky. Tato změna vede ke snížení expozice střevní sliznice karcinogenům. Prokázali jsme, že snížený výskyt nádorů je spjat se změnami v mikroflóře, jako je například zvýšení počtu kmene Bacteroidetes a snížení Firmicutes a Proteobacteria. Poškozená regulace ve střevě zvyšuje aktivaci sliznice a systémové imunitní reakce a má za následek chronickou prozánětlivou stimulaci, která vede k masivnímu nárůstu nádorů. Zajímavým zjištěním je, že IRAK-M deficitní myši potlačují imunitní reakci prostřednictvím T regulačních buněk, která vede k masivnímu nárůstu nádorů Berglund et al. (2010) (Berglund et al., 2010). V budoucnu by individuální manipulace se složením střevní mikroflóry mohla být slibnou strategií v léčbě a prevenci kolorektálního karcinomu a nespecifických střevních zánětů..

6. ZÁVĚR Stále narůstající počet in vitro a in vivo studií ukazuje protektivní účinek probiotik a komenzálních bakterií. Avšak další studie jsou potřeba, protože je důležité pořádně prozkoumat každé onemocnění,etnickou skupinu, dávkování, vhodnou růstovou fázi bakterií atd. Neživé bakterie nebo jejich komponenty mají oproti živým bakteriím tu výhodu, že se dají déle uchovávat a jsou bezpečnější při podávání malým dětem a imunokompromitovaným pacientům. Z našich studií dále vyplývá, že léčba skrze modulaci střevní mik-

15

roflóry nebude vhodná pro všechny pacienty a půjde použít jen do určitého věku člověka. V úvahu musí být také brána specifita každého kmene a každý kmen se musí náležitě otestovat. Další lidské studie musí být vždy pečlivě navrhnuty a to jak výběr vhodného kmene, dávkování , způsob dávkování a dále musí ošetřeny všechny možné rizikové faktory nežádoucích účinků (Besselink et al., 2008). Zatímco jsme se jen zlehka dotkli tohoto zajímavého tématu další a další funkce různých druhů jsou kontinuálně objevovány. Naše dvě studie týkající se bakteriálních lyzátů jasně ukazují, jaký může být účinek v jedné jediné bakterii. V našich budoucích studiích se zaměříme na detailní odhalování těchto mechanismu. Vzájemný vztah mezi mikroflorou a hostitelem a jeho vlivem na slizniční imunitní systém byl jedním diskutovaných témat této práce. Dalšími tématem byl efekt časné kolonizace na imunitní odpověd hostitele, interakce hostitele s bakteriálními lyzáty a jejich použití při léčbě nespecifických střevních zánětů a kolorektálního karcinomu a bakteriální lyzáty mohou být použity k úpravě narušené střevní mikroflóry po podání antibiotik. Probiotická léčba může být v budoucnu přirozený a levný způsob jak ovlivnit imunitní systém, metabolismus a celkový zdravotní stav hostitele bez nutnosti použití syntetických léčebných přípravků s jejich nežádoucími účinky.

16

7. REFERENCE Adlerberth, I., and Wold, A. E. (2009). Establishment of the gut microbiota in Western infants. Acta Paediatr 98, 229-238. Barnes, M. J., and Powrie, F. (2009). Regulatory T cells reinforce intestinal homeostasis. Immunity 31, 401-411. Besselink, M. G., van Santvoort, H. C., Buskens, E., Boermeester, M. A., van Goor, H., Timmerman, H. M., Nieuwenhuijs, V. B., Bollen, T. L., van Ramshorst, B., Witteman, B. J., et al. (2008). Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet 371, 651-659. Bibiloni, R., Fedorak, R. N., Tannock, G. W., Madsen, K. L., Gionchetti, P., Campieri, M., De Simone, C., and Sartor, R. B. (2005). VSL#3 probiotic-mixture induces remission in patients with active ulcerative colitis. Am J Gastroenterol 100, 1539-1546. Biswas, A., Wilmanski, J., Forsman, H., Hrncir, T., Hao, L., Tlaskalova-Hogenova, H., and Kobayashi, K. S. (2011). Negative regulation of Toll-like receptor signaling plays an essential role in homeostasis of the intestine. Eur J Immunol 41, 182-194. Clapper, M. L., Cooper, H. S., and Chang, W. C. (2007). Dextran sulfate sodium-induced colitis-associated neoplasia: a promising model for the development of chemopreventive interventions. Acta Pharmacol Sin 28, 1450-1459. Cooper, H. S., Murthy, S. N., Shah, R. S., and Sedergran, D. J. (1993). Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Lab Invest 69, 238-249. Dieleman, L. A., Ridwan, B. U., Tennyson, G. S., Beagley, K. W., Bucy, R. P., and Elson, C. O. (1994). Dextran sulfate sodium-induced colitis occurs in severe combined immunodeficient mice. Gastroenterology 107, 1643-1652. FAO/WHO (2001). Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria. In, (Cordoba (Argentina): Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization), p. 34. Gaboriau-Routhiau, V., Rakotobe, S., Lecuyer, E., Mulder, I., Lan, A., Bridonneau, C., Rochet, V., Pisi, A., De Paepe, M., Brandi, G., et al. (2009). The key role of segmented filamentous bacteria in the coordinated maturation of gut helper T cell responses. Immunity 31, 677-689. Gupta, P., Andrew, H., Kirschner, B. S., and Guandalini, S. (2000). Is lactobacillus GG helpful in children with Crohn's disease? Results of a preliminary, open-label study. J Pediatr Gastroenterol Nutr 31, 453457. Hrncir, T., Stepankova, R., Kozakova, H., Hudcovic, T., and Tlaskalova-Hogenova, H. (2008). Gut microbiota and lipopolysaccharide content of the diet influence development of regulatory T cells: studies in germ-free mice. BMC Immunol 9, 65. Hudcovic, T., Stepankova, R., Cebra, J., and Tlaskalova-Hogenova, H. (2001). The role of microflora in the development of intestinal inflammation: acute and chronic colitis induced by dextran sulfate in germfree and conventionally reared immunocompetent and immunodeficient mice. Folia Microbiol (Praha) 46, 565-572. Hufeldt, M. R., Nielsen, D. S., Vogensen, F. K., Midtvedt, T., and Hansen, A. K. (2010). Variation in the gut microbiota of laboratory mice is related to both genetic and environmental factors. Comp Med 60, 336-347. Ivanov, II, Frutos Rde, L., Manel, N., Yoshinaga, K., Rifkin, D. B., Sartor, R. B., Finlay, B. B., and Littman, D. R. (2008). Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe 4, 337-349. Keilbaugh, S. A., Shin, M. E., Banchereau, R. F., McVay, L. D., Boyko, N., Artis, D., Cebra, J. J., and Wu, G. D. (2005). Activation of RegIIIbeta/gamma and interferon gamma expression in the intestinal tract of SCID mice: an innate response to bacterial colonisation of the gut. Gut 54, 623-629. Kverka, M., Zakostelska, Z., Klimesova, K., Sokol, D., Hudcovic, T., Hrncir, T., Rossmann, P., Mrazek, J., Kopecny, J., Verdu, E. F., and Tlaskalova-Hogenova, H. Oral administration of Parabacteroides distasonis antigens attenuates experimental murine colitis through modulation of immunity and microbiota composition. . Clin Exp Immunol, in press. Laukoetter, M. G., Nava, P., and Nusrat, A. (2008). Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. World J Gastroentero 14, 401-407.

17

Lavasani, S., Dzhambazov, B., Nouri, M., Fak, F., Buske, S., Molin, G., Thorlacius, H., Alenfall, J., Jeppsson, B., and Westrom, B. (2010). A novel probiotic mixture exerts a therapeutic effect on experimental autoimmune encephalomyelitis mediated by IL-10 producing regulatory T cells. Plos One 5, e9009. Lebeer, S., Vanderleyden, J., and De Keersmaecker, S. C. (2010). Host interactions of probiotic bacterial surface molecules: comparison with commensals and pathogens. Nat Rev Microbiol 8, 171-184. Mackie, R. I., Sghir, A., and Gaskins, H. R. (1999). Developmental microbial ecology of the neonatal gastrointestinal tract. Am J Clin Nutr 69, 1035S-1045S. Mold, J. E., Michaelsson, J., Burt, T. D., Muench, M. O., Beckerman, K. P., Busch, M. P., Lee, T. H., Nixon, D. F., and McCune, J. M. (2008). Maternal alloantigens promote the development of tolerogenic fetal regulatory T cells in utero. Science 322, 1562-1565. Newburg, D. S., and Walker, W. A. (2007). Protection of the neonate by the innate immune system of developing gut and of human milk. Pediatr Res 61, 2-8. Obermeier, F., Dunger, N., Strauch, U. G., Grunwald, N., Herfarth, H., Scholmerich, J., and Falk, W. (2003). Contrasting activity of cytosin-guanosin dinucleotide oligonucleotides in mice with experimental colitis. Clin Exp Immunol 134, 217-224. Okada, Y., Tsuzuki, Y., Miyazaki, J., Matsuzaki, K., Hokari, R., Komoto, S., Kato, S., Kawaguchi, A., Nagao, S., Itoh, K., et al. (2006). Propionibacterium freudenreichii component 1.4-dihydroxy-2naphthoic acid (DHNA) attenuates dextran sodium sulphate induced colitis by modulation of bacterial flora and lymphocyte homing. Gut 55, 681-688. Okayasu, I., Hatakeyama, S., Yamada, M., Ohkusa, T., Inagaki, Y., and Nakaya, R. (1990). A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology 98, 694-702. Olszak, T., An, D., Zeissig, S., Vera, M. P., Richter, J., Franke, A., Glickman, J. N., Siebert, R., Baron, R. M., Kasper, D. L., and Blumberg, R. S. (2012). Microbial exposure during early life has persistent effects on natural killer T cell function. Science 336, 489-493. Packey, C. D., and Sartor, R. B. (2009). Commensal bacteria, traditional and opportunistic pathogens, dysbiosis and bacterial killing in inflammatory bowel diseases. Curr Opin Infect Dis 22, 292-301. Petnicki-Ocwieja, T., Hrncir, T., Liu, Y. J., Biswas, A., Hudcovic, T., Tlaskalova-Hogenova, H., and Kobayashi, K. S. (2009). Nod2 is required for the regulation of commensal microbiota in the intestine. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 15813-15818. Probert, C. S., Williams, A. M., Stepankova, R., Tlaskalova-Hogenova, H., Phillips, A., and Bland, P. W. (2007). The effect of weaning on the clonality of alpha beta T-cell receptor T cells in the intestine of GF and SPF mice. Dev Comp Immunol 31, 606-617. Reiff, C., Delday, M., Rucklidge, G., Reid, M., Duncan, G., Wohlgemuth, S., Hormannsperger, G., Loh, G., Blaut, M., Collie-Duguid, E., et al. (2009). Balancing inflammatory, lipid, and xenobiotic signaling pathways by VSL#3, a biotherapeutic agent, in the treatment of inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis 15, 1721-1736. Rubin, D., Weiner, H. L., Fields, B. N., and Greene, M. I. (1981). Immunologic tolerance after oral administration of reovirus: requirement for two viral gene products for tolerance induction. J Immunol 127, 1697-1701. Sartor, R. B. (2006). Mechanisms of disease: pathogenesis of Crohn's disease and ulcerative colitis. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 3, 390-407. Servin, A. L. (2004). Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria against microbial pathogens. FEMS Microbiol Rev 28, 405-440. Sheil, B., Shanahan, F., and O'Mahony, L. (2007). Probiotic effects on inflammatory bowel disease. J Nutr 137, 819S-824S. Singh, B., Read, S., Asseman, C., Malmstrom, V., Mottet, C., Stephens, L. A., Stepankova, R., Tlaskalova, H., and Powrie, F. (2001). Control of intestinal inflammation by regulatory T cells. Immunol Rev 182, 190-200. So, J. S., Kwon, H. K., Lee, C. G., Yi, H. J., Park, J. A., Lim, S. Y., Hwang, K. C., Jeon, Y. H., and Im, S. H. (2008). Lactobacillus casei suppresses experimental arthritis by down-regulating T helper 1 effector functions. Mol Immunol 45, 2690-2699. Sokol, H., Pigneur, B., Watterlot, L., Lakhdari, O., Bermudez-Humaran, L. G., Gratadoux, J. J., Blugeon, S., Bridonneau, C., Furet, J. P., Corthier, G., et al. (2008). Faecalibacterium prausnitzii is an antiinflammatory commensal bacterium identified by gut microbiota analysis of Crohn disease patients. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 16731-16736.

18

Stepankova, R., Powrie, F., Kofronova, O., Kozakova, H., Hudcovic, T., Hrncir, T., Uhlig, H., Read, S., Rehakova, Z., Benada, O., et al. (2007). Segmented filamentous bacteria in a defined bacterial cocktail induce intestinal inflammation in SCID mice reconstituted with CD45RBhigh CD4+ T cells. Inflamm Bowel Dis 13, 1202-1211. Sudo, N., Sawamura, S., Tanaka, K., Aiba, Y., Kubo, C., and Koga, Y. (1997). The requirement of intestinal bacterial flora for the development of an IgE production system fully susceptible to oral tolerance induction. J Immunol 159, 1739-1745. Swidsinski, A., Ladhoff, A., Pernthaler, A., Swidsinski, S., Loening-Baucke, V., Ortner, M., Weber, J., Hoffmann, U., Schreiber, S., Dietel, M., and Lochs, H. (2002). Mucosal flora in inflammatory bowel disease. Gastroenterology 122, 44-54. Uronis, J. M., Arthur, J. C., Keku, T., Fodor, A., Carroll, I. M., Cruz, M. L., Appleyard, C. B., and Jobin, C. (2011). Gut microbial diversity is reduced by the probiotic VSL#3 and correlates with decreased TNBS-induced colitis. Inflamm Bowel Dis 17, 289-297. Verdu, E. F., Bercik, P., Cukrowska, B., Farre-Castany, M. A., Bouzourene, H., Saraga, E., Blum, A. L., Corthesy-Theulaz, I., Tlaskalova-Hogenova, H., and Michetti, P. (2000). Oral administration of antigens from intestinal flora anaerobic bacteria reduces the severity of experimental acute colitis in BALB/c mice. Clin Exp Immunol 120, 46-50. Wang, Q., Fang, C. H., and Hasselgren, P. O. (2001). Intestinal permeability is reduced and IL-10 levels are increased in septic IL-6 knockout mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 281, R1013-1023. Williams, A. M., Probert, C. S., Stepankova, R., Tlaskalova-Hogenova, H., Phillips, A., and Bland, P. W. (2006). Effects of microflora on the neonatal development of gut mucosal T cells and myeloid cells in the mouse. Immunology 119, 470-478. Yan, F., and Polk, D. B. (2010). Probiotics: progress toward novel therapies for intestinal diseases. Curr Opin Gastroenterol 26, 95-101. Zanvit, P., Tichopad, A., Havlickova, M., Novotna, O., Jirkovska, M., Kolostova, K., Cechova, D., Julak, J., Sterzl, I., and Prokesova, L. (2010). Adjuvant effect of Bacillus firmus on the expression of cytokines and toll-like receptors in mouse nasopharynx-associated lymphoid tissue (NALT) after intranasal immunization with inactivated influenza virus type A. Immunol Lett 134, 26-34.

8. PUBLIKACE Publikace in extenso, které jsou podkladem disertace: Klimesova K, Kverka M, Zakostelska Z, Hudcovic T, Hrncir T, Stepankova R, Rossmann P, Ridl J, Kostovcik M, Mrazek J, Kopecny J, Kobayashi K S, Tlaskalova – Hogenova H, Altered gut microbiota promotes colitis-associated cancer in IL-1 receptorassociated kinase M deficient mice. Odesláno k recenzi do IBD

Hansen CH, Nielsen DS, Kverka M, Zakostelska Z, Klimesova K, Hudcovic T, Tlaskalova-Hogenova H, Hansen AK. Patterns of early gut colonization shape future immune responses of the host. PLoS One. 2012;7(3):e34043. Epub 2012 Mar 27. IF2011= 4,092 Zakostelska Z, Kverka M, Klimesova K, Rossmann P, Mrazek J, Kopecny J, Hornova M, Srutkova D, Hudcovic T, Ridl J, Tlaskalova-Hogenova H. Lysate of probiotic Lac-

19

tobacillus casei DN-114 001 ameliorates colitis by strengthening the gut barrier function and changing the gut microenvironment. PLoS One. 2011;6(11):e27961. Epub 2011 Nov 22. IF2011= 4,092 Tlaskalová-Hogenová H, Stěpánková R, Kozáková H, Hudcovic T, Vannucci L, Tučková L, Rossmann P, Hrnčíř T, Kverka M, Zákostelská Z, Klimešová K, Přibylová J, Bártová J, Sanchez D, Fundová P, Borovská D, Srůtková D, Zídek Z, Schwarzer M, Drastich P, Funda DP. The role of gut microbiota (commensal bacteria) and the mucosal barrier in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases and cancer: contribution of germ-free and gnotobiotic animal models of human diseases. Cell Mol Immunol. 2011 Mar;8(2):110-20. Epub 2011 Jan 31. Review. IF2011= 2,992 Kverka M, Zakostelska Z, Klimesova K, Sokol D, Hudcovic T, Hrncir T, Rossmann P, Mrazek J, Kopecny J, Verdu EF, Tlaskalova-Hogenova H. Oral administration of Parabacteroides distasonis antigens attenuates experimental murine colitis through modulation of immunity and microbiota composition. Clin Exp Immunol. 2011 Feb;163(2):250-9. doi: 10.1111/j.1365-2249.2010.04286.x. Epub 2010 Nov 19. IF2011= 3,360

Publikace in extenso bez vztahu k tématu disertace: Kovar M, Tomala J, Chmelova H, Kovar L, Mrkvan T, Joskova R, Zakostelska Z, Etrych T, Strohalm J, Ulbrich K, Sirova M, Rihova B. Overcoming immunoescape mechanisms of BCL1 leukemia and induction of CD8+ T-cell-mediated BCL1specific resistance in mice cured by targeted polymer-bound doxorubicin. Cancer Res. 2008 Dec1; 68(23):9875-83. IF2011= 7,856

20