UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMAKOGNOZIE
DIPLOMOVÁ PRÁCE Antiradikálová aktivita přírodních látek. II.
Vypracovala: Petra Stehnová Vedoucí diplomové práce: Doc. RNDr. Jiřina Spilková, CSc. Oponent: Datum zadání: 29. 10. 2004 Termín odevzdání: 15. 5. 2006 Datum obhajoby: 6. 6. 2006
3
Děkuji Doc. RNDr. Jiřině Spilkové, CSc. za odborné vedení a pomoc při zpracování diplomové práce, a za vstřícný přístup při konzultacích.
Tuto diplomovou práci jsem vypracovala samostatně pod odborným vedením školitele a za pouţití uvedené literatury.
V Hradci Králové, 15. 5. 2006
………………………….
4
OBSAH
SEZNAM UŢITÝCH ZKRATEK .................................................................................... 7 1 ÚVOD A CÍL PRÁCE ................................................................................................... 8 2 TEORETICKÁ ČÁST ................................................................................................. 10 2.1 Volné radikály..................................................................................................... 10 2.2 Třezalka tečkovaná ............................................................................................. 12 2.2.1 Botanický popis ............................................................................................ 12 2.2.2 Obsahové látky ............................................................................................. 13 2.2.3 Farmakologické účinky................................................................................. 13 2.2.4 Přípravky s obsahem třezalky tečkované ...................................................... 15 2.3 Stanovení antioxidační aktivity .......................................................................... 16 3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ....................................................................................... 18 3.1 Pouţitý materiál, přístroje a pomůcky ................................................................ 18 3.1.1 Rostlinný materiál ......................................................................................... 18 3.1.2 Chemikálie .................................................................................................... 18 3.1.3 Přístroje a pomůcky ...................................................................................... 19 3.2 Stanovení flavonoidů .......................................................................................... 19 3.3 Stanovení hypericinů .......................................................................................... 20 3.4 Stanovení ztráty sušením .................................................................................... 21 3.5 Stanovení zbytku po vysušení extraktů .............................................................. 21 3.6 Stanovení antioxidační aktivity .......................................................................... 22 3.6.1 Příprava roztoku DPPH ................................................................................ 22 3.6.2 Příprava extraktů z drog ................................................................................ 22 3.6.2.1 Metanolový extrakt ............................................................................... 23 3.6.2.2 Vodný extrakt ....................................................................................... 23 3.6.3 Stanovení antioxidační aktivity extraktů z drog ........................................... 23 3.6.3.1 Stanovení antioxidační aktivity metanolových extraktů ....................... 23 3.6.3.1.1 Stanovení antioxidační aktivity Hyperici herba z oblasti Snina.... 23 3.6.3.1.2 Stanovení antioxidační aktivity Hyperici herba z oblasti Stropkov ....................................................................................................... 24 3.6.3.1.3 Stanovení antioxidační aktivity rutinu ........................................... 24
5
3.6.3.2 Stanovení antioxidační aktivity vodných extraktů................................ 25 3.6.3.2.1 Stanovení antioxidační aktivity Hyperici herba z oblasti Snina a Stropkov ......................................................................................... 25 3.6.3.2.2 Stanovení antioxidační aktivity rutinu ........................................... 25 3.7 Tenkovrstvá chromatografie ............................................................................... 26 3.7.1 Důkaz hyperosidu, rutinu a kys. chlorogenové v metanolovém extraktu ..... 26 3.7.2 Důkaz hyperosidu, rutinu a kys. chlorogenové ve vodném extraktu ............ 27 4 VÝSLEDKY ................................................................................................................ 28 4.1 Antioxidační aktivita........................................................................................... 28 4.2 Tenkovrstvá chromatografie ............................................................................... 43 5 DISKUSE..................................................................................................................... 48 6 ZÁVĚR ........................................................................................................................ 53 7 LITERATURA ............................................................................................................ 54
6
SEZNAM UŽITÝCH ZKRATEK AA
antioxidační aktivita
ACE
angiotensin konvertující enzym
BHA
butylhydroxyanisol
BHT
butylhydroxytoluen
ČL
Český lékopis
DPPH 1,1 – difenyl − 2 – pikrylhydrazylový radikál MAO monoaminooxidáza SSRI
inhibitory zpětného vychytávání serotoninu
TBHQ butylhydrochinon
7
1 ÚVOD A CÍL PRÁCE V nedávných letech byl zaznamenán zvýšený zájem o antioxidanty, tedy o látky chránící organismus proti škodlivému působení volných radikálů. Běţně v organismu vznikají reaktivní formy kyslíku a dusíku mající fyziologický význam. Působí jako signální molekuly nebo zabíjejí fagocytované mikroorganismy. Mnoţství volných radikálů však nesmí překročit míru schopností obranných mechanismů organismu. Mohlo by dojít k poškození organismu. Volné radikály se velkou měrou podílejí na rozvoji nemocí a komplikací s nimi související. Nadměrné mnoţství reaktivních forem kyslíku a dusíku tak můţe mít za následek rozvoj chronických nemocí jako jsou rakovina, ateroskleróza a revmatismus. Oxidativní stres můţe hrát důleţitou roli také v rozvoji neurodegenerativních onemocněních k nimţ řadíme Alzheimerovu a Parkinsonovu chorobu. Na základě tohoto zjištění je snaha volné radikály eliminovat a omezit tak jejich škodlivé působení. Za fyziologického stavu udrţuje organismus potřebnou koncentraci volných radikálů enzymovými a neenzymovými mechanismy. Z enzymů jsou to superoxiddismutáza, kataláza, glutathionperoxidáza a glutathionreduktáza. Kyselina močová, feritin, glutathion, ceruloplazmin, bilirubin, cystein a karnosin řadíme mezi neenzymové antioxidanty. Snaha zabránit škodlivému působení volných radikálů na organismus vede společnost k přijímání exogenních antioxidantů. Z exogenních neenzymatických antioxidantů jsou nejčastěji uţívány tokoferoly, karotenoidy a kyselina askorbová. Některá potravní aditiva jako je butylhydroxyanisol (BHA), butylhydroxytoluen (BHT), propylgalát nebo butylhydrochinon (TBHQ) řadíme mezi syntetické antioxidanty. Také celá řada léků má antioxidační účinek, který mohou uplatnit při jejich působení na organismus. K antioxidačním látkám uţívaných jako léky patří statiny, lokální anestetika, blokátory kalciového kanálu, ACE inhibitory, N-acetyl cystein a celá řada dalších (1). V současné době je pozornost obrácena spíše na antioxidanty rostlinného původu vyskytující se v ovoci a zelenině, v čaji a léčivých rostlinách. K významným sloţkám výţivy s antioxidačním účinkem patří polyfenoly obsaţené v rostlinné stravě. Jedná se o různorodou skupinu látek obsahujících aromatické jádro s několika fenolovými skupinami. Hlavní část polyfenolických látek tvoří flavonoidy (1). Vysoký obsah
8
flavonoidů je v červeném víně, zeleném a černém čaji a celé řadě léčivých rostlin. Jsou buď nositeli účinku nebo se na hlavním účinku významně podílejí. Jednou z nejčastěji uţívaných léčivých rostlin je také třezalka tečkovaná a od ní odvozené produkty. Dramaticky tak stoupla spotřeba rostliny jako výchozí suroviny pro výrobu fytofarmak (2). Uţívá se hlavně při léčbě mírných depresí. Poslední dobou je však stále více zkoumána kvůli antioxidačním schopnostem. Vedle hypericinu a hyperforinu najdeme v třezalce řadu aktivních sloučenin zahrnující fenolické sloučeniny, které mají schopnost působit jako zametači reaktivních forem kyslíku. Není přesně známo, zda jsou za antioxidační aktivitu zodpovědné polyfenolické látky, flavonoidy nebo hypericin, který patří do skupiny naftodiantronů a má 6 hydroxylových skupin, coţ je více, neţ mají některé rostlinné polyfenoly (3). Cílem této práce bylo zjistit a porovnat antioxidační aktivitu vodných a metanolových extraktů Herba hyperici. K dispozici jsem měla usušenou nať Hypericum perforatum získanou sběrem v Prešovském kraji v lokalitách Snina a Stropkov (Slovensko). Byla měřena i antioxidační aktivita jedné z obsahových látek třezalky tečkované, rutinu. Antioxidační aktivita byla stanovena spektrofotometricky, metodou zaloţenou na zhášení radikálu 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl (DPPH).
9
2 TEORETICKÁ ČÁST 2.1 VOLNÉ RADIKÁLY V metabolismu aerobních buněk se za normálních podmínek objevují redoxní procesy, kterými vznikají volné radikály (2). Běţně se tak tvoří reaktivní formy kyslíku a reaktivní formy dusíku, které mají značný fyziologický i patogenetický význam. Jsou důleţitými prostředníky přenosu energie, faktory imunitní ochrany a signálními molekulami buněčné regulace. Za určitých okolností však mohou působit jako toxické látky schopné organismus poškodit a někdy ho dokonce i usmrtit (4). Volné radikály jsou schopné samostatné existence. Ve svém elektronovém obalu mají nepárový elektron, eventuelně více nepárových elektronů, které získaly ztrátou či přijetím. Jen některé z reaktivních forem kyslíku a dusíku jsou volnými radikály, tedy látky s nepárovým elektronem. V molekule některé orbitaly tvoří chemické vazby mezi jednotlivými atomy. Volné radikály z nich pak vznikají hemolytickým štěpením kovalentní chemické vazby, nebo přidáním jednoho elektronu k normální molekule redukcí, nebo oxidací tedy ztrátou jednoho elektronu. K volným radikálům reaktivních forem kyslíku patří superoxid O2·, který je nejběţnějším radikálem, peroxyl ROO·, alkoxyl RO·, hydroperoxyl HO2· a nejnebezpečnější je hydroxylový radikál OH·. Peroxid vodíku H2O2, kyselinu chlornou HOCl, ozon O3 a singletový kyslík
1
O2
řadíme k látkám, které nejsou volnými radikály, ale patří mezi reaktivní formy kyslíku. Oxid dusnatý NO· a oxid dusičitý NO2· patří k volným radikálům reaktivních forem dusíku. Mezi látky, které nejsou volnými radikály spadá kyselina dusitá HNO2, oxid dusitý N2O3, oxid dusičitý N2O4, nitroxid NO, nitrosyl NO+, nitronium NO2+, peroxynitrit ONOO a alkylperoxynitrit ROONO (4). Jako radikály se chovají i atomy přechodných kovů ( Fe, Cu, Ni, Mn, Ti ) (1). Většina volných radikálů je málo stabilních a vysoce reaktivních se snahou chybějící elektron doplnit. Chybějící elektron můţe získat setkáním s jiným radikálem. Častěji však dochází k vytrţení elektronu ze „zdravé“ molekuly (1). Takto můţe dojít k poškození buňky, kdy jsou zničeny důleţité molekuly, jako jsou proteiny, nukleové kyseliny nebo fosfolipidy buněčných membrán (2). Pokud nejsou radikály odstraňovány, napadají a přeměňují další sloučeniny v radikály a nastartují tak
10
řetězovou reakci. Tato reakce je ukončena aţ po setkání dvou radikálů nebo po setkání s látkou, jejíţ radikál je stabilní a můţe delší dobu přetrvávat (1). K poškození buňky ale nemusí vţdy dojít. Za normálních okolností existuje rovnováha mezi volnými radikály a antioxidanty (1). Buňka aktivuje obranné mechanismy, které zahrnují antioxidační enzymy a neenzymatické sloučeniny, které brání škodlivému působení volných radikálů (2). K antioxidačním enzymům patří superoxiddismutáza, kataláza, glutathionperoxidáza a glutathionreduktáza. Neenzymatické sloučeniny zahrnují proteiny, které změní oxidoredukční vlastnosti přechodných prvků, které tak přestanou katalyzovat radikálové reakce, dále sem řadíme askorbát redukující anorganické i organické radikály, či α-tokoferol, který se mění na stabilnější radikál. Obranné mechanismy organismu proti oxidačnímu poškození vzájemně spolupracují, doplňují se a mnohdy i potencují. Funkce jednoho antioxidantu často podmiňuje účinek jiného (4). Endogenní systém je často dostačující pro odklízení reaktivních forem kyslíku a dusíku (2). Dojde-li však k porušení rovnováhy mezi vznikem a odstraňováním volných radikálů označujeme to jako oxidační stres. Můţe být vyvolán nadměrnou produkcí reaktivních forem kyslíku a dusíku, nedostatečnou funkcí antioxidačního ochranného systému nebo kombinací obou těchto nedostatků. K nadměrné tvorbě reaktivních forem kyslíku dochází při některých metabolických situacích, při reoxygenaci tkáně po ischemii nebo po příjmu oxidoredukčně aktivních xenobiotik (4). Volné radikály mohou přímo vyvolat vznik onemocnění, nebo mohou zhoršovat či komplikovat jeho průběh. Choroby, kde hrají volné radikály rozhodující úlohu, jsou nazývány nemocemi z volných radikálů („free radical diseases“) (1). K daným chorobám se řadí například ateroskleróza na jejímţ počátku je oxidace lipoproteinů o nízké hustotě volnými radikály. Volné radikály mohou poškozovat β-buňky Langerhansových ostrůvků a podílet se na vzniku diabetu mellitus i na rozvoji jeho pozdních komplikací. Maligní přeměny buňky mohou být vyvolány působením volných radikálů na DNA. Reaktivní formy kyslíku a dusíku se podílejí také na onemocnění trávicího traktu. Zvýšená produkce volných radikálů byla prokázána u infekce Helicobacter pylori. U Crohnovy choroby byla popsána nedostatečná antioxidační ochrana. Centrální nervový systém obsahuje velké mnoţství lipidové tkáně, která můţe být volnými radikály poškozena. U Parkinsonovy choroby byl prokázán zvýšený výskyt volných radikálů a určitou roli hrají také v rozvoji Alzheimerovy choroby (1). Reaktivní formy kyslíku, jako je superoxid, jsou přítomny také v zánětlivé tkáni. Jejich 11
producenty jsou aktivované leukocyty, neutrofily a makrofágy, které uvolňují i proteolytické enzymy. Tím přispívají k destrukci mikroorganismů, ale také poškozují tkáň postiţenou zánětem. Z reaktivních forem dusíku se zánětlivého procesu účastní oxid dusnatý (NO·) produkovaný v makrofázích a přispívá k zabíjení intracelulárně přeţívajících patogenů. Vazodilatační účinky oxidu dusnatého přispívají ke zvýšenému prokrvení zánětlivé tkáně. Reaktivní formy kyslíku mohou atakovat nukleové kyseliny a modifikovat je na nepřirozené deriváty, které zavedou chybu při replikaci DNA (mutace) a takové modifikace mohou mít vliv i na karcinogenezi (4). Volné radikály mají také příznivé účinky na organismus. V membráně fagocytů vzniká řetězovou reakcí kyselina chlorná, která se vyuţívá k zabíjení fagocytovaných mikroorganismů. Peroxid vodíku je nezbytný pro oxidaci jodidu na elementární jod, který štítná ţláza vyuţívá k jodaci aromatických jader tyroninu. Příznivý účinek má i radikál oxid dusnatý, který má v endoteliálních buňkách výrazný vasodilatační efekt. S volnými radikály se můţeme setkat také v podobě signálních molekul (1).
2.2 TŘEZALKA TEČKOVANÁ Drogu Herba hyperici poskytuje Hypericum perforatum L., třezalka tečkovaná, z čeledi Hypericaceae (5).
2.2.1 Botanický popis Třezalka tečkovaná se řadí mezi vytrvalé byliny s přímou lodyhou dorůstající výšky 3090 cm (6). Roste hojně na travnatých slunných stanovištích, na mezích a u cest (7). Původně se vyskytovala v Evropě, Asii a Severní Americe, dnes je ale zavlečena i na ostatní kontinenty. Třezalka je výrazná zlatě ţlutými kvítky, vyrůstajícími v bohatých vidličnatých latách, a sekrečními nádrţky, které způsobují světlé tečkování listů, zřetelné hlavně v procházejícím světle, a upozorňující na druhové pojmenování (5). Vstřícné listy jsou přisedlé, vejčité a celokrajné. Černé tečky na okraji korunních plátků
12
a ţlázky na zadní straně prašníků obsahují červené barvivo hypericin (7). Usušená nať Hypericum perforatum se sbírá krátce před kvetením nebo v květu (červenec, srpen) (5).
2.2.2 Obsahové látky Nať obsahuje řadu
sloučenin zahrnující naftodiantrony (0,05 – 0,30 %) s
fotodynamickým účinkem (hypericin
a pseudohypericin a jejich předstupně
protohypericin proto-pseudohypericin). Vzájemný poměr těchto látek kolísá podle původu drogy. Dále obsahuje fluoroglucinolové deriváty (hyperforin a adhyperforin), flavonoidy (2 – 4 %)
(kvercitin, hyperosid, rutin a isokvercitin), biflavonoidy
(amentoflavon), hydroxyskořicové kyseliny (kyselina chlorogenová, kyselina kávová), proantocyanidiny, třísloviny (8 – 10 %), jejich obsah však skladováním silně klesá. Dalšími obsahovými látkami jsou xantin, aminokyseliny (GABA) a silice (0,05 – 0,3 %) (5, 8, 9, 10).
2.2.3 Farmakologické účinky Lidově se třezalka tečkovaná uţívala pro svůj rány hojící efekt, k léčbě gastrických ulcerací, jako antiseptická a sedativní látka (11). Dále se pouţívala k léčbě zánětu průdušek a urogenitálního traktu, hemeroidech, migréně, bolesti hlavy, při diabetu mellitus a zánětech sedacího nervu. Uplatňovala se také jako diuretikum a antimalarikum (8). V oficiální terapii se dnes pouţívá jak droga tak i fytofarmaka z ní vyráběná. Droga, samotná nebo v čajových směsích, působí jako adstringens a antidiarhoikum (5). Fytofarmaka
z třezalky
tečkované
se
pouţívají
hlavně
jako
antidepresiva.
Kontrolovanou klinickou studii byl prokázán účinek při terapii mírné deprese (9). Terapeutický efekt, při léčbě Herba hyperici, by se měl dostavit po 2 − 4 týdnech uţívání. Pokud nedojde k výraznějšímu antidepresivnímu efektu do 6 týdnů, měla by být léčba konzultována s lékařem (8). Jedna ze studií provedená Butterweckem V. a kol. (12) ukazuje na srovnatelný efekt extraktu Hypericum perforatum a tricyklických
13
antidepresiv při léčbě mírné deprese. Autoři zde poukazují i na skutečnost lepší compliance pacientů uţívající třezalkový extrakt oproti pacientům léčených syntetickým antidepresivem. Navíc antioxidační působení třezalky vede k hypotéze, zda není lepší neţ tricyklická antidepresiva nebo inhibitory zpětného vychytávání serotoninu (SSRI) (9).
Studií bylo také prokázáno, ţe podávání Herba hyperici
v lékové formě po dobu osmi týdnů, má stejný vliv na hypotalamus jako syntetické antidepresivum imipramin (12). Denní doporučená dávka při léčbě deprese ověřená studií je 500 mg extraktu a to odpovídá 1 − 2 mg hypericinu (6). Agostinisa P. a kol. (6) však ve své studii prokázali, ţe ne hypericin ale hyperforin je zodpovědný za antidepresivní aktivitu rostliny. Studie, zaměřená na mechanismus účinku Hypericum perforatum ve vztahu k mírnění deprese, zmiňuje fakt, ţe extrakt třezalky tečkované, hypericin, imipramin i fluoxetin významně zvyšují hladinu serotoninu v mozkové kůře potkanů po dlouhodobé léčbě trvající minimálně osm týdnů, ale ne po kratší době podávání (2 týdny) (12). Zvýšená hladina serotoninu můţe být způsobena inhibicí zpětného vychytávání serotoninu. Prací Panocka I. a kol. (13) a Benedí J. a kol. (3) byl prokázán vliv extraktu třezalky tečkované na zpětné vychytávání i na inhibici monoaminooxidázy (MAO), enzymu odbourávající serotonin. Několik studií se zabývalo propojením deprese s abúzem alkoholu. Alkoholová závislost je jedním z hlavních zdravotních a socioekonomických problémů světa. Poznáním, ţe deprese a nadměrné pití alkoholu vede k podobným změnám aktivit neurotransmiterů, se pozornost obrátila na třezalku (13). Tato rostlina zvyšuje hladinu nejen serotoninových receptorů, ale také receptorů pro dopamin, norepinefrin a opioidních receptorů v CNS . Sníţení patologického pití alkoholu při současném podávání léčiv se serotoninergním účinkem bylo prokázáno i u experimentálních zvířat (9). Studie Khalifa A. E. (14) ukazuje potenciální nootropické vlastnosti třezalkového extraktu v dávkách ekvivalentních uţívání jako antidepresiva. Jak uţ bylo zmíněno, sloučeniny zodpovědné za antidepresivní aktivitu, hypericin a hyperforin, zvyšují hladinu serotoninu a ten má ochranný efekt proti oxidativnímu poškození neuronů (3). Deprese je častým jevem u pacientů se senilní demencí. Studie na myších ukázala, ţe třezalkový extrakt je lepší alternativou při léčbě deprese spojené s demencí neţ podávání syntetických antidepresiv s anticholinergními účinky způsobující sedaci a posturální hypotenzi u geriatrických pacientů (14, 15, 3).
14
Experimentálně byla prokázána antimikrobiální aktivita proti Grampozitivním bakteriím (11). U hypericinu, jedné z obsahových látek třezalky tečkované, byl prokázán antivirový účinek, který by se mohl uplatnit při potenciální léčbě AIDS (6). Třezalka tečkovaná je v současné době podrobena vysokému zájmu po chemické i farmakologické stránce. Důvodem je snaha potvrdit terapeutický vliv na popáleniny, modřiny, podlitiny a otoky (16). Několika studiemi byl prokázán i protizánětlivý účinek třezalky tečkované. Ve studii Menegazzia M. a kol. (17) byl hodnocen vliv třezalky tečkované na zvířecí model s akutním zánětem pohrudnice. Extrakt rostliny redukuje rozvoj akutního zánětu, který je jinak doprovázen infiltrací neutrofilů, interleukinu 1 a zvýšenou produkcí tumor necrosis faktoru do místa zánětu. Flavonoidy obsaţené v Herba hyperici mohou inhibovat cyklooxygenázu a tím modulovat metabolismus arachidonové kyseliny a rozvoj zánětu (18).
2.2.4 Přípravky s obsahem třezalky tečkované Herba hyperici je velmi vyuţívanou drogou, o čemţ svědčí mnoţství vyráběných přípravků evidovaných v databázi AISLP (19). Setkáváme se s ní v různých lékových formách, jako jsou kapsle, tablety, globule, roztok, kapky, injekční roztoky, masti a čajové směsi. Suchý třezalkový extrakt je obsaţen v přípravcích: Felis 425 (cps., Salutas Pharma GmbH, SRN), Felisio 425 (cps., Salutas Pharma GmbH, SRN), Helarium hypericum (tbl., Bionorica AG, SRN), Hypericum stada (cps., Stadapharm GmbH, SRN), Hyperikan (tbl., Dr. Willmar Schwabe GmbH_CO, SRN), Klosterfrau hypericum (tbl., MCM Klosterfrau vertriebs GmbH, SRN), Myrall (cps., Stadapharm GmbH, SRN), Remotiv 250 (tbl., Ewopharma spol. s r. o. ČR a Max-Zeller Söhne Ag, Švýcarsko), Cesradyston 200 (cps., Cesra Arzneimittel GmbH_CO, SRN) a Jarsin 300 (tbl., Lichtwer Pharma AG/GmbH, SRN). S drogou Hyperici herba se hojně setkáváme v čajových směsích: Alvisan Neo (Leros s.r.o., ČR), Fytokliman Planta (Leros s.r.o., ČR), Nať třezalky (Leros s.r.o., ČR), Species nervinae planta (Leros s.r.o., ČR), Stomaran (Leros s.r.o., ČR), Třezalka v nálevových sáčcích (Leros s.r.o., ČR), Třezalkový čaj (Megafyt-R s.r.o., ČR), Ţaludeční čajová směs (Megafyt-R s.r.o., ČR).
15
S třezalkou se setkáváme také v homeopatických přípravcích: Hypericum (tbl., Radim Bakeš_Galenická laboratoř Ostrava, ČR), Traumeel S (ung., Biologische Heilmittel Heel GmbH, SRN), Hypericum (glo., tbl., sol., Dr. Peithner KG, Rakousko) a v Hypericum perforatum (glo., Boiron S. A., Francie), Traumeel (gtt., tbt., Biologische Heilmittel Heel GmbH, SRN) a Dr. Reckeweg R30 (ung., Pharmazeutische Fabrik Dr. Reckeweg GmbH, SRN). Registrované je také veterinární homeopatikum Revet RV 25 A.U.V. (glo., inj., ., Pharmazeutische Fabrik Dr. Reckeweg GmbH, SRN).
2.3 STANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ AKTIVITY Vědci stále častěji vyhledávají nové a účinné antioxidanty v rozsáhlé rostlinné říši zahrnující ovoce, zeleninu, koření a léčivé rostliny. Izolace a chemická identifikace antioxidantů je velmi důleţitá pro jejich vyuţití v praxi jako potravních doplňků. Tento proces je velmi časově náročný a ne vţdy vede k úspěšným výsledkům. Rozvoj efektivních metod, které by odhalily silné antioxidanty v rostlinném extraktu, můţe urychlit
celý
proces
izolace
a
identifikace
chemické
struktury.
Jednou
z nejpouţívanějších metod pro stanovení antioxidační aktivity je metoda vyuţívající radikálu 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl (DPPH). Oproti jiným metodám má řadu výhod, mezi něţ patří jednoduchost a moţnost v krátkém čase proměřit více vzorků (20). DPPH je stabilní volný radikál, který je schopen přijetím volného elektronu nebo vodíkového atomu transformovat se na radikál obtíţně oxidovatelný. Reakce probíhá ve dvou stupních: v prvním reaguje radikál DPPH s antioxidantem (AH) z něhoţ se tak stává radikál, ten pak ve druhém stupni reaguje s dalším radikálem (stejným nebo jiným) a vzniká látka neradikálového charakteru. DPPH· + AH → DPPH-H + A· A· + X· → AX Redukcí radikálu DPPH dochází ke sníţení absorpce při vlnové délce 517 nm. Při pouţití této metody se smíchá fialový roztok DPPH s roztokem vzorku, jehoţ aktivita je měřena, a po uplynutí doby inkubace se spektrofotometricky měří absorbance a porovnává s absorbancí roztoků samotného DPPH.
16
Výsledek se obvykle vyjadřuje jako % redukce DPPH a vypočítává podle vztahu:
%redukceDPPH (1
AVZ ) 100 ASV
kde AVZ = absorbance testovacího vzorku po uplynutí doby inkubace ASV = absorbance slepého vzorku po uplynutí doby inkubace Provedení metody můţe být různé. Roztok DPPH můţe být metanolový nebo etanolový o různé koncentraci (0,1 mM, 0,2 mM a 1 mM). Také doba inkubace se v různých studiích liší (od 10-ti minut po 24 hodin). Absorbance se obvykle měří při 515 nebo 517 nm.
17
3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 3.1 POUŢITÝ MATERIÁL, PŘÍSTROJE A POMŮCKY
3.1.1 Rostlinný materiál Nať třezalky tečkované Hyperici herba byla získána sběrem v lokalitě Snina a Stropkov v Prešovském kraji ( Slovensko) a dodána prostřednictvím firmy Fytopharma Malacky.
3.1.2 Chemikálie
Aqua purificata Butan-2-on, p.a. Difenylboryloxyetylamin = Naturstoff reagenz (CARLROTH, SRN) Etanol, p.a. Etylacetát, č. Kyselina boritá, p.a. Kyselina mravenčí bezvodá, p.a. Kyselina octová bezvodá, p.a. Kyselina octová ledová, p.a. Kyselina šťavelová, p.a. Metanol, p.a. Tetrahydrofuran, p.a. 1,1-difenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) (SIGMA-ALDRICH CHEMIE GmbH, SRN)
18
3.1.3 Přístroje a pomůcky Analytické váhy (KERN & SOHN GmbH, SRN) Inkubační lázeň (HEIDOLPH, SRN) Chromatografické desky SILUFOL (KAVALIER, Votice, ČR) Laboratorní váhy (KERN & SOHN GmbH, SRN) Mlýnek (MOULINEX) Odstředivka (MPW 342, Polsko) Spektrofotometr UV 1601 (SHIMADZU, Austrálie) Sušárna (Binder, SRN) Ultrazvuková lázeň (SONOREX RX 100H, SRN) UV lampa (KRÜSS Optronic, SRN) Vakuová odparka (Laborota 4010 Heidolph, SRN) Vodní lázeň (GFL, SRN)
3.2 STANOVENÍ FLAVONOIDŮ Stanovení flavonoidů bylo provedeno postupem daným v Českém lékopise 2002 dle článku Crataegi folium cum flore (21). Flavonoidy jsem stanovovala u kaţdé drogy na tři naváţky. Při stanovení jsem připravila tři roztoky. Jednalo se o roztok základní, zkoušený a kontrolní. U základního roztoku jsem smíchala 0,400 g práškované drogy (250) se 40 ml lihu R 60 % (V/V) ve 200 ml baňce a zahřívala 10 minut na vodní lázni za častého protřepávání. Poté jsem obsah baňky přefiltrovala přes chomáček vaty do 100,0 ml odměrné baňky. Chomáček vaty jsem vloţila zpět do 200 ml baňky, přidala 40 ml lihu R 60 % (V/V) a znovu zahřívala 10 minut na vodní lázni při 60 ºC. Po ochlazení jsem obsah baňky znovu zfiltrovala do 100,0 ml odměrné baňky. 200ml baňku i filtr jsem promyla lihem R 60 % (V/V) a promývací tekutinu přidala do odměrné baňky. Spojené roztoky jsem doplnila lihem R 60 % (V/V) na 100,0 ml roztoku a ten jsem zfiltrovala. Zkoušený roztok jsem připravila z roztoku základního, kdy jsem 5,0 ml základního roztoku odpařila v baňce s kulatým dnem za sníţeného tlaku do sucha. Zbytek jsem 19
rozpustila v 8 ml směsi metanolu R a kyseliny octové ledové R (10+100) a převedla do 25,0 ml odměrné baňky. Baňku s kulatým dnem jsem promyla 3 ml směsi metanolu R a kyseliny octové ledové R (10+100) a promývací tekutinu jsem přidala do téţe odměrné baňky. K tomuto roztoku jsem přidala 10,0 ml roztoku kyseliny borité R (25,0 g/l) a kyseliny šťavelové R (20,0 g/l) v kyselině mravenčí bezvodé R a zředila kyselinou octovou bezvodou R na 25,0 ml. K přípravě kontrolního roztoku jsem pouţila 5,0 ml základního roztoku, který jsem odpařila v baňce s kulatým dnem za sníţeného tlaku do sucha. Zbytek jsem rozpustila v 8 ml směsi objemových dílů metanolu R a kyseliny octové ledové R (10+100) a převedla do 25,0 ml odměrné baňky. Baňku s kulatým dnem jsem promyla 3 ml směsi objemových dílů metanolu R a kyseliny octové ledové R (10+100) a promývací tekutinu jsem převedla do téţe odměrné baňky. K tomuto roztoku jsem přidala 10,0 ml kyseliny mravenčí bezvodé R a zředila kyselinou octovou bezvodou R na 25,0 ml. Absorbanci zkoušeného roztoku jsem měřila po 30 minutách při 410 nm proti kontrolnímu roztoku. Obsah flavonoudů v procentech, vyjádřeno jako hyperosid (C21H20O12), jsem vypočítala podle vztahu
A 1,235 , kde A je absorbance roztoku v maximu při 410 nm a M je M
hmotnost zkoušené drogy v gramech. Výsledky měření stanovení flavonoidů udává tabulka č. 1.
3.3 STANOVENÍ HYPERICINŮ Postupem udaným v Českém lékopise 2002 (21) v článku Hyperici herba jsem stanovila obsah hypericinů v droze. Pro kaţdou drogu jsem provedla tři stanovení. Zkoušený roztok jsem získala extrakcí 0,800 g práškované drogy se 60 ml směsi objemových dílů vody R a tetrahydrofuranu R (20+80). Směs jsem dala do 100 ml baňky s kulatým dnem a 30 minut vařila na vodní lázni při 70 ºC pod zpětným chladičem. Poté jsem směs odstředila při 3500 otáček 2 minuty a supernatantní tekutinu jsem převedla do 250 ml baňky s kulatým dnem. Zbytek drogy jsem znovu zahřívala s 60 ml směsi objemových dílů vody R a tetrahydrofuranu R (20+80) 30 minut pod zpětným chladičem. Směs jsem znovu odstředila a supernatantní tekutinu odlila do
20
250 ml baňky s kulatým dnem k prvnímu podílu. Za sníţeného tlaku jsem roztoky odpařila do sucha. Ke zbytku jsem přidala 15 ml metanolu R a za pomoci ultrazvuku jsem roztok převedla do 25,0 ml odměrné baňky, kterou jsem doplnila metanolem R. Opět jsem roztok odstředila a přefiltrovala přes filtr ze slinutého skla (0,2 µm), první 2 ml jsem odstranila a z přefiltrovaného roztoku jsem dala 5,0 ml filtrátu do 25,0 ml odměrné baňky a doplnila metanolem R. Absorbanci zkoušeného roztoku jsem měřila při 590 nm za pouţití metanolu R jako kontrolní tekutiny. Obsah všech hypericinů v %, vyjádřeno jako hypericin (C30H16O8), jsem vypočítala podle vzorce
A 125 , kde A je absorbance při 590 nm a m je naváţka m 870
drogy v gramech. Lékopisné poţadavky činí nejméně 0,08 % všech hypericinů, počítáno jako hypericin (C30H16O8). Výsledky měření stanovení hypericinů udává tabulka č. 2.
3.4 STANOVENÍ ZTRÁTY SUŠENÍM Stanovení ztráty sušením jsem provedla postupem Českého lékopisu 2002 (21). Váţenku i s víčkem jsem nechala asi 1 hodinu v sušárně při 100 – 105 ºC. Váţenku jsem poté nechala zchladnout v exsikátoru a zváţila. Váţenku i s naváţkou, která činila asi 0,6 g, jsem nechala 2 hodiny v sušárně při 100 – 105 ºC. Poté jsem váţenku znovu zváţila a vypočítala ztrátu sušením. Lékopis povoluje maximální ztrátu sušením 10 %. Pro kaţdou drogu jsem provedla tři stanovení. Výsledky stanovení jsou v tabulce č. 3.
3.5 STANOVENÍ ZBYTKU PO VYSUŠENÍ EXTRAKTŮ Stanovení zbytku po vysušení extraktů jsem provedla postupem podle Českého lékopisu 2002 (21). Zahříváním 0,5 g drogy s 50 ml metanolu jsem připravila metanolový extrakt. Extrakt jsem zahřívala 30 minut při 65 ºC, přefiltrovala do 50,0 ml odměrné
21
baňky a doplnila. Stejně tak jsem připravila vodný extrakt, jen místo metanolu jsem pouţila 50 ml vody. 2 ml zkoušeného extraktu jsem převedla do předem vysušené a zváţené váţenky. Na vodní lázni jsem extrakt odpařila do sucha a zbytek jsem sušila 3 hodiny v sušárně při 100 – 105 ºC. Po vychladnutí v exsikátoru jsem váţenku opět zváţila a výsledek vyjádřila v g/l. U kaţdého vzorku drogy jsem provedla 2 stanovení zbytku po odpaření vodného extraktu a 2 stanovení zbytku po odpaření metanolového extraktu. Výsledky jsou uvedeny v tabulce č.4.
3.6 STANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ AKTIVITY Antiradikálovou aktivitu jsem stanovovala spektrofotometrickou metodou vyuţívající radikál 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl (DPPH).
3.6.1 Příprava roztoku DPPH Připravila jsem si základní 0,2 % roztok DPPH, který jsem uchovávala v lednici. Naváţila jsem 0,0500 g DPPH a kvantitativně převedla do 25,0 ml odměrné baňky a doplnila metanolem. K rozpuštění DPPH jsem pouţila ultrazvukovou lázeň, kde jsem roztok 5 minut ponechala. Ze základního roztoku jsem odměřila 5,0 ml a v 50,0 ml odměrné baňce doplnila metanolem po značku. Získala jsem 0,02 % roztok, který jsem pouţívala ke stanovení.
3.6.2 Příprava extraktů z drog Antiradikálovou aktivitu jsem stanovovala u metanolového i vodného výluhu drogy a z kaţdého vzorku drogy jsem připravila 3 výluhy metanolové a 3 vodné.
22
3.6.2.1 METANOLOVÝ EXTRAKT
Metanolový výluh jsem připravila zahříváním 0,5 g drogy s 50 ml metanolu po dobu 30 minut při 65 ºC. Směs jsem přefiltrovala do 50,0 ml odměrné baňky a doplnila do 50,0 ml metanolem. K vlastnímu měření jsem pouţívala metanolový extrakt, který jsem ještě 200x naředila. Z původního výluhu jsem odměřila 0,5 ml a ve 100,0 ml odměrné baňce jsem doplnila metanolem po značku.
3.6.2.2 VODNÝ EXTRAKT
Vodný výluh jsem připravila zahříváním 0,5 g drogy s 50 ml vody na vodní lázni pod zpětným chladičem při 65 ºC po dobu 30 minut. Po vychladnutí jsem směs zfiltrovala do 50,0 ml odměrné baňky a doplnila na 50,0 ml vodou. Z odměrné baňky jsem odměřila 5,0 ml roztoku a za sníţeného tlaku jsem jej odpařila do sucha. Zbytek jsem rozpustila ve 100,0 ml metanolu. Z tohoto metanolového roztoku jsem připravila 100x ředěný roztok. 5,0 ml roztoku jsem doplnila ve 25,0 ml odměrné baňce metanolem po značku.
3.6.3 Stanovení antioxidační aktivity extraktů z drog
3.6.3.1 STANOVENÍ
ANTIOXIDAČNÍ
AKTIVITY
METANOLOVÝCH
EXTRAKTŮ
3.6.3.1.1 Stanovení antioxidační aktivity Hyperici herba z oblasti Snina
Při vlastním měření jsem odměřila 0,3; 0,5; 0,7; 1,0; 1,3; 1,5 a 1,6 ml metanolového extraktu do 5,0 ml odměrných baněk. Přidala jsem 200 µl roztoku DPPH a doplnila metanolem do 5,0 ml. Obsah odměrných baněk jsem promíchala, odměrné baňky 23
uzavřela a ponechala 30 minut inkubovat v 37 ºC teplé lázni. Po uplynutí poţadovaného času jsem měřila absorbanci při vlnové délce 517 nm proti metanolu. Současně jsem připravila slepý vzorek pro kontrolu. Slepý vzorek obsahoval 200 µl roztoku DPPH a metanol, kterým jsem odměrnou baňku doplnila na 5,0 ml. Antioxidační aktivitu jsem vyjádřila v % redukce DPPH podle vztahu:
%redukceDPPH (1
AVZ ) 100 ASV
kde AVZ = absorbance testovacího vzorku po uplynutí doby inkubace ASV = absorbance slepého vzorku po uplynutí doby inkubace Výsledky stanovení antioxidační aktivity drogy Hyperici herba z oblasti Snina uvádí tabulka č. 5.
3.6.3.1.2 Stanovení antioxidační aktivity Hyperici herba z oblasti Sropkov
K měření antiradikálové aktivity drogy Herba hyperici z oblasti Stropkov jsem pouţila řadu: 0,1; 0,4; 0,7; 1,0; 1,3; 1,5 a 1,6 ml. Při měření jsem postupovala stejně jako u drogy z oblasti Snina. Výsledky stanovení udává tabulka č. 6.
3.6.3.1.3 Stanovení antioxidační aktivity rutinu
Rutin jsem získala semipreparativní tenkovrstvou chromatografií metanolového extraktu drogy ( 3.6.2.1.) na Silufolu. Nanášela jsem 250 µl metanolového výluhu do pruhu. Mobilní fází byla směs etylacetátu R, kyseliny mravenčí bezvodé R a vody R (90:6:9). Poté jsem desky z komory vyndala a nechala do druhého dne v digestoři odpařit mobilní fázi. Druhého dne jsem vyškrábala pás, který odpovídal rutinu, a eluovala s 5 ml metanolu pomocí ultrazvuku. Následně jsem směs přefiltrovala přes fritu a kvantitativně převedla do 5,0 ml odměrné baňky.
24
Pro stanovení antioxidační aktivity jsem k roztoku přidala 200 µl roztoku DPPH a doplnila metanolem po značku. Odměrné baňky jsem zamíchala a uzavřené ponechala 30 minut inkubovat ve vodní lázni 37 ºC teplé. Při 517 nm jsem změřila absorbanci proti metanolu a antioxidační aktivitu vyjádřila v % redukce DPPH. Výsledky stanovení AA eluátu rutinu z metanolového extraktu Herba hyperici oblasti Snina a Stropkov uvádí tabulky č. 8 a 9.
3.6.3.2 STANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ AKTIVITY VODNÝCH EXTRAKTŮ
3.6.3.2.1 Stanovení antioxidační aktivity Hyperici herba z oblasti Snina a Stropkov
Při měření antioxidační aktivity metanolového roztoku vodného extraktu jsem postupovala stejně jako u měření antioxidační aktivity metanolového extraktu. V obou případech jsem k měření antioxidační aktivity pouţila řadu: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 a 0,6 ml. Výsledky stanovení antioxidační aktivity metanolového roztoku vodného extraktu jsou v tabulce č. 5 a č. 6.
3.6.3.2.2 Stanovení antioxidační aktivity rutinu
Semipreparativní tenkovrstvou chromatografií vodného extraktu drogy (nanášeno 250 µl) jsem získala rutin postupem stejným jako u metanolového extraktu. K metanolovému roztoku rutinu jsem přidala 200 µl roztoku DPPH, doplnila do 5,0 ml metanolem a inkubovala 30 minut při teplotě 37 ºC. Výsledky stanovení vodného extraktu Hyperici herba z oblasti Snina a Stropkov uvádí tabulky č. 8 a 9.
25
3.7 TENKOVRSTVÁ CHROMATOGRAFIE
3.7.1 Důkaz hyperosidu, rutinu a kyseliny chlorogenové v metanolovém extraktu Podle článku Hyperici herba v ČL 2002 (21) jsem si připravila zkoušený roztok. Naváţila jsem 0,5 g práškované drogy a zahřívala ji s 10 ml metanolu na vodní lázni pod zpětným chladičem při 60 ºC po dobu 10 minut. Směs jsem přefiltrovala a doplnila na 50,0 ml metanolem. Jako stacionární fázi jsem pouţila Silufol bez UV indikátoru, dělící dráha byla 10 cm dlouhá. Mobilní fáze: S1: kyselina mravenčí bezvodá R, voda R, etyl-acetát R (6:9:90) S2: kyselina mravenčí bezvodá R, voda R, butan-2-on, etyl-acetát R (10:10:30:50)
Detekce: 1. Postřik roztokem difenylboryloxyetylaminu 1 % a po 30 minutách pozorování skvrn v UV světle při 365 nm. 2. Postřik roztokem DPPH 0,2 % a následné prohlíţení na denním světle. Nanášky: SN – 10 µl metanolového extraktu drogy Herba hyperici z oblasti Snina STR – 10 µl metanolového extraktu drogy Herba hyperici z oblasti Stropkov H - 10 µl standardu hyperosidu 0,1 % R - 10 µl standardu rutinu 0,1 % KCH- 10 µl standardu kyseliny chlorogenové 0,1 % Schéma chromatogramů je na obrázku č.1 a 2.
26
3.7.2 Důkaz hyperosidu, rutinu a kyseliny chlorogenové ve vodném extraktu Vodný extrakt jsem připravila zahříváním 0,5 g drogy s 50 ml vody na vodní lázni při 65 ºC 30 minut. Po ochlazení jsem směs zfiltrovala a doplnila do 50,0 ml vodou. Vodný extrakt jsem na vodní lázni zahustila asi na 30 % původního obsahu a nanášela jsem 20 µl extraktu. Podmínky chromatografie uvádí kapitola 3.7.1. Schéma chromatogramů jsou uvedena na obrázku č. 3 a 4.
27
4 VÝSLEDKY 4.1 ANTIOXIDAČNÍ AKTIVITA Tabulka č. 1: Stanovení obsahu flavonoidů Hyperici herba
Původ drogy Stropkov
Snina
Naváţka Absorbance drogy ( g ) 0,3772 0,3773 0,3716 0,3700 0,3688 0,3722
1,188 1,194 1,178 1,106 1,102 1,110
Obsah flavonoidů (%) Přepočteno na vysušenou drogu 3,890 3,908 3,915 3,692 3,690 3,683
Průměr (%) Směrodatná odchylka 3,904
0,013
3,688
0,005
Tabulka č. 2: Stanovení obsahu hypericinů v Hyperici herba
Původ drogy Stropkov
Snina
Naváţka Absorbance drogy ( g ) 0,7367 0,7337 0,7360 0,7363 0,7398 0,7363
0,703 0,712 0,729 0,666 0,635 0,649
Obsah hypericinů (%) Přepočteno na vysušenou drogu 0,137 0,139 0,142 0,130 0,123 0,127
28
Průměr (%) Směrodatná odchylka 0,140
0,003
0,127
0,003
Tabulka č. 3: Stanovení ztráty sušením
Droga
Stropkov
Snina
Naváţka (g) 0,6376 0,6244 0,6096 0,6017 0,5222 0,6006
Ztráta hmotnosti (g) po 2 hod sušení 0,0530 0,0511 0,0503 0,0481 0,0451 0,0442
Ztráta sušením (%) 8,312 8,184 8,251 7,994 8,637 7,359
Průměr (%)
Směrodatná odchylka
8,249
0,064
7,997
0,639
Tabulka č. 4: Stanovení zbytku po vysušení extraktů
Typ extraktu Oblast drogy Naváţka drogy Metanolový
Vodný
Snina
(g/2 ml) 0,0201
Stropkov
0,0201
Snina
0,0200
Stropkov
0,0200
29
Hmotnost extraktu (g) po 3 hod sušení 0,0057 0,0057 0,0064 0,0060 0,0064 0,0062 0,0069 0,0071
Průměr
Odparek
(g) 0,0057
(g/l) 2,85
0,0062
3,10
0,0063
3,15
0,0070
3,50
Tabulka č. 5 – Stanovení antioxidační aktivity drogy Herba hyperici (původ Snina) Objem Vztaţ. na vzorku odparek extraktu vzorku (ml) (µg) Metanolový 1 0,3 0,3 4,3135 0,5 0,5 7,1891 0,5 0,7 0,7 10,0648 0,7 1,0 1,0 14,3783 1,0 1,3 1,3 18,6917 1,3 1,5 1,5 21,5674 1,5 1,6 1,6 23,0052 1,6 2 0,3 0,3 4,2853 0,5 0,5 7,1421 0,5 0,7 0,7 9,9989 0,7 1,0 1,0 14,2842 1,0 1,3 1,3 18,5695 1,3 Typ
Číslo
A
A
% redukce Průměr
výluhu DPPH
DPPH
0,197 0,187 0,152 0,157 0,144 0,121 0,119 0,118 0,075 0,073 0,072 0,032 0,029 0,029 0,020 0,017 0,016 0,016 0,016 0,016 0,179 0,182 0,157 0,150 0,153 0,117 0,119 0,119 0,080 0,076 0,082 0,038 0,034 0,034
24,521 20,426 41,762 33,191 40,496 53,640 49,362 51,240 71,264 68,936 70,248 87,739 87,660 88,017 92,337 92,766 93,191 93,191 93,191 93,191 26,033 24,793 35,124 38,017 36,777 48,000 47,111 47,111 64,444 66,222 63,556 83,111 84,889 84,889
30
0,261 0,235 0,261 0,235 0,242 0,261 0,235 0,242 0,261 0,235 0,242 0,261 0,235 0,242 0,261 0,235 0,235 0,235 0,235 0,235 0,242 0,242 0,242 0,242 0,242 0,225 0,225 0,225 0,225 0,225 0,225 0,225 0,225 0,225
s
(%) 22,473 2,896 38,483 4,626
51,414 2,144
70,149 1,167
87,805 0,187
92,765 0,427
93,191 0,000
25,413 0,877 36,639 1,451
47,407 0,513
64,741 1,358
84,296 1,026
Pokračování tabulky č. 5
Typ extraktu
Vodný
Číslo
Objem vzorku vzorku (ml) 1,5 1,5 1,5 1,6 1,6 1,6 3 0,3 0,3 0,3 0,5 0,5 0,5 0,7 0,7 0,7 1,0 1,0 1,0 1,3 1,3 1,3 1,5 1,5 1,5 1,6 1,6 1,6 1 0,1 0,1 0,1 0,2 0,2 0,2 0,3 0,3 0,3
Vztaţ. na odparek (µg) 21,4263
22,8547
4,3143
7,1906
10,0668
14,3811
18,6954
21,5717
23,0098
3,1513
6,3025
9,4538
A
A
% redukce Průměr
výluhu DPPH
DPPH
0,020 0,019 0,020 0,016 0,016 0,017 0,152 0,166 0,164 0,147 0,150 0,149 0,120 0,118 0,118 0,078 0,078 0,067 0,039 0,033 0,036 0,019 0,017 0,018 0,021 0,019 0,019 0,159 0,152 0,150 0,126 0,118 0,123 0,091 0,091 0,091
91,111 91,556 91,416 93,133 93,133 92,704 34,764 28,755 29,614 36,910 35,622 36,052 48,498 48,018 48,018 65,639 65,639 70,485 82,819 85,463 84,141 91,630 92,511 92,070 90,789 91,667 91,667 17,617 20,833 21,875 34,375 38,542 35,938 52,850 52,604 52,604
31
0,225 0,225 0,233 0,233 0,233 0,233 0,233 0,233 0,233 0,233 0,233 0,233 0,233 0,227 0,227 0,227 0,227 0,227 0,227 0,227 0,227 0,227 0,227 0,227 0,228 0,228 0,228 0,193 0,192 0,192 0,192 0,192 0,192 0,193 0,192 0,192
s
(%) 91,361 0,227
92,990 0,248
31,044 3,250
36,195 0,656
48,178 0,277
67,254 2,798
84,141 1,322
92,070 0,441
91,374 0,506
20,108 2,220
36,285 2,105
52,686 0,142
Pokračování tabulky č. 5
Typ extraktu
Číslo
Objem vzorku vzorku (ml) 0,4 0,4 0,4 0,5 0,5 0,5 0,6 0,6 0,6 2 0,1 0,1 0,1 0,2 0,2 0,2 0,3 0,3 0,3 0,4 0,4 0,4 0,5 0,5 0,5 0,6 0,6 0,6 3 0,1 0,1 0,1 0,2 0,2 0,2
Vztaţ. na odparek (µg) 12,6050
15,7563
18,9076
3,1544
6,3088
9,4632
12,6176
15,7721
18,9265
3,1538
6,3076
A
A
% redukce Průměr
výluhu DPPH
DPPH
0,059 0,061 0,067 0,044 0,040 0,036 0,022 0,024 0,023 0,127 0,130 0,133 0,090 0,092 0,098 0,066 0,069 0,075 0,047 0,043 0,041 0,024 0,023 0,026 0,020 0,020 0,022 0,134 0,135 0,122 0,096 0,094 0,102
69,271 68,229 65,104 77,202 79,487 81,538 88,542 87,692 88,205 18,065 16,129 18,902 41,935 40,645 40,244 57,419 57,927 54,268 69,677 72,258 75,000 84,516 85,976 84,615 87,097 88,166 86,982 18,293 17,683 21,795 38,462 39,744 39,645
32
0,192 0,192 0,192 0,193 0,195 0,195 0,192 0,195 0,195 0,155 0,155 0,164 0,155 0,155 0,164 0,155 0,164 0,164 0,155 0,155 0,164 0,155 0,164 0,169 0,155 0,169 0,169 0,164 0,164 0,156 0,156 0,156 0,169
s
(%) 67,535 2,168
79,409 2,169
88,146 0,428
17,699 1,422
40,942 0,884
56,538 1,982
72,312 2,662
85,036 0,815
87,415 0,653
19,257 2,219
39,283 0,713
Pokračování tabulky č. 5
Typ extraktu
Číslo
Objem vzorku vzorku (ml) 0,3 0,3 0,3 0,4 0,4 0,4 0,5 0,5 0,5 0,6 0,6 0,6
Vztaţ. na odparek (µg) 9,4613
12,6151
15,7689
18,9227
A
A
% redukce Průměr
výluhu DPPH
DPPH
0,070 0,067 0,070 0,042 0,041 0,039 0,023 0,025 0,022 0,020 0,020 0,019
55,128 57,051 58,580 73,077 73,718 75,000 85,256 85,207 86,982 88,166 88,166 88,757
33
0,156 0,156 0,169 0,156 0,156 0,156 0,156 0,169 0,169 0,169 0,169 0,169
s
(%) 56,920 1,730
73,932 0,979
85,815 1,011
88,363 0,342
Tabulka č. 6 – Stanovení antioxidační aktivity drogy Herba hyperici ( původ Stropkov) Objem Vztaţ. na vzorku odparek extraktu vzorku (ml) (µg) Metanolový 1 0,1 0,1 1,5584 0,1 0,4 0,4 6,2335 0,4 0,7 0,7 10,9086 0,7 1,0 1,0 15,5837 1,0 1,3 1,3 20,2588 1,3 1,5 1,5 23,3756 1,5 1,6 1,6 24,9339 1,6 2 0,1 0,1 1,5534 0,1 0,4 0,4 6,2136 0,4 0,7 0,7 10,8739 0,7 1,0 1,0 15,5341 1,0 1,3 1,3 20,1943 1,3 Typ
Číslo
A
A
% redukce Průměr
výluhu DPPH
DPPH
0,172 0,179 0,186 0,155 0,152 0,154 0,110 0,111 0,113 0,080 0,077 0,075 0,040 0,039 0,034 0,023 0,024 0,024 0,019 0,018 0,019 0,194 0,194 0,200 0,144 0,152 0,152 0,113 0,113 0,113 0,076 0,075 0,081 0,045 0,038 0,041
18,868 15,566 12,264 26,887 28,302 27,358 48,113 47,642 46,698 62,264 63,679 66,518 82,143 82,589 84,821 89,732 89,286 89,286 91,518 91,964 91,518 13,393 9,767 6,977 33,023 29,302 29,302 47,442 47,442 47,442 64,651 65,116 62,326 79,911 83,036 81,696
34
0,212 0,212 0,212 0,212 0,212 0,212 0,212 0,212 0,212 0,212 0,212 0,224 0,224 0,224 0,224 0,224 0,224 0,224 0,224 0,224 0,224 0,224 0,215 0,215 0,215 0,215 0,215 0,215 0,215 0,215 0,215 0,215 0,215 0,224 0,224 0,224
s
(%) 15,566 3,302
27,516 0,721
47,484 0,721
64,154 2,166
83,185 1,435
89,435 0,258
91,667 0,258
10,046 3,217
30,543 2,148
47,442 0,000
64,031 1,495
81,548 1,568
Pokračování tabulky č. 6
Typ extraktu
Vodný
Číslo
Objem Vztaţ. na vzorku odparek vzorku (ml) (µg) 1,5 1,5 23,3012 1,5 1,6 1,6 24,8546 1,6 3 0,1 0,1 1,5565 0,1 0,4 0,4 6,2260 0,4 0,7 0,7 10,8956 0,7 1,0 1,0 15,5651 1,0 1,3 1,3 20,2346 1,3 1,5 1,5 23,3477 1,5 1,6 1,6 24,9042 1,6 1 0,1 0,1 3,5091 0,1 0,2 0,2 7,0182 0,2 0,3 0,3 10,5273 0,3
A
A
% redukce Průměr
výluhu DPPH
DPPH
0,022 0,022 0,022 0,021 0,020 0,022 0,205 0,203 0,202 0,156 0,158 0,154 0,118 0,114 0,118 0,080 0,082 0,078 0,046 0,040 0,043 0,029 0,027 0,026 0,022 0,021 0,022 0,168 0,173 0,161 0,132 0,129 0,141 0,110 0,105 0,099
90,179 90,179 90,179 90,625 91,071 90,179 8,482 9,375 9,009 29,730 28,829 30,631 46,847 48,649 46,847 63,964 63,063 64,865 79,279 81,982 80,631 86,937 87,838 88,288 90,090 90,541 90,090 19,231 12,183 18,274 36,538 34,518 28,426 47,115 46,701 49,746
35
0,224 0,224 0,224 0,224 0,224 0,224 0,224 0,224 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,222 0,208 0,197 0,197 0,208 0,197 0,197 0,208 0,197 0,197
s
(%) 90,179 0,000
90,625 0,446
8,955 0,449
29,730 0,901
47,447 1,040
63,964 0,901
80,631 1,351
87,688 0,688
90,240 0,260
16,563 3,823
33,161 4,223
47,854 1,652
Pokračování tabulky č. 6
Typ extraktu
Číslo
Objem Vztaţ. na vzorku odparek vzorku (ml) (µg) 0,4 0,4 14,0364 0,4 0,5 0,5 17,5455 0,5 0,6 0,6 21,0546 0,6 2 0,1 0,1 3,5154 0,1 0,2 0,2 7,0308 0,2 0,3 0,3 10,5462 0,3 0,4 0,4 14,0616 0,4 0,5 0,5 17,5770 0,5 0,6 0,6 21,0924 0,6 3 0,1 0,1 3,5049 0,1 0,2 0,2 7,0098 0,2
A
A
% redukce Průměr
výluhu DPPH
DPPH
0,070 0,077 0,073 0,057 0,045 0,046 0,028 0,034 0,032 0,176 0,169 0,171 0,134 0,140 0,125 0,110 0,112 0,106 0,086 0,085 0,090 0,043 0,048 0,052 0,039 0,029 0,040 0,170 0,154 0,151 0,139 0,123 0,122
66,346 60,914 64,904 72,596 77,157 76,650 86,538 83,654 84,615 15,385 18,750 17,788 35,577 32,692 39,904 47,115 46,154 49,038 58,654 59,135 56,731 79,327 76,923 75,000 81,250 86,058 80,769 17,874 17,204 18,817 32,850 33,871 34,409
36
0,208 0,197 0,208 0,208 0,197 0,197 0,208 0,208 0,208 0,208 0,208 0,208 0,208 0,208 0,208 0,208 0,208 0,208 0,208 0,208 0,208 0,208 0,208 0,208 0,208 0,208 0,208 0,207 0,186 0,186 0,207 0,186 0,186
s
(%) 64,055 2,814
75,468 2,500
84,936 1,469
17,308 1,733
36,058 3,630
47,436 1,469
58,173 1,272
77,083 2,168
82,692 2,924
17,965 0,810
33,710 0,792
Pokračování tabulky č. 6
Typ extraktu
Číslo
Objem Vztaţ. na vzorku odparek vzorku (ml) (µg) 0,3 0,3 10,5147 0,3 0,4 0,4 14,0196 0,4 0,5 0,5 17,5245 0,5 0,6 0,6 21,0294 0,6
A
A
% redukce Průměr
výluhu DPPH
DPPH
0,105 0,095 0,086 0,080 0,070 0,072 0,051 0,052 0,044 0,045 0,031 0,022
49,275 48,925 53,763 61,353 62,366 61,290 75,362 72,043 76,344 78,261 85,024 88,172
37
0,207 0,186 0,186 0,207 0,186 0,186 0,207 0,186 0,186 0,207 0,207 0,186
s
(%) 50,655 2,698
61,670 0,604
74,583 2,254
83,819 5,064
Tabulka č. 7: Srovnání průměrné antioxidační aktivity extraktů z drog různého původu. Původ drogy Snina
Typ extraktu Hmotnost vztaţená % redukce na odparek (µg) DPPH metanolový 4,3044 26,987 7,1739 37,106 10,0435 49,000 14,3479 67,381 18,6522 85,414 21,5218 92,065 22,9566 92,518 vodný 3,1532 19,021 6,3063 38,837 9,4594 55,381 12,6126 71,259 15,7658 83,420 18,9189 87,975 Stropkov metanolový 1,5561 11,522 6,2244 29,263 10,8927 47,458 15,5610 64,050 20,2292 81,788 23,3415 89,100 24,8976 90,844 vodný 3,5098 17,278 7,0196 34,309 10,5294 48,648 14,0392 61,299 17,5490 75,711 21,0588 83,816
38
s 2,341 2,244 0,978 1,774 0,845 0,365 0,251 1,954 1,234 1,285 1,936 1,332 0,474 2,323 1,257 0,587 1,521 1,451 0,315 0,321 2,122 2,882 2,425 1,563 2,307 2,667
IC 50 (µg/ml)
9,8927
9,9697
11,9007
11,3659
Tabulka č. 8: Stanovení antioxidační aktivity eluátu rutinu z metanolového a vodného extraktu Hyperici herba (původ Snina). (Kontrola – hodnoty pro eluát odpovídající velikosti z chromatografické desky, který nepřišel do styku se vzorkem.)
Typ extraktu
Číslo
Objem Vztaţ. na vzorku odparek vzorku (µl) (mg)
metanolový 1
250,0
2,5225
2
250,0
2,5060
3
250,0
2,5230
1
250,0
2,5001
2
250,0
2,5035
3
250,0
2,5030
kontrola vodný
kontrola
Typ
Číslo
extraktu
vzorku
metanolový
1 2 3 1 2 3
vodný
A
A
% redukce Průměr
výluhu DPPH
DPPH
0,067 0,070 0,054 0,025 0,030 0,022 0,046 0,032 0,029 0,197 0,043 0,041 0,019 0,040 0,039 0,058 0,055 0,039 0,036 0,161
67,476 66,019 73,786 87,864 85,437 89,320 77,670 84,466 85,922 4,369 77,005 78,075 89,840 74,843 75,472 63,522 65,409 75,472 77,358 13,904
0,206 0,206 0,206 0,206 0,206 0,206 0,206 0,206 0,206 0,206 0,187 0,187 0,187 0,159 0,159 0,159 0,159 0,159 0,159 0,187
s
(%) 69,094 4,129
87,540 1,962
82,686 4,405
81,640 7,121
71,279 6,725
72,746 6,424
Redukce DPPH Redukce DPPH Redukce DPPH rutinu zmenšená o kontrolu rutinu (%) kontrola (%) (%) 79,773
4,369
75,404
75,222
13,904
61,318
39
Tabulka č. 9: Stanovení antioxidační aktivity eluátu rutinu z metanolového a vodného extraktu Herba hyperici (původ Stropkov). (Kontrola – hodnoty pro eluát odpovídající velikosti z chromatografické desky, který nepřišel do styku se vzorkem.)
Typ extraktu
Číslo
Objem Vztaţ. na vzorku odparek vzorku (µl) (mg)
A
metanolový 1
250,0
2,5135
2
250,0
2,5055
3
250,0
2,5105
1
250,0
2,5065
2
250,0
2,5110
3
250,0
2,5035
kontrola vodný
kontrola
A
% redukce Průměr
výluhu DPPH
DPPH
0,070 0,047 0,063 0,035 0,041 0,050 0,030 0,031 0,030 0,197 0,057 0,074 0,072 0,054 0,073 0,065 0,063 0,065 0,051 0,135
68,610 78,924 71,749 84,305 81,614 77,578 86,547 86,099 86,547 11,659 62,500 51,316 52,632 64,474 51,974 57,237 58,553 57,237 66,447 11,184
0,223 0,223 0,223 0,223 0,223 0,223 0,223 0,223 0,223 0,223 0,152 0,152 0,152 0,152 0,152 0,152 0,152 0,152 0,152 0,152
(%) 73,094 5,287
81,166 3,386
86,398 0,259
55,482 6,113
57,895 6,276
60,746 4,981
Typ
Číslo
Redukce DPPH
Redukce DPPH
extraktu
vzorku
rutinu (%)
kontrola (%)
metanolový
1 2 3 1 2 3
80,219
11,659
68,560
58,041
11,184
46,857
vodný
40
s
Redukce DPPH rutinu zmenšená o kontrolu (%)
Graf č. 1: Antioxidační aktivita metanolových extraktů
% redukce DPPH
100,00 Snina 1
80,00
Snina 2
60,00
Snina 3 Stropkov 1
40,00
Stropkov 2 20,00
Stropkov 3
0,00 1,5565 6,2260 10,8956 15,5651 20,2346 23,3477 24,9042 m ( µg )
Graf č. 2: Antioxidační aktivita metanolových roztoků vodných extraktů
% redukce DPPH
100,00 Snina 1
80,00
Snina 2 60,00
Snina 3 Stropkov 1
40,00
Stropkov 2
20,00
Stropkov 3
0,00 3,5049
7,0098 10,5147 14,0196 17,5245 21,0294 m ( µg )
41
Graf č. 3: Graf lineární regrese antioxidační aktivity metanolového extraktu
% redukce DPPH
100,00 80,00
y = 3,1413x + 18,924 R2 = 0,989
60,00
Snina
40,00
Stropkov y = 3,622x + 6,8955 R2 = 0,9976
20,00 0,00 0,0000
5,0000
10,0000
15,0000
20,0000
25,0000
m ( µg )
Graf č. 4: Graf lineární regrese antioxidační aktivity metanolového roztoku vodného extraktu
% redukce DPPH
100,00 80,00
y = 4,0246x + 9,876 R20,969 =
60,00
Snina
40,00
Stropkov y = 3,8223x + 6,5561 R20,9914 =
20,00 0,00 0,0000
5,0000
10,0000
15,0000
m ( µg )
42
20,0000
25,0000
4.2 TENKOVRSTVÁ CHROMATOGRAFIE
Obrázek č. 1: Schéma chromatogramu metanolového extraktu po postřiku difenylboryloxyetylaminem 1 %. Mobilní fáze S1: kyselina mravenčí bezvodá R, voda R, etyl-acetát R (6:9:90)
červená
Rf 0,98
Rf 0,98
červená zelená červená červená
0,82 0,76 0,70 0,60
0,82 0,75 0,69 0,61
zelená oranţová
0,26 0,17
0,28 0,19
0,17
oranţová červená
0,05 0,00
0,05 0,00
0,00
Snina
Stropkov
Rf
0,07
Hyperosid
43
Rf
Rutin
Pokračování obrázku č. 1. Mobilní fáze S2: kyselina mravenčí bezvodá R, voda R, butan-2-on, etyl-acetát R (10:10:30:50)
červená červená
Rf 1,00 0,96
Rf 1,00 0,96
zelená
0,58
0,58
oranţová
0,47
0,47
oranţová
0,25
0,25
Snina
Stropkov
Rf
Rf
Rf
0,62 0,47 0,25
Hyperosid
44
Rutin
Kys. chlorogenová
Obrázek č. 2: Schéma chromatogramu metanolového extraktu po postřiku roztokem DPPH 0,2 %. Mobilní fáze S1: kyselina mravenčí bezvodá R, voda R, etyl-acetát R (6:9:90) Rf
Rf
ţlutá
0,71
0,71
ţlutá
0,50
0,50
ţlutá ţlutá
0,32 0,24
0,34 0,24
ţlutá
0,07
0,07
Snina
Rf
Rf
0,23
0,08
Stropkov
Hyperosid
Rutin
Mobilní fáze S2: kyselina mravenčí bezvodá R, voda R, butan-2-on, etyl-acetát R (10:10:30:50) Rf
Rf
ţlutá
0,73
0,75
ţlutá
0,50
0,51
ţlutá
0,28
0,29
Snina
Stropkov
Rf
Rf
Rf
0,50
0,31
Hyperosid
45
Rutin
Kys. chlorogenová
Obrázek č. 3: Schéma chromatogramu metanolového roztoku vodného extraktu po postřiku difenylboryloxyetylaminem 1 %. Mobilní fáze S1: kyselina mravenčí bezvodá R, voda R, etyl-acetát R (6:9:90) Rf
Rf
červená
0,79
0,77
modrozel
0,46
0,47
ţlutá
0,32
0,35
ţlutá
0,10
0,15
Snina
Stropkov
Rf
Rf
0,31 0,13
Hyperosid
Rutin
Mobilní fáze S2: kyselina mravenčí bezvodá R, voda R, butan-2-on, etyl-acetát R (10:10:30:50) Rf
Rf
modrozel
0,65
0,66
ţlutá
0,55
0,55
ţlutá
0,35
0,36
Snina
Stropkov
Rf
Rf
Rf
0,63 0,53 0,35
Hyperosid
46
Rutin
Kys. chlorogenová
Obrázek č. 4: Schéma chromatogramu metanolového roztoku vodného extraktu po postřiku roztokem DPPH 0,2 %. Mobilní fáze S1: kyselina mravenčí bezvodá R, voda R, etyl-acetát R (6:9:90) Rf
Rf
modrozel
0,45
0,47
ţlutá
0,35
0,38
ţlutá
0,12
0,15
Snina
Stropkov
Rf
Rf
0,30 0,13
Hyperosid
Rutin
Mobilní fáze S2: kyselina mravenčí bezvodá R, voda R, butan-2-on, etyl-acetát R (10:10:30:50) Rf
Rf
modrozel
0,45
0,47
ţlutá
0,35
0,38
ţlutá
0,12
0,15
Snina
Stropkov
Rf
Rf
Rf
0,30 0,13
Hyperosid
47
Rutin
Kys. chlorogenová
5 DISKUSE Třezalka tečkovaná se stala významným předmětem zájmu vědců zkoumajících antioxidační aktivitu. Tato široce rozšířená léčivá rostlina obsahuje mnoho sloučenin s dokumentovanou biologickou aktivitou, zahrnující flavonoidy, naftodiantrony, fluoroglucinoly,
proantocyanidiny,
xanthony a
silici
(22).
Stala
se
jedním
z nejpopulárnějších rostlinných přípravků v USA a také v Evropě (23). Toto prvenství je dáno hlavně klinicky prokázaným účinkem při terapii mírné deprese. Zvýšený zájem o Hypericum perforatum je dán také díky jejím antioxidačním a antiradikálovým vlastnostem. Výsledky studie, kterou provedli Hunt E. J. a kol. (24) ukázaly na inhibici volných radikálů produkovaných v jednotlivých buňkách i cévních tkáních pomocí extraktu z třezalky. Vysoká atioxidační aktivita byla prokázána u řady bulharských léčivých rostlin, mezi něţ patří také třezalka tečkovaná, ve studii Ivanova D. a kol. (25). Antioxidační potenciál extraktů Hypericum perforatum a jejích částí je hodnocen na základě obsahu fenolických sloučenin (2). Více jak 57 % všech fenolických sloučenin přítomných v extraktu jsou flavonoidy, hlavně kvercetin a jeho glykosidy. Na základě studií bylo potvrzeno, ţe právě tento typ sloučenin je nejvýznamnějším antioxidantem. Mají strukturální aspekty určující vysoký antioxidační potenciál (2). Rozdíly ve struktuře a substituci flavonoidů mají za následek různé antioxidační schopnosti flavonoidů (26). Studie (2) (11) a (27) se shodly na vlivu volných OH- skupin fenolických sloučenin na AA. Významně zvýšená antioxidační a antiradikálová aktivita je v případě substituce kruhu C OH skupinou v poloze 3 a 5 a navíc dvojná vazba v poloze 2,3 je v konjugaci s oxo skupinou v poloze 4. Podle výsledků získaných ze studie Zou Y. a kol. (28), můţe být antioxidační mechanismus třezalky tečkované připisován schopnosti zhášet volné radikály, vázat (chelatovat) kovy a schopnosti zhášet reaktivní kyslíkaté sloučeniny. Studie (2) hodnotící antioxidační potenciál etanolového extraktu Hypericum perforatum zaznamenala výrazné sníţení lipidové peroxidace. Flavonoidní aglykony pak byly označeny za hlavní aktéry antioxidačního účinku extraktu a ochrany proti lipidové peroxidaci. Hypericin a hyperforin nemají významnější podíl na antioxidačních vlastnostech. Studie také upozorňuje na konzumaci třezalky tečkované a farmaceutických produktů zahrnující potravní doplňky s antioxidačním efektem s prospěšným vlivem na zdraví. K tomuto konstatování se přidává také studie Wach A. a kol. (29).
48
Peroxidaci lipidových membrán liposomů v sérii in vitro testů bránil extrakt Hypericum perforatum bohatý na flavonoidy. Výsledkem této studie (28) bylo prokázání schopnosti zametat volné radikály a antioxidační vlastnosti třezalky tečkované a návrh přípravků s obsahem třezalky tečkované pro léčbu onemocnění postihující srdce. Ovšem studie Peeblesa K. A. a kol. (23) zdůrazňuje schopnost třezalkového extraktu interagovat s jinými léčivy. Hlavně díky sloučeninám hypericin a hyperforin, které indukují cytochrom P 450 jeho izoformy 1A2 a 3A4. Dochází tak ke změně metabolismu léčiv odbourávaných tímto enzymem (např. warfarinu, teofylinových přípravků, felodipinu, statinů). Pro inhibici lipidové peroxidace, schopnost zhášet hydroxylový radikál a pro vzájemné působení s volným radikálem DPPH se studie Benedí J. a kol. (3) zaměřila na standardizovaný extrakt třezalky tečkované. Výsledky ukazují na zhášení DPPH radikálu v závislosti na mnoţství extraktu. Byla zjištěna IC50 109 µg / ml, která odpovídá standardizovanému extraktu s obsahem 0,3 % hypericinů. To také potvrdila studie (30). Na mnoţství extraktu je také závislá prokázaná inhibice enzymové i neenzymové peroxidace v mozkové kůře potkana. Skutečnost, ţe aktivita volných radikálů a lipidová peroxidace mohou být zahrnuty do tvorby a rozvoje neurodegenerativních poruch, nastolila otázku, zda-li i jiné neurologické stavy, zahrnující deprese, mohou být ovlivněny reaktivními sloučeninami kyslíku. Proto také byly zhodnoceny antioxidační vlastnosti tradičních antidepresiv. Výsledkem je, ţe klorgylin a deprenyl významně inhibují hydroxylový radikál. Studie ukazuje také na zjevnou inhibiční aktivitu třezalky zhášet reaktivní formy kyslíku, ale i na schopnost zhášet reaktivní formy dusíku. Studie Luo L. a kol. (16) to také dokazuje. NO-syntáza katalyzuje oxidaci guanidinu na L-arginin za tvorby NO. NO můţe reagovat se superoxidovým radikálem O2· za vzniku vysoce reaktivního peroxynitritu ONOO¯, který hraje roli v buněčném poškození nebo zničení buněk. Luo L. a kol. (16) zjišťoval pravděpodobný inhibiční efekt flavonoidů třezalky tečkované na NO-syntázu. Kvercetin a hyperosid byly nejaktivnějšími sloučeninami. Naopak kvercitrin a rutin neukázaly ţádny inhibiční efekt. Včasným a opakovaným uţitím inhibitoru NO-syntázy byl zaznamenán ochranný vliv na CNS. Kvercetin a jeho glykosid hyperosid (kvercetin 3O-β galaktosid) byly dále studovány na zvířecích modelech. Výsledky ukázaly, ţe kvercetin je neselektivní inhibitor všech tří izoforem NO-syntázy, endoteliální, neuronové i indukované. Hyperosid prokázal svoji selektivitu na zvýšené inhibici
49
neuronové NO-syntázy. Ze závěru studie plyne vztah mezi inhibicí NO-syntázy a antidepresivním účinkem flavonoidů (kvercetin a hyperosid) z Hypericum perforatum. Některé studie ukazují, ţe léčivé rostliny mají ochranný efekt proti buněčné smrti neuronů způsobené oxidativním stresem. Léčba třezalkou tečkovanou inhibuje peroxidem vodíku indukované zvýšení aktivity enzymu kaspáza-3, který hraje důleţitou roli v apoptóze buňky. Významný neuroprotektivní efekt Hypericum perforatum proti H2O2 indukované apoptóze v lidské buněčné linii neuronových buněk byl prokázán studií Janga M. H. a kol. (31). Studie (11) se zabývala vztahem rozpustnosti sloučenin v reakčním prostředí a jejich aktivitou. Rozpustnost aglykonu v emulzi je větší neţ glykosidu, který si přirozeně vybere vodnou fázi v emulzi typu olej ve vodě. Vysoká AA biapigeninu a hypericinu (aglykony) je přisuzována jejich rozpustnosti v olejové fázi. Zjištění, ţe volné OH skupiny ve fenolických sloučeninách jsou nejvíce zodpovědné za AA, je potvrzeno skutečností, ţe biapigenin a hypericin obsahují více OH skupin neţ jiné sloučeniny izolované z etylacetátové frakce metanolového extraktu Hypericum hyssopifolium. Cílem mé práce bylo zjistit antioxidační aktivitu a schopnost zhášet volné radikály in vitro u extraktů z Herba hyperici. K dispozici jsem měla nať Hypericum perforatum ze dvou oblastí Prešovského kraje (Slovensko), Snina a Stropkov. Antioxidační aktivitu jsem stanovovala metodou zhášení radikálu DPPH. Spektrofotometricky jsem měřila pokles absorbance roztoku při vlnové délce 517 nm. Antioxidační aktivita se vyjadřuje jako % redukce DPPH podle vzorce:
%redukceDPPH (1
AVZ ) 100 ASV
kde AVZ = absorbance testovacího vzorku po uplynutí doby inkubace ASV = absorbance slepého vzorku po uplynutí doby inkubace nebo hodnotou IC50, coţ odpovídá naváţce vzorku nebo koncentraci extraktu, která způsobí pokles absorbance DPPH na 50 %. Metodou jsem stanovovala AA vodného a metanolového extraktu z nati. Protoţe z literatury je známo, ţe na AA se podílejí flavonoidy, stanovila jsem jejich mnoţství v droze. Stanovení jsem provedla postupem podle ČL 2002 článku Crataegi folium cum flore (21). Metoda je zaloţena na spektrofotometrickém stanovení reakčních produktů s kyselinou boritou a šťavelovou. Výsledky uvádí tabulka č.1. Obsah flavonoidů, přepočtený na vysušenou drogu a vyjádřený v % hyperosidu, je u natí v rozmezí 50
3,688 ± 0,005 aţ 3,904 ± 0,013 %. Český lékopis 2002 (21) konkrétní obsah flavonoidů neuvádí, podle literárních údajů můţe být v droze 2 – 4 % flavonoidů (8). Jak vyplývá z výsledků stanovení, je analyzovaná droga z hlediska obsahu flavonoidů velmi kvalitní. Kvalita drogy je podle lékopisu posuzována podle obsahu hypericinů. Obsah hypericinu stanoveného podle ČL 2002 článku Hyperici herba (21) udává tabulka č. 2. Obsah v analyzovaných vzorcích, počítáno na vysušenou drogu, je 0,140 ± 0,003 aţ 0,127 ± 0,003 %. Poţadavek lékopisu (21) je nejméně 0,08 % hypericinů, počítáno jako hypericin, i tento ukazatel analyzované vzorky několikanásobně převyšují. U třezalky z oblasti Snina byl stanoven niţší obsah flavonoidů i niţší obsah hypericinů. Rozdíl v mnoţství sekundárních metabolitů u Hypericum perforatum pěstovaných v různých lokalitách se zabývá studie (32). Autor studie poukazuje na silný genetický vliv, na klimatické faktory, nadmořskou výšku, sluneční svit, geografickou polohu, sloţení půdy. Výsledky zjištěné antioxidační aktivity Herba hyperici uvádí tabulka č. 5-7 a grafy č. 1-2. Vodné a metanolové extrakty drogy z oblasti Snina prokázaly jen nepatrně vyšší antioxidační aktivitu neţ extrakty drogy z oblasti Stropkov. Při porovnání hodnot IC50 (mnoţství drogy v μg, které způsobuje pokles absorbance DPPH na 50 %) vyplývá, ţe mezi vzorky nejsou výrazné rozdíly. IC50 analyzovaných vzorků se pohybuje v rozmezí 9,8927 – 11,9007 μg/ml. Konkrétní hodnoty IC50 uvádí tabulka č. 7. Hodnota IC50 publikovaná v literatuře, pro standardizovaný extrakt s obsahem 0,3 % hypericinů, je 109 μg/ml (3). Tenkovrstvou chromatografií byly v extraktech (metanolovém i vodném) dokazovány látky pravděpodobně zodpovědné za antioxidační aktivitu, a to především flavonoidy. Jako mobilní fáze byly pro TLC pouţity kyselina mravenčí bezvodá R, voda R, etylacetát R (6:9:90) a kyselina mravenčí bezvodá R, voda R, butan-2-on, etyl-acetát R (10:10:30:50), nejčastěji pouţívané při chromatografii flavonoidních drog. Detekce byla provedena postupem ČL 2002 (21) postřikem s roztokem difenylboryloxyetylaminu 1 %. K důkazu antioxidačně působících látek byla deska chromatogramu po důkladném odvětrání zbytků rozpouštědel postříkána roztokem radikálu DPPH 0,2 %. Antioxidačně působící látky se projevily ţlutým zbarvením na fialovém pozadí. Schéma chromatogramu je na obr. č. 1 – 4. Nejvýraznější skvrna, která odpovídala rutinu, byla dále hodnocena. Ze souboru látek přítomných v metanolovém i vodném extraktu z drogy byla skvrna rutinu separována semipreparativní tenkovrstvou chromatografií. V eluátu skvrny byla 51
měřena antioxidační aktivita reakcí s DPPH radikálem, od hodnoty antioxidační aktivity skvrny
rutinu
byla
odečtena
hodnota
antioxidační
aktivity
eluátu
z čisté
chromatografické desky (v tab. 8 a 9 označeno jako kontrola). Výsledky měření udává tabulka č. 8 a 9. Do metanolového extraktu přejde patrně více látky z drogy neţ do vodného extraktu. Antioxidační aktivita rutinu získaného z extraktů drogy ze Sniny byla 61,318 % resp. 75,404 % redukce DPPH, u rutinu získaného z extraktů drogy původu ze Stropkova byla antioxidační aktivita 46,857 % resp. 68,560 % redukce DPPH.
52
6 ZÁVĚR Metodou zaloţenou na zhášení radikálu DPPH byla spektrofotometricky stanovena antioxidační aktivita extraktů z drogy Hyperici herba pocházející ze sběru ve dvou různých lokalitách. Analyzovány byly vodné a metanolové extrakty. Porovnání hodnot IC50 ukazuje jen nevýrazné rozdíly v antioxidační aktivitě v pořadí: metanolový extrakt drogy z oblasti Snina (9,8927 μg/ml) > vodný extrakt drogy z oblasti Snina (9,9697 μg/ml) > vodný extrakt drogy z oblasti Stropkov (11,3659 μg/ml) > metanolový extrakt drogy z oblasti Stropkov (11,9007 μg/ml). Tenkovrstvou chromatografií byly v metanolovém i vodném extraktu dokázány flavonoidy. Obsah flavonoidů byl u drogy původu Stropkov 3,904 ± 0,013 % a drogy původu Snina 3,688 ± 0,005 % přepočteno na vysušenou drogu. Obsah hypericinů byl u drogy z lokality Stropkov 0,140 ± 0,003 % a u drogy z lokality Snina 0,127 ± 0,003 % přepočteno na vysušenou drogu. U rutinu získaného z extraktů semipreparativní tenkovrstvou chromatografií byla zjištěna antioxidační aktivita v pořadí: metanolový extrakt drogy z oblasti Snina > metanolový extrakt drogy z oblasti Stropkov > vodný extrakt drogy z oblasti Snina > vodný extrakt drogy z oblasti Stropkov. Antioxidační aktivita rutinu získaného z extraktů semipreparativní tenkovrstvou chromatografií dosahovala v závislosti na pouţitém extrakčním rozpouštědle a původu vzorku těchto hodnot: metanolový extrakt drogy z oblasti Snina 75,404 %, metanolový extrakt drogy z oblasti Stropkov 68,560 %, vodný extrakt drogy z oblasti Snina 61,318 %, vodný extrakt drogy z oblasti Stropkov 46,857 %.
53
7 LITERATURA 1.
Racek, J.: Oxidační stres a moţnosti jeho ovlivnění. Praha, Galen, 2003.
2.
Silva, B. A., Ferreres, F., Malva, J. O. et al.: Phytochemical and antioxidant charakterization of Hypericum perforatum alcoholic extracts. Food Chem., 2005; 90, 157-167.
3.
Benedí, J., Arroyo, R., Romeco, C. et al.: Antioxidant properties and protective effects of a standardized extract of Hypericum perforatum on hydrogen peroxide – induced oxidative damage in PC 12 cells. Life Sci., 2004; 75, 1263 –1276.
4.
Štípek, S. a kol.: Antioxidanty a volné radikály ve zdraví a v nemoci. Praha, Grada, 2000.
5.
Hubík, J., Dušek, J., Spilková, J. a kol.: Obecná farmakognosie II. Sekundární látky. Praha, SPN, 1989.
6.
Agostinisa, P., Vantieghema, A., Merlevedea, W. et al.: Hypericin in cancer treatment: more light on the way. Int. J. Bioch. Cell Biol., 2002; 34, 221 – 241.
7.
Baloun, J., Beneš, K., Minařík, J.: Farmaceutická botanika. Praha, Avicenum, 1978.
8.
WHO monographs on selected medicinal plants. 2. ed. Geneva, World Health Organization, 2002.
9.
Rezvania, A. H., Overstreetb, D. H., Perfumic, M. et al.: Plant derivatives in the treatment of alcohol dependency. Pharmacol. Biochem. Be., 2003; 75, 593 – 606.
10. Tomko, J. a kol.: Farmakognozia učebnica pre farmaceutické fakulty. 2. vyd. Martin, Osveta, 1999. 11. Cakir, A., Mavi, A., Yildirim, A. et al.: Isolation and characterization of antioxidant phenolic compounds from the aerial parts of Hypericum hyssopifolium L. by activity – guided fractionation. J. Ethnopharmacol., 2003; 87, 73 – 83. 12. Butterweck, V., Böckersb, T., Kortea, B. et al.: Long – term effects of St. John΄s wort and hypericin on monoamine levels in rat hypothalamus and hippocampus. Brain Res., 2002; 930, 21 – 29. 13. Panocka, I., Perfumi, M., Angeletti, S. et al.: Effects of Hypericum perforatum extract on ethanol intake, and on behavioral despair. Pharmacol. Biochem. Be., 2000; 66, 105 – 111.
54
14. Khalifa, A. E.: Hypericum perforatum as a nootropic drug: enhancement of retrieval memory of a passive avoidance conditioning paradigma in mice. J. Ethnopharmacol., 2001; 76, 49 - 57. 15. El-Sherbinya, D. A., Khalifaa, A. E., Attiab, A. S. et al.: Hypericum perforatum extrakt demonstrates antioxidant properties against elevated rat brain oxidative status induced by amnestic dose of skopolamine. Pharmacol. Biochem. Be., 2003; 76, 525 - 533. 16. Luo, L., Sun, Q., Mao, Y. Y. et al.: Inhibitory effects of flavonoids from Hypericum perforatum on nitric oxide synthese. J. Ethnopharmacol., 2004; 93, 221 - 225. 17. Menegazzia, M., Paolab, R. D., Mazzonb, E. et al.: Hypericum perforatum attenuates the development of carrageenan – induced lung injury in mice. Free Rad. Biol. Med., 2005; v tisku. 18. Kergeta, M., Kotnika, P., Hadolinb, M. et al.: Phenols, proanthocyanidins, flavones and flavonols in some plant materials and their antioxidant activities. Food Chem., 2005; 89, 191 - 198. 19. www: Mikro-verze AISLP-ČR. 20. Masuda, T., Inaba, Y., Maekawa, T. et al.: Simple detection method of powerful antiradical compounds in the raw extract of plants and its application for the identification of antiradical plant constituents. J. Agric. Food Chem., 2003; 51, 1831 – 1838. 21. Český lékopis 2002. Praha, Grada, 2002. 22. Hostenska, K., Reichlingb, J., Bommerc, S.: Hyperforin a constituent of St. John΄s wort ( Hypericum perforatum L.) extract induced apoptosis by triggering activation of caspases and with hypericin synergistically exerts cytotoxicity toward human malignant cell lines. Eur. J. Pharm. Biopharm., 2003; 56, 121 – 132. 23. Peeblesa, K. A., Bakerb, R. K., Kurza, E. U. et al.: Catalytic inhibition of human DNA topoisomerase II; by hypericin, a naphthodiantrone from St. John΄s wort ( Hypericum perforatum ). Biochem. Pharmacol., 2001; 62, 1059 – 1070. 24. Hunt, E. J., Lester, C. E., Lester, E. A. et al.: Effect of St. John΄s wort on free radical production. Life Sci., 2001; 69, 181 – 190. 25. Ivanova, D., Gerova, D., Chervenkov, T. et al.: Polyphenols and antioxidant capacity of Bulgarian medicinal plants. J. Ethnopharmacol., 2005; 96, 145 – 150.
55
26. Aaby, K., Hvattum, E., Skrede, G.: Analysis of flavonoids and other phenolic compounds using high – performance liquid chromatography with coulometric array detection: relationship to antioxidant activity. J. Agric. Food Chem., 2004; 52, 4595 – 4603. 27. Tsimogiannis, D., Oreopoulon, V.: Free radical scavenging and antioxidant activity of 5, 7, 3; 4, 2; - hydroxy – substituted flavonoids. Innov. Food Sci. Emerg. Technol., 2004; 5, 523 – 528. 28. Zou, Y., Lu, Y., Wei, B.: Antioxidant activity of a flavonoid – rich extract of Hypericum perforatum L. in vitro. J. Agric. Food Chem., 2004; 52, 5032 – 5039. 29. Wach, A., Pyrzyńska, K., Biesaga, M.: Quercetin content in some food and herbal samples. Food Chem., 2005; v tisku. 30. Choi, Ch. W., Kim, S. C., Hwang, S. S. et al.: Antioxidant activity and free radical scavenging kapacity between Korean medicinal plants and flavonoids by assay – guided comparison. Plant Sci., 2002; 163, 1161 – 1168. 31. Janga, M. H., Leea, T. H., Shina, M. Ch. et al.: Protective effect of Hypericum perforatum Linn (St. John΄s wort) against hydrogen peroxide – induced apoptosis on human neuroblastoma cells. Neurosci. Lett., 2002; 329, 177 – 180. 32. Abreu I. N., Porto A. L. M., Marsaioli A. et al.: Distribution of bioactive substances from Hypericum brasiliense during plant growth. Plant Sci., 2004; 167, 949 – 954.
56
