UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA KATEDRA EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE ROSTLIN

Translace mRNA a její regulace u rostlin Bakalářská práce Filip Linhart Školitel: doc. RNDr. David Honys, Ph.D. Praha 2015

Poděkování Chtěl bych poděkovat svému školiteli doc. RNDr. Davidu Honysovi, Ph.D. za odbornou pomoc, cenné rady a ochotnou spolupráci během vyhotovení této práce a vyhledávání odborné literatury.

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vyhotovil samostatně s použitím všech uvedených literárních pramenů a souhlasím s jejím zveřejněním.

V Praze, dne 31. července 2015 Filip Linhart 2    

ABSTRAKT Translace mRNA je po transkripci další důležitou etapou genové exprese, a na její regulaci závisí skutečné množství syntézy jednotlivých proteinů a následné fyziologické, ontogenické a fenotypické jevy. U rostlin nabývá regulace translace značného významu během progamické fáze, oplození a biologie semen, kdy jsou s různou mírou selektivity translatovány již skladované molekuly mRNA. Dále se regulace translace uplatní díky své rychlosti a flexibilitě i v reakci na abiotické krizové situace, což má velký význam pro schopnost přežití a adaptace rostlin jakožto přisedlých organismů. Globální regulaci doprovází selektivní regulace exprese jednotlivých transkriptů, což moduluje translační odpověď. Nakonec je mechanismus translace, tak jako u jiných organismů, terčem virových napadení, a to často za pozoruhodných okolností a strategií ze strany patogena i hostitele. Cílem této rešerše je podat širší obraz současných znalostí regulačních cest translačního aparátu u rostlin, nejnovějších objevů a perspektiv. Molekulární a fyziologická úroveň ve vztahu k makroskopické realitě průběhu života a okolním podmínkám otevírají nové obzory k pochopení základů životní strategie rostlin a buněčných a molekulárních procesů vůbec.

Klíčová slova Translace, regulace translace, rostliny, regulace genové exprese, mRNA, ribozóm, fosforylace, pyl, klíčení, ontogeneze, abiotický stres, virové napadení

ABSTRACT After transcription, mRNA translation represents further important step in gene expression pathway. Translational regulation controls the abundance of synthesized proteins and the subsequent physiological, ontogenic and phenotypical consequences. In plants, the translational regulation takes on an even higher importance during the progamic phase, fertilization and seeds biology, when the already stocked mRNA transcripts are being translated with varying degrees of selectivity. Furthermore, translational regulation, which allows for a quick reaction and a notable flexibility, a vital function during abiotic stress, is essential for the adaptation and survival of sessile organisms like plants. Global regulation is associated with selective regulation of the expression of individual transcripts, which allows modulation of the response. Finally, similarly for all other organisms, the translation mechanism of plants is a target of viral infections, which initiates interesting responses from both the pathogen and the host. This review presents the summary of our current knowledge of the regulatory means of the mRNA translation system in plants, including the latest discoveries and perspectives. The relation between the molecular and physiological level on one side, and the macroscopic reality of life within the environmental conditions on the other side open up new horizons in our understanding of fundamentals of plants’ survival strategies and, more generally, of cellular and molecular processes.

Keywords Translation, translational regulation, plants, gene expression regulation, mRNA, ribosome, phosphorylation, pollen, germination, ontogenesis, abiotic stress, viral infection

3    

OBSAH SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK

5

ÚVOD

6

LITERÁRNÍ PŘEHLED

7

1. Translace v eukaryotické buňce

7

Zrání a export molekuly mRNA Molekula tRNA Popis ribozómu Iniciace translace Elongace a terminace translace

7 8 9 10 11

2. Specificita translace a její regulace u rostlin Izoformy iniciačních faktorů eIF4E a eIF4G u rostlinné buňky Fosforylace a její význam v obecné regulaci translace

14 14 14

3. Význam translace a její regulace v gametofytu a během ontogeneze 17 Pohlavní rozmnožování (kryto)semenných rostlin obecně Samčí gametofyt, význam a podstata translační regulace Klíčení semen, význam a podstata translační regulace

4. Regulace translace u rostlin reakcí na vliv klimatických faktorů

17 18 21

25

Podstata problematiky Regulace translace v kontextu osvětlení a fotosyntézy Reakce rostlinného organismu na změny teploty Reakce rostlinného organismu na variace dostupnosti vody

25 25 26 28

5. Regulace translace u rostlin v situaci virové infekce

32

Obecně o virové infekci Virové infekce u rostlin a jejich strategie využití translačního aparátu hostitele Umlčení mRNA jako obranný mechanismus rostlin

32 32 34

ZÁVĚR

35

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

36

4    

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ABA: kyselina abscisová, abscisic acid ATP: adenosintrifosfát CRT: kalretikulin DNA: desoxyribonukleová kyselina dsRNA: dvouřetězová – double strand RNA eEF: eukaryotický elongační faktor, eukaryotic elongation factor eIF: eukaryotický iniciační faktor, eukaryotic initiation factor ER: endoplasmatické retikulum eRF: eukaryotický uvolňovací faktor, eukaryotic release factor GTP: guanosintrifosfát HSP: protein tepelného stresu – heat shock protein mRNA: mediátorová ribonukleová kyselina ORF: otevřený čtecí rámec, open reading frame PABP: polyA binding protein RISC: RNA-indukovaný umlčovací komplex – RNA-induced silencing complex RNA: ribonukleová kyselina rRNA: ribozomální ribonikleová kyselina S: Svedberg siRNA: malá interferenční RNA – small interfering RNA TMV: virus tabákové mozaiky – tobacco mosaic virus tRNA: transportní ribonukleová kyselina UTR: nepřekládaná oblast, untranslated region vsiRNA: malá interferenční RNA odvozená z viru – virus-derived small interfering RNA

5    

ÚVOD V každé buňce živého organismu kódují molekuly DNA (deoxyribonukleová kyselina) mimo jiné strukturu proteinů zajišťujících naprostou většinu buněčných funkcí. Sekvence párů bází molekuly DNA kódující pořadí aminokyselin tvořících příslušný polypeptid se nazývá gen. Při procesu transkripce strukturního genu je sekvence jednoho z dvou komplementárních vláken DNA přepsána pomocí enzymu DNA-dependentní RNA polymerázy II v jednovláknovou molekulu mRNA (mediátorová ribonukleová kyselina), jež po dodatečných úpravách slouží jako templát k syntéze polypeptidu. Syntéza polypeptidu, který se posléze stane funkčním proteinem, se nazývá translace. Důsledkem kompartmentace jsou v eukaryotické buňce procesy transkripce a translace odděleny místně i časově: DNA se nachází v buněčném jádře, kde je také přepisována, avšak translace zralé mRNA, která opustí jádro, se následně odehrává v cytoplasmě buňky. Molekuly RNA mohou mít nejen informační, ale i katalytickou funkci. Translace je zajištěna komplexem složeným z rRNA (ribozomální RNA) a proteinů zvaným ribozóm, který postupuje po molekule mRNA a dle jejího templátu polymerizuje aminokyseliny, přicházející ve vazbě s tRNA (transferová RNA). Vzniká tak polypeptidový řetězec, který dozraje ve funkční protein. Transkripce genů je přísně regulovaným procesem, aktivace a inhibice exprese jednotlivých genů v buňkách hraje klíčovou roli pro vývoj a život mnohobuněčného organismu. Regulace transkripce je proto předmětem mnoha výzkumů. Syntéza a zpracování mRNA je však energeticky a časově náročným procesem, a není tedy divu, že existuje řada regulačních možností i v cytoplasmě, tedy co se týče hospodaření s mRNA, frekvence a průběhu její translace obecně, či selektivně. Tato regulační úroveň nabývá značné role zejména v průběhu embryogeneze, kde hraje klíčovou roli již nasyntetizovaná rezerva mRNA, pak v situacích vyžadujících rychlou specifickou reakci na konkrétní externí podmínky, ať se jedná o běžné změny podmínek, či o akutní reakci na ohrožení a poškození pletiv. Zaměřme se na situaci usedlých organismů, kterými jsou rostliny. Mezi obecné charakteristiky těchto organismů patří zaprvé autotrofie, zadruhé vazba na substrát, tedy nemožnost pohybu. Zdálo by se, že jsou rostliny značně znevýhodněné oproti živočichům, kteří jsou schopni migrace, aktivní fyzické reakce na podnět a centralizované kontroly. Tato představa je však mylná: rostlinné organismy jsou často v migraci úspěšnější díky schopnosti šíření spor či semen a dlouhé životnosti a odolnosti tohoto stádia. Přisedlý způsob života při vegetativní a generativní fázi jde spolu s odolností a značnou schopností adaptace: kontinuální vegetativní růst a významná schopnost reakce na změnu lokálních podmínek a krizové situace. Společně s vždy nezbytnými faktory regulace transkripce DNA, regulace translace mRNA nabývá tedy mimořádné důležitosti v otázce regulace genové exprese u rostlin. Předmětem této práce je popis procesu translace mRNA a jeho regulace se zaměřením na rostlinné organismy, výzkum regulačních mechanismů tohoto procesu u rostlin v kontextu ontogeneze, abiotických a biotických faktorů.

6    

KAPITOLA PRVNÍ Translace v eukaryotické buňce Je obecně známo, že rostliny jsou mnohobuněčné eukaryotické organismy; začneme tedy z tohoto obecného hlediska. V první kapitole popíšeme procesy předcházejícími vlastní translaci a proces translace mRNA v eukaryotické buňce. Tyto informace obecně platí pro všechny rostlinné buňky, jimž se budeme věnovat v dalších kapitolách.

v Zrání a export molekuly mRNA V eukaryotické buňce podléhá molekula pre-mRNA řadě posttranskripčních úprav, a to ještě dříve, než opustí buněčné jádro. Jedná se o významný rozdíl oproti situaci prokaryotických buněk a buněčných organel prokaryotického původu, u nichž mRNA neprochází výraznějšími posttranskripčními úpravami a translace je dokonce často zahájena ještě před ukončením transkripce. Není tedy divu, že u eukaryotických organismů je repertoár posttranskripčních regulací výrazně bohatší. Zrání čerstvě nasyntetizované molekuly pre-mRNA zahrnuje zejména několik dějů, z nichž dva mají víceméně obecnou platnost: jedná se o zajištění stability molekuly, jejíž životnost by se v opačném případě počítala v řádu minut, a také o sestřih v podobě odstranění nekódujících částí genů, zvaných introny (Bentley, 2014). První zásadní krok spočívá v připojení čepičky na 5’ konec molekuly pre-mRNA. Tento proces se nazývá čepičkování (angl. capping) a uskutečňuje se pomocí tří enzymů. Tato první posttranskripční modifikace nastává ještě před dokončením transkripce a jedná se zároveň o klíčový kontrolní bod (Galland et al., 2014). Čepička je tvořena nukleosidem 7-methylguanosinem, jež je navázán na první nukleotid molekuly mRNA s interpozicí třech fosfátových skupin neobvyklou vazbou 5’-5’ (Bentley, 2014). Funkcí čepičky je mimo ochrany molekuly RNA před degradací aktivitou exonukleáz a kontrolou jejího exportu do cytoplasmy i zajištění iniciace translace (Bentley, 2014). Další posttranskripční modifikací je tzv. polyadenylace, při níž je na 3’ konec molekuly mRNA připojen poly(A) řetězec. Zatímco transkripce stále probíhá, enzymatický komplex poly(A)ozómu odstřihne funkční pre-mRNA od zbytku primárního transkriptu (Bentley, 2014). Tentýž enzymatický komplex obsahuje enzym poly(A) polymerázu, který připojí řetězec 40 až 250 adeninových nukleotidů k 3’ konci nově syntetizované pre-mRNA (King, 2015). Rovněž poly(A) řetězec hraje roli v ochraně molekuly mRNA před degradací a

7    

umožňuje její transport z jádra do cytoplazmy a má význam v iniciaci translace (M.W.King, 2015). Další úpravou vedoucí ke zralé molekule mRNA je sestřih (angl. splicing). Sekvence bází tvořící gen obsahuje totiž jednak dále využitelné úseky, exony, přerušované intervenujícími sekvencemi, introny, které jsou během úpravy odstraněny a nehrají tedy při translaci a její regulaci roli. Samotný sestřih je katalyzován enzymatickým komplexem zvaným spliceozóm, který zajišťuje vystřižení intronů a následné spojení příslušných exonů, reakčním mechanismem transesterifikace (Cui et al., 2014). Alternativní sestřih zvyšuje variabilitu zralých mRNA, čímž umožňuje další úroveň posttranskripčních regulací a tím dramaticky zvyšuje rozmanitost genové exprese. Uvádí se, že u rostlin podstupuje více než polovina genů alternativní sestřih, což je méně, než například u savců, nicméně tento fenomén stále hraje důležitou roli v regulaci vývojových procesů (Cui et al., 2014). Výsledkem postranskripčních úprav je tedy molekula mRNA (též zvaná transkript) připravená k přechodu do cytoplazmy s pomocí specifických vazebných proteinů (Muench et al., 2012) a následně k translaci. Určitá frakce mRNA je však často skladována v cytoplasmě a translace se dočká až později. Například za stresových podmínek vede nutnost reakce a šetření energie ke značnému omezení většiny obecných translačních procesů probíhajících v buňce (Ueda et al., 2012), a to ve prospěch syntézy stresových proteinů, o čemž budeme ještě mluvit (viz jednotlivé případy popsané v kapitole 4). Značná část dotčených molekul mRNA

není

bezprostředně

degradována,

nýbrž

setrvává

skladována

v cytoplasmě pro následnou intenzivní translaci po návratu do normálních podmínek (Stuger et al., 1999).

v Molekula tRNA Molekula tRNA, jejíž roli jsme již zmínili dříve, je dlouhá v průměru 70 až 85 nukleotidů a rovněž prochází řadou posttranskripčních úprav, konkrétně podstupuje sestřih 5‘ a 3‘ konců a chemickou modifikaci řady bází. Následně zaujímá komplexní sekundární strukturu umožněnou vzájemnými interakcemi jednotlivých částí molekuly a konečně terciární strukturu, která jí dává její charakteristické trojrozměrné uspořádání (Betat et al., 2014). V cytoplasmě je k čerstvě nasyntetizované, či recyklované molekule tRNA připojena esterickou vazbou odpovídající aminokyselina pomocí extrémně specifického enzymu aminoacyl tRNA syntetázy. Proces aktivace tRNA se odehrává ve dvou etapách: nejprve je aminokyselina aktivována adenylací za štěpení ATP, poté je katalyzován vznik její vazby k 3‘ 8    

konci tRNA (Lu et al., 2014). Vzniklý komplex aminoacyl-tRNA pak vstupuje do translace. Proces aktivace tRNA aminokyselinami je přísně kontrolován, navázání nesprávné aminokyseliny vede k degradaci celého komplexu (Lu et al., 2014). Jistá zajímavost spočívá ve faktu, že počet variant tRNA je podstatně vyšší, než počet aminokyselin (20, u rostlin 18, či 19), a to nejen kvůli degeneraci genetického kódu, kdy jednu aminokyselinu může kódovat několik tripletů (Cognat et al., 2013).

v Popis ribozómu Ribozóm

je

zajišťujícím

vlastní

katalytickým translaci

za

komplexem účasti

již

popsaných dalších aktérů - aminoacyl-tRNA a zralé mRNA. Většinu ribozómů najdeme na povrchu endoplazmatického retikula, jež hraje roli v následujících

úpravách

polypeptidu,

ovšem

mohou být v cytoplazmě i volně či vázány na cytoskelet (Krupinska et al., 2003). Ribozóm je obrovský ribonukleoproteinový komplex, skládá se z proteinů a ze specializovaných molekul RNA, zvaných rRNA, jež tvoří vlastní katalytické jádro ribozómu a zastávají tak katalytickou funkci při vzniku peptidové vazby (Graifer and Karpova, 2015). Proteinové komponenty hrají spíše roli strukturní a regulační (Graifer and Karpova, 2015). Eukaryotický

ribozóm

se

skládá

s dvou

podjednotek, o velikostech 40S a 60S (obr. 1), dle sedimentačního koeficientu Svedberg, které se při iniciaci translace spojí a tvoří jednotku zajišťující katalýzu procesu. 40S podjednotka váže molekulu mRNA a komplementární antikodon tRNA, zatímco 60S podjednotka obsahuje tři místa zajišťující vazbu komplexu

aminoacyl-tRNA

(aminoacyl

site),

katalýzu polymerace (peptidyl site) a uvolnění tRNA (exit site) (Graifer and Karpova, 2015). 9    

Obrázek   1:   Struktura   40S   a   60S   podjednotek   eukaryotického   ribozómu   z  jejich   styčné   strany   s  vyznačením   jednotlivých  ribonukleoproteinů  a  jejích   hlavních   funkcí   v  procesech,   které   dále   popíšeme.   (Zdroj   obrázku:   Graifer   and   Karpova,  2015).  

Velká 60S ribozomální podjednotka obsahuje tři molekuly rRNA o velikostech 25S, 5,8S a 5S, zatímco malá 40S podjednotka obsahuje pouze jedinou molekulu 18S rRNA (Ben-Shem et al., 2011). Proteiny sice nemají přímou katalytickou účast na translaci, avšak zastávají různé funkce. Jsou výrazně zastoupeny, neboť 60S podjednotka jich obsahuje 46, 40S podjednotka 33 (Ben-Shem et al., 2011). Přibližně polovina vazeb mezi oběma podjednotkami je zajištěno právě prostřednictvím proteinů (Graifer and Karpova, 2015).

v Iniciace translace V eukaryotických buňkách se iniciace translace účastní mnoho proteinů zvaných eukaryotické iniciační faktory (eIF, angl. eukaryotic initiation factors). S iniciační Met-tRNA se spojí faktor eIF2 v komplexu s molekulou GTP, zatímco k 40S ribozomální podjednotce se váží faktory eIF1, eIF1A a eIF3 (M.W.King, 2015). Jejich spojením vznikne takzvaný 43S pre-iniciační komplex (obr. 2). Obrázek   2:   Funkční   konfigurace   43S   pre-­‐iniciačního   komplexu.   Faktory   eIF1   a   eIF3   brání   spojení   s  velkou   60S   ribozomální   podjednotkou.   Iniciační   faktor   eIF5   se   následně   naváže   k  43S   komplexu  a  hraje  roli  v  asociaci  s  velkou  podjednotkou  (Luna  et  al.,   2012)   podobně   jako   přítomnost   iniciační   met-­‐tRNA   „přednabité“   GTP  neseným  eIF2  (Hinnebusch,  2014).  

Další účastník translační iniciace, molekula mRNA, se ocitne ve vazbě se skupinou iniciačních faktorů eIF4, jež ve spolupráci s poly(A)-binding proteinem (PABP) propojuje 5‘ a 3’ konce mRNA, konkrétně čepičku a poly(A) řetězec (Kropiwnicka et al., 2015). Tyto dva zmíněné faktory vzájemně propojí eIF4G (obr. 3), což znamená, že je molekula mRNA je cirkularizována, což usnadňuje proces translace, konkrétně její (re)iniciaci (Kawaguchi and Bailey-Serres, 2002). Molekula mRNA, spojena s faktory eIF4E a eIF4G, je ještě asociována s faktory eIF4A a eIF4B, vázané na eIF4G v zóně propojení čepičky a poly(A)konce (Kropiwnicka et al., 2015).

Obrázek   iniciačních   k  asociací  

3:  

Komplex   faktorů,   s  43S  

mRNA  

a  

připraven   pre-­‐iniciačním  

komplexem.   Jak   uvidíme,   vazba   bude   zajištěna  faktorem  eIF4G.   Poznámka:   trojice   eIF4E,   eIF4G   a   eIF4A  je  často  nazývána  eIF4F.   10    

Popsaný komplex faktorů umožní vazbu k 43S komplexu spojeného s iniciační tRNA, přičemž faktor eIF4G je vázán s již zmíněným faktorem eIF3 asociovaným s malou podjednotkou (M.W.King, 2015) a vidíme vznik 48S pre-iniciačního komplexu (Obr. 4). V tuto chvíli skenuje podjednotka molekulu mRNA ve směru 5‘–>3’, dokud nenarazí na start kodon AUG, související s koncem tzv. 5’ nepřekládané oblasti (5’UTR) a se začátkem otevřeného čtecího rámce (ORF, angl. open reading frame), tedy skutečně translatované sekvence (Hinnebusch, 2014). Zmíněný sken by byl nemožný bez helikázové aktivity faktoru, lépe řečeno helikázy, eIF4A působící na molekulu mRNA a odstraňující sekundární struktury 5‘UTR (Martinez-Silva et al., 2012).

Obrázek   4:   48S   preiniciační   komplex  a  sken  mRNA.  

Iniciační faktory jsou posléze uvolněny, k malé podjednotce se připojí velká 60S podjednotka, a tak za účasti faktoru eIF5 vznikne kompletní ribozóm (Luna et al., 2012). Iniciační tRNA s methioninem je v tuto chvíli lokalizována na P místě 60S podjednotky a elongace může začít (Hinnebusch, 2014). Zejména u rostlin, na které se v této práci zaměříme, hraje proces iniciace translace větší regulační roli, i když elongace může také podléhat regulaci. Důležitost regulace transkripce tím není úplně zastiňována, ovšem je možno říci, že počet syntetizovaných polypeptidů již nemůže být přímým indikátorem účinnosti transkripce příslušného genu (Kawaguchi and Bailey-Serres, 2002).

v Elongace a terminace translace Elongace je proces syntézy polypeptidu následující iniciaci translace. Informace tripletů bází otevřeného čtecího rámce (ORF) mRNA slouží jako předloha k sekvenci aminokyselin. Katalyzační funkci polymerizace hraje velká 60S ribozomální podjednotka (M.W.King, 2015). Tento proces však vyžaduje také účast neribozomálních proteinů, tzv. elongačních faktorů. 11    

Iniciační aminoacyl-tRNA komplex obsazuje P místo a druhý komplex odpovídající druhému tripletu ORF nasedne na A místo ribozómu. Je k tomuto účelu použit komplex eEF1α-GTP, kdy GTP podlehne hydrolýze, výsledný komplex eEF1α-GDP se odštěpí (Sasikumar et al., 2012) a peptidyltransferáza 60S podjednotky (ribozym) katalyzuje tvorbu peptidové vazby mezi methioninem a druhou aminokyselinou prostřednictvím své peptidyltransferázové aktivity (M.W.King, 2015). Methionin je od své tRNA uvolněn. Dodejme, že opětné nabití eEF1α je zajištěno komplexem eEF1βγ (Sasikumar et al., 2012). Následuje translokace, kdy se obě tRNA posunou, první z místa P na místo E a druhý (spojen se syntetizovaným polypeptidem) z místa A na místo P. Jinak řečeno se celý ribozomální komplex posune směrem 3’ o jeden triplet vůči mRNA. Translokace vyžaduje elongační faktor eEF2, opět za hydrolýzy GTP (Sasikumar et al., 2012). Místo A je nyní volné k vazbě nového komplexu aminoacyl-tRNA a celý proces se opakuje - dvojice prvních aminokyselin se váže k aminokyselině tohoto nového komplexu, první tRNA je při následující translokaci vypuzena z místa E (M.W.King, 2015). Tímto způsobem pokračuje proces translace mRNA a elongace polypeptidového řetězce. Následující schéma (Obr. 5) shrnuje veškeré procesy, o kterých jsme nyní hovořili (včetně nabití aminoacyl-tRNA popsaném na samém začátku této kapitoly).

Obrázek  5:  Schématické  shrnutí  procesu  translační  elongace.  

Otevřený čtecí rámec končí tripletem zvaným STOP kodon (existují 3 různé), za nímž následuje 3’UTR. Tomuto kodonu neodpovídá žádná molekula tRNA, nýbrž ho rozpoznává 12    

tzv. uvolňovací faktor (eRF, angl. release factor), který nasedne na místo A (M.W.King, 2015). Tento faktor váže GTP a způsobí katalýzu transferu polypeptidu z P místa k molekule H2O při hydrolýze GTP (M.W.King, 2015). Následuje uvolnění peptidu, poslední tRNA, komplexu eRF-GDP a konečně rozpad samotného ribozómu na obě podjednotky (M.W.King, 2015). Ještě je nutno dodat, že každá molekula mRNA může mnohokrát opakovaně sloužit k translaci, ale také může být předmětem několika simultánních translačních procesů. Komplex mRNA s několika nasedlými ribozomálními jednotkami se nazývá polyzóm.

Závěrečné slovo Popsali jsme si význam, podstatu a mechanismus translace mRNA, jednoho z pilířů genové exprese. Zaměřili jsme se na eukaryotické buňky a nyní svou pozornost obrátíme k rostlinným organismům a k regulačním možnostem, které charakterizují proces translace. Začneme souhrnem rostlinných specifik a obecných regulačních mechanismů a poté se zaměříme na konkrétní situace.

13    

KAPITOLA DRUHÁ Specificita translace a její regulace u rostlin Proces translace u rostlin je do jisté míry totožný s procesem translace ostatních eukaryotických buněk. Jsou mu ovšem vlastní jisté specifické charakteristiky, které, jak později uvidíme, mohou hrát roli v regulaci translace (Kawaguchi and Bailey-Serres, 2002). Zmíníme zde charakteristickou existenci izoforem iniciačních faktorů translace a dále význam fosforylace na globální regulaci.

v Izoformy iniciačních faktorů eIF4E a eIF4G u rostlinné buňky Začněme charakteristickým faktem: u rostlin mají faktory eIF4E, vážící se na čepičku mRNA, a eIF4G, propojující 4E a PABP, dvě možné formy, známé navíc pod názvem eIFiso4E a eIFiso4G (Kawaguchi and Bailey-Serres, 2002). I přes totožnou funkci je rozdíl mezi nimi dosti významný, jelikož eIFiso4E jeví 50-55% odlišnost v sekvenci aminokyselin oproti eIF4E. eIFiso4G dosahuje dokonce až 65% rozdílnosti primární struktury oproti svému homologu (Kawaguchi and Bailey-Serres, 2002) a je neobyčejně malé velikosti a atypické sekundární a terciární struktury (Cheng and Gallie, 2010). Iniciační faktory eIF4E a eIF4G tvoří podjednotky iniciačního faktoru eIF4F, faktory eIFiso4E a eIFiso4G se asociují ve formě iniciačního faktoru eIFiso4F (Muench et al., 2012) spolu s helikázou eIF4A (Cheng and Gallie, 2010). Rozdíly disponibility těchto forem hrají roli v regulaci četnosti iniciace, stejně jako závislost afinity komplexu eIF4F a eIF4isoF na sekundární struktuře 5‘UTR molekuly mRNA (Muench et al., 2012), jak ještě uvidíme.

v Fosforylace a její význam v obecné regulaci translace Fosforylace a defosforylace proteinů spočívá v kovalentním připojení/odštěpení fosfátové skupiny pomocí enzymů, kterými jsou protein kinázy a protein fosfatázy. Jedná se o jeden z fundamentálních procesů hrajících roli v aktivaci a deaktivaci vazebných míst proteinů, tedy v regulaci jejich interakční a katalytické aktivity. Probereme si tedy tuto roli v rámci translačního procesu v rostlinné buňce. Ø Fosforylace iniciačních (a elongačních) translačních faktorů V mnoha případech zesiluje fosforylace interakční schopnosti iniciačních faktorů translace, což je zejména případ u interakcí mezi jednotkami eIF1, eIF5 a podjednotkou eIF3C, dále 14    

mezi podjednotkami eIF3C a eIF2β, a to pomocí fosforylace protein kinázou CK2 (Muench et al., 2012). Zejména faktor eIF3C je vícečetnou fosforylací podpořen ve vazbě s ostatními proteinovými faktory (Mulekar and Huq, 2014). Následující schéma zobrazuje tyto interakce a ilustruje význam fosforylace (Obr. 6). Obrázek  6:  Znázornění  interakcí  iniciačních  faktorů  eIF1,  e1F2β,   eIF3c   a   eIF5,   dle   pokusů   in   vitro,   při   absenci   40S   ribozomální   subjednotky.   Spojovací   čáry   vyznačují   interakce   mezi   proteiny,   červené   čáry   vyznačují   ty   interakce,   které   jsou   posíleny   fosforylací   enzymem   CK2,   což   poukazuje   na   významnou   roli   fosforylace   a   zmíněného   enzymu   při   formování   translačního   iniciačního  komplexu  (Muench  et  al.,  2012).  

Faktory eIF4 obsahují také četná fosforylační místa. Na funkci těchto faktorů a její efektivitě, spolu s výše popsanými faktory 43S komplexu, je často závislá celková frekvence translačních procesů, a proto se celkově dá říci, že formování iniciačního komplexu malé ribozomální podjednotky a mRNA je často nejpomalejší etapou celé translace (Gingras et al., 1999). Jako příklad negativní regulace můžeme uvést helikázu eIF4A a podjednotku eIF4G, jejichž aktivita je regulována v režii represivních fosforylačních míst, jejichž defosforylace je podmíněna různými faktory (Boex-Fontvieille et al., 2013). Molekulární mechanismus není ještě zcela probádaný, ovšem jsou známa fosforylační místa specifická pro tyto proteiny u rostlin (Boex-Fontvieille et al., 2013). Fosforylace se účastní regulace translace i na úrovni elongačních faktorů. Faktor eEF2, zodpovědný za translokaci, je u rostlin negativně regulován fosforylací; při stresových podmínkách navíc dochází k obecné represi elongace (Szick-Miranda et al., 2003). Ø Fosforylace ribozomálních proteinů Proteiny tvořící spolu s rRNA ribozomální podjednotky také podléhají regulaci. Ribozomální protein S6 (RPS6) zde hraje klíčovou roli, úroveň jeho fosforylace má vliv na úroveň translace a tvorbu polyzómů (Boex-Fontvieille et al., 2013). Ve hře je protein kináza S6K, jež je sama pod kontrolou dalších protein kináz (Boex-Fontvieille et al., 2013). Intenzivní fosforylace C-konce RPS6 pod kontrolou signálních kaskád umožňuje zejména v kontextu abiotického stresu regulovat translační iniciaci, vesměs se zde jedná o pozitivní typ regulace (Muench et al., 2012). Další regulační fosforylace podmíněná environmentálními faktory se nachází na ribozomálním proteinu S14 (Boex-Fontvieille et al., 2013).

15    

Ø Nejdůležitější protein kinázy v regulaci translace a významné regulační dráhy U všech eukaryotických buněk najdeme protein kinázu CK2, jejíž funkce při transkripci, translaci a jiných buněčných procesech je předmětem mnoha výzkumů, zejména v rámci ontogeneze, adaptace a reakce na stres u rostlinného organismu (Mulekar and Huq, 2014). Výzkumy u Triticum (pšenice) a Arabidopsis thaliana ukázaly, že následující proteiny mohou být substrátem protein kinázy CK2: eIF2α a eIF2β, eIF3c, eIF4B a eIF5 (Dennis and Browning, 2009), a to zejména v důsledku pozitivní regulace reakcí na světlo (Muench et al., 2012). V rámci rostlinné cytologie se dále mimo jiné setkáváme s protein kinázou GCN2, která má funkci při globální represi translace v reakci na environmentální stres (Muench et al., 2012) a na xenobiotika (Faus et al., 2015). Další z rodiny protein kináz je enzym S6K. U rostlin hraje významnou roli v signální dráze TOR s účastí TOR kinázy modulující translační aktivitu dle intenzity fotosyntézy (Muench et al., 2012). Jako shrnutí mechanismů fosforylace popsaných v této kapitole uvedeme následující schéma znázorňující důležité dráhy obecné regulace translační iniciace v závislosti na environmentálních faktorech (Obr. 7). Obrázek   7:   Souhrn   aktivačních   (černě)   a   represivních   (šedě)   drah   související   s   fosforylací   během   různých   abiotických   situací   se   znázorněním   zodpovědných   protein   kináz.   Fosforylované   proteiny   jsou   označeny   P.   Černá   hvězdička   naznačuje   souvislost   fosforylace   s  fotosyntézou,   šedá   ukazuje  

na  

souvislost  

defosforylace  

s  fotosyntézou   a   bílá   na   nezávislost   stupně   fosforylace   na   úrovni   fotosyntézy   (Zdroj   obrázku:  Boex-­‐Fontvieille  et  al.,  2013).  

Závěrečné slovo Popsali jsme si vlastnosti translace u rostlin a hlavní regulační mechanismy, které však samy o sobě nesvědčí o specifičtějších regulačních mechanismech tvořících neuvěřitelný svět k probádání. Organismus není stroj, je výsledkem dlouhodobé evoluce, kde se četné procesy překrývají, doplňují, účastní, či neúčastní dle řady faktorů, a odpověď na makroskopické úrovni je toho globálním výsledkem. Proto se v následujících kapitolách zaměříme na rostlinu z hlediska jejího života a situací, které ji potkávají, a na výzkumy odhalující tajemství, jež se skrývají za makroskopicky pozorovatelnou ranou ontogenezí, reakcemi a přežitím rostliny. 16    

KAPITOLA TŘETÍ Význam translace a její regulace v gametofytu a během ontogeneze Proces translace hraje variabilní, avšak důležitou roli v procesu rostlinné ontogeneze. Mezi důležité fáze životního cyklu rostlinného organismu patří gametogeneze, oplodnění, embryogeneze, tvorba semene a jeho klíčení. Tyto procesy jsou z hlediska hospodaření s mRNA a translace velice pestré, proto se jim budeme podrobněji věnovat, a to se zaměřením na rostliny krytosemenné, jež jsou z tohoto hlediska nejlépe prozkoumány. V této kapitole se podíváme na stávající znalosti týkající se progamické fáze, embryogeneze, klíčení a začátku vegetativního růstu.

v Pohlavní rozmnožování (kryto)semenných rostlin obecně Úvodem

si

zopakujme

princip

evolučně

úspěšného

systému

rozmnožování

krytosemenných rostlin. Podívejme se na průběh oplození samičího gametofytu (zárodečného vaku) svým samčím kolegou (pylovým zrnem) včetně charakteristického dvojitého oplození. Gametofyt je haploidním stádiem životního cyklu rostlin, jež vzniká klíčením spor, produktu redukčního dělení, a je zodpovědný za zformování gamet. Sporofyt je naproti tomu diploidním stádiem tvořícím veškeré vegetativní a generativní orgány rostliny (vyjma vlastních gametofytů). Pylová zrna vznikají v prašnících na tyčinkách květů a po svém uvolnění je jejich úkolem opylit vlastní či častěji jinou rostlinu (přenos větrem, opylovači...). Opylení je následováno progamickou fází, růstem pylové láčky, jež končí dvojitým oplozením. Jeho důsledkem je vznik zygoty jako zárodku budoucí sporofytické generace a endospermu zodpovědného za výživu embrya ve zrajícím semeni (Obr. 8). OObrázek   8:   Obecné   schéma   opylení   a   dvojitého   oplození   krytosemenných   rostlin.   Pylové   zrno   dosedne   na   bliznu   a   vyklíčí,   jeho   spermatické   buňky   (vzniklé   druhou   pylovou   mitózou)   jsou   neseny   pylovou   láčkou,   která   je   ve   svém   růstu   chemicky   vedena   pletivy   pestíku   a   následně   synergidami   k  otvoru   klovému   (mikropyle).   Pylová   láčka   se   přes   mikropyle   dostane   k   zárodečnému   vaku,   jedna   synergida   degeneruje,  což  umožní  puknutí  pylové   láčky,   druhá   poté   chemicky   odpuzuje   další   láčky,   případně   slouží   jako   rezerva   pro   druhý   pokus   o   oplození,  

17    

pokud  první  selže  (Dresselhaus  and  Franklin-­‐Tong,  2013).  Při  vstupu  do  mikropyle  a  proniknutí  pylové  láčky  do   synergidy   pozorujeme   účast   několika   proteinových   receptorů,   ligandů   a   iontových   kanálů,   zprostředkujících   interakci   obou   gametofytů   (Kessler   and   Grossniklaus,   2011).   Jedna   ze   spermatických   buněk   fúzuje   se   samičí   vaječnou   buňkou   a   vznikne   diploidní   zygota,   druhá   fúzuje   s  dvěma   polárními   jádry,   což   vede   ke   vzniku   triploidního  endospermu,  jehož  rolí  bude  výživa  rostoucího  embrya  vzniklého  ze  zygoty.

v Samčí gametofyt, význam a podstata translační regulace V naší práci se zaměříme se zejména na samčí gametofyt, jelikož při obecném nedostatku znalostí je z hlediska translační regulace prozkoumán stále ještě podstatně důkladněji, nežli gametofyt samičí. Pylové zrno je pozoruhodnou strukturou. Spolu se semenem se jedná o jedno ze dvou stádií procházejících dehydratací, metabolicky téměř neaktivním stavem, což souvisí se specifiky adaptace rostlin k suchozemskému životu. Prostorová a časová diskontinuita vlhkého prostředí znemožňuje přežití, aktivní pohyb a samostatné párování hydratovaných brvitých/bičíkatých gamet, jak tomu je u řas, mechorostů a výtrusných, na vlhku závislých rostlin. Existence nepříznivých období a neschopnost aktivního pohybu si vynucuje existenci stádií, jež slouží jako odolní poslové při generativním rozmnožování a šíření potomstva, a to i na velkou vzdálenost (Dresselhaus and Franklin-Tong, 2013). Ø Pylové zrno, jeho klíčení a růst pylové láčky, obecné informace Čím prošlo pylové zrno, než nasedlo na bliznu? Po redukčním dělení na samém počátku projde pylové zrno fází vývoje a zrání v prašníku, během níž pozorujeme zejména výrazně asymetrické dělení, první pylovou mitózu (PMI), jež dá vzniknout vegetativní a generativní buňce, jež mají výrazně odlišné osudy. Zatímco generativní buňka ještě proliferuje a projde ještě jedním buněčným cyklem (PMII, druhá pylová mitóza), na jehož konci jsou samčí gamety, spermatické buňky, vegetativní buňka buněčný cyklus opustí a připravuje se na svou funkci, tvorbu a intenzivní růst pylové láčky. Mezi důležité faktory patří syntéza rezerv (Bedinger, 1992). Poslední fází dozrávání pylu je jeho dehydratace, na jejímž konci je zralé zrno připraveno prašník opustit (Bedinger, 1992). Po dosednutí na bliznu následuje rehydratace pylu, klíčení a růst pylové láčky a oplození, jak ukázal obrázek 8. Pylové zrno v rámci metabolických rezerv obsahuje i skladované dlouhověké molekuly mRNA, transkribované již během svého zrání, což souvisí s nutností rychlého spuštění metabolismu při zmíněné rehydrataci, kdy by byl celý proces genové exprese od DNA k proteinu, zdlouhavý (Honys et al., 2000). Syntéza proteinů během klíčení pylového zrna a následného růstu pylové láčky jsou tedy z velké míry postaveny na posttranskripčních dějích (Honys a Twell 2004). 18    

Růst pylové láčky je příkladem apikálního růstu závislého na aktinovém cytoskeletu (Cheung et al., 2008) a na gradientu vápníkových (a jiných) iontů, což jde ruku v ruce s mechanismem skladování Ca2+ iontů v endoplasmatickém retikulu (Holdaway-Clarke and Hepler, 2003). Jako příklad proteinu, v jehož syntéze, různé dle lokalizace a času, hraje translační regulace podstatnou roli, si uvedeme kalretikulin. Ten váže vápníkové ionty v lumen endoplasmatického retikula a tím moduluje koncentraci iontů Ca2+, nezbytných v procesech růstu pylové láčky, při interakcích se samičími orgány a při oplození (Lenartowska et al., 2009; Lenartowski et al., 2014). Ø Syntéza kalretikulinu aneb prostorová lokalizace translace Již zmíněný protein kalretikulin (CRT) nám umožní popsat případ lokalizace translační aktivity spuštěné po opylení. Jeho translace se odehrává na ribozómech asociovaných s hrubým endoplasmatickým retikulem (Lenartowska et al., 2009), jak je tomu často u proteinů spojených se signalizací (Suwinska et al., 2015). Tabulka 1 znázorňuje distribuci CRT mRNA, proteinu CRT a 18S rRNA v pylu petunie během klíčení a růstu pylové láčky.

Tabulka  1:  Lokalizace  CRT  mRNA,  proteinu  CRT  a  18S  rRNA  v  pylu  petunie  při  klíčení,  vyrašení  a  růstu   pylové  láčky  na  několika  místech,  vždy  zleva  doprava  od  vlastního  zrna  (ga),  přes  místo  rašení  láčky   (a),  báze  láčky  (br),  proximální,  distální  a  subapikální  zóny  láčky  (psh,  dsh,saz),  což  ukazuje  organizaci   lokalizace  mRNA  a  translace.  Jak  jsme  uvedli,  CRT  moduluje  koncentraci  Ca2+,  je  zde  tedy  patrná   přímá  korelace  s  kontrolou  růstu  (Zdroj  tabulky:  Suwinska  et  al.,  2015).  

Lokalizace translace na endoplasmatickém retikulu (dále ER) souvisí s existencí Nterminální signální sekvence u proteinu CRT, jež je rozpoznána signální rozpoznávací částicí (SRP), což vede krátce po začátku translace k vazbě na specifický receptor na ER. Po translaci je protein transportován do lumen ER (Lenartowski et al., 2014). Byl pozorován další zajímavý efekt, neboť i samotná CRT mRNA se může ocitnout ve vazbě s ER za účasti specifického proteinu vázaného s membránou ER (Suwinska et al., 2015). Apikálně-bazální distribuci, kterou ukazuje předchozí tabulka, je pak možno částečně připsat i typické cytoplasmatické cirkulaci, která pak může být sama mimo jiné regulována i působením CRT na organizaci aktinu prostřednictvím Ca2+ iontů, i když konkrétní mechanismus není dosud přesně objasněn (Suwinska et al., 2015).

19    

Ø Selektivní časování translace a skladování mRNA Nyní se na příkladu genu ntp303 u tabáku podíváme na dočasné umlčení translace specifických transkriptů během zrání pylového zrna a její opětovné spuštění po rehydrataci. (Honys et al., 2000). Na rozdíl například od transkriptu lat52, jež je aktivně translatován během zrání pylu navíc s účastí translačně zesilovací funkce sekvence 5‘UTR (Bate et al., 1996), pozorujeme u transkriptu genu ntp303 absenci translace doprovázenou jeho výraznou akumulací ve velkých ribonukleových komplexech (EPP) obsahujících také rRNA a ribozomální podjednotky, což zajišťuje možnost skladování mRNA ve stabilních podmínkách a jeho následnou rychlou aktivaci po rehydrataci (Honys et al., 2009). Funkčně tvoří EPP komplexy analogy zárodečných/germinálních granulí živočichů, jejich složení je však pravděpodobně komplexnější (Hafidh et al., 2011). Tvorba komplexů EPP začíná v raném stádiu vývoje pylu, kdy je transkripce skladovaných transkriptů nejsilnější a kdy jsou některé transkripty asociovány s EPP a jiné jsou translatovány na polyzómech (Honys et al., 2000). Později již polyzómů nepřibývá, nové transkripty se hromadí v transportní formě ribonukleoproteinů (mRNP) a v konečné fázi dozrávání jsou transkripty, volné, či polyzomální, masivně asociovány s EPP (Honys et al., 2000).

Obrázek   9:   Cytoplasmatické   hospodaření   s  mRNA   během   zrání   pylového   zrna,   model   transkriptu   genu   ntp303.   Bližší   popis   v  textu.   (Zdroj   obrázku:   Honys  et  al.,  2000).  

Role komplexů EPP nespočívá jen v uskladnění transkriptů, ale po rehydrataci také značně usnadňuje transport mRNA a translačního materiálu do potřebných míst, zejména do apikální části rostoucí pylové láčky (Honys et al., 2009). Při spuštění translace se uplatňují i 5’UTR translační zesilovače, jak bylo prokázáno v případě modelového skladovaného transkriptu ntp303 (Hulzink et al., 2002). Specifické sekvence 5’UTR mohou vést ke tvorbě sekundárních struktur, které mimo vlastní úlohy při regulaci translace hrají také roli při stabilizaci mRNA. Na rozdíl od translačních zesilovačů konstitutivních transkriptu (viz lat52, Bate et al., 1996) 20    

umožňuje zmíněná sekundární struktura 5’UTR transkriptu ntp303 zesílení translace až po rehydrataci, nikoli však během zrání, což naznačuje existenci specifického vazebného proteinu uplatňujícího se až po opylení (Hulzink et al., 2002). Během růstu pylové láčky pozorujeme četnost přítomnosti a translace transkriptů několika stovek genů (Lin et al., 2014). Některé mají specifickou funkci výhradně v tomto stádiu a asi 150 je víceméně specificky silně translatováno v in vivo rostoucí pylové láčce (Lin et al., 2014). Pozorujeme rozdíl v případě klíčení in vitro, kdy očividně chybí účast samičích signalizačních mechanismů na posttranskripční genovou expresi (Lin et al., 2014). Budoucí výzkumy na fyziologické a molekulární úrovni mohou dále objasnit podstatu ještě neprobádaných mechanismů.

v Klíčení semen, význam a podstata translační regulace Semeno je, obdobně jako pylové zrno, dehydratované stádium s omezeným metabolismem. Díky své relativní dlouhověkosti a značné odolnosti má dvojí roli, jednak zajistit přežití nevhodného období (u efemérních a jednoletých bylin toto stádium zajišťuje přežití do další vegetační sezony) a jednak sloužit jako vektor pro postembryonální vývoj nového jedince. Jakmile je jednou rehydratací spuštěno, klíčení je nenávratným procesem. Ø Podstata mechanismu klíčení Proces klíčení je zahájen, když se setkají vhodné podmínky a semeno se již nenachází v dormantním stádiu (Finkelstein et al., 2008). Z hlediska genové exprese můžeme říci, že podobně, jako je tomu u pylového zrna, většina transkripčních a maturačních procesů mRNA důležitých pro klíčení proběhla během zrání semene a po vyklíčení převezme žezlo regulovaná translace skladovaných molekul mRNA (Galland et al., 2014). Transkripce a její regulace hrají roli při udržování a ukončení dormance semen; zde můžeme připomenout dobře popsanou roli kyseliny abscisové (ABA) a giberelinů (Finkelstein et al., 2008). První fytohormon indukuje dormanci a zabraňuje klíčení, druhý má opačný efekt, stimuluje mobilizaci rezerv v semeni a klíčení (Finkelstein et al., 2008). Avšak transkripční regulační mechanismy, mající v tomto stádiu relativizovanou roli, nevysvětlují vše ostatní (Layat et al., 2014). Během klíčení semeno kontrolovaně přechází do metabolicky vysoce aktivního režimu iniciovaného nasáváním vody a pokračujícího přípravnými specifickými procesy, jež vyústí ve vlastní vyklíčení semene emergencí radikuly, vše za intenzivní translace skladovaných molekul mRNA (Galland et al., 2014). Byla popsána 21    

variabilita translace různých transkriptů v různých orgánech, nikoli nepřekvapivě, například platí, že transkripty kódující proteiny hlavních metabolických drah jsou přednostně překládány v dělohách (Ge et al., 2013). Polyzómy byly pozorovány již krátký čas po začátku rehydratace suchého semene (Bewley and Pramanik, 1997) a tento dynamický proces dále pokračuje v několika etapách (Obr. 10).

Obrázek   10:   Fáze   klíčení   a   proteosyntéza   u   Arabidopsis   thaliana.   Nejprve   vidíme   syntézu   proteinů   odpovídajícím   pozdnímu   vývojovému   stádiu   semene,   například   cruciferin   (CRA),   které   jsou   následně   degradované   v  druhé   fázi,   zatímco   nastává   intenzivní   translace   enzymů  zajišťující  právě  tuto  degradaci,  a   také   důležitých   remodelačních   a   opravných   proteinů,   jako   antioxydantů,   například   monodehydroascorbate   reductáza   (MDAR6)   a   detoxifikačních   enzymů,   např.   mercaptopyruvate   sulfurtransferáza   1   (MST1).   Následuje   nástup   třetí   fáze,   který   je   charakterizován   translací   genů   kódujících   pro   cytoskeletární   proteiny,   což   logicky   zapadá   do   navazujícího   klíčení   a   růstu.   (Zdroj  obrázku:  Galland  et  al.,  2014).  

Jak je vidět, u nedormantních semen probíhá exprese existujících (a nově přepisovaných) transkriptů dle organizovaného scénáře, přičemž transkripty prioritně redistribuované do polyzómů kódují zejména proteiny účastnící se buněčného transportu, regulace transkripce a modifikace buněčné stěny (Layat et al., 2014). Do popsaného schématu dobře zapadá příklad exprese aktinu, neboť aktinový cytoskelet se aktivně účastní mobilizace rezerv v prvních fázích následujících po rehydrataci, tedy na počátku vegetativního růstu, (Diaz-Camino et al., 2005). Dokud je semeno suché, aktin je vzácný a nehraje významnou roli během vlastní rehydratace, ovšem záhy dochází k masivní translaci

aktinových mRNA, jež jsou již

přítomny v embryu, nicméně jsou také de novo transkribovány; v neposlední řadě byla pozorována i časová a místní posttranskripční regulace exprese různých izoforem aktinu (Diaz-Camino et al., 2005). U Arabidopsis thaliana je tak v raném stádiu nejvíce exprimován aktin 7 (ACT7), jehož exprese je pod kontrolou fytohormonů, zejména auxinu (McDowell et al., 1996). Popsaný systém tak představuje konkrétní příklad translační kvantitativní a kvalitativní regulace dle časové a místní lokalizace jednotlivých transkriptů během morfogeneze mladého klíčku (Diaz-Camino et al., 2005).

22    

Ø Mechanismy selektivity translace během imbibice, v dormanci a rané ontogenezi Nyní si rozebereme aktuálních znalosti mechanismů selektivní translace dle vývojových stádií semene a klíčku. Rozdíl mezi dormantním a nedormantním stádiem během bobtnání semen je zde zajímavým faktorem. V obou případech pozorujeme výraznou míru asociace mRNA s polyzómy, avšak jejich distribuce se v obou případech liší dle jednotlivých transkriptů, jak to ukazují experimenty u Helianthus annuus (Layat et al., 2014) a Arabidopsis thaliana (Basbouss-Serhal et al., 2015). Délka 5‘UTR nehraje roli v regulaci distribuce transkriptů mezi oběma stavy - translatovaným a netranslatovaným, pozorujeme však korelaci s frekvencí bází G a C v této regulační sekvenci. V dormantním stádiu byly mRNA s nízkým obsahem G a C v 5‘UTR výrazně častěji pozorovány ve vazbě na polyzómy (Basbouss-Serhal et al., 2015). Některé transkripty obsahují krátké ORF v 5‘UTR (uORF, angl.. upstream ORF), jejich přítomnost a délka mají u rostlin represivní účinek na účinnost translace. uORF totiž musejí být preiniciačním komplexem během skenování překonány, často za cenu reiniciace, jíž se pravděpodobně účastní eIF3 (von Arnim et al., 2014). U dormantních semen je zastoupení mRNA obsahujících uORF vyšší než u nedormantních, u nichž naproti tomu pozorujeme diskriminaci četnosti translace a asociace do polyzómů dle délky uORF, pokud jsou přítomné, což, spolu s obsahem G a C, hraje roli v selektivnosti translace. Přesný mechanismus není však zcela prozkoumán (Basbouss-Serhal et al., 2015). To, zda byla jistá mRNA syntetizována de novo po vyklíčení, či byla skladována v suchém semeni, má také svůj význam. Zrání pre-mRNA souvisí s účastí proteinů vázajících se k čepičce v jádře a hrajících roli v regulaci odpovědi na kyselinu abscisovou - ABA (Hugouvieux et al., 2001). Některé transkripty jsou ve své expresi negativně regulovány právě úrovní ABA (Hugouvieux et al., 2001). ABA, snížení jejíž koncentrace indukuje konec dormance a indukuje schopnost klíčení, má také prokazatelný účinek na aktivitu volných, k membráně a k cytoskeletu vázaných polyzómů s tím, každá kategorie přednostně translatuje různé funkční kategorie transkriptů (Szypulska and Weidner, 2011). Také byla experimentálně prokázána přednostní translace skladované mRNA jsou za účasti jedné z izoforem eIF4E, konkrétně eIFiso4E (Dinkova et al., 2011). Funkční rozdílnost translačních iniciačních faktorů eIF4E a eIFiso4E se však neomezuje jen na předchozí příklad, dále byly pozorovány různé fenotypové projevy v případě menšího, či většího zastoupení jedné z obou izoforem (Martinez-Silva et al., 2012). Klíč k této variabilitě leží v 5’UTR, neboť eIF4E se přednostně váže k transkriptům, jejichž 5’UTR je delší a obsahuje stabilní sekundární struktury (Martinez-Silva et al., 2012). Podobně byla 23    

pozorována rozdílná lokalizace a aktivita obou translačních iniciačních faktorů pozorována i v pozdějších fázích ontogeneze, neboť eIFiso4E je více lokalizován v oblasti mladého kořene, což se projevuje například selektivní expresí určitých transkriptů v závislosti na nutričním stavu (Martinez-Silva et al., 2012). Konečně zmíníme regulační propojení procesů transkripce a translace, konkrétně zpětné spojení regulace translace s mechanismem transkripce ve formě pozitivní a negativní regulace prostřednictvím selektivní translace mRNA genů kódujících transkripční faktory (BasboussSerhal et al., 2015). Takto zprostředkovaná transkripční regulace se často týká signalizace spojené s fytohormony, tedy fyziologických procesů následujících po vyklíčení dormantních a nedormantních semen (Basbouss-Serhal et al., 2015).

Závěrečné slovo Jedinečnost rostlinné reprodukce si vyžaduje specifická bádání, neboť tvoří v mnoha faktorech paralelní a méně známý svět vedle mnohem více probádané gametogeneze, embryogeneze a rané ontogeneze živočichů. Výzkum není vždy snadný, zejména co se týče in vivo klíčení pylového zrna, a mnoho objevů vede spíše k popsání k dalších záhad, novým regulačním procesům zasluhujícím probádání. Nyní pokročíme ve sledování dalších fází ontogeneze rostliny, kdy po zahájení svého vegetačního růstu bude muset čelit rychlým změnám podmínek, ne vždy příjemným, a často vyžadujícím okamžitou reakci.

24    

KAPITOLA ČTVRTÁ Regulace translace u rostlin reakcí na vliv klimatických faktorů Nyní se podívejme na význam translačních regulací pro rostlinu během vegetativní a generativní fáze. Jelikož rostlina nemá ve většině případů možnost rychlé fyzické reakce na změnu vlivu prostředí, spíše využívá rychlé adaptace růstových a biosyntetických procesů k přizpůsobení se a k překonání změny.

v Podstata problematiky Zatímco je většina dlouhodobých morfologických a fyziologických adaptací předmětem transkripční regulace, krátkodobé faktory vyžadující okamžitou odpověď spadají často do domény translace, což bude tématem následující části. Stresové situace obecně vedou k celkové

represi

translace,

k rychlému

přechodu

aktivně

translatovaných

mRNA

k sekvestrované vazbě v útvaru stresových granulí, tvořených zejména za účasti eIF4E a specifických mRNA-vazebných proteinů (Weber et al., 2008), avšak rezistence a přežití si vyžadují naopak selektivní zvýšené zastoupení specifických proteinů a příslušné regulační mechanismy jsou na posttranskripční úrovni četné a různorodé. Jelikož se jedná o extrémně polymorfní mechanismus, který zdaleka není plně prozkoumán, učiníme zde rozbor některých významných příkladů náležícím několika typickým stresovým situacím, jež byly experimentálně prokázány.

v Regulace translace v kontextu osvětlení a fotosyntézy Autotrofie rostlin souvisí s nutností rychlých regulací stavu fotosyntetického aparátu ve fotosyntetizujících pletivech. Tyto regulace implikují zejména reakce na intenzitu osvětlení a na fotosyntetický režim chloroplastů (Floris et al., 2013). Intenzita světla a množství CO2 obecně ovlivňují řadu fosforylačních míst ribozomálních proteinů a translačních iniciačních faktorů (Boex-Fontvieille et al., 2013). Konkrétně u Arabidopsis thaliana byl prokázán vliv osvětlení nebo fotosyntetické aktivity (tedy množství CO2) nebo obojího na (de)fosforylaci devíti fosforylačních míst u ribozomálních proteinů a třinácti těchto míst u translačních iniciačních faktorů (Boex-Fontvieille et al., 2013) – viz také kapitola druhá, Obr. 7. Nyní se podívejme na konkrétní adaptační situaci, zejména za souvislých stresových podmínek. Světlosběrný komplex LHC, který absorbuje dopadající světlo, potřebuje zejména možnost rychlé adaptace na přesvětlení, což se promítá do intenzity translace některých 25    

transkriptů kódujících proteiny tohoto komplexu. Příslušné proteiny jsou kódovány jadernými geny, což translační regulaci umožňuje (Floris et al., 2013).

Obrázek   11:   Celkové   množství   mRNA   a   množství   mRNA   v  polyzomální   frakci,   znázorněno   při   slabém  osvětlení  (světle  šedá),  běžném  osvětlení  (středně  šedá)  a  silném  osvětlení  (tmavě  šedá).   (Zdroj  obrázku:  Floris  et  al.,  2013).  

Při nadbytku světla je značně nápadné zvýšení translační úrovně genů Lhcb4.3 a ELIP2 (Obr. 11, Floris et al., 2013). Není se čemu divit, neboť protein ELIP2 se účastní mechanismu fotoprotekce díky své funkci transientního pigmentového přenašeče (Adamska, 1997) a v disipaci škodlivého přebytku energie. Protein Lhcb4.3 má také silný, byť méně prozkoumaný vliv na vlastnosti LHC v této situaci (Klimmek et al., 2006). Rychlá modulace genové exprese právě na posttranskripční úrovni se zde tedy jeví jako nezbytná. Byla prokázána existence signalizační dráhy ze strany chloroplastu, působící na regulaci translace jednotlivých mRNA, avšak ještě zbývá konkrétně objasnit její mechanismus (Floris et al., 2013).

v Reakce rostlinného organismu na změny teploty Na počasí a klimatu záleží nejen osvětlenost, ale také teplota a dostupnost vody. Teplota a její rychlé či pomalé změny představují v přírodě jeden z klíčových faktorů ovlivňujících schopnost přežití a adaptační strategie živých organismů včetně rostlin. Odpovědi na rychlé a/nebo extrémní teplotní variace jsou předmětem četných výzkumů. Z hlediska translace mRNA se budeme zajímat spíše o krátkodobější krizové situace. Ø Reakce a obranné mechanismy rostlin za vysokých teplot Jak je typické pro stresové situace, celková translační úroveň se při tepelném stresu snižuje (Ueda et al., 2012). Typický globální inhibiční mechanismus translace spočívající ve fosforylaci iniciačního faktoru eIF2α při tepelném stresu neplatí (Browning, 2004) a rovněž obě izoformy eIF4E jsou nepostižené (Bailey-Serres, 1999). Naopak byla pozorována globální fosforylace faktoru eIF4A a defosforylace faktoru eIF4B (Bailey-Serres, 1999). 26    

eIF4A obsahuje represivní fosforylační místa inhibující vazební potenciál s iniciačním komplexem (Boex-Fontvieille et al., 2013; Szick-Miranda et al., 2003). Naproti tomu defosforylace eIF4B snižuje jeho interakci s PABP, což je v neprospěch translační reiniciace (Boex-Fontvieille et al., 2013). Konečně byla prokázána defosforylace ribozomálního proteinu S6 (Bailey-Serres, 1999), což opět hraje roli v translační represi (Beltran-Pena et al., 2002). Translace řady transkriptů je tedy snížena ve prospěch úspory energie, kterou by spotřebovala syntéza proteinů, jež nejsou krátkodobě nezbytné, a proto se inhibice týká četných metabolických funkcí včetně například syntézy ribozomálních proteinů (Ueda et al., 2012). Transkripty jsou v případě tepelného stresu víceméně (dle vazebných míst transkriptu) mRNA) skladovány za tvorby agregátů specifických stresových granulí, obsahující mimo jiné tzv. proteiny tepelného stresu (angl. heat shock protein – HSP) z rodiny HSP20 a HSP70 (Weber et al., 2008). Tvorba polyzómů asociovaných s konkrétními mRNA je naopak zvýšena, a to ve prospěch selektivní syntézy specifických proteinů, které usnadní odolnost a přežití organizmu (Ueda et al., 2012). Část vysvětlení selektivní translace spočívá v charakteristikách vlastních molekul mRNA. Na rozdíl od normálních teplot, je za zvýšené teploty u rostlin faktorem přednostní translace délka kódující části mRNA s potenciální rolí v usnadnění cirkularizace transkriptu během iniciace (Yanguez et al., 2013). Co se týče 5’UTR sekvence mRNA, zde byly pozorovány faktory podmiňující prioritní translaci za stresových podmínek, zejména nižší obsah bází G a C (Yanguez et al., 2013). Vysoký obsah G a C bází naopak znesnadňuje iniciaci díky snazší tvorbě sekundárních struktur (Kozak, 2005). Dále, konkrétní 5’UTR sekvence specifických transkriptů kódujících proteiny tepelného stresu umožňují silnou selektivní translaci, jak je tomu např. u HSP81 (Matsuura et al., 2008). Nejedná se o alternativní formu translační iniciace, nýbrž o selektivní podporu jinak umlčené iniciace za vysoké teploty (Matsuura et al., 2008). Ø Reakce a obranné mechanismy rostlin za nízkých teplot Druhá situace, se kterou se seznámíme, bude vliv nízkých teplot, jež nastává nejen v zimním období, ale i krátkodobě při ranních mrazech, apod. Podíváme se na procesy související s aklimatizačními procesy a s krátkodobými adaptačními mechanismy, které náleží k našemu tématu. Za nízkých teplot byla prokázána významná role specifických proteinů, které se váží k mRNA a zajišťují regulaci její translace. U rostlin bylo popsáno několik RNA vazebných proteinů, spojených s krizovou situací nízkých teplot (Juntawong et al., 2013), vysoce 27    

konzervovaných mezi rostlinnými druhy (Karlson et al., 2009). Příkladem jsou proteiny CSP1 až 4 u Arabidopsis thaliana, jejichž koncentrace stoupá za chladu s různou rychlostí, např. Pomalejší akumulace CSP2 je očividně více spojena s dlouhodobější aklimatizací (Juntawong et al., 2013; Kim et al., 2009; Sasaki et al., 2007). Byla pozorována jejich cílená vazba ke specifickým molekulám mRNA asociovaným s polyzómy (Juntawong et al., 2013); například protein CSP1 se přednostně váže s transkripty, kódující proteiny účastnící se zejména energetického metabolismu a geneze ribozómů (Juntawong et al., 2013). Všechny zmíněné proteiny vykazují vůči transkriptům chaperonovou aktivitu se schopností eliminovat sekundární struktury mRNA vzniklé v důsledku chladu (Juntawong et al., 2013; Kim et al., 2009; Sasaki et al., 2007). Selektivnost vazby je podmíněna zejména motivy v 5‘UTR mRNA, podmiňujícími také schopnost tvorby sekundárních struktur (Juntawong et al., 2013). Dokonce se spekuluje o tom, zda existuje korelace s procesem transportu mRNA z jádra interakcí s mRNA helikázami, což by mohlo hrát roli v kontextu konformačních změn postihujících metabolismus mRNA za nízkých teplot (Kim et al., 2009).

v Reakce rostlinného organismu na variace dostupnosti vody Druhý nepředvídatelný a z hlediska rostlin často rozhodující faktor, kterým je četnost a distribuce srážek, jejich nerovnoměrnost, střídání období sucha a záplav, je víceméně spojen s tím prvním, v dobrém i ve zlém. Sucho a zaplavení ovlivňují v přírodě život mnoha rostlin a jsou důležitými faktory ovlivňujícími zemědělství, ale také přežití pokojových rostlin. Ø Reakce a obranné mechanismy rostlin v situaci dehydratace Když jsme se věnovali o vysokým teplotám, jistě nás napadne také problém sucha, i když obojí nemusí být nutně spojeno. Dehydratace znamenající osmotický stres je jednou z největších hrozeb pro suchozemské rostliny. Vyšší rostliny, i sukulentní a adaptované na dlouhá období sucha, nemohou fyzické vyschnutí svých pletiv přežít, jsou takzvaně homoiohydrické (Heber et al., 2006); mají však časovou rezervu danou schopností plazmolytické reakce a regulačních prostředků na molekulární úrovni umožňujících déle přetrvat v naději, že zaprší (či, že budou zality). Osmotický stres může vzniknout i v jiných situacích, významná je například zvýšená salinita. Abiotické stresy doprovázejí veškeré fáze života rostliny, a to již v raném období, o kterém jsme v minulé kapitole hovořili. Dehydratace bývá v tomto stádiu častým problémem, následující fakta je ovšem do jisté míry možno zobecnit na další stresové situace (Swigonska 28    

et al., 2014). Předně má tento abiotický stres jako následek obecné snížení translace následované přednostní translací určitých transkriptů (Kosowska et al., 2004). Další výzkum ukázal podíl volných a vázaných polyzómů, což nepředstavuje pouhou obecnou reorganizaci translační mašinerie, nýbrž to svědčí o selektivitě translace specifických mRNA (Obr. 12), jelikož jednotlivé typy polyzómů do jisté míry korelují s funkcí syntetizovaného proteinu (Krupinska et al., 2003).

Obrázek   12:   U   klíčících   semen   Triticale   caryopses   byl   indukován   osmotický  dehydratační  stres.  Zleva   doprava   vždy:   volné   polyzómy,   polyzómy   vázané   s  membránou,   s  cytoskeletem   a   s  obojím.   Z  těchto   experimentálních   dat   jasně   vyplývá   redistribuce   translační   četnosti   mRNA   a   selektivní   aktivace   translace   specifických   stresových   genových   kategorií   Zdroj   obrázku:   Kosowska  et  al.,  2004).  

Zde vidíme navození preference pro polyzómy vázané na membránu a cytoskelet, jejichž   existence byla u rostlin prokázána (Klyachko et al., 2000), což ukazuje na možnou roli proteinů vázaných s těmito strukturami v promoci translační aktivity (Swigonska et al., 2014). Dále byla experimentálně zjištěna zvýšená stabilita polyzómů selektivně vytvořených za abiotického stresu (Swigonska et al., 2014), což jde ruku v ruce s logikou situace, nejstabilnějšími jsou právě polyzómy asociované s membránou a cytoskeletem (BrosowskaArendt and Weidner, 2011). V kontextu stresové situace nemůžeme vynechat regulační mechanismus spočívající v interakci transkriptů s molekulami malých interferenčních (angl. small interfering) RNA. Tyto siRNA fungují mimo jiné jako translační inhibitory, ve vazbě s proteinem ARGONAUTE se váží ke komplementární mRNA, což vede k represi či k rozštěpení mRNA (Chen, 2009). Obrázek   13:   vliv   proteinu   IAR3   na   toleranci   k  vyschnutí:   mutace   genu   iar3   vede   ke  značně   snížené   toleranci   a   nižšímu   procentu   přežití   po   dvou   týdnech   působení   vodního   stresu   (zdroj   obrázku:   Kinoshita   et   al.,  2012).  

Gen IAR3 má u četných rostlin nezbytnou funkci při   zvýšení tolerance k vyschnutí (Kinoshita et al., 2012), jak ukazuje následující pokus (Obr. 13). Protein IAR3 hraje roli zejména 29    

v morfologických modifikacích nastávajících za osmotického stresu a translace příslušného transkriptu je za normálních podmínek reprimovaná interakcí s molekulou siRNA zvanou miR167a, což vede k

rozštěpení transkriptu. Vyšší zastoupení miR167a tedy koreluje

s nižším zastoupením transkriptu IAR3 a naopak (Kinoshita et al., 2012). Závěr je jasný: regulačním mechanismem je snížení tvorby a koncentrace miR167a, což bylo experimentálně prokázáno za osmotického stresu a nastávající během dehydratační krize (Kinoshita et al., 2012). Snížení úrovně miR167a umožňuje zvýšení exprese genu IAR3, ve prospěch adaptace rostliny, zvyšující šanci na přežití (Kinoshita et al., 2012). Viděli jsme tedy pěkný příklad experimentálního důkazu účasti siRNA v translační regulaci v odpovědi na abiotický stres. Ø Reakce a obranné mechanismy rostlin v situaci zaplavení a následné hypoxie Hospodaření s vodou a schopnost přizpůsobení se suchu tvoří komplexní problém. Podívejme se nyní na opačnou situaci, je-li přebytek vody v substrátu a následně i v pletivech kořene a prýtu. Tato situace je běžná při silných srážkách, záplavách, klasickém scénáři přelévání pokojových rostlin a existuje dlouhodoběji v některých ekosystémech. Způsobuje jednak porušení homeostáze a jednak anoxii s možným vážnými následky pro metabolismus rostliny (Lin et al., 2015) nemluvě o zvýšeném riziku biologického napadení. Znemožnění oxidativní fosforylace v podmínkách anoxie také zásadně omezuje dostupnost ATP (Shingaki-Wells et al., 2014), což nás zajímá při průzkumu translační regulace, která se v podobných limitních případech uplatní. Rostliny s adaptací na často zaplavené a málo provzdušněné půdy nejsou nutně tolerantnější k anoxii, spíše se u nich vyvinula schopnost transportu kyslíku na větší vzdálenost (Vartapetian, 2006). Procesy anaerobní glykolýzy a etanolové fermentace nastávající v situace hypoxie a anoxie vyžadují preferenční výskyt specifických enzymů (Vartapetian, 2006). I když globálně má anoxie za následek redukci počtu polyzómů a tím redukci úrovně translace, pozorujeme přesný opak v případě transkriptů kódujících zmíněné specifické enzymy patřící mezi takzvané stresové proteiny (Szick-Miranda et al., 2003). Například u kukuřice, je tímto způsobem zesílena exprese genů kódujících alkohol dehydrogenázu 1 a 2, sacharóza syntázu 1 a 2, aldolázu a enolázu (Szick-Miranda et al., 2003). Nyní se podívejme na molekulární podstatu translačních regulací. Faktor eIF4B a ribozomální protein S6 jsou za anoxie defosforylovány (Szick-Miranda et al., 2003), což obojí vede k represi translace (Beltrán-Peňa et al., 2002; Boex-Fontvieille et al., 2013), jak jsme již uvedli v případě tepelného stresu. Podobně helikáza eIF4A, která je za podmínek anoxie také do 60ti minut fosforylovaná (Fennoy and Bailey-Serres, 1995), a PABP mají v těchto 30    

podmínkách sníženou schopnost vazby s translačním iniciačním komplexem a i obecně je jeho stabilita snížena (Boex-Fontvieille et al., 2013; Szick-Miranda et al., 2003). Anoxie rovněž způsobuje snížení účinnosti interakce faktorů eIF4A a PABP s faktorem eIF4G či eIF4isoG (Szick-Miranda et al., 2003). Ještě zbývá zmínit fosforylaci iniciačního faktoru eIF2α, jež zabraňuje jeho reaktivaci výměnou GDP za GTP (Muench et al., 2012) a kterou v situaci anoxie pozorujeme (Li et al., 2011). Podobně je tomu i v případě fosforylace elongačního faktoru eEF2 (Li et al., 2011). Viděli jsme tedy příčiny celkového umlčení translační aktivity, nyní se budeme věnovat schopnosti selektivní iniciace translace transkriptů kódujících stresové proteiny. Molekuly mRNA

stresových

proteinů

mohou

jevit

vyšší

stabilitu,

což

je

zvýhodňuje

v konkurenceschopnosti při iniciaci translace ve zmíněných podmínkách (Fennoy and Baileyserres, 1995). To však nevysvětluje vše, neboť větší roli hraje sekvence nukleotidů mimo ORF, například v závislosti na izoformách faktorů eIF4F a eIF4isoF. Forma eIF4isoF (skládající se z eIF4isoE a eIF4isoG) neumožňuje, na rozdíl od své kolegyně, translaci transkriptů obsahujících výrazné sekundární strukturní motivy v 5’UTR (Gallie and Browning, 2001). Při anoxii, přesněji řečeno v důsledku sníženého pH charakteristického pro tento stav, je hyperfosforylován faktor eIF4E, nikoliv však jeho izoforma eIF4isoE, jejíž stav se nemění (Szick-Miranda et al., 2003). Fosforylace mění vazebnou afinitu faktorů (Khan and Goss, 2004), čímž jsou selektivně více ovlivněny transkripty vyžadující komplex eIF4F. Co se týče 5’UTR sekvence, u některých transkriptů pozorujeme také případ silného translačního aktivátoru, o to účinnějšího, čím blíže start kodonu se vyskytuje. Transkript genu kódující pro alkohol dehydrogenázu obsahuje specifickou sekvenci poblíž start kodonu, která je vysoce účinná (Satoh et al., 2004).Tato sekvence neovlivňuje stabilitu, tedy akumulaci transkriptů (Satoh et al., 2004) a nemá zvláštní význam za aerobních podmínek (Mardanova et al., 2007), avšak umožňuje vyhnutí se globálnímu translačnímu umlčení a tedy efektivní translaci za situace hypoxie (Mardanova et al., 2007).

Závěrečné slovo Jak jsme viděli, rostliny využívají k přežití a adaptaci abiotickým stresům panoplii regulačních možností, které translační mašinerie nabízí: vlastní struktura molekuly mRNA tvořící transkript, regulace transkripčních faktorů, jiné interagující molekuly. Můžeme se jen těšit, až nám budoucí výzkumy popíší konkrétní mechanismy s ještě bohatšími detaily a odhalí další tajemství. V další kapitole se znovu setkáme s podobnými jevy, tentokrát v kontextu jejich zneužití virovým patogenem a sebeobrany hostitele. 31    

KAPITOLA PÁTÁ Regulace translace u rostlin v situaci virové infekce Nepříznivé abiotické podmínky nejsou jedinou hrozbou, které musí rostlina čelit. Virové infekce, ať spontánní či oportunistické, jsou pro rostliny potenciálním vážným ohrožením. Podstata virové infekce je známá. Virus se vyznačuje závislostí na transkripčním a translačním aparátu hostitelské buňky pro syntézu vlastních proteinů.

v Obecně o virové infekci Virus postrádá vlastní translační mechanismus a pronikne do hostitelské buňky za účelem vlastního rozmnožování, replikace svého genomu (různými mechanismy, jejichž podrobná charakteristika sahá nad rámec této práce) a syntézy vlastních proteinů, většinou v omezené míře a s významnými specifickými funkcemi (Csorba et al., 2015), mezi něž patří zásahy do signálních a regulačních drah hostitelské buňky, čímž je dále oslaben obranný systém hostitele (Walsh and Mohr, 2011). Viriony se také mohou snadno rozšířit do okolních buněk až do celého organismu, u rostlin z buňky do buňky prostřednictvím plasmodesmů a na velkou vzdálenost přes floém (Csorba et al., 2015). V rámci koevoluce virů a rostlin se vyvinulo, jak je tomu často u interakcí patogenů a hostitelů, množství útočných a obranných mechanismů (Csorba et al., 2015).

v Virové infekce u rostlin a jejich strategie využití translačního aparátu hostitele Nyní se budeme věnovat zneužití translace ze strany virů, obvykle intenzivnímu vzhledem k rychlému replikačnímu cyklu viru (Gao et al., 2014). Uveďme několik známých vektorů a jejich strategií, které se liší zejména dle typů virových patogenů a specificitou k rostlinnému hostiteli (Csorba et al., 2015). Zaměříme se na pozitivní jednořetězové RNA viry tvořící nejvýznamnější skupinu rostlinných patogenů (Ghoshal and Sanfacon, 2015). Ø 5‘ Omega faktor: známý příklad translačního zesilovače u rostlinného viru Virus tabákové mozaiky (TMV) je pozitivní RNA virus, jehož molekula RNA obsahuje v 5‘UTR oblasti specifickou sekvenci, známou pod názvem Omega (Ω) leader (Gallie, 2002). Molekula RNA tohoto viru obsahuje 5‘ čepičku, avšak postrádá poly(A) řetězec, nicméně i přesto nebo právě proto je efektivně translatována (Gallie, 2002). Ω leader umožňuje zahájení translace doprovázené rozpadem proteinů virionu spojených s molekulou RNA v řádu minut 32    

po vniknutí do hostitelské buňky a následovně i translaci volných virových RNA v cytoplasmě hostitele (Gallie, 2002). V TMV RNA pozorujeme nejen absenci sekundární struktury 5’UTR, ale také specifickou poly(CAA) sekvenci, kde Ω leader rekrutuje hostitelský protein HSP101 (Wells et al., 1998). Následně jsou vázány faktory eIF4G a eIF3, což umožní vazbu 40S ribozomální podjednotky bez nutnosti účasti dalších podjednotek, například helikázy eIF4A (Wells et al., 1998). Specifická sekundární struktura na 3‘ konci TMV RNA, jež mimikuje strukturu tRNA hraje roli v translační iniciaci, neboť takto umožňuje interakci s 5’ koncem a přítomnými faktory (Dreher and Miller, 2006). Za zmínku stojí, že 3’UTR TMV RNA se neúčastní prvního kola translace po průniku viru do buňky (Gallie, 2002). Ø 3‘ translační aktivátory nezávislé na čepičce Viry si v mnoha případech přivlastňují translaci svých molekul mRNA využitím komplexu eIF4F nezávisle na čepičce, jež jejich mRNA často postrádá (Simon and Miller, 2013). Rovněž může chybět poly(A) řetězec na 3‘ konci a 3’UTR může obsahovat aktivační sekvenci, což je častou strategií u rostlinných virů, zejména pozitivních jednořetězcových RNA virů (Nicholson and White, 2011), z nichž můžeme zmínit významnou rodinu virů Tombusviridae (Gao et al., 2013). Prokázal to pokus se satelitní mRNA viru nekrózy tabáku ze zmíněné rodiny, kde odstranění 120 nukleotidů v 3‘UTR téměř znemožnilo translaci (Simon and Miller, 2013). To je rozdíl oproti živočišným virům, kdy u nečepičkovaných molekul mRNA bývá pro iniciaci translace významná spíše 5’UTR sekvence (Gao et al., 2013). Zmíněné sekvence se vyznačují schopností tvořit sekundární struktury v mRNA (krátkými spoji komplementárních úseků), kdy 3'UTR sekvence tvoří smyčku, jež interaguje s apikální vlásenkovou strukturou na 5' konci (Simon and Miller, 2013) poté, co tato navázala translační iniciační faktory nebo přímo ribozomální subjednotky (Gao et al., 2014). Iniciace translace na 5‘ konci je tedy zprostředkována funkcí 3’UTR translačního zesilovače (angl. enhanceru), který rekrutuje iniciační faktory, ve většině případů eIF4E a eIF4G, a předá je na správné místo, což je mechanismus víceméně specifický pro rostlinné viry (Gao et al., 2014). Tímto mechanismem translační iniciace nezávislé na čepičce mohou jednořetězové pozitivní RNA viry zajistit syntézu vlastních proteinů na úkor proteosyntézy hostitele (Nicholson and White, 2011).

33    

v Umlčení mRNA jako obranný mechanismus rostlin Poté, co jsme viděli v minulé kapitole, je zřejmé, že umlčení mRNA je užitečným mechanismem negativní regulace genové exprese i na posttranskripčních úrovních, například u rostlinných pozitivních jednořetězových RNA virů (Ghoshal and Sanfacon, 2015). První fází je využití virových dvouřetězových RNA objevujících se u jednořetězových RNA virů během replikace (Zhu and Guo, 2012) či v případech sekundárních struktur (Ding and Voinnet, 2007), které nejsou u těchto RNA vzácným jevem. Po rozpoznání DICER-like enzymy je virová dsRNA rozštěpena na malé interferenční RNA, zvané vsiRNA (virusderived small interfering RNA) (Ma et al., 2015). V další fázi umlčování vstupují do hry proteiny ARGONAUTE, dosti konzervované u eukaryotických organismů (Mallory and Vaucheret, 2010). Tento protein se ve spojení s dalšími proteiny váže k vsiRNA molekule a vytvoří komplex RISC, jehož cílem je virová RNA (Mallory and Vaucheret, 2010). Funkcí komplexu RISC je umlčení cílové virové molekuly RNA díky komplementaritě specifických sekvencí (Zhu and Guo, 2012). Virová RNA je následně rozštěpena, fragmenty mohou sekundárně sloužit amplifikaci, tedy k tvorbě dalších molekul vsiRNA prostřednictvím rostlinné RNA-dependentní RNA polymerázy a DICER-like enzymu (Zhu and Guo, 2012). Rozštěpení

mRNA

není

jediným

mechanismem umlčení, je však důležitým, jelikož vede k tomuto amplifikačnímu cyklu obranného mechanismu umlčení (Mallory and Vaucheret, 2010).

Obrázek   14:   Obecné   schéma   umlčení   virové   mRNA   jejím   rozštěpením   komplexem   RISC   tvořeným   vsiRNA   a   proteinem   ARGONAUTE.   Bližší  popis  v  textu.  

Závěrečné slovo Znalosti a poznatky o reakci rostlin na napadení virovými patogeny by si zasloužily samostatnou práci, zde jsme se z prostorových důvodů omezili jen na omezené množství výše popsaných případů. Mechanismy, se kterými jsme se zde setkali, však odhalují další krok k poznání četnosti významů procesu translace mRNA pro rostliny a úctyhodného bohatství a zajímavosti translačního mechanismu vůbec. Z praktického hlediska se mechanismy interakcí virů s hostitelem navíc dají četně využívat k různým experimentům. 34    

ZÁVĚR Předložená rešerše nás provedla pestrým světem translace mRNA v rostlinné buňce, takto významného regulačního aparátu syntézy proteinů doplňujícího selektivní aktivaci a represi transkripce jednotlivých genů. Na úrovni ontogeneze je tato regulační hladina často zastiňována nezbytnou a dominantní regulací transkripční, avšak některé vývojové fáze a procesy, například oplození a klíčení semen včetně rané ontogeneze, jsou na využití již transkribované a dále skladované mRNA vysoce závislé. Dále jsme probrali reakci rostlin na abiotický stres, při kterém rostlina bez možnosti pohybu z místa na místo získává tímto typem regulace značnou výhodu rychlé reakce na nastalou situaci. Společně s modulárním způsobem růstu je právě schopnost rychlé reakce pro rostlinu nezbytná. Konečně jsme stručně zmínili i reakci rostlinného organizmu na napadení patogenem, zejména virovou infekci, kdy se uplatňují specifické a velice zajímavé molekulární mechanismy jako výsledek dlouhých společných závodů ve zbrojení patogenů a hostitelů. Studium hospodaření s mRNA a regulace translace dává nikoli úplnou, avšak velice obsáhlou představu o komplexitě a zajímavosti vývojových a regulačních procesů rostlin na fyziologické a molekulární úrovni. Z četných výzkumů a získaných znalostí můžeme usuzovat na podstatu věci. Současné rostliny jsou výsledkem dlouhodobého nezávislého vývoje, jejichž společným předkem, který je spojuje i s živočichy, byl před stovkami milionů let jednobuněčný organismus. Výzkum dnešních mechanismů regulace a ontogeneze však nemůže než vykazovat značnou divergenci vyplývající z odlišné organizace mnohobuněčného těla i z rozdílných životních strategií. Avšak vzdálený společný původ a obdobnost některých podnětů, jakými jsou například virová napadení a abiotické stresové situace, vysvětluje nezanedbatelné podoby pozorovaných mechanismů u rostlin s ostatními vývojovými liniemi. Četná podoba spojená s kvalitativními a kvantitativními rozdíly svědčí o logice věci. Je velice zajímavé pozorovat procesy regulace genové exprese na posttranskripčních úrovních, jež jsou výsledkem dlouhého pragmatického i náhodného účinku evoluce, která umožnila obrovský úspěch rostlin jako přisedlých autotrofních organismů. Výzkum fyziologie a cytologie rostlin má před sebou širokou perspektivu. Z čistě vědeckého hlediska zbývá ještě hodně objevit a pochopit k objasnění tajemství podstaty života a jeho vývoje. Bez rostlin bychom tu nebyli, a to nejen proto, že produkují kyslík, ale i proto, že jsou i primárními producenty potravního řetězce, a tak je pro nás jejich výzkum neméně důležitý než výzkum v oblasti biologie člověka a humánní medicíny. A to nejen z ekonomického hlediska. Pochopení rostlin a jejich biologie bude dříve či později stát na jednom z předních míst, co se týče zajištění budoucnosti lidstva a naší planety, naší výživy, ochrany přírody, pestrého a bohatého prostředí, kdy původně vědecký zájem v sobě spojí užitečné a příjemné. Nikdo sice neví, co přinese budoucnost a kterým směrem se výzkum bude ubírat, avšak s touto perspektivou má experimentální biologie rostlin budoucnost před sebou a máme se tedy opravdu na co těšit.

35    

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY Adamska,  I.,  1997,  ELIPs  -­‐  Light-­‐induced  stress  proteins:  Physiologia  Plantarum,  v.  100,  p.  794-­‐805.   Bailey-­‐Serres,  J.,  1999,  Selective  translation  of  cytoplasmic  mRNAs  in  plants:  Trends  in  Plant  Science,   v.  4,  p.  142-­‐148.   Basbouss-­‐Serhal,  Soubigou-­‐Taconnat,  Bailly,  and  Leymarie,  2015,  Germination  Potential  of  Dormant   and  Nondormant  Arabidopsis  Seeds  Is  Driven  by  Distinct  Recruitment  of   Messenger  RNAs  to  Polysomes.   Bate,  N.,  C.  Spurr,  G.  D.  Foster,  and  D.  Twell,  1996,  Maturation-­‐specific  translational  enhancement   mediated  by  the  5'-­‐UTR  of  a  late  pollen  transcript:  Plant  Journal,  v.  10,  p.  613-­‐623.   Bedinger,  P.,  1992,  THE  REMARKABLE  BIOLOGY  OF  POLLEN:  Plant  Cell,  v.  4,  p.  879-­‐887.   Beltran-­‐Pena,  E.,  R.  Aguilar,  A.  Ortiz-­‐Lopez,  T.  D.  Dinkova,  and  E.  S.  de  Jimenez,  2002,  Auxin  stimulates   S6  ribosomal  protein  phosphorylation  in  maize  thereby  affecting  protein  synthesis   regulation:  Physiologia  Plantarum,  v.  115,  p.  291-­‐297.   Ben-­‐Shem,  A.,  N.  G.  de  Loubresse,  S.  Melnikov,  L.  Jenner,  G.  Yusupova,  and  M.  Yusupov,  2011,  The   Structure  of  the  Eukaryotic  Ribosome  at  3.0  angstrom  Resolution:  Science,  v.  334,  p.  1524-­‐ 1529.   Bentley,  D.  L.,  2014,  Coupling  mRNA  processing  with  transcription  in  time  and  space:  Nature  Reviews   Genetics,  v.  15,  p.  163-­‐175.   Betat,  H.,  Y.  Long,  J.  E.  Jackman,  and  M.  Morl,  2014,  From  End  to  End:  tRNA  Editing  at  5  '-­‐  and  3  '-­‐ Terminal  Positions:  International  Journal  of  Molecular  Sciences,  v.  15,  p.  23975-­‐23998.   Bewley,  J.  D.,  and  S.  K.  Pramanik,  1997,  Post-­‐transcriptional  regulation  of  storage  protein  synthesis   during  early  embryogenesis:  Basic  and  Applied  Aspects  of  Seed  Biology,  v.  30,  p.  53-­‐61.   Boex-­‐Fontvieille,  E.,  M.  Daventure,  M.  Jossier,  M.  Zivy,  M.  Hodges,  and  G.  Tcherkez,  2013,   Photosynthetic  Control  of  Arabidopsis  Leaf  Cytoplasmic  Translation  Initiation  by  Protein   Phosphorylation:  Plos  One,  v.  8,  p.  12.   Brosowska-­‐Arendt,  W.,  and  S.  Weidner,  2011,  Effect  of  osmotic  stress  on  the  formation  of  a   population  of  polysomes  and  their  stability  in  pea  (Pisum  sativum  L.)  seeds:  Acta  Physiologiae   Plantarum,  v.  33,  p.  1475-­‐1482.   Browning,  K.  S.,  2004,  Plant  translation  initiation  factors:  it  is  not  easy  to  be  green:  Biochemical   Society  Transactions,  v.  32,  p.  589-­‐591.   Chen,  X.  M.,  2009,  Small  RNAs  and  Their  Roles  in  Plant  Development,  Annual  Review  of  Cell  and   Developmental  Biology:  Annual  Review  of  Cell  and  Developmental  Biology,  v.  25:  Palo  Alto,   Annual  Reviews,  p.  21-­‐44.   Cheng,  S.  J.,  and  D.  R.  Gallie,  2010,  Competitive  and  Noncompetitive  Binding  of  eIF4B,  eIF4A,  and  the   Poly(A)  Binding  Protein  to  Wheat  Translation  Initiation  Factor  eIFiso4G:  Biochemistry,  v.  49,   p.  8251-­‐8265.   Cheung,  A.  Y.,  Q.  H.  Duan,  S.  S.  Costa,  B.  H.  J.  de  Graaf,  V.  S.  Di  Stilio,  J.  Feijo,  and  H.  M.  Wu,  2008,  The   dynamic  pollen  tube  cytoskeleton:  Live  cell  studies  using  actin-­‐binding  and  microtubule-­‐ binding  reporter  proteins:  Molecular  Plant,  v.  1,  p.  686-­‐702.   Cognat,  V.,  G.  Pawlak,  A.  M.  Duchene,  M.  Daujat,  A.  Gigant,  T.  Salinas,  M.  Michaud,  B.  Gutmann,  P.   Giege,  A.  Gobert,  and  L.  Marechal-­‐Drouard,  2013,  PlantRNA,  a  database  for  tRNAs  of   photosynthetic  eukaryotes:  Nucleic  Acids  Research,  v.  41,  p.  D273-­‐D279.   Csorba,  T.,  L.  Kontra,  and  J.  Burgyan,  2015,  viral  silencing  suppressors:  Tools  forged  to  fine-­‐tune  host-­‐ pathogen  coexistence:  Virology,  v.  479,  p.  85-­‐103.   Cui,  Z.  B.,  Q.  Xu,  and  X.  X.  Wang,  2014,  Regulation  of  the  circadian  clock  through  pre-­‐mRNA  splicing  in   Arabidopsis:  Journal  of  Experimental  Botany,  v.  65,  p.  1973-­‐1980.   Dennis,  M.  D.,  and  K.  S.  Browning,  2009,  Differential  Phosphorylation  of  Plant  Translation  Initiation   Factors  by  Arabidopsis  thaliana  CK2  Holoenzymes:  Journal  of  Biological  Chemistry,  v.  284,  p.   20602-­‐20614.   36    

Diaz-­‐Camino,  C.,  R.  Conde,  N.  Ovsenek,  and  M.  A.  Villanueva,  2005,  Actin  expression  is  induced  and   three  isoforms  are  differentially  expressed  during  germination  in  Zea  mays:  Journal  of   Experimental  Botany,  v.  56,  p.  557-­‐565.   Ding,  S.  W.,  and  O.  Voinnet,  2007,  Antiviral  immunity  directed  by  small  RNAs:  Cell,  v.  130,  p.  413-­‐426.   Dinkova,  T.  D.,  N.  A.  Marquez-­‐Velazquez,  R.  Aguilar,  P.  E.  Lazaro-­‐Mixteco,  and  E.  S.  de  Jimenez,  2011,   Tight  translational  control  by  the  initiation  factors  eIF4E  and  eIF(iso)4E  is  required  for  maize   seed  germination:  Seed  Science  Research,  v.  21,  p.  85-­‐93.   Dreher,  T.  W.,  and  W.  A.  Miller,  2006,  Translational  control  in  positive  strand  RNA  plant  viruses:   Virology,  v.  344,  p.  185-­‐197.   Dresselhaus,  T.,  and  N.  Franklin-­‐Tong,  2013,  MaleFemale  Crosstalk  during  Pollen  Germination,  Tube   Growth  and  Guidance,  and  Double  Fertilization:  Molecular  Plant,  v.  6,  p.  1018-­‐1036.   Faus,  I.,  A.  Zabalza,  J.  Santiago,  S.  G.  Nebauer,  M.  Royuela,  R.  Serrano,  and  J.  Gadea,  2015,  Protein   kinase  GCN2  mediates  responses  to  glyphosate  in  Arabidopsis:  Bmc  Plant  Biology,  v.  15,  p.   12.   Fennoy,  S.  L.,  and  J.  Baileyserres,  1995,  POSTTRANSCRIPTIONAL  REGULATION  OF  GENE-­‐EXPRESSION   IN  OXYGEN-­‐DEPRIVED  ROOTS  OF  MAIZE:  Plant  Journal,  v.  7,  p.  287-­‐295.   Finkelstein,  R.,  W.  Reeves,  T.  Ariizumi,  and  C.  Steber,  2008,  Molecular  aspects  of  seed  dormancy,   Annual  Review  of  Plant  Biology:  Annual  Review  of  Plant  Biology,  v.  59:  Palo  Alto,  Annual   Reviews,  p.  387-­‐415.   Floris,  M.,  R.  Bassi,  C.  Robaglia,  A.  Alboresi,  and  E.  Lanet,  2013,  Post-­‐transcriptional  control  of  light-­‐ harvesting  genes  expression  under  light  stress:  Plant  Molecular  Biology,  v.  82,  p.  147-­‐154.   Galland,  M.,  R.  Huguet,  E.  Arc,  G.  Cueff,  D.  Job,  and  L.  Rajjou,  2014,  Dynamic  Proteomics  Emphasizes   the  Importance  of  Selective  mRNA  Translation  and  Protein  Turnover  during  Arabidopsis  Seed   Germination:  Molecular  &  Cellular  Proteomics,  v.  13,  p.  252-­‐268.   Gallie,  D.  R.,  2002,  The  5  '-­‐leader  of  tobacco  mosaic  virus  promotes  translation  through  enhanced   recruitment  of  eIF4F:  Nucleic  Acids  Research,  v.  30,  p.  3401-­‐3411.   Gallie,  D.  R.,  and  K.  S.  Browning,  2001,  eIF4G  functionally  differs  from  eIFiso4G  in  promoting  internal   initiation,  cap-­‐independent  translation,  and  translation  of  structured  mRNAs:  Journal  of   Biological  Chemistry,  v.  276,  p.  36951-­‐36960.   Gao,  F.,  S.  P.  Gulay,  W.  Kasprzak,  J.  D.  Dinman,  B.  A.  Shapiro,  and  A.  E.  Simon,  2013,  The  Kissing-­‐Loop   T-­‐Shaped  Structure  Translational  Enhancer  of  Pea  Enation  Mosaic  Virus  Can  Bind   Simultaneously  to  Ribosomes  and  a  5  '  Proximal  Hairpin:  Journal  of  Virology,  v.  87,  p.  11987-­‐ 12002.   Gao,  F.,  W.  K.  Kasprzak,  C.  Szarko,  B.  A.  Shapiro,  and  A.  E.  Simon,  2014,  The  3  '  Untranslated  Region  of   Pea  Enation  Mosaic  Virus  Contains  Two  T-­‐Shaped,  Ribosome-­‐Binding,  Cap-­‐Independent   Translation  Enhancers:  Journal  of  Virology,  v.  88,  p.  11696-­‐11712.   Ge,  F.  W.,  Y.  Hu,  and  J.  B.  Wang,  2013,  Spatial  and  temporal  gene  expression  during  seed  germination   of  Brassica  napus:  Acta  Physiologiae  Plantarum,  v.  35,  p.  2939-­‐2950.   Ghoshal,  B.,  and  H.  Sanfacon,  2015,  Symptom  recovery  in  virus-­‐infected  plants:  Revisiting  the  role  of   RNA  silencing  mechanisms:  Virology,  v.  479,  p.  167-­‐179.   Gingras,  A.  C.,  B.  Raught,  and  N.  Sonenberg,  1999,  eIF4  initiation  factors:  Effectors  of  mRNA   recruitment  to  ribosomes  and  regulators  of  translation:  Annual  Review  of  Biochemistry,  v.   68,  p.  913-­‐963.   Graifer,  D.,  and  G.  Karpova,  2015,  Roles  of  ribosomal  proteins  in  the  functioning  of  translational   machinery  of  eukaryotes:  Biochimie,  v.  109C,  p.  1-­‐17.   Hafidh,  S.,  V.  Capkova,  and  D.  Honys,  2011,  SAFE  KEEPING  THE  MESSAGE:  mRNP  Complexes  Tweaking   after  Transcription,  in  L.  J.  Collins,  ed.,  Rna  Infrastructure  and  Networks:  Advances  in   Experimental  Medicine  and  Biology,  v.  722:  Berlin,  Springer-­‐Verlag  Berlin,  p.  118-­‐136.   Heber,  U.,  O.  L.  Lange,  and  V.  A.  Shuvalov,  2006,  Conservation  and  dissipation  of  light  energy  as   complementary  processes:  homoiohydric  and  poikilohydric  autotrophs:  Journal  of   Experimental  Botany,  v.  57,  p.  1211-­‐1223.   37    

Hinnebusch,  A.  G.,  2014,  The  Scanning  Mechanism  of  Eukaryotic  Translation  Initiation,  in  R.  D.   Kornberg,  ed.,  Annual  Review  of  Biochemistry,  Vol  83:  Annual  Review  of  Biochemistry,  v.  83:   Palo  Alto,  Annual  Reviews,  p.  779-­‐812.   Holdaway-­‐Clarke,  T.  L.,  and  P.  K.  Hepler,  2003,  Control  of  pollen  tube  growth:  role  of  ion  gradients   and  fluxes:  New  Phytologist,  v.  159,  p.  539-­‐563.   Honys,  D.,  J.  P.  Combe,  D.  Twell,  and  V.  Capkova,  2000,  The  translationally  repressed  pollen-­‐specific   ntp303  mRNA  is  stored  in  non-­‐polysomal  mRNPs  during  pollen  maturation:  Sexual  Plant   Reproduction,  v.  13,  p.  135-­‐144.   Honys,  D.,  D.  Renak,  J.  Fecikova,  P.  L.  Jedelsky,  J.  Nebesarova,  P.  Dobrev,  and  V.  Capkova,  2009,   Cytoskeleton-­‐Associated  Large  RNP  Complexes  in  Tobacco  Male  Gametophyte  (EPPs)  Are   Associated  with  Ribosomes  and  Are  Involved  in  Protein  Synthesis,  Processing,  and   Localization:  Journal  of  Proteome  Research,  v.  8,  p.  2015-­‐2031.   Hugouvieux,  V.,  J.  M.  Kwak,  and  J.  I.  Schroeder,  2001,  An  mRNA  cap  binding  protein,  ABH1,   modulates  early  abscisic  acid  signal  transduction  in  Arabidopsis:  Cell,  v.  106,  p.  477-­‐487.   Hulzink,  R.  J.  M.,  P.  F.  M.  de  Groot,  A.  F.  Croes,  W.  Quaedvlieg,  D.  Twell,  G.  J.  Wullems,  and  M.  M.  A.   van  Herpen,  2002,  The  5  '-­‐untranslated  region  of  the  ntp303  gene  strongly  enhances   translation  during  pollen  tube  growth,  but  not  during  pollen  maturation:  Plant  Physiology,  v.   129,  p.  342-­‐353.   Juntawong,  P.,  R.  Sorenson,  and  J.  Bailey-­‐Serres,  2013,  Cold  shock  protein1  chaperones  mRNAs   during  translation  in  Arabidopsis  thaliana:  Plant  Journal,  v.  74,  p.  1016-­‐1028.   Karlson,  D.,  K.  Nakaminami,  K.  Thompson,  Y.  Yang,  V.  Chaikam,  and  P.  Mulinti,  2009,  Plant  Cold-­‐shock   Domain  Proteins:  on  the  Tip  of  an  Iceberg:  Plant  Cold  Hardiness:  from  the  Laboratory  to  the   Field,  p.  43-­‐54.   Kawaguchi,  R.,  and  J.  Bailey-­‐Serres,  2002,  Regulation  of  translational  initiation  in  plants:  Current   Opinion  in  Plant  Biology,  v.  5,  p.  460-­‐465.   Kessler,  S.  A.,  and  U.  Grossniklaus,  2011,  She's  the  boss:  signaling  in  pollen  tube  reception:  Current   Opinion  in  Plant  Biology,  v.  14,  p.  622-­‐627.   Khan,  M.  A.,  and  D.  J.  Goss,  2004,  Phosphorylation  states  of  translational  initiation  factors  affect   mRNA  cap  binding  in  wheat:  Biochemistry,  v.  43,  p.  9092-­‐9097.   Kim,  M.  H.,  K.  Sasaki,  and  R.  Imai,  2009,  Cold  Shock  Domain  Protein  3  Regulates  Freezing  Tolerance  in   Arabidopsis  thaliana:  Journal  of  Biological  Chemistry,  v.  284,  p.  23454-­‐23460.   Kinoshita,  N.,  H.  Wang,  H.  Kasahara,  J.  Liu,  C.  MacPherson,  Y.  Machida,  Y.  Kamiya,  M.  A.  Hannah,  and   N.  H.  Chua,  2012,  IAA-­‐Ala  Resistant3,  an  Evolutionarily  Conserved  Target  of  miR167,   Mediates  Arabidopsis  Root  Architecture  Changes  during  High  Osmotic  Stress:  Plant  Cell,  v.   24,  p.  3590-­‐3602.   Klimmek,  F.,  A.  Sjodin,  C.  Noutsos,  D.  Leister,  and  S.  Jansson,  2006,  Abundantly  and  rarely  expressed   Lhc  protein  genes  exhibit  distinct  regulation  patterns  in  plants:  Plant  Physiology,  v.  140,  p.   793-­‐804.   Klyachko,  N.,  L.  Aksenova,  M.  Dunaeva,  and  A.  Kulikova,  2000,  Interaction  of  plant  polysomes  with   the  actin  cytoskeleton:  Cell  Biology  International,  v.  24,  p.  351-­‐358.   Kosowska,  M.,  E.  Fraczek,  R.  Amarowicz,  M.  Karamac,  S.  Abe,  and  S.  Weidner,  2004,  Water-­‐deficit-­‐ induced  changes  in  cytoskeleton-­‐bound  and  other  polysomal  populations  in  embryonic  tissue   during  triticale  caryopsis  germination:  Acta  Physiologiae  Plantarum,  v.  26,  p.  67-­‐74.   Kozak,  M.,  2005,  Regulation  of  translation  via  mRNA  structure  in  prokaryotes  and  eukaryotes:  Gene,   v.  361,  p.  13-­‐37.   Kropiwnicka,  A.,  K.  Kuchta,  M.  Lukaszewicz,  J.  Kowalska,  J.  Jemielity,  K.  Ginalski,  E.  Darzynkiewicz,  and   J.  Zuberek,  2015,  Five  eIF4E  isoforms  from  Arabidopsis  thaliana  are  characterized  by  distinct   features  of  cap  analogs  binding:  Biochemical  and  Biophysical  Research  Communications,  v.   456,  p.  47-­‐52.   Krupinska,  S.,  S.  Weidner,  E.  Fraczek,  and  R.  Amarowicz,  2003,  Polysome  formation  and  stability  in   pea  stem  and  root  tissue:  Acta  Physiologiae  Plantarum,  v.  25,  p.  135-­‐141.   38    

Layat,  E.,  J.  Leymarie,  H.  El-­‐Maarouf-­‐Bouteau,  J.  Caius,  N.  Langlade,  and  C.  Bailly,  2014,  Translatome   profiling  in  dormant  and  nondormant  sunflower  (Helianthus  annuus)  seeds  highlights  post-­‐ transcriptional  regulation  of  germination:  New  Phytologist,  v.  204,  p.  864-­‐872.   Lenartowska,  M.,  R.  Lenartowski,  D.  J.  Smolinski,  B.  Wrobel,  J.  Niedojadlo,  K.  Jaworski,  and  E.   Bednarska,  2009,  Calreticulin  expression  and  localization  in  plant  cells  during  pollen-­‐pistil   interactions:  Planta,  v.  231,  p.  67-­‐77.   Lenartowski,  R.,  A.  Suwinska,  J.  Prusinska,  K.  Gumowski,  and  M.  Lenartowska,  2014,  Molecular   cloning  and  transcriptional  activity  of  a  new  Petunia  calreticulin  gene  involved  in  pistil   transmitting  tract  maturation,  progamic  phase,  and  double  fertilization:  Planta,  v.  239,  p.   437-­‐454.   Li,  J.,  F.  Mahdi,  L.  Du,  S.  Datta,  D.  G.  Nagle,  and  Y.  D.  Zhou,  2011,  Mitochondrial  Respiration  Inhibitors   Suppress  Protein  Translation  and  Hypoxic  Signaling  via  the  Hyperphosphorylation  and   Inactivation  of  Translation  Initiation  Factor  eIF2  alpha  and  Elongation  Factor  eEF2:  Journal  of   Natural  Products,  v.  74,  p.  1894-­‐1901.   Lin,  K.  H.,  L.  F.  O.  Chen,  S.  D.  Li,  and  H.  F.  Lo,  2015,  Comparative  proteomic  analysis  of  cauliflower   under  high  temperature  and  flooding  stresses:  Scientia  Horticulturae,  v.  183,  p.  118-­‐129.   Lin,  S.  Y.,  P.  W.  Chen,  M.  H.  Chuang,  P.  Juntawong,  J.  Bailey-­‐Serres,  and  G.  Y.  Jauh,  2014,  Profiling  of   Translatomes  of  in  Vivo-­‐Grown  Pollen  Tubes  Reveals  Genes  with  Roles  in  Micropylar   Guidance  during  Pollination  in  Arabidopsis:  Plant  Cell,  v.  26,  p.  602-­‐618.   Lu,  J.  M.,  M.  Bergert,  A.  Walther,  and  B.  Suter,  2014,  Double-­‐sieving-­‐defective  aminoacyl-­‐tRNA   synthetase  causes  protein  mistranslation  and  affects  cellular  physiology  and  development:   Nature  Communications,  v.  5,  p.  13.   Luna,  R.  E.,  H.  Arthanari,  H.  Hiraishi,  J.  Nanda,  P.  Martin-­‐Marcos,  M.  A.  Markus,  B.  Akabayov,  A.  G.   Milbradt,  L.  E.  Luna,  H.  C.  Seo,  S.  G.  Hyberts,  A.  Fahmy,  M.  Reibarkh,  D.  Miles,  P.  R.  Hagner,  E.   M.  O'Day,  T.  F.  Yi,  A.  Marintchev,  A.  G.  Hinnebusch,  J.  R.  Lorsch,  K.  Asano,  and  G.  Wagner,   2012,  The  C-­‐Terminal  Domain  of  Eukaryotic  Initiation  Factor  5  Promotes  Start  Codon   Recognition  by  Its  Dynamic  Interplay  with  eIF1  and  eIF2  beta:  Cell  Reports,  v.  1,  p.  689-­‐702.   M.W.King,  2015,  Translation  of  Proteins,  http://themedicalbiochemistrypage.org.   Ma,  X.  F.,  M.  C.  Nicole,  L.  V.  Meteignier,  N.  Hong,  G.  P.  Wang,  and  P.  Moffett,  2015,  Different  roles  for   RNA  silencing  and  RNA  processing  components  in  virus  recovery  and  virus-­‐induced  gene   silencing  in  plants:  Journal  of  Experimental  Botany,  v.  66,  p.  919-­‐932.   Mallory,  A.,  and  H.  Vaucheret,  2010,  Form,  Function,  and  Regulation  of  ARGONAUTE  Proteins:  Plant   Cell,  v.  22,  p.  3879-­‐3889.   Mardanova,  E.  S.,  L.  A.  Zamchuk,  and  N.  V.  Ravin,  2007,  The  5  '-­‐untranslated  region  of  the  maize   alcohol  dehydrogenase  gene  provides  efficient  translation  of  mRNA  in  plants  under  stress   conditions:  Molecular  Biology,  v.  41,  p.  914-­‐919.   Martinez-­‐Silva,  A.  V.,  C.  Aguirre-­‐Martinez,  C.  E.  Flores-­‐Tinoco,  N.  D.  Alejandri-­‐Ramirez,  and  T.  D.   Dinkova,  2012,  Translation  Initiation  Factor  AteIF(iso)  4E  Is  Involved  in  Selective  mRNA   Translation  in  Arabidopsis  Thaliana  Seedlings:  Plos  One,  v.  7,  p.  12.   Matsuura,  H.,  A.  Shinmyo,  and  K.  Kato,  2008,  Preferential  translation  mediated  by  Hsp81-­‐3  5  '-­‐UTR   during  heat  shock  involves  ribosome  entry  at  the  5  '-­‐end  rather  than  an  internal  site  in   Arabidopsis  suspension  cells:  Journal  of  Bioscience  and  Bioengineering,  v.  105,  p.  39-­‐47.   McDowell,  J.  M.,  Y.  Q.  An,  S.  R.  Huang,  E.  C.  McKinney,  and  R.  B.  Meagher,  1996,  The  arabidopsis   ACT7  actin  gene  is  expressed  in  rapidly  developing  tissues  and  responds  to  several  external   stimuli:  Plant  Physiology,  v.  111,  p.  699-­‐711.   Montane,  M.  H.,  and  K.  Kloppstech,  2000,  The  family  of  light-­‐harvesting-­‐related  proteins  (LHCs,  ELIPs,   HLIPs):  was  the  harvesting  of  light  their  primary  function?:  Gene,  v.  258,  p.  1-­‐8.   Muench,  D.  G.,  C.  Zhang,  and  M.  Dahodwala,  2012,  Control  of  cytoplasmic  translation  in  plants:  Wiley   Interdisciplinary  Reviews-­‐Rna,  v.  3,  p.  178-­‐194.   Mulekar,  J.  J.,  and  E.  Huq,  2014,  Expanding  roles  of  protein  kinase  CK2  in  regulating  plant  growth  and   development:  Journal  of  Experimental  Botany,  v.  65,  p.  2883-­‐2893.   39    

Nicholson,  B.  L.,  and  K.  A.  White,  2011,  3  '  Cap-­‐independent  translation  enhancers  of  positive-­‐strand   RNA  plant  viruses:  Current  Opinion  in  Virology,  v.  1,  p.  373-­‐380.   Sasaki,  K.,  M.  H.  Kim,  and  R.  Imai,  2007,  Arabidopsis  COLD  SHOCK  DOMAIN  PROTEIN2  is  a  RNA   chaperone  that  is  regulated  by  cold  and  developmental  signals:  Biochemical  and  Biophysical   Research  Communications,  v.  364,  p.  633-­‐638.   Sasikumar,  A.  N.,  W.  B.  Perez,  and  T.  G.  Kinzy,  2012,  The  many  roles  of  the  eukaryotic  elongation   factor  1  complex:  Wiley  Interdisciplinary  Reviews-­‐Rna,  v.  3,  p.  543-­‐555.   Satoh,  J.,  K.  Kato,  and  A.  Shinmyo,  2004,  The  5  '-­‐untranslated  region  of  the  tobacco  Alcohol   dehydrogenase  gene  functions  as  an  effective  translational  enhancer  in  plant:  Journal  of   Bioscience  and  Bioengineering,  v.  98,  p.  1-­‐8.   Shingaki-­‐Wells,  R.,  A.  H.  Millar,  J.  Whelan,  and  R.  Narsai,  2014,  What  happens  to  plant  mitochondria   under  low  oxygen?  An  omics  review  of  the  responses  to  low  oxygen  and  reoxygenation:  Plant   Cell  and  Environment,  v.  37,  p.  2260-­‐2277.   Simon,  A.  E.,  and  W.  A.  Miller,  2013,  3  '  Cap-­‐Independent  Translation  Enhancers  of  Plant  Viruses,  in  S.   Gottesman,  ed.,  Annual  Review  of  Microbiology,  Vol  67:  Annual  Review  of  Microbiology,  v.   67:  Palo  Alto,  Annual  Reviews,  p.  21-­‐42.   Stuger,  R.,  S.  Ranostaj,  T.  Materna,  and  C.  Forreiter,  1999,  Messenger  RNA-­‐binding  properties  of   nonpolysomal  ribonucleoproteins  from  heat-­‐stressed  tomato  cells:  Plant  Physiology,  v.  120,   p.  23-­‐31.   Suwinska,  A.,  R.  Lenartowski,  D.  J.  Smolinski,  and  M.  Lenartowska,  2015,  Molecular  evidence  that   rough  endoplasmic  reticulum  is  the  site  of  calreticulin  translation  in  Petunia  pollen  tubes   growing  in  vitro:  Plant  Cell  Reports,  v.  34,  p.  1189-­‐1199.   Swigonska,  S.,  A.  Badowiec,  A.  Mostek,  A.  Krol,  and  S.  Weidner,  2014,  Formation  and  stability  of   polysomes  and  polysomal  populations  in  roots  of  germinating  seeds  of  soybean  (Glycine  max   L.)  under  cold,  osmotic  and  combined  cold  and  osmotic  stress  conditions:  Acta  Physiologiae   Plantarum,  v.  36,  p.  651-­‐662.   Szick-­‐Miranda,  K.,  S.  Jayachandran,  A.  Tam,  J.  Werner-­‐Fraczek,  A.  J.  Williams,  and  J.  Bailey-­‐Serres,   2003,  Evaluation  of  translational  control  mechanisms  in  response  to  oxygen  deprivation  in   maize:  Russian  Journal  of  Plant  Physiology,  v.  50,  p.  774-­‐786.   Szypulska,  E.,  and  S.  Weidner,  2011,  Importance  of  cytomatrix-­‐bound  polysomes  to  synthesis  of   lysine-­‐containing  proteins  in  triticale  germs  under  ABA  treatment:  Acta  Physiologiae   Plantarum,  v.  33,  p.  1461-­‐1465.   Ueda,  K.,  H.  Matsuura,  M.  Yamaguchi,  T.  Demura,  and  K.  Kato,  2012,  Genome-­‐Wide  Analyses  of   Changes  in  Translation  State  Caused  by  Elevated  Temperature  in  Oryza  sativa:  Plant  and  Cell   Physiology,  v.  53,  p.  1481-­‐1491.   Vartapetian,  B.  B.,  2006,  Plant  anaerobic  stress  as  a  novel  trend  in  ecological  physiology,   biochemistry,  and  molecular  biology:  2.  Further  development  of  the  problem:  Russian   Journal  of  Plant  Physiology,  v.  53,  p.  711-­‐738.   von  Arnim,  A.  G.,  Q.  D.  Jia,  and  J.  N.  Vaughn,  2014,  Regulation  of  plant  translation  by  upstream  open   reading  frames:  Plant  Science,  v.  214,  p.  1-­‐12.   Walsh,  D.,  and  I.  Mohr,  2011,  Viral  subversion  of  the  host  protein  synthesis  machinery:  Nature   Reviews  Microbiology,  v.  9,  p.  860-­‐875.   Weber,  C.,  L.  Nover,  and  M.  Fauth,  2008,  Plant  stress  granules  and  mRNA  processing  bodies  are   distinct  from  heat  stress  granules:  Plant  Journal,  v.  56,  p.  517-­‐530.   Wells,  D.  R.,  R.  L.  Tanguay,  H.  Le,  and  D.  R.  Gallie,  1998,  HSP101  functions  as  a  specific  translational   regulatory  protein  whose  activity  is  regulated  by  nutrient  status:  Genes  &  Development,  v.   12,  p.  3236-­‐3251.   Yanguez,  E.,  A.  B.  Castro-­‐Sanz,  N.  Fernandez-­‐Bautista,  J.  C.  Oliveros,  and  M.  M.  Castellano,  2013,   Analysis  of  Genome-­‐Wide  Changes  in  the  Translatome  of  Arabidopsis  Seedlings  Subjected  to   Heat  Stress:  Plos  One,  v.  8,  p.  16.   Zhu,  H.,  and  H.  S.  Guo,  2012,  The  role  of  virus-­‐derived  small  interfering  RNAs  in  RNA  silencing  in   plants:  Science  China-­‐Life  Sciences,  v.  55,  p.  119-­‐125. 40