Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta. Studijní program: BIOLOGIE

Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní program: BIOLOGIE Studijní obor: EKOLOGIE

Bc. Markéta Koprnická

Fylogeografie a invazní cesty druhu Proasellus coxalis s.l. (Crustacea: Isopoda) Phylogeography and dispersal routes of the Proasellus coxalis s.l. (Crustacea: Isopoda)

Diplomová práce

Školitelka: RNDr. Veronika Sacherová, Ph.D.

Praha, 2013

Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu.

V Praze, 14. 8. 2013

________________________

Bc. Markéta Koprnická

ABSTRAKT

Schopnost disperze sladkovodních bezobratlých je ovlivněna mnoha faktory. V současné době v ní hraje podstatnou roli také člověk. Mimo jiné stavbou plavebních kanálů zničil přirozené hranice mezi povodími a umožnil tak šíření druhů na nová území. Tato práce na základě genetických dat určuje možné invazní cesty nepůvodního druhu P. coxalis s.l. do České republiky a snaží se zhodnotit jeho fylogeografii v rámci České republiky. Byl osekvenován gen COI a 28S. Do analýz bylo zahrnuto 96 jedinců z 27 populací z České republiky. Z volně přístupné databáze GenBank bylo staženo 40 sekvencí genu pro COI a 7 sekvencí genu 28S. Na území České republiky se nacházejí dvě odlišné genealogické linie P. coxalis s.l. (6% rozdíl mezi sekvencemi genu pro COI). Jedna pochází z recentní invaze z mediteránní oblasti (přes západní invazní koridor a další plavební kanály). Druhá linie je na našem území nejspíše původní a mohla by spadat do poddruhu P. coxalis septentrionalis. Výsledky jsou diskutovány. Klíčová slova: Proasellus coxalis s.l., COI, invazní cesty, fylogeografie

ABSTRACT

Dispersal of freshwater invertebrates is affected by many factors. Recently, human activities played a very important role in their dispersal. Among others, constructions of new shipping canals damages natural boundaries and the species can spread into new areas. This Master thesis deal with non-indigenous species P. coxalis s.l. On the genetic bases assess a possible dispersal routes into the Central Europe (and the Czech Republic), and phylogeography of this species in the Czech Republic. I amplified and sequenced DNA of the mitochondrial cytochrome oxidase subunit I (COI) gene and 28S nuclear rDNA gene. 96 individuals from 27 localities in the Czech Republic were analyzed. I also included 40 sequences of the COI gene and 7 of the 28S gene from the GenBank database. In the Czech Republic, there are two different genealogic lineages of P. coxalis (with 6% genetic distance between sequences of the COI gene). The first lineage comes from recent invasion of this species from Mediterranean area (through Western invasion corridor and other shipping canals). The second lineage is probably indigenous in the area and it can probably be assigned to the subspecies P. coxalis septentrionalis. The results are discussed. Keywords: Proasellus coxalis s.l., COI, dispersal routes, phylogeography

PODĚKOVÁNÍ Na tomto místě bych chtěla poděkovat všem, kteří mi byli nápomocni při sepsání práce. Především patří tyto řádky mé milé školitelce RNDr. Veronice Sacherové, Ph.D. za její trpělivost a velmi přátelský přístup, celé vedení a financování práce. Dále pak děkuji RNDr. Jakubu Horeckému, Ph.D. za prvotní představení problematiky. Jemu a také Mgr. Janu Špačkovi, Ph.D. za poskytnutí mnoha užitečných informací, poznatků a literárních zdrojů. Velmi děkuji za sbírání některých vzorků Mgr. Janu Špačkovi, Ph.D. a Mgr. Natálii Lapšanské, za pomoc a rady při práci v laboratoři pak především RNDr. Jasně Vukić, Mgr. Evě Balcarové, Ph.D. a Mgr. Martinu Krajíčkovi. Mgr. Antonínu Střížkovi děkuji za sdílení studijních poznatků a nepostradatelné praktické rady při zpracování výsledků. V neposlední řadě patří veliké díky mé rodině, za toleranci a podporu po celou dobu mého studia.

Vám všem, děkuji!

OBSAH 1.

ÚVOD.....................................................................................................................................7 1.1

Disperze sladkovodních bezobratlých .............................................................................7

1.1.1

Aktivní disperze. .....................................................................................................8

1.1.2

Pasivní disperze ......................................................................................................8

1.1.3

Disperze zprostředkovaná člověkem (human-mediated dispersal) ........................11

1.2

Poznámky k taxonomii a biologii druhu Proasellus coxalis.............................................18

1.2.1

Taxonomie P. coxalis.............................................................................................18

1.2.2

Biologie a ekologie P. coxalis, jeho srovnání s A. aquaticus....................................19

1.2.3

Morfologie P. coxalis.............................................................................................20

1.3

Datované výskyty P. coxalis v Evropě a v České republice..............................................22

2.

CÍLE PRÁCE...........................................................................................................................24

3.

METODIKA ...........................................................................................................................25

4.

3.1

Sběr dat........................................................................................................................25

3.2

Izolace DNA, purifikace a sekvenace .............................................................................26

3.3

Fylogenetické zpracování sekvencí................................................................................27

3.4

Doplňující data .............................................................................................................28

3.5

Migrační tůňka .............................................................................................................28

VÝSLEDKY.............................................................................................................................30 4.1 Haplotypové sítě...............................................................................................................30 4.2 Fylogenetický strom.........................................................................................................36 4.3

Odhad středních genetických vzdáleností sekvencí genu COI ..........................................37

4.4 Vnitropopulační variabilita...............................................................................................39 4.5

Migrační tůňka................................................................................................................40

5.

Diskuze ................................................................................................................................42

6.

ZÁVĚR ..................................................................................................................................52

SEZNAM LITERATURY...................................................................................................................53 SEZNAM PŘÍLOH ..........................................................................................................................62

Disperze sladkovodních bezobratlých

1. ÚVOD 1.1


Disperze obecně označuje proces, kterým se organismy (nebo jejich dormantní stádia) rozšiřují. Má význam nejen v měřítku prostorovém, ale též časovém (Townsend at al. 2008). Jelikož se jedná o velmi široký pojem, často se jeho definice liší podle oblasti výzkumu. V případě sladkovodních bezobratlých tak může být zúžen například pouze na záznamy o suchozemském přenosu (Bilton et al. 2001). Nebo naopak zahrnuje disperze také pohyb přímo ve vodě, jako je drift organismů či jejich propagulí po proudu, pohyb laterální a proti proudu (Malmqvist 2002). Kontinentální sladkovodní ekosystémy představují habitaty charakteristické svou nespojitostí, obklopené z pohledu vodních organismů nehostinnou pevninou, jež je pro ně neobyvatelná. Ovšem i přes zdánlivou izolaci vodních habitatů vykazuje mnoho sladkovodních druhů široké geografické rozšíření (Bilton et al. 2001, Figuerola & Green 2002a). Některé organismy dosáhnou této široké distribuce aktivním letem (dospělců) přes otevřenou krajinu (Kovats et al. 1996). Mnoho vodních organismů ovšem postrádá mobilitu nutnou k přemísťování z jednoho povodí do druhého, ke kolonizování nových území či k disperzi do sousedních vodních ploch třeba i v rámci jednoho povodí (Figuerola & Green 2002a). K šíření pak využívají takových vektorů přenosu, jako jsou zvířata, vítr nebo vodní proud, které jim zajišťující pasivní transport mezi těmito nespojitými habitaty (Bilton et al. 2001). Schopnost disperze souvisí s průběhem rozmnožovacího cyklu, způsobem života organismu a jeho životní strategií. Nemusí být vnímána jen jako mechanismus pro kolonizaci vhodného prostředí (Malmqvist 2002; Palmer et al. 1996), ale může také silně ovlivnit a být ovlivněna množstvím vnitrodruhové i mezidruhové kompetice (Bowler & Benton 2005; Palmer et al. 1996). V konečném důsledku může působit i na to, jak si organismy poradí se změnami prostředí, tedy především: klimatickými změnami, fragmentací či ztrátou habitatu nebo invazí nepůvodních druhů (Bowler & Benton 2005). V následujících řádcích budou popsány možné mechanismy disperze vodních bezobratlých organismů, s rozvinutím možností relevantních pro studovaný organismus Proasellus coxalis. Jak již bylo naznačeno v předchozím textu, mechanismy disperze se tedy všeobecně dělí na dva základní způsoby. Při aktivní disperzi je živočich schopen šířit se vlastním pohybem. V případě pasivní spoléhá na jiné vektory přenosu. V neposlední řadě pak nesmíme opominout ani lidskou aktivitou, jež velmi ovlivňuje disperzi mnoha organismů (Gherardi et al. 2009; Leppäkoski et al. 2002).

7


1.1.1

Aktivní disperze.

Aktivní disperze je velmi důležitá především v tekoucích vodách. Proud vody postupně unáší dolů po směru toku všechny částice, včetně organismů ve vodě se vyskytujících. Jelikož by tento jev vedl k postupné extinkci druhů v úsecích horních toků, musejí se tedy organismy nějaký způsobem pohybovat i proti proudu. A tak v případě druhů vodního hmyzu, jež mají okřídlená letuschopná imága, platí hypotéza tzv. kolonizačního cyklu (Müller 1982). Ta říká, že ztráty vzniklé driftem v horních tocích jsou nahrazeny díky okřídleným imágům, která létají proti proudu, kde posléze kladou vajíčka (Bilton et al. 2001; Müller 1982; Williams & Williams 1993). Avšak v tocích žijí i další bentičtí bezobratlí, kteří nedisponují letuschopnými imágy. Ti se musejí s unášejícím proudem vyrovnat jiným způsobem. Mnoho druhů je proto pozitivně rheotaktických, tzn., pohybují se proti proudu, aby snížily svůj drift. Ovšem i proudobytný vodní hmyz s okřídlenými imágy vykazuje v nymfálních instarech pozitivní rheotaxi. (Elliot 1971; Williams & Williams 1993). Pohyb proti proudu je kromě vodního hmyzu velmi známý například u blešivců (Elliott 1971; Hughes 1970; Minckley 1964; Rawer-Jost et al. 1999; Williams & Williams 1993). Blešivci putují proti proudu sezónně, přes zimu (v době reprodukce) nemigrují (Rawer-Jost 1999; Williams & Williams 1993). Ačkoli obývají i biotopy se silným prouděním, pro migraci preferují oblasti s pomalejším proudem (Hughes 1970; Rawer-Jost et al. 1999). Elliott (1971) ve své studii pozoroval blešivce, kteří migrovali za tmy na povrchu substrátu, a měřil vzdálenost, kterou překonají za 24 hodin. Proti proudu jsou schopni urazit až 14 m, po proudu pak do 10 m. Je tedy zřejmé, že migrace proti proudu může mít větší význam, než jen pouhou kompenzaci driftu (Elliott 1971). To velmi zdatně dokazuje Dikerogammarus villosus, který je schopen invadovat proti proudu rychlostí 30-40 km za rok (Josens et al. 2005). Naproti tomu v další studii se jen jeden z 6 amerických blešivců (Gammarus bousfieldi) pohyboval proti proudu masově, ostatní druhy zdolávaly jen krátké vzdálenosti tak, aby kompenzovaly svou ztrátu způsobenou driftem (Minckley 1964). Dalším korýšem, u kterého se vyskytuje (ač jen strohý) záznam o pozitivní rheotaxi je Asellus aquaticus. Ten, ve studii zabývající se makrobentosem překonávajícím rybí přechody, byl schopen pohybu proti proudu, avšak výlučně vyhledával místa s pomalým proudem (Rawer-Jost 1999).

1.1.2

Pasivní disperze

Jak již bylo napsáno výše, v tekoucích vodách mohou být organismy pasivně přemísťovány proudem. Ačkoli si některé druhy proti driftu vytvořily adaptace, je přesto určité procento organismů proudem pasivně odnášeno. Tito jedinci pak mohou propojovat prostorově oddělené populace (Bilton 2001) a zachovávat mezi nimi genový tok. Proudem se však organismy šíří jen v rámci daného toku. Na nové vodní plochy pak mohou být pasivně přeneseny pomocí různých živočichů (například ptáky, savci i hmyzem) nebo větru (Figuerola & Green 2002b; Maguire 1963; Peck 1975). 8


Důležitou roli při pasivní disperzi hraje schopnost vytvářet rezistentní dormantní stádia, která jsou velmi častá právě u sladkovodních bezobratlých, jejichž habitaty (na rozdíl od mořských) představují často nestálá prostředí. Tato strategie vznikla v průběhu evoluce nezávisle na sobě napříč různými taxony. Je nezbytná pro organismy, jež obývají přechodné habitaty, jako jsou například periodické tůně (Cáceres 1997). Větrem se tak mohou na krátké vzdálenosti šířit třeba vajíčka žábronožky Branchipodopsis wolfi (Brendonck & Riddoch 1999), či obecně vzato jakákoli jiná malá rezistentní dormantní stádia (Bilton et al. 2001). Větrné proudy však mohou unášet také celé jedince létavého hmyzu, a ti jsou pak šířeny i na velké vzdálenosti (Kelly et al. 2001). Živočichové, jakožto vektor přenosu, mají v pasivní disperzi významné postavení. Již Darwin (Darwin & Beer 2008) ve svém významném díle uvádí možnost přenosu semen, bezobratlých či jejich vajíček migrujícími ptáky. Předkládá pozorování, kdy sladkovodní měkkýši aktivně přilnuli na nohy vodního ptáka (konkrétně kachny), který jim pak může pomoci šířit se i na velmi velké vzdálenosti. Že za rozšířením některých druhů stojí migrující vodní ptactvo, dokládají i současné studie. Nejlépe dokumentovaným případem je šíření sladkovodních perlooček pomocí přenosu jejich trvalých vajíček (efipií) vodním ptactvem. Významnou roli v postglaciální disperzi tak potenciálně představují ptáci pro přenos mezi jednotlivými habitaty u Daphnia pulex na Sibiři (Weider & Hobaek 1997). Známá je dále i souvislost mezi genetickou distribucí severoamerických populací Daphnia laevis s hlavními tahy tamních vodních ptáků, kdy populace Daphnia laevis jsou si geneticky podobnější na severu a jihu, než západě a východě (Taylor et al. 1998). Organismy, jež jsou šířeny pomocí živočichů, mají v zásadě dvě možnosti, jakými mohou být transportovány. A to buď uvnitř (enzoochorie) či na povrchu (epizoochorie) zvířete. Zde budou používány výrazy interní a externí transport, jež ve své studii používají Figuerola & Green (2002a). Při interním transportu musejí být zachovány dvě důležité podmínky: nejdříve musí živočich organismus či jeho rezistentní stadium pozřít, a posléze musí tento organismus či částice projít trávicím traktem bez poškození. Pro externí transport je předurčující, jak dobře přenášená částice či organismus k vektoru svého přenosu přilne a v případě, že nejsou přenášena rezistentní dormantní stádia snášející úplné vyschnutí, jak dlouhou dobu je daný organismus schopen přečkat mimo vodní prostředí (Figuerola & Green 2002a). V následujících případech budou popsány možnosti disperze jednotlivými skupinami živočichů se snahou podrobněji přiblížit varianty relevantní pro druh Proasellus coxalis, na kterého je tato práce zaměřena.

Hmyz Různé druhy vážek, motýli, cikády či včely mohou na svém těle přenášet kromě řas také nálevníky nebo vířníky (Maguire 1963). Dále například draví brouci čeledi Dytiscidae, mohou interním transportem rozšiřovat vajíčka žábronožky Branchipus schaefferi (Beladjal & Mertens 2009).

9


Vodní ptáci Bylo dokázáno, že vodní ptáci společně se svou potravou konzumují i mnoho částic, které jen projdou jejich střevem. Kromě semen rostlin mají v potravě zastoupeny např. vajíčka různých druhů perlooček, lupenonožců, škeblovek či mechovek (Brochet et al. 2010; Figuerola et al. 2003). Většina částic zůstane po průchodu střevem životaschopná. Vzhledem k frekventovaným denním migracím vodních ptáků je tak potenciál k disperzi těchto druhů, především na lokální úrovni, velmi vysoký (Figuerola et al. 2003). Interní transport se ovšem nemusí týkat pouze druhů, které produkují rezistentní dormantní stádia. Jak prokázali Green & Sánchez (2006), způsob takovéto disperze je možný i u larev vodního hmyzu. Jedná se o druh pakomára Chironomus salinarius, jehož larvální stádium dokáže bez poškození přežít ve střevě břehouše černoocasého (Limosa limosa). Druh Chironomus salinarius získává díky této vlastnosti další významný potenciál disperze (Green & Sánchez 2006). Externí transport pomocí ptáků je velmi rozšířený například u měkkýšů. Nejranější zmínku o něm publikoval Darwin (Darwin & Beer 2008), jak již bylo zmíněno výše. Měkkýši snadno přilnou na nohu vodního ptáka, kde se dokážou udržet velmi dlouho. Některé duhy, jako např. Tryonia navíc díky přítomnosti operkula snadno předejdou vysoušení. Právě u rodu Tryonia a také Planorbarius byla dokázána jasná spojitost jejich distribuční historie s vodními tažnými ptáky. Jsou ovšem schopny disperze nejen externím, ale v některých případech i interním transportem (Wesselingh et al. 1999). Schopnost přilnout na kachní peří byla dále zaznamenána u perloočky Cercopagis pengoi (Makarewicz et al. 2001). Taktéž Segerstråle (1954) ve svém pokusu pozoroval u blešivce Gammarus lacustris aktivní „nalézání“ na kachnu. Byl schopen se udržet na peří mimo vodu až dvě hodiny, což byla nejdelší doba v experimentu. Není tedy vyloučeno, že by přečkal i delší časový interval. Navíc na kachnu „nalézal“ velmi ochotně a rychle. Je ovšem zajímavé, že Gammarus pulex tuto schopnost (aktivně přilnout na peří) nemá. Zdá se tedy, že zatímco Gammarus lacustris může být šířen vodními ptáky, Gammarus pulex nikoli. Toto chování bylo jedním z faktorů podmiňujících historické rozšíření obou druhů v Dánsku a Fennoskandinávii během glaciálů. Díky pasivní disperzi se dnes Gammarus lacustris vyskytuje i na velmi izolovaných vodních plochách a mimo jiné téměř ve všech pohořích Norska (Segerstråle 1954).

Savci O několik let později, po pokusu, jež uskutečnil Segerstråle (1954), byl Gammarus lacustris, společně s dalším blešivcem druhu Hyalella azteca, nalezen v Kanadě i v srsti vodních savců - ondatry a bobra (Peck 1975). Další semiaquatický živočich - nutrie říční (Myocastor coypus) - představuje také významný potenciál disperze vodních bezobratlých. Její srst umožňuje přenášet kromě rezistentních stádií také živé organismy, mezi které patří různé druhy perlooček, vířníků, larev dvoukřídlých, chvostoskoků či kroužkovců čeledi Naididae (Waterkeyn et al. 2010). Vektorem přenosu ovšem nemusejí být pouze vodní obratlovci. Mnohdy stačí k přilnutí jen krátký kontakt živočicha s vodní plochou. Například cysty tří velkých korýšů třídy Branchiopoda (Triops 10


numidicus, Branchipus a Tanymastigites) se zachytily na nohách ovcí, které se pohybovaly v mělké části tůně (Thiéry 1997). Taktéž prase divoké (Sus scrofa) přenáší ve své srsti mnoho dormantních stádií různých druhů vodních bezobratlých. Vzhledem ke způsobu svého života často vyhledává mokřiny, ve kterých se „válí“ a může tedy představovat velmi významný vektor disperze na lokální úrovni (Vanschoenwinkel et al. 2008), i když někteří jedinci jsou schopni urazit i více jak 250 km (Andrzejewski & Jezierski 1978) a potenciálně tak mohou přenášet organismy i na delší vzdálenosti (Vanschoenwinkel et al. 2008).

Disperze organismů na velké a krátké vzdálenosti (long/short-distance dispersal) Podle vzdálenosti, na kterou je daný organismus/jeho dormantní stádium schopen se rozšířit/být šířen, můžeme dále rozdělit disperzi také na krátké a dlouhé vzdálenosti. Green & Figuerola (2005) považují za disperzi na dlouhé vzdálenosti situaci, při které se sladkovodní organismy šíří mezi vodními plochami vzdálenými od sebe nejméně 10 km. Vzhledem k zachování životaschopnosti organismů (pokud se nejedná o velmi rezistentní stádium), je jejich transport časově omezen (Figuerola & Green 2002a). Pravděpodobnost přenosu na velké vzdálenosti je proto většinou nízká (nižší než u krátkých vzdáleností) a rozhodující pro úspěšnost takové disperze je především celkový počet přenesených propagulí/organismů (Trakhtenbrot et al. 2005). Jak vyplývá z přehledu mechanismů disperze sladkovodních bezobratlých, v přenosu na velké vzdálenosti hraje klíčovou roli migrující vodní ptactvo (např. Brochet et al. 2010; Green & Figuerola 2005; Taylor et al. 1998; Wesselingh et al. 1999), které je schopné za krátký časový interval urazit poměrně velkou vzdálenost (Clausen et al. 2002). Avšak dalekého transportu jsou, i když v menší míře, schopni také savci, jako nutrie říční (Waterkeyn et al. 2010) či prase divoké (Andrzejewski & Jezierski 1978). Také lidská aktivita velmi ovlivňuje disperzi mnoha organismů (Leppäkoski et al. 2002; Panov et al. 2004), této problematice bude věnována následující kapitola. Na lokální úrovni se uplatňují všechny výše zmíněné mechanismy disperze. Vanschoenwinkel et al. (2008) navíc považuje za velmi pravděpodobné, že savci mají daleko větší význam při pasivním přenosu sladkovodních organismů na krátké vzdálenosti, než bylo zatím publikováno, jelikož takovýchto studií je stále velmi málo.

1.1.3

Disperze zprostředkovaná člověkem (human-mediated dispersal)

Člověkem zprostředkované disperze (lze použít výraz introdukce) mohou být rozlišeny do dvou hlavních kategorií. A sice jako introdukce záměrné a neúmyslné (Panov et al. 2004).

Záměrné introdukce Lidské přetváření sladkovodních systémů introdukováním nepůvodních druhů má v Evropě dlouhou historii. Nejranější příkladem jsou již ve středověku prováděné introdukce kapra 11


obecného (Cyprinus carpio) na území Evropy (Copp et al. 2005). V druhé polovině 19. století se ve zvýšené míře začaly v Evropě vysazovat i další druhy ryb, zejména z důvodů zásobování, větší pestrosti potravní nabídky a pro sportovní účely (Gherardi et al. 2009). Zvýšení komerční rybí produkce bylo spjato i potřebou zajištění potravy pro tyto chovy a tedy s dovozem velkého množství korýšů, především různonožců jako Gammarus pulex, G. tigrinus, Pontogammarus robustoides (Jaždžewski 1980). Komerční využití se netýká jen ryb. Například rak bahenní (Astacus leptodactylus), do České republiky introdukován roku 1892, se stal předmětem chovu po zdecimování populací našich původních druhů raků račím morem (viz níže). Ovšem jen do doby, než začal být chráněn zákonem, stejně jako rak říční a kamenáč (Horká 2006). Některé druhy jsou šířeny i pro svůj ozdobný význam prostřednictvím akvarijního a zahradnického obchodu, přičemž z těchto chovů mohou uniknout do volné přírody (Bilton et al. 2001; Gherardi et al. 2009). Například jeleček velkohlavý (Pimephales promelas), chovaný často jako okrasná ryba v zahradních nádržích, se nyní vyskytuje a rozmnožuje na území Velké Británie, kde je nepůvodní (Copp et al. 2007). Během 20. století celkový počet nepůvodních druhů v Evropě výrazně stoupl. A to hlavně po roce 1940, kdy byla disperze (všeobecně, tedy nejen záměrné introdukce) nepůvodních druhů podporována větší mobilitou a obchodem v průběhu 2. světové války (Gherardi et al. 2009).

Neúmyslné introdukce (disperze) V některých případech mohou být ovšem společně s organismem, který je introdukován, neúmyslně šířeny i jiné druhy (Panov et al. 2004) a též parazité či původci nemocí vysazovaných organismů (Gherardi et al. 2009). Jako tomu bylo při introdukci okouna nilského z Viktoriina jezera do jednoho z jezer ve Spojených Státech Amerických, s nímž se do nové lokality rozšířila i perloočka Daphnia lumholtzi (Havel & Hebert 1993). Nebo například introdukce amerických raků - raka pruhovaného (Orconectes limosus) a raka signálního (Pacifastacus leniusculus) - do České republiky (a dalších států) měla za následek zavlečení oomycety Aphnomyces astaci, která je původcem račího moru, nemoci smrtelné pro neamerické druhy raků (Filipová et al. 2006a; Filipová et al. 2006b). Neúmyslné disperze organismů způsobené lidskou aktivitou jsou ale především spjaty se stavbou plavebních kanálů, transportem v balastní vodě (zejména na dlouhé vzdálenosti) a s lodní dopravou všeobecně.

Plavební kanály Jako výsledek průmyslových a ekonomických aktivit člověka vzniklo v Evropě, zejména v posledních dvou stoletích, četné množství plavebních kanálů (Bij de Vaate et al. 2002). Tyto stavby odstranily přirozené hranice mezi povodími jednotlivých řek, jež se v Evropě ustálily na konci pleistocénu (Herhaus 1977; Nehring 2002). Propojená povodí pak umožnila expanzi mnoha 12


(do té doby biogeograficky odděleným) druhům, ať už díky jejich přirozené disperzi - aktivní pohyb proti proudu, unášení driftem (Jaždžewski 1980; Nehring 2002; Van der Velde et al. 2002), přenos pomocí jiných živočichů, např. ptáků (Nehring 2002) či transportu na lodích (Jaždžewski 1980; Nehring 2002; Reinhold & Tittizer 1997; Van der Velde et al. 2002). Z řek a kanálů vznikla síť více jak 28.000 km dlouhá, spojující 37 evropských zemí (Galil et al. 2007). Tato vodní síť nyní propojuje dříve přirozeně geograficky oddělená povodí moří jižní Evropy (Kaspické, Azovské, Černé, Středozemní) a severních evropských moří (Baltské, Severní a Bílé). Existují v ní čtyři hlavní invazní koridory: severní, centrální, jižní a západní (Panov et al. 2009). Severní koridor spojuje Černé a Azovské moře s Kaspickým mořem díky Azovsko-Kaspické vodní cestě. Kanál mezi řekami Volha-Don propojuje tato jižní moře přes Volho-Baltský kanál s mořem Baltským a Bílým, zahrnující kanál Bílé-Baltské moře (Galil et al. 2007; Panov et al. 2009). Centrální koridor zajišťuje spojení Černého moře s Baltským přes Dněpr a kanál BugPripyať. Centrální koridor je pak spojen s Labem a Severním mořem díky kanálům Visla-Odra a Havel-Odra. Propojení Labe s Rýnem je zajištěno přes Středozemní kanál (Mittelland Canal) a kanály Dortmund-Ems a Rýn-Herne (Jaždžewski 1980; Galil et al. 2007). Jižní koridor vznikl díky propojení Rýnu a Dunaje kanálem Mohan-Dunaj. Z řeky Mohan kvůli postavenému kanálu každoročně odteče velké množství vody. Deficit musí být kompenzován přesunem více jak 100 mil. m3 vody z Dunaje ročně kanálem zpátky do Mohanu. Mnoha organismům z dunajského ekosystému a Pontokaspiské oblasti je tak díky tomuto jevu usnadněno šíření přímo do vod západní Evropy (Bij de Vaate et al. 2002; Nehring 2002). Západní koridor spojuje kanálem Rhôna-Rýn Středozemní moře se Severním a řeky Rhônu a Rýn (Panov et al. 2009). Řada starších splavných kanálů, které sice dnes nemají pro komerční dopravu velký význam, spojují povodí řek a umožňují šíření druhům z mediteránní oblasti až do povodí Severního moře či Atlantského oceánu. Jsou to kanály Canal du Centre, Canal de Briar a kanál Rýn-Marna (Galil et al. 2007). Všechny hlavní kanály včetně dat zprovoznění jsou přehledně znázorněny na obrázku (obr. 1).

13


Obr. 1. Nejdůležitější evropské vodní cesty a invazní koridory vodních organismů. U každého plavebního kanálu je uvedeno datum zprovoznění. Jednotlivá čísla označují následující kanály: 1. kanál Volha-Don, 2 Volho-Baltský kanál 3. Kanál Bílé moře-Baltské moře 4. Kanál Bug-Prypjať 5. Kanál Visla-Odra 6. Kanál Havel-Odra 7. Středozemní kanál 8. Kanál Dortmund-Ems 9. Kanál Rýn-Herne 10. Kanál Mohan-Dunaj 11. Kanál Rhôna-Rýn 12. Canal du Centre 13. Canal de Briar 14. Kanál Rýn-Marna 15. Kanál Kiel Podle Galil et al. (2007), upraveno.

14


Není známo přesné množství, ale odhaduje se, že až 65 druhů se může šířit napříč evropskými vodními cestami (Galil et al. 2007). Je zajímavé, že ačkoli jsou nepůvodní druhy zastoupeny téměř všemi taxonomickými skupinami, je nejvíce invazních druhů reprezentováno hlavně korýši a měkkýši (Devin et al. 2005; Leuven et al. 2009). Značná část invazních druhů má pontokaspický původ a v minulosti se rozšířily severním a centrálním koridorem (Bij de Vaate et al. 2002; Galil et al. 2007). Ovšem otevřením plavebního kanálu Mohan-Dunaj v roce 1992, díky němuž se vytvořil jižní invazní koridor, se pontokaspickým druhům naskytla nová cesta do západní Evropy, která je v současnosti velmi významným donorem těchto organismů (Galil et al. 2007; Tittizer 1997; Van der Velde et al. 2002).

Následující příklady uvádí druhy, které se šíří jednotlivými koridory: Severní koridor Velmi invazní druh, který se jako první z pontokaspických druhů rozšířil do Evropy, je slávička mnohotvárná (Dreissena polymorpha). Do vod západní Evropy invadovala právě severním koridorem (Bij de Vaate et al. 2002; Nehring 2002). Centrální koridor I tuto cestu využívá ke své expanzi Dreissena polymorpha (Bij de Vaate et al. 2002; Olenin & Leppäkoski 1999). Z dalších organismů Pontokaspické oblasti vyskytujících se nyní i v západní Evropě to jsou například vidlonožec Limnomysis benedeni či blešivec Pontogammarus robustoides (Olenin & Leppäkoski 1999). Jižní koridor Jak bylo popsáno výše, jižní koridor představuje v současnosti nejvýznamnější cestu šíření pro pontokaspické druhy (Galil et al. 2007; Tittizer 1997; Van der Velde et al. 2002). Invadují jím například různonožci Dikerogammarus villosus (Bernauer & Jansen 2006; Devin et al. 2001) a Chelicorophium curvispinum či stejnonožec Jaera istri (Bernauer & Jansen 2006). Západní koridor Druhy z mediteránní oblasti se šíří západním koridorem. Jsou jimi krevetka Atyaephyra desmaresti, různonožec Echinogammarus berilloni (Bernauer & Jansen 2006), stejnonožci Proasellus meridianus (Tittizer et al. 2000; Wolff 1973) a Proasellus coxalis (Tittizer et al. 2000), druh studovaný v této práci.

Balastní voda. Balastní voda se používá ke stabilizaci nákladních lodí v případě, že nejsou plně naložené (Gollasch et al. 2002). Obvykle je umístěna ve speciálních balastních tancích nebo přímo v prázdném nákladním prostoru lodi (Galil et al. 2007). S touto vodou může být nabráno také 15


nesčetné množství živých planktonních i bentických organismů a diapausních vajíček bezobratlých živočichů (Duggan et al. 2005; Gray et al. 2007). Vzhledem k podstatě plavebního průmyslu je zřejmé, že lodě musejí nabrat vodu v jednom místě a vypustit ji poté na jiné, geograficky oddělené lokalitě. Balastní voda tak nabízí velký potenciál k transportu nepůvodních druhů na nová území (Gollasch et al. 2002), která mohou být i mnoho tisíc kilometrů vzdálená (Carlton & Geller 1993; Ricciardi & MacIsaac 2000). Dokladem významu balastní vody jakožto prostředku disperze na dlouhé

(mezikontinentální)

vzdálenosti

je

invaze

druhů

z Pontokaspiské

oblasti

do

severoamerických Velkých jezer (Ricciardi & MacIsaac 2000). V případě živých organismů k tomu, aby mohly být vypuštěny na nových lokalitách, musejí nejdříve přežít celou dobu transportu v tanku, někdy i týdny trvající (Carlton & Geller 1993). Organismům musejí dále vyhovovat také environmentální podmínky nové lokality jako teplota, salinita, živiny, dostupnost potravních zdrojů či přítomnost dalších konkurentů nebo predátorů (Nehring 2005). Pro eliminaci invazí nepůvodních druhů z balastní vody je tak například v severoamerických Velkých jezerech zavedena regulace, kdy lodě musejí ještě před vplutím na Velká jezera smíchat balastní vodu se slanou mořskou vodou. Toto opatření má zabránit proniknutí striktně sladkovodních organismů, ovšem neúčinkuje na organismy euryhalinní (Ricciardi & MacIsaac 2000). Skutečností, že balastní voda je primárně právě brakického nebo mořského původu, vysvětluje Nehring (2002) malý význam zaoceánské lodní dopravy pro šíření sladkovodních nepůvodních druhů v rámci západní Evropy. Toto tvrzení v další studii dokumentuje údaji, že v Německu bylo z 98 nepůvodních sladkovodních bezobratlých balastní vodou zavlečeno pouze 15 (Nehring 2005). Balastní vodu používají rovněž i lodě ve vnitrozemské dopravě. Reinhold & Tittizer (1997) se zabývali disperzním potenciálem lodí v plavebním kanále Mohan-Dunaj a výsledek, byť v jiném kontextu, potvrzuje nedůležitost disperze balastní vodou pro sladkovodní organismy. Zatímco v chladících filtrech a na trupu lodi nalezli mnoho organismů různých taxonů, v balastní vodě byl objeven pouze jediný klanonožec.

Rozšíření Proasellus coxalis vlivem lidské aktivity Vybudování plavebních kanálů mělo zřejmě pozitivní vliv i na disperzi druhu P. coxalis. Z původního areálu výskytu, který je v okolí východního pobřeží Středozemního moře, v jižní Itálii, Sicílii a Egejských ostrovech (Gruner 1965), se podle Tittizer et al. (2000) pravděpodobně rozšířil z jižní Francie přes řeku Rhônu, Saônu, Doubs, kanál Rhôna-Rýn - zprovozněn roku 1834 (Galil et al. 2007) - a Rýn do severního Německa a ostatních sousedních zemí. V Německu byl první nález zaznamenán roku 1931 na dolním Rýnu. V 50. letech byl poprvé nalezen u ústí řeky Ems, v 90. letech pak v Labi v okolí Hamburku a také u ústí řeky Wesser (Tittizer et al. 2000). Nyní se pravidelně nachází nejen ve vnitrozemských (Tittizer 2000), ale také v brakických vodách Severního moře (Nehring & Leuchs 2000). Jeho šíření Nehring & Leuchs (2000) připisují jak lodím (na jejich povrchu i v balastní vodě), tak i aktivnímu pohybu. Vždy je ale podle nich disperze tohoto druhu do západní Evropy možná jen díky vybudovaným plavebním kanálům. Dále uvádějí, 16


že P. coxalis je jediným druhem z mediteránní oblasti, který se vyskytuje v brakických vodách estuárů Severního moře.

Vliv nepůvodních druhů na ekosystém Druhy, které jsou šířeny, ať už záměrně nebo neúmyslně, lidskou činností, mohou mít často minimálně pozorovatelný vliv na původní společenstva (Gherardi et al. 2009). Introdukce některých druhů jsou všeobecně vnímány dokonce jako prospěšné, shrnuto ve studii Ewel et al. (1999). I přesto, že je nepůvodních druhů, které jsou v novém areálu výskytu problematické pro tamní společenstva, poměrně málo, můžou mít katastrofický dopad na životní prostředí, potažmo i lidskou ekonomiku (Gherardi et al. 2009). Zářným příkladem může být Dikerogammarus villosus. Tento blešivec má díky své agresivitě a velké dravosti velmi negativní dopad na původní společenstva makrozoobentosu. Živí se larvami vodního hmyzu, stejnonožci i jinými původními i nepůvodními blešivci (Dick et al. 2002; Tittizer et al. 2000). Ze svých obětí často pozře pouze hlavu či části končetin, aniž by je celé zkonzumoval (Dick et al. 2002). Navíc je schopen velmi rychlé disperze, za rok urazí až 30-40 km (Josens et al. 2005). Jeho migrace vodními cestami se neustále vyvíjí a rychle postupuje na nové lokality (Devin et al. 2001). Ze svého původního areálu výskytu (Pontokaspické oblasti) se po Evropě šíří díky plavebním kanálům, jak bylo popsáno výše. S balastní vodou došlo k zavlečení i do Severní Ameriky (Ricciardi & MacIsaac 2000). Jeho výskyt byl zaznamenán také v České republice (Petrusek 2006). Dreissena polymorpha je dalším klasickým příkladem druhu, který může mít za jistých okolností velmi negativní dopad jak na původní společenstva, tak i na hospodářství. Stejně, jako D. villosus, se tento druh z Pontokaspické oblasti šířil do Evropy díky kanálům (viz výše) a do Severní Ameriky s balastní vodou (Ricciardi & MacIsaac 2000). Právě americké populace způsobují hospodářské problémy, jako například ucpávání potrubí (Nalepa 1994). D. polymorpha může redukcí abundance zooplanktonu ovlivňovat i strukturální změny ve společenstvu. Dále může být příčinou dramatického snižování početnosti ostatních mlžů, kterým filtrováním ubírá potravu (Karatayev et al. 1997). Již více než 100 let se tento druh vyskytuje i v České republice. U nás zatím nezpůsobuje žádné hospodářské problémy, pouze v případě vyšší hustoty lze předpokládat vliv na naše vodní měkkýše (Beran 2006). V případě P. coxalis nebyl pozorován žádný negativní vliv na ekosystém. Naopak, v koexistenci s naším běžným druhem Asellus aquaticus se většinou vyskytuje v menších početnostech (Horecký et al. 2006; Horecký & Špaček 2007), ačkoli byl v laboratorní studii kompetičním vítězem nad A. aquaticus (Constantini & Rossi 1998), viz níže.

17

Poznámky k taxonomii a biologii druhu Proasellus coxalis

1.2


1.2.1

Taxonomie P. coxalis

Na území České republiky se z vodních bezobratlých řádu Isopoda nacházejí pouze dva druhy. Na rozdíl od berušky Asellus aquaticus, běžně se v našich vodách vyskytující, má druh P. coxalis z důvodu své velké variability poměrně složité taxonomické členění. Jeho zařazení do systému bezobratlých živočichů je podle Martin & Davis (2001) následující:

Podkmen: Crustacea Třída: Malacostraca Řád: Isopoda Podřád: Asellota Čeleď: Asellidae Druh: Proasellus coxalis Dollfus, 1892

P. coxalis je považován za polytypický druh. Vyznačuje se velkou morfologickou variabilitou. Taxonomické studie, založené především na těchto morfologických odlišnostech, popsaly až 23 víceméně geograficky oddělených poddruhů (Herhaus 1977). Další revize různých autorů však odhalily nedůslednost při taxonomickém zařazení. Několik poddruhů se neprávem řadilo do skupiny P. coxalis a nyní jsou považovány jako samostatný druh, jiné představují naopak pouze ekotypy P. coxalis, některé byly nově popsány (Argano & Campanaro 2004; Stoch 1989; Stoch et al. 1996). Ketmaier et al. (2001) se zabýval touto skupinou v Itálii, Sardinii a Jordánsku. Poukazuje na překvapivě vysokou genetickou rozdílnost jednotlivých populací a podporuje hypotézu, že pod jménem P. coxalis je ve skutečnosti ukryto několik geneticky rozdílných druhů. Ke stejnému závěru dospěl i ve své další studii (Ketmaier 2002). Ketmaier et al. (2001) dále vytýká současné taxonomii celého rodu Proasellus, že nereflektuje jeho fylogenezi a plánuje další genetická srovnání v širší geografické škále. Ta již částečně proběhla. Její první výsledky byly zatím jen prezentovány (data nebyla publikována) a naznačují dávnou divergenci některých populací z Itálie a Sardinie (Campanaro et al. 2004). Je důležité také poznamenat, že Stoch (1989) zpochybňuje přítomnost P. coxalis v Evropě a tyto populace označuje jako P. banyulensis. Stejný autor v další publikaci pak se svými kolegy podotýká, že P. banyulensis je v Evropě široce rozšířen a pravděpodobně je zde autochnonní, ikdyž je mnohými autory považován za nepůvodní ve střední Evropě (Gerecke et al. 2005). Navíc upozorňují, že ačkoli byl tento druh dlouho označován jako P. coxalis, byl již definován jako samostatný druh P. banyulensis (Gerecke et al. 2005; Stoch 1989). Názory ovšem nejsou 18


podloženy žádnou fylogeografickou studií. S ohledem na nedostatek spolehlivých určovacích znaků se nyní druh P. coxalis konzervativně uvádí jako komplex (morfologicky velmi podobných) druhů P. coxalis (P. coxalis – group, nebo též P. coxalis s.l.) a tradičně se vymezuje mimo jiné především tvarem endopoditů na 2. páru samčích pleopodů (Argano & Campanaro 2004; Stoch et al. 1996).

1.2.2

Biologie a ekologie P. coxalis, jeho srovnání s A. aquaticus

P. coxalis obývá vody stojaté i tekoucí, tam ale vyhledává habitaty s klidnějším proudem, vyskytuje se také ve vodách brakických. Živí se rostlinnou hmotou a detritem, potravní strategií je drtič, sběrač (Gruner 1965, Nehring 2006). Biologie a ekologie P. coxalis je velmi podobná našemu běžnému druhu A. aquaticus, jenž je podrobně popsán např. v Lellák et al. (1972). Bude tedy věnována pozornost především těm vlastnostem, kterými se oba druhy liší. P. coxalis je, stejně jako A. aquaticus, bivoltinní, s hlavními populačními maximy na jaře a na podzim (Flössner 1987; Pešková 2008; Uvíra 1985). V jejich životní strategii však existují určité rozdíly. Sezónní reprodukční periody nejsou u P. coxalis striktně vymezeny, mohou se měnit v závislosti na průměrných teplotách daného roku, pravidelně se ale objevuje prodloužení podzimní periody do poloviny listopadu. (Na rozdíl od A. aquaticus, jehož reprodukce trvá striktně od března do října.) Vyskytuje se i malá tendence k reprodukci v průběhu zimy. Umístění, délka a intenzita reprodukce jsou plastičtější a daleko více ovlivněny teplotou než u A. aquaticus. P. coxalis se začíná pářit při menších velkostech, což zvyšuje plodnost zejména u jedinců, kteří se nacházejí na rozhraní jednotlivých velikostních tříd (Flösner 1987). Ještě před samotným pářením tvoří, stejně jako A. aquaticus, pre-kopulační páry, a k samotnému páření dochází v momentě svlékání samičky, kdy jsou odkryty její pohlavní otvory (Lellák et al. 1972). Na druhou stranu, páření A. aquaticus ve vyšších velikostních třídách je kompenzováno větší plodností, jelikož počet vajíček v marsupiu koreluje s délkou těla. Tyto uvedené rozdíly v životní strategii mohou být dány především odlišným geografickým původem obou druhů (Flösner 1987). Při vzájemné koexistenci obou druhů dorůstá A. aquaticus menších rozměrů a celkově dosahuje menších početností. P. coxalis má ale především díky schopnosti lepšího využití potravních zdrojů různého původu a též schopnosti růst nezávisle na přítomnosti jiného druhu lepší kompetiční vlastnosti. Často tedy na konkrétních lokalitách vítězí a je také a lepším potenciálním kolonizátorem (Constantini & Rossi 1998). Ovšem nutno poznamenat, že studie (Constantini & Rossi 1998) byla prováděna za laboratorních podmínek. Ve vzorcích z České republiky představuje P. coxalis jen zřídka dominantní taxon a většinou se vyskytuje v menších početnostech (Flasarová 1975; Horecký & Špaček 2007; vlastní pozorování). Též zmiňovaná studie, kterou provedl Flössner (1987) a jež byla lokalizovaná do podnebných podmínek srovnatelných s Českou republikou, dokládá, že abundance obou druhů se mezi jednotlivými lety střídaly. Když byla průměrná roční teplota vyšší, byl početnější P. coxalis, zatímco v letech s nižšími teplotami se více dařilo druhu A. aquaticus. 19


1.2.3

Morfologie P. coxalis

Samci P. coxalis obecně dosahují délky těla do 10 mm, samice okolo 6,6 mm. Ve srovnání s naším běžným druhem A. aquaticus (jehož samci běžně měří 12 mm a samice 8 mm, ale mohou mít délku až 20 mm - samci a až 15 mm - samice), nabývá P. coxalis tedy menších délek těla (Gruner 1965). A to i v případě menších rozměrů A. aquaticus daných kompetičním stresem (Constantini & Rossi 1998). Kromě délky těla odlišují oba druhy morfologické rozdíly, které mají determinační funkci. Vzhledem k chybějícímu popisu P. coxalis v u nás běžně dostupných klíčích, jsou zde uvedeny následující determinační znaky, čerpáno z: Flasarová (1975), Horecký & Špaček (2007), Gruner (1965).

Kresba Kresba na temeni hlavy je velmi rychlým a celkem spolehlivým určovacím znakem, je „slitá“ a trojúhelníkovitého tvaru (obr. 2). Zatímco A. aquaticus má dvě „brýlovitě“ oddělené skvrny (obr. 3).

Obr. 2. P. coxalis, kresba na temeni hlavy. Foto: autorka práce.

Obr. 3. A. aquaticus, kresba na temeni hlavy. Foto: autorka práce.

2. pleopod samců Endopodit 2. páru pleopodů samců tvoří na vnitřní straně „bambulkovitý“ výstupek (obr. 4), A. aquaticus má tento výstupek šavlovitého tvaru (obr. 5).

Obr. 4. P. coxalis, „bambulkovitý“ výstupek na vnitřní straně endopoditu 2. samčího pleopodu. Podle Gruner (1965), upraveno.

20

Obr. 5. A. aquaticus, šavlovitý výstupek na vnitřní straně endopoditu 2. samčího pleopodu. Podle Gruner (1965), upraveno.


2. pleopod samic 2. pár pleopodů samic je dvakrát delší než široký (obr. 6), zatímco u A. auqticus má kruhovitý tvar (obr. 7)

Obr. 6. P. coxalis, 2. samičí pleopod. Podle Gruner (1965), upraveno.

Obr. 7. A. aquaticus, 2. pár samičích pleopodů. Podle Gruner (1965), upraveno.

1. pereopod samců 1. pereopod samců má distální konec oválný, jasně zahnutého tvaru (obr. 8), u A. aquaticus je přítomen trojhranný výběžek (obr. 9).

Obr. 8. P. coxalis, 1. samčí pereopod. Podle Flasarové (1975), upraveno.

Obr. 9. A. aquaticus, trojhranný výběžek 1. samčího pereopodu. Podle Gruner (1965), upraveno.

21

Datované výskyty P. coxalis v Evropě a v České republice

1.3


P. coxalis je běžným a široce rozšířeným druhem oblasti Středozemního moře. V literatuře je často citováno rozšíření, jež uvádí Gruner (1965): vyskytuje se v jižní Itálii, Sicílii a Egejských ostrovech, odkud se rozšířil do severní Afriky, Sýrie, Palestiny, Řecka, Chorvatska, Slovinska, severní Itálie, jižní Francie, Španělska a Portugalska. Zatím však nebylo podloženo fylogeografickou studií. V severní Francii byl zaznamenán roku 1930 (Devin et al. 2005). V roce 1931 byly první výskyty evidovány také v Německu v dolním Porýní (Tittizer et al. 2000). Dále v roce 1956 z povodí řek Maas a Saale, kde se nejdříve rozlišovaly dva poddruhy: P. coxalis peregrinus Herbst, 1956 a P. coxalis septentrionalis Herbst, 1956. Později byly na základě podrobnější morfologické studie sloučeny tyto středoevropské formy do poddruhu P. coxalis septentrionalis (Herhaus 1977). V 80. letech přibylo pak nálezů z povodí řek Rýn, Weser a Labe, v 90. letech poprvé spatřen v okolí Hamburku (Tittizer et al. 2000). V 70. letech byl objeven také na jihu Švédska, další nálezy pocházejí z let 1999 a 2000 (Lundin 2003). Ve Švýcarsku byl poprvé zaznamenán v roce 1974 na horním toku Rýna (Heuss 1976).

Výskyt P. coxalis v České republice Na území České republiky byl P. coxalis poprvé zaznamenán již roku 1947 v jižních Čechách v Horusicích u Veselí nad Lužnicí, na Moravě roku 1956 v Podskalském potoce na okrese Olomouc. Ve středních Čechách jsou objevy datovány z roku 1951 z přehrady Slapy u Cholína. V severních Čechách byl pak nalezen roku 1974 v louži u řeky Ploučnice u Novin pod Ralskem. Všechny tyto nálezy jako poddruh P. coxalis septentrionalis determinovala a posléze publikovala Flasarová (1975). V roce 1994 byl poprvé zjištěn i v Labi (Flasarová 1996). Další záznamy, tentokráte z Pálavy, dokládají Kubíček & Opravilová (1999). Po roce 2000 jsou evidovány nálezy téměř z celého území České republiky, jejich lokalizaci publikovali Horecký et al. (2006). Aktuální data o výskytu jsou také shromážděna na portále ČHMÚ (ČHMÚ - Výběr profilů jakosti povrchových vod, taxon: Proasellus coxalis). Obrázek 10 přibližně ilustruje současný výskyt P. coxalis a vznikl začleněním těchto dat do výše zmíněné mapy. Horecký et al. (2006) ale poznamenávají, že rozšíření P. coxalis je pravděpodobně výrazně větší, než se uvádí, a vzhledem k malému povědomí o tomto druhu nejspíše docházelo k jeho záměně s běžným druhem A. aquaticus.

22


Obr. 10. Mapa znázorňující současný výskyt druhu P. coxalis na území České republiky. Černé body jsou nálezy evidované na portále ČHMÚ (viz text). Podle Horeckého et al. 2006, upraveno.

Ačkoli

byly

populace

na

území

České

republiky

determinovány

jako

P. coxalis septentrionalis, vzhledem k výše popsaným taxonomickým nejasnostem, bude dále používáno pouze druhové zařazení P. coxalis s.l.

23

Cíle práce

2. CÍLE PRÁCE V úvodu byla probírána schopnost disperze sladkovodních bezobratlých organismů. Významná část této kapitoly byla věnována vlivu lidské činnosti, která v mnoha ohledech vede k šíření nepůvodních druhů organismů na nová území. V České republice se vyskytuje mnoho nepůvodních druhů sladkovodních živočichů. Patří mezi ně i Proasellus coxalis s.l., druh s původním areálem výskytu v mediteránní oblasti. Šíření do střední Evropy se přikládá lodní dopravě skrze plavební kanály (Tittizer et al. 2000). Jeho první nález v České republice je však datován v daleko dřívější době, než byl evidován na území Německa. Proto se Horecký & Špaček (2007) domnívají, že spíše než lodní dopravou mohl být do České republiky zavlečen společně s dovozem ryb či vodního ptactva z mediteránní oblasti, nebo se rozšířil přirozeně pomocí tažného vodního ptactva. Na základě porovnání genetických dat populací z území České republiky a dalších zemí, především států jižní Evropy, jsou cíly této práce: 

určit, zdali se P. coxalis šíří z mediteránní oblasti díky lodní dopravě;



nebo byl na naše území zavlečen jiným způsobem (například s dovozem vodního ptactva), či je přirozeně šířen pomocí tažného vodního ptactva;



prozkoumat fylogeografické vztahy populací P. coxalis s.l. na území České republiky.

V práci vzniklé na Katedře ekologie zaměřené na fylogeografii A. aquaticus, bylo mimo jiné zjištěno, že při porovnání populací z lotických a lentických habitatů mezi nimi neexistuje genetická variabilita, která by byla vázána k typu habitatu. Tento výsledek vedl k závěru, že mezi populacemi z tůní a toků musí být propojení a berušky vodní tedy musejí být nějakým způsobem schopny překonat souš oddělující jednotlivé vodní plochy (Střížek 2012). Jelikož se P. coxalis vyskytuje ve stejných habitatech jako A. aquaticus a ekologií si jsou druhy velmi podobné, předpokládá se, že se budou šířit podobnými mechanismy. Z výše zmíněných důvodu je součástí této práce i pokus s migrační tůní, který je ovšem jen okrajový a má pouze informativní charakter. Jeho cílem je: 

zjistit, zdali jsou berušky v důsledku stresových faktorů (vysychání habitatu) schopny samy aktivním pohybem překonat (na krátkou vzdálenost) suchozemskou bariéru mezi vodními plochami.

24

Metodika

3. METODIKA 3.1

Sběr dat

Vzorky populací P. coxalis byly odebírány v průběhu let 2008 až 2013. Odebraní jedinci byli přímo v terénu umísťováni do čistého 96 % etanolu. V laboratoři pak následovala determinace a přebírání od A. aquaticus, jelikož se tyto druhy vyskytují často společně a u některých, především menších jedinců, není kresba na hlavě pouhým okem jasně rozpoznatelná. Vzorky byly odebírány autorkou této práce, dalšími studenty i pracovníky Katedry ekologie Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy v Praze a také pracovníky státních podniků Povodí Labe a Povodí Vltavy, jejich jména jsou uvedena v tabulce umístěné v přílohách. Část vzorků ovšem vznikla pečlivou determinací dříve nasbíraných vzorků populací A. aquaticus, jež byly určené pro práci obhájenou minulý rok (Střížek 2012) a mezi kterými byli nacházeni i jedinci P. coxalis. Vzorky všech populací byly následně použity k dalším analýzám. Vzhledem ke vzácnějšímu výskytu P. coxalis se ne vždy podařilo (a to i přes značné lovné úsilí) odebrat více jak deset jedinců. Aby došlo k co největšímu pokrytí území České republiky, musely být do analýz zařazeny i populace, které čítaly třeba jen jediného jedince. Lokality, z nichž pocházely vzorky populací, byly rozděleny do skupin podle povodí našich velkých řek. Mapa (obr. 11) znázorňuje umístění všech zkoumaných lokalit a vymezuje hranice povodí.

Obr. 11. Mapa znázorňující přibližné umístění lokalit. Světle šedé linie naznačují hranice povodí. 25

Metodika

3.2

Izolace DNA, purifikace a sekvenace

Z nasbíraných vzorků byla izolována DNA. Izolace probíhala v laboratoři Katedry ekologie a byla prováděna pomocí komerčně prodávaného kitu DNeasy Blood & Tissue Kit od firmyQIAGEN®. DNA byla izolována minimálně z jednoho jedince každé populace, preferován byl větší počet (2 -3 jedinci). Počty izolací byly však primárně ovlivněny počtem nasbíraných jedinců. Napříč povodími byly zvoleny populace, kde byla provedena izolace DNA u 5 jedinců pro zjištění vnitropopulační genetické variability. Koncentrace DNA byla u každého izolátu měřena pomocí přístroje Nanodrop®. Podle naměřených hodnot byla posléze izolovaná DNA ředěna H2O pro PCR (polymerace chain reaction) tak, aby její koncentrace, vstupující do reakce PCR, byla v rozmezí 20 – 40 μl. Izoláty byly uchovávány v lednici v označených mikrozkumavkách. Prostředí mrazničky o teplotě -18°C bylo využito k dlouhodobějšímu skladování. U všech jedinců byl analyzován mitochondriální gen kódující cytochrom c oxidázu podjednotku I (COI). Rychlost akumulace mutací u tohoto genu je vhodná pro jeho široké využití, od taxonomických studií po fylogeografické práce (Morvan et al. 2013; Trontelj et al. 2005; Verovnik et al. 2005) Použití genu pro COI bylo voleno také z důvodu možného srovnání se studiemi našeho běžného druhu A. aquaticus. Jeho fylogeografie byla náplní práce Antonína Střížka (Katedra ekologie, 2012). Navíc tento gen použili své studii také Morvan et al. (2013), jejichž data jsou neopominutelnou součástí této práce (viz níže). Pro další srovnání byl u vybraných jedinců napříč povodími zvolen mitochondriální gen 28S, opět používaný v publikaci Morvan et al. (2013). Amplifikace genů proběhla pomocí reakce PCR (polymerace chain reaction) (Mullis et al. 1986). V reakci byly použity 2μl izolované DNA a 23μl PCR mixu, který měl složení: 15μl H2O, 1μl MgCl2, 3μl PCR buffer bez MgCl2, 3μl dNTPs, 0,8μl primer A, 0,8μl primer B, 1μl Taq DNA polymeráza 1U. Sekvence primerů genu COI (Folmer et al. 1994) jsou následující: 5´- GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG 3´- TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA Sekvence primerů genu 28S (Morvan et al. 2013; Verovnik et al. 2005): 5´- CAAGTACCGTGAGGGAAAGTT 3´- AGGGAAACTTCGGAGGGAACC V PCR byly používány následující cykly: Pro gen COI nejdříve: 1x (3 min – 94°C), 5x (1 min – 94°C, 1 min – 45°C, 1 min – 72°C) 35x (1 min – 94°C, 1 min – 50°C, 1 min – 72°C), 1x (6 min 72°C). Posléze byly pro geny COI a 28S používány cykly podle Morvan et al. (2013): 1x (2 min – 94°C), 40x (COI) nebo 35x (28S) (30s – 94°C, 30s – 48°C (COI) / 62°C (28S), 30s – 72°C), 1x (10 min – 72°C).

26

Metodika

Několik μl každého PCR produktu bylo následně použito v gelové elektroforéze, pro vizualizaci výsledku PCR. U některých vzorků bohužel při amplifikaci genu pro COI opakovaně vycházelo více PCR produktů různé délky. U těchto vzorků byl produkt požadované délky vyříznut z elektroforézového gelu a extrahován kitem QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN®), výtěžek (naředěn v různých poměrech H2O pro PCR) byl znovu amplifikován. Purifikace dobrých PCR produktů byla prováděna nejdříve pomocí kitu MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN®), posléze byla kvůli větší výtěžnosti použita metoda etanolové precipitace, která je popsána v protokolu umístěném v přílohách. U takto přečištěných PCR produktů byla posléze měřena koncentrace DNA na přístroji Nanodrop®. Podle výsledku byly pak produkty smíchány s určitým množstvím H2O a primerem a předány k sekvenační analýze prováděné Laboratoří sekvenace DNA (servisní pracoviště Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovy v Praze). Kvůli špatným začátkům bylo nutné některé sekvence osekvenovat i z druhé strany.

3.3

Fylogenetické zpracování sekvencí

Sekvence byly nejdříve prohlíženy v programu Chromas Lite 2.1 (Technelysium Pty Ltd 2012). Z analýz byly úplně vyřazeny nesmyslné a vadné sekvence. V některých případech bylo nutné sekvence ručně editovat, což probíhalo pomocí programu BioEdit Sequence Alignment Editor ver. 7.1.7 (Hall 1999). Následně byl vytvořen alignment a sekvence byly upravené na stejný počet nukleotidů. Sekvence byly dále přejmenovány podle lokalit a každé sekvenci byl přiřazen unikátní název, vše probíhalo ve výše zmíněném programu BioEdit. Haplotypové sítě nabízejí přehlednou vizualizaci vnitrodruhových vztahů a výsledné zobrazení může být přesnější než u klasických fylogenetických stromů s dichotomickým větvením. Proto byly pro znázornění vztahů jednotlivých haplotypů genu pro COI zvoleny právě haplotypové sítě a k doplnění geografických poměrů přidány schematické mapy. Pro výpočet sítí byl použit program Network ver. 4.6.1.1 (Fluxus Technology Ltd, UK). Sítě byly vypočítány metodou Median– joining MJ, parametr ε byl u všech výpočtů sítí roven 0 (Bandelt et al. 1999). Pro následné zobrazení a editaci pak sloužil program Network Publisher ver. 2.0.0.1 (Fluxus Technology Ltd, UK). Další úpravy a zpracování sítí a map probíhaly v programu Adobe® Photoshop® CS2 ver. 9.0. Pro znázornění vztahů populací na základě genu 28S byl použit fylogenetický strom. Strom byl konstruován v programu Mega 5.2 (Tamura et al. 2011) metodou Neighbor-Joining. Jako outgroup byl zvolen druh Proasellus meridianus (získání dat viz níže). Následně byl strom graficky upraven v programu Adobe® Photoshop® CS2 ver. 9.0. Střední genetické vzdálenosti uvnitř a mezi skupinami haplotypů a povodími byly vypočítány v programu Mega 5.2 (Tamura et al. 2011), pomocí Kimura dvouparametrového testu (Kimura 1980.) 27

Metodika

Odhady stáří divergence byly stanoveny na základě rychlosti divergence genu pro COI, kterou Ketmaier et al. (2003) odvodil pro rod Stenasellus podle historických dat oddělování ostrovů Sardinie a Korsiky. Hodnota byla stanovena na 0,0125 substitucí jednoho nukleotidu za milión let. Tento odhad byl v předkládané práci použit hned z několika důvodů. Rod Stenasellus je příbuzný a relativně podobný studovanému druhu P. coxalis, patří do stejné nadčeledi (Aselloidea). Tento odhad stáří divergence byl použit i ve fylogeografických studiích druhu A. aquaticus (Střížek 2012, Verovnik et al. 2005). V neposlední řadě o vhodnosti využití této hodnoty svědčí i fakt, že je využívána v právě probíhající fylogenetické studii, zabývající se přímo rodem Proasellus (Campanaro et al. 2004).

3.4

Doplňující data Pro dosažení cílů práce bylo nutné začlenit do analýz vzorky také z evropských populací,

využity byly populace druhu P. coxalis z práce Morvan et al. (2013). Všechny sekvence z této publikace jsou volně dostupné z portálu: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Dále pak byly využity sekvence, které byly součástí fylogeografické studie prováděné na druhu A. aquaticus, kde P. coxalis sloužil jako outgroup (Verovnik et al. 2005). Všechny tyto sekvence genu pro COI i 28S byly staženy z Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Z publikace Morvan et al. (2013) byla použita i sekvence druhu P. meridianus, který sloužil jako outgroup při konstrukci fylogenetického stromu genu 28S. Součástí informací zveřejněných k sekvencím použitých ve studii Morvan et al (2013) byly též souřadnice GPS jednotlivých populací P. coxalis. Tyto souřadnice byly posléze využity k jejich vizualizaci na mapě Evropy. Všechny stažené sekvence jsou uvedeny v tabulce v přílohách.

3.5

Migrační tůňka Cílem pokusu s migrační tůňkou je zjistit, zdali jsou berušky schopny samy aktivním

pohybem překonat (na krátkou vzdálenost) suchozemskou bariéru mezi vodními plochami v případě, že dochází k vysychání jejich habitatu. Z ryze praktických důvodů byl k experimentu použit druh A. aquaticus, který je velmi hojný a proto není obtížné nalovit i větší počet jedinců. Použití druhu P. coxalis by kvůli jeho menším početnostem a vzácnějšímu výskytu působilo značné komplikace. Byl vytyčen kruh o poloměru 1 m. Po celém jeho obvodu byl umístěn pruh fólie, asi 15 cm široký, tak, že zasahoval 2-3 cm pod zem a zbytek tvořil nad zemí hranici, která měla zabránit případným migrujícím beruškám opuštění pokusného prostoru. Uprostřed takto ohraničeného kruhu byla vytvořena tůňka o průměru 0,5 m, hluboká přibližně 10 cm. Její dno sestávalo z pevné dvojité fólie (pro zajištění nepropustnosti) černé barvy (pro snazší vysychání tůňky). Profil tůně měl postupně se svažující břehové partie, aby co nejvíce simuloval přírodní podmínky. Po celém obvodu pokusného kruhu byly ve vzdálenosti 30 cm umístěny zemní pasti - plastové nádoby 28

Metodika

(kelímky) o objemu 0,5 l, které byly naplněny malým množstvím vody a lihu, aby byly případné migrující berušky v zemní pasti fixované, bez možnosti úniku. Vzhled pokusného kruhu s tůňkou ilustruje schematický obrázek (obr. 12). Substrát dna tůňky tvořilo opadané listí, nasbírané podél vodního toku. K zajištění ustáleného chemického prostředí bylo 12 dnů před pokusem namočeno ve vodě z místního potoka, ze kterého byly posléze berušky odebírány. Experiment probíhal po dobu 14 dní s jedním opakováním. Po celou dobu jeho trvání byla hladina v tůňce upravována tak, aby byla tůňka na jeho konci vyschlá. Na začátku pokusu bylo do tůňky vloženo 100 jedinců druhu A aquaticus. Dvakrát denně byl kontrolován obsah zemní pastí pro potenciální přítomnost berušky vodní, jednou denně pak sondou Hanna HI 98130 - pH/Ec metr combo měřeny fyzikálně-chemické parametry vody v tůňce (pH, teplota, konduktivita) a pomocí pravítka byla odečítána výška hladiny. Všechny zjištěné parametry byly zaznamenány do tabulky. Na konci experimentu byla opatrně vyjmuta fólie tvořící dno tůňky. Jedinci, kteří v tůňce zůstali, byli pečlivě vybráni a spočítáni. Pro další opakování pokusu byly naloveny nové berušky vodní.

Obr. 12. Schéma umístění tůňky a zemních pastí.

Pokus s migrační tůňkou je pro tuto práci pouze okrajový a jeho výsledek má informativní charakter. Proto byla zjištěná data jen zapsána do tabulky a byl vytvořen jednoduchý graf znázorňující poměry jedinců, kteří v tůňce zůstali, kteří případně migrovali a byli zachyceni v zemních pastích a těch, kteří nebyli nalezeni ani v tůňce, ani v pastích.

29

Výsledky

4. VÝSLEDKY Do fylogeografických analýz bylo celkem zahrnuto 96 sekvencí genu pro COI jedinců druhu Proasellus coxalis z 27 lokalit ležících na území České republiky (obr. 11). Bohužel, i přes veškerou snahu, některé sekvence měly opakovaně nečitelné začátky, u některých nepomohla ani zpáteční sekvenace. Jelikož takovýchto sekvencí nebylo zanedbatelné množství a nemohly být úplně vyřazeny, bylo nutné zkrátit všechny sekvence vstupující do analýz na 580 nukleotidů. Podstatnou součástí této práce jsou i sekvence ze studie Morvan et al. (2013), jak již bylo uvedeno v metodice. Některé z nich byly ještě kratší (v důsledku používání vnitřních primerů) a tak do analýz, kterých byly součástí, vstupovalo jen 484 nukleotidů. V sekvenci genu pro COI o celkové délce 484 nukleotidů bylo celkem 163 variabilních pozic, z toho 138 bylo parsimonně informativních. Průměrné zastoupení jednotlivých bazí bylo následující: T -34,4%, C - 23,5%, A - 24,5%, G - 17,6%. Dále bylo analyzováno 18 sekvencí genu 28S celkové délky 748 nukleotidů, které musely být zkráceny na 680 nukleotidů opět z důvodu použití kratších sekvencí z publikace Morvan et al. (2013). V sekvenci genu 28S, dlouhé 680 nukleotidů, nebylo celkem 11 variabilních pozic, 8 bylo parsimonně informativních. Zastoupení jednotlivých bazí bylo následující: T - 19,6 %, C - 28,3 %, A - 19,5 %, G - 32,6 %.

4.1 Haplotypové sítě Haplotypové sítě, doplněné schematickými mapami, tvoří hlavní výstupy této práce. Jsou na nich přehledně zobrazeny fylogeografické a fylogenetické vztahy populací Proasellus coxalis nejen z území České republiky, ale také z mediteránní oblasti a střední a severní Evropy (získání těchto dat bylo uvedeno v metodice). Všechny sítě byly vypočítány v programu Network a Network Publishers (Fluxus Technology Ltd, UK) s parametrem ε = 0 (Bandelt et al. 1999). Na obrázku 13 ilustruje haplotypová síť, doplněná slepou mapou Evropy, vztahy evropských a severoafrických populací. Síť byla zkonstruována na základě všech 96 sekvencí genu pro COI z této práce, 37 sekvencí genu pro COI ze studie Morvan et al. (2013) a 2 sekvencí genu pro COI z publikace Verovnik et al. (2005). Všechny sekvence použité k výpočtu sítě byly zkráceny na celkovou délku 484 nukleotidů. Haplotypy mají stejnou velikost koleček, v síti tedy není zohledněn počet jedinců, sdílejících stejný haplotyp. Měřítko pod sítí odpovídá 8 mutacím. Pozice haplotypů ze Slovinska (světle modrá barva, označení písmenem C) naznačuje, že by mohly být ze všech skupin haplotypů pravděpodobně nejblíže k dávnému společnému předkovi. Ve studii, ze které jsou tyto sekvence slovinských populací převzaty (Verovnik et al. 2005), sloužily pouze jako outgroup a nebylo přesně specifikováno místo jejich sběru (byl pouze uveden stát). Avšak vzhledem k intenzitě sběru vzorků v Dinárském krasu se dá předpokládat, že populace pochází právě z této oblasti, která je považovaná za evropské centrum biodiverzity 30

Výsledky

Obr. 13. Haplotypová síť genu pro COI, zobrazující haplotypy z Evropy a mediteránní oblasti a jejich lokalizace na mapě. 31

Výsledky

sladkovodních bezobratlých (např. Trontelj et al. 2005; Verovnik et al. 2005). Tomu by mohla odpovídat i pozice těchto slovinských populací v síti a též ve fylogenetickém stromu 28S (viz níže). Nejvíce se odlišují populace z Libanonu (žlutě, písmeno F), které od torsa sítě dělí 81 mutací, a populace z Řecka (hnědá barva, písmeno G), které dělí 64 mutací. Dvě chorvatské populace spadají do dvou odlišných haplotypových skupin, označených písmeny H a E, přičemž jedna sdílí společného předka s řeckou populací, druhá je v síti umístěna blíže k libanonské populaci. Haplotyp označený červenou barvou a písmenem D je pak společný pro populace z jihu Španělska a Alžírska. Tento haplotyp je v sesterském vztahu s „růžovou“ skupinou haplotypů, označených písmenem B, sdílí s ní společného předka. Konečně se dostáváme k českým populacím, tato skupina je geograficky nejrozmanitější a spadají do ní populace z jižní, střední i severní Evropy a také z České republiky. Je tedy evidentní, že české (i ostatní středo a severoevropské) populace jsou propojeny s těmi jihoevropskými a k disperzi z těchto regionů nějakým způsobem dochází. Překvapivé je zjištění, že na území České republiky se vyskytuje ještě další větev, „modrá“skupina haplotypů, označená písmenem A. Haplotyp z této skupiny sdílí s českými populacemi pouze jedinec nalezený na jihu Švédska. Skupina je od ostatních jasně oddělena. Celá situace dokládá, že na území České republiky se nacházejí populace ze dvou odlišných větví. Další síť na obrázku 14 podrobně znázorňuje haplotypy pouze z České republiky a jejich lokalizaci na mapě. Pro tvorbu sítě byly použity všechny sekvence genu pro COI (96) z českých populací o délce 580 nukleotidů. Pro dosažení věrohodnosti sítě byly začleněny také 2 sekvence genu pro COI z práce Verovnik et al. (2005), vybrané vzhledem k pozici této populace ve fylogenetickém stromu genu 28S (viz níže). Síť doplňuje mapa České republiky, která pomocí koláčových grafů dokumentuje výskyt skupin haplotypů na jednotlivých lokalitách. Nad mapou je uvedeno měřítko, každý graf zohledňuje počet analyzovaný jedinců z dané populace. Stejně tak je v síti zohledněn počet jedinců sdílejících společný haplotyp – velikostí kolečka a také číslem, pouze u haplotypů reprezentovaných jediným jedincem není číslo uvedeno. U sítě je opět nakresleno měřítko, odpovídající 3 mutacím. Pro značnou vzdálenost jednotlivých větví je naznačeno jejich přerušení. Na haplotypové síti je zřetelné, že haplotypy „modré“ skupiny A mezi sebou mají jasný vztah, vycházející z jediného společného předka. Dva nejpočetněji zastoupené haplotypy této skupiny jsou na sesterské úrovni. O něco málo složitější je situace v „růžové“ skupině B, kde je na začátku šedě naznačená alternativní spojnice (není v přesném měřítku) a nelze tedy říci, jaký haplotyp je mateřský, ze kterého vycházejí ostatní v této skupině. V našem případě je ale, než vztahy

jednotlivých

haplotypů,

důležitější

jejich

výskyt

v populacích.

Oproti

druhu

Asellus aquaticus, u kterého bylo na našem území zjištěno mnoho velmi heterogenních haplotypů

32

Výsledky

Obr. 14. Haplotypová síť genu pro COI zobrazující haplotypy z území České republiky a jejich lokalizace na mapě. 33

Výsledky

(Střížek 2012), má Proasellus coxalis zastoupení s 11 haplotypy ze dvou různých větví poměrně chudé. Připomeňme si, že „růžová“ B skupina haplotypů je společná pro jiho-, středo- i severoevropské populace. Z mapy je zřetelné zastoupení této skupiny především v povodí Labe a Vltavy. Mnohdy se v nich vyskytují populace zastoupené pouze tímto haplotypem. Například na severu na řece Ploučnici (lokalita Boreček), ve středních Čechách v Libickém luhu na Bačovce nebo na jihu Čech na řece Lužnici a Malši (lokalita Roudné). Naopak na Moravě je pouze jediná lokalita zastoupena jen haplotypy skupiny B a haplotypy z A skupiny jsou na tomto geografickém území častější. Ve shrnutí lze říci, že je mnoho lokalit, na kterých se vyskytují obě skupiny haplotypů, s různým poměrem zastoupení. Zároveň jsou lokality, kde byly zaznamenány pouze haplotypy skupiny A či B, haplotypy skupiny B jsou zastoupeny spíše na Moravě. V rozmístění obou skupin haplotypů není patrné striktně regionální rozmístění. Obrázek 15 je obdobou obrázku 14, síť byla vytvořena stejným způsobem. Vychází ovšem z opačného principu. Jednotlivá povodí, barevně odlišená na mapě, jsou promítnuta do haplotypové sítě. Je zde patrná určitá disproporce. Zatímco jedna skupina haplotypů se víceméně rovnoměrně vyskytuje ve všech povodích, druhá (B skupina, obsahující i evropské populace) je v povodí Moravy zastoupena pouze jediným haplotypem a nejvíce frekventovaná je v povodí Labe. Situace z obrázků 14 a 15 je ještě doplněna mapou (obr. 16), na které jsou zobrazeny hranice povodí a zároveň shrnující koláčové grafy, uvádějící poměrné zastoupení obou skupin haplotypů v rámci povodí. Vystihuje výše uvedené a dokládá, že v povodí Labe a Vltavy jsou obě skupiny zastoupeny rovnoměrně, zatímco v povodí Moravy je častější „modrá“ A skupina haplotypů, v této práci zastoupená pouze českými populacemi (a jedním vzorkem ze Švédska).

34

Výsledky

Obr. 15. Haplotypová síť genu pro COI. Povodí promítnutá do sítě haplotypů z území České republiky.

35

Výsledky

Obr. 16. Poměrné zastoupení dvou skupin haplotypů z České republiky v rámci povodí.

4.2 Fylogenetický strom Ribozomální gen 28S se skládá z klíčových segmentů, které jsou velmi konzervativní napříč taxonomickými úrovněmi, a také z variabilních úseků. Seskupení těchto vlastností je vhodné pro jeho použití v odhadech fylogenetických vztahů na vyšších taxonomických úrovních (Bae et al. 2010). Proto byl pro doplnění použit i v této práci. Do analýzy bylo zahrnuto celkem 18 vybraných sekvencí tohoto genu napříč povodími a haplotypy z České republiky. Aby měl tento krok smysl, bylo použito také 6 sekvencí z již zmiňované studie Morvan et al. (2013). Jako outgroup byl použit druh P. meridianus ze stejného datového zdroje. Sekvence byly zkráceny na délku 689 nukleotidů. Obrázek 17 znázorňuje výsledný fylogenetický strom. Barevně jsou odlišeny populace z České republiky (růžová, modré ohraničení) a další evropské a severoafrické, jejich barva odpovídá značením použitým v mapě Evropy na obrázku 13. Jasně se oddělila slovinská populace, které je ze všech populací nejpodobnější dávnému společnému předkovi. Zdá se, že populace z tohoto území mohly hrát ve fylogenezi P. coxalis významnou roli. Dále jsou odděleny řecké a libanonské populace, které i v síti (obr. 13) vykazovaly značné odlišnosti od ostatních skupin haplotypů. Naopak společnou skupinu tvoří populace z Francie, Chorvatska, Alžírska a také České republiky, které v haplotypové síti (obr. 13) sice tvořily samostatné haplotypové skupiny, jejich rozdílnost však nebyla tak značná, jako u předešlých populací.

36

Výsledky

Obr. 17. Fylogenetický strom genu 28S. CZ – Česká republika, DZ – Alžírsko, HR – Chorvatsko, FR – Francie, GR – Řecko, LB – Libanon, SI – Slovinsko.

4.3 Odhad středních genetických vzdáleností sekvencí genu COI Odhady středních vzdáleností, vypočítané pomocí testu: Kimura dvouparametrový model (uvedeno v metodice), budou přehledně znázorněny v tabulkách s uvedením směrodatné odchylky, která bude vždy umístěna v šedých polích tabulky, případně v pravém rohu nad diagonálou.

37

Výsledky

Z tabulek 1. a 2. vyplývá, že všechna povodí – Labe, Vltavy i Moravy - mají velmi podobnou míru vnitřní heterogenity, nejmenší vykazuje povodí Moravy, kde se, jak bylo prezentováno výše, ze skupiny B vyskytuje pouze jediný haplotyp. Největší heterogenitu má povodí Vltavy. Nejvíce se od sebe liší povodí Labe a Morava, avšak rozdíly jsou minimální. Tab. 1. Odhad střední vzdálenosti uvnitř povodí ČR. LABE

MORAVA VLTAVA

LABE

0,005

MORAVA VLTAVA

Tab. 2. Odhad střední vzdálenosti mezi povodími ČR.

0,034 0,033

0,005 0,005

MORAVA

0,032 0,005

0,031 0,005

VLTAVA

0,034 0,005

0,033

Tab. 3. Odhad střední vzdálenosti mezi oběma haplotypovými skupinami v rámci ČR.

A Haplotypy skupiny A Haplotypy skupiny B

S.E.

LABE

B

0,010 0,060

Tab. 4. Odhad střední vzdálenosti uvnitř haplotypových skupin v rámci ČR s uvedením celkových počtů jedinců ve skupině a počtu nalezených haplotypů. Haplotypy skupiny: A B celkem 96 54 42 Počet jedinců Počet haplotypů ve 11 6 5 skupině Vzdálenost uvnitř skupiny 0,007 0,006 0,006 S.E. 0,002 0,002 0,002

Z tabulek 3 a 4 lze vyčíst, že obě skupiny haplotypů jsou od sebe vzdáleny 6%, což značí relativně podstatný rozdíl, který byl patrný již z haplotypových sítí. Pomocí odhadu časové divergence (uvedeno v metodice) bylo odhadnuto, že se obě skupiny od sebe oddělily již před 2 – 2,8 milióny let. Zároveň ale obě skupiny haplotypů vykazují podobnou míru vnitřní heterogenity. Haplotypy skupiny A byly v analyzovaných vzorcích početnější a skupina obsahovala celkem 6 haplotypů, což je o jeden více než skupina B, která měla i o něco menší heterogenitu, rozdíl je však minimální. V tabulce 5 jsou uvedeny odhady středních vzdáleností mezi evropskými skupinami haplotypů, které byly stanoveny na základě haplotypové sítě z obrázku 13. Jsou v nich samozřejmě pod písmenem A a B zahrnuty i populace z České republiky. Nejvíce se od všech ostatních skupin odlišují G a F (Řecko a Libanon). Skupina G se od ostatních liší od 15,9 % do 26 %, skupina F od 20,5 % do 26 %. Stáří divergence obou skupin od ostatních je odhadováno na dobu před 7,32 až 11,76 (pro skupinu G) a 7,08 až 11,76 milióny lety (pro skupinu F). Od slovinské skupiny haplotypů C, která má podle zjištěných výsledků nejspíše velmi blízko k centru divergence druhu P. coxalis, se ze skupin haplotypů vyskytujících se na území České republiky zhruba před 1,8 – 2,76 miliónů let oddělila skupina A, posléze asi před 1,12 – 2,08 miliónů let skupina B.

38

Výsledky

Tab. 5. Odhad střední vzdálenosti mezi evropskými haplotypovými skupinami. A

Skupina haplotypů A Skupina haplotypů B Skupina haplotypů C Skupina haplotypů D Skupina haplotypů E Skupina haplotypů F Skupina haplotypů G Skupina haplotypů H Skupina haplotypů I

0,060 0,057 0,071 0,059 0,213 0,214 0,065 0,062

B

C

D

E

F

G

H

I

0,012

0,012 0,010

0,014 0,010 0,011

0,012 0,011 0,007 0,011

0,029 0,028 0,030 0,029 0,029

0,030 0,026 0,026 0,027 0,025 0,034

0,013 0,010 0,009 0,012 0,009 0,030 0,024

0,013 0,011 0,009 0,013 0,009 0,030 0,025 0,010

0,040 0,039 0,050 0,205 0,178 0,041 0,050

0,045 0,022 0,219 0,179 0,034 0,036

0,049 0,220 0,181 0,049 0,060

0,216 0,165 0,032 0,034

0,260 0,224 0,216

0,159 0,170

0,039

4.4 Vnitropopulační variabilita Na 5 z celkem 27 lokalit byl nalezen a následně do analýz zahrnut pouze jediný exemplář druhu P. coxalis. Na ostatních lokalitách bylo odebráno více jedinců. Nejvíce (8) jedinců bylo do genetických analýz zahrnuto z lokality Týniště. Všichni jedinci měli stejný haplotyp Aa. Pouze tento haplotyp byl společný také pro všechny jedince z populací Tvrdonice 9 (5 jedinců) a Tvrdonice 13 (4 jedinci). Naopak z B skupiny měli jediný haplotyp Ba společný všichni jedinci ze severu Čech z řeky Ploučnice (lokalita Boreček). Haplotyp Bb byl společný všem 3 analyzovaným jedincům z lokality Roudné na Malši. V tabulce 6 je uveden celkový soupis jedinců zahrnutých do analýz s uvedeným typem a četností jednotlivých haplotypů. Názvy všech haplotypů z území České republiky byly stanoveny na základě haplotypové sítě, která je součástí příloh. Jednotlivé haplotypy jsou uvedeny u všech analyzovaných vzorků v celkové tabulce v přílohách. kód lokality

Tab. 6. Tabulka shrnující počet jedinců a počet a typ všech haplotypů na jednotlivých lokalitách, rozdělených podle povodí.

LABor LACer LALba LALib LASmi LAVal LAZab ORTys ORKos OHBoh OHKav MOHej MOMor MOStr MOTvd MOTvr DYPri DYSou VLBak VLBel VLHal VLLuz VLPor VLRou VLTus VLZel VLZev

počet počet jedinců haplotypů Povodí LABE Boreček 5 1 Černínovsko 5 3 Libický luh 3 1 Liblice 2 2 Smiřice 5 3 Valy 1 1 Záboří nad Labem 3 3 2 Týniště 8 1 Kostelec nad Orlicí 2 1 Bohušovice 1 1 Karlovy Vary 1 1 Povodí MORAVY Hejtmanka 5 2 Morava 1 1 Střeň 5 3 Tvrdonice 9 5 1 Tvrdonice 13 4 2 Přítluky 04 - Dyje 3 2 Soutok Dyje 2 1 Povodí VLTAVY Hobšovice 2 1 Bělá 5 2 Halámky 7 2 Lužnice 4 2 Poříčí 3 2 Roudné 3 1 Tušť 5 2 Zelčín 1 1 Brtná - Želiv, Trnava 5 3 lokalita

haplotypy Ba Aa(2), Ba(2), Bd Bc Aa, Ba Aa(3), Bc, Bd Ba Aa, Ab(2) Aa Ba Ba Ba Ab(3), Bb(2) Aa Ab(2),Ad(2), Bb Aa Aa(3), Ae Ab, Bb(2) Bb Ac Aa(4), Af Ab(5), Ba(2) Ba(3), Bb Ab, Be(2) Bb(3) Ab(3), Ba(2) Aa Ab(2), Ba, Bb(2)

39

Výsledky

4.5 Migrační tůňka Pokus s migrační tůňkou zastává v této práci pouze doplňující informaci. Jeho cílem bylo zjistit, zdali jsou berušky vodní (Asellus aquaticus) schopny vlivem stresových podmínek (vysychání biotopu) aktivní migrace za účelem osídlit novou vodní plochu. Během 12, v opakování během 14 dní, byla sledována migrační tůňka (popsáno v metodice), až do doby, než došlo k jejímu vyschnutí. Časové intervaly jsou jiné z důvodu odlišného vývoje počasí, kdy tůňka vysychala s rozdílnou rychlostí. A to i přesto, že byla její hladina upravována, aby vysychání bylo co nejplynulejší. V průběhu pokusu byl zaznamenáván vývoj chemicko-fyzikální parametrů vody, které jsou shrnuty v tabulce 7. Poslední dny pokusu již nebylo možné kvůli velmi malému objemu vody parametry změřit. V průběhu pokusu nebyl nalezen žádný jedince A. aquaticus v zemní pasti (kontrola 2x denně), umístěné po obvodu sledovaného území. Po skončení celého pokusu bylo v tůňce z původního počtu 100 nalezeno nejdříve 94, v opakování pak 96 jedinců. Někteří byli úplně vyschlí. Ovšem asi třetina jedinců, kteří vykazovali alespoň malé známky života, se po vložení do vody začala aktivně pohybovat, bez náznaků poškození. Nebylo tedy prokázáno, že by jedinci A. aquaticus byli schopni aktivní disperze přes souš za účelem osidlování nových vodních ploch. Rozdíl v počtu nenalezených berušek vodních je výsledkem spíše lidské chyby (mohlo snadno dojít k přehlédnutí vyschlého jedince), než důsledkem jejich vycestování z tůňky. Poměrné zastoupení nalezených a nenalezených berušek vodních je znázorněno na obrázcích 18 a 19.

Tab. 7. Vývoj fyzikálně-chemických parametrů vody v migrační tůňce v průběhu pokusu.

Den 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

40

pH 7,6 7,7 7,9 7,8 7,6 8,4 7,9 8,8 8,4 9,8 N N

1. pozorování teplota konduktivita Hladina °C μS vody / cm 21,4 660 12,0 20,2 690 12,0 21,8 713 10,0 19,3 805 9,0 21,4 660 7,5 21,0 653 6,0 20,7 892 4,0 18,4 967 4,0 19,2 867 3,5 19,6 1243 2,0 N N 0 N N 0

Den 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

pH 7,6 7,8 7,6 8,0 7,9 8,1 8,1 7,9 8,5 9,0 9,5 10,2 N N

2. pozorování teplota konduktivita Hladina °C μS vody / cm 15,1 890 11,0 15,2 868 12,0 16,0 853 10,0 16,8 600 8,0 16,5 730 7,5 17,6 659 7,5 17,0 697 6,0 15,5 630 5,0 15,8 1279 3,0 16,8 1543 3,5 17,0 984 2,0 17,2 1196 1,5 N N 0 N N 0

Výsledky

Obr. 18. Graf počtu nalezených a nenalezených berušek vodních, 1. pozorování. 1. pozorování Tůňka 94 Zemní pasti 0 Nenalezeno 6

Tůňka Nenalezeno

Obr. 19. Graf počtu nalezených a nenalezených berušek vodních, 2. pozorování. 2. pozorování Tůňka 96 Zemní pasti 0 Nenalezeno 4

Tůňka Nenalezeno

41

Diskuze

5. Diskuze Tato práce představuje prvotní pokus o přiblížení fylogeografie druhu Proasellus coxalis, na základě molekulárních dat získaných z genu pro COI a 28S. V kombinaci s využitím přístupných dat, jež byly součástí dvou vědeckých studií (Morvan et al. 2013; Verovnik et al. 2005), se snaží přiblížit vztahy populací P. coxalis z území České republiky s populacemi z evropské a mediteránní oblasti. Podrobně se pak věnuje situaci na území České republiky. Jelikož se P. coxalis považuje za druh nepůvodní, předkládaná práce se pomocí fylogeografie pokusí dokumentovat jeho možné invazní cesty. Již v úvodu byla probírána schopnost disperze vodních organismů, která má významný vliv na jejich distribuci (Bilton et al. 2001; Malmqvist 2002; Panov et al. 2004). Především ve 20. a 21. století hraje významnou roli v disperzi vodních organismů také činnost člověka. Mimo jiné, zejména propojení dříve přirozeně oddělených povodí plavebními kanály a transport v balastní vodě (nejen) zaoceánských lodí umožňující disperzi nepůvodních organismů na nová území (Gherardi et al. 2009; Leppäkoski et al. 2002). Avšak, kromě schopnosti disperze ovlivnily současnou distribuci organismů na evropském kontinentě také čtvrtohorní glaciální cykly (Hewitt 1996). Současný výskyt P. coxalis v České republice může být tedy ovlivněn hned několika faktory.

P. coxalis v rámci Evropy a mediteránní oblasti Druh P. coxalis bývá často členěn do mnoha geograficky ohraničených poddruhů, jak bylo popsáno v úvodu (Herhaus 1977; Stoch 1996). Molekulární data promítnutá do haplotypové sítě spolu s mapou Evropy na obrázku 13 tuto skutečnost naznačují. Síť sestává z jasně oddělených dlouhých větví, na jejichž koncích se nacházejí jeden či více nedávno oddělených haplotypů. Ty jsou zřetelně lokalizované do různých míst Evropy a mediteránní oblasti (opomineme-li haplotypy skupiny A a B, které budou dále diskutovány). Dlouhé větve v síti značí, že haplotypy se na dané lokalitě nacházejí již delší dobu a jejich rozdílnost, spolu s jasným geografickým vymezením a v kombinaci s morfologickými odlišnostmi pak potvrzují členění na jednotlivé poddruhy (Walker & Avise 1998). Na obrázku 20 znázorňují mapy geografické rozmístění jednotlivých poddruhů P. coxalis, které publikoval Herhaus (1977) a lokalizaci haplotypových skupin na mapě Evropy, která byla prezentována v kapitole Výsledky. Z obrázku je zřejmé, že výskyt jednotlivých skupin haplotypů v odlišných geografických areálech by mohl reflektovat rozšíření poddruhů. Ačkoli nemáme k dispozici materiál k morfologickému porovnání, mohli bychom se podle těchto map pokusit určit některé poddruhy.

42

Diskuze

Obr. 20. Mapa geografického rozmístění poddruhů P. coxalis a mapa výskytu haplotypů P. coxalis. Čísla na mapě označují následující poddruhy: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.

P. coxalis coxalis P. coxalis cyrenaicus P. coxalis africanus P. coxalis peyerimhoffi (Madeira): P. coxalis perarmatus (Remy, 1936) P. coxalis gabriellae P. coxalis banyulensis P. coxalis italicus P. coxalis polychaetus P. coxalis dudichi P. coxalis wolfi P. coxalis sardous

13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23.

P. gardinii P. coxalis lucifugus P. karamani P. coxalis corcyracus P. coxalis epiroticus P. coxalis leucadius P. coxalis cephallenus P. coxalis rhodiensis P. coxalis ciliciensis P. coxalis peregrinus P. coxalis septentrionalis

Mapa na levé straně byla upravena podle Herhaus (1977), mapa na pravé straně je součástí výsledků této práce. Uvedené názvy poddruhů pocházejí ze starší publikace a některé poddruhy byly od té doby vyčleněny, jako např. P. banyulensis (viz níže), jiné naopak nově popsány. Ovšem v této diskuzi si vystačíme i s nepřesnými daty. Nejvíce odlišný haplotyp F (žlutá barva), který byl sebrán v Libanonu, by mohl vlastnit poddruh pod číslem 1: P. coxalis coxalis. Tento poddruh Stoch (1989) vyčlenil jako typického zástupce druhu a používal ho při sporných momentech determinace. Například na základě porovnávání s ním vyčlenil P. coxalis banyulensis do samotného druhu P. banyulensis. Další, nejvíce se odlišující haplotyp, pochází z Řecka. Na tomto území se však vyskytují hned 4 poddruhy. Na severu Afriky se z analyzovaných haplotypů vyčlenily 2 skupiny, na tomto území jsou taktéž zaznamenány 2 poddruhy: P. coxalis peyerimhoffi (č. 4) a P. coxalis africanus (č. 3). Chorvatské populace, které pocházely z opačných konců země a každá měla jiný haplotyp, by mohly odpovídat poddruhům P. coxalis lucifugus (14) a P. karamani (15). Rozpor však nastává na území Itálie, Francie a Španělska. Ačkoli z těchto lokalit máme k dispozici větší množství dat, vyskytovala se zde jediná skupina haplotypů. Ovšem na mapě je vyznačeno více poddruhů. To by odpovídalo tvrzení, které uvádí Gerecke et al. (2005): v Evropě (zahrnuje i Itálii) se druh P. coxalis vůbec nevyskytuje a tyto populace řadí pouze do druhu P. banyulensis (Stoch 1989). Ve střední Evropě jsou na mapce zakresleny dva poddruhy, Herhaus 43

Diskuze

(1977) je ale v publikaci, z níž mapa pochází, řadí do jednoho poddruhu (P. coxalis septentrionalis). Při pohledu na mapy se zdá být pravděpodobné, že „růžová linie“ by tedy mohla představovat P. (c). banyulensis, „modrá linie“ (zde zastoupená populacemi jen z České republiky a jedincem ze Švédska) pak P. c. septentrionalis. Na fylogenetické rozhodnutí, zdali se skutečně jedná o druh P. banyulensis či obě linie tvoří poddruhy P. coxalis, není k dispozici mnoho dat, předešlé determinační práce byly založené pouze na morfologii. Ve chvíli, kdy budou publikovány kompletní výsledky fylogenetické studie rodu Proasellus, kterou v současné době provádějí Campanaro et al (2004), bude možné taxonomické rozhodnutí učinit. Haplotypy z území Libanonu a Řecka jsou podle odhadu stáří divergence (jenž byl stanoven na základě hodnoty rychlosti divergence genu pro COI, k níž dospěl Ketmaier et al. (2003), viz kapitola Metodika) od ostatních vzdáleny přibližně 8,2–10,4 a 6,36–10,4 miliónů let. Pro vytvoření silné reprodukční izolace mezi dvěma vzdálenými populacemi uvádějí Knowlton et al. (1993) minimální požadovanou dobu 3–3,5 milióny let. Na základě těchto údajů lze předpokládat velmi dávnou kolonizaci území druhem P. coxalis a značnou izolovanost daných populací. Také fylogenetický strom genu 28S (obr. 17), ve kterém se oddělily právě populace z Libanonu a Řecka, potvrzuje, že tyto populace nejsou již dlouhou dobu v kontaktu s ostatními z mediteránní oblasti. Ve fylogenetickém stromě genu 28S (obr. 17) můžeme pozorovat oddělení i slovinské populace. K vyčlenění populací z Dinárského krasu na základě analýz genu 28S dospěli také Verovnik et al. (2005) ve fylogeografické studii druhu Asellus aquaticus. Situace je zapříčiněna chybějícím genovým tokem mezi populacemi, tudíž jejich izolovaností. Území Dinárského krasu se vyznačuje rozsáhlým výskytem krasových útvarů, které svým vznikem způsobily právě genetickou izolaci populací žijících na tomto území (Verovnik et al. 2005). Hypotézu Dinárského krasu, jakožto důležitého refugia vodních organismů, podporuje i značný výskyt endemických druhů na daném území (Sket 1999). Populace A. aquaticus z jižní a střední Evropy byly v rámci genu 28S naopak uniformní, díky nedávnému genovému toku, který vyžaduje alespoň minimální kontakt mezi populacemi (Verovnik et al. 2005). Podobná situace mohla nastat u P. coxalis. Analýza genu 28S vyčlenila populace z Libanonu a Řecka, které se již na základě analýz genu pro COI značně odlišovaly od ostatních haplotypů, jak bylo popsáno výše. Také se oddělila právě skupina haplotypů z území Slovinska, zatímco ostatní populace z Chorvatska, Alžírska, Francie a České republiky byly uniformní, nejspíše díky relativně nedávnému genovému toku, který mezi těmito populacemi probíhal. Vzhledem ke svému umístění ve fylogenetickém stromě genu 28S a díky své pozici v haplotypové síti by bylo možné se domnívat, že populace z území Slovinska v minulosti hrály významnou roli jako centrum radiace druhu P. coxalis. Tuto skutečnost by potvrzoval fakt, že i pro jiné druhy je území Slovinska důležitým centrem jejich evoluční historie, například pro dva druhy raků rodu Austropotamobius (Trontelj et al. 2005) či pro již zmiňovaný druh A. aquaticus (Verovnik et al. 2005). Ačkoli, ve zmíněných studií (Trontelj et al. 2005; Verovnik et al. 2005) bylo v dané oblasti nelezeno velké množství haplotypů. Tato práce má k dispozici omezené množství

44

Diskuze

dat, na jejichž základě nelze významnou roli populací P. coxalis z této oblasti ve fylogenezi druhu jednoznačně potvrdit. Zjištěné střední genetické vzdálenosti mezi jednotlivými skupinami haplotypů se pohybovaly od 2,2% až do 26%. Průměrná genetická distance například mezi poddruhy mouchy Glossina palpalis dosahuje (gen pro COI) hodnoty 6,6%, zatímco pro poddruhy Glossina fuscipes má hodnotu jen 2% (Dyer et al. 2008). U korýšů se hodnota genetické distance (v rámci genu pro COI) určující hranici mezi druhy nejčastěji pohybuje mezi 16-32% (Hebert et al. 2003). Hranice k rozlišení druhů mezi kryptickými podzemními druhy blešivců byla definována na 16% genetické distance (Lefébure et al. 2006). O něco vyšší hodnota - 22,1-23,6% byla zjištěna u poddruhů Lepidurus apus, které byly posléze rozděleny do samotných druhů (Vanschoenwinkel et al. 2012). Další kryptická linie, například u perloočky patřící do komplexu Daphnia longispina, neměla hodnotu genetické distance menší než 12,4% (Petrusek et al. 2012). U bezkrunýřky rodu Vejdovskybathynella jsou sekvence genu pro COI vzdáleny 14-17% (Camacho et al. 2011). Genetické distance velkých haplotypových skupin u A. aquaticus, který je také členěn do několika poddruhů, jsou relativně podobné hodnotám zjištěným v této práci, pohybují se od 10,8% mezi Dinárským krasem a centrální Evropskou skupinou do 21,6% mezi ukrajinskou skupinou a evropskými haplotypy (Verovnik et al. 2005). Na základě poměrně velkých genetických rozdílů zjištěných u P. coxalis (2,2 – 26 %) se zdá být tedy pravděpodobné, že některým haplotypovým skupinám minimálně statut poddruhů přísluší. Nejnovější studie, zaměřená na dynamiku diversifikace nadčeledi Aselloidea (Morvan et al. 2013) dokládá, že celá nadčeleď představuje velmi starou linii, její diversifikace začala již v pozdním devonu, asi před 374 milióny let. Studie potvrdila členění rodu Proasellus na odlišné morfologické linie. Na základě těchto výsledků může být dřívějších 8 morfologických linií nyní členěno do 4 hlavních fylogenetických linií: slavus, coxalis, alpinská linie a ibersko-aquitanianská linie (oblast Pyrenejského poloostrova). Proasellus coxalis představuje jednu celou fylogenetickou linii a potvrdila se správnost dřívějšího zavedení skupiny druhů P. coxalis. Rod Proasellus začal diversifikovat ve svrchní juře (před 145 - 167milióny let), tyto 4 linie se objevily velmi brzy po oddělení rodu a jejich vztah k ostatním rodům čeledi Asellidae se dá podle Morvan et al. (2013) jen velmi těžko vysvětlit, přičemž linie coxalis začala diverzifikovat nejdříve ze všech. V celé čeledi byly objeveny jen 2 případy parafyletických rodů. Jedním z nich je Chthonasellus bodoni, představuje pravděpodobně morfologicky odvozený druh, který patří právě do rodu Proasellus. U rodu Proasellus s v ibersko-aquitanianské linii také objevilo 7 z celkově 8 parapatrických distribucí mezi nadzemními a podzemními sesterskými druhy (další byla jen u rodu Bragasellus).

Invazní cesty P. coxalis do České republiky Ačkoli se v oblasti Středozemního moře vyskytuje množství geograficky jasně vymezených haplotypů, situace v jižní, střední a severní Evropě je značně rozdílná. Na obrázku 13 je patrné, že je toto rozsáhlé území geneticky daleko jednotnější. Vyskytují se zde pouze 2 skupiny haplotypů, 45

Diskuze

přičemž jedna byla nalezena jen na území České republiky a Švédska. Jak již bylo popsáno v úvodu, druh P. coxalis má původní areál rozšíření v mediteránní oblasti (Gruner 1965), což bylo ostatně již dokumentováno výše. Ve střední a severní Evropě se považuje za druh nepůvodní (např. Tittizer et al. 2000) a jeho rozšíření do těchto geografických celků se předpokládá díky rozšířené vnitrozemské lodní dopravě skrze člověkem vybudované plavební kanály, jež propojují velké evropské řeky (Galil et al. 2007; Tittizer et al. 2000). Tyto invazní cesty se dají logicky odvodit podle datování a umístění prvních nálezů a i podle dalšího výskytu P. coxalis v Evropě. Na základě analýzy genu pro COI, jež je prezentovaná na obrázku 13, jasně vyplývá, že populace z jihu Evropy sdílí stejné haplotypy s populacemi z Německa, Nizozemí, České republiky i Švédska. Vzhledem k lokalizaci těchto shodných haplotypů na jihu Francie, severu Španělska, Korsice a v Itálii lze potvrdit, že P. coxalis využil západního koridoru vzniklého propojením řek Rhôna a Rýn a dále plavebních kanálů propojujících Rýn s Labem ke své invazi do střední a severní Evropy. Tedy cestu, kterou popsali např. Tittizer et al. (2000). Na základě výsledků této práce tak lze dokázat, že část populací P. coxalis se v České republice vyskytuje díky recentní invazi, jež byla umožněná lidskou činností. Invazní cesta byla pomocí molekulárních dat potvrzena také například u pontokaspického druhu Limnomysis benedeni. Ten, podobně jako P. coxalis, v populacích na nepůvodním území sdílel větší množství shodných haplotypů s populacemi z původního areálu výskytu (Audzijonyte et al. 2009). Naopak u dalšího pontokaspického druhu, různonožce Echinogammarus ischnus, se v populacích v nepůvodním areálu vyskytovaly pouze dva haplotypy (Cristescu et al. 2004). Rozdílná genetická diverzita populací nepůvodních druhů souvisí zaprvé s charakterem invaze (jestli se daný organismus na nové lokality rozšířil díky jednorázovému zavlečení, nebo díky opakujícím se či kontinuálním invazím) za druhé s genetickou strukturou populací v areálech původního rozšíření (Audzijonyte et al. 2009). A tak zatímco v případě L. benedeni se v nepůvodních areálech vyskytují jedinci s různými haplotypy, které navíc náleží k různým haplotypovým skupinám, v případě P. coxalis bylo v populacích z Francie, Itálie a Španělska zjištěno sice více haplotypů, ale všechny tvoří jedinou skupinu (B). V českých populacích se pak z této skupiny (B) vyskytuje ne jediný, ale více haplotypů. Což může značit víceméně kontinuální genový tok, který ovšem může být do jisté míry trochu omezený. Srovnáme-li haplotypové mapy z obrázku 13 a 14, je patrné, že pokud byly do sítě začleněny evropské populace (obr. 13), čítala skupina B více haplotypů, než v případě sestrojení haplotypové sítě pouze z českých populací (obr. 14). Horecký & Špaček (2007) se domnívají, že by se P. coxalis mohl v České republice vyskytovat, spíše než v důsledku propojení vodních cest, buď zavlečením spolu s dovozem vodního ptactva z oblasti Středozemního moře či západní Evropy, nebo díky přirozené pasivní disperzi na tažném vodním ptactvu. Tyto hypotézy dokládají skutečností, že první nálezy z území České republiky se uskutečnily asi o 30 let dříve, než kdy byl P. coxalis zaznamenám v Německu v povodí Labe. Dále, že první nálezy na našem území pocházejí z horní části povodí Vltavy a Moravy (datování uvedeno v kapitole Úvod). V neposlední řadě zmiňují polohu České republiky, která leží

46

Diskuze

na migračních cestách tažného vodního ptactva, mezi původním (mediteránní oblast) a sekundárním (úmoří Severního moře) areálem výskytu. Zavlečení s dovezeným vodním ptactvem zajisté nemůžeme vyloučit, zároveň ho na základě zjištěných dat nelze ani potvrdit. Ačkoli se teoreticky takovéto zavlečení mohlo udát, zajisté by to ale nemohla být jediná cesta, kterou se k nám P. coxalis dostal. V tom případě by totiž musely být populace v České republice spíše uniformní, s menším počtem haplotypů, jak tomu bylo u výše zmiňovaného různonožce E. ischnus (Cristescu et al. 2004) a nejspíše by nešlo k pokrytí víceméně celého území České republiky. V úvodu byl zmiňován experiment, dokazující možnost pasivní disperze blešivce na kachním peří (Segerstråle 1954). V případě P. coxalis či velmi podobného druhu A. aquaticus takovýto přenos pozorován nebyl, ani nebyl uskutečněn experiment k prokázání či vyloučení přenosu na vodním ptactvu. Avšak vzhledem k relativně podobné konstituci i velikosti těla druhů P. coxalis a Gammarus lacustris se takovýto přenos i v případě P. coxalis nezdá být nemožný. Ovšem na druhou stranu, již v samotném experimentu, který prováděl Segerstråle (1954), druhý zkoumaný blešivec, G. pulex, takovéhoto přenosu schopen nebyl. Další otázkou je, zdali by P. coxalis byl schopen překonat úskalí disperze na dlouhé vzdálenosti (Figuerola & Green 2002a). Jak uvádí Horecký & Špaček (2007), poloha České republiky opravdu leží na migračních trasách tažného vodního ptactva (vyplývá to např. ze studie Wesselingh et al. 1999). Za předpokladu, že by P. coxalis byl schopen disperze díky vodnímu ptactvu i na dlouhé vzdálenosti, měla by být genetická struktura populace na takto propojených lokalitách velmi podobná. Jako tomu je např. u druhu Daphnia laevis, jehož populace si jsou geneticky podobnější právě na lokalitách, kterými vedou migrační trasy vodních ptáků (Taylor et al. 1998). Data z této práce ovšem takovouto disperzi nenaznačují. Na území České republiky se vyskytují dvě poměrně odlišné haplotypové skupiny (obr. 13 a 14), zde rozlišovány jako A a B (toto zjištění bude dále diskutováno níže), z nichž se pouze jedna vyskytuje v jižní Evropě (B). Pokud by se P. coxalis na naše území šířil přirozeně výše zmíněným způsobem, v populacích jižní Evropy by se měly vyskytovat i haplotypy skupiny A, ovšem tomu tak není. Je sice možné, že by tyto haplotypy mohly uniknout vzorkování, které prováděli Morvan et al. (2013), z jejichž studie dané sekvence z Evropy pocházejí, ovšem tato situace je při relativně dostatečném množství sekvencí z dané oblasti velmi nepravděpodobná. Další možností, kdy by disperze pomocí vodních ptáků mohla probíhat a daná genetická data by tomu nenasvědčovala, je, že jedinci s haplotypy skupiny A, by se v populacích v jižní Evropě nemohli realizovat v důsledku již zaplněné ekologické niky silnějšími populacemi z jižních oblastí. Takovéto úvahy se ovšem pohybují na velmi vratké rovině a nejsou podloženy žádnými důkazy. Zůstaňme proto u sdělení, že přirozená pasivní disperze tažným vodním ptactvem je na základě zjištěných dat, jež tato práce předkládá, velmi nepravděpodobná. Dalším druhem, který pochází z oblasti Středozemního moře, je sladkovodní krevetka Desmarestova (Atyaephyra desmarestii). V České republice byl výskyt poprvé zaznamenán až v roce 2007 (Straka & Špaček 2009). Podobně jako P. coxalis se do západní Evropy šíří cestami lodní dopravy (Tittizer et al. 2000). Nejbližší místo výskytu je od lokality nálezu v České republice 47

Diskuze

vzdáleno 500 km po proudu. Je proto pravděpodobné, že se k nám nedostala aktivní migrací, ale spíše pouze zavlečením lidskou činností, například s balastní vodou (Straka & Špaček 2009). Dalším stejnonožcem rodu Proasellus, který se šíří do střední Evropy (byl zavlečen také na Britské ostrovy), je P. meridianus. Původní rozšíření má v západní Evropě (Gruner 1965, Tittizer et al. 2000). Do ostatních částí Francie se pravděpodobně dostal díky kanálům spojujícím řeky Rhônu, Saônu a Seinu a do střední Evropy přes kanál Rhôna-Rýn, podobně jako P. coxalis (Leuven et al. 2009; Tittizer et al. 2000). Oproti němu však P. meridianus na území České republiky zaznamenán nebyl. V Německu byl zatím pozorován jen v řekách Saare a Rýn a to v malých početnostech (Tittizer et al 2000). Z Nizozemska pocházejí záznamy, že ačkoli se běžně vyskytuje společně s druhem A. aquaticus, P. meridianus mu nekonkuruje, ale přizpůsobuje se mu. Na rozdíl od A. aquaticus neobývá znečištěné vody (Wolff 1973). Je otázkou, zdali k nám opravdu ještě nedorazil (to by potvrzovaly jen řídké nálezy v Německu), nebo díky své podobnosti s A. aquaticus zatím pouze uniká pozornosti, podobně jako P. coxalis (viz úvod a také níže v textu).

Fylogeografie P. coxalis v České republice Jak již bylo řečeno, na území České republiky se vyskytují dvě skupiny haplotypů – A a B. Jejich vztah, společně s frekvencí výskytu obou skupin haplotypů je znázorněn na obrázku 14. Zatímco haplotypy skupiny B se vyskytují i v jižní, střední a severní Evropě (popsáno výše, obrázek 13), haplotypy skupiny A byly zaznamenány pouze u populací na území České republiky, s výjimkou jednoho jedince z jižního Švédska. Ten sdílel haplotyp skupiny A společně s další jedincem z území České republiky. Výskyt dvou jasně oddělených větví, které se od sebe oddělily přibližně před 2,0 - 2,8 milióny lety a z nichž se jedna vůbec nevyskytuje v jižním areálu, okolo Středozemního moře, je sice překvapivý, nicméně, na základě domněnek některých autorů, ne zcela nečekaný. Herhaus (1977) ve své studii kromě antropogenního zavlečení P. coxalis do střední Evropy plavebními kanály či například s vodními rostlinami (což je podobný případ jako zavlečení s importovaným vodním ptactvem, jež bylo diskutováno výše) uvádí ještě druhou hypotézu, kterou je přirozené aktivní „přicestování v historické době“. Domnívá se, že tento druh mohl do střední Evropy přirozeně expandovat na konci pliocénu či brzkým začátkem pleistocénu, což je období přibližně před 1,8 – 3,6 milióny lety. V této době byl jih a sever Evropy propojen říčním systémem

Rhôna-Rýn-Dunaj.

Později

bylo

spojení

přerušeno

vytvořením

přirozeným

geografických hranic. (Které jsou dnes vlivem lidské činnosti zničeny.) Tato domněnka byla o několik let později podpořena také kolektivem italských vědců Ketmaier et al. (2001), kteří datovali oddělení populací ze Sardinie a centrální Itálie od pravděpodobného jordánského předka (z rodu Proasellus) do konce miocénu (přibližně před 5,3 – 7,2 milióny let; datování historických epoch čerpáno z portálu Mezinárodní komise pro stratigrafii, ICS). Souhlasí tak s hypotézou, jež předložil Herhaus (1977), tedy s šířením rodu Proasellus do Evropy během terciéru. Datování divergence obou skupin haplotypů, jež se vyskytují na území České republiky, je odhadováno 48

Diskuze

přibližně do doby před 2,0 – 2,8 milióny let a oddělení skupiny haplotypů A (potencionálně původní ve střední Evropě) od skupiny C (haplotypy z území Slovinska) se událo zhruba před 1,8 – 2,76 milióny let, což odpovídá hranici konce pliocénu a začátku pleistocénu. Také Gerecke et al. (2005) považují rod Proasellus ve střední Evropě za původní a předpokládají jeho široké rozšíření, ovšem tyto jedince řadí do druhu P. banyulensis, jak bylo uvedeno výše. Již bylo podotknuto, že Horecký & Špaček (2007) vzhledem k celkem časným nálezů P. coxalis na území České republiky zpochybňovali jeho šíření především skrze plavební kanály. Úplné propojení mediteránní oblasti s Labem je dokončeno až v roce 1938, kdy byl otevřen Středozemní kanál (č. 7 na obrázku 1). Ten, díky dalším dvěma kanálům, spojuje Rýn s Labem. První datovaný nález u nás pochází již z roku 1947 (tedy 9 let po otevření Středozemního kanálu), a to z horního toku Vltavy u Veselí nad Lužnicí. Při pohledu na obrázek 14 je zřejmé, že obě skupiny haplotypů na řece Lužnici (horní tok Vltavy) jsou zastoupeny zhruba v podobném poměru. Nepřevládají haplotypy skupiny B, jež se vyskytují v jižní Evropě a je tedy možné, že právě první nálezy by mohly spadat do haplotypové skupiny A. Tato větev by potenciálně mohla zastupovat jedince P. coxalis, kteří se na našem území nevyskytují díky recentní invazi z oblasti Středozemního moře, nýbrž mohou být díky expanzi v dávné době historickou součástí fauny České republiky. Horecký et al. (2006) uvádí, že v minulosti zřejmě mohlo docházet k častým záměnám P. coxalis za druh velmi podobný a u nás hojný – A. aquaticus, a proto mohl zůstat dlouho nepovšimnut. To je velmi pravděpodobné, navíc vzhledem k širokému výskytu A. aquaticus, jehož populace bývají i značně početné, se může tento druh zdát být „nezajímavý“. P. coxalis, který koexistuje s A. aquaticus a v našich podmínkách tvoří jen velmi výjimečně dominantní taxon (Flössner 1987; Horecký & Špaček 2007; vlastní pozorování), tak může snadno unikat pozornosti. Rozmístění obou skupin haplotypů A a B v rámci České republiky by mohlo naznačovat jejich odlišný původ. Při pohledu na obrázek 14 si můžeme všimnout, že ačkoli jsou frekvence výskytu obou skupiny haplotypů víceméně vyrovnané, přeci jen haplotypy skupiny A převládají. V povodí Labe je sice skupina B početnější, to se ale dá vysvětlit jeho těsnějším propojením s mediteránní oblastí. V povodí Vltavy již převažují haplotypy skupiny A. Zcela jiná je situace v povodí Moravy, kde se ze skupiny B vyskytuje pouze jediný haplotyp a celkově převažují haplotypy skupiny A (obr. 15 a 16). Z obrázku 16 dále vyplývá, že haplotypy skupiny A jsou v jednotlivých povodích zastoupeny rovnoměrněji. Tyto údaje by tak mohly potvrzovat, že haplotypy skupiny B pocházejí z recentní invaze, zatímco příchod jedinců vlastnících haplotypy skupiny A na území České republiky sahá do daleko dávnější historie. Ketmaier et al. (2001) při studii P. coxalis v Itálii, Sardínii a Jordánsku vyjádřil pochybnosti nad přítomností P. coxalis v Evropě a raději italské populace řadí, stejně jako Stoch et al. (1996), do druhu P. banyulensis. S čímž nesouhlasí Argano & Campanaro (2004) a navrhují raději minimálně italské populace a populace ze Sardinie (předmět jejich studie), řadit do komplexu druhů P. coxalis (P. coxalis - group). Na základě alozymových dat Ketmaier (2002) uvádí značnou genetickou rozdílnost italských populací, které v této studii řadí již do zmíněného komplexu druhů 49

Diskuze

P. coxalis. Značné genetické rozdíly mezi populacemi vysvětluje několika po sobě jdoucími kolonizačními vlnami italského území. V současné době probíhá rozsáhlá fylogenetická studie celého rodu Proasellus, jejíž prvotní výsledky naznačují, že přes značné genetické rozdíly si jsou populace rodu Proasellus morfologicky velmi podobné a pro nedostatek diagnostických znaků se řadí právě do komplexu druhů P. coxalis (Campanaro et al. 2004). Tyto údaje byly již uvedeny v úvodu, ale vzhledem ke složitosti vztahů bylo vhodné je připomenout. Ačkoli se tedy uvádí, že italské populace P. coxalis jsou geneticky značně rozdílné (Ketmaier 2002), data z této oblasti (Itálie, Korsika), které máme k dispozici ze studie Morvan et al. (2013), tomu nenasvědčují. Všechny populace se zařadily do haplotypové skupiny B. Nabízí se otázka, zdali se haplotypy skupiny A nevyskytují právě na tomto geneticky heterogenním území? Do České republiky by byly zavlečeny také díky recentní invazi přes plavební kanály a pouze náhodou by se mezi jedinci, kteří byli do genetických analýz zařazeni, nevyskytli ti s haplotypem A? Na druhou stranu, dat z jižní Francie a severního Španělska bylo celkem velké množství a proto se tato hypotéza zdá být nepravděpodobná. Že se haplotypy skupiny A neobjevily ani na území Německa, může být naopak způsobeno právě nedostatečným „provzorkováním“ daných populací, jelikož dat z území Německa a Nizozemí bylo ve studii Morvan et al. (2013) velmi málo. Složité je i vysvětlení přítomnosti haplotypu skupiny A v jižním Švédsku. Zde je P. coxalis považován také za nepůvodní (Lundin 2003). Buď mohl být přehlížen a nepovšimnut, ze stejných důvodů, jako tomu mohlo být v našich podmínkách. Nebo mohl být zavlečen s balastní vodou a to v obou případech – ať už je skupina A ve střední Evropě díky recentní invazi z mediteránní oblasti či se do ní dostala již v historických dobách (také z mediteránní oblasti). Z výše zmíněného plyne, že je složité na základě zjištěných skutečností dospět k jednoznačnému závěru o původu haplotypové skupiny A. Budeme-li ovšem předpokládat, že jedinci P. coxalis s haplotypy skupiny A jsou ve střední Evropě již dlouhou dobu, ačkoli nevíme, kdy přesně na toto území expandovali, podle malého počtu zjištěných haplotypů můžeme odhadovat, že případná kolonizace území České republiky probíhala nejspíše v nedávné době, typem Pionýr. To znamená, že dané území kolonizoval jen malý počet jedinců, kteří byli geneticky homonomní (Hewitt 1996). U druhu A. aquaticus je situace zcela opačná. Na území České republiky se vyskytuje značné množství haplotypů z více haplotypových skupin. Populace střední a severní Evropy přitom sdílí stejné skupiny haplotypů (Střížek, 2012). Předpokládá se tedy, že kolonizace našeho území druhem A. aquaticus probíhala typem zvaným Falanga, kdy velká genetická heterogenita nevznikla až v kolonizované oblasti, ale byla předávána z mateřské populace na dceřinou. Celá kolonizovaná oblast (severní a střední Evropy) sdílí množství starých linií, které pocházejí z refugia (Hewitt 1996, Střížek, 2012). Původ haplotypové skupiny A nemůže být na základě výsledků této práce jednoznačně vysvětlen. Proto by bylo vhodné získat více vzorků především z území střední Evropy, případně i Itálie a v další studii se pokusit ještě více přiblížit historii druhu P. coxalis na našem území. Okrajovou součást předkládané práce představuje pokus s migrační tůňkou, který se snažil alespoň z části objasnit možné cesty disperze druhu A. aquaticus a P. coxalis. Oba stejnonožci 50

Diskuze

obývají stojaté i tekoucí vody. V případě A. aquaticus bylo zjištěno, že se jedinci obývající tyto odlišné habitaty geneticky nijak zásadně neliší a mezi těmito populacemi musí být nějakým způsobem zachován genový tok (Střížek 2012). Experiment s migrační tůňkou neprokázal, že by se A. aquaticus za stresových podmínek (vysychání habitatu) aktivní migrací snažil osídlit nové vodní plochy. Naopak, většina jedinců byla po skončení pokusu ukryta pod substrátem, což není nijak překvapivé zjištění, jelikož zimu přečkávají právě zahrabáni v sedimentu (Murphy & Learner 1982). I při minimální vlhkosti zůstalo mnoho jedinců životaschopných (po opětovném umístění do vody). Na základě osobního pozorování se zdá být pravděpodobnější případné šíření spíše vlhkým substrátem (např. mezi mokrým listím), které by náhodně mohlo vést i k osídlení nové vodní plochy. Ovšem jen na velmi krátkou vzdálenost. V případných dalších experimentech na toto téma by bylo vhodné zaměřit se spíše na aktivní pohyb proti proudu či mnohokrát zmiňovanou možnost disperze pomocí vodního ptactva, například s podobným designem experimentu, který použil Segestråle (1954).

51

Závěr

6. ZÁVĚR Tato práce byla zaměřena na nepůvodního sladkovodního stejnonožce Proasellus coxalis s.l. Jejím hlavním cílem bylo pomocí genetických dat určit případné invazní cesty tohoto druhu a zhodnotit fylogeografické vztahy populací vyskytujících se na území České republiky. Z celkem 27 populací bylo analyzováno 96 jedinců genem pro cytochrom oxidázu podjednotky I (COI). Pro doplnění vztahů mezi liniemi byl použit také ribozomální gen 28S, této analýze bylo podstoupeno 18 jedinců z 18 populací napříč povodími. Pro interpretaci výsledků byly do analýz začleněny i vzorky zahraničních populací. K tomu byla využita volně přístupná data z GenBank, jež byla součástí studií Morvan et al. (2013) a Verovnik et al. (2005). Na území České republiky bylo zjištěno celkem 11 unikátních haplotypů patřících do dvou různých genealogických linií, jež od sebe diversifikovaly před 2 -2,8 milióny let (6% rozdíl mezi sekvencemi genu pro COI). Jedna z těchto linií se vyskytuje v jižní, střední i severní Evropě, a jelikož s ní jedinci z území České republiky sdílejí totožné haplotypy, bylo potvrzeno, že část populací druhu P. coxalis se vyskytuje na území České republiky díky stavbě plavebních kanálů a lodní dopravě s nimi spjaté (Nehring & Luchs 2002; Tittizer et al. 2000). Zároveň se na základě zjištěných výsledků zdá být nepravděpodobný přenos vodním ptactvem na dlouhé vzdálenosti. Překvapivě byla na našem území zjištěna ještě druhá skupina haplotypů, která se, až na jednoho jedince ze Švédska, vyskytovala pouze v populacích z České republiky. Při porovnání literárních údajů (Herhaus 1977; Gerecke et al. 2005), společně s časným datováním prvních nálezů tohoto druhu na našem území (Flasarová 1975), a snadnou záměnou za hojnější druh A. aquaticus (Horecký & Špaček 2007), se může zdát pravděpodobné, že tato genealogická linie mohla expandovat na území České republiky již v (dávné) minulosti, a část populací druhu P. coxalis se zde nevyskytuje díky recentní invazi plavebními kanály. Díky velkému rozdílu mezi skupinami haplotypů A a B lze říci, že podle údajů z literatury by mohly haplotypy skupiny B odpovídat (pod)druhu P. c. banyulensis a skupiny A (pod)druhu P. c. septentrionalis, ale přesné taxonomické postavení linií nelze bez dalších genetických dat určit. Okrajovou součást této práce tvořil i migrační experiment, prováděný na druhu Asellus aquaticus. Nebylo prokázáno, že by beruška vodní vlivem stresových podmínek (vysychání biotopu) byla schopná osidlovat nové vodní plochy díky své aktivní migraci.

52

SEZNAM LITERATURY Andrzejewski R., Jezierski W. 1978. Management of a wild board population and its effects oon commercial land. Acta Theriologica 23: 309-339. Argano R., Campanaro A. 2004. Two new Proasellus (Crustacea, Isopoda, Asellidae) species from Sardinia: evidences of an old colonization wave of the island. Studi Trentini di Scienze Naturali, Acta Biologica 81: 49-52. Audzijonyte A., Wittmann K.J., Ovcarenko I., Väinölä R. 2009. Invasion phylogeography of the Ponto-Caspian crustacean Limnomysis benedeni dispersing across Europe. Diversity and Distributions 15: 346-355. Bae C.H., Robbins R.T., Szalanski A.L. 2010. Secondary stuctures models of D2-D3 expansion segments of 28S rRNA for Hoplolaiminae species. Journal of Nematology 42(3): 218229. Bandelt H.-J., Forster P., Röhl A. 1999. Median-joining networks for inferring intraspecific phylogenies. Molecular Biology and Evolution 16: 37–48. Beladjal L., Mertens J. 2009. Diaspore dispersal of Anostraca by flying insects. Journal of Crustacean Biology 29(2): 266-268. Beran L. 2006. Dreissena polymorpha (Pallas, 1771) – slávička mnohotvárná. pp. 217-218. In: Mlíkovský J., Stýblo P. (eds.) Nepůvodní druhy fauny a flory České republiky. Praha: ČSOP ISBN 978-80-903329-7-3, pp. 456. Bernauer D., Jansen W. 2006. Recent invasions of alien macroinvertebrates and loss of native species in the upper Rhine River, Germany. Aquatic Invasions 1(2): 55-71. Bij de Vaate A., Jazdzewski K., Ketelaars H.A.M., Gollasch S., Van der Velde G. 2002. Geographical patterns in range extension of Ponto-Caspian macroinvertebrate species in Europe. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 59: 1159- 1174. Bilton D.T., Freeland J.R., Okamura B. 2001. Dispersal in freshwater invertebrates. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics 32: 159-81. Brendonck L., Riddoch B.J. 1999. Wind-borne short-range egg dispersal in anostracans (Crustacea: Branchipoda). Biological Journal of the Linnean Society 67: 87-95. Brochet A.L., Gauthier-Clerc M., Guillemain M., Fritz H., Watrekeyn A., Baltanás Á., Green A.J. 2010. Field evidence of dispersal of branchiopods, ostracods and bryozoan by teal (Anas crecca) in the Camargue (southern France). Hydrobiologia 637: 255-261. Browler D.E., Benton T.G. 2005. Causes and consequences of animal dispersal strategies: relating individual behaviour to spatial dynamics. Biological Reviews 80: 205-225. Cáceres C.E. 1997. Dormancy in invertebrates. Invertebrate Biology 116(4): 371-383.

53

Camacho A.I., Dorda B.A., Rey I. 2011. Identifying cryptic speciation across groundwater populations: fist COI sequences of Bathynellidae (Crustacea, Syncarida). Graellsia 67(1): 7-12. Campanaro A., Ketmaier V., Argano R. 2004. COI data indicate a complex evolutionary history for Italian Subterranean and surface populations of Proasellus (Crustacea, Isopoda).pp. 131. In: Gibert J. (ed.) SWSB Symposium on Worl Subterranean Biodiversity, Book of abstracts. Villeurbanne: University Claude Bernard of Lyon. pp. 182. Carlton J.T., Geller J.B. 1993. Ecological Roulette: the global transport of nonindigenous marine organisms. Science 261: 78-82. Clausen P., Nolet B.A., Fox A.D., Klaassen M. 2002. Long-distance endozoochorous dispersal of submerged macrophyte seeds by migratory waterbirds in northern Europe – a critical review of possibilities and limitations. Acta Oecologica 23: 191-203. Constantini L.M. & Rossi L. 1998. Competition between two aquatic detrivorous isopods – a laboratory study. Hydrobiologia 368: 17-27. Copp G.H., Bianco P.G., Bogutskaya N.G., Erös T., Falka I., Ferreira M.T., Fox M.G., Freyhof J., Gozlan R.E., Grabowska J., Kováč V., Moreno-Amich R., Naseka A.M., Peňáz M., Povž M., Przybylski M., Robillard M., Russell I.C., Stakėnas S., Šumer S., Vila-Gispert A., Wiesner C. 2005. To be, or not to be, a non-native freshwater fish? Journal of Applied Ichthyology 21: 242-262. Coop G.H., Templeton M., Gozlan R.E. 2007. Propagule pressure and the invasion risks of nonnative freshwater fishes: a case study in England. Journal of Fish Biology 71 (Supplement D): 148-159. Cristescu M.E.A., Witt J.D.S., Grigorovich I.A., Hebert P.D.N., MacIsaac H.J. 2004. Dispersal of the Ponto-Caspian amphipod Echinogammarus ischnus: invasion waves from the Plestocene to the present. Heredity 92: 197-203. Darwin Ch., Beer G. 2008. On the origin of species. New York: Oxford University Press, Rev. ed. ISBN 9780199219223 pp. 394. Devin S., Beisel J.N., Bachmann V., Moreteau J.C. 2001. Dikerogammarus villosus (Amphipoda: Gammaridae): another invasive species newly established in the Moselle river and French hydrosystems. Annales de Limnologie 37(1): 21-27. Devin S., Bollache L., Noël P.Y., Beisel J.N. 2005. Patterns of biological invasions in French freshwater systems by non-indigenous macroinvertebrates. Hydrobiologia 551: 137146. Dick J.T.A., Platvoet D., Kelly D.W. 2002. Predatory impact of the freshwater invader Dikerogammarus villosus (Crustacea: Amphipoda). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 59: 1078-1084. Duggan I.C.,van Overdijk C:D:A:, Bailey S.A., Jenkins P.T., Limén H., MacIsaac H.J. 2005. Inveretbrates associated with residual ballast water and sediments of cargo-carrying ships entering the Great Lakes. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 62: 2463-2474. 54

Dyer N.A., Lawton S.P., Ravel S., Choi K.S., Lehane M.J., Robinson A.S., Okedi L.M., Hall M.J.R., Solano P., Donnelly M.J. 2008. Molecular phylogenetics of tsetse flies (Diptera: Glossinidae) based on mitochondrial (COI, 16S, ND2) nad nuclear ribosomal DNA sequeces, with an emphasis on the palpalis group. Molecular Phylogenetics and Evolution 49: 227-239. Elliott J.M. 1971. Upstream movements of benthic invertebrates in a lake district stream. Journal of Animal Ecology 40(1): 235-252. Ewel J.J., O‘Dowd D.J., Bergelson J., Daehler C.C., D’Antonio C.M., Gómez L.D., Gordon D.R., Hobbs R.J., Holt A., Hopper K.R., Hughes C.E:, LaHart M., Leakey R.R.B., Lee W.G., Loope L.L., Lorence D.H., Louda S.M., Lugo A.E., McEvoy P.B., Richardson D.M., Vitousek P.M. 1999. Deliberate introductions of species: Research needs – Benefits can be reaped, but risks are high. BioScience 49(8): 619-630. Figuerola J., Green A.J. 2002a. Dispersal of aquatic organisms by waterbirds: a review of past research and priorities for future studies. Freshwater Biology 47: 483-494. Figuerola J., Green A.J. 2002b. How frequent is external transport of seeds and invertebrate eggs by waterbirds? A study in Doñana, SW Spain. Archiv für Hydrobiologie 155(4): 557-565. Figuerola J., Green A.J., Santamaría L. 2003. Passive internal transport of aquatic organisms by waterfowl in Doñana, south-west Spain. Global Ecology & Biogeography 12: 427-436. Filipová L., Kozubíková E., Petrusek A. 2006a. Orconectes limosus (Rafinesque, 1817) – rak pruhovaný.pp. 237-239. In: Mlíkovský J., Stýblo P. (eds.) Nepůvodní druhy fauny a flóry České republiky. Praha: ČSOP ISBN 978-80-903329-7-3,. pp. 456. Filipová L., Petrusek A., Kozák P., Policar T. 2006b. Pacifastacus leniusculus (Dana, 1852) – rak signální. pp. 239-240. In: Mlíkovský J., Stýblo P. (eds.) Nepůvodní druhy fauny a flóry České republiky. Praha: ČSOP ISBN 978-80-903329-7-3, pp. 456. Flasarová M. 1975. Proasellus coxalis septentrionalis (Herbst) (Isopoda: Asellota) in Böhmen und Mähren. Věstník Československé společnosti zoologické 39: 254-264. Flasarová M. 1996. Poznámky o Isopodech (Crustacea: Isopoda: Asellota and Oniscidea) v severozápadních Čechách. I. Sborník Okresního muzea v Mostě, řada přírodovědná 18: 18-20. Flössner D. 1987. Populationsdynamik and Produktion von Asellus aquaticus (L.) und Proasellus coxalis (Dollfus) in der mittleren Saale. Limnologica 18: 279-295. Galil B.S., Nehring S., Panov V. 2007. Waterways as invasion highways – impact of climate change and globalization. pp. 64-74. In: Nentwing W. (ed.) Biological invasions. Ecological studies, vol. 193. Berlin: Springer – Verlag ISBN-10 3-540-36919-8, pp. 443. Gerecke R., Stoch F., Meisch C., Schrankel I. 2005. Die Fauna der Quellen und des hyporheischen Interstitials in Luxemburg. Unter besonderer Berücksichtigung der Acari, Ostracoda und Copepoda. - Ferrantia. Travaux scientifiques du Musée national d’histoire naturelle 41: 1- 134. Gherardi F., Gollasch S., Minchin D., Olenin S., Panov V.E. 2009. Alien invertebrates and fish in European inland waters. pp. 81-92. In: DAISIE (Delivering Alien Invasive Species 55

Inventories for Europe). Handbook of alien species in Europe. Invading Nature - Springer Series in Invasion Ecology. New York: Springer ISBN 978-1-4020-8279-5, pp. 399. Gollasch S., MacDonald E., Belson S., Botnen H., Christensen J.T., Hamer J.P., Houvenaghel G., Jelmert A., Lucas I., Masson D., McCollin, Olenin S., Persson A., Wallentinus I., Wetsteyn L.P.M.J., Wittling T 2002. Life in ballast tanks. pp. 217-231. In: Leppäkoski E., Gollasch S., Olenin S. (eds.) Invasive aquatic species of Europe: distribution, impacts and management. Dordrecht: Kluwer Academic Publisher ISBN 1-4020-0837-6, pp. 583. Gray D.K., Johengen T.H., Reid D.F., MacIsaac H.J. 2007. Efficacy of open-ocean ballast water exchange as a means of preventing invertebrate invasions between freshwater ports. Green A.J., Figuerola J. 2005. Recent advances in the study of long-distance dispersal of aquatic invertebrates via birds. Diversity and Distributions 11: 149-156. Green A.J., Sánchez M.I. 2006. Passive internal dispersal of insect larvae by migratory birds. Biology Letters 2: 55-57. Gruner H.E. 1965. Krebstiere oder Crustacea. In: Dahl R. (ed.): Die Tierwelt Deutschlands 51 (1). Jena, Gustav Fischer, pp. 149. Hall T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series 41: 95–98. Havel J.E., Hebert P.D.N. 1993. Daphnia lumholtzi in North America: Another exotic zooplankter. Limnology and oceanography 38(8): 1823-1827. Hebert P.D., Ratnasingham S., deWaard J.R. 2003. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proceedings of the Royal Society B (Suppl.) 270: S96-S99. Herhaus K.F. 1977. Die Verbeitung von Proasellus coxalis (Dollfus, 1892) (Crustacea, Isopoda, Asellidae) in Mitteleuropa. Zoologischer Anzeiger Jena 199: 314-324. Heuss K. 1976. Neufunde von Proasellus coxalis (Dollfus, 1892) (Crustacea, Isopoda, Asellidae) in Ceutschland und der Schweiz. Gewässer und Abwässer 60/61: 70. Hewitt G. M. 1996. Some genetic consequences of ice ages, and their role in divergence and speciation. Biological Journal of the Linnean Society 58: 247–276. Horecký J., Špaček J., Petrusek A. 2006. Proasellus coxalis (Dollfus, 1982). pp. 240-242. In: Mlíkovský J., Stýblo P. (eds.) Nepůvodní druhy fauny a flóry České republiky. Praha: ČSOP ISBN 978-80-903329-7-3, pp. 456. Horecký J., Špaček J. 2007. Proasellus coxalis s.l. (Malacostraca: Isopoda) – invadér nebo přehlíšený turista? pp. 38. In: Bryja J., Zukal J., Řehák Z. (eds.) Zoologické dny Brno 2007, Sborník abstraktů z konference 8. -9. února 2007. Brno: Ústav biologie obratlovců AV ČR ISBN 978-80-903329-7-3, pp. 224. Horká I. 2006. Astacus leptodactylus (Eschscholtz, 1823) – rak bahenní. pp.229-231. In: Mlíkovský J., Stýblo P. (eds.) Nepůvodní druhy fauny a flóry České republiky. Praha: ČSOP ISBN 978-80-903329-7-3, pp. 456.

56

Hughes D.A. 1970. Some factors affecting drift and upstream movements of Gammarus pulex. Ecology 51(2): 301-305. Jaždžewski K. 1980. Range extensions of some gammaridean species in European inland waters caused by human activity. Crustaceana Supplement 6: 84-106. Josens G., Bij de Vaate A., Usseglio-Polatera P., Cammaerts R., Chérot F., Grisez F., Verboonen P., Vanden Bossche J.P. 2005. Native and exotic Amphipoda and other Peracarida in the River Meuse: new assemblages emerge from a fast changing fauna. Hydrobiologia 542: 203-220. Karatayev A.Y., Burlakova L.E., Padilla D.K. 1997. The effects of Dreisenna polymorpha (Pallas) invasion on aquatic communities in eastern Europe. Journal of Shellfish Research 16(1): 187-203. Kelly L.C., Bilton D.T., Rundle S.D. 2001. Population structure and dispersal in the Canary Island caddisfly Mesophylax aspersus (Trichoptera, Limnephilidae). Heredity 86: 370-377. Ketmaier V., Argano R., Cobolli M., De Matthaeis E., Messana G. 2001. A systematic and biogeographical study of epi- and hypogean populations of the Proasellus species group from Sardinia, central Italy and Jordan: allozyme insights. Journal of zoological systematics and evolutionary research 39: 53-61. Ketmaier V. 2002. Isolation by distance, gene flow and phylogeography in the Proasellus coxalisgroup (Crustacea, Isopoda) in Central Italy: allozyme data. Aquatic sciences 64: 66-75. Ketmaier V., Argano R.,Caccone A. 2003. Phylogeography and molecular rates of subterranean aquatic Stennasellid Isopods with a peri- Thyrrenian distribution. Molecular Ecology 12: 547-555. Kimura M. 1980. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular Evolution 16: 111– 120. Knowlton N., Weight L.A., Solorzano L.A., Mills De E.K., Bermingham E. 1993. Divergence in proteins, motichondrial DNA, and reproductive compatibility across the isthmus of Panama. Science 260: 1629-1632. Kovats Z.E., Ciborowski J.J.H., Corkum L.D. 1996. Inland dispersal of adult aquatic insects. Freshwater Biology 36: 265-276. Kubíček F. & Opravilová V. 1999. Isopoda. Folia Facultatis Sientarium Naturalium Universitatis Masarykianae Brunensis, Biologia 101: 155-157. Lefébure T., Douady J., Gouy M., Trontelj P., Briolay J., Gibert J. 2006. Phylogeography of subterranean amphipod reveals cryptic diversity and dynamic evolution in extreme environments. Molecular Ecology 15: 1797-1806. Lellák J., Kořínek V., Fott J., Kořínková J., Punčochář P. 1972. Biologie vodních živočichů. Univerzita Karlova – Praha, pp. 220. Leppäkoski E., Gollasch S., Olenin S. 2002. Introduction: Alien species in European waters. pp. 16. In: Leppäkoski E., Gollasch S., Olenin S. (eds.) Invasive aquatic species of Europe: 57

distribution, impacts and management. Dordrecht: Kluwer Academic Publisher ISBN 14020-0837-6, pp. 583. Leuven R.S.E.W., Van der Velde G., Baijens I., Snijders J., Van der Zwart Ch., Lenders H.J.R., Bij de Vaate A. 2009. The river Rhine: a global highway for dispersal of aquatic invasive species. Biological invasions 11: 1989-2008. Maguire B. 1963. The passive dispersal of small aquatic organisms and their colonization of isolated bodies of water.Ecological Monographs 33(2): 161-185. Makarewicz J.C., Grigorovich I.A., Mills E., Dmaske E., Cristescu M.E., Pearsal W., LaVoie M.J., Keats R., Rudstam L., Hebert P., Halbritter H., Kelly T., Matkovich C., MacIsaac H.J. 2001. Distribution, fecundity, and genetics of Cercopagis pengoi (Ostroumov) (Crustacea, Cladocera) in lake Ontario. Journal of Great Lakes Research 27(1): 19-32. Malmqvist B. 2002. Aquatic invertebrates in riverine landscapes. Freshwater Biology 47: 679-694. Martin J.W. & Davis G. E. 2001. An Updated Classification of the Recent Crustacea. Los Angeles: Natural History Museum of Los Angeles County ISSN: 1-891276-27-1, pp. 132. Minckley W.L. 1964. Upstream movements of Gammarus (Amphipoda) in Doe Run, Meade County, Kentucky. Ecology 45(1): 195-197. Morvan, C., Malard, F., Paradis, E., Lefébure, T., Konecny-Dupré, L ., Douady, C.J. 2013. Timetree of Aselloidea Reveals Species Diversification Dynamics in Groundwater. Systematic Biology 62(4): 512–522. Mullis K., Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn G., Erlich H. 1986. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 51: 263–273. Müller K. 1982. The Colonization Cycle of Freshwater Insects. Oecologia 52: 202-207. Murphy P.M., Learner M.A. 1982. The life history and production of Asellus aquaticus (Crustacea: Isopoda) in the River Ely, South Wales. Freshwater Biology 12: 435–444 Nalepa T.F. 1994. Decline of native unionid bivalves in Lake St. Clair after infestation by the zebra mussel Dreissena polymorpha. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 51: 2227-2233. Nehring S. 2002. Biological invasions into German waters: an evaluation of the importance of different human-mediated vectors for nonindigenous macrozoobenthic species. pp. 373-383. In: Leppäkoski E., Gollasch S., Olenin S. (eds.) Invasive aquatic species of Europe: distribution, impacts and management. Dordrecht: Kluwer Academic Publisher ISBN 1-4020-0837-6, pp. 583. Nehring S. 2005. International shipping – A risk for aquatic biodiversity in Germany. In: Nentwig W., Bacher S., Cock M.J.W., Dietz H., Gigon A., Wittenberg R. (eds.) Biological Invasions: FromEcology to Control. Neobiota 6: 125-143. Nehring S., Leuchs H. 2000. Neozoen im Macrozoobenthos der Brackwässer an der deutschen Nordseeküste. Lauterbornia 39: 73-116.

58

Olenin S., Leppäkoski E. 1999. Non-native animals in the Baltic Sea: alteration of benthic habitats in coastal inlets and lagoons. Hydrobiologia 393: 233-243. Palmer M.A., Allan J.D., Butman CH.A. 1996. Dispersal as a regional process affecting the local dynamics of marine and stream benthic invertebrates. Trends in Ecology & Evolution 11(8): 322-326. Panov V.E., Krylov P.I., Riccardi N. 2004. Role of diapause in dispersal and invasion success by aquatic invertebrates. Journal of Limnology 63(1): 56-69. Panov V.E., Alexandrov B., Arbačiauskas K., Binimelis R., Copp G.H., Grabowski M., Lucy F., Leuven R.S.E.W., Nehring S., Paunović M., Semenchenko V., Son M.O. 2009. Assessing the risks of aquatic species invasions via European inland waterways: from concepts to environmental indicators. Integrated Envinronmental Assessment and Management 5(1): 110-126. Peck S.B. 1975. Amphipod dispersal in the fur of aquatic mammals. The Canadian Field-Naturalis 89: 181-182. Pešková M. 2008. Sezónní změny v populacích berušky vodní Asellus aquaticus (Crustacea: Isopoda) ve Středočeském kraji – Bakalářská práce. Přírodovědecká fakulta Ostravská Univerzita v Ostravě, pp. 45. Petrusek A. 2006. Dikerogammarus villosus (Sovinsky, 1984) – blešivec velkohrbý. pp. 233-234. In: Mlíkovský J., Stýblo P. (eds.) Nepůvodní druhy fauny a flory České republiky. Praha: ČSOP ISBN 978-80-903329-7-3, pp. 456. Petrusek A., Thielsch A., Schwenk K. 2012. Mitochondrial sequence variation suggests extensive cryptic diversity within the Western Parearctic Daphnia longispina complex. Limnology and Oceanography 57(6): 1838-1845. Rawer-Jost C., Kappus B., Böhmer J., Jansen W., Rahmann H. 1999. Upstream movements of benthic macroinvertebrates in two different types of fishways in southwestern Germany. Hydrobiologia 391: 47-61. Reinhold von M., Tittizer T. 1997. Zur Rolle von Schiffen als Vektoren beim Faunenaustausch Rhein/Main/Main-Donau-Kanal/Donau. Deutsche Gewässerkundliche Mitteilungen 41: 199-205. Riccardi A., MacIsaac H.J. 2000. Recent mass invasion of the North American Great Lakes by Ponto Caspian species. Trends in Ecology & Evolution 15(2): 62-65. Segerstråle S.G. 1954. The freshwater amphipods, Gammarus pulex (L.) and Gammarus lacustris G. O. Sars, in Denmark and Fennoscandia – A contribution to the late- and post-glacial immigration history of the aquatic fauna of northern Europe. Societas Scientiarum Fennica Commentationes Biologicae 15: 1-91. Sket B. 1999. The nature of biodiversity in hypogean waters and how it is endangered. Biodiversity and Conservation 8: 1319–1338. Stoch F. 1989. Critical remarks on the southern Italian asellids described by E. Dudich (1925) with redescriptions of some taxa (Crustacea, Isopoda, Asellota). Miscellanea Zoologica Hungarica 5: 61-69. 59

Stoch F., Valentino F., Volpi E. 1996. Taxonomic and biogeographic analysis of the Proasellus coxalis-group (Crustacea, Isopoda, Asellidae) in Sicily, with description of Proasellus mantalentii n. sp. Hydrobiologia 317: 247-258. Straka M., Špaček J. 2009. First record of alien crustaceans Atyaephyra desmarestii (Millet, 1831) and Jaera istri Veuille, 1979 from the Czech Republic. Aquatic Invasions 4(2): 397-399. Střížek A. 2012. Kolonizace Střední Evropy bentickým sladkovodním korýšem Asellus aquaticus (Isopoda, Crustacea) – Diplomová práce. Přírodovědecká fakulta Univerzita Karlova v Praze, pp. 86. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. 2011. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Molecular Biology and Evolution 28: 2731–2739. Taylor D.J., Finston T.L., Hebert P.D.N. 1998. Biogeography of a widespread freshwater Crustacean: pseudocongruence and cryptic endemism in the North American Daphnia laevis complex. Evolution 52(6): 1648-1670. Thiéry A. 1997. Horizontal distribution and abundance of cysts of several large branchiopods in temporary pool and ditch sediments. Hydrobiologia 359: 177-189. Tittizer T. 1997. Ausbreitung aquatischer Neozoen (Makrozoobenthos) in den europäischen Wasserstrassen, erläutert am Beispiel des Main-Donau-Kanals. In: Kavka G. (ed.) Güteentwicklung der Donau: Rückblick und Perspektiven. Schriftenreihe des Bundesamtes für Wasserwirtschaft 4: 113-134. Tittizer T., Schöll F., Banning M., Haybach A., Schleuter M. 2000. Aquatische Neozoen im Makrozoobenthos der Binnenwasserstraβen Deutschlands. Lauterbornia 39: 1-72. Tittizer T., Schöll F., Banning M., Haybach A., Schleuter M. 2000. Aquatische Neozoen im Makrozoobenthos der Binnenwasserstraβen Deutschlands. Lauterbornia 39: 1-72. Townsend C.R., Begon M., Harper J.L. 2008. Essentials of ecology. ISBN: 978-1-4051-5658-5, pp. 510. Trakhtenbrot A., Nathan R., Perry G., Richardson D.M. 2005. The importance of long-distance dispersal in biodiversity conservation. Diversity and Distribution 11: 173-181. Trontelj P., Machino Y., Sket B. 2005. Phylogenetic and phylogeographic relationships in the crayfish genus Austropotamobius inferred from mitochondrial COI gene sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution 34: 212–226. Uvíra V. 1985. Příspěvek k poznání biologie Asellus aquaticus L. (Crustacea, Isopoda). Acta Universitatis Palackianae Olomucensis, facultas rerum naturalium, Biologica 26: 155164. Van der Velde G., Nagelkerken I., Rajagopal S., Bij de Vaate A. 2002. Invasions by alien species in inland freshwater bodies in western Europe: the Rhine delta. pp. 360-372. In: Leppäkoski E., Gollasch S., Olenin S. (eds.) Invasive aquatic species of Europe: distribution, impacts and management. Dordrecht: Kluwer Academic Publisher ISBN 14020-0837-6, pp. 583.

60

Vanschoenwinkel B., Waterkeyn A., Vandecaetsbeek T., Pineau O., Grillas P., Brendonck L. 2008. Dispersal of freshwater invertebrates by large terrestrial mammals: a case study with wild boar (Sus scrofa) in Mediterranean wetlands. Freshwater Biology 53: 2264-2273. Vanschoenwinkel B., Pinceel T., Vanhove M.P.M., Denis C., Jocque M., Timms B.V., Brendonck L. 2012. Toward a global phylogeny of the „living fossil“ Crustacean order of the Notostraca. Plos One 7(4): 1-9. Verovnik R., Sket B., Trontelj P. 2005. The colonization of Europe by the freshwater crustacean Asellus aquaticus (Crustacea: Isopoda) proceeded from ancient refugia and was directed by habitat connectivity. Molecular Ecology 14: 4355 – 4369. Walker D. and Avise J.C. 1998. Principles of phylogeography as illustrated by freshwater and terrestrial turtles in the southeastern United States. Annual Review of Ecology and Systematics 29: 23–58. Waterkeyn A., Pineau O., Grillas P., Brendonck L. 2010. Invertebrate dispersal by aquatic mammals: a case study with nutria Myocastor coypus (Rodentia, Mammalia) in Southern France. Hydrobiologia 654: 267-271. Weider L.J., Hobaek A. 1997. Postglacial dispersal, glacial refugia, and clonal structure in Russian/Siberian populations of the artic Daphnia pulex complex. Heredity 78: 363-372. Wesselingh F.P., Cadée G.C., Renema W. 1999. Flying high: on the airborne dispersal of aquatic organisms as illustrated by the distribution histories of the gastropod genera Tryonia and Planorbarius. Geologie en Mijnbouw 78: 165-174. Williams D.D., Williams N.E. 1993. The upstream/downstream movement paradox of lotic invertebrates: quantitative evidence from a Welsh mountain stream. Freshwater Biology 30: 199-218. Wolff W.J. 1973. The distribution of Asellus aquaticus (L.) and Prosellus meridianus (Rac.) in the southwestern part of Netherlands. Hydrobiologia 42(4): 381-392.

INTERNETOVÉ ZDROJE: Lundin K. 2003. Proasellus coxalis. http://www.artfakta.se/Artfaktablad/Proasellus_Coxalis_101632.pdf, navštíveno 16. 6. 2013. ČHMÚ: Výběr profilů jakosti povrchových vod, taxon: Proasellus coxalis. http://hydro.chmi.cz/isarrow/mfilter.php?agenda=POV, navštíveno: 7. 8. 2013. Portál mezinárodní komise pro stratigrafii, International Commission on Stratigraphy – ICS. http://www.stratigraphy.org, navštíveno 7. 8. 2013.

61

SEZNAM PŘÍLOH

1. PROTOKOL PURIFIKACE PCR PRODUKTŮ

2. HAPLOTYPOVÁ SÍŤ - OZNAČENÍ HAPLOTYPŮ Z ÚZEMÍ ČESKÉ REPUBLIKY

3. TABULKA VŠECH ANALYZOVANÝCH VZORKŮ

4. TABULKA SEKVENCÍ STAŽENÝCH Z DATABÁZE GENBANK

62

Příloha č. 1. Protokol purifikace PCR produktů.

Protokol purifikace PCR produktů metodou ethanolové precipitace. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

Dodáme k PCR produktu H2O (pro PCR), tak aby bylo v každém stripu 100 μl. Přepitujeme do 1,5 ml zkumavek, popíšeme. Přidáme octan sodný (1/10 objemu), tj. 10 μl. Přidáme 2násobek objemu vymraženého ethanolu (99,9 %) = 200 μl. Protřepeme. Centrifugace 10 min., 14 000 RPM. Odsajeme pipetou tekutinu, lze též opatrně vylít, PCR produkt je vysrážený na dně. Odsávanou tekutinu pipetujeme do kádinky. Přidáme 100 μl vymraženého 75% ethanolu. Promícháme. Centrifugace 10 min., 14 000 RPM, opět odpipetujeme / vylijeme tekutinu nad PCR produktem. 12. Dáme vysušit do heat-blocku, vysušíme úplně do sucha (cca 2 hod.) při teplotě 40 °C (vzorky necháme otevřené, heat-block ohradíme alobalem). 13. Po vysušení dolijeme 20-25 μl H2O (pro PCR), podle množství PCR produktu (síla proužku při elektroforéze). 14. Kontrola – nanesením na gel (proužek může svítit i v jamce, většinou jsou proužky slabší).

63

Příloha č. 2. Haplotypová síť zobrazující označení jednotlivých názvů haplotypů vyskytujících se na území České republiky.

64

Příloha č. 3. Souhrnná tabulka analyzovaných vzorků. Kód vzorku

Název lokality

DYPri1 DYPri2 DYPri5 DYSou1 DYSou2 LABor1 LABor2 LABor3 LABor4 LABor5 LACer1 LACer2 LACer3 LACer5 LACer6 LALba1 LALba2 LALba3 LALib1 LALib2 LASmi2 LASmi5 LASmi6 LASmi7 LASmi8 LAVal1 LAZab1 LAZab2 LAZab3 MOHej1 MOHej2 MOHej3 MOHej5 MOHej6 MOMor1 MOStr1 MOStr2 MOStr3 MOStr5 MOStr6 MOTvd1 MOTvd2 MOTvd3 MOTvd4 MOTvd5 MOTvr1 MOTvr2 MOTvr3 MOTvr5 OHBoh1 OHKav1 ORKos1 ORKos2 ORTys1 ORTys2

Přítluky 04 – Dyje Přítluky 04 – Dyje Přítluky 04 – Dyje Soutok Dyje Soutok Dyje Boreček, Ploučnice Boreček, Ploučnice Boreček, Ploučnice Boreček, Ploučnice Boreček, Ploučnice Černínovsko 1 Černínovsko 1 Černínovsko 1 Černínovsko 1 Černínovsko 1 Libický luh Libický luh Libický luh Liblice 2 Liblice 2 Smiřice Smiřice Smiřice Smiřice Smiřice Valy, Labe Záboří n. Labem 3 Záboří n. Labem 3 Záboří n. Labem 3 Hejtmanka, most Hejtmanka, most Hejtmanka, most Hejtmanka, most Hejtmanka, most Morava1 Střeň 9 Střeň 9 Střeň 9 Střeň 9 Střeň 9 Tvrdonice 9 Tvrdonice 9 Tvrdonice 9 Tvrdonice 9 Tvrdonice 9 Tvrdonice 13 Tvrdonice 13 Tvrdonice 13 Tvrdonice 13 Bohušovice Karlovy Vary 1 Kostelec n. Orlicí Kostelec n. Orlicí Týniště Týniště

Povodí Dyje Dyje Dyje Dyje Dyje Labe Labe Labe Labe Labe Labe Labe Labe Labe Labe Labe Labe Labe Vltava Vltava Labe Labe Labe Labe Labe Labe Labe Labe Labe Morava Morava Morava Morava Morava Morava Morava Morava Morava Morava Morava Morava Morava Morava Morava Morava Morava Morava Morava Morava Ohře Ohře Labe Labe Labe Labe

Habitat tok /tůň Dyje Dyje Dyje Dyje Dyje Ploučnice Ploučnice Ploučnice Ploučnice Ploučnice tůň tůň tůň tůň tůň Bačovka Bačovka Bačovka tůň tůň tůň tůň tůň tůň tůň Labe tůň tůň tůň Morava Morava Morava Morava Morava Morava Morava Morava Morava Morava Morava tůň tůň tůň tůň tůň tůň tůň tůň tůň Ohře Ohře Štědrý p. Štědrý p. tůň tůň

GPS

Datum

N48 50.626 E16 44.016 N48 50.626 E16 44.016 N48 50.626 E16 44.016 N48 37.446 E16 55.219 N48 37.446 E16 55.219 N50 37.860 E14 43.123 N50 37.860 E14 43.123 N50 37.860 E14 43.123 N50 37.860 E14 43.123 N50 37.860 E14 43.123 N50 17 13.2 E14 30 21.5 N50 17 13.2 E14 30 21.5 N50 17 13.2 E14 30 21.5 N50 17 13.2 E14 30 21.5 N50 17 13.2 E14 30 21.5 N50 06.108 E15 11.018 N50 06.108 E15 11.018 N50 06.108 E15 11.018 N50 18.566 E14 35.289 N50 18.566 E14 35.289 N50 17.447 E15 51.856 N50 17.447 E15 51.856 N50 17.447 E15 51.856 N50 17.447 E15 51.856 N50 17.447 E15 51.856 N50 01.983 E15 37.002 N50 01.395 E15 20.142 N50 01.395 E15 20.142 N50 01.395 E15 20.142 N49 42.961 E17 01.536 N49 42.961 E17 01.536 N49 42.961 E17 01.536 N49 42.961 E17 01.536 N49 42.961 E17 01.536 N48 47.147 E17 05.292 N49 41.029 E17 08.951 N49 41.029 E17 08.951 N49 41.029 E17 08.951 N49 41.029 E17 08.951 N49 41.029 E17 08.951 N48 46.141 E17 03.066 N48 46.141 E17 03.066 N48 46.141 E17 03.066 N48 46.141 E17 03.066 N48 46.141 E17 03.066 N48 42.126 E16 59.559 N48 42.126 E16 59.559 N48 42.126 E16 59.559 N48 42.126 E16 59.559 N50 29.531 E14 09.436 N50 12.900 E12 49.664 N50 07.749 E16 13.082 N50 07.749 E16 13.082 N50 09.171 E16 03.844 N50 09.171 E16 03.844

23.04.09 23.04.09 23.04.09 24.04.09 24.04.09 16.04.13 16.04.13 16.04.13 16.04.13 16.04.13 23.03.07 23.03.07 23.03.07 23.03.07 23.03.07 02.05.13 02.05.13 02.05.13 15.04.09 15.04.09 12.04.07 12.04.07 12.04.07 12.04.07 12.04.07 02.05.13 21.03.07 21.03.07 21.03.07 25.04.10 25.04.10 25.04.10 25.04.10 25.04.10 25.04.09 24.04.10 24.04.10 24.04.10 24.04.10 24.04.10 25.04.09 25.04.09 25.04.09 25.04.09 25.04.09 25.04.09 25.04.09 25.04.09 25.04.09 03.05.10 15.04.09 25.04.13 25.04.13 26.04.10 25.04.10 0

Odebral Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Veronika Sacherová Veronika Sacherová Veronika Sacherová Veronika Sacherová Veronika Sacherová Jan Špaček Jan Špaček Jan Špaček Antonín Střížek Antonín Střížek Veronika Sacherová Veronika Sacherová Veronika Sacherová Veronika Sacherová Veronika Sacherová Jan Špaček Veronika Sacherová Veronika Sacherová Veronika Sacherová Antonín Střížek Antonín Střížek Antonín Střížek Antonín Střížek Antonín Střížek Markéta Koprnická Antonín Střížek Antonín Střížek Antonín Střížek Antonín Střížek Antonín Střížek Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Antonín Střížek Jan Špaček Jan Špaček Antonín Střížek Antonín Střížek

Kód izolátu 9 10 106 31 32 147 148 149 150 151 44 7 8 39 142 155 156 157 49 127 23 42 21 91 110 158 36 37 101 55 56 94 119 121 67 57 58 95 113 115 4 5 6 136 137 1 2 3 140 53 249 159 160 79 90

Haplotyp COI

28S A/-

Bb Ab Bb Bb Bb Ba Ba Ba Ba Ba Aa Ba Aa Bd Ba Bc Bc Bc Aa Ba Bd Aa Aa Bc Aa Ba Aa Ab Ab Ab Ab Bb Ab Bb Aa Ad Bb Ab Ab Ad Aa Aa Aa Aa Aa Ae Aa Aa Aa Ba Ba Ba Ba Aa Aa

A A A A A A A A A A A A -

65

ORTys3 ORTys4 ORTys5 ORTys6 ORTys7 ORTys8 VLBak1 VLBak2 VLBel1 VLBel2 VLBel3 VLBel4 VLBel5 VLHal1 VLHal2 VLHal3 VLHal4 VLHal5 VLHal6 VLHal7 VLLuz1 VLLuz2 VLLuz3 VLLuz5 VLPor1 VLPor2 VLPor3 VLRou1 VLRou2 VLRou3 VLTus1 VLTus2 VLTus3 VLTus4 VLTus6 VLZel1 VLZev1 VLZev2 VLZev3 VLZev4 VLZev5

66

Týniště Týniště Týniště Týniště Týniště Týniště Hobšovice Hobšovice Bělá Bělá Bělá Bělá Bělá Halámky Halámky Halámky Halámky Halámky Halámky Halámky Lužnice Lužnice Lužnice Lužnice Poříčí, Želivka Poříčí, Želivka Poříčí, Želivka Roudné Roudné Roudné Tušť Tušť Tušť Tušť Tušť Zelčín Brtná - Želiv, Trnava- Želiv, Brtná Trnava- Želiv, Brtná Trnava- Želiv, Brtná Trnava Brtná - Želiv, Trnava

Labe Labe Labe Labe Labe Labe Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava Vltava

tůň tůň tůň tůň tůň tůň Bakovský p. pp. Bakovský p. Bělá Bělá Bělá Bělá Bělá Lužnice Lužnice Lužnice Lužnice Lužnice Lužnice Lužnice Lužnice Lužnice Lužnice Lužnice Želivka Želivka Želivka Malše Malše Malše Lužnice Lužnice Lužnice Lužnice Lužnice Vltava Trnava Trnava Trnava Trnava Trnava

N50 09.171 E16 03.844 N50 09.171 E16 03.844 N50 09.171 E16 03.844 N50 09.171 E16 03.844 N50 09.171 E16 03.844 N50 09.171 E16 03.844 N50 16.177 E14 09.513 N50 16.177 E14 09.513 N49 27.467 E15 14.115 N49 27.467 E15 14.115 N49 27.467 E15 14.115 N49 27.467 E15 14.115 N49 27.467 E15 14.115 N48 51.139 E14 54.637 N48 51.139 E14 54.637 N48 51.139 E14 54.637 N48 51.139 E14 54.637 N48 51.139 E14 54.637 N48 51.139 E14 54.637 N48 51.139 E14 54.637 N49 04.841 E14 45.469 N49 04.841 E14 45.469 N49 04.841 E14 45.469 N49 04.841 E14 45.469 N49 32.083 E15 12.010 N49 32.083 E15 12.010 N49 32.083 E15 12.010 N48 56.076 E14 29.390 N48 56.076 E14 29.390 N48 56.076 E14 29.390 N48 53.529 E14 53.156 N48 53.529 E14 53.156 N48 53.529 E14 53.156 N48 53.529 E14 53.156 N48 53.529 E14 53.156 N50 19.172 E14 26.990 N49 31.381 E15 12.508 N49 31.381 E15 12.508 N49 31.381 E15 12.508 N49 31.381 E15 12.508 N49 31.381 E15 12.508

26.04.10 25.04.10 25.04.10 25.04.10 26.04.10 26.04.10 26.04.13 26.04.13 02.05.13 02.05.13 02.05.13 02.05.13 02.05.13 01.06.09 01.06.09 01.06.09 01.06.09 01.06.09 01.06.09 01.06.09 30.05.09 30.05.09 30.05.09 30.05.09 21.05.13 21.05.13 21.05.13 01.06.09 01.06.09 01.06.09 01.06.09 01.06.09 01.06.09 01.06.09 01.06.09 03.10.08 09.05.13 09.05.13 09.05.13 09.05.13 09.05.13

Antonín Střížek Antonín Střížek Antonín Střížek Antonín Střížek Antonín Střížek Antonín Střížek Natálie Lapšanská Natálie Lapšanská Natálie Lapšanská Natálie Lapšanská Natálie Lapšanská Natálie Lapšanská Natálie Lapšanská Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Natálie Lapšanská Natálie Lapšanská Natálie Lapšanská Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Markéta Koprnická Natálie Lapšanská Natálie Lapšanská Natálie Lapšanská Natálie Lapšanská Natálie Lapšanská

30 122 123 80 33 41 172 173 166 167 168 169 170 45 46 47 105 128 132 133 24 25 26 103 176 177 178 48 130 131 27 28 29 92 104 40 161 162 163 164 165

Aa Aa Aa Aa Aa Aa Ac Ac Aa Af Aa Aa Aa Ba Ab Ab Ba Ab Ab Ab Bb Ba Ba Ba Be Be Ab Bb Bb Bb Ab Ba Ab Ab Ba Aa Ab Bb Ba Bb Ab

A A A A A A -

Příloha č. 4. Tabulka sekvencí stažených z databáze GenBank. Gen

Accession number

Populace

Kód

GPS

Stát

Druh

COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI COI 28S 28S 28S 28S 28S 28S 28S

JQ921162.1 JQ921163.1 JQ921164.1 JQ921151.1 JQ921152.1 JQ921153.1 JQ921154.1 JQ921155.1 JQ921173.1 JQ921174.1 JQ921148.1 JQ921149.1 JQ921150.1 JQ921171.1 JQ921156.1 JQ921169.1 JQ921170.1 JQ921160.1 JQ921161.1 JQ921146.1 JQ921147.1 JQ921165.1 JQ921141.1 JQ921142.1 JQ921145.1 JQ921137.1 JQ921138.1 JQ921139.1 JQ921140.1 JQ921157.1 DQ144752.1 DQ144751.1 JQ921143.1 JQ921144.1 JQ921158.1 JQ921159.1 JQ921166.1 JQ921167.1 JQ921168.1 JQ921172.1 JQ921924.1 JQ921922.1 JQ921921.1 JQ921923.1 JQ921920.1 DQ144777.1 JQ922028.1

TLEMCEN TLEMCEN TLEMCEN BUNAR BUNAR BUNAR LOPAR LOPAR AMUNT AMUNT CASAMOZA CASAMOZA CASAMOZA GAJA MILLAS LAUCHA1 LAUCHA2 TRICHONI TRICHONI CALPONT CALPONT QUERCIOL BEITED BEITED BISRI DADES NZALA NZALA NZALA NAUERNAA BENAJO1 BENAJO1 ORFES ORFES RAAN RAAN RAAN STENSAN TLEMCEN BUNAR CASAMOZA TRICHONI BISRI LAFINOU

YAS861 YLK100 YLK582 YLK400 YLK581 YAB013 YLK449 YLK595 YAS229 YCD316 YAS469 YAS406 YAS470 YLK575 YAS468 YLK812 YCD91 YLK450 YLK577 YAS738 YAS798 YAS755 YLK352 YLK348 YLK590 YCD10 YCD71 YCD76 YCD77 YLK319 PA5 PA4 YCD238 YCD231 YAS877 YLK163 YAS498 YLK745 YLK817 YAS471 YLK640 YLK426 YAS409 YLK359 YLK741 PA4 YCD936

N34.7734 W1.25053 N34.7734 W1.25053 N34.7734 W1.25053 N42.72361 E17.87611 N42.72361 E17.87611 N42.72361 E17.87611 N44.83083 E14.73194 N44.83083 E14.73194 N42.46861 E3.09222 N42.46861 E3.09222 N42.51861 E9.44222 N42.51861 E9.44222 N42.51861 E9.44222 N43.19722 E2.42028 N42.68056 E2.70583 N51.39622 E11.98671 N51.38177 E11.95397 N38.60278 E21.55639 N38.60278 E21.55639 N43.82683 E11.30172 N43.82683 E11.30172 N43.84525 E11.32144 N33.70255 E35.47058 N33.70255 E35.47058 N33.5802 E35.53548 N31.3668 W5.97527 N32.6269 W8.41032 N32.6269 W8.41032 N32.6269 W8.41032 N52.46431 E4.76365 N36.75376 W5.20183 N36.75376 W5.20183 N42.17053 E2.86924 N42.17053 E2.86924 N55.999 E12.766 N55.999 E12.766 N55.999 E12.766 N56.428 E12.873 N34.7734 W1.25053 N42.72361 E17.87611 N42.51861 E9.44222 N38.60278 E21.55639 N33.5802 E35.53548 44.87955 N 1.61442 E

Algeria Algeria Algeria Croatia Croatia Croatia Croatia Croatia France France France France France France France Germany Germany Greece Greece Italy Italy Italy Lebanon Lebanon Lebanon Morocco Morocco Morocco Morocco Netherlands Slovenia Slovenia Spain Spain Spain Spain Sweden Sweden Sweden Sweden Algeria Croatia France Greece Lebanon Slovenia France

Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus coxalis Proasellus meridianus

67

Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta. Studijní program: BIOLOGIE

Recommend Documents