UJI AKTIVITAS ISOLAT ACTINOMYCETES DARI SAMPEL PASIR GUNUNG SLAMET TERHADAP BAKTERI Escherichia coli DAN Bacillus subtilis
Disusun sebagai salah satu syarat menyelesaikan Program Studi Strata Satu pada Fakultas Farmasi
Oleh: MIFTA RIZKI UTAMI K 100 120 090
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA 2016
i
HALAMAN PERSETUJUAN
HALAMAN PESETUJUAN UJI AKTIVITAS ISOLAT ACTINOMYCETES DARI SAMPEL PASIR GUNUNG SLAMET TERHADAP BAKTERI Escherichia coli DAN Bacillus subtilis
PUBLIKASI ILMIAH
Oleh: MIFTA RIZKI UTAMI K 100 120 090
Telah diperiksa dan disetujui untuk diuji oleh:
Dosen Pembimbing
Rima Munawaroh, M.Sc., Apt NIK.958
iii
HALAMAN PENGESAHAN
UJI AKTIVITAS ISOLAT ACTINOMYCETES DARI SAMPEL PASIR GUNUNG SLAMET TERHADAP BAKTERI Escherichia coli DAN Bacillus subtilis
OLEH
MIFTA RIZKI UTAMI K 100 120 090
Telah dipertahankan di depan Dewan Penguji Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta
Pada hari Selasa, 13 Desember 2016 dan dinyatakan memenuhi syarat
Dewan Penguji: 1.
(…………….)
Azis Saifudin, Ph.D., Apt (Ketua Penguji)
2.
Ratna Yuliani, M. Biotech. St
(…………….)
(Anggota I Penguji) 3.
Rima Munawaroh, M.Sc., Apt
(…………….)
(Anggota II Penguji)
Dekan,
Azis Saifudin, Ph.D., Apt
NIK. 956 ii iii
PERNYATAAN Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam naskah publikasi ini tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan orang lain, kecuali secara tertulis diacu dalam naskah dan disebutkan dalam daftar pustaka. Apabila kelak terbukti ada ketidakbenaran dalam pernyataan saya di atas, maka akan saya pertanggungjawabkan sepenuhnya.
Surakarta, 13 Desember 2016 Penulis
MIFTA RIZKI UTAMI
K 100 120 090
iv
UJI AKTIVITAS ISOLAT ACTINOMYCETES DARI SAMPEL PASIR GUNUNG SLAMET TERHADAP BAKTERI Escherichia coli DAN Bacillus subtilis
Abstrak Resistensi bakteri terhadap obat antibakteri, merupakan salah satu permasalahan yang serius terhadap kesehatan masyarakat. Berdasarkan permasalahan tersebut sangat penting untuk mencari senyawa antibakteri baru terutama dari mikroorganisme. Actinomycetes merupakan mikroorganisme yang memiliki potensi tinggi sebagai penghasil senyawa bioaktif termasuk senyawa antibakteri. Tanah adalah habitat Actinomycetes. Tujuan penelitian ini adalah mengetahui jumlah isolat Actinomycetes, potensi antibakteri yang dihasilkan oleh Actinomycetes dari sampel pasir Gunung Slamet terhadap pertumbuhan Escherichia coli dan Bacillus subtilis, serta mengetahui golongan senyawa antibakteri. Isolasi Actinomycetes dari pasir Gunung Slamet dilakukan dengan pengambilan sampel pasir pada 5 titik lokasi, pra-perlakuan sampel pasir, estimasi sampel pasir dengan tingkat pengeceran hingga , isolasi pada media selektif. Media yang digunakan adalah starch casein agar, starch casein broth, Bennet agar, oatmeal agar. Identifikasi isolat Actinomycetes menggunakan colouring grup dan pewarnaan Gram. Uji aktivitas antibakteri menggunakan metode agar blok. Kromatografi lapis tipis menggunakan fase diam silika gel GF254 dan fase gerak n-heksan : etil asetat (2:3). Uji bioautografi menggunakan metode bioautografi kontak. Isolasi Actinomycetes dari sampel pasir Gunung Slamet diperoleh 5 isolat Actinomycetes dengan kode isolat A4, A6, A8, A10, A10B. Isolat Actinomycetes kode A10 mampu menghambat pertumbuhan Escherichia coli dengan diameter zona hambat 18 mm dan Bacillus subtilis dengan diameter zona hambat 26 mm. Hasil uji kromatografi lapis tipis dan bioautografi menunjukkan bahwa bercak pada Rf 0,97 mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli dan Bacillus subtilis yang merupakan senyawa golongan terpenoid dan propilpropanoid. Kata Kunci : Pasir Gunung Slamet, Actinomycetes, Escherichia coli, Bacillus subtilis.
Abstract Bacterial resistance to antibacterial drugs, is one serious problem to public health. Based on these problems, it is very important to search for new antibacterial compounds mainly from microorganisms. Actinomycetes are microorganisms which have a high potential as a producer of bioactive compounds including antibacterial compounds. Soil is the habitat of Actinomycetes. The purpose of this study was to determine the number of the isolate of Actinomycetes, the potential of antibacterial produced by Actinomycetes of sand from Mount Slamet on the growth of Escherichia coli and Bacillus subtilis, and to find out the classification of the antibacterial compounds.The isolation of Actinomycetes of the sand from Mount Slamet was done by taking some samples of sand at 5 points of location, pre-treatment of sample sand, the estimation of sample sand was done by using dilution rate of to , isolation on selective media. The media used are Starch casein agar, Starch casein broth, Bennet agar, Queker oatmel agar. The identification of Actinomycetes isolates were done using coloring groups and Gram staining. The antibacterial activity was tested by using agar block methods. Thin Layer Chromatography used silica gel GF254 as stationary phase and n-hexane: ethyl acetate (2:3) as mobile phase. The bioautografi test was done by using the contact bioautography method. The isolation of Actinomycetes of Mount Slamet sample sand obtained 5 isolates of Actinomycetes coded A4, A6, A8, A10, A10b. The Actinomycetes isolate of code A10 has indicated to be able to inhibit the growth of Escherichia coli with diameter of inhibitory zone of 18 mm and Bacillus subtilis with diameter of inhibitory zone of 26 mm. The result of Thin Layer Chromatography and bioautography test indicated that compound 1
having antibacterial activity was of Rf value of 0.97 on Escherichia coli and Bacillus subtilis, are classified as the compounds of terpenoids and propylpropanoids. Keywords: Mount Slamet sands, Actinomycetes, Escherichia coli, Bacillus subtilis 1. PENDAHULUAN Tanah merupakan salah satu habitat bagi mikroorganisme, dalam satu gram tanah terdapat jutaan mikroorganisme. Populasi mikroorganisme per gram tanah yang subur meliputi : bakteri (2.500.000.000), Actinomycetes (700.000), fungi (400.000), algae (50.000) dan protozoa (30.000) (Budiyanto, 2004). Actinomycetes memiliki habitat didalam tanah. Mikroorganisme terutama streptomycetes 70% berada di tanah (Rao et al., 2001). Actinomycetesjuga ditemukan di tempattempat ekstrim seperti di daerah bekas letusan gunung berapi (Rahayu, 2010). Actinomycetes adalah salah satu mikroorganisme yang banyak dikaji potensinya karena memiliki nilai ekonomi yang tinggi. Actinomycetes sebagai penghasil antibiotik. Dari 10.000 jenis antibiotik yang ditemukan sekitar 75% dihasilkan oleh Actinomycetes (Nurkanto et al., 2008). Actinomycetes merupakan suatu penghasil senyawa aktif terbanyak dibanding dengan bakteri atau kapang, baik itu senyawa antimikroba, antikanker, antivirus, maupun antikolesterol (Budiyanto et al., 2012). Beberapa antibiotik yang dihasilkan dari jenis streptomyces yaitu bleomisin, eritromisin, josamisin, kanamisin, neomisin, dan tetrasiklin (Suwandi, 2010). Actinomycetes dapat dihasilkan dari pasir Gunung Merapi. Pada penelitian sebelumnya Rahayu (2010), berhasil mendapatkan 10 isolat Actinomycetes yang diisolasi dari sampel pasir Gunung Merapi mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli. Sementara penelitian yang dilakukan oleh Ambarwati et al.,(2014), berhasil mendapatkan 8 isolat dari tanah pekarangan, 6 isolat mampu menghambat pertumbuhan Escherichia coli dan Bacillus subtilis dengan perincian isolat yang berpotensi lemah dengan diameter zona hambat 5,00-8,00 mm, yang berpotensi sedang dengan diameter zona hambat 12,00 mm dan 2 isolat yang berpotensi kuat dengan diameter zona hambat 28,00-30,00 mm. Ceylan et al.,(2008) berhasil menemukan isolat Actinomycetes yang mampu menghambat biakan bakteri Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, dan Stenotrophomonas maltophilia actinomycetes merupakan sumber terbesar antibiotika alami (Waluyo and Lud, 2009), dan mempunyai kemampuan memproduksi senyawa bioaktif termasuk senyawa antibiotik yang bermanfaat (Nord et al., 2004). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
jumlah isolat Actinomycetes dari sampel pasir
Gunung Slamet yang berpotensi sebagai antibakteri terhadap pertumbuhan bakteri Escherichia coli dan Bacillus subtilis dan mengetahui golongan senyawa yang mempunyai aktivitas antibakteri.
2
2. METODE PENELITIAN 2.1 Alat Dan Bahan Alat yang digunakan adalah cawan petri, pipet tetes, tusuk sate steril, tabung reaksi, Erlenmeyer, corong pisah (Pyrex), ose bulat, spreader glass, pipa kapiler, cawan porselen, tabung mikro, gelas ukur (Pyrex), gelas penutup, vortex (Thermolyne), mikroskop (Olympus), mikropipet (Socorex), sterile cork borer 6 mm, objeck glass, oven (Memmert), autoklaf (Hirayama), inkubator jamur (Binder), neraca analitik (Ohaus), inkubator shaker (New Brunswick Scientific), waterbath (Memmert), Laminar Air Flow (LAF), lampu UV 254 nm dan 366 nm. Bahan yang digunakan adalah sampel pasir Gunung Slamet, media oatmeal agar, antifungi konsentrasi 100.000 IU/1 mL (nistatin), bakteri uji Escherichia coli dan Bacillus subtilis, Mueller Hinton Agar (MHA), Brain Heart Infussion (BHI), Strach Casein Agar (SCA), Strach Casein Broth (SCB), cat Gram A (kristal violet), cat Gram B (iodin gram), cat Gram C (etil alkohol 95%), cat Gram D (safranin),minyak immersi, larutan ringer laktat, indikator pH universal, plat kromatografi lapis tipis silika gel
akuades, formalin 1%, reagen semprot (anisaldehid
), etil asetat
dan n-heksan.
2.2 Pengambilan Sampel, Pra-Perlakuan Sampel dan Isolasi Actinomycetes pada Media Selektif Sampel pasir diambil dari Gunung Slamet. Gunung Slamet terletak dikecamatan Pulosari, kabupaten Pemalang, propinsi Jawa Tengah. Gunung Slamet berada dalam 5 perbatasan kabupaten yaitu kabupaten Pemalang, kabupaten Brebes, kabupaten Banyumas, kabupaten Purbalingga dan kabupaten Banjarnegara. Sampel pasir diambil dan dicatat tanggal pengambilannya. Sampel pasir diambil pada 10 km dari puncak gunung. Sampel pasir diambil 5 titik lokasi pengambilan pasir, tiap titik pengambilan berjarak 5 meter, sebanyak 300 gram sampel pasir diambil 5-10 cm dari permukaan tanah tiap titik, dan ditempatkan dalam kantong plastik yang berbeda. Pra-perlakuan sampel pasir dilakukan dengan cara sampel pasir dikeringkan dalam cawan Petri pada suhu ruang (20-25
dan dibiarkan di udara kering terbuka selama 4-9 hari. Selanjutnya sampel diayak dan
dimasukkan dalam wadah steril pada suhu 4
sebelum digunakan.Sampel diisolasi menggunakan
media selektif yaitu starch-casein agar selama 3 minggu, Bennet agar selama 2 minggu, dan media outmeal agar selama 2 minggu, masing-masing media dinkubasi pada suhu 28 C.
2.3 Sterilisasi Alat Dan Bahan Sebelum digunakan alat dan bahan perlu disterilisasi agar tidak terjadi kontaminasi yang dapat merusak hasil uji. Alat-alat gelas berupa cawan Petri, tabung reaksi, Erlenmeyer, pipet volume, dan 3
labu takar dimasukkan ke dalam oven (pemanasan kering) dan disterilkan pada suhu 175oC selama 90-120 menit. Alat dan bahan yang tidak tahan pemanasan kering seperti media, pipet tetes, yellow tips, blue tips dimasukkan dalam autoklaf (pemanasan basah) pada suhu 121 oC selama 20 menit. Alat yang telah disterilkan dapat langsung dipakai atau disimpan untuk digunakan lain waktu akan tetapi tetap harus dalam keadaan tertutup rapat, sedangkan untuk media yang tidak segera digunakan harus disimpan pada suhu 4oC (di dalam almari es).
2.4 Identifikasi Isolat Actinomycetes Identifikasi Isolat Actinomycetes secara mikroskopik dilakukan dengan pewarnaan Gram dan Identifikasi Isolat Actinomycetes secara mikroskopik dilakukan dengan mengamati miselium aerial, miselium vegetatif, dan pigmen difus.
2.5 Uji aktivitas Antibakteri Isolat Actinomycetes Uji aktivitas antibakteri isolat Actinomycetes dilakukan dengan menggunakan metode agar block. Metode agar block dilakukan dengan melubangi pada media Mueller Hinton Agar (MHA) yang telah diinokulasi dengan bakteri Escherichia coli dan Bacillus subtilis. Kemudian isolat dari media oatmeal agar diambil dan diletakkan ke dalam media Mueller Hinton Agar (MHA) yang telah diinokulasikan dengan bakteri Escherichia coli dan Bacillus subtilis dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 hari.
2.6 Identifikasi Senyawa Kimia 2.6.1 Fraksinasi Isolat Actinomycetes Isolat Actinomycetes yang memiliki aktivitas zona hambat paling kuat terhadap Escherichia coli dan Bacillus subtilis dipilih dan dikultur pada media starch casein broth, kemudian diinkubasi pada suhu 30°C selama 7 hari pada inkubator shaker. Setelah 7 hari, isolat Actinomycetes disaring dan media difraksinasi menggunakan pelarut etil asetat dengan perbandingan 1 : 1 (v / v), kemudian diinkubasi dalam inkubator shaker selama 1 jam pada suhu 30°C agar etil asetat dan media dapat bercampur. Fase etil asetat yang berisi agen antibakteri dipisahkan dari fase berair, selanjutnya fase etil asetat diuapkan sampai kering pada waterbath suhu 60°C. Ekstrak kering ditambahkan etil asetat 1 mL agar senyawa aktif dalam isolat dapat berpindah kedalam pelarut etil asetat. Etil asetat digunakan untuk memfraksinasi isolat Actinomycetes karena mampu mengambil metabolit sekunder terbanyak. 2.6.2 Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Kromatografi Lapis Tipis menggunakan plat silika gel
sebagai fase diam dan fase gerak
menggunakan pelarut etil asetat : n-heksan dengan perbandingan 2:3 (v / v). Senyawa yang telah 4
difraksinasi ditotolkan pada plat silika dan dilihat pada UV-254 nm dan UV-366 nm. Plat silika disemprot dengan menggunakan reagen semprot anisaldehid-
untuk mendeteksi senyawa
kimia isolat Actinomycetes kemudian dilihat pada UV-254 nm dan UV-366 nm dan ditentukan nilai Rfnya. 2.6.3 Uji Bioautografi Uji bioautografi menggunakan metode bioautografi kontak, dilakukan dengan cara lempeng KLT yang telah dielusi diletakkan pada media MHA dalam cawan petri yang telah diinokulasi dengan bakteri Escherichia coli dan Bacillus subtilis selama 20 menit. Selanjutnya lempeng KLT yang telah dielusi diambil menggunakan pinset steril. Kemudian media MHA diinkubasi pada suhu 37 selama 24 jam. Setelah media diinkubasi, media diamati ada atau tidaknya zona hambat ditandai dengan adanya zona jernih pada media. 2.7 Analisis Data Untuk mengetahui adanya aktivitas antibakteri dari isolat Actinomycetes pada sampel pasir Gunung Slamet terhadap bakteri Escherichia coli dan Bacillus subtilis dilakukan dengan cara menganalisis zona hambat yang dihasilkan oleh masing-masing bakteri. Analisis potensi antibakteri menurut (Lee and Hwang., 2002) dibedakan menjadi 3 kategori yaitu kategori kuat dengan ukuran diameter hambat lebih dari atau sama dengan 20 mm, kategori sedang dengan ukuran diameter 10-19 mm, dan kategori lemah dengan ukuran diameter 5-9 mm. Analisis deteksi senyawa kimia berdasarkan Tabel 1. Identifikasi oleh Waksmundzka-Hajnos et al.,(2008) sebagai berikut: Tabel 1. Identifikasi senyawa kimia menurut Waksmundzka-Hajnos et al.,(2008) Reagen Semprot Warna Senyawa Kimia Merah kecoklatan Terpenoid, propilpropanoid Anisaldehid/
3. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1 Pengambilan Sampel, Pra-Perlakuan Sampel dan Isolasi Actinomycetes pada Media Selektif Pra-perlakuan sampel pasir dilakukan dengan cara sampel pasir dikeringkan dalam cawan petri pada suhu ruang (20-27
dan dibiarkan di udara kering terbuka selama 4-9 hari untuk mengurangi
kelembaban dan mengurangi bakteri yang tumbuh (Ambarwati et al., 2012). Pra-perlakuan sampel dilakukan untuk meminimalkan pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan. Menurut seong et al., (2001), pra-perlakuan sampel untuk isolasi Actinomycetes dari tanah dan pasir dengan menggunakan 4 metode, yaitu penambahan antibiotik, pemanasan kering (1 jam pada suhu 100
,
pengeringan dengan pada udara kering selama lebih dari 24 jam, dan pemanasan basah pada suhu 70
selama 15 menit. 5
Hasil dari penanaman sampel pasir pada media starch casein agar (SCA) dengan konsentrasi hingga
diperoleh pada tingkat konsentrasi
koloni Actinomycetes yang tumbuh
lebih banyak tumbuh dan masih bergerombol, berwarna putih, koloni miselium aerialnya terlihat licin, berbentuk bulat-bulat dan masih rapat. Pada tingkat konsentrasi
diperoleh ciri-ciri
berbentuk bulat-bulat, berwarna putih dan kuning, berbentuk bulat-bulat, koloni yang tumbuh lebih sedikit, mulai terpisah, tepian rata, melekat erat pada media dan mengalami pengurangan dibanding pada tingkat konsentrasi lebih sedikit dari konsentrasi
, dan hasil pada tingkat konsentrasi
didapatkan ciri-ciri kultur
, berbentuk bulat, warna putih dan kuning, melekat erat pada
media, dan permukaan padat. Isolat Actinomycetes yang ditanam di media starch casein agar (SCA) dipilih konsentrasi
karena hasil kultur lebih sedikit, tidak bergerombol, berbentuk
bulat, berwarna putih dan kuning memiliki morfologi sifat licin, melekat erat pada media, dan memiliki permukaan yang padat. Kemudian sebanyak 10 isolat ditanam kembali pada media purifikasi Bennett agar. Isolat selain Actinomycetes tidak tumbuh dimungkinkan karena yeast extract kurang baik untuk pertumbuhan isolat selain Actinomycetes. Selanjutnya isolat ditanam pada media oatmeal agar. Isolat dapat dikatakan murni jika hanya satu jenis bakteri yang tumbuh dan dapat dipelajari morfologinya. Sebanyak 10 isolat yang ditanam pada media oatmeal agar diperoleh 5 isolat Actinomycetes dengan kode isolat A4, A6, A8, A10, A10b yang menunjukkan ciri-ciri sebagai isolat Actinomycetes. 3.2 Identifikasi Isolat Actinomycetes Isolat Actinomycetes dari media oatmeal agar diidentifikasi secara makroskopi menunjukkan ciri-ciri isolat Actinomycetes adalah koloni kering, tidak beraturan, tidak berlendir, melekat kuat pada media, padat dan berbubuk, warna koloni, miselium aerial, miselium vegetatif dan warna pigmen difus dengan kode isolat A4, A6, A8, A10, A10b yang menunjukkan ciri-ciri sebagai isolat Actinomycetes yang disajikan pada Tabel 3. Hasil dari pewarnaan Gram isolat Actinomycetes menunjukkan bentuk sel batang, Gram positif, berwarna ungu (Ambarwati et al., 2012). Isolat Actinomycetes kode A4, A10, A10b merupakan ciri-ciri dari bakteri Actinomycetes yaitu Gram positif, berwarna ungu, morfologi sel batang dan memiliki spora (Chawdhury et al., 1991). Hasil identifikasi isolat Actinomycetes secara mikroskopi didapatkan morfologi berbentuk sel batang memiliki spora pada isolat kode A4 dan A10 (Tabel 3).
1 2 3
Tabel 2. Identifikasi makroskopik isolat Actinomycetes pada media oatmeal agar Kode Isolat Warna Miselium Warna Miselium Warna Pigmen Aerial Vegetatif Difus A4 Putih Kuning A6 Hijau tua Kuning Kuning A8 Putih Kuning Kuning
6
4 5
A10 A10b
Putih Coklat tua
Putih Coklat
Kuning Kuning
Tabel 3. Hasil Penanaman Isolat Actinomycetes pada media oatmeal agar Kode Isolat
Miselium Aerial
Miselium Vegetatif
A4
A6
A8
A10
A10b
Keterangan :
Menunjukkan spora yang berfilamen pendek
7
Pewarnaan Gram
3.3 Uji aktivitas Antibakteri Isolat Actinomycetes Actinomycetes merupakan bakteri yang dapat menghasilkan antibiotik. Uji aktivitas antibakteri isolat Actinomycetes dari sampel pasir Gunung Slamet terhadap bakteri Escherichia coli dan Bacillus subtilis. Uji aktivitas antibakteri menggunakan metode agar block
(Nedialkova and
Naidenova 2004). Pada uji aktivitas antibakteri digunakan isolat dengan kode A4, A10, A10B, karena memiliki ciri-ciri yang sama dengan isolat Actinomycetes. Hasil pengujian aktivitas antibakteri terhadap Escherhicia coli dan Bacillus subtilis diperoleh 3 isolat yang memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri. Isolat kode A4, A10, A10B, memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri Escherhicia coli dengan ketegori sedang (10,00 mm - 18,00 mm) dan memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan Bacillus subtilis ketegori kuat (20,00 mm – 26,00 mm). Hasil pengujian aktivitas antibakteri isolat Actinomycetes terhadap bakteri Escherhicia coli dan Bacillus subtilis diperoleh isolat dengan kode A4, A10, A10b (Tabel 4). Tabel 4. Hasil uji aktivitas antibakteri isolat Actinomycetes dengan kode A4, A10, A10b Kode isolat
A4 A10 A10b
Zona Hambat* (mm) Escherichia coli Radikal Potensi 10,00 Sedang 18,00 Sedang 13,00 Sedang
Bacillus subtilis Radikal Potensi 24,00 Kuat 26,00 Kuat 20,00 Kuat
Keterangan : * Diameter zona hambat termasuk diameter dari sumuran (6 mm).
3.4 Identifikasi Senyawa Kimia 3.4.1 Fraksinasi Isolat Actinomycetes Hasil filtrat dari penumbuhan pada media starch casein broth setelah 7 hari diperoleh ciri-ciri yang tumbuh menggumpal, berwarna putih. Hasil filtrat diuji aktivitas antibakteri terhadap Escherichia coli dan Bacillus subtilis. Fraksi etil asetat merupakan fraksi etil asetat yang membentuk zona bening disekitar sumuran yang menandakan senyawa aktif antibakteri dapat terambil oleh fraksi etil asetat. Larutan etil asetat merupakan larutan etil asetat yang digunakan sebagai kontrol fraksi etil asetat. Media hasil penyaringan merupakan media hasil penyaringan. Hasil uji aktivitas antibakteri diperoleh fraksi etil asetat terdapat zona bening disekitar sumuran, dan hasil uji aktivitas antibakteri dari etil asetat dan media hasil penyaringan terdapat zona bening disekitar sumuran yang menandakan adanya senyawa aktif antibakteri. 3.4.2 Uji Kromatografi Lapis Tipis dan Bioautografi Kromatografi adalah teknik pemurnian biomolekul berdasarkaan atas perbedaan interaksi molekul antara fase diam dan fase gerak (Sherma et al., 2003). Metode kromatografi dapat dilakukan untuk proses pemisahan komponen-komponen dari suatu senyawa. Pengujian kromatografi lapis tipis dari fase etil asetat dengan isolat Actinomycetes menggunakan reagen semprot anisaldehid- H2SO4 yang 8
diidentifikasi secara visual didapatkan bercak warna merah kecoklatan pada Rf 0,97. Hasil uji KLT yang disemprot dengan anisaldehid didapatkan bercak warna merah kecoklatan mengandung senyawa terpenoid dan propilpropanoid (Tabel 1), (Waksmundska-Hajnos et al., 2008). Hasil pengamatan uji kromatografi lapis tipis disajikan pada Gambar 1. dan Tabel 5.
Gambar 1. Hasil KLT dengan fase diam silika GF254 dan fase gerak etil asetat : n-heksan (2:3). (A) deteksi visual (B) deteksi UV 254 nm (C) deteksi UV 366 nm (D) Deteksi dengan reagen semprot anisaldehid-H2SO4 secara sinar tampak Tabel 5. Hasil Pengamatan warna lempeng KLT kode isolat A10 Rf 0,15
Visual -
UV 254 nm -
0,18 0,20 0,30 0,31 0,56 0,61 0,80 0,85
Coklat Coklat -
Pemadaman -
UV 366 nm Biru keputihan Biru -
0,95 0,96 0,98
-
Pemadaman -
Biru -
Anisaldehid-
sinar tampak -
Hijau Hijau Hijau tua Merah kecoklatan Merah kecoklatan
Keterangan Terpenoid, propilpropanoid Terpenoid, propilpropanoid
Bioautografi merupakan metode sederhana yang digunakan untuk menunjukkan adanya aktivitas antimikroba (Choma, 2005). Metode yang digunakan adalah metode bioautografi kontak. Hasil uji bioautografi terhadap bakteri Escherichia coli dan Bacillus subtilis menghasilkan 1 zona hambat pada nilai Rf 0,97 (Gambar 2). Bercak warna merah kecoklatan pada kromatografi lapis tipis mengandung golongan senyawa terpenoid dan propilpropanoid (Waksmundzka-Hajnos et al., 2008).
A B Gambar 2. Hasil uji bioautografi pada bakteri Escherichia coli (A) dan Bacillus subtilis (B)
9
4. PENUTUP 4.1 Kesimpulan Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa: 1. Isolat Actinomycetes yang diperoleh dari Pasir Gunung Slamet sebanyak 5 isolat. 2. Isolat Actinomycetes yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli dengan potensi sedang yaitu kode A4 = 10,00 mm, kode A10 = 18,00 mm, dan kode A10b = 13,00 mm. Isolat Actinomycetes yang mampu menghambat bakteri Bacillus subtilis dengan potensi menghambat kuat yaitu kode A4 = 24,00 mm, kode A10 = 26,00 mm, dan kode A10b = 20,00 mm. 3. Golongan senyawa yang terdapat pada isolat Actinomycetes memiliki aktivitas antibakteri yaitu senyawa terpenoid dan propilpropanoid. 4.2 Saran Berdasarkan hasil dan pembahasan dapat disarankan sebagai berikut: 1. Metode pada pengambilan sampel pasir perlu dikaji ulang dengan mengetahui letak titik koordinat secara spesifik. 2. Ada 1 isolat mampu menghambat pertumbuhan bakteri Escherichia coli dan Bacillus subtilis dengan kemampuan kuat,maka perlu dilakukan perbanyakan isolat yang paling poten menggunakan biomassa sampel.
DAFTAR PUSTAKA Ambarwati, A., Sujono, T., Sembiring, L., dan Wahyuono, S., 2012, Uji Aktivitas Antibakteri Isolat Actinomycetes Dari Rizosfer Padi (Oriza sativa) Terhadap Salmonella Typhosa Dan Staphylococus aureus, Journal of Biology, 1 (1), 1–6. Ambarwati A., Sembiring, L., Soegihardjo, C.J., 2014, Antibiotic produced by streptomycetes associated with rhizosphere of purple nut sedge (Cyperus rotundus L.) in Surakarta, Indonesia, African Journal of Microbiology Research, 6 (1), 52–57. Budiyanto, 2004, Mikrobiologi Terapan, Malang, Universitas Muhammadiyah Malang. Budiyanto, M., dan Muhtadi, F., 2012, Peranan Bakteri Actinomycetes dalam Industri Antibiotik, Journal online Biosains, Volume 1, 71-85. Ceylan, Okmen and Ugur, 2008, Isolaton of Soil Streptomyces as Source Antibiotics active AgainsResistant Bacteria, Journal Biosci, 2 (73), 73–82. Choma, I., 2005, The use of thin-layer chromatography with direct bioautography for antimicrobial analysis, LGCG Europe, 18 (9), 1–7. 10
Chowdhury, M., Moniruzzaman, N., Nahar and N., Choudhhury, 1991, Production of Cellulases and Saccharification of Lignocellulolitic by Micromonospora, Journal Microbiology and Biotechnology Springer, 7 (6), 1-8. Lee, J., Y., and Hwang, B., K., 2002, Diversity of Antifungal Actinomycetes in Various Vegetative Soils of Korea, Canadian Journal of Microbiology, 39 , 254-264. Nedialkova, D., and Naidenova, M., 2004, Screening The Antimicrobial Activity Of Actinomycetes Strain Isolated from Antartica. Journal of Culture Colection, 4, 29–35. Nurkanto, A., Listyaningsih, F., Julistiono., & Agusta, A., 2008, Eksplorasi Keanekaragaman Aktinomycetes Tanah Ternate Sebagai Sumber Antibiotik, Jurnal Biologi Indonesia, 6 (3), 325-339. Rahayu, T., dan Ristrianto, D, 2010, Isolasi Rare Actinomycetes dari Pasir Pantai Depok Daerah Istimewa Yogyakarta yang berpotensi Antibiotik terhadap E. coli Multiresisten, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Muhammadiyah Surakarta, Surakarta. Rao N., S., S., 2001, Soil Microbiology, 4 th ed, USA, Science Publishers. Sherma, j., Fried, B., Dekker, M., 2003, Handbook of thin-layer chromatography, 3 ed, Marcel Dekker, Inc., New York, XV, 997. Suwandi, 2010, Skrining Mikroorganisme Penghasil Antibiotik, cermin dunia kedokteran, Jakarta, 89, 46-48. Waksmundzka-Hajnos, M., Sherma, J., and Kowalska, T., 2008, Thin layer chromatography in phytochemistry, chromatographic science series, 99, 184. Waluyo and Lud, 2009, Mikrobilogi Lingkungan, Universitas Muhammadiyah Malang, Malang Press.
11
