Transformasi, Studi Molekuler, dan Bioasai Tanaman Ubi Jalar untuk Ketahanan terhadap Hama atau Penyakit

Transformasi, Studi Molekuler, dan Bioasai Tanaman Ubi Jalar untuk Ketahanan terhadap Hama atau Penyakit Alberta Dinar Ambarwati, D.W. Utami, D. Damayanti, A. Sisharmini, T.J. Santoso, M. Herman, dan Minantyorini Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan, Bogor

ABSTRAK Perakitan tanaman ubi jalar transgenik tahan hama boleng atau penyakit virus dilakukan dengan menyisipkan gen proteinase inhibitor (pinII) atau gen coat protein (CP) dari Sweet Potato Feathery Mottle Virus (SPFMV) ke dalam genom tanaman. Penguasaan teknik transformasi, molekuler, dan bioasai akan sangat mendukung keberhasilan dalam perakitan tanaman transgenik. Pada tahun 2000 dilakukan penelitian transformasi dengan gen pinII dan gen CP-SPFMV melalui penembakan partikel maupun Agrobacterium tumefaciens, serta mem-pelajari teknik dasar molekuler dan bioasai. Eksplan daun dan petiol ubi jalar varietas Jewel digunakan sebagai jaringan target. Ekstraksi DNA tanaman dila-kukan dengan beberapa modifikasi CTAB dan bioasai dilakukan pada umbi ubi jalar putativ transgenik dan nontransgenik (kontrol). Transformasi melalui penembakan partikel dengan kotransformasi pTwa (pinII, Bar) dan pRQ6 (Gus, hpt) belum menghasilkan transforman yang tahan pada seleksi higromisin 25 mg/l. Sedangkan melalui A. tumefaciens dihasilkan 18 tanaman putativ transge-nik yang ditransformasi dengan gen pinII dan enam tanaman putativ transgenik dengan gen CP-SPFMV. Hasil kuantitas konsentrasi o DNA berkisar 0,7-1,8 µg/µl. Optimasi PCR diperoleh pada kondisi 95 C selama 30 o o detik, 50 C selama 60 detik, dan 72 C selama 45 detik. Pengujian bioasai pada 32 umbi berdasarkan jumlah lubang gerekan menunjukkan rata-rata skor kerusakan umbi 4,4-4,5 de-ngan persentase mortalitas Cylas pada tanaman putativ transgenik lebih tinggi (30,8%) dibandingkan dengan tanaman nontransgenik (15%). Kata kunci: Transformasi, molekuler, bioasai, pinII, CP-SPFMV, ubi jalar

ABSTRACT The production of transgenic sweet potato resistant to pest or virus disease was done by inserting proteinase inhibitor (pinII) gene or coat protein (CP) of Sweet Potato Feathery Mottle Virus (SPFMV) gene into sweet potato genome through transformation technique. Knowledge of transformation, molecular, and bio-assay is therefore important in contributing the success to produce transgenic plant. Experiment was conducted in 2000, including some activities: transforma-tion with pinII and CP-SPFMV gene via particle bombardment and Agrobac-terium tumefaciens, study on basic molecular, and bioassay. Explants from petiole and leaf pieces of sweet potato cv. Jewel were used as target tissues. DNA extraction used the modification of CTAB method and bioassay was conducted on storage roots of putative transgenic plants and non transgenic plants (control). Transformation via particle bombardment with co-transformation of pTwa (pinII, Bar) and pRQ6 (Gus, hpt) have not produced the transformant yet surviving in hygromycin selection (25 mg/l). Transformation via A. tumefaciens produced 18 and six putative transgenic plants transformed with pinII and CP-SPFMV gene, respectively. The quantity of the DNA concentration was about 0.7-1.8 µg/µl. Optimation of PCR was o o o obtained at 95 C for 30 sec, 50 C for 60 sec, and 72 C for 45 sec. Bioassay on 32 storage roots based on the number of punctures, showed the score damaged roots was 4.4-4.5 and the percentage of Cylas mortality on putative transgenic plants (30.8%) was higher than on untransformed plants (15%). Key words: Transformation, molecular, bioassay, pinII, CP-SPFMV, sweet potato

Prosiding Seminar Hasil Penelitian Rintisan dan Bioteknologi Tanaman

19

PENDAHULUAN Serangan hama boleng ubi jalar Cylas formicarius maupun penyakit virus yang disebabkan oleh Sweet Potato Feathery Mottle Virus (SPFMV) merupakan kendala dalam budi daya ubi jalar, yang dapat menyebabkan kehilangan hasil 30-100% (Chalfont et al., 1990; Nakano et al., 1994). Berkembangnya bioteknologi memungkinkan penggunaan sumber gen yang berasal dari organisme lain, yang tidak tersedia dalam plasma nutfahnya. Untuk mendapatkan tanaman ubi jalar yang mempunyai ketahanan terhadap hama boleng C. formicarius dapat dilakukan dengan menyisipkan gen proteinase inhibitor (pinII) ke dalam genom tanaman ubi jalar. Sedangkan untuk ketahanan terhadap penyakit virus SPFMV dengan menyisipkan gen coat protein dari SPFMV. Penyisip-an gen ketahanan ini dapat dilakukan dengan teknik transformasi gen melalui penembakan partikel (Prakash dan Varadarajan, 1992) atau melalui Agrobacterium tumefaciens (Newell et al., 1995; Otani et al., 1998). Keberadaan/ekspresi gen pelapor Gus dapat dideteksi melalui pengujian histokimia dengan cara merendam jaringan transforman dalam larutan β-glucuronidase (Jefferson et al., 1987). Sedangkan identifikasi terjadinya integrasi gen sasaran dapat dikonfirmasi melalui analisis molekuler, misalnya dengan teknik PCR atau Southern Blot. Dengan teknik PCR, sekuen DNA dari gen pinII atau gen CP-SPFMV yang diapit oleh primer oligonukleotida spesifik dari gen ini dapat diamplifikasi se-banyak pengulangan siklus dalam proses PCR tersebut, sehingga dapat terdeteksi keberadaannya dalam genom tanaman (Chee et al., 1991). Tanaman yang positif mengandung gen sasaran masih perlu diuji tingkat ekspresi atau keefektifannya terhadap hama atau penyakit target melalui bioasai. Evaluasi ketahanan ubi jalar terhadap hama boleng dapat dinilai berdasarkan banyaknya lubang gerekan pada permukaan umbi (Rolston et al., 1979), persentase luas permukaan umbi yang rusak atau kedalaman umbi yang rusak (Hahn dan Leuschner, 1981). Penelitian Newell et al. (1995) telah mendapatkan tanaman ubi jalar transgenik yang meng-ekspresikan enzim β-glucuronidase, cowpea trypsin inhibitor, dan snowdrop lectin setelah melalui analisis Southern Blot, RNA dot blot, dan analisis protein menggu-nakan deteksi chemiluminescence. Dengan telah diperolehnya beberapa tanaman putativ transgenik hasil transformasi dengan gen pinII maupun gen CP-SPFMV, maka pada tahun anggaran 2000 dapat dilakukan penelitian awal untuk pengujian molekuler, yaitu optimasi teknik ekstraksi DNA ubi jalar dan PCR serta pengujian ketahanan ubi jalar terhadap hama boleng. Di samping itu, kegiatan transformasi dengan gen pinII atau gen CP-SPFMV masih dilanjutkan untuk mendapatkan jumlah tanaman yang lebih banyak. BAHAN DAN METODE Penelitian dilakukan pada tahun 2000 di Kelti Biologi Molekuler, Balitbio, Bogor dan merupakan penelitian lanjutan dari tahun anggaran (TA) 1998/99. Eksplan yang digunakan untuk penelitian transformasi adalah potongan daun dan petiol yang diambil dari kultur sumber eksplan (mother stocks) ubi jalar varietas Jewel, sedangkan daun dan umbi tanaman putativ transgenik ubi jalar masingmasing digunakan sebagai materi untuk analisis molekuler dan bioasai.

20

Ambarwati et al.: Transformasi, Studi Molekuler, dan Bioasai Tanaman Ubi Jalar

Transformasi dengan Gen pinII melalui Penembakan Partikel Metode transformasi menggunakan prosedur Klein et al. (1988) dengan alat gen gun (Biolistic PDS 1000/He) Biorad. Kondisi yang digunakan untuk penembak-

an berdasarkan hasil optimasi penelitian tahun sebelumnya, yaitu tekanan 1100 psi, jumlah tembakan dua kali dengan jarak tembak 7 dan 9 cm. Penembakan menggunakan sistem ko-transformasi pTwa (pinII, Bar) dengan pRQ6 (Gus, hpt) pada molaritas 2 : 1. Eksplan daun dan petiol hasil transformasi selanjutnya ditumbuhkan pada media induksi dan regenerasi dengan seleksi higromisin 25 mg/l. Transformasi dengan Gen pinII atau gen CP-SPFMV melalui A. tumefaciens Transformasi untuk ketahanan terhadap hama menggunakan Agrobacterium strain LBA4404 yang mengandung pGA643pin dengan gen ketahanan antibiotik kanamisin. Sedangkan transformasi untuk ketahanan terhadap penyakit virus SPFMV menggunakan plasmid pMON10574-1 yang berisi gen coat protein SPFMV, nptII, dan uidA. Prosedur transformasi berdasarkan metode Newell et al. (1995) atau modifikasinya. Eksplan daun dan petiol diinokulasi dengan A. tumefaciens selama 30-60 menit. Ko-kultivasi menggunakan media dengan penambahan asetosiringon 10 mg/l selama 3 sampai 4 hari. Seleksi ketahanan kalus dan regenerasi dilakukan dengan kanamisin 50 mg/l. Tunas atau planlet hasil transformasi diaklima-tisasi dan ditanam di rumah kaca. Ekstraksi DNA dan Analisis PCR Ekstraksi DNA ubi jalar menggunakan modifikasi metode CTAB (Porebski et al., 1997; Varadarajan dan Prakash, 1991). Sebelum dilakukan ekstraksi DNA,

daun tanaman ubi jalar diberi perlakuan gelap dengan cara ditutup dengan aluminium foil selama 12-48 jam (Varadarajan dan Prakash, 1991). Bufer ekstraksi terdiri dari 100 mM Tris HCl, 50 mM EDTA, 500 mM NaCl, 0,3% βmercaptoethanol, 2% CTAB, dengan penambahan PVP 50 mg (Porebski et al., 1997). Pemurnian DNA dengan menambahkan campuran chloroform dan octanol (24 : 1). Uji kuantitas konsen-trasi DNA menggunakan spektrofotometer. Hasil DNA yang diperoleh, selanjutnya digunakan untuk analisis PCR dengan mesin PCR Programable Thermal Controller (MJ Research Inc, Massachussetts, USA). Bioasai terhadap Hama Boleng C. formicarius Umbi ubi jalar tanaman putativ transgenik dan nontransgenik (kontrol) diinfestasi, masing-masing dengan 5 pasang imago per umbi. Pengamatan kerusakan umbi dilakukan 1 minggu setelah infestasi dengan menghitung jumlah lubang gerekan (Rolston et al., 1979). Setelah 3 minggu diinfestasi, umbi dibelah untuk menghitung jumlah larva dan pupa yang hidup. HASIL DAN PEMBAHASAN Transfomasi Induksi kalus dan regenerasi eksplan hasil transformasi menggunakan media Gosukonda et al. (1995) maupun Newell et al. (1995) yang sudah digunakan untuk penelitian regenerasi ubi jalar tanpa ditransformasi pada tahun anggaran se-belumnya (Ambarwati et al., 2000). Transformasi dengan gen pinII dilakukan


21

seca-ra langsung dengan penembakan partikel dan secara tidak langsung melalui vektor A. tumefaciens. Eksplan daun dan petiol yang ditransformasi melalui penembakan partikel belum ada yang tumbuh atau tahan pada media seleksi 3 dengan higromi-sin 25 mg/l. Persentase kalus tahan pada seleksi 2 (12-25%) juga berkurang diban-dingkan dengan seleksi 1 (34-65%) (Tabel 1). Proses transformasi melalui penembakan partikel bersifat random, sehingga ada kemungkinan jaringan/sel tersebut tidak ikut tertransformasi sehingga tidak Tabel 1. Kalus terseleksi pada transformasi ubi jalar dengan gen pinII melalui penembakan partikel pada ko-transformasi pTwa : pRQ6 Eksplan

Jumlah eksplan

Kalus terseleksi 1

Kalus terseleksi 2

Kalus terseleksi 3

98 138

34 (34,7%) 90 (65,2%)

12 (12,2%) 35 (25,4%)

0 0

Daun Petiol

Seleksi higromisin 25 mg/l; pTwa: pinII; Bar, pRQ6: Gus; hpt

mempunyai ketahanan pada media seleksi. Di samping itu, kerusakan sel/jaringan akibat faktor fisik selama proses penembakan akan lebih besar dibandingkan dengan melalui A. tumefaciens. Konsentrasi higromisin 25 mg/l yang digunakan Otani et al. (1998) pada transformasi ubi jalar melalui A. tumefaciens tampaknya masih terlalu tinggi untuk penyeleksi pada transformasi secara langsung. Oleh karena itu, masih perlu dilakukan penelitian optimasi konsentrasi higromisin yang tepat sebagai agen seleksi untuk transformasi melalui penembakan partikel. Teknik transformasi yang lain adalah melalui vektor A. tumefaciens. Teknik ini tampaknya lebih memberikan harapan untuk mendapatkan tanaman transgenik dibandingkan dengan melalui penembakan partikel. Transformasi dengan Agrobacterium memberikan kemungkinan jaringan yang tertransformasi lebih besar, di samping integrasinya bersifat sederhana (low copy number), relatif lebih murah, dan reprodusibel (Songstad et al., 1995; Siemens dan Schieder, 1996). Transformasi menggunakan Agrobacterium LBA4404 yang berisi pGA643pin (pinII, nptII) telah menghasilkan beberapa tanaman putativ transgenik setelah melalui se-leksi kanamisin 50 mg/l. Setelah 3 kali subkultur (pada media seleksi 3) kalus ma-sih bisa bertahan (31-41%) dan sebagian bisa beregenerasi membentuk Tabel 2. Transformasi ubi jalar dengan gen pinII melalui A. tumefaciens Eksplan Daun Petiol

Jumlah eksplan

Kalus terseleksi 3

132 189

42 (31,8%) 78 (41,3%)

Regenerasi 2 (1,5%) 16 (8,5%)

Seleksi kanamisin 50 mg/l, pGA643pin, pinII, nptII Tabel 3. Transformasi ubi jalar dengan gen CP-SPFMV melalui A. tumefaciens Eksplan Daun Petiol

Jumlah eksplan

Kalus terseleksi 3

44 38

15 (34,1%) 6 (15,8%)

Regenerasi 0 6 (15,8%)

Seleksi kanamisin 50 mg/l, pMON10574-1, CP-SPFMV, Gus, nptII

22


tanaman, baik untuk eksplan daun maupun petiol (Tabel 2). Kemampuan regenerasi eksplan petiol (8,5%) lebih besar dibandingkan dengan eksplan daun (1,5%). Hal yang sama dijumpai pada penelitian Lowe et al. (1994) di mana keberhasilan tertinggi juga diperoleh dari eksplan petiol. Transformasi melalui A. tumefaciens juga dilakukan dengan gen CP-SPFMV untuk ketahanan terhadap penyakit virus SPFMV. Tabel 3 memperlihatkan bebera-pa kalus dan tunas yang lolos pada media seleksi. Dengan terekspresinya gen Gus melalui Gus assay dan gen nptII (kanamisin) memberikan harapan bahwa gen sasaran CP-SPFMV telah ikut terintegrasi, karena ketiga gen tersebut terdapat dalam T-DNA yang ditransfer oleh Agrobacterium ke tanaman. Seperti halnya transformasi dengan gen pinII, pada transformasi menggu-nakan gen CP-SPFMV ini terlihat bahwa eksplan petiol lebih responsif untuk bere-generasi membentuk tanaman. Dari enam kalus yang lolos seleksi kanamisin menghasilkan enam tanaman regenerasi secara organogenesis. Penelitian Murata et al. (1998) menghasilkan ubi jalar yang positif mengandung gen CP-SPFMV mela-lui pengujian molekuler setelah ditransformasi secara langsung dengan elektropo-rasi dan penembakan partikel. Untuk memastikan keberadaan gen pinII maupun gen CP-SPFMV dalam genom tanaman putativ transgenik tersebut perlu dilakukan pengujian secara molekuler. Studi Molekuler Mengingat banyaknya kandungan metabolit sekunder pada ubi jalar dan belum pernah dilakukan ekstraksi DNA ubi jalar di Balitbio, maka sebagai pendahulu-an studi molekuler akan dilakukan optimasi teknik ekstraksi DNA ubi jalar. Ekstraksi DNA ubi jalar menggabungkan modifikasi metode Varadarajan dan Prakash (1991) dan Porebski et al. (1997). Metode ini khusus untuk tanaman de-ngan kandungan polisakarida dan polifenol tinggi. Polisakarida akan menyulitkan teknik ekstraksi karena membentuk suatu matriks gelatin sehingga DNA sukar di-pisahkan dan tidak dapat teramplifikasi pada PCR dengan menghambat aktivitas Taq polimerase (Porebski et al., 1997). Untuk itu, telah dilakukan beberapa modifi-kasi, seperti perlakuan gelap daun tanaman selama 1248 jam sebelum diekstrak DNAnya (Varadarajan dan Prakash, 1991), penambahan β-mercaptoetanol dan pvp (polivinilpirolidon) dalam bufer ekstraksi (Porebski et al., 1997). PVP merupakan suatu polimer solid dengan berat molekul tinggi yang akan mengikat polifenol me-lalui hydrogen bonding sehingga dapat dipisahkan dari DNA (Porebski et al., 1997). Sharma et al. (2000) menambahkan DEAE-cellulose dalam purifikasi untuk meng-eliminasi protein, polisakarida, dan polifenol pada ekstraksi DNA kacang tanah.


23

Dengan memodifikasi metode ini, telah diekstraksi delapan sampel tanaman ubi jalar hasil transformasi dari penelitian TA 1999/2000 (Gambar 1) sebelum dipurifikasi dengan RNA-se. Sedangkan hasil optimum kuantitas konsentrasi DNA menggunakan spektrofotometer pada rasio OD A260/A280 adalah 0,7-1,8 µg/µl (Tabel 4). Varadarajan dan Prakash (1991) menghasilkan sampel DNA ubi jalar dengan kuantitas 1,6-1,8 (A260/A280) yang selanjutnya dapat dipotong oleh beberapa enzim restriksi seperti Bgl II, Hae III, dan Xho. Untuk penelitian tahun selanjutnya akan dilakukan pemisahan hasil amplifikasi PCR dengan elektroforesis agarose gel dan pewarnaan ethidium bromide. Bioasai Di samping studi awal molekuler, telah dicoba pula pengujian (bioasai) untuk melihat keefektifan tanaman terhadap hama boleng C. formicarius. Bioasai dilakukan pada 32 umbi ubi jalar berumur 9 bulan dari tanaman putativ transgenik pinII yang diperoleh melalui penembakan partikel maupun A. tumefaciens. Setiap umbi diinfestasi dengan lima pasang imago hama boleng. Hasil bioasai disajikan pada Tabel 5 dan 6. Dilihat dari rata-rata skor kerusakan umbi, yaitu 4,4 sampai 4,5 menunjukkan bahwa dalam setiap umbi terdapat kira-kira 11-15 lubang kerusakan. Sedangkan apabila dilihat dari tingkat mortalitas Cylas pada tanaman putativ yang diuji me-nunjukkan persentase yang lebih tinggi (22,5-39%) dibandingkan dengan tanaman kontrol (10-20%). Demikian juga dengan rata-rata jumlah larva (2,6) maupun jum-lah pupa (1,6) yang hidup pada tanaman putativ adalah lebih sedikit daripada yang ditemukan pada tanaman kontrol (6,7) dan (3,5). Beberapa peneliti menggunakan prosedur evaluasi ketahanan yang berlainan.

Gambar 1. Hasil DNA yang diekstrak dengan metode modifikasi CTAB Tabel 4. Hasil pengamatan kuantitas konsentrasi DNA Sampel 1 2 3 4 5 6 7 8 (kontrol)

24

OD A260

OD A280

Kemurnian

Konsentrasi (µg/µl)

0,84 0,90 0,59 0,89 0,14 0,56 1,48 0,36

0,48 0,55 0,38 0,50 0,62 0,34 0,79 0,33

1,75 1,84 1,55 1,78 1,78 1,65 1,87 1,70

1,05 1,13 0,74 1,11 1,43 0,70 1,85 0,77


Tabel 5. Bioasai umbi ubi jalar hasil transformasi dengan gen pinII melalui penembakan partikel terhadap hama boleng Sampel tanaman 1 2 3 4 5 6 7 8 Rata-rata Kontrol

Skor kerusakan umbi 4,50±0,5 4,00±0,8 4,50±0,5 4,50±0,5 4,50±0,5 4,50±0,5 4,33±0,4 4,75±0,4 4,40±0,5 4,80±0,4

Mortalitas (%) Jumlah larva (ekor) 37,5 40,0 35,0 22,5 55,0 30,0 46,7 45,7 39,05 20,0

2,5 2,3 3,5 2,0 2,0 2,5 2,6 2,3 2,4 9,2

Jumlah pupa (ekor) 1 1 1 1,3 2 1 1,3 1,5 1,2 4

Tabel 6. Bioasai umbi ubi jalar hasil transformasi dengan gen pinII melalui A. tumefaciens terhadap hama boleng Sampel tanaman 1 2 Rata-rata Kontrol

Skor kerusakan umbi

Mortalitas (%)

Jumlah larva (ekor)

Jumlah pupa (ekor)

4,75±0,4 4,25±0,4 4,50±0,4 4,80±0,4

32,50 12,50 22,50 10,00

2,5 3,2 2,8 4,2

2,5 1,75 2,1 3,0

Jayaramiah (1975) menggunakan persentase kerusakan umbi sebagai kriteria ketahanan. Metode seleksi ketahanan yang dikemukakan oleh Talekar (1982) adalah berdasarkan nilai rata-rata dan sim-pangan baku dari jumlah hama boleng tiap 1 kg umbi, persentase kerusakan umbi, atau jumlah hama boleng dan persentase kerusakan umbi. Dari hasil yang telah diperoleh masih perlu ditindaklanjuti, misalnya dengan kegiatan transformasi untuk meningkatkan perolehan jumlah tanaman yang lebih memadai, melanjutkan kegiatan molekuler maupun bioasai sehingga diperoleh tanaman ubi jalar yang positif mengandung gen pinII atau gen CP-SPFMV serta mempunyai ketahanan terhadap hama boleng atau penyakit virus. KESIMPULAN 1. Transformasi melalui A. tumefaciens menghasilkan 18 tanaman putativ transgenik ubi jalar yang ditransformasi dengan gen pinII dan 6 tanaman putativ transgenik yang ditransformasi dengan gen CP-SPFMV. 2. Studi pendahuluan molekuler untuk ekstraksi DNA menghasilkan DNA dengan kuantitas (A260/A280) sebesar 0,7-1,8 µg/µl. 3. Bioasai pada 32 umbi ubi jalar terhadap hama boleng di laboratorium menunjukkan rata-rata skor kerusakan umbi 4,4-4,5; persentase mortalitas Cylas pada tanaman putativ lebih tinggi dibandingkan dengan tanaman kontrol, sedangkan jumlah larva dan pupa hidup yang ditemukan pada tanaman putativ lebih sedikit daripada tanaman kontrol.


25

DAFTAR PUSTAKA Ambarwati, A.D., M. Herman, A. Sisharmini, E. Listanto, T.J. Santoso, dan Minantyorini. 2000. Transformasi tanaman ubi jalar untuk ketahanan terhadap hama dan penyakit. Laporan Hasil Penelitian TA 1999/2000. 62 hlm. Chalfont, R.B., R.K. Janson, D.R. Seal, and J.M. Schalk. 1990. Ecology and management of sweet potato insects. Annu. Rev. Entomol 35:157-180. Chee, P.P., R.F. Drang, and J.L. Slightom. 1991. Using polymerase chain reaction to identify transgenic plants. Plant Molecular Biology Reporter 20:1928-1931. Gosukonda, R.M., A. Parobodessai, E. Blay, C.S. Prakash, and C.M. Peterson. 1995. Thidiazuron-induced adventitious shoot regeneration of sweet potato (Ipomoea batatas). In Vitro Cell Dev. Biol. 31:65-71. Hahn, S.K. and K. Leuschner. 1981. Resistance of sweet potato cultivars of African to sweet potato weevil. Crop Sci. 21:499-503. Jayaramiah, M. 1975. Reaction of sweet potato varieties to damage of the weevil, Cylas formicarius (Fabr.)(Coleoptera : Curculionidae) and on the possibility of picking up of infestation by weevil. Mysore J. Agric. Sci. 9:418-421. Jefferson, R.A., T.A. Kavanagh, and M.W. Bevan. 1987. Gus fusions: Glucuronidase as a versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6:3901-3907. Klein, T.M., M. Fromm, A. Weissinger, D. Tomes, S. Schaaf, M. Sletten, and J. Sanford. 1988. Transformation of maize cells using high velocity microprojectile. Proc. Natl. Acad. Sci. 85:4305-4309. Lowe, J.M., W.D.O. Hamilton, and C.A. Newell. 1994. Genetic transformation in Ipomoea batatas (L.) Lam (sweet potato). In Bajaj, Y.P.S. (Ed.). Biotechnology in Agriculture and Forestry. Plant Protoplasts and Genetic Engineering 29:304-316. Murata, T., Y. Okada, A. Saito, T. Kimura, M. Mori, M. Nishiguchi, K. Hanada, J. Sakai, and H. Fukuoka. 1998. Transformation by direct gene transfer in sweet potato (Ipomoea batatas L. (Lam.). Proceeding of International Workshop on Sweet Potato Production System toward the 21st Century. Miyakonojo, Japan. p. 159-180. Nakano, N., S. Fuentes, and L.F. Salazar. 1994. Spot virus diseases detected in the tropics of South and Central America and South East Asia. JIRCAS Paper 1:5865. Newell, C.A., J.M. Lowe, A. Merryweather, L.M. Rooke, and W.D.O. Hamilton. 1995. Transformation of sweet potato [Ipomoea batatas (L.) Lam.] with Agrobacterium tumefaciens and regeneration of plants expressing cowpea trypsin inhibitor and snowdrop lectin. Plant Science 107:215-227. Otani, M., T. Shimada, T. Kimura, and A. Saito. 1998. Transgenic plant produc-tion from embryogenic callus of sweet potato [Ipomoea batatas (L.) Lam.] using Agrobacterium tumefaciens. Plant Biotechnology 15(1):11-16.

26


Porebski, S., L.G. Bailey, and B.R. Baum. 1997. Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant Molecular Biology Reporter 15(1):8-15. Prakash, C.S. and U. Varadarajan. 1992. Genetic transformation of sweet potato by particle bombardment. Plant Cell Rep. 11:53-57. Rolston, L.H., T. Barlow, T. Hernandez, S.S. Nilakhe, and A. Jones. 1979. Field evaluation of breeding lines and cultivar of sweet potato for resistance to the sweet potato weevil. Hort. Sci. 14:634-635. Sharma, K.K., M. Lavanya, and V. Anjaiah. 2000. A method for isolation and purification of peanut genomic DNA suitable for analytical applications. Plant Molecular Biology Reporter 18:393a-393h. Siemens, J. and O. Schieder. 1996. Transgenic plants: Genetic transformationrecent developments and the state of the art. Plant Tissue Culture and Biotechnology 2(2):66-75. Songstad, D.D., D.A. Somers, and R.J. Grusbach. 1995. Advances in alternative DNA delivery techniques. Plant Cell, Tissue, and Organ Culture 40:1-15. Talekar, N.S. 1982. A search for sources of resistance to sweet potato weevil. In Villareal, R.L. and T.D. Griggs (Eds.). Sweet Potato. Proc. of the First Inter. Sym. AVRDC, Tainan, Taiwan. p. 147-156. Varadarajan, G.S and C.S. Prakash. 1991. A rapid and efficient method for the extraction of total DNA from the sweet potato and its related species. Plant Molecular Biology Reporter 9(1):6-12.


27

Transformasi, Studi Molekuler, dan Bioasai Tanaman Ubi Jalar untuk Ketahanan terhadap Hama atau Penyakit

Recommend Documents