TINJAUAN PUSTAKA Bakteri Bintil Akar Salah satu interaksi bakteri dengan tanaman yang paling penting dan menarik adalah antara tanaman legum dan bakteri dari genus Rhizobium, Bradyrhizobium, Shinorhizobium, Mesorhizobium dan Azorhizobium.
Legum
merupakan suatu kelompok besar tanaman yang memiliki nilai ekonomi penting seperti kedelai, semanggi (clover), alfafa, buncis, dan kapri.
Rhizobium,
Bradyrhizobium, Shinorhizobium, Mesorhizobium dan Azorhizobium adalah bakteri gram negatif motil yang berbentuk batang. Infeksi akar tanaman legum oleh spesies yang cocok dengan salah satu genus tersebut mengarah pada pembentukan bintil akar yang dapat mengubah nitrogen yang berupa gas menjadi nitrogen terikat, dan proses ini dinamakan fiksasi nitrogen. Pada umumnya bintil terbentuk pada akar tanaman, namun bintil juga dapat terbentuk pada batang, misalnya pada legum tropis Sesbania yang dinodulasi oleh Azorhizobium caulinodans. Tanaman ini tersebar di daerah tropis yang tanahnya seringkali mengalami defisiensi nitrogen (Madigan et al. 2003). Sekitar 90% dari seluruh spesies tanaman legum dapat mengalami nodulasi. Namun, terdapat spesifisitas antara legum dan galur Rhizobium. Suatu galur Rhizobium umumnya dapat menginfeksi spesies legum tertentu dan tidak pada spesies lainnya.
Sekelompok galur Rhizobium yang dapat menginfeksi
kelompok legum yang berkerabat dinamakan kelompok inokulasi silang. Walaupun galur Rhizobium mampu menginfeksi legum tertentu, tetapi tidak selalu dapat menghasilkan bintil yang memfiksasi nitrogen (Madigan et al. 2003). Genus Bradyrhizobium hanya memiliki satu tipe spesies, yaitu Bradyrhizobium japonicum (Holt et al. 1994). Menurut Perret et al. (2000), B. japonicum termasuk salah satu anggota famili Rhizobiaceae yang memiliki kisaran
inang
yang
luas
seperti
pada
tanaman
anggota
kelompok
Aeschynomeneae (Papilionoideae), Arachis spp., Phaseoleae (Papilionoideae), Macroptilium, dan Vigna spp. Namun pada umumnya B. japonicum membentuk bintil akar pada jenis legum anggota kelompok Phaseoleae (Papilionoideae) dan Glycine spp.
5 B. japonicum memiliki karakteristik antara lain berbentuk batang dengan ukuran 0.5-0.9 x 1.2-3.0 µm, tidak membentuk spora, dapat membentuk granul poly-β-hidroksibutirat, motil dengan satu flagela polar atau subpolar, dan bersifat aerobik. Temperatur optimum pertumbuhannya berkisar antara 25-30 oC sedangkan pH optimumnya 6-7 meskipun demikian galur yang berasal dari tanah asam dapat hidup di bawah pH optimum (Holt et al. 1994). Toleransi Bakteri Bintil Akar terhadap Cekaman Lingkungan Asam Simbiosis Rhizobium-legum dipengaruhi oleh penurunan pH tanah. Penurunan pH tanah tidak hanya menimbulkan peningkatan konsentrasi proton, tetapi juga kelarutan logam seperti aluminium yang bersifat toksik terhadap BBA. Respon BBA terhadap tanah asam tergantung pada interaksi sejumlah faktor diantaranya konsentrasi H+, aktivitas Al3+ dan kemampuan kompetisi dan persistensi dari galur Rhizobium (Tiwari et al.1992). Isolasi dan karakterisasi BBA dilakukan untuk memperoleh galur yang toleran terhadap lingkungan asam. Adanya BBA yang toleran asam-Al menjadi sumber eksplorasi materi genetik yang berperan dalam respon toleransi bakteri tersebut pada lingkungan asam. Telaah molekuler dilakukan dengan menggunakan mutan yang dihasilkan melalui mutagenesis dengan transposon seperti Tn5. Goss et al. (1990) melakukan karakterisasi mutan galur Rhizobium meliloti WSM419 yang dihasilkan melalui mutagenesis dengan Tn5. Galur liar R. meliloti WSM419 dapat bertahan hidup dan memiliki kemampuan nodulasi pada tanah asam (pH 5.6). Sementara itu galur mutannya menjadi sensitif terhadap asam dan tidak mampu tumbuh pada pH 5.6. Hal ini menunjukkan pada galur mutan telah kehilangan kemampuan untuk memelihara pH intraselulernya (pHi).
Hasil
analisis fragmen DNA yang membawa Tn5 dan klon sekuen pengapit dari mutan tersebut menunjukkan lokus act (untuk acid tolerance) berada pada 4.4 kb dari fragmen yang dipotong dengan EcoRI.
Selanjutnya Tiwari et al. (1992)
melakukan karakterisasi mutan yang diinduksi dengan Tn5 dari galur-galur R. meliloti WSM419 dan R. leguminosarum WSM710. Hasil pemetaan melalui pemotongan dengan enzim restriksi pada WSM419 menunjukkan bahwa gen yang berperan dalam toleransi terhadap asam berada pada empat fragmen unik hasil
6 pemotongan dengan EcoRI. Pada galur mutan yang sensitif terhadap pH media di bawah 6.0 (TG2-6) dengan kandungan Ca 1 mM, dapat diperbaiki kemampuan ketahanan hidupnya pada pH media 5.5 dengan penambahan Ca 50 mM. Pada galur ini peningkatan konsentrasi Ca media dapat memperkecil penurunan pHi. Sementara itu pada WSM710, dua gen yang berperan dalam toleransi terhadap asam berada pada fragmen hasil pemotongan dengan EcoRI yang terpisah yaitu pada 12 kb dan 16 kb.
Karena galur-galur R. leguminosarum lebih toleran
terhadap asam daripada WSM419, maka terdapat kemungkinan untuk transfer materi genetik dari galur yang lebih toleran ke galur yang kurang toleran. Analisis sekuen DNA yang terlibat dalam respon toleransi BBA terhadap lingkungan asam telah dipelajari pada R. tropici (Ricillo et al. 2000), R. leguminosarum bv. viciae, dan S. meliloti (Reeve et al. 2002). Hasil analisis gen yang mengalami penyisipan oleh Tn5-luxAB pada galur mutan R. tropici CIAT899-13T2 yang tidak mampu tumbuh pada kondisi asam, menunjukkan similaritas yang tinggi dengan gen gsh dari E. coli yang menyandikan enzim glutathion synthetase. Kelimpahan Kalium dan pHi pada galur mutan tersebut lebih rendah dibandingkan tipe liarnya (Ricillo et al. 2000). Pada galur mutan R. leguminosarum bv. viciae, dan S. meliloti yang mengalami transposisi Tn5 pada gen actP mengalami hambatan ekspresi dari P-type ATPase yang termasuk subfamili CPx yang berperan dalam transport logam berat. Pada mutan yang mengalami knockout pada gen actP tersebut menunjukkan sensitivitas terhadap Cu.
Hal ini menunjukkan adanya keterlibatan logam berat tersebut dalam
mempertahankan pH media pada kondisi asam (Reeve et al. 2002). Selain itu ketahanan terhadap pH juga dipelajari pada E. coli yang memiliki kemampuan adaptasi terhadap perubahan lingkungannya. E. coli dapat tumbuh pada kisaran pH eksternal yang luas yaitu antara 5-9. Pada E. coli homeostasis pH tergantung pada konsentrasi K+ eksternal (White et al. 1992). Arginin dekarboksilase yang disandikan oleh gen adi mengalami induksi pada pH asam, anaerobiosis, dan media kaya. Hasil analisis sekuen DNA yang berukuran 3 kb dari kromosom E. coli yang menyandikan arginin dekarboksilase menunjukkan bahwa sekuen ini menyandikan protein yang terdiri atas 755 asam amino dan berukuran 84420 Da, serta memiliki homologi dengan dekarboksilase
7 lain dari E. coli yaitu CadA (lisin dekarboksilase), SpeC (ornitin dekarboksilase biosintetik) dan SpeF (ornitin dekarboksilase biodegradatif) (Stim & Bennet 1993). Mutagenesis dengan Transposon pada Bakteri Masing-masing tipe bakteri membawa transposon yang unik, berikut ini adalah beberapa tipe transposon yang umum terdapat pada bakteri antara lain: (i) insertion sequence elements (elemen IS), (ii) transposon komposit, dan (iii) transposon nonkomposit (Snyder & Champness 1997). Elemen IS adalah transposon bakteri terkecil yang biasanya hanya berukuran 750-2000 bp dan hanya mengkode enzim transposase yang dibutuhkan dalam transposisinya.
Elemen IS tidak membawa gen penanda seleksi dan
ditemukan hanya karena elemen ini menimbulkan inaktivasi dari gen yang disisipinya. Pada E. coli secara alami ditemukan empat elemen IS yang berbeda yaitu IS1, IS2, IS3, dan IS4. Sampai saat ini telah ditemukan lebih dari 700 elemen IS pada bakteri, meskipun kebanyakan dapat digolongkan dalam 20 famili. Kadang-kadang dua elemen IS dari tipe yang sama membentuk transposon yang lebih besar, disebut tranposon komposit dengan membawa gen lain. Contoh tipe transposon komposit yaitu Tn5, Tn9, dan Tn10. Untuk transposon komposit Tn5 misalnya terdiri atas gen untuk resistensi terhadap kanamisin (Kanr) dan resistensi streptomisin (Strr) yang diapit oleh elemen IS yang disebut IS50. Transposon komposit bukan satu-satunya tipe transposon yang membawa gen-gen resistensi terhadap antibiotik.
Gen-gen tersebut juga dapat menjadi
bagian dari transposon nonkomposit.
Gen-gen pada transposon nonkomposit
diapit oleh suatu inverted repeat dan tipe transposon ini minimal terdiri atas satu gen resistensi saja. Contoh transposon nonkomposit adalah Tn3 yang memiliki gen resistensi terhadap ampisilin. Tidak semua tipe transposon dapat digunakan untuk mutagenesis. Suatu transposon yang digunakan dalam mutagenesis harus memiliki kelengkapan berikut ini: (i) memiliki kemampuan untuk berpindah dengan frekuensi yang tinggi, (ii) pemilihan sekuen targetnya tidak terlalu selektif, (iii) membawa gen
8 penanda seleksi sederhana, seperti resistensi terhadap antibiotik, dan (iv) dapat digunakan untuk transposisi ke berbagai macam bakteri yang berbeda (broad host range). Tn5 ideal digunakan untuk mutagenesis acak pada bakteri gram negatif karena memiliki kelengkapan di atas.
Tn5 tidak hanya berpindah dengan
frekuensi yang relatif tinggi, tetapi juga transposon ini hampir tidak ada spesifisitas dalam pemilihan targetnya dan mampu bertransposisi pada setiap bakteri gram negatif. Tn5 juga membawa gen resistensi terhadap kanamisin yang dapat terekspresi pada hampir semua bakteri gram negatif (Snyder & Champness 1997). Pada penelitian ini digunakan transposon mini-Tn5 yang merupakan turunan dari transposon Tn5.
Keistimewaan transposon ini adalah tidak
membawa gen transposase yang berperan dalam proses transposisinya. Untuk proses transposisi dari mini-Tn5, gen transposase dikonstruksi pada plasmid yang membawanya yaitu pUT (pUTmini-Tn5) (Herrero et al. 1990). Setelah mini-Tn5 mengalami transposisi (berpindah) dalam hal ini dari plasmid ke kromosom, tidak dapat melakukan transposisi kembali karena gen transposase-nya tetap berada di dalam plasmid pUT. Plasmid pUT merupakan turunan dari plasmid pGP704 dan memiliki origin of replication dari plasmid R6K yang hanya dapat dipelihara pada bakteri penghasil π protein. Plasmid ini juga membawa origin of transfer (oriT) dari plasmid RP4, yang dapat menghasilkan transfer yang efisien ke sel resipien dari galur donor yang mengekspresikan fungsi konjugatif dari RP4 seperti E. coli SM10 (λ pir). pUT membawa gen tnp*, suatu mutan gen tnp dari IS50R yang tidak memiliki situs NotI dan menyandikan transposase yang dibutuhkan untuk transposisi dari elemen mini-Tn5 (Lorenzo et al. 1990). Penghilangan situs NotI tersebut tidak merubah struktur dari produk gen tnp.
Gen transposase yang
dimodifikasi (dengan menghilangkan situs NotI), dinamakan gen tnp* dan diklon pada situs SalI dari pGP704 derivatif dengan orientasi yang dapat mengatur proses transposisi secara optimal. Konstruksi ini dinamakan pUTKm. Plasmid pUTKm mengendalikan donor minitransposon dengan penanda resistensi terhadap antibiotik kanamisin (Herrero et al. 1990). Mini-Tn5 diapit oleh ujung I dan O yang terdiri atas 19 pasang basa.
Elemen mini-Tn5 kanamisin pada
9 pUT/Km terdiri atas tiga Kmr derivatif. Dua gen resistensi kanamisin berasal dari transposon Tn903 dengan orientasi yang berlawanan, sedangkan yang ketiga diisolasi dari Tn5 sendiri. Salah satu ciri penting dari elemen tersebut adalah hilangnya inhibitor transposase bersama dengan pUT setelah transposisi, sehingga satu galur resipien dapat digunakan untuk proses insersi berulang dengan menggunakan minitransposon yang memiliki penanda seleksi yang berbeda (Lorenzo et al. 1990). Gambar 1 menampilkan peta plasmid pUTmini-Tn5Km1 beserta transposon mini-Tn5Km1 yang digunakan dalam penelitian ini untuk melakukan mutagenesis dengan transposon melalui proses konjugasi. A)
pUTmini-Tn5Km1 7.055 kb
B)
Gambar 1 (A) Peta plasmid pUTmini-Tn5Km1 (7.055 bp). (B) Transposon miniTn5Km1. Herrero et al. (1990) melaporkan hasil insersi transposon pada kromosom melalui proses konjugasi antara E. coli SM10(λ pir) dengan Pseudomonas putida. Dari hasil analisis pada 8 koloni ekskonjugan menunjukkan bahwa terjadi insersi tunggal pada masing-masing ekskonjugan, insersi transposon pada kromosom ekskonjugan terjadi pada lokasi yang berbeda, dan gen transposase tidak terdapat
10 pada ekskonjugan. Pada penelitian ini dilakukan mutagenesis dengan transposon mini-Tn5Km1 dari E. coli S17-1 (λ pir) ke B. japonicum toleran asam-Al melalui proses konjugasi dan dari ekskonjugan yang diperoleh diharapkan terdapat mutan sensitif asam-Al. Selanjutnya dari galur mutan sensitif dilakukan isolasi gen yang terlibat dalam toleransi asam-Al pada B. japonicum.
