Terug naar de Microscoop

Terug naar de Microscoop

Jaarverslag 2008–2009 van het Leids Cytologisch en Pathologisch Laboratorium W.IJ. Allemaal

Coulomb Press Leyden

Leiden 2010

Publicatie en distributie: Coulomb Press Leyden Postbus 16084 2301 GB Leiden www.boekwinkeltjes.nl [email protected]

Deze publicatie is tot stand gekomen met medewerking van allen, werkzaam bij het LCPL. The illustration on the cover shows the image of Plate A (drawings by the skilful artist Hashime Murayama) of the famous monograph by Papanicolaou (1883–1962) and Traut, published in 1943: Diagnosis of uterine cancer by the vaginal smear, New York: The Commonwealth Fund. (With kind permission of The Commonwealth Fund.) ©Coulomb Press Leyden, 2010

Leids Cytologisch en Pathologisch Laboratorium Rooseveltstraat 4c - 2321 BM Leiden Tel.: (071) 5160160 - Fax: (071) 5160199 Postbus 16084 - 2301 GB Leiden www.lcpl.nl Niets uit deze uitgave mag worden vermenigvuldigd en/of openbaar gemaakt worden door middel van druk, fotokopie of op welke andere wijze ook, zonder voorafgaande schriftelijke toestemming van de uitgever.

ISBN: 978-90-71421-63-1 ISSN: 0924-0691

INHOUD

5

Inhoud Inleiding

7

A Capita Selecta 11 A1 Do we need the light microscope? (Mathilde E. Boon) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 A2 SBBW screening 2008; bevolkingsonderzoek baarmoederhalskanker regio west (M.E. Boon, E.J. Kamp, E.C.M. Ooms, W.W.J. Spijker, J. Zwaan) . . 20 A3 Borstelhistologie: een nieuwe methode die een nieuwe PALGA-Thesaurusterm verdient (Mathilde E. Boon) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 A4 Exploiting the Dutch KOPAC O codes: their signifcance for the detection of squamous intraepithelial lesions in cervical cytology (Mathilde E. Boon, Anne M.E. Roeters, Tj. Romke Bontekoe) . . . . 37 A5 Consequenties van de nieuwe richtlijnen van NVVP voor Pap II en IIIA/KOPAC P4 en HPV (Mathilde E. Boon) . . . . . . . . . . . . . . 49 A6 Baarmoederhalskanker en HPV (Anna van Boekel, Marleen de Vries) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 A7 A case of endometrial adenocarcinoma misinterpreted as of endocervical origin in a ThinPrep slide using cytohistology and biomarkers (Nivea Meyer-Alcântara, Elle K.J. Risse, Elisabeth Ouwerkerk-Noordam, Mathilde E. Boon) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 A8 A case of adenocarcinoma in situ of the intestinal type diagnosed in liquid-based cervical cytology with the help of cytohistology (Petra J.M. Pothuis-Adriolo, Elisabeth Ouwerkerk-Noordam, Elle K.J. Risse, Mathilde E. Boon) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 A9 The Japanese joy of screening ThinPrep slides in Holland (Shoko Chinomi, Nivea Meyer-Alcântara) . . . . . . . . . . . . . . . 67 A10A case of clear cell adenocarcinoma of the cervix, diagnosed on paraffin sections from residual material of liquid-based cervical cytology (Yvonne Verdijk, Elle K.J. Risse, Elisabeth Ouwerkerk-Noordam, Mathilde E. Boon) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 A11Switching from neural networks (NNS) to the Imager (Hologic) for computer-assisted screening (Elisabeth M. Meijer-Marres, Mathilde E. Boon) . . . . . . . . . . . . 73 A12Experience and personality play a key role in computer-assisted screening (Elisabeth Ouwerkerk-Noordam, Mathilde E. Boon, Elle K.J. Risse) . 76

6

INHOUD

B Evaluatie van het Ingestuurde Materiaal (M.E. Boon, S. Beck, R.P. Dutrieux, H. Korporaal, E.M. Meijer-Marres) 80 B1 Cervixuitstrijkjes zijn cervixmonsters . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 B2 Cytoscores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 B3 Histoscores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 Histoscores bevolkingsonderzoek, B.O. . . . . . . . . . . . . . . . . 85 Histoscores niet-bevolkingsonderzoek, N.B.O. . . . . . . . . . . . . . 85 Plaveiselcelcarcinomen van de cervix . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 Adenocarcinomen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 B4 Ontstekingen: de KOPAC O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 B5 Histologie en niet-gynaecologische cytologie . . . . . . . . . . . . . 89 B6 Moleculaire pathologie: diagnostiek van seksueel overdraagbare aandoeningen en Candida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101 Chlamydia en Neisseria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101 Humaan papillomavirus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104 Herpes simplexvirus en Varicella zostervirus . . . . . . . . . . . . . . 107 Candida albicans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 C Publicaties en Abstracts 112 Wetenschappelijke publicaties 2008 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 Reguliere publicaties . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 Abstracts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 Overige vakpublicaties 2008 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 Selectie abstracts 2008 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114 C1 Analyses die van nut kunnen zijn voor de optimalisering van HPVvaccinatieprogramma’s, gebaseerd op data betreffende HPV en (pre)neoplasie van de cervix bij Surinaamse vrouwen . . . . . . . . . . . . . . 114 C2 Evaluating the health of the vaginal flora using cultivation-independent methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 C3 Cutting it thin: exploiting the residual thin layers sample for histocytology. The boons of the formalin free fixative BoonFix . . . . . . . . 115 C4 The biomarker p16INK4a on paraffin sections prepared from cervical brush samples highlights nuclear changes resulting in an unquestionable cytohistological diagnosis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116 C5 Clinical complaints and cytohistology . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 C6 Biomarkers on paraffin sections prepared from the residual material of liquid-based cervical cytology, highlight cancerous tissue fragments overlooked in a false-negative Papanicolaou-stained ThinPrep® Slide . 118 C7 Exploiting the residual cervical thin layer sample through cytohistology118 C8 The additional value of cytohistology and biomarkers from the residual of thin layer cervical samples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

INLEIDING

7

Inleiding Dit is de tweede keer dat wij in de bekende groene kaft twee jaren bijeenbrengen, dit maal 2008 en 2009. Net als de voorgaande 35 jaren leggen wij observaties en belevenissen in medisch Nederland op papier vast. De kaft wordt dit jaar gesierd door tekeningen van Hashime Murayama, die hij maakte voor het boek van Papanicolaou en Traut ‘Diagnosis of Uterine Cancer by the Vaginal Smear’. U leest het goed, er staat ‘vaginal smear’, het strijkje van de vagina. Tien jaar geleden promoveerde Myrthe Kok in Utrecht op het proefschrift ‘Neural Network-Based Screening in Cervical Cytology’, met als ondertitel ‘Do We Need the Light Microscope?’ met de pathologen Prof. dr. J.G. van den Tweel als een van de promotoren en Dr. M.E. Boon als co-promotor. Ze promoveerde in het jaar 2000, toen we nog echte uitstrijkjes van de huisartsen binnenkregen. Het proefschrift is gebaseerd op de analyse van meer dan 500.000 LCPL-uitstrijkjes. Het proefschrift hebben wij, 10 jaar later, herbekeken, nu wij met de dunnelaag en de Imager zijn teruggekeerd naar de lichtmicroscoop. Myrthe stierf op 30 oktober 2009, derhalve kan zij geen medeauteur zijn van het eerste caput, dit ondanks het feit dat dit hoofdstuk voor een groot deel bestaat uit haar letterlijke teksten. Voorbij het uitstrijkje Papanicolaou wond zich niet op over de overgangszone en het endocervixkanaal. Hij zoog afgebladderde cellen (exfoliated cells) met een pipetje uit de fornix posterior op, terwijl de vrouw op haar rug lag. In dat ‘afvalputje’ was veel, belangrijk diagnostisch materiaal voorhanden, hetgeen duidelijk naar voren komt als je de tekening van Hashime Murayama goed bekijkt. De tekening maakt wel een tekortkoming zichtbaar, namelijk dat er maar één focusvlak is weergegeven. Met de lichtmicroscoop kunnen we zeer veel focusvlakken van een cel in beeld brengen door met de microscoopschroef op en neer te draaien. Zodoende kunnen we niet twee maar drie dimensies van de cel visualiseren. Dezelfde tekortkoming van de tweedimensionale visualisering geldt voor foto’s en digitale beelden zoals van het PAPNET-systeem. Het uitstrijkje is voorbij Papanicolaou gebruikte de term ‘smear’, in het Nederlands vertaald als ‘uitstrijkje’, voor het objectglaasje waarop de clinicus cellen had uitgestreken. Het uitstrijkje bestaat niet meer, in ons laboratorium ontvangen wij potjes met een borsteltje. Het objectglaasje voor de cytologische diagnostiek wordt op het laboratorium gemaakt met behulp van peperdure apparaten, door analisten die één voor één de potjes door hun vingers moeten laten gaan om er tenslotte een Papanicolaou gekleurd ‘uitstrijkje’ van te maken. In dat proces kan van alles en nog wat fout gaan, bijvoorbeeld

8

INLEIDING

kan patiënten- c.q. potjesverwisseling voorkomen. Patiëntenverwisseling is bij het oude uitstrijkje vrijwel onmogelijk, omdat de huisarts de naam en geboortedatum van de vrouw op het objectglaasje heeft geschreven. In deze nieuwe situatie, nu het uitstrijkje van Papanicolaou niet meer bestaat, lopen wij vast met de terminologie. We krijgen geen uitstrijkje meer binnen maar potjes, en hoe noemen we die dan? We hebben gekozen voor het woord ‘cervixmonster’, klinkt wat Vlaams, maar als je dat ‘monster’ maar vaak genoeg uitspreekt went het rap. De nieuwe mogelijkheden van het cervixmonster Het huidige ‘cervixmonster’ geeft ons vele nieuwe mogelijkheden. We noemen hier de ‘borstelhistologie’ waarvan we in dit boekje enkele voorbeelden tonen. De nieuwe techniek van de dunnelaagcytologie (thin-layer cytology ofwel liquidbased cytology) heeft de weg geopend om op betrekkelijk eenvoudige wijze, met de Imager van de firma Hologic, 22 diagnostische beeldvelden, fields of view (FOV), automatisch te selecteren. Die 22 FOV’s moeten wel door de mens worden bekeken. Terug naar de microscoop In 2000 meende Myrthe Kok, gebaseerd op haar analyse van de beoordeling van computerbeelden, dat de tijd van de lichtmicroscopie voorbij was. Echter, in 2009 zijn we weer helemaal terug bij de microscoop. De technische ontwikkelingen hebben ervoor gezorgd dat we weer kunnen profiteren van de driedimensionale aspecten van benigne en maligne cellen.

De trotse directeuren van het LCPL, Richard Dutrieux en Mathilde Boon.

INLEIDING

9

Door de directeuren R.P. Dutrieux (links) en M.E. Boon (rechts) werd namens het LCPL een waterput geschonken aan de bevolking van Groblersdal. Wat het jaar 2008 voor 2009 betekende In het voorgaande groene boekje ‘Schenken en Ontvangen’ werden enkele hoogtepunten van het LCPL gememoreerd, zoals de overdracht van het beeld ‘Imago’ aan het LCPL door de Isala klinieken. Dit fraaie beeld hebben we in 2009 een centrale rol toebedeeld. Imago staat op de officiële statiefoto’s tussen de trotse directeuren van het LCPL, Richard Dutrieux en Mathilde Boon. Ook wordt de succesvolle NVVP-hervisitatie uitgebreid vermeld: het gebruik van het formalinevrije fixeren met BoonFix wordt voor het eerst goedgekeurd door de visiterende pathologen. In 2009 hebben wij circa 100.000 monsters op het LCPL kunnen verwerken, zeer succesvol, dat wel! Ook wordt de samenwerking met TNO betreffende een microarray van de vaginale flora genoemd. Het biomoleculaire concept dat wij in Leiden tot bloei brachten is verwerkt in het proefschrift van Annemarie Klomp uit 2008 (‘Bacterial Imbalance of the Vaginal Flora; a Cytological and Biomolecular Concept of Gardnerella vaginalis’). In 2009 zijn we verder gegaan met het toepassen van klinische monsters en hebben we (wetenschappelijk!) kunnen aantonen dat Gardnerella als een ongewenst onkruid moet worden beschouwd en met recht door ons ‘het zevenblad van de vagina’ genoemd wordt. In 2008 is door onze ICT-ploeg hard gewerkt aan de voorbereidingen voor het nieuwe PALGA-UDPS. Na 10 jaar zal het LCPL zich in 2009 helemaal in de

10

INLEIDING

PALGA-familie voegen en geen eigen eigenwijsheidjes handhaven die de PALGAdata hinderlijk corrumperen. In 2008 startte Richard Dutrieux met de Masterclass ‘bestuurders in de gezondheidszorg’ van de Erasmus Universiteit in Rotterdam. In dit kader werd in februari 2009 een werkbezoek afgelegd aan de nederzetting van de NDLOVU Care Group gelegen in het Groblersdal in Zuid-Afrika. In deze gemeenschap werden onder leiding van de Nederlandse arts Hugo Tempelman onder meer een kliniek, een school, diverse sportfaciliteiten, een bakkerij en zelfs een theater opgezet. Richard Dutrieux heeft tijdens dit werkbezoek voor zijn collega-bestuurders een voordracht gegeven over een door het LCPL vastgestelde significant verhoogde incidentie van HPV-gerelateerde baarmoederhalsafwijkingen bij HIV-positieve vrouwen in de regionale bevolking rond de ‘compound’. Materiaal voor dit onderzoek was slechts kort voor het werkbezoek aan het LCPL aangeleverd door Hugo Tempelman. Gezien de klinische implicaties van deze bevindingen (verhoogde noodzaak tot opsporing en behandeling van ‘vroege laesies’) werd door Richard Dutrieux en Mathilde Boon besloten een gezamenlijk vervolgbezoek af te leggen. Dit vond plaats in augustus 2009, ruim 2 maanden na het succesvol afronden van de Masterclass. Tijdens dit bezoek werden met de NDLOVU-kliniek afspraken gemaakt voor verder gezamenlijk onderzoek. Tevens werd namens het LCPL een waterput geschonken aan de bevolking van Groblersdal. Hiermee zullen zij in staat zijn het rond de waterput gelegen woeste land te ontginnen voor akker- en tuinbouw. Wij hopen in de komende jaren te kunnen genieten van de bijdrage van het LCPL aan een verbetering van leefomstandigheden en bevolkingsgezondheid, zowel in Nederland als in Zuid-Afrika. Dr. Mathilde E. Boon, patholoog

Richard P. Dutrieux, patholoog

A1. LIGHT MICROSCOPY

11

A. Capita Selecta A1 Do we need the light microscope? ∗ Mathilde E. Boon Het proefschrift van Myrthe Kok gaat over het gebruik van een geautomatiseerd systeem voor het primair screenen van cervixuitstrijkjes. Dit systeem, bekend onder de naam PAPNET, maakt gebruik van twee neurale netwerken, die de abnormale cellen in uitstrijkjes selecteren en deze vervolgens tonen op de bij het systeem behorende monitor. Derhalve wordt het systeem ook wel aangeduid als ‘neurale netwerktechnologie (NNT)’ of ‘neurale netwerkscreening (NNS).’ De implementatie van NNS in Leiden vond gefaseerd plaats. Van september 1992 tot december 1994 werd een deel van de binnenkomende uitstrijkjes met NNS beoordeeld, en het resterende deel met de lichtmicroscoop (conventioneel). Gedurende deze beginjaren bevatte NNS een lichtmicroscopische component: de door de neurale netwerken geselecteerde abnormale cellen werden eerst op het computerscherm bekeken, en vervolgens door de microscoop. Deze vorm van NNS wordt gedefinieerd als ‘hybride NNS.’ In januari 1995 werd het conventionele screenen geheel losgelaten, en werden de uitstrijkjes met hybride NNS beoordeeld. Van januari 1995 tot december 1996 werd de lichtmicroscoop in NNS steeds minder toegepast. De analisten gingen meer en meer de selectie van PAPNET vertrouwen en vonden het minder en minder nodig het uitstrijkje zelf helemaal door te screenen. De verschillende hoofdstukken in Myrthes proefschrift weerspiegelen analyses over zowel hybride NNS (Hoofdstuk 2 tot en met 5) als over pure NNS (Hoofdstuk 6 en 7), waarbij de diagnose zonder lichtmicroscopische elementen tot stand komt. Hier volgt de Nederlandse samenvatting van vijf hoofdstukken van Myrthes proefschrift, deels door Mathilde Boon aangevuld met Leidse gegevens en PAPNETbeelden. Consequences of neural network technology for cervical screening: Increase in diagnostic consistency and increase in positive socres Hoofdstuk 2 beschrijft een onderzoek waarin de centrale vraag is of positieve scores en diagnostische consistentie beïnvloed worden, indien hybride NNS geïmplementeerd wordt in de primaire screening. Voor dit onderzoek werden de diagnoses van 65.527 met hybride NNS gescreende uitstrijkjes vergeleken met die van 25.767 conventioneel gescreende uitstrijkjes. Voor beide screenmethodes werden ∗ Deze tekst is gebaseerd op en grotendeels ontleend aan het proefschrift van Myrthe Kok: Neural Network-Based Screening in Cervical Cytology: Do We Need the Light Microscope?, Leiden, Coulomb Press Leyden, 2000.

12

A. CAPITA SELECTA

de positieve scores berekend voor een drietal afwijkingen, te weten ‘atypie’ (Pap II), ‘geringe en matige dysplasie’ (Pap IIIA) en ‘ernstige dysplasie en hoger’ (≥ Pap IIIB). Voor alle drie de afwijkingen waren de scores van hybride NNS significant hoger dan die van conventioneel screenen. Het gebruik van hybride NNS resulteert alleen in een significant hogere diagnostische consistentie voor wat betreft de ernstige afwijkingen. Voor de andere twee afwijkingen was de diagnostische consistentie gelijk voor beide screenmethodes. Concordance with histology for low-grade diagnosed cervical smears: The additional value of neural network technology Voor Hoofdstuk 4 hebben we een database gebruikt, bestaande uit 83.404 met hybride NNS beoordeelde uitstrijken en 49.792 lichtmicroscopisch gescreende uitstrijken. In totaal waren 1.920 uitstrijken beoordeeld als Pap IIIA (geringe dysplasie), waarvan 963 (1,15%, 95% Betrouwbaarheidsinterval (BI): 1,08%–1,23%) met behulp van hybride NNS en 957 (1,92%; 95% BI: 1,80%–2,04%) met de lichtmicroscoop gediagnosticeerd waren. De uitkomsten waren significant verschillend (P-waarde < 0, 001). De overeenkomst met de histologie was significant beter voor hybride NNS dan voor conventioneel screenen. Bovendien was het percentage overdiagnoses significant lager voor hybride NNS dan voor conventioneel screenen, hetgeen leidt tot aanzienlijk minder onnodige verwijzingen naar de tweedelijn. Cytologic recognition of invasive squamous cancer of the uterine cervix: Comparison of conventional light-microscopical screening and neural networkbased screening In Hoofdstuk 5 werd onderzocht of hybride NNS even goed is als lichtmicroscopisch screenen in het opsporen van (micro-)invasieve plaveiselcelcarcinomen, hetgeen klinisch gezien de belangrijkste afwijking is. Het totale materiaal bestond uit 354.631 uitstrijken, en werd gestratificeerd naar screenmethode (hybride NNS versus lichtmicroscopisch screenen). Tevens werd onderscheid gemaakt tussen indicatie-en bevolkingsonderzoekuitstrijken. In het totale materiaal zaten 71 histologisch bevestigde (micro-)invasieven, waaronder 4 foutnegatieven, gemist bij conventionele screening. Beide screenmethodes waren even goed in het opsporen en beoordelen van (micro-)invasieve cervixcarcinomen. De vier foutnegatieve uitstrijken werden opnieuw beoordeeld met pure NNS, waarbij drie van de vier als ‘verdacht’ en één als ‘ernstig afwijkend’ herbeoordeeld werden. Bovendien werd na analyse van de digitale beelden duidelijk, dat groepen cellen met kernen die bleek zijn en op het eerste gezicht onschuldig ogen, karakteristiek zijn voor de diagnose (micro-)invasief cervixcarcinoom. Implementation of neural network-based screening (NNS) in cervical cytology: No need for the light microscope? In Hoofdstuk 6 is de onderzoeksvraag of pure NNS geschikt is voor primaire screening. Om deze vraag te beantwoorden werd een steekproef, die eerder met behulp van hybride NNS beoordeeld was in Utrecht, in het LCPL beoordeeld met pure NNS

A1. LIGHT MICROSCOPY

13

om na te gaan in hoeverre de lichtmicroscopische component, wel aanwezig bij hybride maar niet bij pure NNS, van invloed is op de cytologische diagnose. Van alle gevallen was zeven jaar follow-up beschikbaar. De casussen werden gerangschikt in een groep van 793 vrouwen met een ‘negatieve follow-up’ (geen afwijkingen in 7 jaar) en een groep van 192 vrouwen met een ‘positieve follow-up’ in 7 jaar. Deze uitkomsten werden gebruikt voor de berekeningen van de diagnostische capaciteit. Van 985 casussen waren de 128 PAPNET-beeldvelden (‘tegels’) beschikbaar en konden in Leiden op een computerscherm worden beoordeeld. De uitstrijken zelf bleven in Utrecht. Receiver Operating Characteristics curves (ROC-curves) werden geconstrueerd om het verschil in diagnostische capaciteit tussen beide screenmethodes te vergelijken, uitgedrukt als oppervlakte onder de curve, ofwel ‘AUC.’ Pure NNS genereerde meer Pap 0 diagnoses, 88 versus 36 bij hybride NNS. Hybride NNS resulteerde in meer Pap IIIA diagnoses (geringe dysplasie) dan pure NNS. De AUC voor vrouwen die als definitieve follow-up diagnose ‘tenminste geringe dysplasie’ hadden, was significant hoger voor hybride NNS (81%; 95% BI: 77%– 85%) dan voor pure NNS (75%; 95% BI: 70%–85%). Ook was voor deze Pap IIIA uitstrijken de overeenkomst met de histologie beter voor hybride NNS dan voor pure NNS. De klinische relevantie van deze lichte afwijkingen staat echter ter discussie. Naast de lichte werd ook naar de ernstige dysplasieën gekeken. Met hybride NNS werden minder ernstige dysplasieën cytologisch gediagnosticeerd dan met pure NNS, 25 versus 11 bij hybride NNS. In de Fig. A1.1 worden ROC curves getoond van hybride NNS (met lichtmicroscopie) en oude NNS (geheel gebaseerd op de computerbeelden). Het eindpunt is hier wederom de histologische diagnose binnen 7 jaar. Het aantal pure NNS is lager (896) dan het aantal hybride NNS omdat er in de pure NNS-groep meer gevallen uitvielen waarop de onderzoeker geen diagnose durfde te stellen, hetgeen begrijpelijk is want er was geen uitstrijkje beschikbaar dat lichtmicroscopisch beoordeeld kon worden. In het Engelstalige onderschrift van de figuur valt te lezen dat de AUC-waarden van hybride NNS weliswaar iets hoger uitkwam (0,813 versus 0,779) maar dat dit verschil niet significant is. Kort en goed, de belangrijke afwijkingen kunnen heel goed opgespoord worden zonder lichtmicroscopische stap. De algemene conclusie luidde dat pure NNS een goed hulpmiddel is voor tijdsbesparende diagnostiek en gebruikt kan worden voor primaire screening indien de nadruk ligt op de detectie van ernstige afwijkingen en een optimale voorspelling van negatieven. A new paradigm for ASCUS diagnosis using neural network technology (PAPNET) In Hoofdstuk 7 wordt geanalyseerd of ASCUS scores (Pap II) verminderd kunnen worden met behulp van het gebruik van pure NNS in het primaire screenproces. Allereerst werden 168 gevallen, die reeds als ASCUS gediagnosticeerd waren met ófwel hybride NNS ófwel met de lichtmicroscoop, herbeoordeeld met pure NNS. Tevens werd een extra diagnostisch criterium toegevoegd aan het herbeoordelingsproces, te weten ‘naakte kernen’ (reservecellen) of ‘kernen met heel weinig cy-

14

A. CAPITA SELECTA

Sensitivity

1

Hybrid NNS

0.8 a Pure NNS

A 0.6 b B

0.4

C 0.2 c 0 0

0.2

0.4

0.6

0.8 1 1 - Specificity

Fig. A1.1. ROC curves for hybrid NNS (n = 949) and pure NNS (n = 896), respectively, for detecting (pre)neoplastic cervical lesions (≥HSIL) in a seven-year follow-up period. The cytologic diagnoses are in a four-category scale, according to the (lumped) KOPAC codes (P1, P2+3, P4+5, ≥P6). The three corresponding thresholds lead to the points a, b, and c (hybrid NNS), and to A, B, and C (pure NNS). The AUC values are 0.813 (hybrid NNS) and 0.779 (pure NNS) (P value for the difference 0.23).

toplasma.’ Het uitsluitend beoordelen van de digitale beelden resulteerde in een aanzienlijke daling in de ASCUS scores. Gevallen met positieve follow-up werden met pure NNS wederom als ASCUS beoordeeld. Het nieuwe diagnostische criterium bleek een belangrijke indicator te zijn dat de uitstrijk echt (licht) afwijkend is en zich progressief zou kunnen ontwikkelen. Het invoeren van het gebruik van pure NNS in de dagelijkse routine en het toepassen van een nieuw diagnostisch criterium resulteerde in een daling van de ASCUS scores van 10% naar 1% in het LCPL, hetgeen aanzienlijk minder verwijzingen naar de tweedelijn impliceert. In het jaar van het onderzoek, 1996, gingen wij gebruikmaken van het paradigma ‘onrijpe cellen’ en zo zagen wij de Pap II scores afnemen van 10% naar 2%. Myrthe vroeg zich af of de lichtmicroscoop in de toekomst nog langer nodig is. Een logische vraag gezien het atlasgedeelte van haar proefschrift waarvan we hier vier casussen tonen. In die voorbeelden is duidelijk dat een cytologische diagnose op een conventioneel uitstrijkje heel goed op een computerscherm te

A1. LIGHT MICROSCOPY

15

Fig. A1.2. Plate 4. Summary screen, 16 door de analist bij elkaar gebrachte PAPNET-tegels. Histologie: CIN I. Het neurale net heeft zeer veel atypische reservecellen (zonder cytoplasma) geselecteerd.

stellen is. Op de PAPNET-tegeltjes van Fig. A1.5 komt de diatheseachtergrond van het (invasieve) carcinoom goed tot zijn recht. Ook, zo laat Myrthe Kok zien, is die diatheseachtergrond een belangrijke diagnostische trigger wanneer het uitstrijkje

16

A. CAPITA SELECTA

Fig. A1.3. Plate 8. Summary screen, 16 door de analist bij elkaar gebrachte PAPNET-tegels. Histologie: CIN III. Het neurale net heeft enige losliggende CIN III cellen en vele CIN III epitheelbrokken geselecteerd, allen met grote hyperchromatische kernen. zeer weinig carcinoomcellen bevat. Tegels met veel bloed (zie Fig. A1.6) moeten de diagnost ook aan het denken zetten. Onze analisten hebben, dankzij PAPNET, computerselectie leren vertrouwen,

A1. LIGHT MICROSCOPY

17

Fig. A1.4. Plate 10. Summary screen, 16 door de analist bij elkaar gebrachte PAPNET-tegels. Histologie: CIN III. Het neurale net heeft zeer veel, grotendeels losliggende CIN III cellen geselecteerd met kleine, hyperchromatische kernen.

hetgeen belangrijk bleek bij de introductie van de Imager (Hologic). Met de introductie van de dunnelaagtechniek (ThinPrep) zijn we weer terug bij de lichtmicroscoop, hetgeen een grote vreugde is want die driedimensionale beelden zijn veel informatiever dan de tweedimensionale van de PAPNET-monitor.

18

A. CAPITA SELECTA

Fig. A1.5. Plate 15. Summary screen, 16 door de analist bij elkaar gebrachte PAPNET-tegels. Histologie: plaveiselcelcarcinoom. Zeer veel duidelijk maligne cellen tegen een achtergrond van diathese (rood).

A1. LIGHT MICROSCOPY

19

Fig. A1.6. Plate 16. Summary screen, 16 door de analist bij elkaar gebrachte PAPNET-tegels. Histologie: invasief carcinoom. Deze beelden zijn te bloederig om een diagnose op te kunnen stellen, en eindigen derhalve op een Pap 0 in de pure NNS, zonder lichtmicroscopie. Dit is wel een link beeld!

20

A. CAPITA SELECTA

A2 SBBW screening 2008; bevolkingsonderzoek baarmoederhalskanker regio west∗ M.E. Boon, E.J. Kamp,† E.C.M. Ooms,† W.W.J. Spijker,† J. Zwaan † Ook dit jaar publiceren wij de data van het bevolkingsonderzoek van de regio west (SBBW). Alle tabellen zijn verstrekt door SBBW en zijn in 2009 opgenomen in het Jaarverslag 2008 van de Stichting SBBW. Wat de tekst betreft wijken we soms een beetje af van de originele en de SBBW-figuren hebben wij hier en daar iets anders vormgegeven. Demografische gegevens De demografische gegevens (leeftijdsopbouw) van de vrouwen van 30 tot en met 60 jaar die in de SBBWregio wonen zijn verwerkt in Fig. A2.1. De oudste vrouwen (60 jaar) maken deel uit van de naoorlogse geboortegolf, immers ze zijn 8 jaar na de oorlog geboren, en wel in 1948. Tot 1970 worden de cohorten groter, daarna zien we een Fig. A2.1. Vrouwen woonachtig in de regio van de gestage afname. In kleur is SBBW (regio West). In oranje de uitgenodigde coweergegeven welke cohor- horten van 2008. ten een uitnodiging ontvingen. 8000 Uitnodigingen 6000 In 2008 zijn 83.864 vrouwen uitgenodigd voor het bevolkingsonderzoek, te we- 4000 ten vrouwen geboren in 1978, 1973, 1968, 1963, 2000 Huisarts 1958, 1953 en 1948. TaSBBW bel A2.1 geeft een overzicht 0 geb.jaar:1948 1953 1958 1963 1968 1973 1978 van het aantal uitnodigingen per geboortejaar en uit- Fig. A2.2. Aantal uitnodigingen per geboortejaar en nodigende instantie. In Fig. uitnodigende instantie. ∗ De hier gepresenteerde data zijn eveneens verschenen in het Jaarverslag 2008 van de Stichting SBBW. † SBBW.

A2. SBBW SCREENING

21

Tabel A2.1. Aantal uitnodigingen per geboortejaarcohort en uitnodigende instantie. Geboortejaar Huisarts SBBW Totaal 1948 5.081 4.632 9.713 1953 5.460 4.968 10.428 1958 6.316 5.664 11.980 1963 7.345 6.409 13.754 1968 7.081 6.493 13.574 1973 6.062 6.211 12.273 1978 5.193 6.949 12.142 Totaal 42.538 41.326 83.864

A2.2 zijn deze cijfers gevisualiseerd. In 2008 waren 289 uitnodigende huisartspraktijken actief. Van het totaal aantal uitgenodigde vrouwen ontving 50,7% de uitnodiging via de huisarts. Participatie Respons en opkomst 2002-2008 In Fig. A2.3 wordt een overzicht gegeven van de respons in de jaren 2002 tot en met 2008. De respons is onderverdeeld in ‘actieve participatie’ (opkomst) en ‘passieve participatie’ (het terug100 % zenden van een ingevulde antwoordkaart). De 80 % overblijvende groep is de ‘non-responsgroep’. 60 % In Fig. A2.4 is de opTotaal komst uitgesplitst naar Antw.kaart 40 % uitnodigende instantie, Non!respons huisarts of SBBW, met 20 % in alle jaren een hogere opkomst wanneer de 0% huisarts de uitnodiging jaar: 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 verstuurt. Fig. A2.3. Respons 2002-2008. Opkomst per geboortejaarcohort Fig. A2.5 geeft de opkomst weer per geboortejaarcohort. De figuur laat zien dat de opkomst van de 30- en 35-jarige vrouwen het laagst is. De hoogste opkomst wordt gezien bij vrouwen die geboren zijn in 1963 en door de huisarts een uitnodiging voor een uitstrijkje ontvangen. Het overall-gemiddelde is hoog, maar is met 66,4% iets lager dan vorig jaar (66,9%). Door het ‘na-ijleffect’ zal de uiteindelijke deelname aan het bevolkingsonderzoek hoger blijken. Zo bedroeg per 1 september 2009 de deelname voor het uitnodigingsjaar 2005, inclusief na-ijleffect tenslotte 70,1%.

22

A. CAPITA SELECTA

Respons en opkomst 2002-2008 Stimulatie opkomst jon100 % ge vrouwen De meeste afwijkingen wor80 % den gevonden bij de jonge vrouwen (30- en 3560 % jarigen), terwijl de opkomst voor deze cohorten rela40 % tief laag is. Daarom wordt Huisarts door SBBW sinds 2005 ex20 % tra aandacht aan de 30- en SBBW 35-jarigen besteed tenein0% jaar: 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 de de opkomst te stimuleren. Fig. A2.4. Opkomst in de periode 2002-2008, uitnoIn Fig. A2.6 zijn links diging huisarts versus SBBW. de opkomstcijfers weergegeven van de 30-jarigen 100 % van vier screenjaren. De screenjaren zijn respectie80 % velijk 2004, 2006, 2007 en 2008. De extra SBBW60 % aandacht vanaf 2005 heeft duidelijk effect gehad op 40 % Huisarts de opkomst van de groep SBBW 20 % 30-jarigen. De totale opTotaal komst is met 7,1% geste0 % gen, van 54,9% in 2004 1948 1953 1958 1963 1968 1973 1978 naar 62,0% in 2007. In Fig. A2.5. Opkomst per geboortejaarcohort. 2008 is dit iets afgenomen naar 59,7%. Kennelijk heb100 % ben de bijzondere acties ook geleid tot een grote80 % re deelname van de 30-jarige vrouwen die door de 60 % huisarts zijn uitgenodigd. De opkomst van deze groep 40 % 30 jr ! Huisarts steeg met 7,3%, van 64,5% 30 jr ! SBBW 30 jr ! Totaal in 2004 naar 71,8% in 2007. 20 % 35 jr ! Huisarts 35 jr ! SBBW Hier nam de opkomst in 35 jr ! Totaal 2008 ook iets af naar 69,4%. 0 % 2004 2006 2007 2008 2004 2006 2007 2008 Al met al kan gesteld worden dat de hogere opkomst Fig. A2.6. Opkomst 30-jarigen (links) en 35-jarigen van de 30-jarigen de extra (rechts).

A2. SBBW SCREENING

23

inspanningen van SBBW rechtvaardigen. De 35-jarigen die in de eerste ronde niet hebben deelgenomen en ook geen antwoordkaart hebben teruggestuurd, zijn d.m.v. een speciale mailing aangeschreven. Ook hier is een stijging in de opkomst waar te nemen, van 60,3% in 2004 naar 63,1% in 2007 en 61,8% in 2008 (zie Fig. A2.6 rechts). Het effect is weliswaar minder indrukwekkend dan voor de 30-jarigen, maar nog steeds de moeite waard. Tenslotte kan worden opgemerkt dat ook voor de 35-jarigen de stijging in opkomst het hoogst is bij de vrouwen die een uitnodiging van de huisarts ontvangen, daar wordt een opkomst van 69,9% bereikt. Opkomst per gemeente In de Tabellen A2.2 wordt de opkomst weergegeven per gemeente. De tabellen geven drie groepen weer, gebaseerd op het totaal aantal inwoners in die gemeenten. Er is een groep ge100% meenten tot 20.000 inwoners (A-gemeenten), 80% een groep van 20.000 tot 250.000 inwoners 60% (B-gemeenten) en Den Haag met meer dan 40% 250.000 inwoners, zijnde de enige C-gemeente. 20% Net als in 2007 is te zien dat in 2008 de opkomst 0% in de A-gemeenten het A B C hoogst is en in de Fig. A2.7. Opkomst voor de A-, B- en C-gemeenten, 2007 C-gemeente het laagst (Fig. A2.7). In de (rood) en 2008 (groen). dorpen (A-gemeenten) is Bergambacht met 82,8% de koploper, en voor de B-gemeenten is dat Westland met 79,9%. De spreiding van de A-data is lager in vergelijking met die van de B-data. Met andere woorden, de dorpen lijken meer op elkaar dan de steden. De Grote Stad (C-gemeente, Den Haag) spant de kroon met een zeer laag opkomstpercentage en een hoge non-responsscore. Passieve participatie Wanneer een vrouw niet deelneemt, maar wel de antwoordkaart terugstuurt met daarop vermeld de reden van niet-deelname, wordt gesproken van ‘passieve participatie’. De verdeling van opgegeven redenen voor ‘niet-deelname’ is weergegeven in Fig. A2.8 en Fig. A2.9. Zoals in de lijn van de verwachtingen ligt, geven vooral jonge vrouwen aan niet aan het bevolkingsonderzoek deel te nemen wegens zwangerschap, en oudere vrouwen omdat zij een baarmoederverwijdering hebben ondergaan (zie Tabel A2.3b).

24

A. CAPITA SELECTA

Tabel A2.2a. Respons en non-respons voor de A-gemeenten. Gemeente UitgeRespons tot 20.000 nodigd Opkomst Antw.kaart inwoners Aantal % Aantal % Alkemade 678 538 79,4 100 14,7 Bergambacht 437 362 82,8 48 11,0 Bodegraven 877 666 75,9 115 13,1 Boskoop 713 523 73,4 98 13,7 Jacobswoude 509 398 78,2 79 15,5 Midden-Delfland 808 644 79,7 94 11,6 Moordrecht 401 300 74,8 60 15,0 Nederlek 637 493 77,4 73 11,5 Noordwijkerhout 761 538 70,7 77 10,1 Ouderkerk 349 275 78,8 63 18,1 Reeuwijk 590 441 74,7 64 10,8 Rijnwoude 844 648 76,8 93 11,0 Schoonhoven 573 437 76,3 78 13,6 Vlist 449 350 78,0 58 12,9 Zevenhuizen-Moerk. 443 361 81,5 64 14,4 Zoeterwoude 409 321 78,5 46 11,2 Totaal 9.478 7.295 77,0 1.210 12,8

Behandeling gynecoloog 919

Aantal 40 27 96 92 32 70 41 71 146 11 85 103 58 41 18 42 973

% 5,9 6,2 10,9 12,9 6,3 8,7 10,2 11,1 19,2 3,2 14,4 12,2 10,1 9,1 4,1 10,3 10,3

Zwangerschap 1333

Zwangerschap 1265

Recente uitstrijk 988

Non-respons

Baarmoeder verwijdering 499

Overig 1440

Fig. A2.8. Passieve participatie: antwoordredenen bij uitnodigen door de huisarts in 2008.

Recente uitstrijk 1008

Behandeling gynecoloog 1254

Baarmoeder verwijdering 616

Overig 1223

Fig. A2.9. Passieve participatie: antwoordredenen bij centraal uitnodigen in 2008.

Wanneer een vrouw aangeeft dat haar baarmoederhals verwijderd is, betreft het een ‘definitieve afmelding’. Dit wil zeggen dat een dergelijke afmelding ertoe leidt dat bij de volgende ronde geen uitnodiging meer wordt verzonden naar deze vrouw. In het geval van zwangerschap wordt na zes maanden opnieuw een uitnodiging verstuurd en is, bij deelname, in feite sprake van uitgestelde participatie. In Tabel A2.3b wordt een overzicht gegeven van de antwoordredenen ‘zwangerschap’ en

A2. SBBW SCREENING

25

Tabel A2.2b. Respons en non-respons voor de B-gemeenten. Gemeente UitgeRespons 20.000-250.000 nodigd Opkomst Antw.kaart inwoners Aantal % Aantal % Alphen ad Rijn 3.495 2.504 71,6 456 13,0 Delft 4.214 2.690 63,8 541 12,8 Gouda 3.423 2.532 74,0 458 13,4 Hillegom 977 685 70,1 158 16,2 Katwijk 2.694 1.923 71,4 355 13,2 Leiden 5.638 3.736 66,3 663 11,8 Leiderdorp 1.338 986 73,7 178 13,3 Leidschendam-Vb. 3.527 2.142 60,7 508 14,4 Lisse 1.075 800 74,4 135 12,6 Nieuwerkerk ad IJs. 1.090 763 70,0 128 11,7 Nieuwkoop 1.253 960 76,6 188 15,0 Noordwijk 1.231 922 74,9 229 18,6 Oegstgeest 1.037 748 72,1 108 10,4 Pijnacker-Nootdorp 2.177 1.700 78,1 236 10,8 Rijswijk 2.236 1.317 58,9 261 11,7 Teylingen 1.657 1.312 79,2 219 13,2 Voorschoten 1.096 821 74,9 143 13,0 Waddinxveen 1.103 835 75,7 161 14,6 Wassenaar 1.193 671 56,2 156 13,1 Westland 4.530 3.621 79,9 552 12,2 Zoetermeer 5.881 3.925 66,7 681 11,6 Totaal 50.865 35.593 70,0 6.514 12,8 Tabel A2.2c. Respons en non-respons voor de C-gemeente. Gemeente UitgeRespons > 250.000 nodigd Opkomst Antw.kaart inwoners Aantal % Aantal % Den Haag 23.512 12.829 54,6 2.818 12,0 Tabel A2.3a. Passieve participatie: antwoordredenen. Huisarts % t.o.v. % t.o.v. antw. uitgenod. redenen vrouwen Baarmoederverwijdering 10% 1% Zwangerschap 25% 3% Behandeling gynaecoloog 18% 2% Overig 28% 3%

Non-respons Aantal 535 983 433 134 416 1.239 174 877 140 199 105 80 181 241 658 126 132 107 366 357 1.275 8.758

% 15,3 23,3 12,6 13,7 15,4 22,0 13,0 24,9 13,0 18,3 8,4 6,5 17,5 11,1 29,4 7,6 12,0 9,7 30,7 7,9 21,7 17,2

Non-respons Aantal 7.865

% 33,5

Centraal % t.o.v. % t.o.v. antw. uitgenod. redenen vrouwen 11% 2% 25% 3% 23% 3% 23% 3%

26

A. CAPITA SELECTA

Tabel A2.3b. Passieve participatie: zwangerschap en baarmoederverwijdering (bv) gestratificeerd naar geboortejaar. Leeftijd Totaal Antwoordredenen Zwanger % bv % 1948 1.207 0 0,0 219 18,1 1953 1.121 0 0,0 241 21,5 1958 1.313 0 0,0 304 23,2 1963 1.314 14 1,1 233 17,7 1968 1.370 272 19,9 90 6,6 1973 1.975 1.017 51,5 23 1,2 1978 2.245 1.295 57,7 5 0,2 Totaal 10.545 2.598 24,6 1.115 10,6

‘baarmoederverwijdering’ gestratificeerd naar geboortejaar. Zoals te verwachten is, zien we ‘zwangerschap’ vooral bij de relatief jonge vrouwen en ‘baarmoederverwijdering’ hoofdzakelijk bij de oudere vrouwen. Bijna alle andere redenen vallen in de categorie ‘tijdelijke afmelding’, de afmelding geldt voor de onderhavige ronde. Bij een volgende ronde wordt wederom een uitnodiging verstuurd. In de evaluatie telt de vrouw één keer. Dit wil zeggen dat als een uitgestelde uitnodiging tot participatie leidde, de vrouw in die ronde wordt meegeteld bij ‘participatie’. Cytoscores De cytologische uitslagen van de vrouwen die een uitstrijkje in het kader van het bevolkingsonderzoek lieten maken, LCPL 44! werden voor het grootste deel (97%) door respectievelijk het LCPL (Leids Cytologisch en Pathologisch Laboratorium), het Wielenga laboratorium in Den Haag, de SSDZ (Reinier de Graaf, Overig 3! Delft), het Goudse Laboratorium en Wielenga 24! Goudse Lab 11! voor een klein deel (3%) door andere laboratoria naar SBBW verzonden SSDZ 18! (zie Fig. A2.10). SBBW beschikt voor dit jaarverslag over 55.721 cytologische uitslagen van de geboortejaarcohorten 1978, 1973, 1968, 1963, 1958, 1953 en Fig. A2.10. Percentage onderzoeken per 1948. Van al deze uitstrijkjes zijn zowel laboratorium in 2008. Pap-klassen als KOPAC-codes bekend. In dit verslag worden de cytologische resultaten in beide coderingsvormen getoond. In Tabel A2.4 is de vertaling van de Pap-classificatie naar de KOPAC-codering weergegeven. Aangezien het grootste deel van de afwijkingen in de KOPAC in de P- en de C-kolom vallen, concentreert de analyse zich geheel op de P en de C en worden

A2. SBBW SCREENING

27

Tabel A2.4. Vertaaltabel Pap-klassen naar KOPAC-codering. Pap-klasse KOPAC P en C Pap 0 P0, C0 Pap I P1, C1 Pap II P2, C3 Pap IIIA P4, P5, C4, C5 Pap IIIB P6, C6 Pap IV P7, C7 Pap V P8, P9, C9 Tabel A2.5. Afgrenzing van de cytoscores. Cytoscore Afgrenzing Negatieve cytoscore Cytologisch negatief (inclusief P2, P3 en C3) Grijze cytoscore KOPAC-code P4 en P5 (= lichte en matige dysplasie) Positieve cytoscore KOPAC-code ≥ P6 (≥ sterke dysplasie) 20‰

de K, de O en de A hier buiten beschouwing gelaten. 16‰ ! Pap IIIB In dit caput wordt gesproken van cytoscores en 12‰ daarbij worden negatieve, grijze en positieve cyto8‰ scores onderscheiden. De afgrenzing van deze drie 4‰ gebieden wordt in Tabel A2.5 gepresenteerd. In de 0‰ 1978 1973 1968 1963 1958 1953 1948 voorgaande verslagen werFig. A2.11. Cytoscores 2008 gestratificeerd naar leef- den de cytoscores altijd tijd. uitgedrukt in Pap-klassen en daarom wordt in Fig. 20‰ A2.12 het verloop van de Pap II cytoscores in deze classifi16‰ catie getoond. Pap IIIA De cytoscores (in h) 12‰ zijn berekend voor de 55.721 uitstrijkjes van het 8‰ screenjaar 2008. Net als in voorgaande jaren wor4‰ den de hoogste cytoscores voor de positieve cytologie 0‰ 2004 2005 2006 2007 1008 (≥ Pap IIIB) bij de jongste Fig. A2.12. Verloop van de cytoscores 2004-2008 van vrouwen gevonden, voor Pap II en Pap IIIA. Pap IIIA

28 Tabel A2.6. (Pre)carcinoom van de cervix, definities. Plaveisel CIN I CIN II CIN III (Micro)invasief plaveiselcelcarcinoom

A. CAPITA SELECTA

Cilinder (endocervix)

adenocarcinoma in situ adenocarcinoom

2008 zijn dit de geboortejaren 1968, 1973 en 1978. Ook bij Pap IIIA zien we de hoogste score voor de jongste groepen (zie Fig. A2.11). In Fig. A2.13 wordt het verloop van de cy10‰ toscores in de periode 2004 tot en met 2008 8‰ getoond. Met andere Pap 3A 6‰ woorden, van één vol! Pap IIIB tooide onderzoekscyclus 4‰ van 5 jaar. In 2006 zijn de labo2‰ ratoria begonnen met de dunnelaagmethode. In 0‰ 2004 2005 2006 2007 2008 Fig. A2.12 en Fig. A2.13 is te zien dat rondom Fig. A2.13. Verloop van de cytoscores 2004-2008 van Pap 2006 een toename van IIIA en ≥ Pap IIIB. de cytoscores optrad en dat die scores zich in 2008 stabiliseerden. Histoscores: definities De histoscores (positieve histologische bevindingen) worden, analoog aan de cytoscores, berekend over 1.000 onderzochte vrouwen, het zijn dus promillages, van de 55.721 uitstrijkjes van het screenjaar 2008. De histologische onderzoeken worden verslagen in een terminologie waarin zowel de plaveiselcelafwijkingen (in de CIN-terminologie) als de afwijkingen van het cylinderepitheel van de endocervix (de adeno’s) worden uitgedrukt. Incidenteel kan er een adenocarcinoom van het endometrium worden vastgesteld. In totaal zijn er zes verschillende histologische diagnoses van (pre)carcinoom (zie Tabel A2.6). Histoscores van de direct verwezen vrouwen Wij concentreren ons in de eerste plaats op die vrouwen die op basis van een uitstrijkje in het kader van het bevolkingsonderzoek met een cytologische diagnose KOPAC ≥ P5 en ≥ C5 direct naar de gynaecoloog werden verwezen. In het ziekenhuis wordt een vervolgdiagnose gesteld door de patholoog die het biopt beoordeelt dat door de gynaecoloog is afgenomen op geleide van de colposcopie.

A2. SBBW SCREENING

Tabel A2.7. Afgrenzing van de histoscores. Histoscore Negatieve histoscore Grijze histoscore Positieve histoscore

29

Afgrenzing histologisch negatief CIN I en CIN II ≥ CIN III

Tabel A2.8. Histologische diagnoses 2008, vrouwen die naar het ziekenhuis verwezen zijn wegens een cytologische diagnose ≥ P5 en ≥ C5 (≥ matige dysplasie). Lab 1 Lab 2 Lab 3 Lab 4 Overig Totaal N (uitslag ≥ P5 en ≥ C5) 64 153 59 20 17 313 Geen follow-up bekend 2 9 2 0 2 15 Cytologie negatief 1 2 6 0 0 9 Cytologie positief 1 15 2 0 1 19 Histologie negatief 2 3 2 0 0 7 CIN I 3 8 7 0 0 18 CIN II 17 13 9 4 5 48 CIN III 35 88 29 16 9 177 Adeno-c.i.s. 0 3 0 0 0 3 (Micro)invasief 3 9 2 0 0 14 plaveiselcarcinoom Endocervixcarcinoom 0 2 0 0 0 2 Endometriumcarcinoom 0 1 0 0 0 1 ≥ CIN III 38 103 31 16 9 197 Tabel A2.9. Histoscores 2008, vrouwen die naar het ziekenhuis verwezen zijn wegens een cytologische diagnose ≥ P5 en ≥ C5 (≥ matige dysplasie) per 1.000. Lab 1 Lab 2 Lab 3 Lab 4 Overig Totaal Cytoscore ≥ P5 en ≥ C5 4,396 5,860 5,583 3,067 10,961 5,278 Geen follow-up bekend 0,137 0,345 0,189 0,000 1,289 0,253 Cytologie negatief 0,069 0,077 0,568 0,000 0,000 0,152 Cytologie positief 0,069 0,575 0,189 0,000 0,645 0,320 Histologie negatief 0,137 0,115 0,189 0,000 0,000 0,118 CIN I 0,206 0,306 0,662 0,000 0,000 0,304 CIN II 1,168 0,498 0,852 0,613 3,224 0,809 CIN III 2,404 3,371 2,744 2,454 5,803 2,984 Adeno-c.i.s. 0,000 0,115 0,000 0,000 0,000 0,051 (Micro)invasief 0,206 0,345 0,189 0,000 0,000 0,236 plaveiselcarcinoom Endocervixcarcinoom 0,000 0,077 0,000 0,000 0,000 0,034 Endometriumcarcinoom 0,000 0,038 0,000 0,000 0,000 0,017 ≥ CIN III 2,610 3,945 2,934 2,454 5,803 3,322

30

A. CAPITA SELECTA

In totaal zijn dit jaar 2007 2008 313 vrouwen doorgestuurd naar de tweeCIN II CIN II de lijn, vanwege een KOPAC ≥ P5 en/of CIN I CIN I ≥ C5. Van 15 van de 313 direct verCIN III CIN III wezen vrouwen was geen follow-up bekend (4,8%). Van 298 direct verwezen vrou- Fig. A2.14. Histoscores CIN I/II/III 2007 en 2008, van wen werd wel be- vrouwen met ≥ P5 en ≥ C5. schikt over vervolgdiagnoses. Er werden 14 (micro)invasieve plaveiselcelcarcinomen gediagnosticeerd. De histoscore ≥ CIN III was in 2008: 3,322 (2007: 3,532). In 2008 was de histoscore endocervixcarcinoom 0,034 (2007: 0,049) en voor adeno-c.i.s. 0,051 (2007: 0,082). De histoscore ≥ CIN III nam iets af van 3,532 naar 3,322. Taartdiagrammen van de direct verwezen vrouwen Van de vrouwen met een cytologische diagnose KOPAC ≥ P5 + ≥ C5, die daarmee direct naar de gynaecoloog zijn verwezen, kunnen de histologische diagnoses worden verdeeld in negatief, CIN I, CIN II, en ≥ CIN III (zie Tabel A2.8). Uit deze gegevens zijn zogenaamde ‘taartdiagrammen’ geconstrueerd (Fig. A2.14). Al met al blijft het diagram van 2008 ongeveer hetzelfde als voor 2007, met voornamelijk CIN III diagnoses voor de direct verwezen vrouwen. Histoscores van de indirect verwezen vrouwen De histoscores van de vrouwen met een P4 (lichte dysplasie) uitstrijk zijn berekend. Deze vrouwen worden doorverwezen naar de gynaecoloog wanneer de diagnose van de herhalingsuitstrijk wederom ≥ P4 is. Dit is dus via een indirecte route. Niet alle vrouwen met een P4 worden doorgestuurd: wanneer de herhalingsuitstrijk geen afwijkingen vertoont, hoeven deze vrouwen niet nader te worden onderzocht. In 2008 werd aan 359 vrouwen, via de huisarts, het advies gegeven om een colposcopisch biopt te laten verrichten. Van 38 vrouwen is geen follow-up bekend. Bij 217 vrouwen werd in de tweede lijn geen biopt genomen, maar werd alleen een vervolguitstrijk gemaakt. Hieruit kwamen er 117 met negatieve bevindingen en 100 met afwijkende cytologie (zie Tabel A2.10). Van de overige vrouwen heeft SBBW de beschikking over de histologische diagnose: er werd bij 27 vrouwen een CIN III gevonden. De histoscores worden in Tabel A2.11 gepresenteerd. De histoscore ≥ CIN III nam toe van 0,312 in 2007 naar 0,506 in 2008. De histoscores van de verschillende laboratoria voor de vrouwen van de indirecte route lopen sterk uiteen.

A2. SBBW SCREENING

31

Tabel A2.10. Histologische diagnoses 2008, vrouwen met een cytologische diagnose P4 (lichte dysplasie), die na een herhalingsuitstrijk naar het ziekenhuis verwezen zijn (indirecte route). Lab 1 Lab 2 Lab 3 Lab 4 Overig Totaal N 66 195 69 27 2 359 Geen follow-up bekend 8 24 3 2 1 38 Cytologie negatief 19 71 20 7 0 117 Cytologie positief 9 77 8 6 0 100 Histologie negatief 5 4 10 2 0 21 CIN I 6 8 12 4 0 30 CIN II 9 1 9 3 1 23 CIN III 9 9 6 3 0 27 Adeno-c.i.s. 0 0 0 0 0 0 (Micro)invasief 1 1 1 0 0 3 plaveiselcarcinoom Endocervixcarcinoom 0 0 0 0 0 0 Endometriumcarcinoom 0 0 0 0 0 0 ≥ CIN III 10 10 7 3 0 30 Tabel A2.11. Histoscores 2008, vrouwen met een cytologische diagnose P4 (lichte dysplasie), die na een herhalingsuitstrijk naar het ziekenhuis verwezen zijn (indirecte route) per 1.000. Lab 1 Lab 2 Lab 3 Lab 4 Overig Totaal Cytoscore 4,533 7,469 6,530 4,140 1,289 6,053 Geen follow-up bekend 0,549 0,919 0,284 0,307 0,645 0,641 Cytologie negatief 1,305 2,719 1,893 1,073 0,000 1,973 Cytologie positief 0,618 2,949 0,757 0,920 0,000 1,686 Histologie negatief 0,343 0,153 0,946 0,307 0,000 0,354 CIN I 0,412 0,306 1,136 0,613 0,000 0,506 CIN II 0,618 0,038 0,852 0,460 0,645 0,388 CIN III 0,618 0,345 0,568 0,460 0,000 0,455 Adeno-c.i.s. 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 (Micro)invasief 0,069 0,038 0,095 0,000 0,000 0,051 plaveiselcarcinoom Endocervixcarcinoom 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 Endometriumcarcinoom 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 ≥ CIN III 0,687 0,383 0,662 0,460 0,000 0,506 Uiteindelijke histoscores CIN III De ‘uiteindelijke histoscores’ zijn te berekenen uit de som van de scores die resulteren uit de direct verwezen vrouwen (KOPAC ≥ P5 en ≥ C5) en die van de indirecte route (KOPAC P4). In Fig. A2.15 zijn de histoscores van respectievelijk

32

A. CAPITA SELECTA

CIN I, CIN II en CIN III weergegeven. Er is duidelijk te zien dat de bijdrage van de indirecte route op de uiteindelijke histoscore ook in 2008 sterk afhankelijk is van de ernst van de afwijking: groot voor CIN I, klein voor CIN III. De uiteindelijke histoscore CIN III was 3,439 terwijl die in 2003 slechts 2,533 bedroeg. 100%

Leeftijdsstratificatie 80% van de CIN III histoscores 60% In 2008 heeft SBBW 40% wederom profijt gehad van het unieke systeem 20% dat is opgezet waarbij 0% de cytologische en hisCIN I CIN II CIN III tologische data rechtstreeks gekoppeld zijn. Fig. A2.15. Indirecte (KOPAC P4; rood) en directe In 2007 werden 207 CIN (KOPAC P5; groen) route naar CIN I, CIN II en CIN III. III laesies gediagnosticeerd. In 2008 zijn dit 2007 6‰ er 204. Gestratificeerd 2008 naar leeftijd waren de histoscores van de 30- en 4‰ 35-jarige vrouwen met CIN III in 2008 hoger dan in 2007 en voor de 2‰ overige leeftijdscategoriën juist iets lager (Fig. A2.16). 0‰ 30

35

40

45

50

55

60 jr

Fig. A2.16. Histoscores CIN III 2007 en 2008, gestratificeerd naar leeftijd.

A3. BORSTELHISTOLOGIE

33

A3 Borstelhistologie: een nieuwe methode die een nieuwe PALGA-Thesaurusterm verdient Mathilde E. Boon De PALGA heeft een thesaurus voor de te gebruiken termen. In dit caput betogen wij dat de term ‘ingeblokt cytologisch materiaal’ uit de tijd is en vervangen moet worden door ‘borstelhistologie’. Introductie Het cervixuitstrijkje bestaat niet meer in het LCPL, alle cervix samples komen tegenwoordig in een potje fixatief binnen. In het LCPL wordt de ThinPrep-methode (Hologic) gebruikt. De FDA-richtlijnen geven aan dat, nadat het borsteltje is afgeschud in het fixatief, het borsteltje door de clinicus moet worden weggegooid. In het Leidse LCPL worden de borsteltjes niet weggegooid, maar komen de potjes met borsteltje en al op het laboratorium aan. Van die ‘prullenmand’ samples (die zoals blijkt zeer veel histologische borstelbiopten bergen) kunnen histologische coupes worden gemaakt. Dit is een nieuwe methode waarbij niets wordt weggegooid. Op basis van het cytologische ThinPrep-glaasje kan het vermoeden rijzen dat het borsteltje nog veel biopsiemateriaal zal bevatten. Wij hebben deze methode sinds 2004 toegepast en hebben na 3.000 casussen geleerd welke samples voor borstelhistologie in aanmerking komen, en wel degene die onbeoordeelbare gecollabeerde brokken bevatten: dit zien we in 0,5% van de ThinPrep-glaasjes. In die geselecteerde gevallen zenden wij de huisarts een fax waarbij wij zijn medewerking vragen: in 90% van de gevallen krijgen wij de fax getekend terug. Materiaal en methode De studiegroep bestaat uit 205 vrouwen met een borstelhistologie met een diagnose ≥ CIN II. De controlegroep bestaat uit 353 vrouwen die zonder een borstelhistologie naar de tweedelijn werden verwezen wegens een cytologische diagnose ≥ matige dysplasie. Van alle 558 vrouwen werd de histologische diagnostiek in de tweedelijn nagetrokken. Zowel de studiegroep als de controlegroep komt uit het materiaal van 2007, zijnde 65.000 gescreende vrouwen met ThinPrep samples. Resultaten Van de 205 vrouwen uit de studiegroep werd bij 66% een CIN III in de tweedelijn gediagnosticeerd, bij 7% een plaveiselcelcarcinoom (PCC) en bij 4% een adenocarcinoom. Van de 353 vrouwen uit de controlegroep had 50% een CIN III, 2% een PCC en 1% een adenocarcinoom. Wat betreft de vrouwen waarbij de verwijzing geen pathologie opleverde (CIN 0), was het percentage in de borstelhistologiegroep 2% en in de controlegroep 18%. De diagnose adenocarcinoma in situ (AIS) werd in beide groepen slechts bij 2% van de vrouwen gesteld in de tweedelijn.

34

A. CAPITA SELECTA

Tabel A3.1. Diagnose in de tweedelijn van 558 vrouwen. Cytol. CIN CIN 0 0 I II III AIS PCC Controlegroep 36 29 32 65 175 6 6 Borstelhistologiegroep 0 4 11 26 136 5 15 Totaal 36 33 43 91 311 11 21

Adeno 4 8 12

Totaal 353 205 558

Bij de controlegroep is de beslissing om de vrouw naar de tweedelijn te verwijzen gebaseerd op een cytologische diagnose, in de borstelhistologiegroep is dat besluit genomen op basis van een histologische diagnose.

Discussie Het diagnosticeren in de borstelhistologiecoupes is klip en klaar. Dit in tegenstelling tot de ThinPrep-cytodiagnostiek waarbij de diagnosten vaak onzeker blijven. Toch werden er ook fouten gemaakt, zo was er een casus van cervicale endometriose waarbij wij ten onrechte op de borstelhistologie de diagnose adenocarcinoom gaven vanwege een verhoogde proliferatie. We hebben hiervan geleerd. Ook was er een casus waarbij in eerste instantie het colposcopisch biopt negatief was (CIN 0), maar waarbij een jaar later, in 2008, een PCC werd vastgesteld. Daarnaast waren er twee gevallen waarbij de CIN III niet meer werd teruggevonden terwijl de borstelhistologiecoupes grote brokken CIN III-weefsel bevatten, met zeer veel proliferatie (Ki-67) in de kernen en p16 (HPV-activiteit) in zowel de kernen als in het cytoplasma. Kortom, wij menen dat we hier te maken hebben met een fout-negatief colposcopisch biopt. Wij menen dat het voor de huisarts makkelijk is om met een borsteltje heel veel CIN III-weefsel te verzamelen terwijl het maken van colposcopische biopten met grote brokken CIN III vaak verre van eenvoudig is. Een bijkomend voordeel is dat de brokken CIN III direct in contact komen met fixatief en middels een schudmachine in het laboratorium verwerkt worden. De clinicus hoeft alleen maar het borsteltje in het potje met fixatief te plaatsen en kan geen fouten maken. Hoe vaak niet ontvangt de patholoog een door de clinicus verknepen biopt waarin de CIN III-brokken mechanisch beschadigd zijn. Kortom, onze ervaring heeft ons geleerd dat borstelhistologie vaak superieur is aan colposcopische biopten! In de communicatie met de huisartsen is het belangrijk dat er een uitslag verstuurd wordt waarin de term ‘borstelhistologie’ gebezigd wordt en waarin het woord ‘cytologie’ totaal ontbreekt. Ook is het voor de gynaecoloog belangrijk dat hij door heeft dat het hier een (wellicht superieure?) harde histologische diagnose betreft, die door de huisarts met zijn borsteltje tot stand kwam, en niet een boterzachte cytologische diagnose. Als zij/hij dat beseft, dan kan zij/hij, gewapend met die diagnose, direct aan de slag en hoeven allerlei omwegen, die duur zijn en de vrouw onnodig in het onzekere laten, niet meer worden bewandeld. Conclusie De term ‘borstelhistologie’ verdient een plek in de PALGA-Thesaurus.

A3. BORSTELHISTOLOGIE

35

Fig. A3.1. Cytologie (boven) en borstelhistologie gepubliceerd in ‘Zorgen voor Morgen’, van een casus van plaveiselcelcarcinoom. Grote brokken carcinoomweefsel in de borstelhistologie. Dit is een casus waarbij de carcinoomcellen niet in het cytologiepreparaat waren herkend!

36

A. CAPITA SELECTA

Fig. A3.2. Dezelfde invasief carcinoomcasus met een Ki-67-kleuring (proliferatie) en p16-kleuring (HPV-integratie, beide bruingekleurde beelden boven, en onder borstelhistologie in de C34-kleuring waarbij de angiogenese (rood) zichtbaar wordt. Deze grote brokken carcinoomweefsel waren achtergebleven in het borsteltje dat nog in het potje met BoonFix zat. Ook deze beelden zijn gepubliceerd in ‘Zorgen voor Morgen’.

A4. CERVICAL INFLAMMATION

37

A4 Exploiting the Dutch KOPAC O codes: their signifcance for the detection of squamous intraepithelial lesions in cervical cytology ∗ Mathilde E. Boon, Anne M.E. Roeters, Tj. Romke Bontekoe† The O-axis of the Dutch cytological coding system, KOPAC, enables to code for eight inflammatory events, that is koilocytosis (related to human papillomavirus (HPV)), Trichomonas, dysbacteriosis (related to bacterial vaginosis (BV)), Candida, Gardnerella, Actinomyces, ‘Chlamydia’, and nonspecific inflammation (leucocytosis). This study presents an analysis of 1,008,879 smears. Of each smear, the age of the woman and the reason for smear taking (screening or indication) was available. The cytoscores (per mille) for the KOPAC O codes were calculated. For the screening smears, the cytoscores were for koilocytosis (HPV) 2.6, for Trichomonas vaginalis 1.9, for dysbacteriosis 31.4, for Candida albicans 9.8, for Gardnerella vaginalis 0.7, for Actinomyces 6.9, for ‘Chlamydia’ 0.8, and for inflammatory changes 66.4. For the calculation of the Odds Ratio (OR), normal smears were used as a reference. The cytoscores for ‘Chlamydia’ and Gardnerella covaried with high grade SIL (HSIL), with an OR of 7 and 12, respectively. In addition, the OR for Trichomonas vaginalis, for dysbacteriosis, and for inflammation proved to be significantly high in the indication smears. Introduction Cytology is the principal method for screening of cervical cancer. Among women worldwide, cervical cancer is the second most common cancer after breast cancer with an estimated 493,000 new cases and 274,000 deaths in 2002.1 It is well established that infection with certain human papillomaviruses (HPV) plays a central role in cervical carcinogenesis.2 Although HPV is widely prevalent, only a few infected women will develop cervical cancer, suggesting that other factors are involved. HPV infection can result in malignancy if the immune system is not able to clear the infection. Certain co-factors, such as cotinine, decrease the capacity of the immune system, explaining the higher incidence of cervical carcinoma in women who smoke. Another possible factor may be simultaneous other infections. In this context, a higher prevalence of squamous abnormalities was found in women with dysbacteriosis and in women with Gardnerella.3,4 But not all infections are culpable. Candida was shown not to be associated with cervical (pre)neoplasia.5 ∗ Materiaal gepubliceerd in Diagnostic Cytopathology 2010; 38: 85-93. † Bontekoe Research, Leiden.

38

A. CAPITA SELECTA

The Dutch system for coding cervical cytology, the so-called KOPAC, enables us to evaluate both the status of the squamous epithelium as well as the simultaneous inflammatory events, that is koilocytosis (related to HPV), Trichomonas, dysbacteriosis (related to bacterial vaginosis (BV)), Candida, Gardnerella, Actinomyces, ‘Chlamydia’, and nonspecific inflammation (leucocytosis). Since 1988, each Dutch smear is coded for both. Therefore, the KOPAC coding system provides a unique opportunity to study the status of the squamous epithelium concurring with inflammatory events. In the present study, we exploited a large data base over 18 years, containing over 1,000,000 KOPAC-coded smears. Materials and methods The 1,008,879 smears are coded according to the KOPAC system. Over 80% of these smears are conventional smears, the remainder are liquid-based cytology (LBC) slides, all dating after the introduction of this technique in our laboratory in 2002. KOPAC is an acronym, in which each letter stands for a cytological axis (see Table A4.1). In this article, we concentrate on the diagnosis of inflammatory events (KOPAC O-axis) and status of the squamous epithelium (KOPAC P-axis). Translated into the Bethesda system, P1 stands for within normal limits (WNL), P2-P3 for atypical squamous cells of undetermined significance (ASCUS), P4 for low grade squamous intraepithelial lesions (LSIL), P5-P7 for high grade squamous intraepithelial lesions (HSIL), and P8-P9 for carcinoma. Women with high grade squamous intraepithelial lesions (HSIL) are referred to the gynecologist for colposcopic biopsy. Cases coded as KOPAC P2-P4 (ASCUS + LSIL) require a repeat smear after 6 months. The inflammatory diagnoses on the KOPAC O-axis; koilocytosis (O1), Trichomonas vaginalis (O2), dysbacteriosis (O3), Candida (O4), Gardnerella vaginalis (O5), noninflammatory flora (O6), Actinomyces (O7) (mainly in IUD users), ‘Chlamydia’ (O8), and nonspecific inflammatory changes (leucocytosis) (O9) are depicted in Fig. A4.1. In the legend of this figure, the decisive criteria of the respective O codes are given. In Fig. A4.1(h) a so-called Chlamydia indicator cell is shown, being a benign metaplastic cell with a freckled aspect of the cytoplasm and altered staining. A smear virtually never requires two O-codes. Note that the presence of koilocytosis (O1) excludes a KOPAC P1 code (within limits).6 ThereTabel A4.1. The five cytological axes of the KOPAC acronym. Dutch English K-axis Kompositie Composition O-axis Ontsteking Inflammation P-axis Plaveiselepitheel Squamous epithelium A-axis Andere afwijkingen Other abnormalities C-axis Cylindercelepitheel Endocervical columnar epithelium

A4. CERVICAL INFLAMMATION

39

ab

cd

e f Fig. A4.1. Inflammatory events of the KOPAC O-axis. All are ThinPrep slides. (a) Koilocytosis: excavitation of the cytoplasm due to active HPV infection. (b) Trichomonas vaginalis: diagnostic small blue blobs. Here, the Trichomonads are mixed with a few leucocytes. (c) Dysbacterosis: cells with a detached bacterial film. The cells are only partly covered by coccoid bacteria (compare with blue mountain cell of KOPAC O3 depicted in Fig. A4.1e). (d) Candida albicans: hyphi and spores. (e) Gardnerella vaginalis: blue mountain cells are easily detected by the dark blue color due to the mountain of blue staining Gardnerella covering squamous cells completely. (f) Noninflammatory: only a few bacteria and no granulocytes.

40

A. CAPITA SELECTA

gh

I Fig. A4.1. (Continued.) (g) Actinomyces: a blue tangle of bacteria. (h) ‘Chlamydia’: the indicator cells display a freckled aspect of the cytoplasm and altered staining. It is questionable whether these changes are exclusively an effect of Chlamydia infection and can also be induced by HPV. (i) Nonspecific inflammatory changes: epithelial cells covered by leucocytes. Note that smears with a few scattered granulocytes are not coded as O9.

fore, KOPAC O1 and P1 are never given simultaneously, accordingly all O1 smears receive a ≥ P2 code. The Dutch family physicians take smears in the context of the national screening program, the so-called screening smears. In addition, smears are taken of symptomatic women or taken as a repeat smear after a preceding abnormal screening smear (KOPAC P2-P4). These are the indication smears. The screening smears are taken from women aged 30, 35, 40, 45, 50, 55, and 60 years. The age groups were created around the ages of screening such that the 30 year cohort ranges from 28 to 32 years of age, the 35 year cohort from 33 to 37 years of age and so on. Note that that data base contains indication smears of women younger than 30 and older than 60 years. We use the term cytoscore for both the O-codes and the P-codes. The number of smears with a specific code of the O-axis per 1,000 smears is calculated, accordingly the O-cytoscores are expressed per mille. The P-cytoscores for ASCUS + LSIL and

A4. CERVICAL INFLAMMATION

41

60,000

40,000

20,000

0 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62

Fig. A4.2. Women’s age in years (horizontal axis) and number of smears (vertical axis) of the indication smears (red bars) and screening smears (green bars). The number of screenee smears peaks at age 30, 35, 40, 45, 50, 55, and 60.

for HSIL were calculated per 1,000, thus also expressed per mille. The O-cytoscores and Odds Ratios (OR) with 95% confidence intervals (CI) were calculated using the normal smears (O6) as reference. As the context of the smear taken (screening versus indication) is a possible effect modifier, 20‰ we stratified the data Indication smears to this variable as well. Screening smears These calculations were 15‰ made using SPSS 12.0 for Windows and Excel 10‰ 2007. In order to evaluate 5‰ the consistency of the conventional KOPAC O diagnoses, the cytoscores 0‰ 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 of four cytotechnologists (each screening Fig. A4.3. The HSIL cytoscores, for screening and indiover 8,000 conventional cation smears, stratified by age. smears) in one year (1994) were calculated.

42

A. CAPITA SELECTA

Results From January 1991 until March 2008, 1,008,879 cervical smears were KOPACcoded. Fig. A4.2 illustrates the number of screening and indication smears as a function of women’s age. It is obvious (and to be expected) that the number of screening smears show a clear 5 year repetition pattern (Fig. A4.2). Stratification of HSIL (KOPAC P5-P9) as a function of age group is depicted in Fig. A4.3.The cytoscores for HSIL are highest among the 30 and 35 year groups and dwindle gradually with age. The cytoscore for HSIL peaks to 18.3h of the indication smears. In all age groups, the HSIL cytoscores are higher in the indication group. The cytoscores of every inflammatory event coded on the KOPAC O-axis, regardless of the P-codes or women’s age, are given in Table A4.2. Dysbacteriosis (O3) and nonspecific inflammations (O9) are relatively common, while Trichomonas vaginalis, Gardnerella vaginalis, and ‘Chlamydia’ cells are rare. As expected, smears of symptomatic women (indication smears) show more concurrent inflammatory events than those taken in scope of the screening program (screenees). Fig. A4.4 shows cytoscores per age group of the inflammatory events among screening and indication smears separately. For both the screenees and the indication women, inflammatory events are more common in younger women and inflammatory cytoscores decline accordingly with age. The cytoscores of Trichomonas and Actinomyces, however, show a different pattern: Trichomonas peaks among women in the 50 year group and Actinomyces’ in the 35 and 40 year group. To evaluate the status of the squamous epithelium concurring with inflammatory events, we compared each inflammatory event with the noninflammatory smears (KOPAC O6), the reference group, for the screening and indication cohort separately. The reference group of the screening and indication cohort contains 614,083 and 261,117 smears, respectively. Figs. A4.5 and A4.6 show the cumulative cytoscores for the status of squamous epithelium (KOPAC P-axis) found in inflammatory smears. It is evident that, compared to the noninflammatory smears, an

Tabel A4.2. Cytoscores (h) for inflammatory events in screening and indication smears regardless of the P-codes or women’s age. Screening smears Indication smears O1 - Koilocytosis (HPV) 2.6 9.6 O2 - Trichomonas vaginalis 1.9 3.2 O3 - Dysbacteriosis 31.4 54.8 O4 - Candida albicans 9.8 16.0 O5 - Gardnerella vaginalis 0.7 0.9 O6 - Noninflammatory flora 879.6 840.4 O7 - Actinomyces 6.9 8.8 O8 - ‘Chlamydia’ 0.8 2.3 O9 - Nonspecific inflammatory changes 66.4 64.0

A4. CERVICAL INFLAMMATION

43

Koilocytosis

Trichomonas vaginalis

20‰

Indication Indication

15‰

4‰

Screening

Screening 3‰

10‰ 2‰ 5‰ 0‰

1‰

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

0‰

Dysbacteriosis

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

Candida 30‰ Indication

60‰

Screening

50‰ 20‰ 40‰ 30‰ 10‰

20‰ 10‰ 0‰

Indication Screening

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

0‰

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

Actinomyces

Gardnerella vaginalis 15‰

1.5‰

Indication

Indication

Screening

Screening 1‰

10‰

0.5‰

5‰

0‰

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

0‰

Chlamydia indicator cells ! KOPAC O8 Indication 4‰

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

Nonspecific inflammation 80‰

Screening 60‰

3‰

40‰

2‰

20‰

1‰

Indication Screening

0‰

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

0‰

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

Fig. A4.4. The cytoscores for the O-codes, stratified by age. (A) Koilocytosis (O1); (B) Trichomonas vaginalis (O2); (C) Dysbacteriosis (O3); (D) Candida (O4); (E) Gardnerella vaginalis (O5); (F) Actinomyces (O7); (G) ‘Chlamydia’ (O8); (h) Nonspecific inflammation (O9).

inflammatory event seems to have an effect on the distribution of epithelial status (KOPAC P-axis). This seems especially evident in koilocytosis, ‘Chlamydia’

44

A. CAPITA SELECTA

cells, and Gardnerella vaginalis. For both screenee and indication women, we observed that Gardnerella and ‘Chlamydia’ are relatively prominent in ASCUS + LSIL smears. All this can be seen in Fig. A4.5 and Fig. A4.6 with WNL in blue, ASCUS + LSIL in green, and HSIL in red. Note that the majority of the KOPAC O1 (koilocytosis) smears is coded as ASCUS-LSIL, both in the screening and in the indication smears. Next, we focus on the cytoscores for HSIL, coded as P5-P9. In the analysis of our data, we looked at the OR and its CI. The ORs and CIs for HSIL (KOPAC P5-P9) per inflammatory diagnosis (O-axis) were calculated for the screening and indication cohort separately. For these calculations, KOPAC O6 is used as reference, as this is the noninflammatory group. The OR is the ratio of two odds, i.e., the ratio of two proportions. One proportion is the cytoscores of HSIL divided by the cytoscores for normal squamous epithelium (KOPAC P1), for noninflammatory smears (KOPAC O6). The other proportion comes from HSIL over KOPAC P1 for the inflammatory smears. Thus, the ORs indicate the effect of inflammations on HSIL, with respect to no inflammation. OR values less than 1 mean a decreased risk, and the higher than 1 an increased risk; the higher the value is > 1, the higher the risk. CI surrounding the OR values can be calculated, and these are important for getting insight into the significance of the differences. As stated earlier, KOPAC O1 and P1 are (almost) never given simultaneously, as the finding of koilocytosis results in an abnormal squamous epithelium, and a subsequent code (KOPAC P > 1). Therefore, the OR for HPV (KOPAC O1) is undetermined. The OR with 95% CI was calculated for cervical HSIL and simultaneous inflammatory events for the screening and indication cohort separately. The CI signals the statistical significance of the OR, viz. if the value 1.0 lies inside the CI, then the OR is not significant and vice versa. This is indicated in Table A4.3.

Tabel A4.3. Odds Ratios for HSIL (KOPAC P5-P9) versus normal/benign (KOPAC P1) per KOPAC O-code. OR of (pre)neoplasia in screening smears in indication smears O1 - Koilocytosis/HPV n.a. n.a. O2 - Trichomonas vaginalis 1.9 (1.0 -3.8) 2.0 (1.2-3.3)∗ O3 - Dysbacteriosis 1.8 (1.5-2.2)∗ 1.5 (1.3-1.7)∗ O4 - Candida albicans 1.0 (0.7-1.5) 0.8 (0.6-1.1) O5 - Gardnerella vaginalis 11.8 (7.4 -19.0)∗ 5.8 (2.3 -10.2)∗ O6 - Noninflammatory flora 1 1 O7 - Actinomyces 1.2 (0.7 -1.8) 1.0 (0.7 -1.5) O8 - Chlamydia indicator cells 6.8 (3.6-12.8)∗ 7.8 (5.6-10.9)∗ O9 - Nonspecific inflammatory changes (leucocytosis) 2.0 (1.7-2.2)∗ 1.6 (1.5-1.8)∗ n.a. = not applicable; ∗ statistically significant.

A4. CERVICAL INFLAMMATION

45

Screening smears: cytoscores of the KOPAC P!axis Koilocytosis Trichomonas vaginalis Dysbacteriosis Candida albicans Gardnerella vaginalis Noninflammatory flora Actinomyces ’Chlamydia’ Nonspecific inflammations 0‰

200‰

400‰

600‰

800‰

1000‰

Fig. A4.5. The cytoscores of the KOPAC P-axis are respectively WNL (blue), ASCUS + LSIL (green), and HSIL smears (red) and the eight O-codes of screening smears. Note that Gardnerella and ‘Chlamydia’ are relatively prominent in ASCUS + LSIL. For koilocytosis, there are no WNL smears. Indication smears: cytoscores of the KOPAC P!axis Koilocytosis Trichomonas vaginalis Dysbacteriosis Candida albicans Gardnerella vaginalis Noninflammatory flora Actinomyces ’Chlamydia’ Nonspecific inflammations 0‰

200‰

400‰

600‰

800‰

1000‰

Fig. A4.6. The cytoscores of the KOPAC P-axis are respectively WNL (blue), ASCUS + LSIL (green), and HSIL smears (red) and the eight O-codes of indication smears. Note that Gardnerella and ‘Chlamydia’ are relatively prominent in ASCUS + LSIL. For koilocytosis, there are no WNL smears.

For both screening and indication smears, Gardnerella, nonspecific inflammatory changes, and dysbacteriosis significantly covary with HSIL in the same smear. It is remarkable that smears coded as ‘Chlamydia’ are frequently simultaneously coded

46

A. CAPITA SELECTA

as HSIL as expressed in the OR of 6.8 in the screening cohort and 7.8 in the indication cohort. Finally, the cytoscores of cytotechnologists for the eight inflammatory events for the year 1994 are presented in Table A4.4. The highest consistency was observed for KOPAC O1 (koilocytosis) and the lowest for KOPAC O8 (‘Chlamydia’). Note that here the data are taken of a year when all screened smears were conventional ones. It is our experience that all KOPAC O cytoscores vary much less between cytotechnologists when liquid-based cytology slides are screened. Discussion The widely used Bethesda system exclusively codes for inflammatory events in smears within normal limits, whereas the Dutch KOPAC coding system codes for inflammatory events regardless of the status of the squamous epithelium. Accordingly, the KOPAC coding system enabled us to evaluate the status of the cervical squamous epithelium and the presence of inflammatory events simultaneously. We performed a cytological study in a considerably large Dutch data base of 1,008,879 smears. With ORs for Gardnerella as high as 11.8 for screenee smears and 5.8 for indication smears. Therefore, our observations give a unique insight in cytological findings of symptomatic and asymptomatic women in the Netherlands. As described previously,3−5 Gardnerella and, to a lesser degree, dysbacteriosis covary with HSIL in the same smear. Such was confirmed in the current much larger study of over 1 million smears. In this context of the significance of the KOPAC O5 diagnosis, it is important to mention that Gardnerella produces N-nitrosamines, which can lead to nonspecific vaginitis. N-nitrosamines are carcinogenic, therefore it is likely that the vaginal flora of women with a smear cytologically diagnosed in Dutch laboratories as

Tabel A4.4. The KOPAC O cytoscores (h) of four cytotechnologists in one year (1994) with exclusively conventional smears. Cytotechnologist 1 2 3 4 n/year 16,100 8,500 15,300 10,300 O1 - Koilocytosis (HPV) 8.7 8.9 7.8 7.7 O2 - Trichomonas vaginalis 1.4 1.9 2.5 1.8 O3 - Dysbacteriosis 57.7 69.9 41.9 51.2 O4 - Candida albicans 22.1 38.7 23.2 32.8 O5 - Gardnerella vaginalis 0.6 0.6 0.7 1.7 O7 - Actinomyces 4.3 6.2 8.2 6.7 O8- ‘Chlamydia’ 1.1 6.7 2.1 1.1 O9 - Nonspecific inflammatory changes 146 152.2 169 94.4

A4. CERVICAL INFLAMMATION

47

Gardnerella produces significant amounts of amines and accordingly women with this cytologic O-code (KOPAC O5) are at risk to develop cervical carcinoma.7−11 It is reported that women with clinically diagnosed BV (probably having a vaginal flora containing variable numbers of Gardnerella bacteria) are at risk to develop CIN or invasive cervical cancer.12−14 It is a well known fact that inflammatory events are influenced by sexual activity and personal hygiene and these lifestyle factors are also confounders for cervical carcinoma. Particularly, Brazilian studies should be mentioned here, in which the relation of Gardnerella and CIN is reported.15−17 In another cytologic study, it was reported that the cytoscores for Gardnerella proved to be significantly higher in smears of HPV-infected women.18 Note that in the latter study,18 the cytoscore of Gardnerella was as high as 170h over 1,000 times that in our study. Clearly, our threshold for the cytologic diagnosis of Gardnerella can be called extremely high, suggesting that only cases with an explosive growth of Gardnerella are detected by our cytotechnologists. This study provides an oversight of the full range of cervical infections as detected by cytology and coded in the KOPAC O, proving that this byproduct of screening can be exploited for large epidemiological studies by using the Dutch KOPAC codes. References 1. Ferlay J. 2004, 2007. GLOBACAN 2002 cancer incidence. Mortality and prevalence worldwide. IARC Cancer Base No. 5 version 2.0. Lyon: IARC Press. 2. Walboomers JM, Jacobs MV, Manos MM, Bosch FX, Kummer JA, Shah KV, Snijders PJ, Peto J, Meijer CJ, Muñoz N. 1999. Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol 189:12-19. 3. Verbruggen BS, Boon ME, Boon LM. 2006. Dysbacteriosis and squamous (pre)neoplasia of immigrants and Dutch women as established in population-based cervical screening. Diagn Cytopathol 34:377-381. 4. Klomp JM, Boon ME, Van Haaften M, Heintz AP. 2008. Cytologically diagnosed Gardnerella vaginalis infection and cervical (pre)neoplasia as established in population-based cervical screening. Am J Obstet Gynecol 199:480.e1-5. 5. Engberts MK, Vermeulen CFW, Verbruggen BSM, van Haaften M, Boon ME, Heintz APM. 2006. Candida and squamous (pre)neoplasia of immigrants and Dutch women as established in population-based cervical screening. Int J Gynecol Cancer 16:1596-1600. 6. Apgar BS, Zoschnick L, Wright TC Jr. 2003.The 2001 Bethesda System terminology. Am Fam Physician 68:1992-1998. 7. Jones BM. 1994. Amines in semen-free vaginal secretions. Int J STD AIDS 5:301-302. 8. Jones BM, al-Fattani M, Gooch H. 1994. The determination of amines in the vaginal secretions of women in health and disease. Int J STD AIDS 5:52-55. 9. Chen KC, Forsyth PS, Buchanan TM, Holmes KK. 1979. Amine content of vaginal fluid from untreated and treated patients with nonspecific vaginitis. J Clin Invest 63:828-835. 10. Sanderson BE, White E, Baldson MJ. 1983.Amine content of vaginal fluid from patients with trichomoniasis and gardnerella associated non-specific vaginitis. Br J Vener Dis 59:302-305. 11. Harington JS. 1975. Epidemiology and aetiology of cancer of the uterine cervix including the detection of carcinogenic N-nitrosamines in the human vaginal vault. S Afr Med J 49:443445.

48

A. CAPITA SELECTA

12. Guijon F, Paraskevas M, Rand F, Heywood E, Brunham R, McNicol P. 1992. Vaginal microbial flora as a cofactor in the pathogenesis of uterine cervical intraepithelial neoplasia. Int J Gynaecol Obstet 37:185-191. 13. Uthayakumar S, Boyle DC, Barton SE, Nayagam AT, Smith JR. 1998. Bacterial vaginosis and cervical intraepithelial neoplasia–cause or coincidence? J Obstet Gynaecol 18:572-574. 14. Mead PB. 1978. Cervical-vaginal flora of women with invasive cervical cancer. Obstet Gynecol 52:601-604. 15. Calore EE, Cavaliere JM, Shirata KN, Araújo MF. 1995. Papillomavirus in cervicovaginal smears of women infected with human immunodeficiency virus. Sao Paulo Med J 113:1009-1011. 16. Falcó GJ, Madamba AM, de la Fuente F, Aparicio AL, Chacón JM, Harguindey S. 1987. Cervical mosaic and an integrated pathophysiological approach to early cervical neoplasia. J Biol Response Mod 6:473-483. 17. Motta EV, Fonseca AM, Bagnoli VR, Ramos L, Pinotti JA. 2001. Colpocytology in a preventive gynecological ambulatory service. Rev Assoc Med Bras 47:302-310 (in Portuguese). 18. Murta EF, Souza MA, Araújo Júnior E, Adad SJ. 2000. Incidence of Gardnerella vaginalis, Candida sp and human papilloma virus in cytological smears. Sao Paulo Med J 118:105-108.

A5. NIEUWE RICHTLIJNEN

49

A5 Consequenties van de nieuwe richtlijnen van NVVP voor Pap II en IIIA/KOPAC P4 en HPV∗ Mathilde E. Boon Inleiding Op het LCPL wordt sinds augustus 2003 de INNO-LiPA-methode voor HPVbepaling en -typering uitgevoerd. In totaal zijn er 9.529 LiPA-testen gedaan. Voor de LiPA-test wordt BoonFix® als suspensiemedium gebruikt. Follow-up richtlijnen NVVP De follow-up richtlijnen voor Pap II (ASCUS borderline) en Pap IIIA/KOPAC P4 worden door de NVVP geformuleerd. De richtlijnen zijn in 2007 aangepast voor ∗ Door M.E. Boon gepresenteerd op de HPV-dag van Innogenetics, 18 september 2009, Gent.

Fig. A5.1. Materiaal voor het inzenden van een HPV-test.

50

A. CAPITA SELECTA

HPV-diagnostiek. Follow-up richtlijnen NVVP 2006: • Pap II of Pap IIIA/KOPAC P4: herhalen na 6 maanden. • Nogmaals Pap II of Pap IIIA/KOPAC P4: consult gynaecoloog. • Na Pap II of Pap IIIA/KOPAC P4 een Pap I: herhalen na 12 maanden. Follow-up richtlijnen NVVP 2007: • Pap II of Pap IIIA/KOPAC P4: herhalen na 6 maanden en een HPV-test. • Pap II of Pap IIIA/KOPAC P4 HPV negatief: herhalen na 12 maanden. • Pap II of Pap IIIA/KOPAC P4 hrHPV: consult gynaecoloog. Richtlijnen en praktijk Het opvolgen van de richtlijnen blijkt een modderige zaak in de huisartsenpraktijk. In 2007 en 2008 zijn er in totaal 477 vrouwen met een Pap II of Pap IIIA/KOPAC P4, positief getest voor hrHPV. Het advies was consult gynaecoloog. Ons bleek dat in totaal 431 van de 477 hrHPV-vrouwen daadwerkelijk een cytologisch en/of histologisch onderzoek bij de gynaecoloog ondergingen. Hier zijn de richtlijnen dus opgevolgd. Van de overige 46 hrHPV-vrouwen zijn geen onderzoeken bekend. Hier zijn de richtlijnen dus niet opgevolgd.

Fig. A5.2. De BioRobot M48 van Qiagen, een apparaat dat DNA zuivert.

A5. NIEUWE RICHTLIJNEN

51

Fig. A5.3. Voorbeeld LiPA-stroken.

Materiaal en methode De huisarts ontvangt formulieren en materialen voor een HPV-test. Wij passen de INNO-LiPA-methode toe (leverancier: Innogenetics) en testen 18 soorten hoog risico (hr) HPV-typen. In 2007 en 2008 zijn bij 431 vrouwen met Pap II of Pap IIIA/KOPAC P4 de richtlijnen voor HPV en follow-up volledig gevolgd. In de PALGA zijn alle follow-up-uitslagen opgespoord van de 431 naar de gynaecoloog verwezen vrouwen. Tabel A5.1 geeft een overzicht van de histologische en cytologische follow-up. Resultaten In Tabel A5.1 zijn de follow-up gegevens van 431 vrouwen verzameld, gestratificeerd naar HPV-uitslag.

Tabel A5.1. Histologie en cytologie follow-up van 431 vrouwen. Pap-klasse en Follow-up histologie HPV-uitslag CIN 0 CIN I CIN II CIN III Pap II hrHPV 96 51 23 13 Pap IIIA/KOPAC P4 hrHPV 38 60 57 44 Pap II HPV negatief 43∗ − − − Pap IIIA/KOPAC P4 HPV negatief 5∗ − − − Totaal 182 111 80 57 ∗ Alleen cytologie.

Totaal

183 199 43 5 431

52

A. CAPITA SELECTA

80 60 40 20 0

normaal reactief

CIN I

CIN II

CIN III

Fig. A5.4. Uitsluitend histologie follow-up. Rood: Percentage positief Pap II hrHPV. Groen: Percentage Pap IIIA/KOPAC P4 hrHPV. Hier is de CIN 0 onderverdeeld in ‘normaal’ en ‘reactief’. • Er worden geen CIN-afwijkingen (histologie) gevonden bij de vrouwen zonder HPV. • Het hoogste percentage CIN III (histologie) wordt gevonden in de Pap IIIA/ KOPAC P4 hrHPV-groep (22,1%). • Bij de follow-up worden geen invasieve carcinomen gevonden. Toekomst? We kunnen ons afvragen of het wel zo verstandig is om alle vrouwen met een Pap II hrHPV direct voor een colposcopisch onderzoek naar de gynaecoloog te verwijzen. Misschien was het beter geweest om bij de 183 Pap II hrHPV het restmateriaal eerst in te sluiten en een p16-kleuring te doen: hierbij wordt zichtbaar of HPV ‘actief’ is (zie Fig. A5.5). Wellicht geldt zulks ook voor de 199 vrouwen met een Pap IIIA/ KOPAC P4. We kunnen beginnen dit te testen op ons eigen Fig. A5.5. Casus van een Pap II met histologische materiaal van 382 hr-positieve follow-up CIN III: p16 positieve cellen. vrouwen.

A6. BAARMOEDERHALSKANKER EN HPV

53

A6 Baarmoederhalskanker en HPV Anna van Boekel, Marleen de Vries Tijdens schoolvakanties hebben we altijd ‘LCPL-kinderen’ over de vloer. Terwijl hun moeder (of vader) werkt spelen zij met elkaar of doen wat kleine klusjes. Oudere kinderen hebben een echt vakantiebaantje. Het werk op het laboratorium is voor sommigen zo inspirerend dat ze het als onderwerp voor hun eindexamenwerkstuk hebben gekozen. In dit caput hebben wij een deel van het profielwerkstuk van Marleen de Vries en Anna van Boekel opgenomen. Inleiding Ons profielwerkstuk gaat over baarmoederhalskanker en HPV. Deze twee termen hebben een logisch verband. HPV veroorzaakt baarmoederhalskanker. In dit werkstuk zullen we eerst uitleggen wat baarmoederhalskanker precies is en hoe baarmoederhalskanker veroorzaakt wordt en ontstaat. Ook wordt een algemene uitleg van kanker gegeven en een korte toelichting over het bevolkingsonderzoek van baarmoederhalskanker. Ons doel met dit project was het aantonen dat als de biomarker Ki-67 een delende cel aantoont, dezelfde cel positief is met de biomarker p16 die een actieve HPVinfectie aantoont. Nog even onze hoofd- en deelvragen op een rijtje. • Wat is baarmoederhalskanker? • Het onderzoek (wat hebben we allemaal gedaan) • De resultaten en de conclusie daarover. Onze hypothese is: Wanneer cellen besmet zijn met HPV ontstaat er een overexpressie van p16, dat de tumorsuppressiegenen blokkeert, dit leidt tot veel celdeling. Hierdoor verwachten we dat er ook een grote expressie van Ki-67 in de cellen is. Kanker en de celdeling Normaal gesproken volgt een cel bij zijn celdeling een celcyclus. Deze cyclus wordt bij kankercellen niet gevolgd. Bij een standaard celcyclus groeit de cel en vermeerderen de organellen in de G1-fase. Tijdens de S-fase verdubbelt het DNA zich. In de G2-fase worden de enzymen gevormd die nodig zijn voor de verdere celdeFig. A6.1. Schema van de celcyling. De G1-, S- en G2-fase heten samen de clus. interfase. Ze bereiden de feitelijke de celdeling

54

A. CAPITA SELECTA

voor. Na de interfase komt de mitose, de M-fase. Het DNA in duplo wordt van elkaar gescheiden in twee aparte cellen. Als er tijdens een normale celdeling een mutatie optreedt in het DNA dan zal de celcyclus stop gezet worden totdat de mutatie hersteld is. Dit gebeurt niet bij een kankercellen. Als er dan fouten in het originele DNA zitten, dan ontstaat er ook een mutatie in het DNA van de tweede cel. Dat komt door uitschakeling van bepaalde regelgenen. Er is dan geen controle meer in de G1-fase. Specifieke eiwitten zorgen normaal gesproken voor de juiste activiteit op het juiste moment in de celcyclus. Maar nu zijn ze ontregeld. Als of de specifieke eiwitten niet worden geactiveerd of de mutatie(s) niet worden opgelost kan er ongecontroleerde celdeling ontstaan. Dat leidt tot het transformeren (veranderen) van de cel. De suppressorgenen zorgen ervoor dat de celdelingen worden geremd. Deze genen worden bij tumorcellen platgelegd door bijvoorbeeld virussen. Een mutatie in het deel van het DNA dat zorgt voor de remming van de celdeling kan ervoor zorgen dat cellen ongeremd verder delen. De proto-oncogenen zorgen voor de ongeremde delingen . Bij de helft van alle tumoren van de mens is er niet maar één mutatie op één gen maar meerdere. Als DNA zo erg beschadigd is dat het niet meer te herstellen is dan schakelt de cel zich normaal gesproken zelf uit door middel van een zelfmoordgen. De cel gaat dan dood (apoptose). Dat werkt juist niet meer als je kanker hebt. Het Rb-proteïne is een tumor suppressorgen, voluit heet het Retinoblastoma proteïne. Alleen als er signalen van groeifactoren van buitenaf komen zal de cel prolifereren(delen). Bij tumorcellen binden de groeifactoren aan de receptoren en schakelen het Rb-proteïne uit. Er is bij kanker altijd één overeenkomst namelijk de ongecontroleerde celdeling. HPV-infectie: de eerste stap naar het cervixcarcinoom De eerste stp naar het cervixcarcinoom is infectie met humaan papillomavirus (HPV). Dit virus hoort bij de Papillomaviridae. De Papillomaviridae is een grote familie soort-specifieke virussen die letsels van de huid en slijmvliezen veroorzaken in veel dierlijke gastheren. HPV komt heel vaak voor, zowel bij mannen als bij vrouwen. Bijna iedereen komt in zijn/haar leven wel eens in aanraking met HPV. HPV zorgt niet alleen voor kwaadaardige tumoren, maar het kan ook voor goedaardige tumor veroorzaken zoals wratten. Meestal komt het virus binnen via de mond/keel, anus en genitalia, en nestelt het zich in de slijmvliezen. HPV is seksueel overdraagbaar en is dus een SOA. Als je besmet bent met dit virus wil dat lang niet altijd zeggen dat je dan meteen kanker hebt. In de meeste gevallen herstelt je immuunsysteem de schade zelf binnen zes tot acht maanden. Als het virus niet vernietigd wordt door je immuunsysteem en lange tijd in de baarmoedermond aanwezig is ontstaat er een voorstadium van baarmoederhalskanker. Slechts 1% van dit voorstadium zal zonder medische hulp ook echt uitgroeien tot kanker.

A6. BAARMOEDERHALSKANKER EN HPV

55

Mutaties kunnen komen door beschadiging van het weefsel maar het kan ook komen door een virus. HPV is een van de vijf virussen die kanker kan veroorzaken. Dit virus is verantwoordelijk voor ongeveer 14% van alle constateringen van kanker bij de mens. Het is daarom een belangrijkste veroorzaker van deze ziekte. Dat HPV-oncogenen werking (ongecontroleerde celdeling) heeft is nog niet zo heel lang bekend. Men kan pas sinds de jaren 80 het HPV-virus isoleren uit een tumor. Er is ook een verschil tussen mannen en vrouwen. Anus-, penis- en vaginakanker zijn zeldzame ziekten en baarmoederhalskanker juist niet. Dat is wel logisch als je weet Fig. A6.2. Overzicht van alle HPV-typen. dat de cervix een overgang is van plaveiselepitheel (bovenste dekkingslaag van de slijmvliezen) op de buitenkant, de vaginale kant, en de cilinderepitheel aan de binnenkant, de baarmoeder kant. Dit is een hormoon gevoelige overgang. Waar gemakkelijk een ‘storing’ kan optreden. HPV-replicatie Van HPV zijn er heel veel verschillende typen. De ene is kwaadaardiger dan de ander. De verschillen zitten in de eiwitmantel. Het DNA genoom is verdeeld in drie delen. Een deel bevat eiwitten die vroeg tot uiting komen (E = early) en een deel voor eiwitten die laat tot uiting komen (L = late). Het derde deel is belangrijk voor de transcriptie en regulatie van de eiwitten. De late eiwitten L1 en L2 vormen de eiwitmantel van het virus. De vroege eiwitten spelen een rol bij de replicatie van het virale DNA. Ze controleren o.a. de transcriptie. Virussen hebben een gastheercel nodig om te overleven. HPV is een virus met een dubbelstrengs DNA-molecuul dat zich repliceert (kopieert) in de kern van de gastheercel. Deze gastheercellen zijn niet delende epitheelcellen (deklaagcellen). Dit klinkt tegenstrijdig want voor Fig. A6.3. HPV-genoom. replicatie van (viraal) DNA zijn bepaalde eiwitten nodig voor de deling. Een voorbeeld daar van is het DNA-polymerase. HPV moet dus de cel zo veranderen dat er genoeg

56

A. CAPITA SELECTA

DNA-polymerase is voor de replicatie. Het virus heeft twee virale eiwitten E6 en E7. Deze eiwitten ontregelen de celcycluscontrolerende eiwitten. De cel wordt door het E7-eiwit geactiveerd om voor de virale replicatie benodigde eiwitten te produceren (het etinoblastoom-eiwit). Het E6-eiwit zorgt ervoor dat de cel zichzelf niet doodt door apoptosis (voorgeprogrammeerde celdood). P53 wordt hiermee uitgeschakeld. Dit eiwit zorgt er juist voor dat als er een DNA-mutatie optreedt dat de cel dan in rustfase wordt gebracht. Er vindt dan geen DNA-replicatie meer plaats. Zo kan de schade hersteld worden door hersteleiwitten. P53 zorgt bij incidentele DNA-schade voor herstel zodat dit niet doorgegeven wordt aan dochtercellen. Als de schade te ernstig is zal het leiden tot apoptosis. Als dit eiwit uitgeschakeld wordt is de cel gevoelig voor mutaties. De geïnfecteerde cel kan door samenwerking van Rb-eiwit en p53 oneindig lang delen zodat de cel onsterfelijk wordt. Het enzym telomerase is daarbij erg belangrijk. Omdat zij er normaal gesproken, bij de deling, voor zorgen dat de telomeren steeds korter worden. Totdat op een gegeven moment de telomeren zo kort zijn dat de cel niet meer kan delen. Dan sterft de cel af. De telomerase zorgt ervoor dat bij de HPVcellen de telomeren steeds weer bijgroeien zodat de cel oneindig kan delen. HrHPV en CIN-laesies De namen van de typen HPV zijn gewoon nummers die gegeven zijn in volgorde van hun ontdekking. Tot nu toe zijn er al meer dan 100 verschillende typen gevonden die allemaal minstens 10% van hun DNA verschillen. Al deze types kunnen onderverdeeld worden in HPV-typen die de huid infecteren (de cutane typen) of die een infectie in de genitale slijmvliezen kan veroorzaken (de muscale HPV-typen). Deze muscale HVP-typen zijn weer verdeeld in hoog en laagrisicofactoren voor kanker. De laag risicofactoren kunnen zorgen voor wratten en die noemen we lrHPV. De hoog risico HPV-typen, hr-HPV, brengen een hoog risico tot vorming van een kanker soort met zich mee. Meestal is dat Baarmoederhalskanker maar het kan ook een andere soort zijn. De typen 16 en 18 zijn erg agressief; samen zijn zij verantwoordelijk voor ongeveer 70% van de gevallen van het cervixcarcinoom. Niet in alle werelddelen is de verdeling hetzelfde. In Afrika komt het type 33 veel vaker voor dan op de rest van de wereld. Baarmoederhalskanker wordt veroorzaakt door een persisterende (aanhoudende) infectie met een hoog risico HPV (hrHPV). De ontwikkeling van baarmoederhalskanker duurt heel lang, zo’n tien tot twintig jaar. Als je al in een voorstadium afwijkende cellen en plekken ontdekt, kan je dat nog goed behandelen. Na een vervolg onderzoek door de gynaecoloog en onderzoek op het laboratorium is er een uitslag. Het cervixcarcinoom is vaak een ongunstige samenloop van omstandigheden van een lange aanhoudende periode van de infectie met een mucosaal hr-HPV.

A6. BAARMOEDERHALSKANKER EN HPV

57

Ki67 en p16INK4a De celcyclus wordt geregeld door eiwitten. Een belangrijk eiwit is het p16INK4a eiwit. Dit eiwit zorgt voor de overgang van de G1 -fase naar de S-fase tijdens de celcyclus. Bij veel tumorsoorten blijkt dit gen inactief te zijn. Bij baarmoederhalskanker is er juist een sterke overexpressie van het p16INK4a -eiwit. Dit komt doordat de oncogenen E6 en E7 binden aan het p53-eiwit en pRB. Hierdoor wordt de tumorsuppressie functie van deze eiwitten geblokkeerd. Het E7 eiwit bindt aan het pRB waardoor het pRB inactief wordt. Een actief pRB-eiwit zorgt ervoor dat de p16INK4a expressie normaal is maar omdat het pRB nu inactief is ontstaat er een overexpressie van p16INK4a . Alle HPV-infecties maken gebruik van dezelfde moleculaire mechanismen. Hierdoor is er bij elke besmetting met HPV een overexpressie van p16INK4a . Ki-67-antigeen is een kerneiwit. Ki-67 komt tot expressie in alle fasen van actief delende cellen. Ki-67-antistoffen worden gebruikt om de celgroei te bepalen. Dit gebeurt met immunohistochemische kwantificering, hierbij wordt het aantal Ki-67positieve cellen ten opzichte van het aantal rustende cellen berekend. Je krijgt dan een Ki-67-index. Wanneer een cel besmet is met HPV heeft het op het celmembraan en in de celkern p16-antigenen en in de celkern Ki-67-antigenen. Dit gaan we gebruiken bij de kleuring. Ons onderzoek Wij kregen beschikking over 16 paraffineblokjes, 6 met een diagnose ASCUS (atypical squamous cells of unknown significance), 6 met een diagnose CIN II en 4 met een diagnose CIN III. Van de paraffineblokjes die we hebben gekregen zijn glaasjes gemaakt. Van ieder blokje zijn er drie glaasjes. Een glaasje voor de negatieve controle, een glaasje waarop we met p16 gaan kleuren en een glaasje waarop we met Ki-67 gaan kleuren. Bij het kleuren wordt altijd gebruik gemaakt van een positieve en een negatieve controle. Dit is nodig zodat je kan controleren of alles goed is gegaan. Bij de kleuring spoelen we de glaasjes met een oplossing met primaire p16-antilichamen of primaire Ki-67-antilichamen. Deze antilichamen binden aan de specifieke antigenen in de cellen. Later spoelen we de glaasjes nog een keer met een antilichaam dat bindt aan het primair antilichaam. Dat tweede antilichaam zorgt uiteindelijk voor de bruine kleur. Het kleuren hebben we gedaan volgens het protocol Standard Sequenza Methode met powervision. Voordat we konden beginnen met het kleuren moesten we de glaasjes deparaffineren, omdat het weefsel in paraffineblokjes heeft gezeten zat er behalve weefsel ook paraffine op de glaasjes. De paraffine hebben we er afgehaald door de glaasjes met ultraclear te spoelen en daarna in oplossingen met een aflopend percentage alcohol van 100% t/m demiwater (gedestilleerd water) te dompelen. Hierna moesten we antigeen retrieval toepassen, de glaasjes werden gekookt om zo de antigenen te herstellen en de receptoren in hun oorspronkelijke vorm terug te

58

A. CAPITA SELECTA

ab

cd Fig. A6.4. p16 positieve weefselbrokken bij een CIN III.

brengen. Dit is nodig omdat p16 en Ki-67 anders niet kunnen binden. In weefsel zit ook altijd endogene peroxidase. Dat moet je blokkeren met waterstofperoxide anders krijg je een valse kleuring. Het p16-antigeen zit in de kern en in het cytoplasma. Het Ki-67-antigeen zit uitsluitend in de kern van de cellen. Bij die cellen kleurt daarom alleen de kern bruin. Onder de microscoop zoeken we naar epitheel dat bruin gekleurd is. Nadat we alle glaasjes hebben bekeken onder de microscoop gaan we ze bekijken met de Chromavision. De Chromavision is een microscoop aangesloten op de computer. De Chromavision scant de glaasjes en daarna kan je ze op het computerbeeldscherm bekijken. De computer is zo geprogrammeerd dat bruin wordt geselecteerd. Nadat de glaasjes waren gescand hebben we ze bekeken op het beeldscherm. Van de bruine epitheelbrokken die we op het scherm hebben geselecteerd berekent de computer het percentage bruin. Op ieder gemeten epitheelbrok heeft Dr. Mathilde Boon een diagnose gesteld: ASCUS, CIN II of CIN III. In Fig.A6.5 is te zien dat het percentage p16 en het percentage Ki-67 in de cellen niet parallel met elkaar lopen. Alleen bij de epitheelbrokken met de diagnose CIN III is dit wel het geval. Dat is ook wel logisch want bij de gevallen met CIN III is het HPV-virus al het langst aanwezig en zijn vooral de cellen het meest aangetast.

A6. BAARMOEDERHALSKANKER EN HPV Tabel A6.1. Chromavision-metingen van epitheelbrokken. Casus Percentage p16 Percentage Ki-67 7 50 74 7 80 38 21 71 59 21 28 1 26 100 99 29 98 8 29 93 32 38 24 44 38 16 37 39 1 60 39 8 29 40 76 44 40 9 10

59

Diagnose∗ CIN III CIN III ASCUS ASCUS CIN III CIN II CIN II ASCUS ASCUS CIN II CIN II ASCUS ASCUS

∗ De diagnose van de epitheelbrok is gesteld door Dr. Mathilde Boon.

Het epitheel is dus al een tijd in contact met het virus waardoor het langer de kans CIN III heeft gehad om zich ontwikCIN II ASCUS kelen tot een CIN III met on80 % geremde celdeling. Ook is er geen duidelijk verschil te zien 60 % in de grafiek tussen weefsel met een ASCUS-diagnose en weefsel met een CIN II-diagnose. 40 % Bij deze diagnoses is er een groot verschil tussen het per20 % centage p16 en het percentage Ki-67. Het is opvallend dat we twee ASCUS-brokken heb0% 0% 20 % 40 % 60 % 80 % 100 % ben opgespoord met een hoog percentage p16 (71% en 76%) Fig. A6.5. Grafiek van de gegevens in Tabel A6.1. in combinatie met een relatief hoog percentage Ki-67 (59% en 44%). Percentage p16 !x!as" versus percentage Ki!67 !y!as" 100 %

Nawoord Dankzij het LCPL (het Leids Cytologisch en Pathologisch Laboratorium) hebben wij, Anna van Boekel en Marleen de Vries, een heel interessant onderzoek kunnen doen. We hebben van het laboratorium een aantal patiënten gekregen waarvan de uitslagen al bekend waren. Wij mochten met dit patiëntenmateriaal nogmaals kijken

60

A. CAPITA SELECTA

wat de diagnoses waren voor deze mensen. We hebben zestien stukjes weefsel van zestien verschillende personen gekregen. Van dit weefsel hebben we coupes en vervolgens preparaten gemaakt. Het was een bijzondere ervaring waar we veel van geleerd hebben. Dit is niet iets wat iedereen kan doen. Alle materialen waren binnen handbereik. We mochten zelfs een aantal dagen weg van school blijven voor ons profielwerkstuk. Het was erg leuk. Deze dagen werd er van alles uitgelegd en hebben we veel geleerd. Natuurlijk hebben we ook veel dingen zelf gedaan. Na een korte uitleg konden we steeds zelf verder werken. Ook de Chromavision konden we zelfstandig gebruiken.

A7. CYTOHISTOLOGY AND BIOMARKERS

61

A7 A case of endometrial adenocarcinoma misinterpreted as of endocervical origin in a ThinPrep slide using cytohistology and biomarkers ∗ Nivea Meyer-Alcântara, Elle K.J. Risse, Elisabeth Ouwerkerk-Noordam, Mathilde E. Boon Objective To optimize the cytological diagnosis of liquid-based cervical cytology, we sometimes apply cytohistology. In this case of adenocarcinoma the residual material of the ThinPrep® (Hologic) specimen was used for additional cytohistology and immunohistochemistry. Material and Methods In 2007 a ThinPrep slide was prepared from a 90-year-old female with vaginal bleeding. Many thick cell groups in the slide arose suspicion of adenocarcinoma,1 but we could not indicate the primary origin. The vial still containing the brush (Cervex-Brush® Combi) was placed in a shaker for 10 minutes to dislodge the material between the bristles. The residual fluid was used to prepare paraffin sections (Shandon® ). From the block, 4 µm sections were cut and stained for Papanicolaou and biomarkers p16INK4a (HPV indication) and Ki-67 (proliferation marker). Results Based on the morphology of the tissue fragments and the positive staining results of the p16, the diagnosis was endocervical adenocarcinoma. In the hysterectomy specimen in the paraffin sections, a primary endometrial adenocarcinoma was found. Cytohistology shows p16 positivity. Research of the literature reveals positivity for p16 in some endometrial adenocarcinomas.2 Conclusion The residual of cervical ThinPrep specimen used for cytohistology can be helpful in cases with adenocarcinoma indicating primary origin. However, in this case of endometrial adenocarcinoma, we misinterpreted the presence of p16 positivity as indication for primary endocervical origin of the tumor. It is good to notice that in some cases of high-risk endometrial adenocarcinomas p16 positivity can be found too.3 References 1. Mazur M, Kurman RJ. Diagnosis of Endometrial Biopsies and Curettings: A Practical Approach. 2nd ed. pp 208-248, 2004. 2. Yemelyanova A, Vang R, Seidman JD, Gravitt PE, Ronnett BM. Am J Surg Pathol 2009;33:914-924. 3. Hamdan MH, Desiderio DM, Nibbering NM. Cancer Biomarkers: Analytical Techniques for Discovery. 1st ed. pp 1-20, 2007. ∗ Door N. Meyer-Alcântara gepresenteerd als poster op het 35th European Congress of Cytology, Lissabon, Portugal, 27-30 September 2009.

62

A. CAPITA SELECTA

Fig. A7.1. Cytology. ThinPrep. Thick Fig. A7.2. Cytohistology. Biomarker cell groups. p16INK4a positive in cytoplasm and in nuclei.

Fig. A7.3. Cytohistology. Biomarker Fig. A7.4. Cytohistology. Biomarker p16INK4a positive in cytoplasm and in Ki-67, positive in some nuclei. nuclei.

A8. LIQUID-BASED CYTOLOGY AND CYTOHISTOLOGY

63

A8 A case of adenocarcinoma in situ of the intestinal type diagnosed in liquid-based cervical cytology with the help of cytohistology ∗ Petra J.M. Pothuis-Adriolo, Elisabeth Ouwerkerk-Noordam, Elle K.J. Risse, Mathilde E. Boon Objective In our laboratory the Shandon Cytoblock® technique is used to optimize diagnoses in difficult cases. In this case of atypical glandular cells (AGC) we used the residual material of the ThinPrep® (Hologic) specimen for cytohistology and immunocytohistochemistry. Material and Methods In 2008 we received a ThinPrep slide of a 50-year-old woman without complaints. The liquid-based cervical cytology (LBC) specimen contained many thick cell groups, that were impossible to classify (Fig. A8.1). The vial still containing the brush (Cervex-Brush® Combi) was therefore placed in a shaker for 10 minutes to ∗ Door P.J.M. Pothuis-Adriolo gepresenteerd als poster op het 35th European Congress of Cytology, Lissabon, Portugal, 27-30 September 2009.

Fig. A8.1. ThinPrep slide. Papanicolaou Fig. A8.2. Cytohistology. Papanicolaou staining. Thick cell group, note undiag- staining. The acinar pattern and goblet nosable nuclei. cells are clearly visible.

64

Fig. A8.3. Cytohistology. Ki-67 immunostaining. The nuclei of the cancer cells show strong proliferative activity.

A. CAPITA SELECTA

Fig. A8.4. Cytohistology. p16INK4a immunostaining. The cytoplasm and some nuclei stain positive as indication for HPV infection of the cancer cells.

dislodge the material trapped between the bristles. The residual sample was used to prepare a paraffin block using the Shandon Cytoblock method. From the block 4 µm serial cytohistological sections were cut and stained with Papanicolaou and the biomarkers Ki-67 (proliferation marker) and p16INK4a (HPV indication). Results In the cytohistology sections we encountered numerous small tissue fragments with an acinar pattern covered with atypical glandular cells intermingled with many goblet cells (Fig. A8.2). The nuclei were elongated and hyperchromatic. Also mitoses were found. The case was signed out as adenocarcinoma in situ (AIS) of the intestinal type, with positive staining for Ki-67 and p16INK4a (Figs. A8.3 and A8.4). This diagnosis was confirmed by histology (cone biopsy, Figs. A8.5, A8.6 and A8.7). Conclusion Cytohistology and immunocytohistochemistry on the residual of cervical LBC specimens are very helpful in cases with thick cell groups. In this case of AIS of the intestinal type, where no feathering cell groups or rosettes were present in the ThinPrep slide, cytohistology could avoid a false-negative diagnosis. This is

A8. LIQUID-BASED CYTOLOGY AND CYTOHISTOLOGY

65

Fig. A8.5. Cervical cone biopsy HE. Adenocarcinoma in situ of intestinal type showing many goblet cells. Note that it is difficult to judge the nuclear atypia of the cancer cells at this magnification.

very important because the intestinal type of AIS is more likely to be associated with invasive adenocarcinoma than the usual type of AIS, 31% versus 17%.1 References 1. WG et al. Int J Gynecol Pathol. 2008;27:92-100.

66

Fig. A8.6. Cervical cone biopsy Alcian blue. Adenocarcinoma in situ of intestinal type showing cytoplasmatic mucus in the cancerous goblet cells.

A. CAPITA SELECTA

Fig. A8.7. Cervical cone biopsy PAS D. Adenocarcinoma in situ of intestinal type showing cytoplasmatic mucus in the cancerous goblet cells.

A9. SCREENING THINPREP

67

A9 The Japanese joy of screening ThinPrep slides in Holland∗ Shoko Chinomi, Nivea Meyer-Alcântara Objective My objective was to reflect on the factor joy in screening for a Japanese cytotechnologist, in a study comparing thin layer and conventional slides. Material and Methods Out of the LCPL archives, 10 ThinPrep® slides and 10 conventional slides were retrieved to access the similarities and differences between the two preparation methods. The focus was morphologic features as such taught by the Brazilian/Dutch cytotechnologist N. Meyer-Alcântara. Results For the thin layer slides, cell size, fixation, background features, uniformity of staining, clearness of nuclear and cytoplasmic detail were studied. For the conventional smear, cell size, fixation, smear pattern, and background features were analyzed.1 In the thin layer slides, fixation was superior but rounding up of the cells was more pronounced which might be a problem. However, in all cases there were more ∗ Door S. Chinomi gepresenteerd als poster op het 35th European Congress of Cytology, Lissabon, Portugal, 27-30 September 2009.

Fig. A9.1. ThinPrep, good fixation Fig. A9.2. Conventional smear, poor fix(1000×). ation (1000×).

68

Fig. A9.3. ThinPrep, (1000×).

A. CAPITA SELECTA

inflammation Fig. A9.4. Conventional smear, inflammation (1000×).

Fig. A9.5. ThinPrep, squamous cell car- Fig. A9.6. Conventional smear, squamous cell carcinoma (1000×). cinoma (1000×).

A9. SCREENING THINPREP

69

flattened cells that could be studied in detail. The background features differed in the conventional smears and the fixation was sometimes poor. Moreover, the cells were flatter and larger. Conclusion Cytology does not have to be relearned but it is important to understand the differences and similarities between thin layer and conventional methods.2 Finally, I have to mention that I learned to enjoy screening here in Holland, especially of the ThinPrep slides. Brazilian joy, as I have encountered in Holland, has proven to be very important for me. References 1. Boon ME, Suurmeijer AJH. The Pap Smear. 3rd ed. Harwood Academic Publishers, 1996. 2. Hologic. The ThinPrep® Pap Test. www.hologic.com.

70

A. CAPITA SELECTA

A10 A case of clear cell adenocarcinoma of the cervix, diagnosed on paraffin sections from residual material of liquid-based cervical cytology∗ Yvonne Verdijk, Elle K.J. Risse, Elisabeth Ouwerkerk-Noordam, Mathilde E. Boon Objective In cases with difficulties in interpretation of thick cell groups in ThinPrep® (Hologic) slides of cervical cytology specimens the Shandon Cytoblock® technique is used in our laboratory. Also in this case the residual material of the sample was used for cytohistology and immunocytohistochemistry. Material and Methods n 2007 we received liquid-based cervical cytology (LBC) from a 38-year-old woman with vaginal discharge. In the thin layer specimen many thick cell groups were encountered (Fig. A10.1). The vial still containing the brush (Cervex-Brush® Combi, Rovers, The Netherlands) was therefore placed in a shaker for 10 minutes ∗ Door Y. Verdijk gepresenteerd als poster op het 35th European Congress of Cytology, Lissabon, Portugal, 27-30 September 2009.

Fig. A10.1. ThinPrep slide, thick cell Fig. A10.2. Cytohistology, solid partigroup. Note blurred, undiagnosable nu- cle of atypical cells with remarkable clei. Papanicolaou stain (1000×). clear cytoplasm. Cytoblock Papanicolaou stain (400×).

A10. RESIDUAL MATERIAL LIQUID-BASED CERVICAL CYTOLOGY

71

Fig. A10.3. Cytohistology, strong pos- Fig. A10.4. Cytohistology, strong positivity for Ki-67 proliferation marker itivity in nuclei and cytoplasm for p16INK4a immunostaining (HPV indica(1000×). tion) (1000×).

Fig. A10.5. Cytohistology strong positivity in the nuclei for CEA immunostaining, as indicator of cervical origin (1000×).

Fig. A10.6. Abdominal hysterectomy specimen with a clear cell adenocarcinoma (solid pattern) of the cervix (H&E, 400×).

72

A. CAPITA SELECTA

to dislodge the material trapped between the bristles. The residual sampling fluid was used to prepare paraffin sections (Shandon Cytoblock® ). Several serial 4 µm sections were cut and stained for Papanicolaou and the biomarkers p16INK4a and Ki-67. Also CEA immunostaining and mucin stains PAS, PAS-D, and Alcian blue were applied. Results There were solid particles of atypical cells with remarkable clear cytoplasm in the sections of the paraffin cytoblock (Fig. A10.2). The nuclei of these cells stained strong positive for Ki-67 (proliferation) marker (Fig. A10.3) and the nuclei and cytoplasm were strong positive for immunostaining with p16INK4a (HPV indication) (Fig. A10.4). Also the CEA immunostaining was positive in the nuclei (Fig. A10.5). PAS-D and Alcian blue staining showed no mucin in the cytoplasm. A radical abdominal hysterectomy and pelvic lymphadenectomy were performed. The tumor was 6 cm in diameter and 12 mm deep infiltrative and was radically operated without lymphnode metastases. There was no maternal exposure to diethylstilbestrol (DES). Histologically a clear cell adenocarcinoma (solid pattern) of the cervix was found (Fig. A10.6). Conclusion Cytohistology in combination with (immuno)cytohistochemistry is useful in cases with thick cell groups in cervical cytology that are difficult to interpret. In this case we could suggest a diagnosis of clear cell adenocarcinoma, a rare (5%) type of cervical adenocarcinoma, not always related to DES but sometimes a result of genetic or exogenous risk factors other than DES.1 References 1. Seki et al. Int J Clin Oncol. 2003;8:399-404.

A11. COMPUTER-ASSISTED SCREENING

73

A11 Switching from neural networks (NNS) to the Imager (Hologic) for computer-assisted screening ∗ Elisabeth M. Meijer-Marres, Mathilde E. Boon Objective Computer-assisted screening (CAS) fully profits from the skills of the cytotechnologists, because they can focus and spend ample time in judging the few microscopic fields selected by the computer. We compared the effects on the cytoscores for computer-assisted screening when our large throughput laboratory switched from neural network scanning (NNS) to the Imager (Hologic). Material and Methods From July 2006-June 2007, 57,913 ThinPrep® slides were scanned via neural networks and from July 2007-June 2008, 64,651 ThinPrep® slides were scanned with the Imager. 99,705 cases concerned population screening of asymptomatic women (screenees), the remainder (22,859) consisted of indication cases. Results As you can see in Table A11.1 and A11.2 the positive cytoscores for ≥ CIN III were for NNS 0.28% and 0.61%, for the Imager 0.44% and 0.87% with higher values in the screenees than in the indication cases. The same trends were observed for the milder lesions and for the cytoscores for the infections. Conclusion The highest positive scores were realized for the combination indication cytology and Imager scanning. The switch to the Imager has enhanced our diagnostic acumen over the full range of cytology in our practice of computer-assisted screening.

∗ Door E.M. Meijer-Marres gepresenteerd als poster op het 35th European Congress of Cytology, Lissabon, Portugal, 27-30 September 2009.

Tabel A11.1. Cytoscores population screening: NNS versus Imager. Diagnosis NNS Imager n % n Inadequate 280 0.58 268 Normal 46,627 96.66 49,310 ASC-US 852 1.77 1,138 CIN I-II 344 0.71 526 ≥CIN III 135 0.28 225 Total 48,238 100.00 51,467

% 0.52 95.81 2.21 1.02 0.44 100.00

74

A. CAPITA SELECTA

Tabel A11.2. Cytoscores indication cases: NNS versus Imager. Diagnose NNS Imager n % n Inadequate 92 0.95 110 Normal 8,846 91.43 11,880 ASC-US 389 4.02 643 CIN I-II 289 2.99 436 ≥CIN III 59 0.61 115 Total 9,675 100.00 13,184

% 0.83 90.11 4.88 3.31 0.87 100.00

Fig. A11.1. NNS summary screen of a CIN III smear. In the nine selected tiles a few single cancer cells and many cancer fragments with large hyperchromatic nuclei. The CT can make the diagnosis CIN III with ease without looking through the microscope.

A11. COMPUTER-ASSISTED SCREENING

Fig. A11.2. Candida albicans in the field of view (FOV) selected by the Imager. Note large normochromatic nuclei. This FOV can be evaluated by the CT microscopically an in this case Full Rescreen is not necessary.

75

Fig. A11.3. CIN III in the field of view (FOV) selected by the Imager. Note large hyperchromatic nuclei. This FOV can be evaluated by the CT lightmicroscopically but in this case Full Rescreen is recommended.

76

A. CAPITA SELECTA

A12 Experience and personality play a key role in computer-assisted screening ∗ Elisabeth Ouwerkerk-Noordam, Mathilde E. Boon, MD, Elle K.J. Risse Objective In the Leiden Cytology and Pathology Laboratory (LCPL) we evaluated the consultation cases for computer-assisted screening during 2007, the year that the LCPL switched from screening with neural network scanning (NNS) to Imager-assisted screening (IAS), and assessed the learning period of working with the Imager by the cytotechnologists. Material and Methods In 2007 the LCPL diagnosed almost 70,000 ThinPrep slides, of which 47,873 were thoroughly evaluated for this study. Six cytotechnologists were involved ∗ Door E. Ouwerkerk-Noordam gepresenteerd als poster op het 35th European Congress of Cytology, Lissabon, Portugal, 27-30 September 2009.

Fig. A12.1. The NNS scanners needed for screening 70,000 slides per year. The technology dating back from the eighties requires a lot of space and air conditioning in any climate.

A12. COMPUTER-ASSISTED SCREENING

77

Fig. A12.2. The Imager needed for screening 70,000 slides per year. The technology of this century requires only little space and no air conditioning in the Dutch climate.

in the screening, 3 junior cytotechnologists (CT1, CT2 and CT3) and 3 senior cytotechnologists (CT4, CT5, CT6). The 47,873 slides were screened, 23,007

8% 6% 4% 2% 0% CT 1

CT 2

CT 3

CT 4

CT 5

CT 6

Fig. A12.3. Percentage consultation cases per cytotechnologist, divided into NNS (gray bars) and Imager-assisted screening (IAS, red bars).

78

A. CAPITA SELECTA

80% 60% 40% 20% 0% CT 1

CT 2

CT 3

CT 4

CT 5

CT 6

Fig. A12.4. Final diagnoses of consultation cases per cytotechnologist (CT) in %, divided into normal and minor diagnoses (green: WNL, ASCUS, and LSIL) and major diagnoses (pink: ≥ HSIL) for NNS (darker colors) and IAS (lighter colors).

using NNS (see Fig. A12.1). July the first, the laboratory switched to IAS and an additional 24,866 slides were screened via the Imager (see Fig. A12.2). With IAS the system scans the slides and the coordinates of 22 fields worthwhile looking at are sent to the microscope. The cytotechnologist has to look at these 22 fields and can give a diagnosis on these fields or can fully rescreen the slide. A CT can decide to consult a case. The consultations for CT1, 2, and 3 were performed by CT4, 5, and 6. The consultations for CT4, 5, and 6 were performed by the pathologist. Accordingly, CT4, 5 and 6 screen slides and perform consultations. The final diagnosis of the consultation cases were tabulated for all 6 CTs. For all cytotechnologists the percentages of fully rescreened (FR) slides at the Imager for July and December 2007 were compared. Results Although the percentage of consultation cases varied for each screener individually, junior cytotechnologists (CT 1-3) had considerable more consultations than senior cytotechnologists (CT 4-6). This was true for the NNS period as well as for Imagerassisted screening (Fig. A12.1). The cases selected for consultation by the junior cytotechnologists (CT 1-3) concerned mainly slides signed out as no abnormalities (NILM), ASCUS, or mild dysplasia. The consultations of the senior cytotechnologists consisted mostly of ≥ Tabel A12.1. Consultation flow. First screening Consultant CT 123 CT 456 CT 456 pathologist

Final diagnosis pathologist pathologist

A12. COMPUTER-ASSISTED SCREENING

79

12% 10% 8% 6% 4% 2% 0% CT 1

CT 2

CT 3

CT 4

CT 5

CT 6

Fig. A12.5. Learning to trust the 22 FOV selected by the Imager: Percentage Full Rescreen of IAS per cytotechnologist. July 2007 (gray bars) and December 2007 (red bars).

CIN II cases. The diagnoses of the consultations for each CT individual did not differ significantly after the CT switched from NNS to IAS. Junior cytotechnologists were more insecure than senior cytotechnologists which is probably a matter of experience (Fig. A12.2). Fig. A12.3 shows the effect of learning to work with the Imager. There were no striking differences between NNS and IAS with only CT3 with clearly less consultations. CT4, CT5, and CT6 screened only a small number of slides, thus here the changes are virtually meaningless. At the start (in July) there is a considerable variation in percentage FR of Imager slides per cytotechnologist (3-12.5%). Interestingly enough the variation is still present after 6 months in December (1-8%), but for each cytotechnologist this percentage decreased, CT5 being the best learner. Conclusions For IAS we see slow and fast learners. The personality of the CT is visible in the percentage fully rescreened slides and in the final diagnosis of the consultation cases.

80

B. EVALUATIE VAN HET INGESTUURDE MATERIAAL

B. Evaluatie diagnostiek 2008 M.E. Boon, S. Beck, R.P. Dutrieux, H. Korporaal, E.M. Meijer-Marres

Inleiding In het B-gedeelte van het jaarverslag rapporteren wij onze diagnostische resultaten. Wij beginnen met de cervixcytologie. In 2008 werden op het LCPL 66.664 cervixuitstrijkjes beoordeeld, waarover wij nader rapporteren in sectie B1 tot en met B4. In sectie B5 worden de resultaten van de histodiagnostiek besproken en in sectie B6 werpen we een blik op onze diagnostiek van seksueel overdraagbare aandoeningen (SOA).

B1 Cervixuitstrijkjes zijn cervixmonsters Totaal aantal uitstrijkjes 66.664 In 2008 werden er vrijwel geen glaasjes (uitstrijkjes) meer ingestuurd, maar ontvingen wij potjes met een borsteltje erin. We gebruiken hiervoor de term ‘monster’,

70.000 60.000 50.000 40.000 30.000 20.000

Totaal B.O. N.B.O.

10.000 0

92 93 94 95 96 97 98 99 00 01 02 03 04 05 06 07 08

Fig. B1.1. Aantallen cervixmonsters per jaar in de jaren 1992 tot en met 2008, voor de categorieën N.B.O, B.O. en Totaal.

B1. CERVIXUITSTRIJKJES

81

Tabel B1.1. Cytoscores bevolkingsonderzoek (B.O.) en indicatiecytologie (niet-bevolkingsonderzoek, N.B.O.) in 2008 berekend in promillages. Pap-klasse 0 II IIIA IIIB IV V n B.O. n 240 1.165 544 128 55 16 52.910 B.O. h 4,54 22,02 10,28 2,42 1,04 0,30 N.B.O. n 93 759 486 86 27 7 13.754 N.B.O. h 6,76 55,18 35,34 6,25 1,96 0,51 Totaal n 333 1.924 1.030 214 82 23 66.664 Totaal h 5,00 28,86 15,45 3,21 1,23 0,35 cervixuitstrijkjes zijn cervixmonsters geworden. Van de 66.664 cervixmonsters die wij ter beoordeling ontvingen uit de eerstelijn, werden er 13.754 (21%) ingezonden op basis van medische indicatie (= niet bevolkingsonderzoek = N.B.O.). De overige 52.910 (79%) zijn afkomstig uit het bevolkingsonderzoek (B.O.). Fig. B1.1 toont de aantallen inzendingen per jaar gedurende een periode van 17 jaar. Sinds 2006 is het aantal uitstrijkjes hoger dan het topjaar 1996, toen de impact van de daling van het N.B.O. nog niet zo voelbaar was, terwijl juist in dat jaar veel vrouwen een uitnodiging kregen via het nieuwe bevolkingsonderzoek. In 1992, toen het huisartsenbevolkingsonderzoek in Nederland van start ging, waren de B.O.-inzendingen in het LCPL nog in de minderheid, met een percentage van 33%. We zien een voortschrijdende verschuiving naar B.O.-inzendingen: in 1996 was het percentage opgelopen tot 66% en in 2002 zelfs tot 80%. Sinds dat jaar zien we een duidelijke toename van het aantal B.O.-inzendingen. In Tabel B1.1 zijn de cytoscores in promillages weergegeven per type onderzoek Tabel B1.2. Cytoscores voor Pap-klasse 0, II, IIIA en IIIB naar leeftijd (alle inzendingen 2008), berekend in promillages. Pap-klasse Leeftijd 0 II IIIA IIIB (jr) h h h h ≤ 30 5,75 58,66 36,07 4,76 30-34 3,06 37,54 24,57 6,22 35-39 5,47 34,96 20,06 5,62 40-44 5,50 30,36 15,85 3,33 45-49 5,51 28,82 12,00 2,56 50-54 4,92 22,46 8,11 1,33 55-59 5,36 11,05 4,71 0,98 ≥ 60 4,31 9,43 5,33 0,41 h van totaal 5,00 28,86 15,45 3,21

82

B. EVALUATIE VAN HET INGESTUURDE MATERIAAL

(B.O. versus N.B.O.). Het totaal aantal niet te beoordelen (Pap-klasse 0) is sinds 1996 aanzienlijk afgenomen, te weten van 1.340 (20,29h) in 1996 tot 333 (5,00h) in 2008. Vooral na 2003, toen wij begonnen met de dunnelaagcytologie, zien we een toenemende daling. De dalende trend voor Pap-klasse 0 stokte in 2005. Voor de Pap-klasse 0 geldt dat er geen duidelijk verband is met de leeftijd (Tabel B1.2). Er waren in totaal 333 glaasjes die niet te beoordelen waren, 93 in het N.B.O. (0,68%) en 240 in het B.O. (0,45%). Tabel B1.2 geeft de cytoscores van de Papklassen per leeftijdscategorie. Voor Papklasse II, IIIA en IIIB worden deze verdelingen grafisch weergegeven in Fig. B1.2. Daar tonen we ook de lijnen van het voorgaande jaar, 2007. De grafieken vertonen opvallend veel overeenkomst, hoe jonger, hoe meer pathologie, en met name hoge cytoscores voor Pap-klasse II en IIIA op jonge leeftijd. Hierna nog meer over de cytoscores.

B2 Cytoscores

Pap II 2007 Pap IIIA ! Pap IIIB

60‰ 50‰ 40‰ 30‰ 20‰ 10‰ 0‰

30

35

40

45

50

55

60 jr

Pap II 2008 Pap IIIA ! Pap IIIB

60‰ 50‰ 40‰ 30‰ 20‰ 10‰ 0‰

30

35

40

45

50

55

60 jr

De cytoscores worden door ons uitgedrukt in Fig. B1.2. Cytoscores (berekend in promillages) voor Pap– promillages, te weten klasse II, IIIA en ≥ IIIB per leeftijdscategorie voor het jaar het aantal over 1.000 2007 (boven) en het jaar 2008 (onder). uitstrijkjes. Sinds de invoering van het nieuwe huisartsen-B.O. in 1996 streven wij ernaar het promillage ‘grijze uitslagen’ (Pap-klasse II en Pap-klasse IIIA) tot een verantwoord minimum te beperken. De gevolgen van die diagnostische aanpak zien we terug in Tabel B1.1. Hierin valt op dat zowel in het B.O. als in het N.B.O. de cytoscores van Pap-klasse II en Pap-klasse IIIA nog steeds laag zijn.

B2. CYTOSCORES

83

Over de Pap-klasse II cytoscores merken we op dat daar weder15‰ om een duidelijke leeftijdsgradiënt aanwezig is, met de hoogste cy10‰ toscore voor de jongere vrouwen (58,66h 5‰ bij ≤ 30 jaar) en de laagste cytoscore 0‰ voor de oudere vrou30 35 40 45 50 55 60 jr wen (9,43h bij ≥ 60 jaar). Ook voor 20‰ N.B.O. 2008 de Pap-klasse IIIA is B.O. er een duidelijke leeftotaal 15‰ tijdsgradiënt, met een waarde van 36,07h voor de jongere vrou10‰ wen (≤ 30 jaar) en een waarde van 5,33h 5‰ voor de oudere vrouwen (≥ 60 jaar). In 0‰ Fig. B1.2 zien we dat 30 35 40 45 50 55 60 jr de scores van zowel Pap II als van Pap IIIA Fig. B2.1. Cytoscores per leeftijdscategorie voor Pap-klasin 2007 lager waren. se ≥ IIIB, berekend in promillages, N.B.O. en B.O. voor de jaren 2007 (boven) en 2008 (onder). N.B.O. 2007 B.O. totaal

20‰

Tabel B2.1. Cytoscores ernstige cytologische afwijkingen (Pap-klasse ≥ IIIB) in niet-bevolkingsonderzoek (N.B.O.) en bevolkingsonderzoek (B.O.) per leeftijdscategorie, berekend in promillages. Leeftijd (jr) < 30 30-34 35-39 40-44 45-49 50-54 55-59 ≥ 60 Totaal

N 2.675 1.714 2.175 2.094 1.848 1.303 830 1.115 13.754

N.B.O. n 12 32 24 27 13 4 6 3 121

h 4,49 18,67 11,03 12,89 7,03 3,07 7,23 2,69 8,80

N − 10.141 7.149 9.007 8.320 6.223 8.308 3.762 52.910

B.O. n − 76 38 31 25 13 7 2 192

h − 7,49 5,32 3,44 3,00 2,09 0,84 0,53 3,63

N.B.O. + B.O. N n 2.675 12 11.855 108 9.324 62 11.101 58 10.168 38 7.526 17 9.138 13 4.877 5 66.664 313

N is het aantal gemaakte uitstrijkjes, n is het aantal afwijkende uitstrijkjes Pap-klasse ≥ IIIB.

h 4,49 9,11 6,65 5,22 3,74 2,26 1,42 1,03 4,70

84

B. EVALUATIE VAN HET INGESTUURDE MATERIAAL

In Tabellen B1.2 en B2.1 zijn de cytoscores gestratificeerd naar leeftijdsgroepen van 5 jaar. In Tabel B1.2 worden de cytoscores van de Pap-klassen gepresenteerd. We zien dat er een leeftijdsgradiënt is voor Pap-klasse II, IIIA en IIIB. Hoge waarden voor vrouwen < 30 jaar, lage waarden voor ≥ 60 jaar. Als gevolg van externe en interne maatregelen zien we dat het percentage ‘gezonde vrouwen’ (vrouwen met uitstrijkjes waarop wij menen te kunnen zeggen dat er geen afwijkingen zijn) dit jaar weer zeer hoog is. In ongeveer 10% van de gevallen wordt het preparaat tweemaal bekeken voor de diagnose ‘gezond’. In dit verband wijzen we erop dat een negatief uitstrijkje ook niet alles zegt. Wij hebben ervaren dat het kan voorkomen dat een vrouw verschillende negatieve uitstrijkjes heeft maar, als ze zich wegens klachten laat biopteren, toch een cervixcarcinoom onder de leden blijkt te hebben. Het blijft belangrijk om klachten niet onder het tapijt te schuiven. Vervolgens kijken we naar de cytoscores van de ernstige cytologische afwijkingen, te weten Pap-klasse IIIB en hoger (zie Tabel B2.1). In 2008 zien we wederom veel N.B.O.-vrouwen (indicatiecytologie) met ernstige cytologische afwijkingen, 8,80h versus 8,30h in 2007. Bij de B.O.-vrouwen zien we minder hoge promillages, namelijk 3,63h in 2008 versus 3,82h in 2007. In 1997 was dat promillage voor het B.O.-cohort slechts 1,80h en voor het N.B.O.-cohort 4,19h. In Fig. B2.1 zien we de cytoscores ernstige cytologische afwijkingen (Pap-klasse IIIB en hoger) voor N.B.O. en B.O. Voor alle leeftijdsgroepen zijn de positieve scores in het N.B.O. hoger dan in het B.O..

B3 Histoscores De histologische diagnoses komen boven water via de PALGA, het pathologisch anatomisch landelijk geautomatiseerd archief. De histoscores worden door ons uitgedrukt in promillages, over 1.000 uitstrijkjes. De histologische onderzoeken vonden in het ziekenhuis (tweedelijn) plaats. Van 3.273 vrouwen werd door ons het cytologische en histologische vervolgonderzoek nagetrokken. In Tabel B3.1 zien we dat hoe hoger de Pap-klasse, hoe meer histologische follow-up. Volgens de NVVP-richtlijnen dienen wij in ons jaarverslag een tabel op te nemen waarin alle follow-up (FU) van de KOPAC P4, ≥ P5, C3-5, ≥ C6 en ≥ A4 Tabel B3.1. Vervolgonderzoek van 3.273 vrouwen gestratificeerd naar Pap-klasse. Pap-klasse II IIIA IIIB IV V Aantal uitstrijken (n) 1.924 1.030 214 82 23 Geen follow-up bekend 27,3% 9,7% 1,4% 2,4% 4,3% Cytologische follow-up 64,1% 47,0% 4,7% 1,2% 4,3% Histologische follow-up 8,6% 43,3% 93,9% 96,3% 91,3%

B3. HISTOSCORES

85

Tabel B3.2. Alle follow-up B.O. en N.B.O., vervolgonderzoek gestratificeerd naar KOPAC P, KOPAC C en KOPAC A. Aantal

FU Cytol. FU Histologische FU FU onbe- nor- Pap CIN Glan. AIS Plav. Adeno Endom. Maligne tot. kend maal >I 0 I II III atypie ca. ca. ca. anders∗ P0 172 66 102 2 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 172 P2-3 1.709 476 829 248 74 48 20 12 0 0 0 0 2 0 1.709 P4 731 78 208 215 43 74 58 54 0 1 0 0 0 0 731 ≥P5 572 23 6 44 17 49 86 312 0 6 23 3 1 2 572 C3-5 333 66 198 37 16 6 4 5 0 0 1 0 0 0 333 ≥C6 20 0 0 1 0 2 1 4 1 4 0 7 0 0 20 ≥A4 5 0 2 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 5 Tot. 3.370 643 1.243 546 150 180 169 387 1 11 25 10 3 3 3.371 ∗ Hierbij gaat het om 1 adenosquameus carcinoom, 1 mixed mullerian tumor en 1 adenocarcionoom met origine onbekend.

is verwerkt. Ook opgenomen zijn: follow-up onbekend, cytologische follow-up en negatieve histologie (CIN 0), welke we voornamelijk vonden in de P4 groep. Interessant zijn ook de P (plaveisel) en C (adeno) coderingen: de overeenkomst tussen cytologie adenocarcinoma in situ en histologie is, wat betreft P en C, verre van 100%. In deze tabel zijn ook de histologische diagnoses CIN I (n = 180) en CIN II (n = 169) verwerkt. Bij de Pap-klasse IIIB wordt er meestal meteen een biopt genomen door de vrouwenarts (histologische follow-up), maar in een klein aantal gevallen wordt volstaan met een cytologische follow-up. In 2008 was het percentage Pap-klasse IIIB met uitsluitend een cytologische follow-up 4,7% (in 2007: 2,3%). Uit de gegevens van Tabel B3.3 en Tabel B3.4 kunnen we de histoscores berekenen. In deze tabellen hebben wij de 180 CIN I en 169 CIN II diagnoses niet opgenomen. Deze worden gepresenteerd in de rest van deze sectie. Histoscores bevolkingsonderzoek, B.O. In het B.O. zien we de hoogste histoscores voor CIN III, met 4,63h (Tabel B3.3). Net als voorgaande jaren zien we wederom opvallend veel pathologie in de jongste leeftijdsgroep (jonger dan 35 jaar): met een histoscore van 10,26h voor CIN III (5,40 in 2007). In 1997 was de histoscore CIN III voor de jonge vrouwen veel lager, en wel slechts 2,50h. In 2008 zagen we in het B.O. 16 plaveiselcelcarcinomen met een histoscore van 0,30h, 5 adenocarcinomen van de endocervix met een histoscore van 0,09h en 1 adenocarcinoom van het endometrium met een histoscore van 0,02h (zie Tabel B3.3). Ten opzichte van 2007 zien we een duidelijke toename van de histoscores ernstige pathologie in het B.O., van 4,68h naar 5,14h. Histoscores niet-bevolkingsonderzoek, N.B.O. Ook in het N.B.O. zijn de histoscores het hoogst voor CIN III, met maar liefst 12,80h. Voor de groep 15-34 jaar is deze 18,91h en voor 35-54 jaar 11,86h

86

B. EVALUATIE VAN HET INGESTUURDE MATERIAAL

Tabel B3.3. B.O. - aantallen histologische diagnoses en histoscores (in promillages) ‘ernstige pathologie’, gestratificeerd in drie leeftijdsgroepen. 30-34 jaar 35-54 jaar ≥ 55 jaar Totaal n h n h n h n h 10.141 30.699 12.070 52.910 CIN III 104 10,26 132 4,30 9 0,75 245 4,63 Adeno-c.i.s. (AIS) 2 0,20 3 0,10 0 − 5 0,09 Plaveiselcelcarc. 5 0,49 9 0,29 2 0,17 16 0,30 Endoc. adenocarc. 2 0,20 1 0,03 1 0,08 5 0,09 Endom. adenocarc. 0 − 0 − 1 0,08 1 0,02 Adenosquameus carc. 0 − 0 − 0 − 0 − Totaal B.O. 113 11,14 145 4,72 13 1,08 272 5,14 Tabel B3.4. N.B.O. - aantallen histologische diagnoses en histoscores (in promillages) ‘ernstige pathologie’, gestratificeerd in drie leeftijdsgroepen. 15-34 jaar 35-54 jaar ≥ 55 jaar Totaal n h n h n h n h 4.389 7.420 1.945 13.754 CIN III 83 18,91 88 11,86 5 2,57 176 12,80 Adeno-c.i.s. (AIS) 2 0,46 3 0,40 0 − 5 0,36 Plaveiselcelcarc. 2 0,46 5 0,67 2 1,03 9 0,65 Endoc. adenocarc. 1 0,23 2 0,27 0 − 3 0,22 Endom. adenocarc. 0 − 0 − 2 1,03 2 0,15 Adenosquameus carc. 0 − 1 0,13 0 − 1 0,07 Adenocarc. origine onbekend 0 − 1 0,13 0 − 1 0,07 Mixed mullerian tumor 0 − 0 − 1 0,51 1 5,68 Totaal N.B.O. 88 20,05 100 13,48 10 5,14 198 14,40

(zie Tabel B3.4). In 1997 was de histoscore voor het N.B.O.-cohort 15-34 jaar veel lager, met een promillage van slechts 6,54h. In 2008 zagen we in het N.B.O. 9 plaveiselcelcarcinomen, met een histoscore van 0,65h (zie Tabel B3.4). Ook vonden we 3 adenocarcinomen van de endocervix (histoscore 0,22h), 2 adenocarcinomen van het endometrium (histoscore 0,15h), 1 adenosquameus carcinoom (histoscore 0,07h), 1 adenocarcinoom waarvan origine onbekend (histoscore 0,07h) en 1 mixed mullerian tumor (histoscore 0,51h). Wederom zijn de histoscores bij het N.B.O. veel hoger dan bij het B.O., voor alle diagnoses. Ook voor het N.B.O. zien we een toename van de histoscore ernstige pathologie, van 13,73h in 2007 naar 14,40h in 2008.

B4. ONTSTEKINGEN

87

Tabel B3.5. FIGO-stadium van 24 van de 25∗ plaveiselcelcarcinomen van de cervix die in 2008 werden opgespoord. FIGO-stadium IA IB > IB Totaal B.O. 10 4 1 15 N.B.O. 3 6 0 9 Totaal 13 10 1 24 ∗ In deze tabel ontbreekt 1 plaveiselcelcarcinoom omdat patiënte is verhuisd naar en behandeld in Turkije.

Plaveiselcelcarcinomen van de cervix Net als voorgaande jaren besteden we dit jaar extra aandacht aan de plaveiselcelcarcinomen die wij opspoorden: het betreft dit jaar 25 casussen, 16 uit het B.O. en 9 uit het N.B.O. Het klinisch stadium van het plaveiselcelcarcinoom van deze 25 vrouwen zijn wij nagegaan: de gegevens zijn verzameld in Tabel B3.5. In deze tabel ontbreekt 1 plaveiselcelcarcinoom, omdat patiënte is verhuisd naar en behandeld in Turkije. Net als in 2007 was er dit jaar slechts 1 diep-invasief carcinoom (FIGO ≥ IB). Er waren 13 vrouwen met een (vroeg) FIGO-stadium, te weten stadium IA, waarvan 10 in het B.O. Adenocarcinomen In 2008 werden er 8 adenocarcinomen van de endocervix gediagnosticeerd, waarvan 5 in het B.O. In het N.B.O. werden er 2 endometriumcarcinomen, 1 squameus carcinoom en 1 carcinoom waarvan origine onbekend gediagnosticeerd. In het B.O. vonden wij 1 endometriumcarcinoom.

B4 Ontstekingen: de KOPAC O Volgens de NVVP-richtlijnen moeten in een jaarverslag ook de scores van de ontstekingen (O-codes van de KOPAC) worden verwerkt. Voor O1 (koilocytose), O2 (Trichomonas), O3 (dysbacteriosis), O4 (Candida), O5 (Gardnerella), O7 (Actinomyces) en O9 (ontsteking) zien we hogere scores in het N.B.O. dan in het B.O. (zie Tabel B4.1). Met name is de cytoscore voor koilocytose veel hoger in het N.B.O. dan in het B.O., 17,8h versus 5,4h. De verschillen zien we gevisualiseerd in Fig. B4.1. Steeds zijn de rode staven (N.B.O.) langer dan de groene (B.O.). Behalve voor Actinomyces zijn de O-cytoscores (zowel voor B.O. als voor N.B.O.) in 2008 hoger dan in 2007, met voor koilocytose een stijging van 5,0h naar 8,0h en voor dysbacteriosis van 41,1h naar 51,8h. Voor Gardnerella zien we een opvallende toename van 1,3h naar 13,2h! Kortom, voor de O-codes die te maken hebben met cervicale carcinogenese, te weten O1 (koilocytose), O3 (dysbacteriosis) en O5 (Gardnerella) is de cytodiagnostiek van het LCPL duidelijk verschoven.

88

B. EVALUATIE VAN HET INGESTUURDE MATERIAAL

Tabel B4.1. Ontstekingen 2008 in aantallen en promillages. ‘O’ van de KOPAC: B.O. N.B.O. nr: Uitleg n h n h 0 Niet te beoordelen 240 4,5 93 6,8 1 Virus (koilocytose) 287 5,4 245 17,8 2 Trichomonas 79 1,5 35 2,5 3 Bacteriën (dysbacteriosis) 2.506 47,4 947 68,8 4 Candida 1.232 23,3 490 35,6 5 Gardnerella 587 11,1 295 21,4 6 Normaal beeld 40.850 772,2 9.289 675,0 7 Actinomyces 315 6,0 124 9,0 8 Chlamydia 4 0,1 4 0,3 9 Ontsteking 6.803 128,6 2.239 162,7 Totaal 52.903 1.000 13.761 1.000

B.O. + N.B.O. n h 332 5,0 532 8,0 114 1,7 3.453 51,8 1.722 25,8 882 13,2 50.138 752,1 439 6,6 8 0,1 9.042 135,6 66.664 1.000

Tabel B4.2. Vijftien vrouwen met een afwijkende vaginale flora. n Gem. leeftijd Dysbacteriosis 4 32 Gardnerella 3 24 Schimmel 8 31 Totaal 15

Gem. pH 6,8 7,2 4,9

Gardnerella Trichomonas Actinomyces Candida Koilocytose Dysbacteriosis 2007!LCPL Fig. B4.1. Promillages van de N.B.O.Gardnerella uitstrijkjes (in rood) Trichomonas en B.O.-uitstrijkjes (in Actinomyces groen) waarin de aanCandida gegeven infectie wordt Koilocytose gediagnosticeerd in 2007 (boven) en 2008 Dysbacteriosis (onder). 2008!LCPL

20‰

40‰

60‰

20‰

40‰

60‰

B5. HISTOLOGIE EN NIET-GYNAECOLOGISCHE CYTOLOGIE

89

Fig. B4.2-5. Schimmel met ontsteking in de eerste drie beelden. Schimmel zonder ontsteking in het vierde beeld (Fig. B4.5). PAS-kleuring.

Fig. B4.6 en Fig. B4.7. Blue mountain cells van een Papanicolaou-gekleurd preparaat met de diagnose Gardnerella.

B5 Histologie en niet-gynaecologische cytologie Inleiding Het totaal aantal onderzoeken met een T-nummer (histologie en niet-gynaecologische cytologie) is in dit verslagjaar 2008 uitgekomen op 19.755. Daarvan zijn 15.337 onderzoeken ingezonden door huisartsen.

90

B. EVALUATIE VAN HET INGESTUURDE MATERIAAL

Materiaal ingezonden door huisartsen Het totaal aantal door huisartsen ingezonden onderzoeken met een T-nummer (histologie en niet-gynaecologische cytologie) is in dit verslagjaar 2008 uitgekomen op 15.337. In Tabel B5.1 zijn de 15.337 door huisartsen ingezonden T-nummers opgenomen die gewoontegetrouw ingedeeld zijn in de categorieën benigne (‘pluis’), premaligne (‘half pluis’) en maligne (‘niet pluis’). Het merendeel van het ingezonden materiaal (zie Tabel B5.1) betreft de huidbiopten. Huidpathologie in de huisartsenpraktijk In deze sectie bespreken wij de trends van de huidpathologie. In 2008 zien we een verdere stijging van de premaligne (half pluis) en maligne (niet pluis) diagnoses (zie Fig. B5.1). Het is opvallend dat in 2006 opeens een piekje verschijnt in ‘premaligne’. Dat jaar nam Mathilde Boon een deel van de dermatopathologiepraktijk waar na het plotselinge vertrek van de patholoog Peter Melkert. Waarschijnlijk geeft zij, die scherp let op proliferatie (Ki-67) vaker de diagnose premaligne af dan haar collega’s, die deze techniek minder vaak toepassen. Het overzicht van de 14.688 huidbiopten uit de huisartsenpraktijk 2008 wordt gepresenteerd in Tabel B5.2, die wegens de omvang gekanteld is afgedrukt. Zoals gebruikelijk, hebben wij de laesies onderverdeeld in melanocytair, epitheliaal, wekedelen en overig. De grootste groep is die van de melanocytaire laesies (n = 5.250). Deze groep bestaat voor het merendeel (4.646 gevallen) uit dermale en samengestelde naevi. Bij 19 was er sprake van een melanoma in situ, en bij 70 van een melanoom.

Tabel B5.1. Overzicht ‘pluis’ (benigne), ‘half pluis’ (premaligne) en ‘niet pluis’ (maligne) van T-nummers ingezonden door huisartsen. Aard ingezonden benigne premalig- maligne geen materiaal laesies ne laesies laesies diagnose n % % % % Huidbiopten 14.688 85,6 6,2 7,4 0,8 Borstelhistologie 261 26,4 64,0 8,4 1,1 Uterus-/cervixweefsel∗ 110 99,1 0,9 0,0 0,0 Mammapunctaat, tepelsecreet 26 100,0 0,0 0,0 0,0 Overige punctaten∗∗ 9 100,0 0,0 0,0 0,0 Urinecytologie 8 100,0 0,0 0,0 0,0 Sputumcytologie 8 87,5 0,0 12,5 0,0 Overig weefsel∗∗∗ 227 96,5 0,0 0,0 3,5 Totaal 15.337 84,9 7,0 7,3 0,8 ∗ per vaginam verloren weefsel (w.o. abortusmateriaal, curettement, biopt/poliep van de cervix. ∗∗ punctaat uit schildklier, gewricht, lymfklier, subcutis. ∗∗∗ slijmvliezen van mond, neus, oog, tractus digestivus of vagina (108); ductus deferens (48); geen

diagnose (8); vaginale flora (63) (zie Sectie B4).

564 588 28 1.618 99,4 1.318 300 12.567 85,6

fibromata/lipomata neuro-/vaattumoren overig Overig ontstekingsbeelden overig Subtotaal geen diagnose Totaal

atypisch thoom DFSP∗

fibroxan-

910

1

4 3

6,2

0,2

Premaligne (half pluis) n % 233 4,4 dysplastische naevus 166 Spitznaevus 48 melanoma in situ 19 673 12,1 actinische keratose 442 morbus Bowen 105 keratoacanthoom 126

metastasen overig∗∗

angiosarcoom

leiomyosarcoom

basaalcelcarcinoom plaveiselcelcarcinoom maligne huidadnextumor

melanoom

n 70 70 % 1,3

9 6 3 1.092

1

5 4

7,4

0,6

0,2

1.008 18,1 923 80 5

Maligne (niet pluis)

∗ DFSP = dermatofibrosarcoma protuberans. ∗∗ maligne of suspect carcinoom (2); kleincellig carcinoom (onbekend primair of metastase) (1).

70 2.122 99,6 942

overig Wekedelenlaesies dermatofibromen

n % 4.947 94,2 Melanocytaire laesies dermale naevus 3.805 samengestelde naevus 841 overige 301 Epitheliale laesies 3.880 69,8 verrucae 3.133 cysteuze laesies 476 huidadnextumoren 201

Benigne (pluis)

Tabel B5.2. Overzicht van de 14.688 huidbiopten uit de huisartsenpraktijk 2008.

14.569 99,2 119 0,8 14.688 100

1.627 100

2.131 100

5.561 100

Totaal n % 5.250 100

B5. HISTOLOGIE EN NIET-GYNAECOLOGISCHE CYTOLOGIE 91

92

B. EVALUATIE VAN HET INGESTUURDE MATERIAAL 16000 14000

!pre"maligne benigne totaal

12000 10000 8000 6000 4000 2000 0

14%

Fig. B5.1. Trends van de huidpathologie in de huisartsenpraktijk in de afgelopen 13 jaar. Boven de totale aantallen per jaar, onder de percentages maligne, premaligne, en de som van beide.

12%

96 97 98 99 00 01 02 03 04 05 06 07 08

maligne premaligne som van beide

10% 8% 6% 4% 2% 0 96 97 98 99 00 01 02 03 04 05 06 07 08

Een andere grote groep is die van de epitheliale laesies (n = 5.561) met voornamelijk verrucae (n = 3.133). Bij de epitheliale laesies zien wij frequent premaligne (‘half pluize’) afwijkingen zoals actinische keratose (n = 442), morbus Bowen (n = 105) en keratoacanthoom (n = 126). In de epitheliale groep worden de meeste maligniteiten aangetroffen, met in de top het basaalcelcarcinoom (n = 923). Het plaveiselcelcarcinoom met n = 80 is in 2008 nog steeds belangrijk. De derde grote groep betreft de wekedelenlaesies met voornamelijk dermatofibromen, fibromata pendula en lipomata. De wekedelenlaesies zijn vrijwel allemaal goedaardig (99,6%). In 2008 enige exotische diagnoses, met driemaal een atypisch fibroxanthoom (driemaal in 2007) en eenmaal een dermatofibrosarcoma protuberans (DFSP) (viermaal in 2007), al deze diagnoses in het halfpluize. In de resterende vierde groep (overig) vinden wij veel ontstekingsbeelden (n = 1.318). In 2007 waren dit er nog 1.244. Er is sprake van een duidelijke toename van biopten waarin we de een of andere vorm van dermatitis aantreffen. Er waren 9 patiënten die vielen onder ‘overig maligne’, waaronder 6 metastasen. In 2007 diagnosticeerden wij bij 9 patiënten een huidmetastase. Ook in 2008 hebben wij de huisarts (en de patiënt) geconfronteerd met de onaangename verrassing dat het carcinoom naar de huid was uitgezaaid. In die groep ‘overig maligne’ zien we nog

B5. HISTOLOGIE EN NIET-GYNAECOLOGISCHE CYTOLOGIE

93

2 maligne of suspecte carcinomen en 1 kleincellig carcinoom waarvan onbekend is of het een primaire tumor of een metastase betreft. Tenslotte konden we op 119 biopten geen classificerende diagnose stellen, veelal ten gevolge van onvoldoende materiaal. Het maligne melanoom in de huisartsenpraktijk Inleiding Sinds jaar (1985) en dag (1 januari) kan het maligne melanoom in de huisartsenpraktijk rekenen op onze warme belangstelling (zie voorgaande jaarverslagen). Nu richten wij ons eerst op de 66 casussen van patiënten met een primair maligne melanoom waarvan wij een excisiebiopt ontvingen. Bij deze patiënten had de huisarts het mes in handen genomen om de laesie te excideren. Bij 4 melanomen verrichtte de huisarts geen excisie, maar besloot hij/zij tot een biopt. Deze bioptiegroep wordt separaat geanalyseerd. In totaal gaat het om 70 patiënten met een maligne melanoom, 37 mannen en 33 vrouwen (zie Tabel B5.3). De meeste melanomen van zowel mannen als vrouwen werden gediagnosticeerd in de cohorten 1938-1977. De excisiegroep In totaal betreft het 66 maligne melanomen waarvan we een excisiepreparaat ontvingen. Van 17 van de 66 excisiepreparaten maakten wij een digitale opname. In de uitvergrotingen konden wij ieder detail goed zien, immers er was geen formaline (dat alles kleurloos maakt) aan te pas gekomen. Er waren geen twee pigmentatiepatronen gelijk, zoals duidelijk is in de 4 voorbeelden van Fig. B5.2a-2d. Omdat bijna al onze (excisie)biopten zijn gefixeerd in het formalinevrije BoonFix zijn de immunokleuringen bijna altijd van zeer goede kwaliteit. De Melan-A-, de HMB45- en de keratinekleuring brengen de architectuur van het melanoom in beeld, en de Ki-67 de proliferatie van de maligne melanoomcellen.

Tabel B5.3. Geboortejaar en geslacht van de 70 melanoompatiënten. Geb. jaar Vrouw Man ≥ 1988 0 2 1978-1987 2 3 1968-1977 7 8 1958-1967 7 6 1948-1957 6 8 1938-1947 6 5 1928-1937 4 3 ≤ 1927 1 2 Totaal 33 37

Totaal 2 5 15 13 14 11 7 3 70

94

B. EVALUATIE VAN HET INGESTUURDE MATERIAAL

ab

cd Fig. B5.2. Macrofoto’s van excisiepreparaten van maligne melanomen 2008, zeer diverse pigmentatiepatronen. In Tabel B5.4 zijn de gegevens van de locatie van het melanoom en de diagnose van de huisarts verwerkt. Voor alle duidelijkheid, het betreft hier de klinische diagnose van de huisarts. In de diagnosegroep ‘benigne’ (n = 31; 47%) kwam de term ‘naevus’ het meest voor, maar ook andere, zoals verruca, haemangioom en erytheem. In de diagnosegroep ‘onrustige laesie’ (n = 22; 33%) vallen onder meer termen als dysplastische naevi, onrustige naevi, laesies met grillige pigmentatie en groeiende naevoïde laesie. Er worden opvallend veel onrustige laesies op het been gezien (en geëxcideerd) te weten 10 (15%) van deze 66 melanoompatiënten. Tenslotte is er een groep van 13 patiënten waar voor de klinische diagnose de term ‘verdacht’ (voor maligniteit) door de huisarts werd gebruikt. De maligniteit waaraan de huisarts dacht was niet alleen het maligne melanoom, maar ook het basalioom en het plaveiselcelcarcinoom. Ook hier weer het been als koploper, met 5 (8%) melanoompatiënten. De meeste melanomen zijn beengelokaliseerd, (n = 20;

B5. HISTOLOGIE EN NIET-GYNAECOLOGISCHE CYTOLOGIE Tabel B5.4. Locatie en diagnose huisarts van maligne melanomen senpraktijk LCPL 2008, 66 casussen uit de excisiegroep. Locatie Benigne Onrustige laesie Verdacht n % n % n % Hoofd 5 8% 0 0% 0 0% Schouder 4 6% 0 0% 2 3% Arm 6 9% 4 6% 1 2% Romp 4 6% 3 5% 2 3% Buik 4 6% 1 2% 1 2% Rug 3 5% 4 6% 1 2% Genitaalstreek 0 0% 0 0% 1 2% Been 5 8% 10 15% 5 8% Totaal 31 47% 22 33% 13 20%

95

uit de huisartTotaal n % 5 8% 6 9% 11 17% 9 14% 6 9% 8 12% 1 2% 20 30% 66 100%

Tabel B5.5. Top 5 melanoomsignalen in de huisartsenpraktijk. n Groei 13 Bloedend 7 Kleurverschillen 5 Hyperpigmentatie 4 Grillige vorm 4

30%), gevolgd door de armmelanomen (n = 11; 17%) en de rompmelanomen (n = 9;14%). Van deze groep van 66 melanoompatiënten waren er 22 (33%) waarbij de huisarts (een of meer) macroscopische bevindingen noteerde die kunnen wijzen op een maligne melanoom zoals bloedend (n = 7; 11%), hyperpigmentatie (n = 4; 6%), kleurverschillen (n = 5; 8%), onscherpe begrenzing (n = 3; 5%) en grillige vorm (n = 4; 6%). In niet minder dan 13 (20%) werd daarnaast door de huisarts en/of patiënt opgemerkt dat de laesie (recent) was gaan groeien, 3 patiënten (5%) meldden dat de laesie jeukte en 2 (3%) gaven pijn aan. De top 5 melanoomsignalen in de huisartsenpraktijk worden op rij gezet in Tabel B5.5, met door de patiënt opgemerkte groei van de laesie als koploper. De bioptiegroep De huisarts kan besluiten om de laesie niet in zijn geheel te excideren, maar een biopt te nemen, ofwel met een bioptstans (patiënt A) ofwel als shave biopt (patiënten B, C en D). Zulks is laagdrempelig en in ieder geval kan de huisarts dan enig idee verschaft worden middels ons advies hoe verder te gaan. In al deze gevallen is uitvoerig telefonisch overleg tussen patholoog en huisarts een sine qua non!

96

B. EVALUATIE VAN HET INGESTUURDE MATERIAAL

Vier ziektegeschiedenissen uit de bioptiegroep Patiënt A Op het formulier van het stansbiopt stond: naevus in de hals. Aanvullende telefonische informatie: stansbiopt uit een laesie van ongeveer 5×4 mm, klinisch onverdacht, door patiënt geen verandering waargenomen. In ons verslag lezen we dat de coupes een dermis tonen die voor een groot deel in beslag wordt genomen door een melanocytaire proliferatie van relatief dicht opeen gelegen rondovale melanocyten die een licht vergrote kern bezitten met vergrote nucleolus. Een duidelijke uitrijpingstendens ontbreekt. De Melan-A dermaal is diffuus sterk positief; epidermaal een kleine grensvlakcomponent zonder opstijgende melanocyten. De HMB45 toont verspreid solitair aankleurende melanocyten in alle niveaus van de dermale component; tevens aankleuring van de grensvlakcomponent. De Ki-67-kernexpressie is diffuus verhoogd. De definitieve conclusie na extern consult was: cutane lokalisatie van melanoom, goed passend bij primair naevoïd melanoom. Het definitieve advies na consult was: reëxcisie met klinisch vrije marge van 1 cm (conform richtlijn melanoom 2005). In de PALGA-databank vonden we dat in oktober 2008 een metastase van maligne melanoom in de parotis was gevonden. Zulks komt zeer zelden voor! Ook lazen wij dat in 2003 een eerder stansbiopt (afgenomen door de dermatoloog) in Amsterdam was beoordeeld als grensvlaknaevus maar bij revisie (VUmc) werd beoordeeld als een atypische melanocytaire proliferatie die, mede gelet op de nieuwe biopsie (LCPL, 2008) geduid moet worden als tenminste sterk dysplastische naevus/melanoma in situ. Het is duidelijk (met de kennis van nu) dat het excisiebiopt dat in 2003 door de specialist was afgenomen door de pathologen van de VU niet juist was beoordeeld. Helaas blijkt dit melanoom kort na de stansbioptdiagnose gemetastaseerd en wel naar de parotis. Patiënt B Op het formulier van het shave biopt stond: sinds een jaar een laesie op de linkerbovenarm. Verruceuze plaque. Verruca seborrhoica? Naevus (papillomateus)? In ons verslag lezen we dat de coupes een oppervlakkige laesie tonen. Langs het epidermo-dermale grensvlak en in de dermis worden naevoïde cellen gezien, vrij groot, epithelioïd en met forse kernen, veelal met duidelijke nucleoli. Onze conclusie was tenslotte: excisie pigmentlaesie huid linkerbovenarm: naevoïd cutaan melanoom. En ons advies was reëxcisie. Wij bekeken de coupes nogmaals en bevestigden de diagnose maligne melanoom. Wij zagen dat de cellen sterk positief waren voor Melan-A. Met name in de oppervlakkige lagen was er ook duidelijke positiviteit voor HMB45. Er was een opvallend hoge Ki-67-kernpositiviteit, ook in de diepere cellagen.

B5. HISTOLOGIE EN NIET-GYNAECOLOGISCHE CYTOLOGIE

97

In de PALGA-databank vonden we dat in Deventer in het reëxcisiepreparaat geen tumorrest (van het maligne melanoom) werd gevonden en dat de twee okselklieren (schildwachterprocedure) tumorvrij waren. Met het shave biopt heeft de huisarts het maligne melanoom vrijwel geheel verwijderd en zijn de restjes melanoomweefsel (snijranden waren niet vrij!) waarschijnlijk weggegranuleerd. In het shave biopt was gezien dat de dikte van het maligne melanoom tenminste 1,4 mm was. Of het nog dikker was konden wij niet zien omdat het melanoom tot in de snijrand van het shave biopt reikte. Gelukkig zijn er tot nu toe geen metastasen geconstateerd. Patiënt C Op het formulier van het shave biopt stond: niet genezende wond op linkeronderbeen, bestaande sinds een half jaar, nu met een verheven kop. Het boven het oppervlak uitstekende bobbeltje werd door de huisarts met een scherp mesje verwijderd (shave biopt). In ons verslag lezen wij dat de coupes een epidermis tonen met het oppervlakkige deel van een verheven ulcererende atypische melanocytaire proliferatie. Aan één zijde nog een klein stukje herkenbaar epidermis, gekenmerkt door irregulaire hyperplasie. In dit kleine epidermisfragmentje geen epidermale melanocytaire component. Onze conclusie was: oppervlakkige excisie huid (shave biopt) onderbeen links: oppervlakkig deel van een ulcererend melanoom. De externe revisie was: nodulair maligne melanoom. Ons advies luidde tenslotte: reëxcisie met marge van 2 cm (conform richtlijn melanoom 2005) is geïndiceerd. Onzekerheid primair cutaan dan wel metastase is aan de orde geweest. Inspectie van de gehele huid is geïndiceerd. De coupes werden door ons gereviseerd en de diagnose melanoom bevestigd. Zowel in de HE- als in de Papanicolaou-kleuring uitgesproken kernatypie, sterk positieve Melan-A en veel proliferatie (Ki-67 positief) (zie Fig. B5.3). In de tumorcellen werden duidelijke mitosefiguren gezien. In de PALGA-databank vonden we dat in 2008 en 2009 in Amsterdam basaalcelcarcinomen werden gediagnosticeerd, bij de wenkbrauw en op het onderbeen. Ook lazen wij dat in Amsterdam in september 2008 in het reëxcisiepreparaat (linkeronderbeen) een rest nodulair melanoom was aangetroffen, zonder tekenen van regressie en zonder satellitose. In het door ons beoordeelde shave biopt was de tumordikte tenminste 2,8 mm, zijnde de dikte van het door de huisarts afgesneden bobbeltje. Gezien de minimale dikte van 2,8 mm van het maligne melanoom is de prognose van deze patiënt op z’n minst zorgelijk, maar in ieder geval is de huisarts door het nemen van een shave biopt uit een ‘niet genezende wond’ op het goede spoor gekomen.

98

B. EVALUATIE VAN HET INGESTUURDE MATERIAAL

ab

cd Fig. B5.3. Microscopische opnames van het shave biopt van patiënt C, gekleurd met achtereenvolgens HE, Ki-67, Melan-A en Papanicolaou. Alle opnames zijn met een 1000× vergroting gemaakt Bij deze vergroting valt de mitosefiguur op. Patiënt D Op het formulier van het shave biopt stond: sinds 2 jaar zwelling/verruca seborrhoica flank rechtsonder. Aanvullende telefonische informatie: verheven plek met diameter van 7 mm met daarin/daarnaast een verruceuze verandering. De shave is qua omvang/oppervlak radicaal maar niet met betrekking tot de bodem. In ons verslag lezen we dat de coupes atypische melanocytaire proliferatie tonen die als gevolg van fragmentatie qua architectuur onvolledig is en niet goed beoordeelbaar (ook niet na opnieuw inbedden ‘kantelen’.) Een betrouwbare beoordeling van eventueel opstijgende melanocyten in de epidermis is niet mogelijk. In het bindweefsel van de fragmenten worden sterk in grootte en vorm wisselende nesten melanocyten gezien met wisseling in celbeeld. Onze conclusie was: atypische samengestelde melanocytaire proliferatie, door fragmentatie en aansnijdartefacten geen zekere diagnose mogelijk. Gelet op de mate van cytonucleaire atypie, onregelmatige groeiwijze, immunofenotypisch expressiepatroon en de hoge Ki-67-kernexpressie rijst de verdenking op melanoom. De excisie is niet radicaal. Patiënt werd naar de dermatoloog verwezen. Het reëxcisiebiopt toonde alleen lit-

B5. HISTOLOGIE EN NIET-GYNAECOLOGISCHE CYTOLOGIE

99

ab

cd Fig. B5.4. Microscopische opnames van het shave biopt van patiënt D, gekleurd met achtereenvolgens HMB45, Ki-67, Melan-A en Papanicolaou. Ook hier zijn alle opnames met een 1000× vergroting gemaakt. In deze tumor wisselende HMB45en Melan-A-aankleuring. tekenweefsel, er werd dus geen melanoomweefsel teruggevonden. Wij reviseerden de coupes en zagen in de Melan-A- en HMB45-kleuring positieve cellen, evenals in de Ki-67-kleuring, wijzend op een melanoom, hetgeen bevestigd werd in de Papanicolaou-kleuring (zie Fig. B5.4). Kort en goed, dit melanoom werd middels het shave biopt geheel verwijderd. In de PALGA-databank vonden we dat in Dordrecht in december 2008 in het reëxcisiepreparaat van de huid flank rechts een reactief beeld met verlittekening werd gezien. In ons eigen archief vonden we dat in 2002 en 2006 door de huisarts een verrucae seborrhoica van respectievelijk de slaap rechts en de borst werd gediagnosticeerd in shave biopten. Het is goed te begrijpen dat de huisarts in 2008 wederom een shave biopt nam omdat hij dacht aan een (goedaardige) verruca seborrhoica.

100

B. EVALUATIE VAN HET INGESTUURDE MATERIAAL

Conclusie De huisarts speelt anno 2008 een belangrijke rol bij het opsporen van het maligne melanoom middels huidexcisies. Zelfs een biopt, hoewel niet ideaal, kan de arts toch op het juiste spoor zetten zoals uit de vier ziektegeschiedenissen blijkt. Histocytologie, cytohistologie en borstelhistologie Histocytologie, cytohistologie en borstelhistologie zijn synoniemen voor het inbedden en tot paraffinecoupes verwerken van gesuspendeerde cervixbrush samples. In 2008 werd bij 261 patiënten borstelhistologie gedaan, met op de seriecoupes de biomarkers Ki-67 (proliferatie) en p16 (HPV-integratie). Bij het merendeel van deze vrouwen (68,5%) werd een (pre)maligne laesie in de coupes gevonden (Tabel B5.1). Materiaal ingezonden door niet-huisartsen Het totaal aantal door niet-huisartsen ingezonden onderzoeken met een T-nummer (histologie en niet-gynaecologische cytologie) is in 2008 uitgekomen op 4.418. In Tabel B5.6 zijn de 4.418 T-nummers (uit verschillende bronnen afkomstig) opgenomen die, net als in Tabel B5.1, zijn ingedeeld in de categorieën benigne (‘pluis’), premaligne (‘half pluis’) en maligne (‘niet pluis’). Het merendeel van het ingezonden materiaal (zie Tabel B5.6) betreft de nagelbiopten (n = 2.887). Schimmeldiagnostiek op nagelbiopten In 2008 werden er 2.887 nagelbiopten ingestuurd voor schimmeldiagnostiek. In 2.438 (84,4%) van deze biopten werd schimmel gediagnosticeerd (zie Tabel B5.6).

Tabel B5.6. Overzicht ‘pluis’ (benigne), 4.418 T-nummers. Aard ingezonden materiaal n ∗ Nagelbiopten 2.887 Blaasspoelingen∗∗ 1.168 Urine (Andros kliniek) 48 ∗∗∗ Prostaatbiopten 190 Huid 125 Totaal 4.418

‘half pluis’ en ‘niet pluis’ (maligne) van pluis (%) 100,0 70,0 97,9 54,2 74,4 89,4

half pluis (%) 0,0 23,4 2,1 0,0 6,4 6,4

niet pluis (%) 0,0 6,6 0,0 45,8 19,2 4,3

∗ pluis = geen schimmel (n = 345 [15,6%]) en schimmel (n = 2.438 [84,4%]). ∗∗ pluis = benigne of ontsteking; half pluis = morfometrie afwijkend, cytologie niet-maligne; niet pluis

= maligne. ∗∗∗ niet pluis omvat suspect maligne (n = 14) en maligne (n = 73).

B6. MOLECULAIRE PATHOLOGIE, SOA-DIAGNOSTIEK EN CANDIDA101 Blaasspoelingen In 2008 beoordeelden wij 1.168 blaasspoelingen, waarvan 818 (70%) met een benigne diagnose. In 77 gevallen vonden wij overtuigend maligne cellen. Met 6,6% harde maligne diagnoses scoren wij wederom vrij hoog. Prostaatbiopten In 2008 beoordeelden wij 190 prostaatbiopten (uit de Andros Mannenkliniek). Bij 87 mannen (45,8%) werd een prostaatcarcinoom gediagnosticeerd. In 2008 zijn wij overgegaan op gelokaliseerde biopten. Middels kleurstoffen werden links en rechts zes locaties gecodeerd, zodat nauwkeurig de uitbreiding en lokalisatie van het carcinoom konden worden gerapporteerd. De optimale samenwerking met de biopterende artsen was daarbij een must.

B6 Moleculaire pathologie: diagnostiek van seksueel overdraagbare aandoeningen en Candida Inleiding Op het LCPL richt de afdeling moleculaire biologie zich voornamelijk op de diagnostiek van seksueel overdraagbare aandoeningen (SOA) en Candida. Alle onderzoeken die wij doen zijn gebaseerd op de uiterst gevoelige PCR-techniek. Wij tonen pathogene virussen en bacteriën aan door naar het DNA van die organismen te zoeken. Voordeel is dat u het materiaal kunt aanleveren in fixatief (BoonFix). Uit al het materiaal dat wij aangeleverd krijgen isoleren wij het DNA met behulp van de Biorobot M48 van de firma Qiagen. We zijn er op die manier zeker van dat PCRremmende stoffen, zoals slijm, ureum en hemoglobine niet aan de PCR-mix worden toegevoegd. Indien nodig koppelen wij de PCR-uitslagen aan de microscopische bevindingen. Daarmee bereiken wij meer diepgang. Het totaal aantal PCR-onderzoeken is in 2008 wederom met 16% gegroeid tot 11.334. Deze groei wordt grotendeels veroorzaakt door het toegenomen aantal HPV-onderzoeken. Vanaf 1 januari 2007 hanteren wij de nieuwe richtlijnen van de NNVP. In deze richtlijnen staat dat vrouwen met een herhaalde Pap II- of IIIA-lichte dysplasie-uitstrijk PCR-diagnostiek voor HPV kunnen krijgen. Chlamydia en Neisseria Totaal aantal Chlamydia- en Neisseria-onderzoeken: 8.094 Al sinds 2003 doen wij de Chlamydia- en Neisseria-onderzoeken met behulp van de Cobas Amplicor PCR-robot van de firma Roche. Deze gevalideerde methode is uiterst betrouwbaar en door de constante factor kunnen LCPL-resultaten van jaren met elkaar vergeleken worden.

102

B. EVALUATIE VAN HET INGESTUURDE MATERIAAL

In het laatste RIVM1000 rapport over SOA-statisvrouwen tieken van 29 SOA-centra mannen 800 wordt melding gemaakt van 13% stijging van 600 SOA-consulten in 2008. Ongeveer 11% van de pa400 tiënten bleek positief voor 200 Chlamydia en 2% voor Neisseria. Er werd een 0 stijging van Chlamydia15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 jr incidentie gemeten bij de jongeren. Het aantal Neis- Fig. B6.1. Aantallen Chlamydia-onderzoeken 2008 per leeftijdscategorie. seria-gevallen nam af. In 2008 werden er 8.094 onderzoeken ingezonden vrouwen 800 vanuit de huisartspraktijk. mannen Het jaar daarvoor waren 600 dat 7.621 onderzoeken. We zien dus een groei van 400 6%. Van de 8.094 uitge200 voerde onderzoeken waren er 4.668 Chlamydia0 bepalingen, waarvan 392 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 jr (11%, tegen 9% in 2007) positief bleken. Dit is een Fig. B6.2. Aantallen Neisseria-onderzoeken 2008 per lichte stijging. Het per- leeftijdscategorie. centage komt overeen met de gegevens van het RIVM. De hierna vermelde percentages tussen rechte haken zijn de gevonden waarden uit 2007. 3.426 Onderzoeken (42% [42%]) waren voor Neisseria, waarvan 47 (1,4% [1,6%]) positief. Van de 4.668 Chlamydia-onderzoeken waren er 3.613 (77% [76%]) van vrouwelijke patiënten en 1.055 (23% [24%] van mannelijke. Van de 3.426 Neisseria-onderzoeken waren deze getallen respectievelijk 2.658 (78% [77%]) en 768 (29%[23%]). Er is daarmee een stijging van Neisseria-onderzoeken te zien bij de mannen. Van de 3.613 Chlamydia-onderzoeken bij vrouwen bleken 278 (8% [7%]) positief tegen 114 (13% [14%]) bij 1.055 ‘mannelijke onderzoeken’. Bij de 2.658 Neisseriaonderzoeken bij vrouwen waren 22 (0,8% [0,6%]) positief tegen 25 (3% [5%]) bij 768 Neisseria-onderzoeken bij mannen. Net als voorgaande jaren zien wij geen grote verschuiving van de percentages ‘positief voor Chlamydia en Neisseria’.

B6. MOLECULAIRE PATHOLOGIE, SOA-DIAGNOSTIEK EN CANDIDA103 20%

Als wij ons eerst richten op de aantallen ondermannen 2008 zoeken, zien we een duidelijk leeftijd-gerelateerd patroon voor zowel Chla10% mydia als Neisseria. Fig. B6.1 geeft dit beeld weer voor Chlamydia en Fig. B6.2 voor Neisseria. De 0% patronen van de twee gra15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 jr fieken vertonen veel overFig. B6.3. Percentage Chlamydia positief per leef- eenkomst. De gegevens van de onderzoeken voor tijdscategorie voor het jaar 2008. mannen en vrouwen zijn 10% verwerkt voor de leefvrouwen 2008 tijdscategorieën boven 15 mannen 2008 jaar. Uit de groep ‘20 tot 25 jaar’ worden voor zowel vrouwen als man5% nen de meeste Chlamydiaén Neisseria-onderzoeken aangevraagd. De cijfers van de voorgaande jaren 0% zijn identiek. Slechts 29 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 jr onderzoeken waren bij paFig. B6.4. Percentage Neisseria positief per leeftijds- tiënten jonger dan 10 jaar categorie voor het jaar 2008. (16 Chlamydia, 13 Neisseria). Deze onderzoeken bleken allemaal negatief. In de leeftijdsgroep van ‘10 tot 15 jaar’ werden 22 onderzoeken verricht, twee bij jongens en 20 bij meisjes. Ook deze onderzoeken waren allemaal negatief. Fig. B6.3 en B6.4 geven voor respectievelijk Chlamydia en Neisseria het ‘percentage positief’ weer per geslacht en leeftijdscategorie. Terwijl in de leeftijdsgroep ‘20 tot 25 jaar’ de hoogste aantallen onderzoeken Chlamydia en Neisseria vallen, voor zowel mannen als vrouwen (zie Fig. B6.1 en B6.2), zien we dat het hoogste percentage ‘positief voor Chlamydia’ en ‘Neisseria’ bij de nog jongere groep ‘15 tot 20 jaar’ valt. Dit namen we in voorgaande jaren ook waar. In de oudere leeftijdscategorieën kwamen zo weinig onderzoeken voor dat de percentages te onbetrouwbaar zijn om te interpreteren. Tabel B6.1 geeft voor mannen en vrouwen de uitslag weer gegroepeerd per lokalisatie van afname. De celsuspensies werden voornamelijk anogenitaal afgenomen: 8.073 (99% [99%]). Van 34 onderzoeken was de lokalisatie anders (keel, mond en oog). Bij slechts 9 onderzoeken werd niet vermeld waar het materiaal was afgenovrouwen 2008

104

B. EVALUATIE VAN HET INGESTUURDE MATERIAAL

Tabel B6.1. Aantallen Chlamydia- en Neisseria-onderzoeken met uitslagen, gegroepeerd per lokalisatie. Chlamydia Neisseria Geslacht Lokalisatie Totaal positief Totaal positief n n % n n % Mannen urine 534 49 9 382 8 2 urethra 504 64 13 370 17 5 anus 3 3 penis 3 1 33 2 anogenitaal 1.044 114 11 757 25 3 overig 8 7 (oog, keel, mond) onbekend 3 4 Totaal M 1.055 114 11 768 25 3 Vrouwen cervix 3.123 244 8 2.362 15 1 urine 422 27 6 248 5 2 urethra 36 7 19 21 1 5 vagina 18 16 anus 2 2 anogenitaal 3.601 278 8 2.649 21 1 overig 11 8 1 13 (oog, keel, mond) onbekend 1 1 Totaal V 3.613 278 8 2.658 22 1 Totaal M+V 4.668 392 8 3.426 47 1

men. Vorig jaar was dit nog bij 40 onderzoeken. In het geval van urine konden wij zelf de aard van het materiaal vaststellen. Er werd voor 1.586 (20% [18%]) onderzoeken urine ingezonden. 916 ‘Mannelijke onderzoeken’ werden op urines gedaan (50%) tegen 670 ‘vrouwelijke onderzoeken’ (11%). Wij raden aan om bij vrouwen een vaginale of cervicale+urethrale wattenstaafafname in te zenden in plaats van een urinemonster, omdat in de literatuur vermeld staat dat bij vrouwen de kans op een fout negatieve uitslag bij urine-onderzoek substantieel is. Een urethrale infectie wordt wel ontdekt na plassen, maar bijvoorbeeld een cervicale infectie wordt regelmatig gemist (Buimer e.a., 1996). Humaan papillomavirus (HPV) Totaal aantal HPV-onderzoeken: 2.643 Sinds begin jaren negentig passen wij in het LCPL de PCR-techniek toe voor het aantonen van humaan papillomavirus (HPV). In 2003 werd dit de Inno-LiPAPCR-test (leverancier: Innogenetics, Gent). Voor de detectie van het PCR-product gebruiken wij een hybridisatierobot.

B6. MOLECULAIRE PATHOLOGIE, SOA-DIAGNOSTIEK EN CANDIDA105 In ons jaarverslag van 2003 rapporteerden we uitgebreid over de techniek (Kramer en Korporaal, 2004). Om marketingredenen (patenten) had Innogenetics in 2007 tijdelijk het aantal HPV-typen teruggebracht naar 18. Nu diagnosticeren wij weer voor 8 ‘laag risico’ typen en 18 ‘hoog risico’ typen. (‘Extra-kit’). Van de ‘hoog risico’ groep is bekend dat het een relatie heeft met het ontstaan van baarmoederhalskanker. De HPV-test is in staat om méér dan de genoemde typen te detecteren. We spreken in dat geval van een ‘onbekend’ type. De fimra Innogenetics sleutelt van tijd tot tijd aan de probes: in 2008 heeft dat waarschijnlijk geresulteerd in minder ‘type onbekend’. Bij de bevinding“HPVhr positief’ is het van belang om het vervolgonderzoek voor de uitstrijk én een HPV-onderzoek eerder te laten plaatsvinden. De huisarts krijgt in dat geval van de onderzoeken de uitslag met een geïntegreerd herhaaladvies! De Nederlandse Vereniging voor Pathologie (NVVP) heeft in het najaar van 2006 een richtlijn uitgebracht waarin (huis)artsen worden uitgenodigd om bij een herhaalde Pap-klasse II of Pap-klasse IIIA (lichte dysplasie) een HPV-onderzoek aan te vragen. Mede op grond van de HPV-uitslag wordt het herhaaladvies voor vervolgonderzoek aangepast. De juiste informatie is te vinden op de website van de NVVP (www.pathology.nl) én de site van de Stichting Bevolkingsonderzoek Baarmoederhalskanker regio West (www.sbbw.nl). Wij zijn in januari 2007 actief begonnen om onze diagnostiek volgens deze richtlijnen uit te voeren. In 2008 werden er 2.643 HPV-bepalingen gedaan, alle op celsuspensies in BoonFix. Er werden 23 onderzoeken aangevraagd op materiaal van mannelijke patiënten. Zes mannen waren positief voor HPVhr. De onderzoeken bij de mannen worden verder niet meegenomen in de evaluatie. De overige 2.620 onderzoeken waren alle op materiaal van onbekende (1) of anogenitale oorsprong bij vrouwelijke patiënten. 2.600 Onderzoeken waren van cervicale afnames. Bij de meeste vrouwen waar een HPV-type werd bepaald, werd de celsuspensie ook lichtmicroscopisch beoordeeld. Tabel B6.2. geeft een weergave van het verband tussen Pap-klasse en de aangetroffen HPV-soort. Tussen de rechte haken staan de percentages die in 2007 gezien werden. Van de 2.600 cervicale suspensies waren er 1.297 (50% [59%]) positief voor HPV, 1.002 (39% [41%]) positief voor HPVhr, 105 (4% [4%]) positief voor HPV ‘alleen lr’ en 190 (7% [13%]) voor een onbekend HPV-type. In de tabel zien we een duidelijk verband tussen Pap-klasse en HPV. Hoe hoger de Pap-klasse, hoe groter de kans op HPV. Dat de score HPV-positief ook in de Pap-klasse I groep aanzienlijk is, is te verwachten, omdat deze patiënten een selecte groep zijn. Het gaat hier om vrouwen die voorgeselecteerd zijn uit onze cytologiepraktijk, bijvoorbeeld vrouwen met koilocytose in de uitstrijk, vrouwen die herhaald onderzocht worden omdat eerder HPVhr is aangetroffen en vrouwen met een verdenking voor een SOA. Voor Papklasse I en II was het percentage HPV-positief respectievelijk 41% [50%] en 75% [79%]. Bij de Pap-klasse IIIA groep werd net als in 2007 een hoog percentage

106

B. EVALUATIE VAN HET INGESTUURDE MATERIAAL

Tabel B6.2. Positiviteit voor HPV gestratificeerd naar Pap-klasse uit de groep van 2.600 cervicale afnamen bij vrouwen. In de tabel staat HPVhr voor ‘HPV in ieder geval hoog risico’, HPVlr staat voor ‘HPV alleen laag risico’ en HPV onbekend voor ‘HPV alleen onbekend risico’. De Pap-klassen komen uit de parallelle uitstrijk. PapAantal HPVpos HPVhr HPVlr HPV onbekend klasse n % n % n % n % n % I 1.875 72 763 41 554 30 76 4 133 7 II 275 11 207 75 175 64 6 2 26 9 IIIA 192 7 167 87 149 78 5 3 13 7 IIIB 3 0 3 100 3 100 IV V geen 255 10 157 62 121 47 18 7 18 7 Totaal 2.600 100 1.297 50 1.002 39 105 4 190 7

positief voor HPV aangetroffen: (87% [90%]). Er werden maar 3 Pap-klasse IIIB vrouwen onderzocht op HPV. In alle drie de gevallen werd er HPV16 aangetroffen. Fig. B6.5 geeft de percentages HPV weer van de 1.875 cytologisch negatieve uitstrijken (Pap-klasse I), wederom voornamelijk HPVhr. Fig. B6.6 geeft de verdeling weer van de diverse HPV-typen uit de groep van 1.875 Pap-klasse I uitstrijken. De figuur vertoont een iets andere verdeling van de HPV-types dan die van 2007. Logisch als men bedenkt dat de diagnostische kit dit jaar een ander ontwerp had. Dit jaar wordt, evenals in 2007, het meest HPV16 gezien (6% [15%]), gevolgd door HPV53 (5% [3%]) en HPV51 (5% [8%]). Terwijl HPV18 en HPV45, na HPV16, het meest in carcinomen worden gezien, komen ze minder frequent voor in de Pap-klasse I uitstrijkjes: respectievelijk 5% [2%] en 2% [2%]. In de HPV ‘laag risico’ groep komen, net als in 2007, HPV-typen 6, 54 en 70 het meest voor (2 à 3%). Type 11 werd maar in 1% van de gevallen aangetroffen. Net als voorgaande jaren vinden we opvallend weinig HPV ‘laag risico’ en zien we geen relatie tot de Pap-klasse. In 2010 zetten we het NVVP-beleid voort om HPV-diagnostiek te koppelen aan de HPV !n!763" Fig. B6.5. Percentages HPV-positief op 1.875 alleen HPVlr !n!76" cytologisch negatieve HPVhr !n!554" (Pap-klasse I) uitstrijken, vergeleken met HPV onbekend !n!133" de gegevens van 2007 (grijs). 0%

20%

40%

B6. MOLECULAIRE PATHOLOGIE, SOA-DIAGNOSTIEK EN CANDIDA107 2007

2008

?

?

!

43

40

40

11

11

44

44

70

70

54

54

6

6

!

26

!

73

!

82

!

35

59

59

!

56

!

39

58

58

68

68

45

45

33

33

!

52

66

66

31

31

18

18

51

51

53

53

16 0%

Fig. B6.6. Verdeling van de diverse HPVtypen als percentage van de 1.875 onderzoeken bij Pap-klasse I cervicale uitstrijkjes. In het linkerdiagram staan de percentages uit 2007 van 1.263 onderzoeken bij Pap-klasse I uitstrijkjes. De rode staven betreffen type ‘hoog risico’, de groene ‘laag risico’. De blauwe categorie labelt een ‘onbekend’ HPV-type. In 2007 werd er voor minder typen gediagnosticeerd (streepje). Er werd in 2008 opvallend minder HPV16 en HPV51 en meer HPV53 en HPV18 aangetroffen.

16

5%

10%

15%

0%

5%

10%

15%

cervixcytologische onderzoeken (uitstrijkjes), zodat we het herhaaladvies kunnen aanscherpen. Herpes simplexvirus (HSV) en Varicella zostervirus (VZV) Totaal aantal HSV- en VZV-onderzoeken: 189 Met behulp van de LightCycler-machine van Roche zijn wij in staat om de PCRtechniek toe te passen voor detectie van Herpes simplexvirus (HSV) type 1 en 2. Het materiaal wordt met een borsteltje of wattenstaafje afgenomen en ingezonden in BoonFix . In het jaarverslag van 2002 schreven wij uitgebreid over de PCRmethode in de LightCycler (Van der Veer, 2003). U kunt dit jaarverslag inzien op onze website. Binnen een dag hebben wij onderzocht of HSV type 1, dan wel type 2 gevonden wordt. Op identieke wijze testen we ook voor het Varicella zostervirus (VZV)(eveneens een Herpes-soort), voor onder andere gordelroosdiagnostiek. Wij zien aan de gegevens op de aanvraagformulieren dat het meestal gaat om blaasjes die op de huid van de patiënt worden aangetroffen. Het is van belang om zo’n blaasje stuk te maken voordat met de borstel of wattenstaaf wordt afgenomen. In 2008 werd 189 keer een herpesonderzoek aangevraagd, net iets meer dan in 2007 [158]. Bij 18 patiënten betrof het een aanvraag voor VZV-onderzoek. Vier

108

B. EVALUATIE VAN HET INGESTUURDE MATERIAAL

Tabel B6.3. Aantallen van patiënten met Herpes simplexvirus-onderzoek, lokalisatie van de laesie en resultaten. Type positief Geslacht Lokalisatie Totaal HSV-pos HSV-1 HSV-2 n % n % n % n % Mannen anogenitaal 30 81 13 43 6 20 7 23 overig 6 16 3 50 3 50 (huid, tong, oog) onbekend 1 3 1 100 1 100 Totaal M 37 100 17 46 10 27 7 19 Vrouwen anogenitaal 121 90 44 36 28 23 16 13 overig 6 4 4 67 4 67 (huid, mond, oog) onbekend 7 5 4 57 2 29 2 29 Totaal V 134 100 52 39 34 25 18 13 Totaal M+V 171 69 40 44 26 25 15 Varicella-onderzoeken (22%) waren positief voor VZV. Het ging om drie mannen en één vrouw. In alle vier de gevallen betrof het een huidafname. Er werd 171 maal een onderzoek voor HSV aangevraagd. De resultaten worden weergegeven in Tabel B6.3. De patiëntengroep bestond uit 37 (22% [23%]) mannen en 134 (78% [77%]) vrouwen. De percentages komen ongeveer overeen met die van 2007 (percentages tussen de rechte haken). Ook in 2008 werden de meeste onderzoeken voor vrouwen aangevraagd. De lokalisaties van de 171 afnamen waren voornamelijk van de anogenitale streek (n = 151 (88% [72%])): bij mannen in materiaal van de penis (n = 18), urethra (n = 9), anus (n = 2) en scrotum (n = 1) en bij vrouwen van voornamelijk de cervix (n = 67), vagina (n = 24) en de schaamlippen (n = 22). In geen van de ingezon40 den materialen werd zovrouwen 2008 wel HSV-1 als -2 aange30 mannen 2008 troffen. Van de 151 anogenitale onderzoeken wa20 ren er 57 (38%) [30%] positief voor HSV. Dit is vrij 10 hoog. De klinische diagnose is kennelijk redelijk betrouwbaar te stellen in 0 10 20 30 40 50 60 70 jr de huisartspraktijk. Van de 57 positieve anogenita- Fig. B6.7. Aantallen Herpes simplex-onderzoeken per le onderzoeken waren er leeftijdscategorie. 34 (60% [59%]) positief voor HSV-1 en 25 (40% [41%]) positief voor HSV-2.

B6. MOLECULAIRE PATHOLOGIE, SOA-DIAGNOSTIEK EN CANDIDA109 In Fig. B6.7 worden de aantallen HSV-onderzoeken per leeftijdscategorie weergegeven. De gemiddelde leeftijd van de mannen met HSV was 39 [35] jaar en van de vrouwen 34 [33] jaar. Candida albicans Totaal aantal Candida albicans onderzoeken: 196 In de schimmeldiagnostiek passen we als aanvulling op de microscopie (Berger en Boon, 2005) al enige jaren DNA-diagnostiek op Candida albicans toe. Dit doen we met behulp van de bovenbeschreven LightCycler-machine (Van der Veer, 2003). Materiaal kan worden afgenomen met een borstel of wattenstaaf en worden ingezonden in ons BoonFix. Na zuivering van het DNA (zie boven) wordt de PCR gedaan (Engberts ea, 2005). Hier moet worden opgemerkt dat in het LCPL óók schimmeldiagnostiek op nagels wordt gedaan, niet via de PCR-methode, maar via morfologische technieken (microscoop) (Boon en Middag-Broekman, 2004). Tabel B6.4 geeft een overzicht van het aantal vrouwen 2008 Candida-onderzoeken. In mannen 2008 60 2008 ontvingen wij 196 aanvragen voor Candida. Dit is een groei van 83% 40 ten opzichte van 2007. Het gaat om tien (5%) 20 [7%] aanvragen van mannen en 186 (95%) [93%] van vrouwen. Eén af0 10 20 30 40 50 60 70 jr name (negatief) was uit het oor van een 40-jarige Fig. B6.8. Aantallen Candida-onderzoeken per leefman en van één afname tijdscategorie. (negatief) bij een vrouw was de lokalisatie niet be40% kend. In alle andere gevalvrouwen 2008 len ging het om genitaal 30% afnamemateriaal. Bij de mannen was al het materiaal negatief voor Candi20% da. Bij de vrouwen waren 27 afnamen positief (15% 10% [20%]). Deze positieve afnamen waren alle van de 0% cervix of vagina. 10 20 30 40 50 60 70 jr Fig. B6.8 geeft het aanFig. B6.9. Percentage ‘Candida positief’ per leef- tal onderzoeken bij mantijdscategorie. nen en vrouwen per leef-

110

B. EVALUATIE VAN HET INGESTUURDE MATERIAAL

Tabel B6.4. Aantallen Candida-onderzoeken gesplitst naar de diverse lokalisaties. Geslacht Lokalisatie Totaal Candida albicans positief n % n % Mannen urethra 4 40 penis 3 30 urine 2 20 gehoorgang 1 10 Totaal M 10 100 Vrouwen cervix 158 85 19 12 vagina 20 11 8 40 labium 4 2 perineum 2 1 urethraslijmvlies 1 1 onbekend 1 1 Totaal V 186 100 27 15 Totaal M+V 196 27 14

tijdscategorie van 10 jaar weer en Fig. B6.9 het percentage ‘positief voor Candida’ (alleen voor de vrouwelijke patiënten opgemaakt). De leeftijd van de 10 mannen was aardig verdeeld over alle categorieën en was gemiddeld 36 [36] jaar. De grootste groep onderzochte vrouwen zat in de leeftijdscategorie 20-29 jaar. In 2007 zat die in de categorie 30-39 jaar. De hoogste kans op ‘positief voor Candida’ lag bij de groep vrouwen tussen de 30 en 40 jaar. De gemiddelde leeftijd van de onderzochte vrouwen was 32 [35] jaar. Deze groep was wat ouder dan de onderzochte vrouwen voor Chlamydia en Neisseria (30 jaar), maar de gemiddelde leeftijd bij de Candida albicans-positieve vrouwen (34 jaar) lag veel hoger dan die bij de Chlamydia/Neisseria-positieve vrouwen (25 jaar). Referenties 1. Berger ThHD, Boon ME. Leidse schimmeldata. In: Jaarverslag 2004 van het Leids Cytologisch en Pathologisch Laboratorium. Leiden: Coulomb Press Leyden, 2005, pp 57-64. 2. Boon ME, Middag-Broekman JHFF. Nagel-schimmels in de Leidse praktijk. In: Jaarverslag 2003 van het Leids Cytologisch en Pathologisch Laboratorium. Leiden: Coulomb Press Leyden, 2004, pp 33-47. 3. Buimer M, Doornum GJ van, Ching S, Peerbooms PG, Plier PK, Ram D, Lee HH. Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae by ligase chain reaction-based assays with clinical specimens from various sites: implications for diagnostic testing and screening. J Clin Microbiol 1996;34:2395-2400. 4. Engberts M, Vinkers M, Korporaal H. Candida: diagnostiek en behandeling in de huisartspraktijk. In: Jaarverslag 2004 van het Leids Cytologisch en Pathologisch Laboratorium. Leiden: Coulomb Press Leyden, 2005, pp 13-20. 5. Koedijk FDH, Vriend HJ, Veen MG van, Op de Coul ELM, Broek IVF van den, Sighem AI van, Verheij RA, Sande MAB van der. Sexually transmitted infections, including HIV, in the Netherlands in 2008. RIVM report nr: 210261005/2009. www.rivm.nl/bibliotheek/rapporten/210261005.html.

B6. MOLECULAIRE PATHOLOGIE, SOA-DIAGNOSTIEK EN CANDIDA111 6. Kramer GC, Korporaal H. Leidse moleculair-biologische HPV-diagnostiek. In: Jaarverslag 2003 van het Leids Cytologisch en Pathologisch Laboratorium. Leiden: Coulomb Press Leyden, 2004, pp 25-32. 7. Veer E van der. DNA-diagnostiek van humane herpesvirussen op het LCPL. In: Jaarverslag 2002 van het Leids Cytologisch en Pathologisch Laboratorium. Leiden: Coulomb Press Leyden, 2003, pp 62-82.

112

C. PUBLICATIES EN ABSTRACTS

C. Publicaties en Abstracts Wetenschappelijke publicaties 2008 Reguliere publicaties 1. Boon ME, Kok LP. Theory and practice of combining coagulant fixation and microwave histoprocessing. Biotech Histochem 2008; 83: 261-277. 2. Engberts MK, Korporaal H, Vinkers M, van Belkum A, van Binsbergen J, Lagro-Janssen T, Helmerhorst T, van der Meijden W. Vulvovaginal candidiasis: diagnostic and therapeutic approaches used by Dutch general practitioners. Eur J Gen Pract 2008; 14: 30-33. 3. Fulciniti F, Frangella C, Staiano M, La Vecchia F, Botti G, Demuru A, Magliulo G, Boon ME. Air-dried smears for optimal diagnostic immunocytochemistry. Acta Cytol 2008; 52: 178-186. 4. Klomp JM, Boon ME, Van Haaften M, Heintz AP. Cytologically diagnosed Gardnerella vaginalis infection and cervical (pre)neoplasia as established in population-based cervical screening. Am J Obstet Gynecol 2008; 199: 480.e1-5. 5. Klomp JM, Verbruggen BSM, Korporaal H, Boon ME, Jong P de, Kramer GC, Haaften M van, Heintz APM. Gardnerella vaginalis and Lactobacillus sp in liquid-based cervical samples in healthy and disturbed vaginal flora using cultivation-independent methods. Diagn Cytopathol 2008; 36: 277284. Abstracts 1. Boon ME. Histocytology, Cervex-Brush sampling, and BoonFix. XV Latin American Congress of Cytology, São Paulo, Brazilië, 1-5 december 2008. 2. Boon ME, Boon LM, Vermeulen CFW. Analyses die van nut kunnen zijn voor de optimalisering van HPV-vaccinatieprogramma’s, gebaseerd op data betreffende HPV en (pre)neoplasie van de cervix bij Surinaamse vrouwen. Pathologendagen, Zeist, 22-23 april 2008. 3. Boon ME, Klomp JM, Verbruggen BSM, Korporaal H, Jong P de, Kramer GC, Haaften M van, Heintz APM. Evaluating the health of the vaginal flora using cultivation-independent methods. 3rd International Congress of Pathology, Barcelona, Spanje, 17-22 mei 2008.

C. PUBLICATIES EN ABSTRACTS

113

4. Boon ME, Ouwerkerk-Noordam E, Brons-Holloway PA, Risse EKJ, MeijerMarres EM, Duineveld SM. The biomarker p16INK4a on paraffin sections prepared from cervical brush samples highlights nuclear changes resulting in an unquestionable cytohistological diagnosis. 34th European Congress of Cytology, Rovaniemi, Finland, 15-18 juni 2008. 5. Boon ME, Risse EKJ. Cutting it thin: exploiting the residual thin layer sample for histocytology. The boons of the formalin free fixative BoonFix. 34th NSH (National Society for Histotechnology) Annual Symposium/Convention, Pittsburgh, PA, USA, 12-18 september 2008. 6. Idzerda-Hoogeveen MM, Holierhoek JP, Ouwerkerk-Noordam E, MeijerMarres EM, Risse EKJ, Boon ME. Clinical complaints and cytohistology. 34th European Congress of Cytology, Rovaniemi, Finland, 15-18 juni 2008. 7. Ouwerkerk-Noordam E, Boon ME, Risse EKJ. Biomarkers on paraffin sections prepared from the residual material of liquid-based cervical cytology, highlight cancerous tissue fragments overlooked in a false-negative Papanicolaou-stained ThinPrep® slide. 34th European Congress of Cytology, Rovaniemi, Finland, 15-18 juni 2008. 8. Risse EKJ, Ouwerkerk-Noordam E, Meijer-Marres EM, Boon ME. Exploiting the residual cervical thin layer sample through cytohistology. 34th European Congress of Cytology, Rovaniemi, Finland, 15-18 juni 2008. 9. Risse EKJ, Ouwerkerk-Noordam E, Meijer-Marres EM, Boon ME. The additional value of cytohistology and biomarkers from the residual of thin layer cervical samples. Pathologendagen, Zeist, 22-23 april 2008.

Overige vakpublicaties 2008 1. Boon ME. De invloed van de Australische epidemiologe Davey op de Evidence van de dunnelaag. VAP-Visie 2008; 3: 33-45. 2. Boon ME. Leven graag! (Column). Supplement 2008; nr 1, januari, p 50. 3. Boon ME, Nagel MPM, Korporaal H. Kunnen vaginale lactobacillus-zetpillen effectief zijn? Supplement 2008; nr 7, juli, p 38-43. 4. Dutrieux RP. Kwaadaardige acrale nagelafwijkingen; Is er een rol voor pedicures in de vroeg-diagnostiek. De Medische Voet 2008; 8; 16-17. 5. Meijer-Marres EM, Boon ME, Ouwerkerk-Noordam E. Van neuraal netwerken naar de Imager: een verder stap voorwaarts in het computerondersteund screenen. VAP Visie 2008; 7: 53-55. 6. Michaels P, Gils J van. A study of natural fungus inhibitors; one year of treating mycosis in a Leiden practice. Household and Personal Care Today 2008; n 1: 52-55.

114

C. PUBLICATIES EN ABSTRACTS

Selectie abstracts 2008 C1 Analyses die van nut kunnen zijn voor de optimalisering van HPV-vaccinatieprogramma’s, gebaseerd op data betreffende HPV en (pre)neoplasie van de cervix bij Surinaamse vrouwen M.E. Boon, L.M. Boon, C.F.W. Vermeulen Objective: HPV en (pre)neoplasie staan in het centrum van de belangstelling, zeker nu de mogelijkheid van HPV-vaccinatie er is. Maar hoe staat het met HPV en (pre)neoplasie bij de Surinaamse vrouwen die naar Nederland zijn verhuisd? In de database van het bevolkingsonderzoek (BO) van Regio West zijn de KOPACuitslagen van deze Surinaamse immigranten te identificeren. We kunnen in de grote databestanden de uitstrijkjes met KOPAC O1, koilocytose, een HPV-gerelateerde celverandering die tijdens het screenproces gedocumenteerd wordt in de KOPAC, terugvinden. Zo konden wij vaststellen dat deze Surinaamse immigranten een hogere prevalentie voor koilocytose hebben. In Suriname zelf is de incidentie van cervixcarcinoom boven de 26 per 100.000 vrouwen. In het licht van die hoge incidentie is het interessant gegevens te verzamelen over de prevalentie van koilocytose en (pre)neoplasie bij Surinaamse vrouwen die niet naar Nederland zijn geëmigreerd maar woonachtig zijn in hun geboorteland. Methods: Van het BO Regio West kunnen we beschikken over de KOPAC-uitslagen van 7.613 vrouwen die in Suriname zijn geboren. Van het Surinaamse bevolkingsonderzoek beschikken wij over KOPAC-uitslagen van 890 Surinaamse vrouwen. De Odds ratios (ORs) en age-adjusted ORs met een 95% confidence interval (CI) werden berekend, waarbij de uitstrijkjes met respectievelijk O6 (geen afwijkingen in de O) en P1 (normaal in de P) als referentie dienden. Results: De age-adjusted ORs voor O1 (HPV) en preneoplasie waren lager voor de geïmmigreerde Surinaamse vrouwen. Er was een duidelijk verband tussen koilocytose en preneoplasie in de uitstrijk. Conclusion: De afgenomen HPV-prevalentie en cytoscores voor preneoplasie bij Surinaamse immigranten kunnen een aanwijzing zijn dat zowel de Surinaamse vrouwen als hun manlijke partners zich aan Nederland hebben aangepast wat betreft hun seksuele lifestyle. De analyse van deze gegevens gecombineerd met kennis uit voorgaande studies wijst erop dat zowel HPV als cervicale preneoplasie in een subpopulatie sterk beïnvloed wordt door de seksuele praktijk van de man, de drager van HPV. De seksuele lifestyle van de vrouw, het slachtoffer van HPV, speelt ook een rol bij de verspreiding van HPV, maar in veel mindere mate. In dit verband is het zelfs in te denken dat het effectiever is jongens tegen HPV te vaccineren dan meisjes. Abstract opgesteld voor: Pathologendagen, Zeist, 22-23 april 2008.

C. PUBLICATIES EN ABSTRACTS

115

C2 Evaluating the health of the vaginal flora using cultivationindependent methods M.E. Boon, J.M. Klomp, B.S.M. Verbruggen, H. Korporaal, P. de Jong, G.C. Kramer, M. van Haaften, A.P.M. Heintz Background: A healthy vaginal flora is of paramount importance. Our objective was to determine the morphotype of the adherent bacteria in liquid-based cytology (LBC) in smears with healthy and disturbed vaginal flora and to use PCR technology on the same fixed cell sample to establish DNA patterns of the 16S RNA genes of the bacteria in the sample. Method: Thirty samples were randomly selected from a large group of cervical cell samples suspended in a commercial coagulant fixative (‘BoonFix’). PCR was used to amplify DNA of five bacterial species: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus jensenii, Gardnerella vaginalis and Mycoplasma hominis. The LBC slides were then analyzed by light microscopy to estimate bacterial adhesion. Result: DNA of lactobacilli was detected in all cell samples. Seventeen smears showed colonization with Gardnerella vaginalis (range 2.6 × 102 - 3.0 × 105 bacteria/µL BoonFix sample). Two cases were identified as dysbacteriotic with high DNA values for Gardnerella vaginalis and low values for Lactobacillus crispatus. The sample with the highest concentration for the (unhealthy) bacteria Gardnerella vaginalis showed an unequivocal Gardnerella infection. This cultivation independent method reveals a strong inverse relationship between Gardnerella vaginalis (unhealthy flora) and Lactobacillus crispatus (healthy flora). Conclusion: This study indicates that the vaginal flora in liquid-based cervical samples can be evaluated because these samples are suitable for quantitative PCR analysis allowing evaluation of the health of the vaginal flora. Abstract opgesteld voor: 3rd International Congress of Pathology, Barcelona, Spanje, 17-22 mei 2008.

C3 Cutting it thin: exploiting the residual thin layers sample for histocytology. The boons of the formalin free fixative BoonFix M.E. Boon, L.P. Kok, E.K.J. Risse In thin layer cytology only 20% of the sample is used to prepare the cytology slide. We evaluated the usefulness of preparing Shandon Cytoblock sections from the residual (fixed in the formalin free fixative BoonFix) left in the vial of the liquid-based cervical cytology specimen (Cytyc). In cases with equivocal cells or thick cell groups the Cytoblock method was applied, giving tissue fragments for histological classification. Furthermore, immunohistochemistry was carried out on the 4 µm thin sections, resulting in highlighting

116

C. PUBLICATIES EN ABSTRACTS

pictures. Routinely, Ki-67 (proliferating marker) and p16 (indicator for HPV infection) were used. False negativity was avoided in liquid-based cytology specimens in which cancer cells were hidden beneath a lot of blood or lying in thick cell groups. Also a case of adenocarcinoma in situ of the cervix (AIS) of the mucinous type was in this manner discovered and a case of severe dysplasia in an atrophic sample. Cytoblock specimen was also useful to avoid false positivity in a case of endometrial tubal metaplasia mimicking AIS cytologically. The ciliated cells were positive for p16, but showed no atypia. Other markers were used on indication, such as synaptofysin and chromogranin in cases with suspicion of neuroendocrine or small cell cancer. When there was a differential diagnosis of primary/metastatic cancer to the cervix or cervical/endometrial cancer, keratin 7/keratin 20 and CEA were very helpful. The remainder of liquid-based cytology is of great value for histocytological diagnosis in equivocal or unsatisfactory liquid-based cervical cytology specimens to avoid false-negative, false-positive and questionable diagnoses. This feat was achieved because the three-dimensional epithelial fragments fixed in the formalin free fixative BoonFix were cut into thin sections, allowing detailed study of each nucleus. The latter is impossible when these fragments end up in the cytology slides. Formalin-free fixation results in excellent morphology combined with optimal immunocytochemistry, as we also have experienced in our diagnosis of over 30,000 skin biopsies. In the workshop cases will be discussed of our selection of over 5,000 specimen. Also the details of the technique using microwave paraffin impregnation will be treated in detail. 34th NSH (National Society for Histotechnology) Annual Symposium/Convention, Pittsburgh, PA, USA, 12-18 september 2008.

C4 The biomarker p16INK4a on paraffin sections prepared from cervical brush samples highlights nuclear changes resulting in an unquestionable cytohistological diagnosis M.E. Boon, E. Ouwerkerk-Noordam, P.A. Brons-Holloway, E.K.J. Risse, E.M. Meijer-Marres, S.M. Duineveld Objective: The cyclin-dependent kinase inhibitor p16 is often overexpressed in high-risk human papillomavirus (hrHPV) transformed cells. The objective of this study was to optimize the morphology of p16 positive atypical and (pre)neoplastic cells in paraffin cytoblock sections with the aim to minimize equivocal diagnoses on cytology samples. Materials and methods: Patients with negative cytology or within normal limits (WNL) (n = 38), atypical squamous cells of undetermined significance (ASCUS) (n = 25) and high-grade squamous intraepithelial lesion (HSIL) (n = 16) were

C. PUBLICATIES EN ABSTRACTS

117

selected. The residual material of the cervical brush samples was processed to cytoblock paraffin sections and stained for p16. The cytohistological diagnosis of the p16 stained paraffin sections was based on the cytological and histological morphology. Results: Of the 38 cytologically negative cases, only four contained a few faintly positive p16 cells. Of the 25 ASCUS cases, one was upgraded to low-grade squamous intraepithelial lesion (LSIL). All 16 HSIL cases contained cells with outspoken diffuse positive immunostaining, highlighting chromatin clumping in the (pre)malignant cells. In the paraffin sections the tissue fragments showed an architecture consistent with HSIL. The nuclear cytoplasmic ratio in the HSIL was severely disturbed. Conclusion: Cervical brush samples allow an unequivocal cytohistological diagnosis based on the (pre)malignant nuclear changes highlighted by the p16 staining of the paraffin sections. Abstract opgesteld voor: 34th European Congress of Cytology, Rovaniemi, Finland, 15-18 juni 2008.

C5 Clinical complaints and cytohistology M.M. Idzerda-Hoogeveen, J.P. Holierhoek, E. Ouwerkerk-Noordam, E.M. Meijer-Marres, E.K.J. Risse, M.E. Boon Objective: The purpose of this study was to establish the relationship between clinical complaints, cervical samples and the final histological diagnoses. Material and methods: From 1,368 patients with clinical complaints in general practice, a cervical thin layer suspension was prepared. This material was handled to make paraffin blocks, using the Shandon Cytoblock® method and the Pathos (Milestone, Italy). From each block several 4 µm sections were cut and stained for Papanicolaou and immunostained for Ki-67 (proliferation marker). Results: From the 1,368 women with complaints 22 had a histological diagnosis of CIN I, II, III, or carcinoma. The most prominent complaint was postcoital bleeding (583). Of these 583 women 10 had a CIN lesion, and 3 a carcinoma (1 squamous cell carcinoma, 1 adenocarcinoma of the endocervix, and 1 adenocarcinoma of the endometrium). The case with endometrial carcinoma and postcoital bleeding concerned extension of the carcinoma along the endocervical canal. The latter might explain the complaints. Conclusion: Although this is a relative small study, we conclude that bleeding symptoms are very important and should not be neglected. In these cases it is wise to use cell blocks for a cytohistological and immunohistological conclusion to achieve a cast iron diagnosis. Abstract opgesteld voor: 34th European Congress of Cytology, Rovaniemi, Finland, 15-18 juni 2008.

118

C. PUBLICATIES EN ABSTRACTS

C6 Biomarkers on paraffin sections prepared from the residual material of liquid-based cervical cytology, highlight cancerous tissue fragments overlooked in a false-negative Papanicolaou-stained ThinPrep® Slide E. Ouwerkerk-Noordam, M.E. Boon, E.K.J. Risse Objective: In the Leiden Cytology and Pathology Laboratory we use the Shandon Cytoblock® technique to optimize our cytological diagnoses. In this case of an overlooked carcinoma we used the residual material of the original ThinPrep specimen to see if we really missed the carcinoma cells. Materials and methods: Early 2007 we were informed that a patient, who in our laboratory had a negative ThinPrep slide in December 2006, was diagnosed with an adenocarcinoma and HSIL. Rescreening of the ThinPrep slide showed a few thick cell groups, on which no classifiable diagnosis could be established. As we preserve the vials with the residual material after the ThinPrep slide is made, we processed it into a paraffin block, using the Shandon Cytoblock method and the Pathos (Milestone, Italy). From each block several 4 µm sections were cut and stained for Papanicolaou, and the biomarkers p16INK4a and Ki-67 were applied. Results: In the histological sections we encountered numerous small tissue fragments with very atypical cells suggestive for carcinoma. Immunostaining with p16INK4a showed a strong and diffuse positivity in cytoplasm and nuclei, the nuclei were strongly positive for Ki-67. Conclusion: Cytohistology and immunohistochemistry on the residual of ThinPrep specimen can be very helpful in avoiding a false-negative diagnosis in liquid-based cervical cytology. Abstract opgesteld voor: 34th European Congress of Cytology, Rovaniemi, Finland, 15-18 juni 2008.

C7 Exploiting the residual cervical thin layer sample through cytohistology E.K.J. Risse, E. Ouwerkerk-Noordam, E.M. Meijer-Marres, M.E. Boon Objective: The objective of the current study was to evaluate the usefulness of preparing Shandon Cytoblock® specimens from the residual left in the vial of the liquid-based cervical cytology specimen (Cytyc). Materials and methods: In cases with equivocal cells or thick cell groups the Cytoblock method was applied, giving tissue fragments for histological classification. Furthermore, immunohistochemistry was carried out on the 4 µm thin sections, resulting in highlighting pictures. Routinely, Ki-67 (proliferating marker) and p16 (indicator for HPV infection) were used. Results: False negativity was avoided in liquid-based cytology specimens in which

C. PUBLICATIES EN ABSTRACTS

119

cancer cells were hidden beneath a lot of blood or lying in thick cell groups. Also a case of adenocarcinoma in situ of the cervix (AIS) of the mucinous type was in this manner discovered and a case of severe dysplasia in an atrophic sample. Cytoblock specimen was also useful to avoid false positivity in a case of endometrial tubal metaplasia mimicking AIS cytologically. The ciliated cells were positive for p16, but showed no atypia. Other markers were used on indication, such as synaptofysin and chromogranin in cases with suspicion of neuroendocrine or small cell cancer. When there was a differential diagnosis of primary/metastatic cancer to the cervix or cervical/endometrial cancer, keratin 7/keratin 20 and CEA were very helpful. Conclusion: The remainder of liquid-based cytology is of great value for cytohistological diagnosis in equivocal or unsatisfactory liquid-based cervical cytology specimens to avoid false-negative, false-positive and questionable diagnoses. Abstract opgesteld voor: 34th European Congress of Cytology, Rovaniemi, Finland, 15-18 juni 2008.

C8 The additional value of cytohistology and biomarkers from the residual of thin layer cervical samples E.K.J. Risse, E. Ouwerkerk-Noordam, E.M. Meijer-Marres, M.E. Boon Objective: In cervical lesions the Ki-67 protein plays an important role in cell proliferation. The p16INK4a (a cyclin-dependent kinase inhibitor) is a gene product, that is overexpressed in abnormal cervical epithelia. The objective of this study was to find out the usefulness of the residual from the thin layer cervical samples (Cytyc) for cytohistology (Shandon Cytoblock® ) and immunohistochemistry. Methods: In 2006 there were 27 carcinomas (16 squamous cell carcinomas, 8 endocervical carcinomas, 1 endometrial carcinoma, 1 neuroendocrine carcinoma and 1 adenosarcoma) diagnosed in liquid-based cytology specimens using current brush methods (Cervex-Brush® Combi, Rovers Medical Devices, Oss, the Netherlands). The vials still containing the brush were placed in a shaker for ten minutes to dislodge the material trapped between the bristles. The residual sampling fluid was used to prepare Cytoblock® paraffin sections (Shandon Cytoblock® Preparation System) which were stained with Papanicolaou-staining and immunostaining for Ki-67 and p16. On indication other markers were used for instance Synaptofysin, Chromogranin, CK7 and CK20. Results: The thin layer cervical samples often contained thick cell groups in which the nuclei were blurred and the architectural features were not clear. In the Cytoblock sections carcinomatous tissue fragments could be studied in detail. The biomarkers Ki-67 and p16 were very helpful with their staining patterns highlighting the architecture of the tumor fragments. In a case of neuroendocrine carcinoma diagnosed in 2006 strong positivity for Chromogranin was found. Also the cytohistology of the residual material of a previous 2004 cervical sample taken from the archive was strongly Chromogranin positive. In this context it is important to mention, that the diagnosis cancer was missed in the 2004 thin layer slide.

120

C. PUBLICATIES EN ABSTRACTS

Conclusion: It is a well-known fact that cervical smears from women with cancer of the uterus frequently are missed in screening practice. To avoid false negativity we recommend to exploit the residual of equivocal or unsatisfactory liquid-based cervical cytology specimens for cytohistological and immunohistochemical diagnosis. Abstract opgesteld voor: Pathologendagen, Zeist, 22-23 april 2008.