SZE.WAMDI DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS. Süle Judit

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS

Süle Judit

Mosonmagyaróvár 2016

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

SZÉCHENYI ISTVÁN EGYETEM MEZŐGAZDASÁG- ÉS ÉLEMISZER-TUDOMÁNYI KAR ÉLELMISZER-TUDOMÁNYI INTÉZET MOSONMAGYARÓVÁR Wittmann Antal Növény-, Állat- és Élelmiszer-tudományi Multidiszciplináris Doktori Iskola Pulay Gábor Élelmiszer-tudományi Doktori Program Doktori Iskola vezetője: Prof. Dr. Neményi Miklós, MHAS egyetemi tanár Programvezető: Prof. habil. Dr. Szigeti Jenő, CSc egyetemi tanár Témavezető: Prof. Dr. habil. Varga László, PhD egyetemi tanár TEJSAVBAKTÉRIUMOK ÉS BIFIDOBAKTÉRIUMOK ÉLŐSEJT-SZÁMÁNAK SZELEKTÍV MEGHATÁROZÁSÁRA SZOLGÁLÓ MÓDSZEREK ÖSSZEHASONLÍTÓ ÉRTÉKELÉSE ÉS ALKALMAZÁSA SAVANYÚ TEJTERMÉKEK MIKROBIOLÓGIAI MINŐSÉGÉNEK ELLENŐRZÉSÉRE

SÜLE JUDIT

Mosonmagyaróvár 2016 2

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Tejsavbaktériumok és bifidobaktériumok élősejt-számának szelektív meghatározására szolgáló módszerek összehasonlító értékelése és alkalmazása savanyú tejtermékek mikrobiológiai minőségének ellenőrzésére Írta: Süle Judit Készült a Széchenyi István Egyetem Mezőgazdaság- és Élelmiszer-tudományi Kar Wittmann Antal Növény-, Állat- és Élelmiszer-tudományi Multidiszciplináris Doktori Iskola Pulay Gábor Élelmiszer-tudományi Doktori Programja keretében Témavezető: Prof. Dr. habil. Varga László, PhD Elfogadásra javaslom (igen / nem) (aláírás) A jelölt a doktori szigorlaton…………%-ot ért el. Mosonmagyaróvár, ……………………………… .……………………………… a Szigorlati Bizottság Elnöke Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom (igen/nem) Első bíráló (Dr. ………………………………) igen/nem (aláírás) Második bíráló (Dr. ………………………………) igen/nem (aláírás) Esetleg harmadik bíráló (Dr. ………………………………) igen/nem (aláírás) A jelölt az értekezés nyilvános vitáján ……………%-ot ért el. Mosonmagyaróvár, ……………………………… A Bírálóbizottság elnöke Doktori (PhD) oklevél minősítése………………… Az EDT elnöke

3

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

“Légy bátor és erős, és kezdj hozzá, semmit ne félj, és ne rettegj; mert az Úr Isten, az én Istenem veled lészen, téged el nem hagy, tőled el sem távozik, míglen elvégzed az Úr háza szolgálatának minden művét.” 1 Krón 28, 20 “És ezt mondá nékem: Elég néked az én kegyelmem; mert az én erőm erőtlenség által végeztetik el.” 2 Kor 12, 9 “Szemeimet a hegyekre emelem, onnan jön az én segítségem. Az én segítségem az Úrtól van, aki teremtette az eget és földet. Nem engedi, hogy lábad inogjon; nem szunnyad el a te őriződ. Ímé, nem szunnyad, és nem alszik az Izráelnek őrizője! Az Úr a te őriződ, az Úr a te árnyékod a te jobbkezed felől. Nappal a nap meg nem szúr téged, sem éjjel a hold. Az Úr megőriz téged minden gonosztól, megőrzi a te lelkedet. Megőrzi az Úr a te ki- és bemeneteledet, mostantól fogva mindörökké!”

4

Zsolt 121, 1-8

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Tartalomjegyzék TARTALOMJEGYZÉK KIVONAT ____________________________________________________ 8 ABSTRACT __________________________________________________ 10 1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉS ______________________________ 11 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ___________________________________ 15 2.1. A tejsavbaktériumok általános jellemzése ____________________ 15 2.1.1. A tejsavbaktériumok története és rendszertani felosztása ______ 17 2.1.2. A Lactobacillus, a Streptococcus és a Bifidobacterium nemzetség jellemzése ________________________________________________ 21 2.1.2.1. A Lactobacillus nemzetség jellemzése és szerepe az élelmiszeriparban ________________________________________ 21 2.1.2.2. A Streptococcus nemzetség jellemzése _________________ 25 2.1.2.3. A Bifidobacterium nemzetség jellemzése _______________ 26 2.2. Probiotikumok __________________________________________ 28 2.2.1. A probiotikumok definíciója_____________________________ 28 2.2.2. A probiotikumok hatásmechanizmusa, jótéteményei __________ 30 2.2.3. A probiotikumok megítélése az Európai Unióban ____________ 32 2.2.4. Savanyú tejtermékekben előforduló hasznos mikroorganizmusok és a probiotikus tejtermékek jellemzése ___________________________ 32 2.3. A prebiotikumok ________________________________________ 36 2.4. A tej ___________________________________________________ 37 2.4.1. A kecsketej és a juhtej jellemzése ________________________ 40 2.4.2. A tevetej ____________________________________________ 41 2.5. Mézek jellemzése ________________________________________ 43 2.5.1. Az akác-, a hárs-, a gesztenye-, a vegyes virág- és az erdei méz jellemzése ________________________________________________ 45 2.6. Tejsavbaktériumok és bifidobaktériumok szelektív elkülönítése _ 47 2.7. Tejsavbaktériumok és bifidobaktériumok kimutatása molekuláris biológiai módszerekkel _______________________________________ 50 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ________________________________ 53 3.1. Tejsavbaktériumok és bifidobaktériumok szelektív kimutatása __ 53 3.1.1. A kísérletekbe bevont baktériumtörzsek____________________ 53 3.1.2. Törzsfenntartás _______________________________________ 55 3.1.3. A szelektív tenyésztés tápközegei és elkészítésük ____________ 59 3.1.3.1. Bakteriológiai pepton (0,1%) ________________________ 59 3.1.3.2. CASO-agar ______________________________________ 59 3.1.3.3. M17 agar Terzaghi szerint ___________________________ 60 3.1.3.4. MRS pH 5,4 agar és MRS pH 6,2 agar _________________ 60 3.1.3.5. Clindamycinnel és ciprofloxacinnal kiegészített De Man‒Rogosa–Sharpe agar (MRS‒CC agar) ___________________ 60

5

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Tartalomjegyzék 3.1.3.6. Lítium‒mupirocinnal (MUP) kiegészített transzgalaktozilált oligoszacharid (TOS) agar (TOS–MUP agar) __________________ 61 3.1.4. Élősejtszám-meghatározás ______________________________ 62 3.2. Tehén-, juh-, kecske- és tevetej alapú probiotikus savanyú tejtermékek előállítása és vizsgálata ____________________________ 63 3.2.1. Alapanyagtejek _______________________________________ 63 3.2.2. Starterkultúra ________________________________________ 64 3.2.3. Termékgyártás _______________________________________ 64 3.2.4. Mikrobiológiai vizsgálatok ______________________________ 65 3.2.4.1. A Streptococcus thermophilus CHCC 742/2130 számbeli meghatározása __________________________________________ 65 3.2.4.2. A Lactobacillus acidophilus LA-5 számbeli meghatározása 66 3.2.4.3. A Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 számbeli meghatározása __________________________________________ 66 3.2.4.4. Az élesztőgomba- és penészgomba-szám meghatározása ___ 67 3.2.4.5. Az Escherichia coli és a kóliformok számának meghatározása ______________________________________________________ 67 3.2.5. pH-mérés ___________________________________________ 68 3.3. Tehéntejből és tevetejből készített natúr és akácmézes probiotikus savanyú tejtermékek előállítása és vizsgálata _____________________ 68 3.3.1. Alapanyagtejek _______________________________________ 68 3.3.1.1. Tevetej __________________________________________ 68 3.3.1.2. Tehéntej _________________________________________ 69 3.3.2. Akácméz (Robinia pseudoacacia L.) ______________________ 69 3.3.3. Starterkultúra ________________________________________ 70 3.3.4. Termékgyártás _______________________________________ 70 3.3.5. Mikrobiológiai vizsgálatok ______________________________ 70 3.3.6. pH-mérés ___________________________________________ 71 3.4. Mézek hasznos és káros mikroorganizmusokra gyakorolt hatásának vizsgálata agardiffúziós lyukteszttel ____________________________ 71 3.4.1. Mézek ______________________________________________ 71 3.4.2. Mikroorganizmus teszttörzsek ___________________________ 72 3.4.3. Agardiffúziós lyuktesztek _______________________________ 75 3.4.3.1. Mikrobaszuszpenziók (inokulum) elkészítése ______________ 76 3.4.3.2. Agarlemezek elkészítése ______________________________ 77 3.4.3.3. Mézminták és hígításaik elkészítése _____________________ 77 3.4.3.4. Inkubálás és a gátlási, ill. serkentési zónák meghatározása ____ 78 3.5. Termékfejlesztés és érzékszervi bírálatok ____________________ 78 3.5.1. Tevetejből és tehéntejből akácméz hozzáadásával készülő probiotikus savanyú tejtermékek kifejlesztése ____________________ 78 3.5.2. Érzékszervi bírálat ____________________________________ 81 3.6. Matematikai‒statisztikai értékelés __________________________ 83 4. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK __________________________ 84 4.1. Tejsavbaktériumok és bifidobaktériumok szelektív kimutatása __ 84

6

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Tartalomjegyzék 4.2. Tehén-, juh-, kecske- és tevetej alapú probiotikus savanyú tejtermékek előállítása és vizsgálata ____________________________ 90 4.2.1. Streptococcus thermophilus CHCC 742/2130 élősejt-szám változása a négyféle tejből készült probiotikus savanyú tejtermékek hűtve tárolása során ____________________________________________________ 90 4.2.2. Lactobacillus acidophilus LA-5 élősejt-szám változása a négyféle tejből készült probiotikus savanyú tejtermékek hűtve tárolása során ___ 92 4.2.3. Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 élősejt-szám változása a négyféle tejből készült probiotikus savanyú tejtermékek hűtve tárolása során ____________________________________________________ 94 4.2.4. A négyféle tejből készült probiotikus savanyú tejtermékek káros mikrobiotájának vizsgálata ___________________________________ 97 4.2.5. A négyféle tejből készült probiotikus savanyú tejtermékek pHértékének változása a hűtve tárolás során ________________________ 97 4.3. Tehéntejből és tevetejből készített natúr és akácmézes probiotikus savanyú tejtermékek előállítása és vizsgálata _____________________ 97 4.3.1. Streptococcus thermophilus CHCC 742/2130 élősejt-számának hűtve tárolás alatti alakulása tehéntejből, illetve tevetejből készített kontroll és akácmézes probiotikus savanyú tejtermékekben _________ 98 4.3.2. Lactobacillus acidophilus LA-5 élősejt-számának hűtve tárolás alatti alakulása tehéntejből, illetve tevetejből készített kontroll és akácmézes probiotikus savanyú tejtermékekben _________________ 100 4.3.3. Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 élősejt-számának hűtve tárolás alatti alakulása tehéntejből, illetve tevetejből készített kontroll és akácmézes probiotikus savanyú tejtermékekben ________ 102 4.3.4. Tevetejből, illetve tehéntejből készített kontroll és akácmézes probiotikus savanyú tejtermékek mikrobiológiai állapotának és pHértékének változása a hűtve tárolás alatt ________________________ 104 4.4. Mézek hasznos és káros mikroorganizmusokra gyakorolt hatásának vizsgálata agardiffúziós lyukteszttel ___________________________ 104 4.4.1. A vizsgált mézek káros baktériumokra gyakorolt hatása ______ 105 4.4.1.1. Gram-negatív baktériumok _________________________ 105 4.4.1.2. Gram-pozitív baktériumok _________________________ 109 4.4.2. A vizsgált mézek élesztő- és penészgombákra gyakorolt hatása 110 4.4.3. A vizsgált mézek hasznos mikroorganizmusokra gyakorolt hatása _______________________________________________________ 111 4.5. Tevetejből és tehéntejből akácméz hozzáadásával készített probiotikus savanyú tejtermékek érzékszervi bírálata ____________ 114 5. KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK ____________________ 120 6. ÖSSZEFOGLALÁS ________________________________________ 123 7. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK _________________________ 126 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS___________________________________ 128 8. IRODALOMJEGYZÉK _____________________________________ 130 MELLÉKLETEK ____________________________________________ 149

7

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Kivonat KIVONAT Savanyú tejtermékek előállításához alkalmazott tejsavbaktérium és bifidobaktérium fajok (törzsek) szelektív tenyésztésére szolgáló módszerek összehasonlítása

során

megállapítottam,

hogy

a

lítium-mupirocinnal

kiegészített, transzgalaktozilált oligoszacharidokat tartalmazó (TOS‒MUP) agar lehetővé tette a bifidobaktériumok élősejt-számának szelektív meghatározását tejsavbaktérium fajok jelenlétében. A Lactobacillus acidophilus elkülönítését leghatékonyabban a 45°C-on, anaerob körülmények között 48 óráig inkubált 5,4-es pH-jú MRS agar biztosította. A clindamycinnel és ciprofloxacinnal kiegészített MRS (MRS‒CC) agar szintén alkalmasnak bizonyult a Lb. acidophilus szelektív elkülönítésére, amennyiben Lb. casei egyáltalán nem volt jelen, vagy csak a Lb. acidophilus-ét nem meghaladó mennyiségben volt kimutatható a termékben. Joghurt esetében a termékazonos mikroorganizmusok szelektív elkülönítése úgy vált lehetővé, ha a mintákat M17 agaron, 37°C-on, 48 óráig, aerob módon (Streptococcus thermophilus), ill. 6,2-es pH-jú MRS agaron, 37°C-on, 72 óráig anaerob körülmények között (Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus) inkubáltam. A tehéntej mellett tevetejből, juhtejből és kecsketejből is sikerült előállítanom a Magyar Élelmiszerkönyv vonatkozó előírásainak megfelelő minőségű ABT-típusú savanyú tejtermékeket, amelyek 4°C-on tárolva minimum 6 hétig kellő számú (> 106 cfu/ml) Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 és Lb. acidophilus LA-5 élősejtet tartalmaztak. Az akácméz-kiegészítés (5%) csökkentette (P < 0,05), sőt meg is akadályozta a B. animalis subsp. lactis BB-12 pusztulását tehéntej-, ill. tevetejalapú probiotikus savanyú tejekben a termékek 4°C-on történő öthetes tárolása során. Agardiffúziós lyuktesztek során az akác-, a hárs-, a vegyes virág-, az erdei- és a gesztenyeméz 25-100%-os oldatai gátolták a Pseudomonas

8

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Kivonat aeruginosa HNCMB 170001, a Salmonella enterica subsp. arizonae HNCMB 42021 és az Escherichia coli HNCMB 35035 szaporodását, miközben a mézek többsége ugyanilyen koncentrációban stimulálta bizonyos tejsavbaktériumtörzsek (Lb. acidophilus ATCC 314, Lb. casei ATCC 334 és S. thermophilus ATCC 19258) szaporodását. Tevetejből, ill. tehéntejből készült natúr és 5% akácmézzel kiegészített probiotikus savanyú tejtermékek hathetes hűtve tárolása közben elvégzett érzékszervi vizsgálatok során a tevetej alapú termékek kedveltsége mindvégig mérsékelt volt. Megfelelő érzékszervi tulajdonságok kialakítása érdekében érdemes

lenne

a

továbbiakban

a

tevetej

savanyítását

klasszikus

joghurtkultúrával végezni, valamint más jellegű (fűszeres, sós) ízesítőanyagok hatását is megvizsgálni.

9

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Abstract ABSTRACT

Comparative evaluation of conventional plating methods for selective enumeration of lactic acid bacteria and bifidobacteria and their application in microbiological quality control of fermented milks

The suitability of eight plating methods was tested for determining the viable counts of a total of 13 bifidobacteria and lactic acid bacteria strains commonly used to make fermented milks. The following incubation conditions proved to be optimal for selective enumeration of culture organisms in ABT-type fermented

milks:

anaerobiosis)

for

MRS‒clindamycin‒ciprofloxacin Lactobacillus

acidophilus

agar

(A),

(37°C,

72

h,

Transgalactosylated

oligosaccharides‒mupirocin lithium salt agar (37°C, 72 h, anaerobiosis) for bifidobacteria (B), and M17 agar (45°C, 24 h, aerobiosis) for Streptococcus thermophilus (T). ABT-type cultured dairy foods were then produced from camel’s and cow’s milks with and without honey addition. It was found that the presence of black locust honey at 5.0% (w/v) largely improved the retention of viability of Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 in the camel milkbased product during storage at 4°C up to 5 weeks.

10

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Bevezetés és célkitűzés 1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉS A probiotikum elnevezés a görög “probios” szóból ered, melynek jelentése: életnek kedvező. A probiotikumok élő mikroorganizmusok, többnyire baktériumok, amelyeket ha elegendő mennyiségben, életképes formában juttatunk a szervezetbe, többféle jótékony hatást gyakorolnak a gazdaszervezet egészségi állapotára. A probiotikumok jótékony hatásaikat egyebek mellett a bélflóra kialakítása, az immunsejtek aktiválása, a vér lipidprofiljának javítása és a tumorsejtek szaporodásának gátlása terén fejtik ki. A legismertebb probiotikus törzsek a tejsavbaktériumok és a bifidobaktériumok fajai közül kerülnek ki. A probiotikus élelmiszerként forgalomba hozott termékek nagy része tejipari gyártmány. A probiotikus baktériumok által kifejtett terápiás hatások csak abban az esetben érvényesülnek, ha elegendő mennyiségben és életképes formában jutnak el rendeltetési helyükre, a vastagbélbe. A nemzetközi és a hazai előírások legalább egymillió élő probiotikus sejt jelenlétét követelik meg a probiotikus termékektől, azok grammjára vagy milliliterére vetítve, a fogyasztás időpontjában. E hasznos mikroorganizmusok előnyös tulajdonságainak és termékbeli jelenlétének igazolása kiemelkedő jelentőséggel bír gyártó és fogyasztó számára egyaránt. A klasszikus joghurtkultúrával ellentétben a probiotikus kultúrák tejben viszonylag lassan szaporodnak, e folyamat serkentése érdekében gyakran egészítik ki Streptococcus thermophilus és Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus tenyészetekkel a probiotikus kultúrákat. A kedvezőbb ízkarakter kialakításáért és technológiai okokból a laktobacillusz és a bifidobaktérium tenyészeteket esetenként aromatermelő és mezofil tejsavbaktérium kultúrákkal (Lactococcus lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris, Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris) együtt alkalmazzák.

11

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Bevezetés és célkitűzés A kereskedelmi forgalomban kapható probiotikus termékek többféle baktériumkultúra hozzáadásával készülnek, e baktériumfajok tenyésztéssel történő szelektív kimutatása számos kérdést vet fel, ugyanis a nemzetközi szakirodalomban gyakorta eltérő és ellentétes állítások találhatók a hasznos mikroorganizmusok

szaporodásához,

valamint

szelektív

elkülönítéséhez

szükséges feltételekre vonatkozóan (pl. tápközeg összetétele, inkubációs hőmérséklet, inkubációs időtartam, aerob/anaerob tenyésztés, stb.). Jóllehet a világ összes tejtermelésének (770 millió t) több mint négyötödét a tehéntej teszi ki, nem elhanyagolható a kecske- (2,4%), a juh(1,3%) és a tevetej (0,4%) mennyisége sem (IDF, 2013). E tejelő állatfajok teje egymástól mind főbb komponenseiben (fehérje, zsír és laktóz mennyisége), mind mikroösszetevőiben (vitaminok, oligoszacharidok, szabad aminosavak, ásványi anyagok mennyisége) különbözik. A probiotikus savanyú tejtermékek gyártásához mindegyik tejféleség alapanyagul szolgálhat. Az összetételbeli eltérések

befolyásolhatják

a

laktobacilluszok

és

a

bifidobaktériumok

szaporodási sebességét, ill. tárolás alatti túlélését a savanyú tejtermékekben. A tevetej, az anyatejhez hasonlóan, nem tartalmaz β-laktoglobulint, ezért a tehéntej-allergiában szenvedő csecsemők számára kifejezetten előnyös lehet a fogyasztása. Kísérleti eredmények arra mutattak rá, hogy az I. típusú cukorbetegek napi injekciós inzulinadagja csökkenthető és a betegek életminősége javítható a tevetej rendszeres fogyasztásával. A tevetej átlagos zsírtartalma 2,75%, fehérjetartalma 2,81%. A tehéntejhez képest nagyobb arányban tartalmaz telítetlen zsírsavakat. A tevetejben több C-vitamin, hamu, nátrium, kálium, foszfor, cink, vas és mangán található, mint a tehéntejben (Fábri és mtsai, 2014a,b). Az egészségtudatos táplálkozásnak köszönhetően kiemelt figyelmet kapott a méz, mint természetes eredetű édesítőszer. A méztartalmú élelmiszereket bizonyos fogyasztói csoportok különösen értékesnek tartják, és Észak-Amerikában, ill. Nyugat-Európában akár 10-15%-kal magasabb áron lehet értékesíteni ezeket, mint az egyéb édesítőszereket tartalmazó konkurens

12

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Bevezetés és célkitűzés termékeket. A méz jelentős mennyiségű fruktózt és glükózt, továbbá kisebb mennyiségű maltózt, szacharózt és különféle oligoszacharidokat tartalmaz (National Honey Board, 1996). A méz mikrobaserkentő, ill. mikrobagátló tulajdonságairól számos közlemény számol be, a kísérleti eredmények azonban sok esetben egymásnak ellentmondóak. Korábbi vizsgálatok már fényt derítettek arra, hogy a tehéntej mellett a tevetej is alkalmas probiotikus savanyú tejtermékek alapanyagául történő felhasználásra, ill. hogy a tejféleségekhez adott akácméz kedvező hatást gyakorol a termékben lévő probiotikus mikrobák tárolás alatti túlélésére. Az elmondottak alapján, vizsgálataim főbb célkitűzései a következők voltak: 1.

A hasznos mikroorganizmusok (joghurtkultúra, aromatermelő és mezofil tejsavbaktériumok, ill. probiotikus baktérium törzsek) szaporodásához, valamint szelektív elkülönítéséhez szükséges feltételek (tápközeg-összetétel, inkubációs hőmérséklet, inkubációs időtartam, aerob/anaerob tenyésztés, stb.) meghatározására és tisztázására vállalkoztam.

2.

Arra kerestem a választ, hogy pasztőrözött tehén-, teve-, juh- és kecsketejből

ABT-típusú

(A:

Lactobacillus

acidophilus,

B:

bifidobaktériumok, T: Streptococcus thermophilus) kultúrával készített savanyú tejtermékekben hogyan változik hűtve tárolás során a kultúra eredetű mikroorganizmusok élősejt-száma. 3.

További vizsgálataim célja az volt, hogy 5% akácmézzel kiegészített, ABT-5 kultúrával savanyított, tehéntejből, ill. tevetejből készített savanyú tejtermékek hasznos

mikroorganizmusainak

élősejt-szám változását nyomon kövessem öthetes hűtve tárolás alatt. 4.

Meg kívántam határozni ötféle méz (akác-, hárs-, vegyes virág-, erdei- és gesztenyeméz) patogén baktériumokra, élesztő- és penészgombákra, valamint hasznos baktériumokra (összesen 27

13

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Bevezetés és célkitűzés mikrobatörzsre) gyakorolt mikrobagátló-, ill. mikrobaserkentő hatásait is, agardiffúziós lyuktesztek segítségével. 5.

Végül, tevetejből és tehéntejből készített natúr-, ill. akácmézzel (5%) kiegészített, ABT-5 kultúrával savanyított tejtermékek előállítását és érzékszervi bírálatát tűztem ki célul.

Kísérleteimet

többek

között

az

indokolta,

hogy

ilyen

jellegű

vizsgálatokról szóló beszámolókat nem találtam a nemzetközi szakirodalomban.

14

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A tejsavbaktériumok általános jellemzése A tejsavbaktériumokra egyes szerzők szerint nem lehet pontos definíciót adni (Axelsson, 2004). Kezdetekben mindenesetre ez a meghatározás létezett: azok a mikroorganizmusok, amelyek képesek erjeszteni és kicsapni a tejet, illetve annak fehérjéit. Azonban e meghatározás szerint még a kóliform baktériumok is a csoportba tartoztak. Ennek a téves nézetnek mondott ellen Beijerinck 1901-ben, amikor különválasztotta a Gram szerint festődő baktériumoktól a Gram-negatív kóliform fajokat (Stiles és Holzapfel, 1997). A tejsavbaktériumok filogenetikailag a Firmicutes törzs, Bacilli osztályba és ezen belül a Lactobacillales rendbe tartoznak (Ásványi-Molnár, 2009). A szakirodalom szerint a “tejsavbaktériumok” (angolul: lactic acid bacteria, LAB) gyűjtőnév, mely alatt mindazokat a Gram-pozitív, endospórát nem képző, kataláz-negatív és oxidáz-negatív, savtűrő, kokkusz és pálcika alakú mikroorganizmusokat értjük, amelyek a szénhidrátok fermentációja során döntően tejsavat képeznek (Pulay, 1972; Klein és mtsai, 1998; Holzapfel és mtsai, 2001; Varga, 2008; Halász, 2009). A tejsavbaktériumok elsősorban azokon a tápanyagokban gazdag élőhelyeken fordulnak elő (talajban, vízben, szerves trágyában, szennyvízben, szilázsban, növényeken, növényi eredetű szerves anyagokon, mesterséges élőhelyeken, tejben, húsban, romlott élelmiszerekben), ahol nagy mennyiségű oldott szénhidrát, fehérjebomlási termék és vitamin van jelen (Holzapfel és mtsai, 2001; Bernardeau és mtsai, 2008; Ásványi-Molnár, 2009). Mivel tápanyagigényük összetett, nem képesek szaporodni a csak glükózt és szervetlen sókat tartalmazó ún. minimum-tápközegben, szaporodásukhoz számos aminosavat, peptidet, vitamint, nukleotidokat, valamint szénhidrátokat és zsírsavakat igényelnek (Reddy és mtsai, 2008). Kizárólag azok a fajok tudják

15

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés a fehérjéket aminosavakra bontani, amelyek sejtfalhoz kötött proteáz enzim termelésére képesek (Deák, 2006). Jellemző rájuk, hogy felépítő folyamatokban résztvevő enzimük kevés van, viszont proteolitikus enzimekben bővelkednek és makromolekulák

felvételére

is

képesek.

Bizonyos

fajok

a

komplex

szénhidrátforrásként ismert prebiotikumokat is hasznosítani tudják (Varga, 2008). Az oxigénhez való viszonyuk különleges, hiszen mint obligát erjesztők valójában anaerobok, de elviselik az oxigén jelenlétét is. Mivel aerob körülmények között is erjesztenek és szaporodnak, aerotoleráns anaeroboknak vagy mikroaerofileknek is nevezik őket (Zalán, 2008). A szénhidrát-erjesztést kétféle módon végezhetik (1. ábra). Az egyik a homofermentatív út, amelynek kizárólagos végterméke a tejsav, míg a másik a heterofermentatív erjedés, ahol a tejsav mellett más vegyületek is keletkeznek, pl. ecetsav és etil-alkohol (Halász, 2009).

1. ábra: A homo- és heterofermentatív tejsavas erjedés sematikus vázlata (Deák, 2006)

16

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés A homofermentáció során a glükózból több mint 85%-ban tejsav képződik. Egy mol glükóz fermentálása során két mol tejsav, valamint két mol ATP molekula keletkezik. A heterofermentáció folyamán csupán 50%-nyi tejsav nyerhető. Egy mol glükóz lebontása egy mol tejsav és még ekvimoláris mennyiségű végtermékek, úgymint: egy mol etanol és egy mol szén-dioxid szintézisét is eredményezi (Reddy és mtsai, 2008). A tejsavbaktériumok széles hőmérsékleti intervallumban (5°C és 45°C között) képesek szaporodni (Reddy és mtsai, 2008). Hőmérsékleti igényük szempontjából mezofil és termofil csoportra oszthatók. A mezofil csoport tagjainak szaporodási optimuma 25-30°C között van, ide sorolhatók a Lactococcus,

a

Leuconostoc

és

a

Pediococcus

fajok.

A

termofil

tejsavbaktériumok optimális szaporodási hőfoka 37-42°C közötti, ebbe a csoportba tartoznak a klasszikus joghurtkultúra alkotói: a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus és a Streptococcus thermophilus (Deák, 2006). Nem meglepő tény, hogy a legtöbb tejsavbaktérium törzs tolerálja a 4,4es pH-értéket is, szaporodásukhoz azonban igénylik az 5,5-6,5-es pH-jú közeget (Reddy és mtsai, 2008). 2.1.1. A tejsavbaktériumok története és rendszertani felosztása A tejsavbaktériumok 1,5-2,0 milliárd éve alakultak ki. Nincs még egy olyan baktériumcsoport, amely annyira sokoldalúan szolgálja az emberiséget, mint a tejsavbaktériumok (Varga, 2008). A tejsavas erjedés mibenlétére a francia kémikus és mikrobiológus, Louis Pasteur derített fényt 1857-ben, majd ezt követte 1873-ban az első tejsavbaktérium, a Bacterium lactis izolálása, melyet Joseph Listernek és Ilja Mecsnyikovnak köszönhetünk (Teuber és Geis, 2006; Halász, 2009). A taxonómia fejlődésével Streptococcus lactis-ra változott Lister tejsavbaktériuma (Orla-Jensen, 1919), a következő névváltozást pedig az a felismerés hozta, hogy a Lactococcus fajok nem sorolhatók a patogén Streptococcus nemzetség tagjai

17

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés közé, így kapta a Lactococcus lactis nevet ez a gömb alakú, mezofil starterbaktérium faj (Teuber és Geis, 2006). A tejsavbaktériumok osztályozásában és definiálásában Orla-Jensen (1919) végzett úttörő munkát, aki a tejsavbaktériumokat az alakjuk (kokkusz vagy pálca), a szénhidrát fermentációjuk módja (homo-, ill. heterofermentatív), a szaporodásukhoz szükséges optimális hőmérséklet, valamint a kataláz-próba és a nitrátredukciós próba eredménye alapján hét nemzetségre osztotta: Betabacterium,

Thermobacterium,

Streptobacterium,

Streptococcus,

Betacoccus, Microbacterium és Tetracoccus. Mindezeket az ismereteket bővítette Stiles és Holzapfel (1997) tanulmánya, mely szerint az alábbi 11 nemzetség alkotja a tejsavbaktériumok széles skáláját: Carnobacterium, Enterococcus,

Lactobacillus,

Lactococcus,

Leuconostoc,

Pediococcus,

Oenococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus és Weissella. Technológiai szempontból, egyes szerzők a humán és az állati emésztőrendszerben jelen levő Bifidobacterium fajokat is a tejsavbaktériumok közé

sorolják

(Halász,

2009).

Tudni

kell

azonban,

hogy

míg

a

tejsavbaktériumokhoz tartozó nemzetségek mindegyike kis guanin+citozin (G+C) tartalmú (< 55 mol%) DNS-állománnyal rendelkezik (Varga, 2008), addig a bifidobaktériumok relatíve nagy, 55-67 mol%-os, G+C tartalmú DNS-t tartalmaznak, ezért rendszertanilag az Actinobacteria törzsbe tartoznak. Mindez magyarázatot ad a fejlődéstörténeti elkülönülésre (Klein és mtsai, 1998; Holzapfel és mtsai, 2001). A

molekuláris

biológiai

módszerek

kialakulása

és

elterjedése

robbanásszerű fejlődést hozott a biológiában (Schleifer, 1987; Deák, 2005; Varga, 2008). Az elmúlt évtizedek során a mikrobiológiában is általánossá vált a molekuláris genetikai jellemzők feltárása, a DNS-ben lévő guanin és citozin mol%-os megoszlásának vizsgálata és – a riboszóma-nukleinsav (rRNS) szekvenciák

összehasonlítása

révén

–

a

mikroorganizmusok

közötti

filogenetikai kapcsolatok feltérképezése, (Woese, 1987; Holzapfel és mtsai, 2001). A rRNS (baktériumoknál: 16S rRNS) összetétele, szekvenciája stabil és

18

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés konzervatív, változatlanul megőrződő tulajdonság. A nukleotid-szekvencia hasonlósága, ill. különbözősége jól tükrözi a fajok származástani (filogenetikai) kapcsolatait, ezért vált az rRNS – ill. az azt meghatározó rDNS – szekvenciaelemzése a molekuláris filogenezis egyik fő módszerévé (Deák, 2005; Varga, 2008). A tejsavbaktériumok főbb csoportjairól és ezek rokonsági kapcsolatairól nyújt áttekintést a 2. ábra.

2. ábra: A 16S rRNS összehasonlító szekvencia analízisén alapuló konszenzus fa, amely bemutatja a tejsavbaktériumok, a bifidobaktériumok és a propionsavbaktériumok rokonsági kapcsolatait (Holzapfel és mtsai, 2001)

19

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés Az Aerococcus, a Carnobacterium, az Enterococcus, a Vagococcus, a Tetragenococcus és a Lactosphaera nemzetségek sokkal közelebbi rokonságban állnak egymással, mint a konszenzus fán látható egyéb tejsavbaktérium nemzetségek. Amint a 2. ábra mutatja, a Lactococcus és a Streptococcus nemzetség tagjai viszonylag közeli rokonok. A legheterogénebb csoportot a Lactobacillus-ok alkotják, hiszen a DNS-ük G+C tartalma 32-54 mol% közötti. A legkisebb, 32%-os G+C tartalommal a Lb. mali rendelkezik, míg a legnagyobb, 54 mol%-os G+C értéke a Lb. fermentumnak és a Lb. pontinak van (Collins és mtsai, 1991; Vandamme és mtsai, 1996; Bernardeau és mtsai, 2008; Singh és mtsai, 2009). A tejsavbaktériumok egyik jellemzője az erős változékonyság, így csoportosításuk is meglehetősen nehéz. Számtalan esetben előfordul, hogy valamely erőteljesen savanyító tejsavbaktérium törzs savanyítóképessége egyszerre, minden látható ok nélkül csökken, vagy megszűnik (Pulay, 1972). Pulay és Krász (1980) tejsavbaktérium tenyészetek élettevékenységét vizsgálták a tej zsírmentes szárazanyag-tartalmának, a hőmérsékletnek, az inokulum mennyiségének és az inkubációs időnek a függvényében. Arra a megállapításra jutottak, hogy a tejsavbaktériumok savtermelő erélye és a termelt sav mennyisége nagymértékben függ a tápközeg szárazanyag-tartalmától. A joghurtkultúra számára savtermelés szempontjából a 26-30% szárazanyagtartalmú teljes tehéntejet tartották ideálisnak, ezen érték alatt és felett a savtermelés üteme lassabb, a képződött sav mennyisége pedig kevesebb volt. A tejsavbaktériumokat sokoldalúságuk miatt előszeretettel alkalmazza az élelmiszeripar számos termék előállításához (Pulay, 1972; Dubernet és mtsai, 2002). Nemcsak a tejiparban játszanak fontos szerepet, hanem a savanyú káposzta, a kovászos uborka, valamint a jó minőségű silótakarmány előállításánál is nélkülözhetetlenek (Pulay, 1972).

20

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés 2.1.2. A Lactobacillus, a Streptococcus és a Bifidobacterium nemzetség jellemzése 2.1.2.1. A Lactobacillus nemzetség jellemzése és szerepe az élelmiszeriparban Több mint 135 fajjal és 27 alfajjal, a Lactobacillus a Lactobacillaceae család legnépesebb nemzetsége. Tagjai pálcika alakúak, gyakran láncokba rendeződnek (Bernardeau és mtsai, 2008). Obligát erjesztők, aerotoleránsak, jól szaporodnak anaerob körülmények között is (Giraffa és mtsai, 2010). A Lactobacillus nemzetség ökológiai szempontból rendkívül sokféle, mert mind a fenotípusban, mind a genotípusban vannak a tagok között olyan különbségek, amelyek a nevezéktan számára tisztázatlan kérdéseket vetettek fel. A kételyekre egyértelmű választ adott a 16S/23S rRNS génszekvencia analízis, melynek segítségéval kilenc filogenetikai csoportot különítettek el a nemzetségen belül: a Lb. acidophilus-, a Lb. casei-, a Lb. plantarum-, a Lb. reuteri-, a Lb. buchneri-, a Lb. salivarius-, a Lb. perolens-, a Lb. vitulinuscatenaformis- és a Pediococcus-csoportot (Pot és Tsakalidou, 2009; Singh és mtsai, 2009). A Lactobacillus fajok szénhidrátbontásuk alapján lehetnek obligát homofermentatívok,

obligát

heterofermentatívok

és

fakultatív

heterofermentatívok (Pot és mtsai, 1994; Hammes és Vogel, 1995; Vandamme és mtsai, 1996). Az egyes fajok szénhidrát-erjesztéséről az 1. melléklet ad bővebb tájékoztatást. A Lb. acidophilus csoportba tartozó tejsavbaktériumok (Lb. acidophilus, Lb. amylovorus, Lb. crispatus, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. delbrueckii subsp. lactis, Lb. johnsonii, Lb. helveticus, Lb. gasseri) szinte kizárólag obligát homofermentatív úton képesek a szénhidrátokat lebontani (Pot, 2008).

21

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés A laktobacilluszok kimondottan kedvelik a savas környezetet (pH: 5,56,5), amit az is igazol, hogy katabolitikus folyamataik elsődleges végterméke a tejsav. A Lb. casei és a Lb. paracasei fellelhető a szilázsban, valamint az állatok és az ember emésztőcsatornájában. A Lb. fermentumot, a Lb. reuteri-csoport egyik legjobban feltérképezett tagját, zöldségekről izolálták (Pot, 2008; Pot és Tsakalidou, 2009). Ezen kívül előfordulnak még nyers tejben és az állati emésztőtraktusban is (Giraffa és mtsai, 2010). A humán emésztőrendszer mikrobiotája az alábbiak szerint jellemezhető. Az emésztőtraktus legfelső szakaszában, a szájüregben, csak kisebb számban (102-104 cfu/g) fordulnak elő baktériumok. Az ileumig tartó felső szakaszban jellemzően a tápanyagok enzimes emésztése zajlik, míg az alsó szakaszban (a vastagbélben), ahol döntő mértékben a tápanyagok mikrobás lebontása folyik, > 1012 cfu/g mikroba jelenlétét regisztrálták. A laktobacilluszok megtalálhatók az egészséges emberi szervezetben, számuk a vastagbélben éri el a legnagyobb értéket, ott ugyanis grammra vetítve akár 104-108 db telepet is képezhetnek (Szakály, 2004; Merk és mtsai, 2005; Bernardeau és mtsai, 2008). A

Lactobacillus

fajok

a

tápanyagban,

elsősorban

erjeszthető

szénhidrátokban gazdag élelmiszermátrixok (pl. sör, gyümölcspép, gabonapép, pácolt hal, tej, hús és hústermékek), valamint a fermentált italok romlásának lehetséges okozói. A cukrok erjesztése során e savtűrő és/vagy savkedvelő mikroorganizmusok lecsökkentik a közeg pH-értékét 4,0-re, ezzel gátat szabnak egyéb nemkívánatos mikroorganizmus szaporodásának, sok esetben el is pusztítva azokat (Stiles és Holzapfel, 1997). Amint a Lb. plantarum több évtizedes, dokumentáltan biztonságos élelmiszeripari alkalmazása is bizonyítja (de Vries és mtsai, 2006), a laktobacilluszok az emberiség szolgálatába állított, igazolt múltú élő szervezetek, amelyek kiérdemelték az “általánosan biztonságosnak tekinthető” (Generally Recognized As Safe, GRAS) jelzőt. Ebbe a kategóriába sorolhatók még a laktokokkuszok és a bifidobaktériumok is (Snydman, 2008).

22

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés Mecsnyikov óta tudjuk, hogy a fermentált tej jótékony hatást gyakorol az emberi szervezetre (Anukam és Reid, 2007; Zalán, 2008). A Lactobacillus nemzetség tagjai a tejipari starterkultúrák legfontosabb alkotói: sajtok, joghurtok és egyéb savanyú tej- és tejszínkészítmények gyártásához elengedhetetlenül szükségesek, valamint a tejtermékek ízének, állományának kialakításában töltenek be fontos szerepet (Pulay, 1972; Dubernet és mtsai, 2002; Bernardeau és mtsai, 2008; Giraffa és mtsai, 2010). A nemzetség több tagja az emésztőrendszerben igazoltan jótékony hatást fejt ki, ezekről a kereskedelmi forgalomban elterjedten használatos törzsekről ad tájékoztatást a 2. melléklet. A Lactobacillus acidophilus jellemzése A Lactobacillus nemzetség alkotói közül a Lb. acidophilus az egyik legelterjedtebben alkalmazott probiotikus baktériumfaj (Elahi és mtsai, 2008). Mozgásszerv nélküli, endospórát nem képző, Gram-pozitív, kataláz-negatív, lekerekített végű pálcika alakú baktérium, mérete 0,6-0,9 µm-től 1,5-6,0 µm-ig terjed. Előfordulhat egyesével, kettesével, vagy akár rövid láncokban is. Rendszerint érdes felszínű telepeket alkot. A táptalaj felületén növő telepek csavart alakúak, míg a tápközeg alján kifejlődöttek szabálytalan formát öltenek. Anaerob, ill. fakultatív anaerob mikroorganizmus. Nem képes szaporodni 1522°C-on, hiszen a Lb. acidophilus a termofil baktériumok közé tartozik. Ennek megfelelően, szaporodási hőoptimuma 35-38°C és még 45-48°C-on is képes szaporodni, ennél magasabb hőfokon viszont már nem. A szénhidrátokat homofermentatív úton bontja. Laktóz-fermentációja során kizárólag optikailag inaktív (DL) tejsav képződik, mintegy 0,3-1,9% mennyiségben. Néha nyálkát is képez, így a tej nyúlóssá válik (Pulay, 1972; Rašić és Kurmann, 1978; IDF, 1995; Süle, 2009). A Lb. acidophilus probiotikus tulajdonságokkal rendelkezik. Eredetileg csecsemők bélsarából izolálták, világszerte elterjedten használják fel savanyú

23

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés tejtermékek, funkcionális élelmiszerek és táplálék-kiegészítők gyártásához (Stiles és Holzapfel, 1997; Deraz és mtsai 2005). Alkalmazásának egyre növekvő tendenciája figyelhető meg, hiszen a Lb. acidophilus nemcsak az egészséges

bélflóra

fenntartásában

játszik

fontos

szerepet,

hanem

mikrobaellenes hatású anyagokat, bakteriocineket (pl. acidocin, laktocidin, acidolin, acidophilin, acidophilucin) is termel (Marshall és Tamime, 1997; Stiles és Holzapfel, 1997; Deraz és mtsai, 2005; Pot, 2008; Giraffa és mtsai, 2010). A róla elnevezett gyógyhatású savanyú tejtermék, az “acidofilusz tej” kizárólagos kultúrakomponense (Pulay, 1972; Stiles és Holzapfel, 1997). A Lb. acidophilus elősegíti a laktóz-intoleranciában szenvedő egyének tejcukoremésztését, csökkenti a vérszérum plazmakoleszterin-szintjét, stimulálja az immunrendszer működését, megakadályozza a patogén mikrobák térnyerését az emésztőrendszerben, ezáltal érvényesíti bélflóra-stabilizáló hatását (Olson és Aryana, 2008). A Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus jellemzése A Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, az általa termelt acetaldehidnek (és kis részben a tejsavnak) köszönhetően jellegzetes, kellemes ízt ad a “savanyú tejtermékek királynőjének”, a joghurtnak (Robinson, 2003; Varga, 2006). Ez a pálcika alakú starter baktérium, valamint a Lb. helveticus és a Lb. delbrueckii subsp. lactis alkotja az ementáli, a gorgonzola és a mozzarella sajtok gyártásához nélkülözhetetlen tejsavbaktérium kultúrát (Hammes és mtsai, 1991). Sejtjeiben gyakran volutinszemcsék is láthatók. Tejben 1,5-3,5% savat termelhet. Gyengén fehérjebontó. A Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus ‒ egyéb homo- és heterofermentatív tejsavbaktérium fajokkal együtt ‒ a savanyú kovászos kenyér tésztájának kelesztésében is közreműködik (Pulay, 1972; Stiles és Holzapfel, 1997).

24

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés 2.1.2.2. A Streptococcus nemzetség jellemzése A Streptococcus nemzetség Gram-pozitív, gömb alakú, láncokba rendeződött, hasonló anyagcseréjű, azonban különböző élőhelyeken előforduló és élettanilag nagymértékben eltérő baktérium fajokat foglal magába. Az elmúlt három

évtizedben

a

tejsavbaktériumokat

újraosztályozták,

melynek

eredményeképpen számos faj az Enterococcus, ill. a Lactococcus nemzetségbe került át (Sharma, 2014). A Streptococcus thermophilus jellemzése A S. thermophilus különbözik a Streptococcus nemzetség kórokozó fajaitól, ugyanis evolúciója során elveszítette az antibiotikum-rezisztenciáért és az adhéziós képességért felelős virulenciafaktort hordozó génjeit, így elnyerhette a GRAS státuszt. A Lc. lactis mellett a S. thermophilus a tejipari starterkultúrákban legnagyobb mennyiségben felhasznált másik tejsavbaktérium faj (Sharma, 2014). A S. thermophilus 0,7-0,9 µm átmérőjű, gömb vagy tojásdad alakú mikroorganizmus, mely párosával, vagy 10-20 sejt összekapcsolódásából álló láncokban fordul elő. A kialakuló láncok hossza függ a hőmérséklettől, ugyanis 45°C-on hosszabb, míg 30°C-on rövidebb láncokat képez (Pulay, 1972). Szilárd táptalajon tenyésztve polimorfizmus jellemzi: képezhet szabálytalan, valamint nagyon apró, tűhegy alakú telepeket is (Rašić és Kurmann, 1978). Gram-pozitív, kataláz-negatív, mozgásra nem képes, endospórát nem képző, fakultatív anaerob baktériumfaj. A termofil tejsavbaktériumok csoportjába

tartozik,

szaporodási

hőoptimuma:

40-45°C.

Hőmérsékleti

minimuma: 20-25°C, maximuma pedig: 50-52°C. Termotoleráns, túléli a 60°Cos, 30 perces hőkezelést. Gyengén vagy egyáltalán nem szaporodik 2% NaCltartalmú tápközegben. Fehérjebontó képessége korlátozott, szaporodásához szabad aminosavakat (glutaminsavat, hisztidint, ciszteint, metionint, valint,

25

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés leucint, izoleucint, triptofánt, arginint és tirozint) igényel. A S. thermophilus számára szükséges szabad aminosavak csekély mennyiségben vannak jelen tejben. A kazeinfehérjék hidrolízisét a joghurtkultúra pálcika alakú baktériuma, a Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus végzi, és látja el a S. thermophilus-t aminosavakkal. Szénhidrátbontása során döntően fiziológiás L(+) tejsavat képez. Előnyben részesíti a diszacharidokat – főképp a laktózt és a szacharózt – és ezeket gyorsabban fermentálja, mint az egyszerű cukrokat. Általában 1%-nál kevesebb (0,5-0,6%) tejsavat képez. A tejipar sajtok (pl. ementáli, parmezán, mozzarella) és különféle savanyú tejtermékek (pl. joghurt) készítéséhez használja fel (Pulay, 1972; Rašić és Kurmann, 1978; Süle, 2009; Sharma, 2014). 2.1.2.3. A Bifidobacterium nemzetség jellemzése Henry Tissier 1899-ben izolálta anyatejjel táplált csecsemők székletéből a későbbi Bifidobacterium nemzetség szabálytalan, Y-alakú baktériumát. A Gram-pozitív, gázt nem képző, anaerob, bifid (kettéhasadt) alakú baktériumot Bacillus bifidus-nak nevezte el. Orla-Jensen dán mikrobiológus 1924-ben újraosztályozta ezt a fajt, amely szerinte minden kétséget kizáróan a tejsavbaktériumok és a vajsavbaktériumok közötti összekötő kapocs szerepét betöltő Bifidobacterium nemzetségbe került (Leahy és mtsai, 2005). A bifidobaktériumok a természetes úton született, anyatejjel táplált, egészséges csecsemők bélmikrobiotájának domináns összetevői (Rockova és mtsai, 2011). Nemcsak az ember, hanem az állatok bélcsatornájának is meghatározó alkotói (Ferraris és mtsai, 2010). A bifidobaktériumok a humán bélflórára gyakorolt védőhatásukról ismert, nem patogén mikroorganizmusok (kivétel ez alól a fogszuvasodást okozó B. dentium) (Charteris és mtsai, 1998; Delcenserie és mtsai, 2005).

26

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés A bifidobaktériumok rendszertanilag az aktinobaktériumok osztályba tartozó, mozgásszerv nélküli, endospórát nem képző, rendkívül változatos alakú baktériumok (Masco és mtsai, 2003). A frissen izolált törzsek elágazó, Y vagy V alakot öltenek (Leahy és mtsai, 2005). Obligát anaerobok, tenyésztésük 80% N2, 10% CO2 és 10% H2 összetételű gázkeverék biztosításával lehetséges (Ferraris és mtsai, 2010). A legtöbb humáneredetű törzs a szaporodásához 36-38°C-ot igényel, míg az állati szervezetből izolált törzsek hőoptimuma a 41-43°C-ot is eléri. A B. lactis és a B. animalis ugyan szaporodni nem tud 3,5-es pH-értékű közegben, viszont képesek túlélni ilyen körülmények között. Általánosságban azonban a bifidobaktériumok jobban kedvelik a 6,5-7,0-es pH-értékű környezetet. Heterofermentatív mikroorganizmusok. Metabolizmusuk lehetővé teszi a glükóz, a galaktóz és a fruktóz bontását is. A glükóz fermentációját a fruktóz-6foszfát-foszfoketoláz enzim végzi, melynek terméke ecetsav és tejsav, 3:2 mólarányban. A heterofermentáció során kis mennyiségben keletkezik még borostyánkősav, hangyasav és etanol is (Leahy és mtsai, 2005; Süle, 2009). A Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BB-12) jellemzése A Lb. acidophilus LA-5 és a B. animalis subsp. lactis BB-12 a dán Chr. Hansen cég speciálisan probiotikus tejtermékek előállításához ajánlott, GRAS státusszal rendelkező kultúraalkotó törzsei (Möller és de Vrese, 2004). A

B.

animalis

subsp.

lactis

BB-12-t

világszerte

alkalmazzák

csecsemőtápszerek, bébiételek, diétás étrend-kiegészítők és probiotikus tejtermékek gyártásához, ugyanis az emésztőrendszeren való áthaladása során is életképes marad és kiválóan kötődik a bélhámsejtekhez (Antunes és mtsai, 2007). A BB-12 törzs technológiai szempontból is megfelel az előírásoknak, hiszen a felhasználásával készülő termékek íze és külső megjelenése megfelelő, ezen felül nagy számban életképes marad a minőség-megőrzési idő lejártáig. Antunes és mtsai (2007) kimutatták, hogy a szacharóz és édesítőszer

27

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés hozzáadásával és B. animalis subsp. lactis BB-12 kultúrával készített probiotikus író 28 napon keresztül megőrizte 108 cfu/ml feletti élősejt-számát. A B. animalis subsp. lactis BB-12 törzset önmagában, vagy Lb. acidophilus LA-5 törzzsel és S. thermophilus-szal kombinálva gyakran alkalmazzák táplálék-kiegészítőként. Utóbbi fajok tevékenysége hatékonynak bizonyult a gyermekeknél jelentkező rotavírusos hasmenések kialakulásának megelőzésében. A BB-12 törzs bizonyítottan képes enyhíteni az atópiás bőrgyulladásban (dermatitisz) szenvedő gyermekek klinikai tüneteit is (Isolauri és mtsai, 2000). E bifidobaktérium törzs és probiotikus tejsavbaktériumok egyidejű adagolását követően a bélben lévő jótékony hatású baktériumok túlsúlyba kerülése figyelhető meg. Amikor egy kísérletben a BB-12 törzset 1011 cfu/nap dózisban fogyasztotta 15 önkéntes, összesen 13 fő székletéből sikerült azt kimutatni. A B. animalis subsp. lactis visszanyerése és a nagy élősejt-szám bevitel között szoros összefüggés (P < 0,001) mutatkozott. Nem elhanyagolható az sem, hogy a klinikai vizsgálat részvevőinél nem okozott mellékhatásokat a nagydózisú probiotikum-bevitel (Larsen és mtsai, 2006).

2.2. Probiotikumok 2.2.1. A probiotikumok definíciója Probiotikumoknak nevezzük azokat az élő mikroorganizmusokat, amelyeket ha elegendő mennyiségben juttatunk a szervezetbe, jótékony hatást fejtenek ki a fogyasztó egészségi állapotára. 2013. október 23-án a Probiotikumok és Prebiotikumok Nemzetközi Tudományos Egyesülete (International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics, ISAPP) megszervezte a FAO/WHO Szakértői Bizottságának és Munkacsoportjának, valamint gasztroenterológiával, gyermekgyógyászattal, családgyógyászattal, bélmikrobiota kutatásokkal, probiotikus baktériumok

28

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés mikrobiológiájával, mikrobiális genetikával, immunológiával és élelmiszertudományokkal foglalkozó orvosok és kutatók közösségének közös értekezletét. Az összehívott szakértői tanácskozás célja az volt, hogy megvitassák, felülvizsgálják és egységesen meghatározzák a probiotikumok definícióját. A kiadott, konszenzuson alapuló nyilatkozat fő érdeme, hogy pontosan definiálja a probiotikumok fogalmát, ezáltal megkönnyíti az orvosok és a fogyasztók számára az eligazodást a piacon lévő probiotikus termékek sokasága között. Az új definíció szerint kizárólag azok a mikroorganizmusok sorolhatók a probiotikum kategóriába, amelyekről megfelelően ellenőrzött vizsgálatok során bebizonyosodott, hogy igazoltan előnyös hatást fejtenek ki a fogyasztó egészségi állapotára. Minden olyan termék, amelyre specifikus állításként a “probiotikumot tartalmaz” felirat kerül, igazolással kell hogy rendelkezzen. Az egészségre vonatkozó állításokat szigorúan ellenőrzi, felülbírálja és nyomon követi az Európai Élelmiszerbiztonsági Hivatal (EFSA). A probiotikumokkal szemben támasztott követelmények a következők szerint módosultak: A termékeknek élő mikrobákat kell tartalmazniuk. Azok a készítmények, amelyeknek nincsen egészségre gyakorolt, bizonyítottan jótékony hatásuk, kikerülnek a probiotikumok kategóriájából, ahogy ezt a 3. ábra is mutatja. Mivel a legtöbb esetben az egészségre vonatkozó állítások tudományos bizonyítékait nem ítélték megfelelőnek, a legtöbb készítményt az EFSA elutasította (Binnendijk és Rijkers, 2013; Hill és mtsai, 2014).

29

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés

3. ábra: A probiotikus és nem probiotikus termékek osztályozása (Hill és mtsai, 2014) Az egészségre gyakorolt jótékony hatás bizonyítása törzsspecifikusan vagy csoport szintjén feltüntetve kötelező előírás a probiotikumok esetében, a várt hatástól függően. A probiotikumok csoportosíthatók az adagolás eszköze (tabletta, nem szájon át történő alkalmazás), a célszervezet (humán, ill. állati probiotikumok), a célpopuláció, a célszerv (belek, vagy egyéb szervek), a hatékonyság és a szabályozási kategóriák alapján. Minden probiotikumnak biztonságosnak kell lennie a használati célnak megfelelően. Holt mikrobák, mikoorganizmusok anyagcseretermékei és mikroba-összetevők nem kerültek be a probiotikumok osztályaiba (Hill és mtsai, 2014). 2.2.2. A probiotikumok hatásmechanizmusa, jótéteményei A

konszenzuson

alapuló

nyilatkozat

a

probiotikumok

hatásmechanizmusait három fő gyakorisági csoportra osztotta (Hill és mtsai, 2014), melyet a 4. ábra szemléltet.

30

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés RITKA (TÖRZSSPECIFIKUS HATÁSOK): IDEGRENDSZERRE GYAKOROLT HATÁSOK IMMUNRENDSZERRE GYAKOROLT HATÁSOK ENDOKRINOLÓGIAI HATÁSOK SPECIFIKUS BIOAKTÍV ANYAGOK TERMELÉSE GYAKORI (FAJ SZINTŰ HATÁSOK): VITAMINSZINTÉZIS

EPESÓK METABOLIZÁLÁSA

KÖZVETLEN ANTAGONIZMUS

ENZIMATIKUS AKTIVITÁS

BÉL VÉDŐGÁTJÁNAK ERŐSÍTÉSE

RÁKKELTŐ ANYAGOK SEMLEGESÍTÉSE

A VIZSGÁLT PROBIOTIKUMOK KÖZÖTT SZÉLESKÖRBEN ELTERJEDT HATÁSOK: KOLONIZÁCIÓS KÉPESSÉG

A SÉRÜLT MIKROBIOTA NORMALIZÁLÁSA

SAVAK ÉS RÖVID SZÉNLÁNCÚ ZSÍRSAVAK TERMELÉSE

FOKOZOTT KÖTŐDÉS ENTEROCITÁKHOZ

A BÉLTRANZIT SZABÁLYOZÁSA

KÓROKOZÓK KOMPETITÍV KIZÁRÁSA

4. ábra: A probiotikumok lehetséges hatásmechanizmusai (Hill és mtsai, 2014) A probiotikumok szervezetben kifejtett jótékony hatásai három fő csoportba sorolhatók. Az elsődleges és egyben leggyakoribb hatás a kiegyensúlyozott bélflóra kialakítása, amely a bélnyálkahártya védekező rendszerének megerősítése, a kórokozó-, rothasztó- és gyulladást okozó baktériumok visszaszorítása, az antibiotikumos terápiát követő, rotavírusok és utazás okozta hasmenés és emésztőrendszeri panaszok enyhítése, a karcinogén enzimek visszaszorítása, valamint jótékony hatású rövid szénláncú zsírsavak és enzimek

szintézise

révén

valósul

meg.

A

második

jótétemény

az

immunmodulációs hatások kifejtése, amely az immunsejtek aktivizálását, a kedvező antitestek és citokinek létrejöttének fokozását, az allergiás reakciók és a kemoterápia mellékhatásainak csökkentését, valamint a gyermekek atópiás ekcémájának rövid időn belüli mérséklését foglalja magába. Egyéb, de nem elhanyagolható hatásaik között említhető meg a vér lipidprofiljának javítása is (Szakály, 2007).

31

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés 2.2.3. A probiotikumok megítélése az Európai Unióban Az élelmiszerek és az étrend-kiegészítők ‒ köztük a pro- és prebiotikumok ‒ gyártói, ill. forgalmazói számos, az egészséget jótékonyan befolyásoló hatással kecsegtették (sok esetben tudományos bizonyítékok nélkül) a fogyasztókat. Ennek vetett véget az Európai Bizottság 2012-ben, ugyanis olyan tudományosan megalapozott, egészségre vonatkozó állításokat tartalmazó listát fogadott el, amellyel a bizonyítékok nélküli állításokkal forgalmazott termékeket kivonta a forgalomból (Európai Bizottság, 2012). “Egészségre vonatkozó állítás: minden olyan állítás, amely kijelenti, sugallja, vagy sejteti, hogy az adott élelmiszer, élelmiszercsoport vagy annak valamely alkotóeleme és az egészség között összefüggés van”, definiálta az Országos Élelmezés- és Táplálkozástudományi Intézet (URL1). Az EFSA értékeli, vizsgálja felül ezeket az állításokat. Az eddig megvizsgált, egészségre vonatkozó állításoknak csupán 78%-a rendelkezett tudományosan igazolt hatással. Az EFSA különbséget tett az állítások között, három kategóriába sorolva a megvizsgált készítményeket: 1. egyértelmű jótékony hatást fejt ki az egészségre, 2. feltehetőleg jótékony hatást gyakorol az egészségre, 3. nem fejt ki jótékony hatást a szervezetben. A probiotikumoknak is az említett előírásoknak kell megfelelniük (Binnendijk és Rijkers, 2013). 2.2.4. Savanyú tejtermékekben előforduló hasznos mikroorganizmusok és a probiotikus tejtermékek jellemzése

Hasznos

mikroorganizmusok

azóta

léteznek,

amióta

fermentált

élelmiszereket fogyasztunk. Jótékony hatásuk felfedezése 1907-ig váratott magára, amikor Ilja Iljics Mecsnyikov felvetette, hogy a bél mikrobiotája káros hatásokat fejt ki az ember egészségére, magát a folyamatot önmérgezésnek definiálta a párizsi Pasteur Intézet későbbi igazgatóhelyettese (Kumar és mtsai,

32

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés 2015). Úgy gondolta, hogy az öregedésért a méregtermelő bélbaktériumok a felelősek, amelyeket a tejsav elpusztít, ezért evett ő maga is naponta bolgár joghurtot (URL2). A Nobel-díjas tudós a bolgár parasztok hosszú átlagéletkorát a savanyú tejtermékek rendszeres fogyasztásával hozta összefüggésbe (Anukam és Reid, 2007). A hasznos mikrobákkal savanyított tejtermékek azóta is az érdeklődés középpontjában állnak egészségvédő, ill. betegségmegelőző tulajdonságuk miatt (Zacarchenco és Massaguer-Roig, 2004). Számottevő fehérje- és zsírtartalmának köszönhetően, a tej kiváló tápközeg és védőmátrix a jótékony hatású mikrobák számára (Kumar és mtsai, 2015), így a probiotikus tejtermékek piaca világszerte növekvő tendenciát mutat (Ashraf és Shah, 2011). Számtalan jótékony hatás tulajdonítható a Bifidobacterium és a Lactobacillus fajoknak: antibiotikum-kúrát követően elősegítik a bélmikrobiota egyensúlyának stabilizálódását, fontos szerepet játszanak a hasmenéses megbetegedések kezelésében és megelőzésében, meggátolják a

székrekedés

okozta

bántalmak

kialakulását, lehetséges

alternatívát jelentenek a gyulladásos eredetű bélbántalmak kezelésében és csökkentik a vérszérum plazmakoleszterin-szintjét. Mindezek mellett képesek a laktóz-intolerancia gyakoriságát csökkenteni β-galaktozidáz temelésük révén, valamint potenciális szerepet játszanak a rák megelőzésében (Varga, 1999; Möller és de Vrese, 2004; Leahy és mtsai, 2005; Moriya és mtsai, 2006; Zavisic és mtsai, 2012). A savanyú tejtermékek kis pH-értéke elősegíti az ásványi anyagok ionos állapotba kerülését, hatékonyabb oldódását, ezáltal akár 6-15%-kal javul a csontépítő kalcium, a magnézium, a foszfor, vagy a rákellenes szelén felszívódása. Mindezekre való tekintettel a savanyú tejkészítmények a gyermekek, a fiatalok, az idősek, a testépítők, a sportolók, a nők, ezen belül is a szoptató és várandós anyák figyelmébe fokozottan ajánlhatók (Szakály és mtsai, 1998). Az élelmiszeripar számára számos, probiotikus tulajdonságokkal rendelkező mikroba kínál lehetőséget új termékek kifejlesztésére. Probiotikus

33

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés hatásaikról ismertek a következő Lactobacillus és Bifidobacterium fajok egyes törzsei: Lb. acidophilus, Lb. casei, Lb. johnsonii, Lb. rhamnosus, Lb. reuteri, B. bifidum, B. longum, B. infantis és B. animalis. A klasszikus joghurtkultúra alkotói (Streptococcus thermophilus és Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)

ugyan

fokozzák

a

laktóz

emésztését

és

támogatják

az

immunrendszert, mégsem tartoznak a probiotikumok közé. Ennek az a magyarázata, hogy az emésztőrendszer pusztító hatásaira érzékenyek, csak kis részük képes eljutni a vastagbélbe, ahol ráadásul nem tudnak megtapadni a bélfalon

(Szakály,

2004;

Granato

és

mtsai,

2010).

A

probiotikus

baktériumoknak az 5. ábrán feltüntetett szelekciós kritériumoknak kell megfelelniük.

5. ábra: A probiotikus mikroorganizmusok szelekciós kritériumai (Araújo és mtsai, 2012) Számos törzs megfelel ezeknek a követelményeknek, valamennyi tejipari világcég rendelkezik egy vagy több, fenotípusos szelekcióval izolált törzzsel, mindezeket foglalja össze a 1. táblázat.

34

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés 1. táblázat: Világszerte elismert probiotikus törzsek (Sanders és Huis in’t Veld, 1999; Araújo és mtsai, 2012) Törzs megnevezése

Világcég, eredet Chr. Hansen, Dánia

Bifidobacterium animalis BB-12

Danone, Franciaország

Bifidobacterium animalis DN173010 Bifidobacterium breve Yakult

Yakult, Japán

Bifidobacterium lactis HN019

Danisco, Franciaország Morinaga Milk Industry, Japán

Bifidobacterium longum BB536

Snow Brand Milk Products, Japán

Bifidobacterium longum SBT-2928

Chr. Hansen, Dánia

Lactobacillus acidophilus LA-5 Lactobacillus acidophilus NCFM

Nestlé, Svájc

Lactobacillus acidophilus NCFM

Rhodia, USA Snow Brand Milk Products, Japán

Lactobacillus acidophilus SBT-2062 Lactobacillus casei CRL-431 Gilliland

Chr. Hansen, USA

Lactobacillus casei DN-014 001 Immunitas

Danone, Franciaország

Lactobacillus casei DN-173 010

Danone, Franciaország Yakult, Japán

Lactobacillus casei Shirota

Urex Biotech, Egyesült Királyság

Lactobacillus fermentum

Nestlé, Svájc

Lactobacillus johnsonii La1

Probi, Svédország

Lactobacillus plantarum 299V Lactobacillus reuteri MM53

BioGaia, Svédország

Lactobacillus reuteri SD2112

BioGaia, USA Urex Biotech, Egyesült Királyság

Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus rhamnosus 271

Probi, Svédország

Lactobacillus rhamnosus GG

Valio, Finnország

A probiotikus élelmiszerként forgalomba hozott termékek legnagyobb része tejipari gyártmány. Ezek között található probiotikus joghurt, kefir, fermentált tejital, tejföl, vajkrém, Túró Rudi, sajtkrém és érlelt sajt is (Szakály, 2004).

35

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés 2.3. A prebiotikumok A prebiotikumok a probiotikumok szelektív táplálékai. Közülük legismertebbek a diétás rostként funkcionáló oligoszaharidok, pl. a szinbiotikus savanyú tejtermékek gyártásához gyakorta felhasznált oligofruktóz és inulin. Ezek rendkívül széles körben elterjedtek a természetben, több ezer növényben megtalálhatók. Összetételükre nézve fruktánok, ami azt jelenti, hogy ún. β-(2,1) kötésekkel összekapcsolódó fruktóz molekulákból épülnek fel. Oligofruktóz esetében 2-7 db, inulin esetében 3-60 db fruktóz egység alkotja a lineáris láncot, amelyet mindig glükóz molekula zár le. Jelentőségük abban rejlik, hogy az emésztőcsatorna felső szakaszában nem hidrolizálódnak, csak a vastagbélben bomlanak

le

bélmikrobiotára,

monoszaharid

építőegységeikre.

Szelektíven

lehetővé teszik, hogy egyfelől a

hatnak

a

vastagbélbe jutott

bifidobaktériumok ott elszaporodjanak és jelentős részarányt (akár 70-80%-ot) érjenek el, másfelől a káros bélbaktériumok számbelileg visszaszoruljanak. A prebiotikumok tehát olyan élelmiszerek, ill. élelmiszer-kiegészítők, amelyek elősegítik a kedvező összetételű bélmikrobiota kialakulását (Pitlik, 2007; Szakály, 2009). A

természetes

eredetű

oligoszacharidok

közé

sorolható

fruktooligoszacharidok (FOS) képesek a vastagbél nyálkahártyájának pHértékét csökkenteni, ezáltal növelik a kalcium, a magnézium, a cink, a vas és a foszfor hatékonyabb oldódását és egyben elősegítik azok felszívódását. A kalcium és a magnézium felszívódásának javulásával csökkenthető a csontritkulás kialakulásának gyakorisága, a vas hatékonyabb felhasználásával pedig a vérszegénység akadályozható meg (Molis és mtsai, 1996; Csanádi, 2008). Varga és mtsai (2003) prebiotikumok probiotikumok túlélésére gyakorolt hatását vizsgálva megállapították, hogy 1,0-5,0%-nyi oligofruktóz adagolása nem befolyásolja a S. thermophilus és a Lb. acidophilus élősejt-számának

36

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés tárolás alatti alakulását, viszont késlelteti (P < 0,05) a bifidobaktériumok pusztulását ABT-típusú savanyú tejtermékekben.

2.4. A tej A tej az emlősállatok tejmirigyei által termelt, fejéssel nyert, romlatlan ital, melynek összetevőiből semmit nem vontak el és semmilyen idegen anyagot nem adtak hozzá (Szakály, 2001; Kukovics és mtsai, 2009). A világ összes tejtermelésének (770 millió t) közel 83%-át a tehéntej, 13%-át a bivalytej, 2,4%-át a kecsketej, 1,3%-át a juhtej, 0,4%-át a tevetej teszi ki (IDF, 2013). Az élet fenntartásához szükséges fehérjék, zsírok, ásványi anyagok és vitaminok rendkívül széles tárháza található meg a tejben. Összetétele alapjában véve az állatfajtól függ, de ugyanazon faj tejének összetevőit sok más tényező is befolyásolja (Kukovics és mtsai, 2009). Alkotói közül a legnagyobb részt (80-90%) a víz teszi ki. A víz nagyobb része (96%-a) szabad, kisebb hányada (4%-a) pedig kötött formában van jelen. A víz oldódást biztosít a tejcukornak, az ásványi anyagoknak és a vízoldható vitaminoknak (Szakály, 2001; Kukovics és mtsai, 2009). A tejfehérjék különösen gazdagok egészségvédő komponensekben, ezért magas biológiai értékűek. Két csoportba sorolhatók: az egyik csoportot a kazeinek (α-, β-, γ- és κ-frakciók) alkotják, amelyek tehéntejben az összes fehérje 76-86%-át teszik ki, míg a másik csoportba a savófehérjék (laktalbuminok, laktoglobulinok, immunglobulinok és protein-pepton frakciók) sorolhatók, amelyek az összes fehérjetartalmon belül kevesebb, mint 14-24%-ot képviselnek. A tejfehérje immunerősítő, érelmeszesedés- és vérrögképződésgátló funkcióival nagymértékben hozzájárul az emberi egészség megóvásához. A tejfehérje esszenciális aminosavakban viszonylag gazdag. 100 g savófehérje 50,9 g, míg ugyanennyi kazein 45,1 g esszenciális aminosavat tartalmaz. Mindkét fehérjefrakcióban a következő limitáló aminosavakat mérték: treonin, lizin, izoleucin és triptofán. Fél liter tej elfogyasztásával a kéntartalmú

37

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés aminosavak, azaz a metionin és a cisztin kivételével az összes esszenciális aminosav-szükségletet fedezni lehet (Csapó és Csapóné, 2002; Kukovics és mtsai, 2009; Biró és Antal, 2009). A tejzsír természetes eredetű és összetételű, jelentős E- és A-vitamin tartalmú zsír. A tehéntej átlagos zsírtartalma 3,8%, de 2,5% és 8,0% között változhat. A tej lipidjeinek 96-99%-át a zsírgolyócsák belsejében elhelyezkedő trigliceridek alkotják. A tejzsír 0,4-2,2%-a a zsírgolyócskák membránjaiban, 0,8-3,4%-a pedig a szérumban található meg (Csapó és Csapóné, 2002). A tejzsír az összes élettani szempontból fontos zsírsavat tartalmazza (Szakály, 2001). A rövid szénláncú zsírsavak közül a vajsav 7-13%-ot, a kapronsav 4-5%-ot, a kaprilsav pedig 1-2,5%-ot tesz ki az összes zsírsavon beül (tejzsír mólszázalékban kifejezve). A zsírsavak közül a többszörösen telítetlen, létfontosságú esszenciális zsírsavaknak sincs híján a tej: a linolsavat (C18:2) 0,8-5,2%-ban, a linolénsavat (C18:3) pedig 0,3-2,9%-os mennyiségben tartalmazza (Csapó és Csapóné, 2002). A tejzsír konjugált linolsav-tartalma 600-2300 mg/100 g. Az alsó érték az energiában szegényebb, téli, a felső érték pedig a nyári, gazdagabb, legeltetéses takarmányozáshoz köthető (Szakály, 2001). A konjugált linolsav potenciális egészségmegőrző hatásai a következők: gátolja a daganatsejtek növekedését, csökkenti a szív- és érrendszeri betegségek kialakulásának kockázatát, elősegíti a csontok egészséges fejlődését és erősíti az immunfunkciókat (Biró és Antal, 2009). A tejzsír magas lectitin- és kefalintartalma oldatban tartja a koleszterint, ezáltal gátolja annak érfalakban való lerakódását (Kukovics és mtsai, 2009). A tejzsírban a hosszú szénláncú, többszörösen telítetlen omega-6 (n-6) és omega-3 (n-3) zsírsavak aránya 2,5:1, ami élettanilag kimondottan kedvező a magyar diétában meghatározott 3:1 arányhoz képest (Szakály, 2001). A tej szénhidráttartalmának döntő hányadát a tejcukor (laktóz) alkotja. A laktóz a tej egyik legállandóbb és legjelentősebb összetevője, mely nagymértékben hozzájárul a tej ozmózisnyomásának fenntartásához (Csapó és Csapóné, 2002). A teljes tej energiatartalmának közel 30%-át adja. (Biró és

38

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés Antal, 2009). A laktóz a tehéntejben átlagosan 4,8-4,9%-ban fordul elő, azonban 4,7-5,8% között változhat (Csapó és Csapóné, 2002). Nem elhanyagolható a tej vitamin- és ásványianyag-tartalma sem. Az ásványi anyagok közül kiemelendő a legnagyobb mennyiségben megtalálható kalcium és foszfor, de a nátrium, a kálium, a magnézium és jó néhány mikroelem (réz, vas, cink, mangán, króm) is jelen van benne (Rigó, 2009). Napi fél liter tej elfogyasztása javasolható, ezzel ugyanis 600 mg kalcium jut a szervezetbe, ami pl. a gyermek- és időskorban optimálisnak tartott 1000 mg-os szükséglet 60%-át biztosítja. A tej ásványianyag-összetételének további előnyös tulajdonsága

az

1,2:1

kalcium–foszfor

arány,

ami

mérsékli

foszforfogyasztásunk túlsúlyát. A tej másik értékes tulajdonsága, hogy háromszor annyi kálium van benne, mint nátrium, ezáltal lehetőséget kínál a nátrium vérnyomásemelő hatásának ellensúlyozására (Szakály, 2001). A zsírban oldódó vitaminok közül megemlíthető a D-vitamin (kalciferol), az A-vitamin (retinol), az E-vitamin (tokoferol) és a K-vitamin (Rigó, 2009). A tejben lévő vízoldható vitaminok közül legfontosabbak: a B1- (tiamin), a B2(riboflavin), a B6- (piridoxin), a B12- (kobalamin), ill. a C-vitamin (aszkorbinsav) (Szakály, 2001). A

négy

alapélelmiszer-csoport

mintegy

nyolcadát

képviselik

a

tejtermékek (ill. maga a tej), és − élettani előnyeik miatt − közülük is a legfontosabbnak minősülnek. A tejtermékek rangját az adja, hogy az egyébként különleges értékű tejből még értékesebb termékek állíthatók elő. Azon túl, hogy a tejtermékeket csecsemők, gyermekek, idősek, terhesek, sportolók, betegek egyáltalán nem nélkülözhetik, az egészséges felnőttek szervezetének normális működéséhez is napi 0,3-0,5 l tej, ill. annak megfelelő tejtermék fogyasztása szükséges (Szakály, 2001).

39

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés 2.4.1. A kecsketej és a juhtej jellemzése Az emberi szervezet nagy értékű fehérjével való ellátása szempontjából jelentős szerepet kap a tehéntejen kívül a kiskérődzők teje is. A három állatfaj tejében az esszenciális aminosavak aránya az összes aminosavakon belül a következő: tehéntejnél 46,7%, kecsketejnél 52,5% és juhtejnél 48,0%. Ezen kívül a kiskérődzők tejében kedvezőbb a savófehérjék aránya (juhtejben: 22%, kecsketejben: 32%) a tehéntejhez képest (18%). A savófehérjék teljes értékűek, még denaturált állapotban is 100%-ban hasznosulnak a szervezetben. A savófehérjék közül specifikus tulajdonságokkal rendelkezik a laktotranszferrin, amely a vas hordozója, valamint az immunglobulin, amely a különböző antitesteket

hordozza

(Csanádi

és

mtsai,

1999).

Mindezek

alapján

megállapítható, hogy a kecsketej biológiai értéke nagyobb a másik két állatfaj tejéhez képest (Fenyvessy, 2009). Fenyvessy (2009) a táplálkozásbiológiai szempontból értékes rövid szénláncú (C4-C10) zsírsavak arányát a juhtejben 21,9 mol%-nak, kecsketejben pedig 16,2 mol%-nak találta. Juh- és kecsketejben a mirisztinsav (12,0 mol%, ill. 8,9 mol%), a palmitinsav (23,7 mol%, ill. 27,7 mol%) és az olajsav (21,8 mol%, ill. 27,4 mol%) fordul elő legnagyobb mennyiségben (Fenyvessy, 2009). Csanádi és mtsai (2008) holstein-fríz tehenek és magyar fehér anyakecskék tejének zsírgolyócska méreteloszlását vizsgálták. Kimutatták, hogy a kecsketej zsírgolyócskáinak átmérője 0,534 µm-től 10,876 µm-ig terjed. Az eredmények mértani átlaga ősszel 2,653 µm, míg tavasszal 2,858 µm volt. A kecske- és a tehéntej zsírgolyócskáinak átmérője között szignifikáns különbséget (P < 0,05) találtak mindkét mintavételi időszakban. Fenyvessy és Csanádi (1999) saját eredményeik irodalmi adatok történő összevetése során megállapították, hogy a kecsketej a magas fehérjetartalma (3,80%) miatt, a juhtej pedig kedvezőbb zsírsavösszetétele és nagyobb ásványianyag-tartalma (0,9 g/100 g) okán tekinthető a tehéntejnél kedvezőbb biológiai értékűnek.

40

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés A hazánkban termelt tejek közül – jelentős fehérje- és zsírtartalma miatt – a juhtej energiatartalma a legnagyobb. A juhtejből szinte kizárólag külföldön értékesülő termékeket, sajtokat és savanyú tejtermékeket (joghurt, kefir) készítenek, folyadéktejként fogyasztása nem jellemző (Fenyvessy, 1995). Kedvező kalcium‒foszfor arány jellemzi mindkét kiskérődző tejét. A kecsketejben átlagosan 145 mg/100 g kalcium és 130 mg/100 g foszfor van, e kettő aránya élettani szempontból igen kedvező, azaz 1,12:1. A juhtejben valamivel több, azaz 210 mg/100 g kalcium és 150 mg/100 g foszfor van jelen, így a Ca/P aránya 1,31:1 (Szakály, 1996). A kiskérődzők közül a kecske “úttörőnek” számít, mert e faj tejét kezdte el leghamarabb táplálékként használni az emberiség (Csapóné és mtsai, 2009). Bár hosszú időn keresztül kizárólag a tehéntejből készített sajtok gyártásához használtak probiotikus kultúrákat, manapság egyre több kutató célja, hogy kecske- és juhtejből is probiotikus sajtokat állítson elő, ugyanis mindkét kiskérődző faj teje alkalmas kiváló érzékszervi tulajdonságokkal és táplálkozásélettani előnyökkel rendelkező probiotikus sajtok gyártására (Perotti és mtsai, 2014).

2.4.2. A tevetej A világon megtermelt összes tejmennyiség viszonylag kis hányadát (0,30,4%) teszi ki a tevetej, ugyanakkor esszenciális tápanyagforrás a sivatagos területeken, ahol “a sivatag fehér aranyának” is nevezik (Wernery, 2006; Fábri és mtsai, 2014a). A száraz, meleg területeken élő egypúpú dromedárok (Camelus dromedarius) és a hideg, sivatagos vidékeken elterjedt kétpúpú baktrián tevék (Camelus bactrianus) teje egyaránt átlátszatlan, kifejezetten fehér színű, könnyen képez habot (El-Agamy, 2006). A tevetej íze a sóstól az enyhén édesig változhat, azt nagymértékben meghatározza a teve által elfogyasztott, sok esetben nagy sótartalmú növényzet és a takarmány minősége, valamint a

41

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés rendelkezésre álló ivóvíz mennyisége (Farah, 1993; Khaskheli és Arain, 2005). A frissen fejt tevetej pH-értéke 6,5-6,7, átlagos sűrűsége 1,029 g/cm3 (Farah, 1993). Konuspayeva és mtsai (2009) átfogóan elemezték az egypúpú, a kétpúpú és a hibrid tevék tejének beltartalmára vonatkozóan 1905 és 2007 között publikált szakirodalmi adatokat, és meghatározták 100 ml tevetej átlagos összetételét: 12,47 ± 1,53 g szárazanyag, 3,82 ± 1,08 g zsír, 3,32 ± 0,62 g összfehérje, 4,46 ± 1,03 g tejcukor és 0,79 ± 0,09 g ásványi anyag. A Nagy és mtsai (2013) által megvizsgált tevetejek átlagos szárazanyag-tartalma ezzel szemben 10% alatti volt, és a reggel fejt tej zsírtartalma a 2,2%-ot sem érte el. A tevetejben lévő fehérjék zöme az ún. védőfehérjék (ellenanyagok) közé tartozik (Fábri és mtsai, 2014a). Míg a tehéntejben a fehérjék 80%-át a kazeinfehérjék alkotják, addig a tevetej esetében ezek csupán 70%-ot tesznek ki (Fukuda, 2013). A tevetej feldolgozásával kapcsolatos nehézségek – pl. a lassú oltós alvadás – hátterében a tevetej nagy mennyiségű β-kazein- és csekély mennyiségű κ-kazein-tartalma áll (Schmidt és Koops, 1977). A tevetejben a savófehérjék mennyisége 0,7-1,0%, melyek közül legfontosabb az αlaktalbumin (Farah, 2011). β-laktoglobulint – az anyatejhez hasonlóan – egyátalán nem tartalmaz, ennek köszönhetően a tehéntej-fehérjére allergiás gyermekek is javarészt következmények nélkül fogyaszthatják (Fukuda, 2013). A tehéntej savófehérjéivel összevetve, a tevetej savófehérjéi nagyobb fokú hőstabilitást mutatnak, ugyanis a 80°C-os félórás hőkezelés a fehérjéknek csupán egyharmadát denaturálja (Al-Saleh, 1996). A tevetej nem specifikus védőfehérjéje a laktoferrin, mely erőteljes baktericid hatást fejt ki az enterohaemorrhágiás Escherichia coli O157:H7 törzzsel szemben (Conesa és mtsai, 2008). Nagy és mtsai (2013) egyedi tevetej mintákat vizsgáltak, és a dromedárok tejének zsírtartalmát a Konuspayeva és mtsai (2009) által közölt átlagos zsírtartalomnál (3,82%) jóval alacsonyabbnak, csupán 2,51%-nak mérték. A tevetej közepes és hosszú szénláncú zsírsavakban gazdag, rövid szénláncú

42

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés zsírsavkészlete azonban szegényesnek mondható a tehén-, a juh- és a kecsketejéhez képest. Haddad és mtsai (2011) arról számoltak be, hogy mirisztinsav (C14:0), palmitinsav (C16), sztearinsav (C18), olajsav (C18:1) teszi ki a tevetej összes zsírtartalmának közel 77%-át. A tevetejben több a telítetlen és hosszú szénláncú zsírsav, mint a tehéntejben, ezért funkcionális hatású, csökkenti a szív- és érrendszeri megbetegedések kockázatát (Ereifej és mtsai, 2011). A tevetej laktóztartalma, mely viszonylag állandó a laktáció alatt, átlagosan 4,46% (Konuspayeva és mtsai, 2009). A kétpúpú baktrián tevék tejében

a

laktózon

kívül

háromféle,

kolosztrumában

pedig

tízféle

oligoszacharidot mutattak ki (Fukuda és mtsai, 2010), ezért a tevetej kiválóan alkalmas gyermektápszerek alapanyagául történő felhasználásra (Alhaj és mtsai, 2013). Mivel a tevék előszeretettel fogyasztanak sótűrő növényeket, tejük nátrium- és klórtartalma nagyobb, mint a többi tejelő állatfajé (Yagil, 1982). A tehéntejhez képest a nyers tevetej akár tízszer több C-vitamint is tartalmazhat, de a savanyított tevetej aszkorbinsav-tartalma is jelentős (Farah, 2011). Napi fél liter tevetej három hónapon át történő fogyasztása mérsékli az I. típusú cukorbetegek napi inzulinadagjának mennyiségét, hiszen inzulinban és inzulinszerű anyagokban is bővelkedik a tevék teje (Agrawal és mtsai, 2007; Juhász és Nagy, 2012). 2.5. Mézek jellemzése A Magyar Élelmiszerkönyv előírásai szerint “a méz az Apis mellifera méhek által a növényi nektárból vagy élő növényi részek nedvéből, illetve növényi nedveket szívó rovarok által az élő növényi részek kiválasztott anyagából gyűjtött természetes édes anyag, amelyet a méhek begyűjtenek, saját anyagaik hozzáadásával átalakítanak, raktároznak, dehidrálnak és lépekben érlelnek” (Magyar Élelmiszerkönyv Bizottság, 2002). A méz sebek és

43

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés légzőszervi megbetegedések gyógyítására évezredek óta használt funkcionális élelmiszer. Egészségvédő tulajdonságai és természetes eredete miatt az élelmiszeripar széleskörűen használja fel különböző élelmiszerek előállításához (Riazi és Ziar, 2012). A méz összetevői között legalább 200 komponenst tartanak számon (Eteraf-Oskouei és Najafi, 2013). A méz olyan (túl)telített cukoroldat, amely több mint kétharmad részben monoszacharidokat, főként fruktózt és glükózt tartalmaz (Molan, 1992; Varga, 2006). Szénhidrátjai között kis mennyiségben (4-5%) oligoszacharidok is szerepelnek (Shin és Ustunol, 2005; Eteraf-Oskouei és Najafi, 2013). Szerves savak gazdag tárháza, tartalmaz ecet-, vaj-, citrom-, hangya-, glükon-, tej-, alma-, borostyánkő-, glutamin- és piroszőlősavat, melyek együttesen alakítják ki a méz 4,0 körüli pH-értékét (Shin és Ustunol, 2005) és jellegzetes ízkarakterét (Eteraf-Oskouei és Najafi, 2013). Vitaminoknak sincsen híján, különböző koncentrációban tartalmaz B2- (riboflavin), B3- (niacin), B5(pantoténsav), B6- (piridoxin), B9- (folsav), K- és C-vitamint (Süle, 2009; Eteraf-Oskouei és Najafi, 2013). A méz enzimekkel bőven ellátott: glükózoxidáz, diasztáz, invertáz, foszfatáz, kataláz és peroxidáz enzimek találhatók benne (Erejuwa és mtsai, 2012). Az elmúlt években a figyelem középpontjába kerültek a méz egészségre gyakorolt jótékony hatásai. Ezek közül leginkább szívvédő (kardioprotektív), májvédő és vércukorszint-szabályozó funkciói emelhetők ki. Említést érdemel továbbá

antivirális,

antibakteriális,

antifungális,

tumorellenes

és

gyulladáscsökkentő hatásmechanizmusa is (Molan, 1992; Erejuwa és mtsai, 2012; Eteraf-Oskouei és Najafi, 2013). A méz bizonyítottan gátolni képes legalább 60 db, Gram-pozitív és Gram-negatív, aerob és anaerob baktériumfaj élettevékenységét. A mézek élesztő- és penészgombákkal (Aspergillus és Penicillum

spp.),

valamint

dermatofita

gombákkal

szembeni

gátló

tevékenységét számos kísérletben vizsgálták (Olaitan és mtsai, 2007). A méz mikrobaellenes tevékenysége azon alapul, hogy a baktériumok sejtfalát károsítja, ill. a sejten belül lejátszódó anyagcsere-folyamatokat gátolja.

44

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés Antimikrobás hatása betudható még nagy cukortartalmának, kis pH-értékének, a glükóz-oxidáz enzim által termelt hidrogén-peroxidnak és számos fitokémiai faktornak (Eteraf-Oskouei és Najafi, 2013). A különböző mézek antibakteriális hatásaikat

nem

csupán

peroxid-aktivitásuknak

köszönhetik,

hanem

a

peroxidmentes összetevőknek is. A hígítatlan mézekben a glükóz-oxidáz enzim inaktív, valamint a H2O2-szint is alacsony. A tömény méz esetében a nagy ozmotikus nyomás és a savas kémhatás együttesen fejt ki antibakteriális hatást. A hígítás aktiválja a glükóz-oxidáz enzimet, amely elkezdi felhasználni a cukrokat, miközben hidrogén-peroxidot fejleszt. Ez esetben a mézek antibakteriális tulajdonságai leginkább a peroxidnak tulajdoníthatók (Zainol és mtsai, 2013). Ugyanakkor a méz – oligoszacharid-tartalmából adódóan – prebiotikus komponensként is szóba jöhet funkcionális élelmiszerek fejlesztésénél (Shin és Ustunol, 2005; Varga, 2006; Riazi és Ziar, 2012). Chick és mtsai (2001) vizsgálataik során megállapították, hogy 5% méz adagolása nem gátolja, sőt a szacharózhoz és a fruktózhoz hasonlóan serkenti a S. thermophilus, a Lb. acidophilus, a Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus és a B. bifidum szaporodását tejben. 2.5.1. Az akác-, a hárs-, a gesztenye-, a vegyes virág- és az erdei méz jellemzése Akácméz (Robinia pseudo-acacia L.). Harmonikus ízvilágú, akácvirág illatú, édes, lágy és kevéssé savas méz. Színe a színtelentől az enyhén sárgás árnyalatig terjedhet. Jelentős fruktóztartalma miatt sokáig megőrzi folyékony állagát. Kiváló fertőtlenítő hatású édesítőszer. Köhögés ellen, valamint gyomorsav-túltengés miatti emésztési zavarok ellen is ajánlott. Nem domináns ízkaraktere miatt italokhoz és süteményekhez előszeretettel használják. Magyarországon az évente megtermett összes méz mennyiségének rendszerint 60%-a akácméz (AMC, 2012).

45

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés Hársméz (Tilia sp.). Illata és íze határozott, karakteres. Kellemes, pikáns aromája fűszerezi az ételeket és az italokat. Színe a gyűjtés idejétől függ. A későbbi származású mézek barnás árnyalatúak. Kristályosodásra igencsak hajlamos. A kristályok között levő folyékony hártya miatt a méz nem áll össze. Más mézekbe kerülve gazdagítja azok zamatát. Különösképpen hörghurut ellen ajánlható. Lázas betegségek enyhítésére és görcsoldásra is alkalmas. Újabban szerepet kap a biokozmetikában is (pl. hársmézzel készített arcpakolás) (AMC, 2012). Gesztenyeméz (Castanea sativa). Illata a gesztenye porzós barkájáéra emlékeztet. Íze kellemes, jól kivehető, enyhe, kicsit kesernyés utóízzel. Színskálája a sárgászöldtől a sárgásbarnáig terjed. A többi virágméznél nagyobb ásványianyag-tartalmú. Rendszeres fogyasztása megakadályozza a trombózisok kialakulását (AMC, 2012). Vegyes virágméz. A vegyes virágméz nem önálló fajtaméz, mivel összetétele rendkívül különböző lehet, de minden esetben kizárólag virágok nektárjából készül. Az eltérések oka lehet egyrészt a méhek által látogatott növények sokfélesége, másrészt a különböző, nem fajtamézekkel történő összekeverése is. Emiatt e mézek színe rendkívül változatos, többnyire sötét árnyalatúak, barnás színűek. Jellemzőjük a gyors kristályosodás. A vegyes virágmézek változatos ízkarakterűek és hasonlóan jó étrendi hatással bírnak, mint a fajtamézek (URL3). Erdei méz (mézharmatméz). E fajtamézet a méhek a növények levelein található mézharmat összegyűjtésével állítják elő. Mivel nem a virágok nektárjából készül, a virágportartalma elenyésző. Nagyon sötét, szinte fekete színű, enyhe illatú, markáns ízű méz. Sok vasat és rezet tartalmaz. Elsősorban vérszegényeknek

hasznos.

Ásványianyag-tartalma,

különleges

aromája

egyedülálló a mézfajták között. Légúttisztító és idegnyugtató hatása is ismert (URL4).

46

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés 2.6. Tejsavbaktériumok és bifidobaktériumok szelektív elkülönítése A probiotikus baktériumok jótékony hatásai csak abban az esetben érvényesülnek, ha elegendő mennyiségben és életképes formában jutnak el rendeltetési helyükre, a vastagbélbe (Leahy és mtsai, 2005; Ghoddusi és Hassan, 2011). A kereskedelmi forgalomban kapható savanyú tejtermékek kultúra eredetű mikroorganizmusainak (joghurtkultúra alkotói, mezofil és aromatermelő

tejsavbaktériumok,

meghatározásához

egyszerű,

probiotikus

költséghatékony,

baktériumok) ugyanakkor

számbeli megbízható

módszerek szükségesek (Ashraf és Shah, 2011; Saccaro és mtsai, 2012). Nagy számban jelentek meg tudományos publikációk az előzőekben felsorolt baktériumok mennyiségi meghatározására kifejlesztett tápközegekről, melyeknek mindegyike kellő szelektivitást ígér a célmikrobá(k)ra vonatkozóan (Charteris és mtsai, 1998; Shah, 2000; Roy, 2001; Tabasco és mtsai, 2007; Ashraf és Shah, 2011; Karimi és mtsai, 2012). Fontos megjegyezni, hogy a tejsavbaktérium és bifidobaktérium fajok szelektív elkülönítése többnyire a kifejlődött telepek szemmel látható tulajdonságai alapján történik. A telepmorfológia sok esetben azonban nem megbízható, nem állandó alaktani jellemző. Kellően szelektív táptalajok kifejlesztésével ez a probléma kiküszöbölhető (Talwalkar és Kailasapathy, 2004; Van de Casteele és mtsai, 2006; Saccaro és mtsai; 2012). A szelektív táptalajok hatékonyan elősegítik a célmikrobák szaporodását, miközben lassítják vagy teljesen megakadályozzák a kísérőflóra tagjainak élettevékenységét (Belák és mtsai, 2011). Ausztrál szerzők 2004-ben megjelent tanulmánya szerint a kereskedelmi forgalomban kapható táptalajok egyike sem teszi lehetővé a savanyú tejtermékek probiotikus és nem probiotikus mikroorganizmusainak szelektív, kellőképpen megbízható elkülönítését (Talwalkar és Kailasapathy, 2004). Az utóbbi években számos tudományos közlemény született a tejsavbaktérium- és bifidobaktérium-fajok szelektív elkülönítéséről. Az

47

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés áttekinthetőség érdekében a 3.-8. mellékletekben foglaltam össze az egyes fajok (nemzetségek) szelektív meghatározására alkalmazott módszereket. Szelektív tápközeg kialakítható gátló-, ill. toxikus anyagok (pl. antibiotikumok, kristályibolya, stb.) hozzáadásával, vagy egyéb korlátozó körülmény (pl. kis pH-érték) alkalmazásával. A tápközeg összetevőin kívül a tenyésztési körülmények (inkubációs hőfok, időtartam, légköri összetevők) optimális megválasztása is eredményezhet szelektív hatást (Deák, 2006). A 3. melléklet a S. thermophilus-szelektív tápközegekről ad áttekintést. A joghurt kokkusz alakú starterbaktériumának kimutatására az M17 agar ajánlható, amely β-glicerofoszfát tartalma révén meggátolja a Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus telepképzését (Van de Casteele és mtsai, 2006; Ashraf és Shah, 2011). Az ST agar, mely a S. thermophilus-ról kapta a nevét, 6,8-es pHértéke révén kedvez az említett faj szaporodásának. E tápagar előnye, hogy a táptalajban lévő brómkrezol-bíbor indikátor lila színének sárgává változása egyértelműen jelzi a sztreptokokkuszok telepképzését és savtermelését, megkönnyítve ezzel a telepszámlálást (Süle, 2009). A 4. melléklet a Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus szelektív elkülönítésére alkalmas táptalajok körét mutatja be. A felsorolt tápagarok zömmel De Man–Rogosa–Sharpe (MRS) agar alapú közegek, melyekben jellemzően a kis pH-érték (4,58-5,3) gátolja a nem laktobacillusz fajok szaporodását. Az MRS agarban lévő glükóz fruktózzal történő helyettesítése és a megnövelt inkubációs hőmérséklet (45°C) együttesen gátolja a Lb. paracasei subsp. paracasei és a B. lactis szaporodását (Tabasco és mtsai, 2007). A Lb. acidophilus szelektív tápközegeit az 5. melléklet ismerteti. A Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus-hoz hasonlóan a Lb. acidophilus elkülönítése is MRS alapú tápagarokon történik, azonban a kísérő mikrobák gátlását a táptalajhoz adott szénhidrátok (szalicin, szorbit, maltóz, trehalóz), gátlóanyagok (epe, epesavas sók), ill. esetenként antibiotikumok (ciprofloxacin, clindamycin) biztosítják. A Nemzetközi Szabványügyi Szervezet (ISO) és a Nemzetközi Tejgazdasági Szövetség (IDF) közös munkájának eredményeként jött létre az a

48

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés világszerte elfogadott módszer, amely MRS‒CC agar – azaz a clindamycinnel és ciprofloxacinnal kiegészített MRS agar – használata révén teszi lehetővé a Lb. acidophilus szelektív kimutatását (ISO és IDF, 2006). A bifidobaktériumok élősejt-számának szelektív meghatározását a 6. mellékletben felsorolt tápközegekkel lehet megvalósítani. Az alaptáptalajok között szerepel az MRS agaron kívül az RCA (Reinforced Clostridial Agar) tápközeg, valamint a transzgalakto-oligoszacharidokat tartalmazó TOS agar is. A Bifidobacterium spp. szaporodása a táptalajhoz adott L-cisztein-HCl-dal, lítium-kloriddal, nátrium-propionáttal, esetleg raffinózzal serkenthető. A nem bifidobaktérium fajok szaporodását a következő antibiotikumok gátolják: neomicin-szulfát, paromomicin-szulfát, nalidixsav, valamint dicloxacillin és lítium-mupirocin. A májinfúzió kiegészítés nemcsak a tejsavbaktériumokat gátolja, hanem előnyösen hat a bifidobaktériumok telepeinek méretére is, megkönnyítve

ezzel

a

tenyésztést

követő

értékelést.

A

nemzetközi

szabványalkotó testületek ajánlásai szerint a transzgalakto-oligoszacharidokat és a

mupirocin

lítium

sóit

tartalmazó

TOS-MUP

agar

alkalmas

a

bifidobaktériumok szelektív elkülönítésére (ISO és IDF, 2010). Az

előbbiekben

említett

mindkét

ISO‒IDF

közös

szabvány

alkalmazhatósági területe kiterjed a savanyú, ill. nem fermentált tejtermékekre, a tejporokra és a csecsemőtápszerekre is. A Lb. casei szelektív meghatározására alkalmas tápközegeket a 7. mellékletben tüntettem fel. Látható, hogy kizárólag MRS alapú tápagarokat használnak e célból. Az alapagarban lévő glükóz ribózzal helyettesíthető, ezáltal a tápközeg hatékonysága fokozódik. Mivel a Lb. casei leginkább a vancomycint képes tolerálni, az MRS agart ezzel az antibiotikummal egészítik ki. Ashraf és Smith (2015) szerint a ribózt tartalmazó Lactobacillus casei (LC) agar nem teszi lehetővé e tejsavbaktérium faj maradéktalanul szelektív elkülönítését. A Lactococcus és Leuconostoc fajok szelektív elkülönítésére ajánlott táptalajok a 8. mellékletből ismerhetők meg. Eszerint a két nemzetség

49

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés kimutatására a módosított Nickels és Leesment agar, valamint az M17 agar a legjobb választás. 2.7. Tejsavbaktériumok és bifidobaktériumok kimutatása molekuláris biológiai módszerekkel A szelektív, differenciáló táptalajok (módszerek) kifejlesztése sok esetben nagy kihívást jelentő feladat, hiszen a termékekben előforduló baktériumfajok

filogenetikailag

rendkívül

közel

állhatnak

egymáshoz,

biokémiai tulajdonságaikban rengeteg lehet a hasonlóság és az átfedés, továbbá a szaporodásukhoz szükséges körülmények is gyakran megegyeznek. A keverékkultúrákkal

készült

termékekből

gyakorta

nehézkes

az

egyes

tejsavbaktérium- és bifidobaktérium-fajok egyidejű elkülönítése, ugyanis a kifejlődött telepek a szelektív táptalajon nem feltétlenül mutatkoznak tipikusnak (Sohrabvandi és mtsai, 2012). A mikroorganizmusok fenotípusát (morfológiai, biokémiai, élettani és egyéb tulajdonságait) erősen befolyásolják a környezeti viszonyok. A mikrobák a megváltozott környezeti viszonyokra fenotípusuk változtatásával reagálnak, ez okozhatja a telepek alakjában megnyilvánuló eltéréseket. Ezzel szemben a baktériumok genotípusa (a genomi jellemzők összessége) mindenfajta környezetben állandó. A baktériumok örökítőanyaga duplaszálú DNS-molekula. A DNS-szálak egymás komplementerei, a két szálban lévő adenin‒timin és guanin‒citozin bázispárokat hidrogénhidak kapcsolják össze. Az adott mikrobafaj az örökítőanyagot jelentő DNS nukleotidszekvenciájával egyértelműen jellemezhető. Mindezen előnyöknek köszönhetően és a tenyésztéses módszerek hátrányainak kiküszöbölése érdekében terjedtek el az általában egy vagy néhány kiszemelt gén vizsgálatán alapuló molekuláris biológiai módszerek, amelyek gyakorlatilag háromféle eljáráson alapulnak: a sejtekből kivont DNS közvetlen vizsgálatán, a hibdridizációs technikákon és a polimeráz láncreakción (PCR) (Deák, 2006).

50

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés A PCR reakción alapuló vizsgálatok specifikusak, hiszen a vizsgálni kívánt gén vagy DNS szakasz – melyet tetszőlegesen lehet kiválasztani – néhány száz, maximum 2500 bázispár hosszúságban, mesterségesen, mindössze néhány óra leforgása alatt felszaporítható. In vitro módszer, mely egy hőstabil polimeráz enzim alkalmazásával folyamatos láncreakcióvá alakítható. A PCR reakció lépései a következők: 1. A felszaporítandó DNS szakasz denaturációja 94-95°C-on. 2. Az indító (primer) szekvenciák megkötődése 50°C-on. 3. A primerek által közrefogott DNS-szakasz kiegészítő szálának enzimes szintézise 72°C-on, a hőstabil DNS polimeráz enzim működési optimumán. E három lépésből áll egy ciklus. A ciklusok 20-40-szeres ismétlése révén jön létre az eredeti DNS-mennyiség milliószorosára sokszorozódott PCRtermék, amely agaróz vagy poliakrilamid gélen történő elektroforézissel választható el (Deák, 2006). Mára meglehetősen elterjedtté vált a valós idejű (“real-time”) PCR (RTPCR) technika, melynek előnye, hogy keverékkultúrákból egyidejűleg képes fajokat kimutatni, valamint az élő és holt sejtek között különbséget tenni (García-Cayuela és mtsai, 2009). A valós idejű PCR kifejezés azt jelenti, hogy az adott időben jelenlévő cél DNS nemcsak kimutathatóvá válik, hanem a mennyisége is meghatározható (Deák, 2006). Az RT-PCR technika gyors, specikfikus, érzékenysége nagy, és tenyésztéstől (tenyésztő közegtől) független módszer, mely lehetővé teszi a mikroorganizmusok kis populációjának detektálását többféle mikrobacsoport jelenlétében is (Herbel és mtsai, 2013). Napjainkban a kutatások egyre inkább a táptalajoktól független molekuláris

biológiai

módszerekkel

történő

probiotikus

élősejt-szám

meghatározást részesítik előnyben (Tabasco és mtsai, 2007; Garcia-Cayuela és mtsai, 2009; Matijašić és mtsai, 2010), azonban az élelmiszer-előállítók még mindig a hagyományos tenyésztéses módszerek hatásosságában hisznek (Tharmaraj és Shah, 2003; Van de Casteele és mtsai, 2006; Elahi és mtsai,

51

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalmi áttekintés 2008). Erre az lehet a magyarázat, hogy a telepszámlálásos technika egyszerű, könnyen kivitelezhető, nem igényel drága berendezéseket és rutin feladatnak számít az üzemi mikrobiológiai laboratóriumokban (Sohier és mtsai, 2014).

52

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyagok és módszerek

3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. Tejsavbaktériumok és bifidobaktériumok szelektív kimutatása Kiinduló vizsgálataim célja az volt, hogy a savanyú tejtermékek előállításához legáltalánosabban alkalmazott probiotikus, valamint nem probiotikus

baktériumtörzsek

tenyésztésére

javasolt

eljárásokat

összehasonlítsam szelektivitás szempontjából és megállapítsam, hogy a különféle kultúrakombinációkkal készülő termékek esetében miként valósítható meg a termékazonos mikroorganizmusok egymástól történő

szelektív

elkülönítése és élősejt-számuk meghatározása. Kísérleteim első részét, amely magába foglalta a tejsavbaktériumok és bifidobaktériumok szelektív elkülönítését, Mosonmagyaróváron, a Magyar Tejgazdasági Kísérleti Intézet Kft. mosonmagyaróvári részlegének Nemzeti Akkreditáló

Testület

által

akkreditált

Kutató‒Élelmiszervizsgáló

Laboratóriumában végeztem. Vizsgálataim

további

részét

a

Nyugat-magyarországi

Egyetem

Mezőgazdaság- és Élelmiszer-tudományi Karának Élelmiszer-tudományi Intézetében működő Élelmiszer- és Vízvizsgáló Laboratóriumban folytattam, amely szintén a Nemzeti Akkreditáló Testület által tanúsított akkreditált státusszal rendelkezik. 3.1.1. A kísérletekbe bevont baktériumtörzsek Kiinduló vizsgálataimat a 2. táblázatban feltüntetett baktériumtörzsekkel végeztem.

53

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyagok és módszerek 2. táblázat: Az első kísérletsorozatban felhasznált tejsavbaktérium- és bifidobaktérium-törzsek Faj

Törzs

Eredet

Bifidobacterium breve

M-16V

Morinaga Milk Industry

Bifidobacterium animalis

BB-12

subsp. lactis

Chr. Hansen / MTKI Kft.*

Lactobacillus acidophilus

LA-5

Lactobacillus acidophilus

NCAIM B.02085

Lactobacillus casei

NCAIM B.01137

Lactobacillus casei

MTKI-R

MTKI Kft.*

CH-2

Chr. Hansen / MTKI Kft.*

YC-X11

Chr. Hansen / MTKI Kft.*

Lactobacillus delbrueckii

NCAIM**

subsp. bulgaricus Lactobacillus delbrueckii

(FD-DVS YC-X11 Yo-Flex®

subsp. bulgaricus Streptococcus thermophilus

TH-4

joghurtkultúrából izolált törzs)

Streptococcus thermophilus

DSM 20479

Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen***

Lactococcus lactis subsp. lactis

VK-256

MTKI Kft.*

biovar. diacetylactis Lactococcus lactis subsp. lactis

ATCC 19435

Leuconostoc mesenteroides

ATCC 19255

American Type Culture Collection

subsp. dextranicum * Magyar Tejgazdasági Kísérleti Intézet Kft.

** National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms (Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteménye) *** Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Mikroorganizmusok és Sejtkultúrák Német Gyűjteménye)

54

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer A bifidobaktérium törzsek közül a B. breve M-16V-t a Morinaga Milk Industry nevű, a tejtermékek gyártásában és forgalmazásában vezető pozíciót betöltő japán cégtől szereztem be. A Magyar Tejgazdasági Kísérleti Intézet Kft. (Mosonmagyaróvár) segítségével vonhattam be első kísérletsorozatomba a dán Chr. Hansen cég kultúráit, azaz a B. animalis subsp. lactis BB-12-t, a Lb. acidophilus LA-5-öt, a Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus CH-2-t, a S. thermophilus TH-4-et és a Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus YC-X11-et. Az NCAIM (National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms) jelzéssel rendelkező Lb. acidophilus és Lb. casei törzseket a Budapesti Corvinus Egyetemen működő Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményéből szereztem be. A S. thermophilus DSM 20479 törzset a Mikroorganizmusok és Sejtkultúrák Német Gyűjteményéből vásároltam meg. 3.1.2. Törzsfenntartás A baktériumtörzseket BSL II. kategóriájú bioprotektív lamináris fülke alatt, aszeptikus körülmények biztosításával élesztettem fel. A gyártók a törzseket liofilezéssel tartósították, majd egy korszerű és biztonságos, dupla ampullából álló csőrendszer belső ampullájába helyezték, végül pedig vákuummal lezárták a liofilizátumot. Az egyes törzsek felhasználásakor az ampulla hegyes végét lángban hevítettem, majd az üveget egy csepp víz segítségével megrepesztettem. Egy percet vártam, hogy a repedésen keresztül a külső és a belső nyomás kiegyenlítődjön. Steril körülmények között a belső ampullát kicsúsztattam, majd a vattadugót eltávolítottam steril csipesz segítségével. Ezután steril Pasteur-pipettával 0,2 ml mennyiségű, előírások szerinti folyékony tápközeggel [az adott törzs igényeinek megfelelően: CASOleves vagy De Man–Rogosa–Sharpe (MRS) tápleves] fellazítottam a tenyészetet. Legalább 20 perces rehidratációt követően a mikroorganizmus számára megfelelő tápközeg (CASO vagy MRS agar) felületén 0,1 ml inokulumot szélesztettem el steril, egyszer használatos szélesztőbottal (Biolab

55

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer Zrt., Budapest). Az inkubációt az adott törzs igényeihez igazítva végeztem. A pontos paramétereket a 3. táblázat foglalja össze.

56

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyagok és módszerek 3. táblázat: A kísérletbe bevont fajok és törzsek felélesztésének és tenyésztésének körülményei Törzs

Felélesztés

Felületi

Tenyésztési

szélesztés

hőfok (°C)

idő (h)

körülmény

Bifidobacterium breve M16-V

MRS-L

MRS-A

37

72

Anaerob

Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12

MRS-L

MRS-A

37

72

Anaerob

Lactobacillus acidophilus LA-5

MRS-L

MRS-A

37

72

Anaerob

Lactobacillus acidophilus NCAIM B. 02085

MRS-L

MRS-A

37

72

Anaerob

Lactobacillus casei NCAIM B.01137

MRS-L

MRS-A

37

72

Anaerob

Lactobacillus casei MTKI-R

MRS-L

MRS-A

37

72

Anaerob

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus YC-X11

MRS-L

MRS-A

37

72

Anaerob

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CH-2

MRS-L

MRS-A

37

72

Anaerob

Streptococcus thermophilus TH-4

CASO-L

CASO-A

37

48

Aerob

Streptococcus thermophilus DSM 20479

CASO-L

CASO-A

37

48

Aerob

Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 19435

CASO-L

CASO-A

30

72

aerob

Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis VK-256

CASO-L

CASO-A

30

72

Aerob

Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum ATCC 19255

CASO-L

CASO-A

30

72

Aerob

MRS-L: De Man–Rogosa–Sharpe tápleves, MRS-A: De Man–Rogosa–Sharpe agar, CASO-L: tejporos szója kazein tápleves, CASO-A: tejporos szója kazein agar

57

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyagok és módszerek Az első kísérletsorozatba bevont törzsek mindegyikét Microbank™ törzsfenntartó fiolában (Pro-Lab Diagnostics, Neston, Egyesült Királyság) tartottam fenn. A fiolában található speciális, porózus szerkezetű gyöngyök nagy felületet biztosítanak a tárolni kívánt mikroorganizmus megtapadásához. Az előzetesen agarlemezen kitenyésztett tipikus telepekből 2-2 kacsnyit juttattam a gyöngyök felületére aszeptikus körülmények között. A fiolákba zárt törzsek hosszú ideig károsodás nélkül tárolhatók akár -70 ± 3°C-os ultramélyfagyasztóban (U 41085; New Brunswick Scientific, New Brunswick, New Jersey, USA). A Microbank™ törzsfenntartó rendszer működésének sematikus ábráját a 9. melléklet szemlélteti. Amikor a 13 törzs bármelyikére szükség volt a kísérlet során, 1-1 db gyöngyöt kiemeltem és a megfelelő tápközeg felületére passzáltam, ügyelve arra, hogy a készítmény ne érje el a kiolvadás hőfokát. A CASO leveshez szükséges komponenseket (10. melléklet) Sartorius CP analitikai mérlegen (Sartorius Hungária Kft., Budapest) nagy pontossággal kimértem, majd desztillált vízben feloldottam. A komponensek teljes oldódásáig a táplevest laboratóriumi főzőlapon melegítettem. Ezt követően 1 M HCl oldattal a pH-értékét 7,3 ± 0,2-re beállítottam, majd a kész tápközeget kémcsövekbe adagoltam. A kereskedelmi forgalomban kapható dehidratált MRS-levesből (Merck KGaA, Darmstadt, Németország) a gyártó utasításai szerint előírt mennyiséget bemértem és desztillált vízben feloldottam. Ezután 1 M HCl oldattal a tápleves pH-értékét 6,2 ± 0,2-re korrigáltam. Mindkét táplevesből 10,3 ml-t adagoltam kémcsövekbe, majd gőzzel telített légtérben (autoklávban) 121°C-on 15 percig sterileztem. A S. thermophilus TH-4 és a S. thermophilus DSM 20479 törzset CASOlevesben inkubáltam 37°C-on, 48 órán keresztül, aerob körülmények között. A Lc. lactis subsp. lactis ATCC 19435, a Lc. lactis subsp. lactis biovar.

58

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer diacetylactis VK-256 és a Ln. mesenteroides subsp. dextranicum ATCC 19255 törzset CASO táplevesben tenyésztettem 30°C-on, 72 órán keresztül, aerob körülmények között. A vizsgálatba bevont összes többi törzset MRS táplevesben élesztettem fel, szaporodásukat pedig 37°C-on, 72 órás anaerob tenyésztéssel serkentettem. Az anaerob körülményeket a 2,5 l-es anaerob edénybe (AnaeroJar; Oxoid, Basingstoke, Egyesült Királyság) helyezett anaerob gázfejlesztő tasak (AnaeroGen; Oxoid) hozta létre, amely 30 percen belül 1% alá csökkentette az edényben lévő oxigénszintet. Az anaerobitás ellenőrzése céljából az edénybe redoxindikátorral átitatott szűrőpapírt (Anaerobic Indicator; Oxoid) helyeztem. A vizsgálatba bevont összes törzsből tisztatenyészetet állítottam elő, amelyek a további szelektív elkülönítő vizsgálatok alapjául szolgáltak. 3.1.3. A szelektív tenyésztés tápközegei és elkészítésük 3.1.3.1. Bakteriológiai pepton (0,1%) A decimális hígítási sor előállításához használt hígítófolyadékot a következőképpen készítettem el: analitikai mérlegen bemértem 1 g peptont (Oxoid), majd 1000 ml desztillált vízben feloldottam. Az oldat pH-értékét 25°C-on 7,0 ± 0,2-re állítottam. A sterilezési veszteség figyelembevételével egyenként 9,3 ml-t adagoltam kémcsövekbe, majd gőzzel telített légtérben (autoklávban) 121°C-on 15 percig sterileztem.

3.1.3.2. CASO-agar A kazein-peptont, szójapeptont és tejport tartalmazó CASO-agar összetételét a 10. mellékletben tüntettem fel. Az összetevőket feloldottam 1000 ml desztillált vízben. Gyakori keveréssel segítettem elő a teljes oldódást, az elegy forráspontjáig melegítettem a táptalajt, majd 250 ml térfogatú, hőálló Na-

59

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer boroszilikát üvegekbe adagoltam és 121°C-on, 15 percig, autoklávban sterileztem. A tápközeg végső pH-értékét steril 1 M NaOH oldattal 7,3 ± 0,2-re korrigáltam.

3.1.3.3. M17 agar Terzaghi szerint A gyártó (Merck) utasítása szerint analitikai mérlegen 55,0 g-ot mértem be a dehidratált M17 agarból, majd 1000 ml desztillált vízben feloldottam. A portáptalaj 5,0 g laktóz-monohidrátot tartalmazott, így kiegészítő komponenst nem kellett hozzáadni. Az összetevők teljes oldódásáig melegített tápközeget hőálló üvegekbe adagoltam, majd 121°C-on, 15 percig sterileztem. A tápközeg sterilezés utáni pH-értéke 25°C-on 6,8 ± 0,2 volt. 3.1.3.4. MRS pH 5,4 agar és MRS pH 6,2 agar A kereskedelmi forgalomban kapható MRS agart (Merck) a gyártó utasításait követve előkészítettem, majd 1 M HCl oldattal beállítottam a pHértékét 5,4-re, ill. 6,2-re. Mindkét táptalajt 500-500 ml térfogatú, hőálló, boroszilikát üvegekbe szétosztottam, majd autoklávban sterileztem standard paraméterek mellett (121°C, 15 perc). 3.1.3.5. Clindamycinnel és ciprofloxacinnal kiegészített De Man‒Rogosa– Sharpe agar (MRS‒CC agar) Desztillált vízben szuszpendáltam a dehidratált MRS agart (Merck). Miután a táptalaj elérte a forráspontot, 250 ml térfogatú üvegekbe 200 ml-t adagoltam ki mérőhengerrel. Ezt követően az általános sterilezési paraméterek (121°C, 15 perc) szerint, gőzzel telített légtérben autoklávoztam az alapagart. Sterilezés után a tápközeg pH-értéke 6,2 ± 0,2 volt szobahőmérsékleten (25°C).

60

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer Az MRS‒CC agar azonban nemcsak az alap MRS agarból áll, hanem két, autoklávban nem sterilezhető antibiotikum törzsoldat is alkotja. Az egyik törzsoldat elkészítéséhez 10 ml desztillált vízben 2,0 mg clindamycinhydrocloridot (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA), a másikhoz pedig ugyancsak 10 ml mennyiségű desztillált vízben 20,0 mg ciprofloxacinhydrocloridot (Sigma Aldrich) oldottam fel. Mindkét oldatot külön-külön főzőpohárban mágneses keverővel kevertettem, melegítés nélkül, teljes oldódásig. Ezután egy 47 mm átmérőjű és 0,22 μm pórusátmérőjű membránszűrőn (Millipore, Bedford, Massachusetts, USA) átszűrtem az antibiotikum törzsoldatokat steril, csavaros kupakkal ellátott Erlenmeyer lombikokba. A 44-47°C-ra lehűtött MRS alap agarhoz (200 ml) aszeptikus körülmények között, lamináris fülke alatt 0,1 ml clindamycin- és 1,0 ml ciprofloxacin-törzsoldatot adtam steril, egyszer használatos pipettával (Greiner Bio-One Hungary Kft., Mosonmagyaróvár). Így a clindamycin végleges koncentrációja az alap MRS agarban 0,1 mg/l, a ciprofloxaciné pedig 10,0 mg/l lett.

3.1.3.6.

Lítium‒mupirocinnal

(MUP)

kiegészített

transzgalaktozilált

oligoszacharid (TOS) agar (TOS–MUP agar) A transzgalaktozilált oligoszacharidokat tartalmazó TOS agarból (Merck) 62,5 g-ot bemértem és 950 ml desztillált vízben szuszpendáltam. Az alapagart gyakori keverés mellett óvatosan melegítettem, figyelembe véve azt, hogy a táptalaj hőérzékeny komponenseket tartalmaz. A teljes oldódás elérése után a táptalajból 190 ml-t adagoltam ki 250 ml térfogatú táptalaj-üvegekbe, majd 115°C-on, 15 percig autoklávban sterileztem. A táptalaj pH-értéke sterilezést követően 6,3 ± 0,2 volt szobahőmérsékleten (25°C-on). A táptalajkészítéssel egyidejűleg 50 mg lítium–mupirocin szelektív kiegészítőt (Merck) 50 ml desztillált vízben feloldottam, majd 47 mm átmérőjű, 0,22 μm-es pórusátmérőjű membránszűrőn steril fecskendővel átszűrtem. Az így elkészített MUP

61

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer kiegészítő oldatból 10-10 ml-t adtam hozzá a 190 ml térfogatú TOS alapagarokhoz. 3.1.4. Élősejtszám-meghatározás A 3. táblázat paraméterei szerint felélesztett törzsek tisztatenyészetéből hígítási

decimális

sort

készítettem

bakteriológiai

peptont

tartalmazó

hígítófolyadékokban. A leoltásokat a 10 és 10 hígítási tagokból készítettem, -6

-8

majd a sterilezett és 45-50°C-ra visszahűtött táptalajjal lemezt öntöttem steril Petri-csészékbe (Sarstedt Aktiengesellschaft, Nümbrecht, Németország). A

tejsavbaktériumok

és

a

bifidobaktériumok

élősejt-számának

meghatározását a 4. táblázatban feltüntetett tápközegek és inkubációs körülmények, valamint minden esetben a klasszikus lemezöntéses módszer alkalmazásával valósítottam meg. 4. táblázat: Tejsavbaktériumok és bifidobaktériumok élősejt-számának meghatározására alkalmazott módszerek Tápközeg

Inkubációs hőfok (°C)

idő (h)

körülmények

CASO agar

37

72

Anaerob*

MRS pH 5,4 agar

45

48

Anaerob*

MRS pH 5,4 agar

37

72

Anaerob*

MRS pH 6,2 agar

37

72

Anaerob*

M17 agar

45

24

Aerob

37

48

Aerob

37

72

Anaerob*

37

72

Anaerob*

M17 agar MRS‒CC agar

†

TOS‒MUP agar‡ *

2,5 l-es AnaeroJar edények, AnaeroGen gázfejlesztő tasakok és Anaerobic Indicator

indikátorcsíkok alkalmazásával (Oxoid). †

Clindamycinnel és ciprofloxacinnal kiegészített De Man–Rogosa–Sharpe (MRS) agar.

‡

Lítium‒mupirocinnal kiegészített transzgalaktozilált oligoszacharid agar.

62

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer Az élősejt-számot az értékelésbe bevont lemezeken (két egymást követő hígítás; egyenként 25-250 db közötti telep) leszámolt telepszámok súlyozott átlagaként adtam meg, a hígítási fok figyelembevételével. 3.2. Tehén-, juh-, kecske- és tevetej alapú probiotikus savanyú tejtermékek előállítása és vizsgálata A

második

alapanyagokból

kísérletsorozat

készített

célja

probiotikus

az

volt,

savanyú

hogy

különféle

tejtermékekben

tej

nyomon

kövessem a termékazonos mikrobák hathetes hűtve tárolás alatti élősejtszámváltozásait.

3.2.1. Alapanyagtejek Négy állatfaj (szarvasmarha, kecske, juh és teve) tejét használtam fel alapanyagul probiotikus savanyú tejtermékek előállításához. A tevetejet az Emirates Industries for Camel Milk and Products (EICMP; Dubai, Egyesült Arab Emírségek), a világ első nagyüzemi tevetejtermelő cége juttatta el légi közlekedés útján, hűtött körülmények között (0-8°C) Mosonmagyaróvárra, az NymE-MÉK akkreditált Élelmiszer- és Vízvizsgáló Laboratóriumába. A nyers tehéntejet a Lajta Hanság Zrt. (Mosonmagyaróvár), a kecsketejet a Tebike Kft. (Győr-Ménfőcsanak),

a

juhtejet

pedig

a

PharmaGene-Farm

Kft.

(Mosonmagyaróvár) bocsátotta rendelkezésemre. A nyers tejek zsír-, fehérje-, laktóz- és szárazanyag-tartalmát a Magyar Tejgazdasági Kísérleti Intézet (MTKI, Mosonmagyaróvár) Nyerstejvizsgáló Laboratóriumában

vizsgáltam

meg

MilkoScan™

Minor

4

műszerrel

(FossAnalytical, Hillerød, Dánia). Eredményeimet az 5. táblázatban foglaltam össze.

63

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer 5. táblázat: A termékgyártáshoz felhasznált nyers tejek összetétele Összetevő

Tehén-

Teve-

Kecske-

Juh-

tej (g/100 g) Zsír

2,31

3,71

3,29

5,95

Fehérje

2,85

3,25

2,95

5,42

Laktóz

4,38

4,57

3,93

4,35

Szárazanyag

10,30

12,21

10,98

16,88

Zsírmentes szárazanyag

8,17

8,56

7,74

10,88

Víz

89,70

87,79

89,02

83,12

Ásványi anyag

0,76

0,68

0,81

1,16

A nyers tejeket felhasználás előtt 80°C-on 10 percig hőkezeltem egy Pearl M típusú vízfürdős hőkezelő medencében (Julabo Labortechnik, Seelbach, Németország). 3.2.2. Starterkultúra A 37-40°C-ra visszahűtött tejeket 0,2 U/l (2,0%) koncentrációban beoltottam ABT-5 jelű fagyasztva szárított DVS kultúrával (Chr. Hansen, Hørsholm, Dánia), amely Lb. acidophilus LA-5 (A), B. animalis subsp. lactis BB-12 (B) és S. thermophilus CHCC 742/2130 (T) törzseket tartalmazott. A liofilezett DVS kultúra előnye, hogy garantáltan nagyszámú (> 5,0 × 1010 cfu/g) élő sejtet tartalmaz, előkészítést és átoltást nem igényel, közvetlenül az alapanyag-tejhez adható. Mikrobiológiai megfelelőségét a 12. melléklet szemlélteti. 3.2.3. Termékgyártás A beoltott alapanyagtejek inkubálása 37°C-on történt a kazein izoelektromos pontjának (pH = 4,6) eléréséig. Ezután gyors, jeges vizes hűtés

64

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer következett 15°C-ra. Mind a négy termékből külön-külön 21 egységet adagoltam ki 50 ml-es, steril, jól zárható centrifugacsövekbe (Greiner Bio-One). Egy napos, 8°C-os előhűtést követően a mintákat hűtőszekrénybe helyeztem és 4°C-on tároltam 6 hétig. A termékgyártás teljes folyamatát két ismétléssel hajtottam végre. 3.2.4. Mikrobiológiai vizsgálatok A gyártást követő 0., 7., 14., 21., 28., 35., és a 42. napon mind a négy termékből 3-3 egységet elővettem és meghatároztam a kultúra eredetű mikroorganizmusok élősejt-számait. A savanyú tejtermékekből a mintavételt az ISO 6887-5:2010 szabvány előírásai szerint végeztem, melynek értelmében az egyes egységekből aszeptikus körülmények között kimértem 10 ml-t steril mintavevő zacskóba (Biolab), majd 90 ml szobahőmérsékletű peptonvízzel hígítottam és homogenizáltam. Ezt követően decimális hígítási sort készítettem és a hígítási sor egyes tagjaiból 1-1 ml-t pipettáztam steril Petri-csészékbe (Sarstedt). Mindegyik hígítási tagból két párhuzamos leoltást végeztem. A leoltást követően a sterilezett, 45-50°C hőmérsékletű táptalajból kb. 15 ml mennyiséget öntöttem a Petri-csészékbe és ezt egyenletes rotáló mozgatással elegyítettem a mintaszuszpenzióval. A tápközeg megszilárdulását követően a Petri-csészéket megfordítottam, majd az adott mikroorganizmus igényeinek megfelelő hőmérsékletű termosztátban inkubáltam.

3.2.4.1.

A

Streptococcus

thermophilus

CHCC

742/2130

számbeli

meghatározása A S. thermophilus számbeli meghatározása lemezöntéses eljárással, M17 agaron (Merck) történt, melynek összetételét a 10. mellékletben tüntettem fel. A tápközeg pH-értéke 6,8 ± 0,1 volt (25°C-on). Az M17 agart 121°C-on, 15

65

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer percig gőzzel telített légtérben, autoklávban sterileztem. A beoltott lemezeket 45°C-on, 24 órán át inkubáltam aerob körülmények között. A S. thermophilus tipikus telepei lencse alakúak, 1-2 mm átmérőjűek voltak. A telepképző egységek számát logaritmizált formában adtam meg. 3.2.4.2. A Lactobacillus acidophilus LA-5 számbeli meghatározása A Lb. acidophilus számbeli meghatározása lemezöntéses eljárással, clindamycint és ciprofloxacint tartalmazó MRS agaron (MRS‒CC agar) történt (ISO és IDF, 2006). Az MRS‒CC agar összetétele a 10. mellékletben látható. A táptalaj elkészítése a 3.1.3.5. alfejezetben leírtak szerint történt. A lemezeket 37°C-on, 72 órán át inkubáltam 2,5 l-es anaerob edényekben (Oxoid). A légköri oxigént AnaeroGen AN 25 tasakok (Oxoid) segítségével kötöttem meg. Az O2szint csökkenését az anaerob edénybe helyezett anaerob indikátor (Anaerobic Indicator; Oxoid) elszíntelenedésével ellenőriztem. A Lb. acidophilus azonosítása telepmorfológia alapján történt, mikroszkópos megerősítéssel. A tipikus sejtek Gram-pozitív festődésű, lekerekített végű pálcikák voltak. A telepképző egységek számát logaritmizált alakban adtam meg.

3.2.4.3.

A

Bifidobacterium

animalis

subsp.

lactis

BB-12

számbeli

meghatározása A B. animalis subsp. lactis BB-12 törzs szelektív, számbeli kimutatása lítium‒mupirocinnal (MUP) kiegészített transzgalaktozilált oligoszacharid (TOS) agaron, lemezöntéses technikával történt. A táptalajt a 3.1.3.6. alfejezetben leírtak szerint készítettem el. Az agarlemezeket 37°C-on, 72 órán keresztül inkubáltam 2,5 l-es anaerob edényekben (Oxoid). A légköri oxigént AnaeroGen AN 25 tasakok (Oxoid) segítségével kötöttem meg, az O2-szint tényleges csökkenését az edénybe helyezett anaerob indikátor (Oxoid) elszíntelenedése igazolta. A B. animalis subsp. lactis BB-12 törzs azonosítása

66

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer telepmorfológia alapján történt, mikroszkópos megerősítéssel. A tipikus telepek szabálytalan vagy Y-alakúak voltak. A telepképző egységek számát logaritmizált formában adtam meg. 3.2.4.4. Az élesztőgomba- és penészgomba-szám meghatározása Az

élesztőgomba-

és

penészgomba-szám

meghatározása

élesztő‒glükóz‒kloramfenikol (YGC) agaron (Merck) történt, lemezöntéses eljárással. Az inokulált agarlemezeket 25°C-on, 5 napig inkubáltam, az MSZ 7954:1999 jelzésű magyar szabványban leírtaknak megfelelően. 3.2.4.5. Az Escherichia coli és a kóliformok számának meghatározása A mintákban esetlegesen előforduló Escherichia coli és kóliform baktériumok számát a legvalószínűbb élősejt-szám (3-csöves MPN) módszerrel határoztam meg. A triptofánnal és 4-metil-umbelliferil-β-D-glükuroniddal kiegészített brillantzöld–epe–laktóz (BBL) táplevest (Oxoid) Durham-féle fermentációs csövekkel ellátott kémcsövekbe adagoltam. A tápleves végső pHértéke 7,2 ± 0,1 volt 25°C-on. A decimális hígítási sor egyes tagjaiból 3 × 1-1 ml-t pipettáztam a BBL-táplevest tartalmazó kémcsövekbe. A beoltott csöveket 37°C-on inkubáltam 24-48 óráig, aerob körülmények között. A kóliformok jelenlétére a Durham-csőben keletkező gázbuborék utalt. A kóliform-pozitív csöveket UV-fény (366 nm) alatt ellenőriztem. A fluoreszkáló csövekhez 1-2 csepp Kovács-féle indol reagenst adtam. Az 1-2 perc alatt kialakuló meggypiros színű rozindol gyűrű egyértelműen bizonyította az E. coli jelenlétét. Az eredmények értékelése Hoskins–táblázat (11. melléklet) segítségével történt.

67

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer 3.2.5. pH-mérés A minták és tápközegek pH-értékét szobahőmérsékleten ellenőriztem Jenway 3510-es típusú laboratóriumi digitális pH-mérővel, kombinált üvegelektróda

(Keison

Products,

Chelmsford,

Egyesült

Királyság)

alkalmazásával. A pH-mérőt használat előtt manuálisan kalibráltam 4,00-es és 7,00-es standard pufferoldatokkal (Merck). 3.3. Tehéntejből és tevetejből készített natúr és akácmézes probiotikus savanyú tejtermékek előállítása és vizsgálata A harmadik kísérletsorozat célja az volt, hogy 5% akácmézzel kiegészített tehéntejből, ill. tevetejből készült ABT-típusú savanyú tejtermékek élősejtszám- és pH-változásait nyomon kövessem a 35 napos tárolási idő alatt.

3.3.1. Alapanyagtejek

3.3.1.1. Tevetej A nyers tevetej beltartalmi értékeit az 5. táblázatban foglaltam össze, mikrobiológiai minőségét pedig a 6. táblázat szemlélteti. Az alapanyagot a fejéstől számított 48 órán belül feldolgoztam. 6. táblázat: A nyers tevetej mikrobiológiai minősége Eredmény (cfu/ml)

Mikrobacsoport

7,3 × 103

Aerob mezofil mikroorganizmus-szám Élesztőgomba-szám

< 1,0 × 100

Penészgomba-szám

< 1,0 × 100

Enterobacteriaceae-szám

< 1,0 × 100

68

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer 3.3.1.2. Tehéntej A nyers tehéntej beltartalmi értékeit az 5. táblázatban tűntettem fel, mikrobiológiai minőségét pedig a 7. táblázatban mutatom be. 7. táblázat: A nyers tehéntej mikrobiológiai vizsgálati eredményei Eredmény (cfu/ml)

Mikrobacsoport

4,8 × 103

Aerob mezofil mikroorganizmus-szám Élesztőgomba-szám

< 1,0 × 100

Penészgomba-szám

< 1,0 × 100

Enterobacteriaceae-szám

< 1,0 × 100

3.3.2. Akácméz (Robinia pseudoacacia L.) Az akácmézet Varga Tamás Imre kisbodaki méztermelőtől szereztem be. A kísérletek kezdete előtt megvizsgáltam a méz mikrobiológiai állapotát, hogy megállapítsam, vajon nem juttat-e a termékekbe akkora nagyságrendű és olyan minőségű

mikroorganizmusokat,

amelyek

esetleg

befolyásolhatnák

az

eredmények alakulását. A méz mikrobiológiai paramétereit a 8. táblázatban tüntettem fel. 8. táblázat: A kísérletben felhasznált akácméz mikrobiológiai minősége Eredmény

Mikrobacsoport

8,0 × 100 cfu/g

Aerob mezofil mikroorganizmus-szám Élesztőgomba-szám

< 1,0 × 100 cfu/g

Penészgomba-szám

< 1,0 × 100 cfu/g

Mezofil szulfitredukáló Clostridium spp.

< 1,0 × 100 cfu/g Negatív (25 g-ban)

Salmonella spp.

69

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer 3.3.3. Starterkultúra A hőkezelt, majd lehűtött alapanyagtejeket beoltottam liofilezett ABT-5 DVS kultúrával (Chr. Hansen). A starterkultúra gyártó által deklarált minimális élősejt-száma 5,0 × 1010 cfu/g volt. 3.3.4. Termékgyártás Ismétlésenként 2-2 l teve- és tehéntejet 90°C-on 10 percig hőkezeltem Pearl M típusú vízfürdős hőkezelő medencében (Julabo Labortechnik), majd 40°C-ra hűtöttem le. Mindkét tejtétel feléhez, azaz 1-1 l-hez 5% akácmézet adagoltam. A másik két egység teve-, ill. tehéntej (1-1 l) töltötte be a kontroll szerepét, ezekhez nem adagoltam akácmézet. A mézes és a kontroll tejeket egyaránt beoltottam 0,2 g/l ABT-5 DVS kultúrával (Chr. Hansen). Ez az inokulum-mennyiség megegyezett az üzemi körülmények között a tanktejhez adandó 2%-os tömegkultúra koncentrációval. A tejeket 37°C-on fermentáltam 4,6-es pH-érték eléréséig. A további savanyodást gyors, jeges vizes hűtéssel akadályoztam meg. Aszeptikus körülmények között mind a négy termékből 1818 egységet adagoltam ki steril, jól zárható, 50 ml-es centrifugacsövekbe (Greiner Bio-One). Egynapos, 8°C-os előhűtéssel érleltem a termékeket, végül pedig hűtőszekrényben 4°C-on tároltam a mintákat. 3.3.5. Mikrobiológiai vizsgálatok A gyártást követő 0., 7., 14., 21., 28. és 35. napon mind a négy termékből elővettem 3-3 egységet, és a 3.2.4. alfejezetben ismertetettek szerint meghatároztam a kultúrából származó hasznos mikroorganizmusok, valamint az esetlegesen jelenlévő főbb szennyező, ill. kórokozó mikrobák élősejt-számait.

70

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer 3.3.6. pH-mérés A minták pH-értékét Jenway 3510-es típusú laboratóriumi digitális pHmérővel,

kombinált

üvegelektróda

(Keison

Products)

alkalmazásával

határoztam meg. A pH-mérőt használat előtt minden esetben kalibráltam 4,00es és 7,00-es standard pufferoldatokkal (Merck). 3.4. Mézek hasznos és káros mikroorganizmusokra gyakorolt hatásának vizsgálata agardiffúziós lyukteszttel A negyedik kísérletsorozat célja az volt, hogy megállapítsam különféle mézek mikrobagátló, ill. mikrobaserkentő hatását agardiffúziós lyuktesztek segítségével. 3.4.1. Mézek A kísérleteimben felhasznált mézeket a kisbodaki Varga Tamás Imre őstermelőtől szereztem be. Az egyenként 1000 g tömegű mézmintákat az Országos Magyar Méhészeti Egyesület által előírt termelői mézes üvegekben, szobahőmérsékleten (25°C) tároltam a kísérletek kezdete előtt. A minták mikrobiológiai minőségét a 9. táblázat mutatja. 9. táblázat: A kísérletben felhasznált fajtamézek mikrobiológiai minősége Mézfajta

Összcsíra-

Élesztő-

Penész-

Clostridium-

szám (cfu/g) Akác Hárs

<1 1,3 × 10

2

Salmonella spp. / 25 g

<1

<1

<1

Negatív

<1

<1

<1

Negatív

Vegyes virág

<1

<1

<1

<1

Negatív

Erdei

<1

<1

<1

<1

Negatív

Gesztenye

<1

<1

<1

<1

Negatív

71

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer A vizsgálati eredmények bizonyítják, hogy a felhasznált mézek mindegyike megfelelt a 4/1998 (XI.11.) EüM rendelet (URL5) előírásainak, hiszen egyik sem szennyeződött mezofil szulfitredukáló anaerob spórás baktériumokkal, ill. szalmonellákkal. A mezofil aerob mikrobaszám, valamint az élesztőgomba- és penészgomba-szám ugyan nem tartozik a rendelet által megkövetelt

vizsgálati

paraméterek

közé,

ennek

ellenére

kísérleteim

eredményessége érdekében e jellemzőket is ellenőriztem. Egyik mintában sem találtam sarjadzó-, ill. fonalasgombát, és a mezofil aerob mikroorganizmusszám is kifogástalannak bizonyult (< 1,0 × 100 cfu/g) négy mézfajta (tétel) esetében. Mivel Clostridium és Salmonella fajok nem voltak jelen a hársmézben, az 1,3 × 102 cfu/g-os mikrobaszámát elfogadhatónak tekintettem. 3.4.2. Mikroorganizmus teszttörzsek A mézek mikrobaellenes hatásának megállapításához 11 db baktérium-, 3 db élesztőgomba- és 7 db penészgomba-törzset, míg a mézek esetleges serkentő hatásának vizsgálatához 6 db, jótékony hatásáról ismert baktériumtörzset használtam fel. Az élelmiszerekben előforduló kórokozó baktériumok mellett élelmiszerromlást okozó mikroszkopikus gombafajokat és az élelmiszeripar számos területén alkalmazott tejsavbaktériumokat, ill. egy bifidobaktériumtörzset is bevontam vizsgálataimba. A tesztmikrobák a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményéből (NCAIM, Budapest), az Orvosi Baktériumok Magyar Nemzeti Gyűjteményéből (HNCMB, Budapest), az American Type Culture Collection törzsgyűjteményből (ATCC; LGC Standards, Wesel, Németország) és a Nyugat-magyarországi Egyetem, Mezőgazdaság-

és

Élelmiszer-tudományi

Kara

Élelmiszer-tudományi

Intézetének törzsgyűjteményéből (T; Mosonmagyaróvár) származtak. A 10.a és a 10.b táblázat összegzi a vizsgálatokba bevont mikroorganizmusok fenntartásához szükséges körülményeket.

72

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer 10.a táblázat: A vizsgálatokba bevont baktériumtörzsek Baktériumtörzs

T / H / I / K*

Káros RCM / 37 ± 1 / 24-48 / AN

Clostridium perfringens NCAIM B.01417

TSA / 37 ± 1 / 24 / A

Escherichia coli HNCMB 35035 Listeria monocytogenes NCAIM B.01373

TSA / 37 ± 1 / 24-48 / A

Salmonella Typhimurium HNCMB 10040

TSA / 37 ± 1 / 24-48 / A

Salmonella enterica subsp. arizonae HNCMB 42021

TSA / 37 ± 1 / 24-48 / A

Staphylococcus aureus HNCMB 112002

TSA / 37 ± 1 / 24-48 / A

Bacillus cereus HNCMB 100002

TSA / 30 ± 1 / 24-48 / A

Clostridium histolyticum HNCMB 105009

RCM / 37 ± 1 / 24-48 / AN

Pseudomonas aeruginosa HNCMB 170001

TSA / 26 ± 1 / 72 / A

Bacillus mycoides T4

TSA / 30 ± 1 / 24-48 / A

Clostridium tyrobutyricum T14

RCM / 30 ± 1 / 120 / AN

Hasznos M17 / 45 ± 1 / 24 / A

Streptococcus thermophilus ATCC 19258 Lactobacillus acidophilus ATCC 314

MRS / 37 ± 1 / 72 / AN

Lactobacillus casei ATCC 334

MRS / 37 ± 1 / 72 / AN

Lactobacillus rhamnosus ATCC 7469

MRS / 37 ± 1 / 72 / AN

Lactobacillus paracasei subsp. paracasei ATCC

MRS / 37 ± 1 / 72 / AN

BAA-52 RCM / 37 ± 1 / 72 / AN

Bifidobacterium breve ATCC 15700

* T: fenntartó tápközeg, H: tenyésztési hőfok (°C), I: tenyésztési idő (h), K: tenyésztési körülmény (A = aerob, AN = anaerob)

73

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer 10.b táblázat: A vizsgálatokba bevont élesztőgomba- és penészgomba-törzsek Törzs

T / H / I / K*

Élesztőgomba Candida (Yarrowia) lipolytica KE 0062.86.03.26

GYP / 26 ± 1 / 48 / A

Saccharomyces cerevisiae KE 162.86.05.07

GYP / 26 ± 1 / 48 / A

Zygosaccharomyces bailii NCAIM Y.00734

GYP / 30 ± 1 / 48 / A

Penészgomba Aspergillus niger NCAIM F.00735

PDA / 24 ± 1 / 72-120 / A

Aspergillus wentii NCAIM F.00167

PDA / 26 ± 1 / 72-120 / A

Rhizopus stolonifer NCAIM F.00654

PDA / 26 ± 1 / 72-120 / A

Aspergillus oryzae T42

PDA / 26 ± 1 / 72-120 /A

Fusarium oxysporum NCAIM F.00728

PDA / 26 ± 1 / 72-120 / A

Helminthosporium oxysporum NCAIM F.00745

PDA / 26 ± 1 / 72-120 / A

Penicillium expansum T51

PDA / 26 ± 1 / 72-120 / A

* T: fenntartó tápközeg, H: tenyésztési hőfok (°C), I: tenyésztési idő (h), K: tenyésztési körülmény (A = aerob, AN = anaerob)

A kórokozó baktériumokat – a klosztridiumok kivételével – tripton-szója ferdeagaron (Trypton Soybean Agar, TSA) tartottam fenn, aerob körülmények között. A három Clostridium fajt Reinforced Clostridial Medium (RCM) táptalajon, anaerob körülmények között tenyésztettem. Az élesztőgombák törzsfenntartása glükóz‒élesztőkivonat‒pepton ferdeagaron (Glucose‒Yeast Extract‒Peptone Agar, GYP) történt 26 ± 1°C-on, ill. 30 ± 1°C-on végzett, 48 órán át tartó inkubálás útján. A penészgombákat burgonya‒dextróz agaron (Potato Dextrose Agar, PDA) tenyésztettem jellemzően 26 ± 1°C hőmérsékleten, 3-5 napon keresztül, biztosítva ezzel a kellő mennyiségű konídium kifejlődésének lehetőségét. A hasznos baktériumok közül a Lactobacillus nemzetség tagjait De Man– Rogosa–Sharpe (MRS) ferdeagaron tartottam fenn 37 ± 1°C-os, 72 óráig tartó anaerob inkubációval. A S. thermophilus szaporodását laktóz-monohidrátot tartalmazó M17 agaron végzett egynapos, 45 ± 1°C-os tenyésztéssel

74

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer serkentettem. A B. breve vizsgált törzsét RCM agaron, 37 ± 1°C-os, 72 órán át tartó anaerob inkubáció alkalmazásával tartottam fenn. A ferdeagaron felszaporított mikrobák közül a baktériumokat és az élesztőgombákat havonta oltottam át, míg a penészgombák passzálásátát kéthavonta végeztem el. A ferdeagaros tenyészeteket 4 ± 1°C-on, hűtőszekrényben tároltam. A 10.a és 10.b táblázatban felsorolt törzsek mindegyikét Microbank™ fiolákban tároltam -70 ± 3°C-on, U 41085 típusú ultra-mélyfagyasztóban (New Brunswick Scientific). A TSA, az RCM, a PDA, a GYP, az MRS és az M17 tápagarok pontos összetétele a 10. mellékletben látható. 3.4.3. Agardiffúziós lyuktesztek Az agardiffúziós módszer elnevezése onnan ered, hogy a vizsgálandó anyagok (jelen esetben: mézek) képesek az agarlemezbe diffundálni és serkenteni vagy gátolni a teszt-mikroorganizmusok szaporodását. A gátlási, ill. serkentési zóna mérete függ a vegyület diffúziós sebességétől, koncentrációjától és a mikroba érzékenységétől. A lyuktesztet úgy végeztem, hogy a vizsgálandó mikroorganizmus

friss,

24

órás

tenyészetének

beállított

sejtsűrűségű

szuszpenziójából egységnyi mennyiséget (0,5 ml) steril Petri-csészébe oltottam, majd a megfelelő tápagarral lemezeket öntöttem. Az agarba a szilárdulást követően lemezenként 4-4 db, egyenként 10 mm átmérőjű lyukat fúrtam lelángolt, lehűtött agarfúróval. A kiszúrt agarkorongokat láng felett sterilezett lándzsával távolítottam el a lemezből. Az egyik lyukba kizárólag 0,85% nátrium-kloridot és 0,1% peptont tartalmazó hígítóvizet pipettáztam, mely a teszt-mikroba szaporodását és az eredmények alakulását nem befolyásolta, így ez töltötte be a kontroll szerepét. A maradék három lyukba pedig a vizsgálandó mézek kerültek különböző koncentrációban. Az elkészített lemezeket az adott tesztmikroba számára optimális körülmények között inkubáltam, majd a kialakult gátlási, ill.

75

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer serkentési zónát tolómérő segítségével megmértem. A kapott eredményeket milliméterben adtam meg. 3.4.3.1. Mikrobaszuszpenziók (inokulum) elkészítése A mézminták serkentő, ill. gátló hatásának teszteléséhez ‒ a 10.a és 10.b táblázatban részletezett tenyésztési feltételek szerint ‒ a baktériumok friss, 24 órás tenyészetét állítottam elő. Az agarlemezen kinőtt tipikus telepekből néhányat steril oltókaccsal (Biolab) 2 ml űrtartalmú, 0,85%-os NaCl-oldatot tartalmazó ampullában (API NaCl 0,85% Medium; bioMérieux, Marcy-l’Etolie, Franciaország) szuszpendáltam. A szuszpenziók kívánt sejtűrűségét az optikai denzitás elve alapján állítottam be. Baktériumok esetében 0,5 McFarland (McF) egységet állítottam be Densimat típusú densitométerrel (bioMérieux). Ez az érték milliliterenként 1,5 × 108 db élő baktériumsejtet jelentett. Ezeket a szuszpenziókat használtam fel a TSA, az RCM, az M17 és az MRS agarlemezek közvetlen beoltására. Nagyobb méretük miatt az élesztőgombák a baktériumokétól eltérő előkészítést igényeltek. Mindhárom élesztőfaj esetében 1,0 McF (3,0 × 108 cfu/ml) értéket állítottam be az előzőleg ismertetett módon. A beállított sűrűségű sejtszuszpenziókból 1-1 ml-t 100-100 ml negyederősségű Ringer oldathoz pipettáztam, majd az egyenletes sejteloszlás elérése érdekében rázókeverővel egyneműsítettem a két oldatot, végül az így kapott élesztőszuszpenzióval oltottam be a GYP agarlemezeket. A mézek penészgombákra gyakorolt hatásának vizsgálata frissen átoltott lemezek felületéről gyűjtött konídiumokból készített inokulumokkal történt. Bürker-kamra segítségével kb. 1,0 × 105 konídium/ml-re állítottam be a konídium-szuszpenzió sűrűségét. Ezek a szuszpenziók szolgáltak a PDA agarlemezek közvetlen beoltására.

76

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer 3.4.3.2. Agarlemezek elkészítése

A

3.4.3.1.

alfejezetben

leírtak

szerint

előkészített

baktérium-,

élesztőgomba- és penészgomba-szuszpenziókból 0,5-0,5 ml-t pipettáztam steril Petri-csészékbe, majd pontosan kimért, 20-20 ml mennyiségű, 45-50°C-ra lehűtött TSA, RCM, M17, MRS, GYP, ill. PDA táptalajokkal lemezeket öntöttem. Annak érdekében, hogy a teszt-mikroorganizmusok eloszlása a tápagarban egyenletes legyen, körkörös, egyenletes rotáló mozgást végezem a lemezöntést követően. Az agarlemezek megszilárdulása után lelángolt és lehűtött steril agarfúróval (dugófúró-csővel) lemezenként 4-4 db, egyenként 10 mm átmérőjű lyukat vágtam az agarrétegbe. Az így kiszúrt agarkorongokat steril lándzsával távolítottam el a lemezből. 3.4.3.3. Mézminták és hígításaik elkészítése A négy lyuk közül az elsőbe 200 μl steril hígítóvizet pipettáztam, ez töltötte be a kontroll szerepét, hiszen a tesztmikroba növekedését nem gátolta, miközben jelezte, hogy a törzs életképes állapotban volt a kísérlet során. A második lyukba 200 μl 5%-os mézoldat került, melyet 0,5 ml mézmintához 9,5 ml steril hígítóvíz hozzáadásával készítettem el. Az egyes hígítások előállítása során intenzív keveréssel biztosítottam a méz elegyedését a hígítófolyadékban. A 10%-os mézoldat – mely 1 ml mézet és 9 ml steril hígítóvizet tartalmazott – szintén 200 μl mennyiségben került a harmadik lyukba. A negyedik lyukba 25%-os mézoldatot (2,5 ml méz + 7,5 ml steril hígítóvíz) tettem, ugyancsak 200 μl-nyi mennyiségben. Egy másik agarlemezen a 0%-os kontroll és a 25%-os mézoldatot tartalmazó lyuk mellett 50%-os (5 ml méz + 5 ml steril hígítóvíz) és 100%-os (hígítatlan mézminta) koncentrációban teszteltem a mézek mikrobákra kifejtett hatását.

77

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer 3.4.3.4. Inkubálás és a gátlási, ill. serkentési zónák meghatározása Az elkészített lemezeket ‒ megfordítás nélkül ‒ termosztátba helyeztem, majd a teszt-mikroorganizmus igényeinek megfelelő körülmények között (10.a és 10.b táblázat) inkubáltam. Táptalajba diffundálását követően a mézoldat háromféle hatást fejthetett ki a mikrobákra: 

az adott mikroba érzékenységet mutatott a mézoldat különböző koncentrációira, így a lyuk körül szaporodásgátlási zóna jött létre;



a vizsgált mikroorganizmus szaporodását a mézoldat serkentette, amely egyértelműen látható szaporodási zónában nyilvánult meg;



a mézminta nem gátolta, de nem is serkentette a teszt-mikroba szaporodását. Az inkubációs idő leteltével a gátlási-, ill. serkentési zóna átmérőjét

tolómérővel határoztam meg. Minden egyes vizsgálatot 3-3 db párhuzamos agarlemez felhasználásával végeztem el. 3.5. Termékfejlesztés és érzékszervi bírálatok 3.5.1. Tevetejből és tehéntejből akácméz hozzáadásával készülő probiotikus savanyú tejtermékek kifejlesztése Ötödik kísérletsorozatom célja az volt, hogy tevetejből, ill. tehéntejből akácméz-tartalmú

probiotikus

savanyú

tejtermékeket

állítsak

elő

és

összehasonlítsam ezek érzékszervi tulajdonságait. A termékeket az MTKI Kft. mosonmagyaróvári kísérleti üzemében gyártottam le. A 3.2.1. alfejezetben ismertetett összetételű alapanyagtejekből 1-1 litert használtam fel. A tehéntej zsírtartalma megegyezett a tevetejével (2,7%). A 3.3.2. alfejezetben bemutatott akácmézet a habarás során adagoltam a termékekhez 5%-os, ill. 10%-os mennyiségben. A kontroll egységekhez (1-1 l) nem adtam mézet. Az alapanyag-tejek savanyításához ABT-5 probiotikus

78

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer kultúrát (Chr. Hansen) használtam, melynek fő jellemzőit a 3.3.3. alfejezetben ismertettem. A probiotikus savanyú tejtermékek gyártástechnológiai folyamatát a 6. ábra szemlélteti.

Alap- és adalékanyagok

Technológiai műveletek

Beállított zsírtartalmú

jellemzők 2,7% zsírtartalom

tehéntej, ill. tevetej Stabilizálószer

Tevetej stabilizálás

40 g/l

(Promikoll Myo-4) Homogénezés Hőkezelés Hűtés ABT-5 kultúra

Beoltás

200 bar 90°C, 5 min 42°C-ra 2-4%

[Lactobacillus acidophilus LA-5 (A), Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 (B), Streptococcus thermophilus CHCC 742/2130 (T)] Alvasztás

37°C-on 4,6 pH-ig

Akácméz

Habarás

4,6 pH-n

Ízesítés

0%, 5%, ill. 10%

Kiadagolás

50 ml-enként

Előhűtés, érlelés

1 nap, <10°C

Hűtve tárolás

4°C-on

6. ábra: Natúr és akácmézzel kiegészített probiotikus savanyú tejtermékek gyártási folyamata

79

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer Az eltérő zsírtartalom okozta ízbeli különbségek elkerülése érdekében a tehéntej zsírtartalmát sovány tej adagolásával a tevetejéhez igazítottam (2,7%ra). A kívánt állomány elérése érdekében a hideg tevetejbe 40 g/l Promikoll Myo-4 stabilizálószert (Globál-Vép Kft., Drégelypalánk) diszpergáltam intenzív keverés mellett. A módosított keményítőt, étkezési zselatint és pektint tartalmazó adalékanyag növeli a tevetejből készített savanyú tejtermék viszkozitását, kialakítja a termékre jellemző, kanalazható állományt, miközben megakadályozza a szinerézist a fogyaszthatósági időn belül. Minthogy a Promikoll Myo-4 stabilizálószer 75-80°C-on táródik fel, a hőkezelést megelőzően adtam hozzá a tevetejhez. Az így előkészített tevetejet és a tehéntejet (melyhez nem adagoltam stabilizálószert) 200 bar nyomáson 75°C-on homogéneztem, majd 90°C-on, 5 percig hőkezeltem Pearl M típusú vízfürdőben (Julabo Labortechnik). Ezt követően 42°C-ra lehűtöttem, majd ABT-5 DVS kultúrával (Chr. Hansen) beoltottam a tejtételeket. 37°C-on végzett fermentációja során a tehéntej 4,5 óra elteltével érte el a 4,6-es pH-értéket. A tevetejben lévő tejfehérjék izoelektromos pontjának eléréséhez jóval több időre, 8,5 órára volt szükség 37°C-on. A tejsavbaktériumok tevetejben történő szaporodását jelentősen lassítja a tevetej lizozim-tartalma (Al haj és Al Kanhal, 2010). ElAgamy és mtsai (1996) meghatározták ennek mennyiségét, és átlagosan 150 µg/l értéket mértek, amely több mint kétszerese a tehéntej mintegy 70 µg/l-es lizozim-tartalmának. A lassabb szaporodás és az ebből adódó kisebb savtermelési aktivitás megnöveli a savas alvadás időszükségletét (Jumah és mtsai, 2001). A túlsavanyodást gyors, jeges vizes hűtéssel akadályoztam meg. A tevetej, ill. a tehéntej egy részét 5-5%, valamint 10-10% akácmézzel dúsítottam, míg a kontroll egységeket nem ízesítettem mézzel. Mindkét alapanyagtejből

háromféle

probiotikus

savanyú

tejtermék

készült:

a

mézkiegészítés nélküli natúr, az 5% akácmézes és a 10% akácmézes termék. Az összesen hatféle termékből 24-24 egységnyit adagoltam ki steril, jól zárható,

80

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer centrifugacsövekbe

(Greiner

Bio-One).

A

végtermékek

jellegzetes

állományának kialakulását 6-24 órás, 10°C alatti érleléssel segítettem elő. Az alvadék fokozatosan megszilárdult, aroma- és ízanyagok képződtek (Szakály, 2001). Ezt követően a termékeket 4°C-on, hűtőszekrényben tároltam. A tevetej alapú

termékekben

a

stabilizálószer

kifejtette

állományjavító

hatását:

kanalazható terméket kóstolhattak az érzékszervi bírálók. A 0., 14., 28. és 42. napon elővettem 6-6 egységet és a következőkben leírtak szerint kóstolásra kínáltam a mintákat. 3.5.2. Érzékszervi bírálat A tej és a tejtermékek érzékszervi vizsgálata (MSZ 12292-87) során objektív terméktulajdonságokat elemzünk, és ennek alapján meghatározzuk a minták rangsorát. A rangsorolás végezhető a kedveltség foka vagy általános minőség alapján, de végezhető szín, íz, illat, állag vagy egyéb jellemzők figyelembevételével is. Fontos, hogy a rangsorolást mindig egyetlen, a bírálók által ismert céllal végezzük. A rangsorolásos módszer alkalmazási területe kiterjed a különböző minták bizonyos jellemző szerinti intenzitás-sorrendjének meghatározására, a kezelések hatásának mérésére, pontosabb vizsgálatok előtt a minták előzetes jellemzésére, bizonyos tulajdonságú termékek kiválasztására, valamint fogyasztók bevonásával kedveltségi sorrend meghatározására. A rangsorolásos bírálatot az MSZ 7304/7-80 szabvány (Élelmiszerek érzékszervi vizsgálati módszerei) alapján végeztem, mely szerint az egyes minták érzékszervi tulajdonságainak intenzitása jutott döntő szerephez. A fő rangsorolási paraméter az összízbenyomás volt. A mintákat minden bírálónak azonos edényben és azonos mennyiségben (50

ml-es

centrifugacsőben)

kínáltam

fel.

A

minták

egyértelmű

megkülönböztetését azáltal biztosítottam a bírálók számára, hogy a savanyú tejtermékeket kódszámokkal láttam el. A bírálathoz felhasznált mintákat véletlen sorrendben tálaltam fel, hogy a kóstolási sorrend esetleges befolyásoló

81

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer hatását kiküszöböljem. A hűtőszekrényben tárolt savanyú tejtermékek hőmérséklete a kóstolás időpontjában megközelítőleg megegyezett, vagyis minden esetben 4 ± 1°C volt. A hatféle savanyú tejterméken kívül a bírálók számára feltálaltam a száj öblögetésére és az ízek közömbösítésére szolgáló csapvizet is. A bírálók a mintákat többször is megkóstolhatták, hiszen több tulajdonság figyelembevételével kialakított összbenyomás alapján rangsoroltak. Minden mintasorozathoz bírálati lapot mellékeltem (13. melléklet). A bírálók a bírálati lapon érzékszervi megállapításaik alapján helyezési számot rendeltek a kódszámhoz. Négy minőségi paramétert (külső megjelenés, állag, illat, íz) pontoztak, nullától ötig terjedő skálán. A bírálóknak előzetesen, nyomtatott

formában

rendelkezésére

bocsátottam

az

MSZ

12292-87

szabványban megtalálható “Általános utasítás az új (egységes) bírálati rendszerhez” című mellékletet (14. melléklet), mely pontosan megadta, hogy mely tulajdonságcsoportokra hány pont adható maximálisan. Az érzékszervi bírálatba hat főt vontam be, akik ugyan hivatalos érzékszervi bírálói képesítéssel nem rendelkeztek, de potenciális fogyasztókként releváns véleményt alkothattak a felkínált termékekről. A bírálók az érzékszervi vizsgálat alapján rangsorszámot (1-6) rendeltek a minták kódszámához.

Az egyes érzékszervi

tulajdonságokra

adott

pontszámokat (egy tulajdonságra maximum 5 pont) beszoroztam az MSZ 122586 szabványban (Joghurt és krémjoghurt) található faktorszámokkal, és így megkaptam a tényleges eredményeket, amelyeket Kramer (1960) rangsorolásos módszerével (15. melléklet) értékeltem ki. A módszer jól alkalmazható gyártmányfejlesztésnél, mert gyors és egyszerű kivitelezni, nem igényel bírálati előírást, sokszor etalont sem, és kevésbé képzett érzékszervi bíráló személyek is végezhetik. A rangsorolásos módszer lényege, hogy a bírálóbizottság eredményét összesítve megkapjuk a helyezési számok összege szerinti rangsort, amelyből látható, hogy melyik termék a legkedveltebb, ill. melyik a legkevésbé elfogadott. Matematikai‒statisztikai alapokon nyugvó módszerről van szó, így a minták közötti szignifikáns különbségek megállapítására is alkalmas. A

82

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Anyag és módszer kiértékelés során a teljes bírálóbizottság összesített eredményét használtam fel a rangsor felállításához. 3.6. Matematikai‒statisztikai értékelés A tárolási idő alatt meghatározott élősejtszám- és pH-értékeket a STATISTICA 9.0 számítógépes adatelemző programcsomag (StatSoft Inc., Tulsa, Oklahoma, USA) felhasználásával végeztem el az általános lineáris modell alapján, mely szerint az idő és a termék fix tényezőként, az ismétlések pedig valószínűségi együtthatóként szerepeltek. Az átlagértékek közötti eltérések szignifikáns, ill. nem szignifikáns voltát a Duncan-féle többszörös összehasonlító vizsgálat segítségével állapítottam meg, 95%-os valószínűségi szinten (StatSoft).

83

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 4. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

4.1. Tejsavbaktériumok és bifidobaktériumok szelektív kimutatása A táptalajok közül a CASO agar bizonyult a legkevésbé szelektívnek, ugyanis a vizsgált törzsek mindegyike kiválóan szaporodott benne (11.a és 11.b táblázat). Noha a CASO agar nem tett lehetővé szelektív elkülönítést, számbeli kimutatásra alkalmasnak bizonyult, így kontroll (referencia) tápközegként funkcionált a kísérletek során. A CASO agaron való tenyésztést mindig az adott faj számára optimális körülmények között végeztem az alábbiak szerint: 

Bifidobacterium és Lactobacillus fajok: 37°C, 72 h, anaerob körülmények;



Streptococcus thermophilus: 37°C, 48 h, aerob viszonyok;



Leuconostoc és Lactococcus fajok: 30°C, 72 h, aerob inkubáció.

84

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 11.a táblázat: Bifidobacterium (B.) és Lactobacillus (Lb.) fajok egytörzs-tenyészeteinek számbeli meghatározása* különféle tápközegek és tenyésztési körülmények alkalmazásával Tápközeg, inkubációs hőfok, inkubációs idő és légköri körülmények CASO agar Baktériumtörzs

TOS‒MUP

MRS‒CC

MRS pH 6,2

MRS pH 5,4

MRS pH

M17 agar,

M17 agar,

agar, 37°C,

agar, 37°C,

agar, 37°C,

agar, 37°C,

5,4 agar,

37°C, 48 h,

45°C, 24 h,

aerob

aerob

< 6,00

72 h,

72 h,

72 h,

72 h,

45°C, 48 h,

anaerob

anaerob

anaerob

anaerob

anaerob

B. animalis subsp. lactis BB-12

8,33 ± 0,18b

9,30 ± 0,12a

< 6,00

8,07 ± 0,14b

< 6,00

< 6,00

< 6,00

B. breve M-16V

8,05 ± 0,11

8,76 ± 0,02

< 6,00

8,61 ± 0,04b

< 6,00

< 6,00

< 6,00

8,34 ± 0,02

8,33 ± 0,02

c

a

Lb. acidophilus LA-5

8,20 ± 0,05

b

< 6,00

8,30 ± 0,10

Lb. acidophilus NCAIM B.02085

8,22 ± 0,06b

< 6,00

8,54 ± 0,17a

8,54 ± 0,04a

8,54 ± 0,03a

Lb. casei NCAIM B.01137

7,70 ± 0,19

a

< 6,00

7,30 ± 0,24

7,58 ± 0,08

7,56 ± 0,08

Lb. casei HDRI-R

7,86 ± 0,15a

< 6,00

7,88 ± 0,18a

Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus

6,30 ± 0,18

ab

a

a

8,42 ± 0,11

7,84 ± 0,07

< 6,00

8,51 ± 0,14a

8,17 ± 0,09b

< 6,00

a

< 6,00

7,76 ± 0,28

a

7,45 ± 0,17a

7,80 ± 0,17a

7,64 ± 0,12a

< 6,00

7,20 ± 0,15b

7,30 ± 0,11b

6,48 ± 0,09

b

< 6,00

< 6,00

< 6,00

6,30 ± 0,33b

< 6,00

< 6,00

< 6,00

b

< 6,00

< 6,00

6,78 ± 0,05

6,70 ± 0,18b

< 6,00

< 6,00

7,11 ± 0,09a

a

a

< 6,00 c

a

a

YC-X11 Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus CH-2 * Az adatok 4 vizsgálat (2 párhuzamos × 2 ismétlés) log10 cfu/ml átlag ± szórás értékeit jelölik. abc

Az ugyanabban a sorban szereplő eltérő betűjelzésű átlagok szignifikánsan különböznek egymástól (P < 0,05).

85

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 11.b táblázat: Tejsavbaktériumok egytörzs-tenyészeteinek számbeli meghatározása* különféle tápközegek és tenyésztési körülmények alkalmazásával Tápközeg, inkubációs hőfok, inkubációs idő és légköri körülmények CASO agar Baktériumtörzs

Streptococcus thermophilus TH-4

7,43 ± 0,12a

Streptococcus thermophilus DSM

8,05 ± 0,22

TOS‒MUP

MRS‒CC

MRS pH 6,2

MRS pH 5,4

MRS pH

M17 agar,

M17 agar,

agar, 37°C,

agar, 37°C,

agar, 37°C,

agar, 37°C,

5,4 agar,

37°C, 48 h,

45°C, 24 h,

aerob

aerob

72 h,

72 h,

72 h,

72 h,

45°C, 48 h,

anaerob

anaerob

anaerob

anaerob

anaerob

< 6,00

< 6,00

< 6,00

< 6,00

< 6,00

7,57 ± 0,13a

6,78 ± 0,18b 6,90 ± 0,18b

a

< 6,00

< 6,00

< 6,00

< 6,00

< 6,00

7,89 ± 0,17

7,98 ± 0,17a

< 6,00

< 6,00

7,81 ± 0,07a

< 6,00

< 6,00

7,71 ± 0,19a

< 6,00

7,18 ± 0,12a

< 6,00

< 6,00

< 6,00

< 6,00

< 6,00

6,30 ± 0,27b

< 6,00

7,80 ± 0,18a

< 6,00

< 6,00

< 6,00

< 6,00

< 6,00

< 6,00

< 6,00

a

20479 Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 19435 Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis VK-256 Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum ATCC 19255 * Az adatok 4 vizsgálat (2 párhuzamos × 2 ismétlés) log10 cfu/ml átlag ± szórás értékeit jelölik. ab

Az ugyanabban a sorban szereplő eltérő betűjelzésű átlagok szignifikánsan különböznek egymástól (P < 0,05).

86

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük A B. animalis subsp. lactis BB-12 és a B. breve M-16V csak 37°C-on, 72 óráig, anaerob módon inkubált CASO agaron, TOS‒MUP agaron és 6,2 pHértékű MRS agaron szaporodott. A TOS‒MUP agaron nyertem vissza a bifidobaktériumokat a legnagyobb számban, mindent egybevetve ez a táptalaj bizonyult legalkalmasabbnak az említett bifidobaktérium fajok szelektív elkülönítésére és számbeli meghatározására. Mindkét Lb. acidophilus törzs (LA-5 és NCAIM B.02085) szaporodott a vizsgált táptalajok többségén, azonban a TOS‒MUP agaron és a 45°C-on 24 órán át aerob módon termosztált M17 agaron nem képeztek telepeket. Hasonló eredményeket kaptam a Lb. casei NCAIM B. 01137 és HDRI-R törzseivel is, amelyek a nyolc kimutatási mód közül hatban szaporodtak, azonban a TOS‒MUP agaron (37°C, 72 órás anaerob inkubáció) és az 5,4-es pH-értékű MRS agaron (45°C, 48 óráig tartó anaerob tenyésztés) nem képeztek telepeket. A Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus YC-X11 és CH-2 a referencia tápközegen

(CASO-agar),

valamint

az

MRS

tápagarok

mindegyikén

szaporodott a 37°C-os anaerob tenyésztés eredményeképpen. Az azonos összetételű táptalajok közül a 6,2-es pH-értékű MRS agar produkálta a legnagyobb Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus élősejt-szám visszanyerést. Összességében mindkét tápközeg alkalmasnak mutatkozott a joghurtkultúra pálcika alakú baktériumainak számbeli meghatározására. A S. thermophilus TH-4 és DSM 20479 a referencia tápközegen kívül csak az M17 táptalajon szaporodott. Látható, hogy a kisebb inkubációs hőfok (37°C) és a hosszabb inkubációs időtartam (48 óra) hatékonyabban serkentette a joghurt gömb alakú baktériumait. Ezt igazolta a 45°C-on 1 napig inkubált M17 agarhoz viszonyított, kb. egy nagyságrenddel nagyobb élősejt-szám átlagérték. A mezofil tejsavbaktérium fajok élősejt-szám visszanyerése a nyolc módszer közül meglehetősen kevés esetben volt sikeres, ami annak tudható be, hogy a bevont táptalajok és/vagy az alkalmazott inkubációs körülmények nem voltak megfelelőek a Lactococcus és a Leuconostoc fajok számára. A CASO-

87

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük agar inkubációs hőfoka (30°C) felelt meg leginkább a mezofil törzseknek. Sohrabvandi

és

mtsai

(2012)

szerint

a

mezofil

tejsavbaktériumok

szaporodásának hőmérsékleti optimuma ugyan 25°C és 31°C között van, azonban a legtöbb faj rendszerint gyorsabban szaporodik 25°C-on, mint 31°Con. Nem volt meglepő, hogy a laktokokkuszok jól szaporodtak a 37°C-on inkubált M17 agaron. A Lc. lactis subsp. lactis ATCC 19435 az anaerob módon, 37°C-on 72 órán keresztül inkubált MRS pH 6,2 agaron jól fejlett telepeket képzett. Ez a megfigyelésünk összhangban van Antunes és mtsai (2007) eredményével, akik kísérleteik során úgy találták, hogy a CHN-22 mezofil aromatermelő kultúra 108 cfu/ml nagyságrendű telepszámot képzett MRS-alapú táptalajon, 37°C-os tenyésztés során. A Ln. mesenteroides subsp. dextranicum ATCC 19255 aromatermelő tejsavbaktérium törzset kizárólag a kontroll táptalajon (CASO-agar) lehetett számbelileg meghatározni. Az előzőek alapján egyértelmű, hogy a bifidobaktériumok szelektív elkülönítése sikeresen megvalósítható TOS‒MUP agaron. Mind a BB-12, mind az M-16V törzs nagyobb élősejtszámot ért el ezen a szelektív táptalajon, mint a referenciaként szolgáló CASO agaron. A Bifidobacterium nemzetség tagjain kívül

a

többi

11

vizsgált

faj

(törzs)

egyike

sem

szaporodott

a

lítium‒mupirocinnal kiegészített TOS agaron. Számos tanulmányban számoltak be a bifidobaktériumok szelektív elkülönítéséről. Rada és Koc (2000) szerint 100 mg/l mupirocint tartalmazó Wilkins‒Chalgren agar, míg Simpson és mtsai (2004) kutatásai alapján 50 mg/l mupirocinnal és 0,05% (w/v) cisztein‒hidrokloriddal kiegészített MRS agar alkalmas erre a célra. Egy mértékadó szabvány 50 mg/l mupirocinnal kiegészített, transz-oligoszacharidokat tartalmazó propionát agart javasol a termékekben jelen lévő Bifidobacterium spp. tejsavbaktériumoktól történő szelektív elkülönítésére (ISO és IDF, 2010).

88

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük Serafini és mtsai (2011) kimutatták, hogy a Bifidobacterium nemzetség 30 fajának törzsei képesek elviselni szélsőségesen nagy (1000 mg/l) mupirocin koncentrációt is. A clindamycinnel és ciprofloxacinnal kiegészített MRS agar (MRS‒CC agar) nagymértékben szelektív volt a Lb. acidophilus-ra, azonban a Lb. casei szaporodását nem gátolta, ezért az MRS‒CC agar csak abban az esetben ajánlható a Lb. acidophilus szelektív elkülönítésére, ha Lb. casei egyáltalán nincs jelen, vagy csak a Lb. acidophilus-ét nem meghaladó mennyiségben kimutatható a termékben. A Lb. acidophilus szelektív kimutatásával kapcsolatosan hasonló nehézségekről számoltak be Saccaro és mtsai (2012), állításaik szerint ugyanis azok a táptalajok, amelyek a Lb. acidophilus szaporodását serkentik, elősegítik a Lb. rhamnosus és a Lb. casei szaporodását is. Ezek az állítások némiképp meglepőek, hiszen az általuk tesztelt MRS‒clindamycin agar, mely 0,5 mg/l mennyiségben tartalmazta a linkózamidok csoportjába tartozó antibiotikumot, korábbi közlések alapján (Van de Casteele és mtsai, 2006) optimális tápközegnek bizonyult a Lb. acidophilus szelektív kimutatására, amennyiben a kísérőflórát a joghurtkultúra alkotói és egyéb, probiotikus fajok (törzsek) képviselték. A 37°C-on inkubált nem szelektív MRS agar optimális tenyésztési feltételeket biztosított a vizsgált fajok nagy részének. Amint azt a 11.a táblázatban feltüntettem, a Streptococcus, a Lactococcus, a Leuconostoc és a Bifidobacterium nemzetség tagjain kívül az összes Lactobacillus spp. jól szaporodott a 37°C-on, 72 óráig, anaerob módon inkubált MRS pH 5,4 agaron. Ez a módszer ezért legfőképpen a Lactobacillus nemzetség tagjainak szelektív kimutatását teszi lehetővé. Ugyanerre a megállapításra jutott Tharmaraj és Shah (2003) is, akik bizonyították, hogy a Lb. acidophilus-t MRS agaron, 43°C-os, 72 órás anaerob tenyésztéssel lehet szelektíven kimutatni. Hasonlóképpen, Lima és mtsai (2009) vizsgálatában is az 5,4-es pH-értékű MRS agar produkálta a legnagyobb élősejt-számokat a Lb. acidophilus probiotikus és nem probiotikus törzsektől való szelektív elkülönítése során.

89

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük Dave és Shah (1996) szerint viszont az 5,2-es pH-értékű MRS agar a Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus szelektív kimutatására alkalmas, amennyiben az inkubálás 45°C-on, 72 órán át történik. A 37°C-on, 48 óráig inkubált M17 agar szinte az összes tejsavbaktérium törzs szaporodását elősegítette. A tenyésztési hőfok 8°C-os emelése (45°C-ra) és az inkubációs időtartam 48 óráról 24 órára csökkentése egyidejűleg javította az M17 agar szelektivitását, hiszen ez utóbbi tenyésztési körülmények csupán a S. thermophilus és a Lb. casei törzsek élettevékenységének kedveztek. Ez a megfigyelésem összhangban van a nemzetközi szakirodalomban olvasható állításokkal, ugyanis például Tabasco és mtsai (2007) sikeresen alkalmazták az M17 agart (45°C, 24 óra, aerob inkubáció) S. thermophilus szelektív elkülönítésére. Tapasztalatuk szerint az inkubációs idő 48 órára történő meghosszabbítása viszont már lehetővé tette a Lb. acidophilus tűhegy alakú telepeinek kifejlődését. 4.2. Tehén-, juh-, kecske- és tevetej alapú probiotikus savanyú tejtermékek előállítása és vizsgálata 4.2.1. Streptococcus thermophilus CHCC 742/2130 élősejt-szám változása a négyféle tejből készült probiotikus savanyú tejtermékek hűtve tárolása során A 12. táblázat szemlélteti a S. thermophilus élősejt-számában bekövetkezett változásokat a hathetes tárolási periódus alatt.

90

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 12. táblázat: Streptococcus thermophilus CHCC 742/2130 élősejt-számának változása a négyféle tejből készült probiotikus (ABT típusú) savanyú tejtermékek 4°C-os tárolása során Tárolási idő

Tehéntejből

Tevetejből

Log10 cfu/ml*

%

Log10 cfu/ml*

%

Log10 cfu/ml*

%

Log10 cfu/ml*

%

8,68 ± 0,11A,b

100,0

8,95 ± 0,13A,a

100,0

8,76 ± 0,14A,ab

100,0

8,80 ± 0,22A,ab

100,0

104,7

8,80 ± 0,03

A,a

100,0

8,75 ± 0,32A,a

8,70 ± 0,18

7

AB,ab

8,68 ± 0,13A,a

14 21 28 35

8,50 ± 0,08

AB,b

8,52 ± 0,21

AB,b

8,50 ± 0,08

AB,b

8,42 ± 0,06

42

B,b

66,1 69,2 66,1 55,0

8,86 ± 0,09

A,a

8,92 ± 0,11

A,a

8,93 ± 0,21

A,a

8,93 ± 0,16

A,a

70,8

8,61 ± 0,06

A,b

63,1

8,60 ± 0,31A,a

81,3

8,66 ± 0,06

A,b

8,63 ± 0,14

A,b

93,3 95,5 95,5

8,10 ± 0,43

AB,b

7,88 ± 0,21

B,d

* Az adatok 6 mérés (3 párhuzamos × 2 ismétlés) átlag ± szórás-értékét jelölik. AB

Az azonos oszlopban szereplő eltérő nagybetűk szignifikáns különbséget jeleznek (P < 0,05).

abcd

Juhtejből

készült fermentált ABT tej

(nap)

0

Kecsketejből

Az azonos sorban szereplő eltérő kisbetűk szignifikáns különbséget jeleznek (P < 0,05).

91

70,8

8,74 ± 0,04

A,a

87,1

69,2

8,75 ± 0,13A,a

89,1

79,4

8,70 ± 0,25

A,ab

79,4

8,68 ± 0,24

A,ab

75,8

AB,ab

60,3

B,c

30,2

74,1 21,9 13,2

8,58 ± 0,24

8,28 ± 0,06

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük A sztreptokokkuszok a termékgyártás végére, ill. a tárolás kezdetére jelentős élősejtszám-értéket (> 4,8 × 108 cfu/ml) értek el mind a négy termékben, és a S. thermophilus volt a 6 hetes tárolási idő végén legnagyobb számban jelenlévő kultúrakomponens. Amint a 12. táblázatban látható, a S. thermophilus-szám mindvégig, önmagában véve is meghaladta a minimálisan megkövetelt (107 cfu/g), kultúrából származó tejsavbaktérium-szám értékét (Magyar Élelmiszerkönyv Bizottság, 2004). Ez a megfigyelésem összhangban van azokkal a beszámolókkal, amelyek a S. thermophilus nagyarányú túléléséről szólnak joghurtok és egyéb savanyú tejtermékek esetében. A kokkusz alakú joghurtbaktérium akár 108 cfu/ml-es mennyiségben is képes túlélni a 3-6 hétig tartó hűtve tárolást (Varga és mtsai, 2002; Antunes és mtsai, 2005; Kudełka; 2010). Kísérleti termékeim S. thermophilus élősejt-számában eltérő mértékű változások következtek be a 6 hetes tárolás alatt, mert míg a fermentált tevetejben 42 nap alatt nem csökkent (P > 0,05) a kokkusz alakú tejsavbaktériumok száma, addig a másik három termékről ez nem volt elmondható, és a túlélési dinamika is erősen alapanyag-függőnek bizonyult. Legkisebb túlélési arányt (13,2%) a kecsketejből készült termékben figyeltem meg a hűtve tárolás 42. napján. Ennél nagyobb (P < 0,05) értékeket kaptam a juhtejből (30,2%) és a tehéntejből (55,0%) készült probiotikus savanyú tejekben, amelyek azonban egymástól is különböztek (P < 0,05) a S. thermophilus életképességét illetően. 4.2.2. Lactobacillus acidophilus LA-5 élősejt-szám változása a négyféle tejből készült probiotikus savanyú tejtermékek hűtve tárolása során A különféle tej-alapanyagokból ABT-5 kultúrával készített savanyú tejtermékek Lb. acidophilus élősejt-számának változását a 13. táblázatban szemléltetem.

92

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 13. táblázat: Lactobacillus acidophilus LA-5 élősejt-számának változása a négyféle tejből készült probiotikus (ABT típusú) savanyú tejtermékek 4°C-os tárolása során Tárolási

Tehéntejből

Tevetejből

idő (nap)

Kecsketejből

készült fermentált ABT tej Log10 cfu/ml*

%

Log10 cfu/ml*

%

Log10 cfu/ml*

%

Log10 cfu/ml*

%

0

6,48 ± 0,44A,a

100,0

6,71 ± 0,29AB,a

100,0

6,46 ± 0,15A,a

100,0

6,83 ± 0,21A,a

100,0

7

6,46 ± 0,03

A,a

95,5

6,64 ± 0,16

14

6,39 ± 0,04A,b

81,3

6,59 ± 0,09A,a

21

6,35 ± 0,23

A,ab

74,1

A,a

6,47 ± 0,18

A,ab

28 35 42

6,38 ± 0,15

A,a

6,09 ± 0,55

A,a

97,7 79,4 40,7

AB,a

6,68 ± 0,07 6,46 ± 0,16

AB,ab

6,35 ± 0,11 6,36 ± 0,35

B,a

AB,a

85,1

6,44 ± 0,08

A,a

75,8

6,44 ± 0,17A,ab

93,3

A,b

56,2 43,7 44,7

6,37 ± 0,07 6,27 ± 0,08

AB,b

6,01 ± 0,17

B,b

6,01 ± 0,16

B,a

* Az adatok 6 mérés (3 párhuzamos × 2 ismétlés) átlag ± szórás-értékét jelölik. AB ab

Juhtejből

Az azonos oszlopban szereplő eltérő nagybetűk szignifikáns különbséget jeleznek (P < 0,05).

Az azonos sorban szereplő eltérő kisbetűk szignifikáns különbséget jeleznek (P < 0,05).

93

95,5

6,66 ± 0,19

A,a

67,6

95,5

6,77 ± 0,13A,a

87,1

81,3

6,72 ± 0,10

A,a

77,6

6,62 ± 0,09

A,a

61,7

6,55 ± 0,13

A,a

52,5

6,53 ± 0,40

A,a

50,1

64,6 35,5 35,5

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük A Lb. acidophilus LA-5 kezdeti élősejt-száma több mint két nagyságrenddel kisebb volt, mint a sztreptokokkuszoké, és a két faj számbeli változásainak tendenciája is különbözött. A laktobacilluszok esetében lassú és közel egyenletes mértékű pusztulást tapasztaltam, amely azt eredményezte, hogy a 6. hét végén mért túlélési arányszámokat illetően nem volt különbség (P > 0,05) a termékek között. A fermentált kecsketejben a tárolás kezdetén szaporodóképes Lb. acidophilus sejteknek több mint egyharmada, a juhtejből készített termékben pedig kb. felük maradt életben a 6 hetes hűtve tárolást követően. Mindent egybevetve, a Lb. acidophilus számára nagyjából azonos túlélési feltételeket biztosított a négyféle alapanyag-tej. Eredményeim eltérnek a Senaka Ranadheera és mtsai (2012) által közöltektől, ők ugyanis a Lb. acidophilus LA-5 élősejt-számának jelentős, négy nagyságrendnyi csökkenéséről számoltak be kecsketejből AB típusú kultúrával készített natúr savanyú tejtermék esetében, négyhetes, 4°C-os tárolást követően. Egy másik kísérletben Nighswonger és mtsai (1996) szintén a Lb. acidophilus termékbeli élősejt-szám csökkenését (P < 0,05) tapasztalták 28 napig 5-7°C-on tárolt savanyú íróban és joghurtokban. 4.2.3. Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 élősejt-szám változása a négyféle tejből készült probiotikus savanyú tejtermékek hűtve tárolása során A bifidobaktériumok élősejt-számában a hathetes hűtve tárolás alatt bekövetkezett változásokat a 14. táblázat mutatja.

94

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 14. táblázat: Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 élősejt-számának változása a négyféle tejből készült probiotikus (ABT típusú) savanyú tejtermékek 4°C-os tárolása során Tárolási

Tehéntejből

Tevetejből

idő (nap)

0

Log10 cfu/ml*

%

Log10 cfu/ml*

%

Log10 cfu/ml*

%

Log10 cfu/ml*

%

6,89 ± 0,04A,a

100,0

6,39 ± 0,16A,b

100,0

7,00 ± 0,18A,a

100,0

6,87 ± 0,17A,a

100,0

A,ab

6,71 ± 0,43

14

6,78 ± 0,15A,a

21

6,80 ± 0,09

A,a

6,82 ± 0,19

A,a

6,81 ± 0,10

A,a

6,83 ± 0,08

A,a

35 42

66,1

6,35 ± 0,05

A,b

91,2

77,6

6,30 ± 0,04A,b

81,3

6,77 ± 0,32ABC,ab

81,3

6,27 ± 0,08

A,b

75,8

ABC,a

6,37 ± 0,06

A,b

85,1 83,2 87,1

6,39 ± 0,25

95,5

A,ab

6,24 ± 0,06

100,0

A,b

70,8

6,69 ± 0,09 6,62 ± 0,16 6,59 ± 0,52

AB,a

ABC,ab

6,49 ± 0,11

BC,b

6,33 ± 0,10

C,b

* Az adatok 6 mérés (3 párhuzamos × 2 ismétlés) átlag ± szórás-értékét jelölik. ABC ab

Juhtejből

készült fermentált ABT tej

7

28

Kecsketejből

Az azonos oszlopban szereplő eltérő nagybetűk szignifikáns különbséget jeleznek (P < 0,05).

Az azonos sorban szereplő eltérő kisbetűk szignifikáns különbséget jeleznek (P < 0,05).

95

49,0

6,71 ± 0,25

A,ab

69,2

58,9

6,83 ± 0,05A,a

91,2

41,7

6,88 ± 0,13

A,a

102,3

6,86 ± 0,05

A,a

97,7

A,ab

91,2

A,a

85,1

38,9 30,9 21,4

6,83 ± 0,13

6,80 ± 0,16

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük A B. animalis subsp. lactis BB-12 kezdeti élősejt-száma elérte, sőt többnyire nagymértékben meghaladta a táplálkozás-fiziológiai szempontból kívánatosnak tartott 106 cfu/g értéket (Sanders és Huis in’t Veld, 1999; Shah, 2000; Magyar Élelmiszerkönyv Bizottság, 2004; Kechagia és mtsai, 2013). E tekintetben nem észleltem különbséget (P > 0,05) a tehéntejből és a két kiskérődző faj tejéből előállított savanyú tejtermékek között, a tevetejből gyártott fermentált tejben viszont ennél kb. fél nagyságrenddel kisebb kezdeti bifidobaktérium-számot (P < 0,05) tapasztaltam. A hűtve tárolás alatti életképesség-megőrzés szempontjából a kecsketej rosszabb feltételeket kínált a bifidobaktériumoknak, mint a másik három tej-alapanyag: a teve-, a juh- és a tehéntejből készült probiotikus savanyú tejekben 6 hét alatt nem csökkent (P > 0,05) a bifidobaktériumok élősejt-száma, míg a kecsketej alapú termékben közel 80%-os pusztulást mértem. A vázolt folyamatok azt eredményezték, hogy a kecsketej- és a tevetej-alapú termék végül hasonló mennyiségű élő B. animalis subsp. lactis sejtet tartalmazott a 6. hét végén. Ehhez képest mintegy fél nagyságrenddel nagyobb értéket (P < 0,05) regisztráltam fermentált tehén-, ill. juhtej mintáimban. A legvalószínűbb magyarázat az, hogy az alapanyagként felhasznált tehéntej és juhtej szárazanyag-tartalma számottevően nagyobb volt, mint a kecsketejé és a tevetejé (5. táblázat), márpedig a bifidobaktérumok köztudottan igényesek a tápanyagellátásra: szaporodásukhoz és termékbeli túlélésükhöz szénhidrátokban és egyéb tápanyagokban gazdag életteret igényelnek (Scardovi, 1986; Tamime és mtsai, 1995). A bifidobaktériumok savanyú tejtermékekben való túlélését illetően megoszlik a kutatók véleménye. A fellelhető közleményekben szereplő adatok nagy szórást mutatnak, ugyanis míg egyesek szerint milliliterenként kevesebb, mint 105 db bifidobaktérium sejt, addig mások szerint több mint 108 db sejt vészeli át a joghurtban uralkodó erősen savas körülményeket (Abu-Taraboush és mtsai, 1998; Gueimonde és mtsai, 2004; Senaka Ranadheera és mtsai, 2012). Eredményeim egyezést mutattak Abu-Taraboush és mtsai (1998), Gueimonde

96

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük és mtsai (2004), valamint Senaka Ranadheera és mtsai (2012) munkáival, melyek szerint a bifidobaktériumok egy nagyságrendnyi pusztulása következik be a tárolás 2. és 4. hete között. 4.2.4. A négyféle tejből készült probiotikus savanyú tejtermékek káros mikrobiotájának vizsgálata A hasznos (kultúrából származó) mikroorganizmusokon kívül vizsgáltam egyes káros (szennyező) mikrobacsoportok esetleges jelenlétét is az ABT típusú savanyú

tejtermékekben.

Eredményeim

szerint

élelmiszer-biztonsági

szempontból kifogástalan volt a fermentált tejtermékek mindegyike, ugyanis egyik minta sem tartalmazott élesztőgombákat, penészgombákat (< 1,0 × 100 cfu/ml), E. colit, ill. kóliform baktériumokat (< 3,0 × 10-1 cfu/ml). 4.2.5. A négyféle tejből készült probiotikus savanyú tejtermékek pH-értékének változása a hűtve tárolás során A termékek kémhatásának változását is nyomon követtem a 6 hetes tárolás során, és azt tapasztaltam, hogy a 4°C-os hőmérséklet nagyrészt megakadályozta az utósavanyodást, hiszen 42 nap alatt csupán kis mértékben (0,01-0,24 egységgel) csökkent az egyes probiotikus savanyú tejtermékek pHértéke. Hasonló megállapításra jutott Medina és Jordano (1995) is, akik 7°C-on tárolt ABT típusú fermentált tejtermékek pH-jának alakulását vizsgálták 36 napon keresztül, és 0,3-0,4-es csökkenést tapasztaltak.

97

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 4.3. Tehéntejből és tevetejből készített natúr és akácmézes probiotikus savanyú tejtermékek előállítása és vizsgálata 4.3.1. Streptococcus thermophilus CHCC 742/2130 élősejt-számának hűtve tárolás alatti alakulása tehéntejből, illetve tevetejből készített kontroll és akácmézes probiotikus savanyú tejtermékekben A 15. táblázat szemlélteti a S. thermophilus CHCC 742/2130 élősejtszámában az öthetes tárolási periódus alatt bekövetkezett változásokat. Látható, hogy a sztreptokokkuszok milliliterenkénti élősejt-száma a termékgyártás végére egymilliárd körüli értéket ért el az összes termékben. A 35 napos tárolás során lassú, összességében nem jelentős mértékű csökkenés következett be a kontroll termékek és az 5% akácmézet tartalmazó minták élősejt-számában is. Mindvégig a S. thermophilus volt a legnagyobb számban jelenlévő kultúraalkotó. A mézadagolásnak egyik alapanyagtej esetében sem volt szignifikáns hatása (P > 0,05) a sztreptokokkuszokra a fermentáció, ill. az azt követő tárolási periódus alatt. Natúr és méztartalmú savanyú tejtermékek vizsgálatáról szóló korábbi tanulmányaikban Varga (2006), valamint Süle és Varga (2009) kifejtették, hogy az akácméz nem rontja (P > 0,05) a S. thermophilus életképességét a hűtve tárolás alatt. Molan (1992) ezzel szemben azt állította, hogy a méz – pontosan nem meghatározott koncentrációban – gátló hatást fejt ki számos Streptococcus fajra. A 15. táblázatból kitűnik, hogy ‒ amint azt a 4.2.1. alfejezetben is megállapítottam ‒ a S. thermophilus CHCC 742/2130 élősejtszáma a teljes tárolási idő alatt, egymagában felülmúlta a Magyar Élelmiszerkönyv által savanyú tejtermékektől megkövetelt, grammonkénti 107, kultúrából származó tejsavbaktérium-szám értékét (Magyar Élelmiszerkönyv Bizottság, 2004).

98

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 15. táblázat: Streptococcus thermophilus CHCC 742/2130 élősejt-számának változása tehéntejből, ill. tevetejből készített kontroll és akácmézes probiotikus (ABT típusú) savanyú tejtermékek 4°C-os tárolása során Tárolási idő (nap)

Tevetejből készített kontroll

Tehéntejből készített

akácmézes

kontroll

akácmézes

fermentált ABT tejtermék Log10 cfu/ml* a

0

9,03 ± 0,06

7

8,88 ± 0,06a

14 21 28 35

8,97 ± 0,02

a

8,99 ± 0,02

a

8,98 ± 0,03

a

8,87 ± 0,14

a

%†

a

100,0

9,01 ± 0,06

70,0

8,86 ± 0,07a

84,5

8,98 ± 0,03

a

8,98 ± 0,04

a

88,2 87,3 70,0

%†

Log10 cfu/ml*

8,99 ± 0,10

9,04 ± 0,10

8,94 ± 0,12

74,0

8,80 ± 0,03a

96,0

8,87 ± 0,02

b

8,86 ± 0,02

b

8,89 ± 0,03

b

8,92 ± 0,19

a

99,0

a

110,0

* Az adatok 6 mérés (3 párhuzamos × 2 ismétlés) átlag ± szórás-értékét jelölik. † Túlélési arány = (cfu/ml az n-edik tárolási napon / cfu/ml a 0. tárolási napon) × 100. ab

Az azonos sorban szereplő eltérő kisbetűk szignifikáns különbséget jeleznek (P < 0,05).

99

a

100,0

96,0

ab

Log10 cfu/ml*

%†

Log10 cfu/ml* a

%†

100,0

8,97 ± 0,12

69,2

8,86 ± 0,20a

78,4

80,2

8,88 ± 0,03

b

77,3

8,94 ± 0,04

a

90,7

ab

85,6

a

87,6

80,1 84,6 98,9

8,92 ± 0,03

8,93 ± 0,03

100,0

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 4.3.2. Lactobacillus acidophilus LA-5 élősejt-számának hűtve tárolás alatti alakulása tehéntejből, illetve tevetejből készített kontroll és akácmézes probiotikus savanyú tejtermékekben A kétfajta tej-alapanyagból ABT-5 kultúrával készült négyféle savanyú tejtermék Lb. acidophilus élősejt-számának változását a 16. táblázatban szemléltetem. A laktobacilluszok kezdeti száma több mint egy nagyságrenddel kisebb volt a sztreptokokkuszokénál, és a két faj (törzs) sejtszám alakulásának tendenciája is különbözött. Ennek ellenére, a 35. napon mért élősejt-számokat illetően csekély volt az eltérés a négy termék között. Amint a 16. táblázat mutatja, a kontroll tehéntej jobb körülményeket (P < 0,05) biztosított a Lb. acidophilus LA-5 elszaporodásához, mint a mézkiegészítés nélküli tevetej; 5% akácméz jelenléte azonban jelentősen javította a laktobacilluszok szaporodását a tevetej alapanyagban. Utóbbi megállapításom nem mond ellent a szakirodalomban olvasható közléseknek, ugyanis Chick és mtsai (2001) arról számoltak be, hogy 5% méz jelenléte 24 óra elteltével ugyanúgy serkentette a Lb. acidophilus szaporodását tejben, mint ugyanennyi fruktózé vagy szacharózé. Kontroll termékeimben 0,25-0,56, méztartalmú mintáimban pedig 0,320,57 nagyságrendű laktobacillusz pusztulást tapasztaltam a hűtve tárolás 5 hete során, ami összhangban van Macedo és mtsai (2008) vizsgálati eredményével, miszerint a Lb. acidophilus élősejt-száma 0,31 és 0,44 nagyságrenddel csökkent 7°C-on 35 napig tárolt natúr, ill. mézes savanyú tejekben.

100

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 16. táblázat: Lactobacillus acidophilus LA-5 élősejt-számának változása tehéntejből, ill. tevetejből készített kontroll és akácmézes probiotikus (ABT típusú) savanyú tejtermékek 4°C-os tárolása során Tárolási idő (nap)

Tevetejből készített kontroll

Tehéntejből készített

akácmézes

kontroll

akácmézes

fermentált ABT tejtermék Log10 cfu/ml* c

0

7,11 ± 0,13

7

7,03 ± 0,20ab

14 21 28 35

6,98 ± 0,03

b

6,96 ± 0,02

b

6,96 ± 0,04

b

6,86 ± 0,06

b

%†

Log10 cfu/ml* a

100,0

7,58 ± 0,11

88,5

7,25 ± 0,02a

73,8

a

71,5 70,8 56,2

7,25 ± 0,02 7,10 ± 0,16

ab

7,18 ± 0,09 7,01 ± 0,13

a

ab

%†

Log10 cfu/ml*

100,0

7,59 ± 0,30

46,2

7,21 ± 0,04ab

46,2

7,20 ± 0,06

a

7,32 ± 0,14

a

7,31 ± 0,12

a

7,03 ± 0,02

a

33,3 38,5 28,2

* Az adatok 6 mérés (3 párhuzamos × 2 ismétlés) átlag ± szórás-értékét jelölik. † Túlélési arány = (cfu/ml az n-edik tárolási napon / cfu/ml a 0. tárolási napon) × 100. abc

Az azonos sorban szereplő eltérő kisbetűk szignifikáns különbséget jeleznek (P < 0,05).

101

ab

%†

Log10 cfu/ml* bc

%†

100,0

7,29 ± 0,09

34,8

7,19 ± 0,01b

80,0

34,8

ab

65,0

a

80,0

7,29 ± 0,34

ab

100,0

6,97 ± 0,16

ab

48,5

45,7 45,7 23,9

7,11 ± 0,15

7,20 ± 0,08

100,0

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 4.3.3. Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 élősejt-számának hűtve tárolás alatti alakulása tehéntejből, illetve tevetejből készített kontroll és akácmézes probiotikus savanyú tejtermékekben A bifidobaktériumok élősejt-számában az öthetes

tárolás

során

bekövetkezett változásokat a 17. táblázat mutatja. A B. animalis subsp. lactis BB-12 kezdeti sejtszáma mintegy másfél nagyságrenddel meghaladta a táplálkozás-élettani szempontból megkívánt 106 cfu/g értéket (Magyar Élelmiszerkönyv Bizottság, 2004). Ebben a vonatkozásban nem észleltem különbséget (P > 0,05) a kétféle tejből előállított kontroll, ill. mézes termékek között. Valamelyes meglepő, hogy a 35 napos tárolás során nem változott jelentősen a bifidobaktériumok élősejt-száma. 5%-nyi méz jelenléte mindkét savanyú tejtermékben csökkentette (P  0,05) a bifidobaktériumok pusztulását, sőt a tárolási periódus utolsó napján nagyobb sejtszámot mértem a méztartalmú savanyú tejtermékekben, mint a tárolás kezdetén (17. táblázat). Eredményeim összhangban vannak azokkal a korábbi megállapításokkal, amelyek szerint 5% akácméz jelenléte késlelteti (P < 0,05) a bifidobaktériumok pusztulását tehéntej alapú probiotikus savanyú tejtermékekben (Süle és Varga, 2009; Riazi és Ziar, 2012). Oligoszacharid tartalmának köszönhetően a méz egyéb édesítőszerekhez (glükóz, fruktóz, szacharóz) képest javítja (P < 0,05) a bifidobaktériumok tárolás alatti túlélését (Ustunol és Gandhi, 2001), és hasonló hatást gyakorol erre a baktériumfajra, mint a prebiotikumként ismert galakto- és frukto-oligoszacharidok, ill. az inulin (Kajiwara és mtsai, 2002; Varga és mtsai, 2003, 2006; Amnah, 2012). A mézek oligoszacharid-tartalma fajtájuktól, ill. eredetüktől függően változhat, és akár 4-11% is lehet (Ustunol és Gandhi, 2001).

102

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 17. táblázat: Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 élősejt-számának változása tehéntejből, ill. tevetejből készített kontroll és akácmézes probiotikus (ABT típusú) savanyú tejtermékek 4°C-os tárolása során Tárolási idő (nap)

Tevetejből készített kontroll

Tehéntejből készített akácmézes

kontroll

akácmézes

fermentált ABT tejtermék Log10 cfu/ml* a

0

7,38 ± 0,04

7

7,27 ± 0,23ab

14 21 28 35

7,26 ± 0,05

b

7,03 ± 0,02

b

7,16 ± 0,05

b

7,05 ± 0,05

c

%†

Log10 cfu/ml*

%†

Log10 cfu/ml*

100,0

7,36 ± 0,05

a

100,0

7,41 ± 0,21

83,3

7,49 ± 0,20a

143,5

7,13 ± 0,12b

75,0

7,56 ± 0,02

a

156,5

7,18 ± 0,05

b

7,47 ± 0,10

a

7,31 ± 0,21

a

7,52 ± 0,14

a

7,22 ± 0,15

b

45,6 62,5 45,8

7,38 ± 0,05

130,4 152,2

b

104,3

7,29 ± 0,42

* Az adatok 6 mérés (3 párhuzamos × 2 ismétlés) átlag ± szórás-értékét jelölik. † Túlélési arány = (cfu/ml az n-edik tárolási napon / cfu/ml a 0. tárolási napon) × 100. abc

Az azonos sorban szereplő eltérő kisbetűk szignifikáns különbséget jeleznek (P < 0,05).

103

a

abc

%†

Log10 cfu/ml* a

%†

100,0

7,49 ± 0,23

50,0

7,41 ± 0,11a

53,6

7,53 ± 0,04

a

102,1

7,55 ± 0,08

a

105,9

7,58 ± 0,16

a

117,6

7,63 ± 0,06

a

126,5

78,6 60,7 96,4

100,0 76,5

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 4.3.4. Tevetejből, illetve tehéntejből készített kontroll és akácmézes probiotikus savanyú tejtermékek mikrobiológiai állapotának és pH-értékének változása a hűtve tárolás alatt A második kísérletsorozathoz hasonlóan, ezúttal is megvizsgáltam egyes szennyező mikrobák esetleges előfordulását az ABT típusú savanyú tejekben. A fermentált tejtermékek és a méz savas kémhatása, kis oxigén-koncentrációja és antimikrobás anyagai egyértelműen gátat szabtak a káros mikroorganizmusok élettevékenységének, mert a megvizsgált savanyú tejtermék-minták egyike sem tartalmazott kimutatható mennyiségű penészgombát, élesztőgombát (< 1,0 × 100 cfu/ml), E. colit, vagy kóliform baktériumot (< 3,0 × 10-1 cfu/ml). A tárolás kezdetén a négy termék kémhatása nem különbözött (P > 0,05), a pH-átlagértékek 4,26 és 4,36 közöttiek voltak. A hűtve tárolás 5 hete alatt nem több mint 0,1 egységgel csökkent mind a kontroll, mind a mézes termék pH-ja. Korábbi vizsgálatainkban is hasonló mértékű változásokat tapasztaltunk (Süle és Varga, 2009). 4.4. Mézek hasznos és káros mikroorganizmusokra gyakorolt hatásának vizsgálata agardiffúziós lyukteszttel A vizsgált mézek a kísérletekbe bevont 27 mikrobafaj (10.a és 10.b táblázat)

közül

összesen

három

(feltételes)

kórokozó

baktériumfajra

gyakoroltak gátló hatást, szintén három tejsavbaktérium-fajra pedig serkentőleg hatottak. A következő alfejezetekben kizárólag az egyértelmű, szembetűnő eredményeket részletezem.

104

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 4.4.1. A vizsgált mézek káros baktériumokra gyakorolt hatása 4.4.1.1. Gram-negatív baktériumok A vizsgálatba bevont ötfajta méz – különböző koncentrációkban (5, 10, 25, 50, 100%) alkalmazva – semmiféle gátló hatást nem gyakorolt a Salm. Typhimurium HNCMB 10040 törzsre. Eljack és Kafi (2014) ezzel szemben arról számolt be, hogy 50, 75 és 100% akácméz teljes mértékben gátolta a Salm. Typhimurium ATCC 14028 törzs szaporodását, míg a 25%-os akácméz-oldat közepes mértékű gátlást (16-20 mm-es gátlási zónát) eredményezett. Rahman és mtsai (2011) hőkezeletlen termelői mézek, valamint kereskedelmi forgalomban lévő mézek antibakteriális hatását vizsgálva azt tapasztalták, hogy a kétféle méz (6,25-100% koncentrációban) nem fejtett ki szaporodásgátló hatást a Salmonella spp.-re. Az ötfajta termelői méz Salmonella enterica subsp. arizonae HNCMB 42021 törzsre gyakorolt hatását a 18. táblázat szemlélteti. A Salm. arizonae HNCM 42021 szaporodását az 5%-os mézoldatok egyike sem befolyásolta, a 10%-os koncentrációjú oldat azonban már jelentős mértékű gátlást váltott ki mind az ötféle méz alkalmazásakor. Feles (50%) hígításban, ill. 100%-os töménységben az akácméz gátolta legnagyobb mértékben a Salm. arizonae-t (33,00 ± 2,65 mm, 35,67 ± 5,69 mm). A hígítatlan mézek majdnem mindegyike kiemelkedően nagy (> 30 mm) gátlási zónát produkált, ami minden bizonnyal a mézek jelentős ozmotikus nyomásából és erősen savas kémhatásából adódott (Zainol és mtsai, 2013). A vizsgált mézek P. aeruginosa HNCMB 170001 törzsre gyakorolt szaporodásgátló hatását a 19. táblázat mutatja.

105

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 18. táblázat: Különböző mézek Salmonella enterica subsp. arizonae HNCM 42021 szaporodására gyakorolt gátló hatása* Mézfajta

Mézkoncentráció 5% (w/v)

10% (w/v)

25% (w/v)

50% (w/v)

100% (w/v)

Akácméz

0

21,67 ± 2,89

23,33 ± 2,31

33,00 ± 2,65

35,67 ± 5,69

Hársméz

0

15,33 ± 2,52

28,33 ± 0,58

30,67 ± 0,58

1,67 ± 0,58

Vegyes virágméz

0

14,00 ± 1,00

21,33 ± 2,52

26,67 ± 0,58

30,67 ± 0,58

Erdei méz

0

16,33 ± 2,08

20,33 ± 0,58

28,00 ± 2,65

34,00 ± 0,00

Gesztenyeméz

0

17,67 ± 2,08

24,00 ± 0,00

28,33 ± 2,31

33,00 ± 5,20

*Az adatok a gátlási zóna átmérőjét (mm) jelzik három párhuzamos vizsgálat átlag ± szórás értékeként.

19. táblázat: Különböző mézek Pseudomonas aeruginosa HNCMB 170001 szaporodására gyakorolt gátló hatása* Mézkoncentráció

Mézfajta 5% (w/v)

10% (w/v)

25% (w/v)

50% (w/v)

100% (w/v)

Akácméz

0

6,00 ± 2,65

20,00 ± 1,00

28,33 ± 1,15

33,33 ± 3,21

Hársméz

0

4,00 ± 3,46

13,67 ± 8,74

13,00 ± 10,39

8,33 ± 0,58

Vegyes virágméz

0

0

20,00 ± 4,58

25,67 ± 3,06

32,67 ± 3,79

Erdei méz

0

0

20,33 ± 3,21

25,00 ± 4,00

33,33 ± 0,58

Gesztenyeméz

0

0

19,67 ± 1,15

25,33 ± 1,15

29,67 ± 3,21

*Az adatok a gátlási zóna átmérőjét (mm) jelzik három párhuzamos vizsgálat átlag ± szórás értékeként.

106

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük A 19. táblázatból látható, hogy az 5%-os mézoldatok hatástalannak bizonyultak a P. aeruginosával szemben, sőt a 10%-os akácméz és hársméz is csupán 4-6 mm-es gátlási zónát alakított ki. Hasonló megállapításra jutottak Sherlock és mtsai (2010), ugyanis az általuk vizsgált mézek (ulmo és manuka méz) 6,3%-os és 12,5%-os oldata semmiféle hatást nem fejtett ki e Pseudomonas fajra. Azt is kimutatták, hogy a 25%-os, ill. 50%-os mézkoncentráció ulmo méz esetében 11 mm és 14 mm, manuka méz esetében pedig 14 mm és 16 mm átmérőjű gátlózónát produkált. Saját vizsgálataimban ugyanezek a mézkoncentrációk minden esetben nagyobb mértékű (13-28 mm) szaporodás-gátlást váltottak ki. Zainol és mtsai (2013) úgy találták, hogy a P. aeruginosa teljes gátlásához minimum 20%-os akácméz oldat szükséges. Meglepő eredmény, hogy a 100%-os hársméz mindössze 8,33 ± 0,58 mm-es gátlási zónát képzett, míg az akác-, a vegyes virág-, a hárs- és a gesztenyeméz egyaránt kb. négyszer ekkora átmérőjű feltisztult zónát hozott létre a P. aeruginosa HNCMB 170001 teszttörzs alkalmazásakor. Agbagwa és Frank-Peterside (2010) Nigéria különböző tájairól származó, hígítatlan és 80%os koncentrációjú mézek vizsgálatakor hasonlóan eltérő méretű (1,4-9,9 mm) gátlózónákat mértek. Az eltérést annak tulajdonították, hogy a mézek különféle növények nektárjából és más-más gyűjtési helyekről származtak. A P. aeruginosa szaporodásának legjelentősebb gátlását ‒ a Salm. arizonae-hez hasonlóan ‒ a hígítatlan akácméz váltotta ki, amit a 33,33 ± 3,21 mm átmérőjű gátlási zóna bizonyított (19. táblázat). A hígítatlan mézekben a glükóz-oxidáz enzim még inaktív és a H2O2 szint is minimális, így a gátló hatás a mézek nagy ozmotikus aktivitásának és savasságának tudható be. A mézek hígításakor azonban a glükóz-oxidáz enzim aktiválódik és a glükózból H2O2 képződik, ami gátlózóna kialakulását eredményezi (Zainol és mtsai, 2013). Az akác-, a hárs-, a vegyes virág-, az erdei- és a gesztenyeméz E. coli HNCMB 35035 törzsre gyakorolt hatása a 20. táblázatban látható.

107

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 20. táblázat: Különböző mézek Escherichia coli HNCMB 35035 szaporodására gyakorolt gátló hatása* Mézfajta

Mézkoncentráció 5% (w/v)

10% (w/v)

25% (w/v)

50% (w/v)

100% (w/v)

Akácméz

0

12,33 ± 5,03

22,00 ± 2,65

31,00 ± 6,24

34,00 ± 5,29

Hársméz

0

10,00 ± 0,00

21,33 ± 0,58

26,33 ± 3,51

32,33 ± 6,66

Vegyes virágméz

0

17,67 ± 1,53

20,67 ± 2,89

27,33 ± 1,53

33,33 ± 4,93

Erdei méz

0

14,33 ± 2,08

25,33 ± 1,15

30,33 ± 0,58

36,00 ± 2,00

Gesztenyeméz

0

15,67 ± 2,08

18,67 ± 0,58

28,33 ± 1,15

33,33 ± 1,15

*Az adatok a gátlási zóna átmérőjét (mm) jelzik három párhuzamos vizsgálat átlag ± szórás értékeként.

108

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük Az előző két Gram-negatív baktériumfajhoz hasonlóan, az E. coli HNCMB 35035 törzzsel szemben is hatástalanok voltak az 5%-os mézoldataim. Sherlock és mtsai (2010) 6,3%-os és 12,5%-os ulmo és manuka mézekről állapították meg ugyanezt, 25%-os mézoldataik viszont már 10 mm-t meghaladó gátlási zónát produkáltak. Eredményeim arról tanúskodnak, hogy a vizsgált mézek, a gesztenyeméz kivételével, 20 mm-t meghaladó gátlási zónát voltak képesek kialakítani 25%-os oldatukkal. A mézkoncentráció növelésével a gátlási zónák átmérője is nőtt, így pl. a feles hígításban alkalmazott mézek közül az akác és az erdei méz 30 mm-t meghaladó szaporodásgátlási zónát hozott létre. A hígítatlan mézek közül az akácméz (34,00 ± 5,29 mm) és az erdei méz (36,00 ± 2,00) gátolta leghatékonyabban az E. colit. Mistry és Shah (2013) háromféle hőkezeletlen termelői méz és egy kereskedelmi forgalomban kapható, feldolgozott méz 20-100%-os oldatának E. coli szaporodására kifejtett hatását vizsgálta agardiffúziós lyukteszttel. Mind a négyféle vizsgált méz, koncentrációtól függetlenül, képes volt gátolni a tesztmikrobát és így terápiás célokra is alkalmasnak mutatkozott. 4.4.1.2. Gram-pozitív baktériumok Ahmadi-Motamayel és mtsai (2013) szerint a méz antimikrobás hatásának köszönhetően megakadályozza az aerob és anaerob, Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok, továbbá az élesztő- és penészgombák szaporodását. Ezzel szemben, agardiffúziós lyuktesztjeimben a vizsgált mézek egyik Grampozitív baktériumfaj (törzs) szaporodását sem gátolták. Malajziai mézek Staphylococcus aureus-ra és Bacillus cereus-ra gyakorolt hatásának vizsgálata során Zainol és mtsai (2013) arra a következtetésre jutottak, hogy az előbbi faj gátlásához (és egyben elpusztításához) minimum 15%-os, az utóbbiéhoz pedig legalább 20%-os akácméz-oldat szükséges. A Gram-pozitív baktériumok nagyobb érzékenységet

109

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük mutattak a maláj mézek komponenseivel szemben, mint a Gram-negatív fajok. Ennek a megállapításnak ellentmondanak az én eredményeim, ugyanis a 10.a táblázatban felsorolt Clostridium, Bacillus, Staphylococcus és Listeria törzsek mindannyian ellenálltak a hazai termelői mézek antibakteriális hatásának. Európai mézekkel végzett hasonló kísérletekről nem találtam beszámolót a szakirodalomban. 4.4.2. A vizsgált mézek élesztő- és penészgombákra gyakorolt hatása Az akác-, a hárs-, a vegyes virág-, az erdei- és a gesztenyeméz se hígítatlanul, se vizes oldataik formájában nem gátolták a 10.b táblázatban felsorolt élesztő- és penészgomba törzsek szaporodását. Lyuktesztjeim kiértékelésekor egyértelműen megállapítható volt, hogy a vizsgált mézek még a Muhammad és Muhammad (2005) által küszöbértékként megjelölt 6 mm-es gátlási zónaátmérőt sem alakították ki. Anyanwu (2012) nigériai mézek antifungális aktivitását tesztelte, és azt tapasztalta, hogy a 20%-os mézoldatok nem gyakoroltak gátló hatást a következő gombákra: Candida albicans, Saccharomyces spp., Aspergillus niger, A. flavus, Penicillium chrysogenum és Microsporum gypseum. Azt is megállapította, hogy a különböző földrajzi helyekről származó, hígítatlan mézek legfeljebb 10-15 mm-es gátlási zónát alakítottak ki. Eredményei szerint a C. albicans volt a mézekkel szemben legellenállóbb élesztőgomba faj, ugyanis a hígítatlan mézminták maximum 10 mm-es gátlási zónát hoztak létre. Omafuvbe és Akanbi (2009) szintén Nigériában öt különböző területről gyűjtöttek mézmintákat és agardiffúziós lyukteszttel igazolták, hogy a mézek nem képesek gátolni a C. albicans szaporodását. Hasonló eredményekről számoltak be más kutatók is (Roderick és mtsai, 2000; Ahmadi-Motamayel és mtsai, 2013). Candiracci és mtsai (2011) vizsgálatai szerint a mézek flavonoid tartalmuknak köszönhetően fejtenek ki gátló hatást a C. albicans-ra.

110

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 4.4.3. A vizsgált mézek hasznos mikroorganizmusokra gyakorolt hatása Amint a 21. táblázatból kitűnik, az ötfajta méz egyike sem gátolta a S. thermophilus ATCC 19258 szaporodását, sőt éppen ellenkezőleg: az esetek többségében jelentős méretű szaporodás-serkentési zónát észleltem az agarlemezekbe fúrt lyukak körül. A multiflorális eredetű vegyes virágméz 2,5%-os oldata már 10 mm feletti átmérőjű zónát hozott létre, miközben a többi mézfajta csak 25, 50, ill. 100%-os töménységben hatott serkentőleg a joghurtkultúra kokkusz alakú komponensének szaporodására. Legintenzívebb serkentést a feles hígítású hársméz oldat (24,67 ± 1,15 mm), valamint a 25 és 50%-os gesztenyeméz oldatok (24 ± 3,46 mm, illetve 24 ± 2,65 mm) váltottak ki, ugyanakkor a hígítatlan mézek már nem eredményeztek ennél nagyobb mértékű szaporodás-serkentést. A nemzetközi szakirodalomban nem találtam olyan közleményt, amely különféle fajtamézek S. thermophilus-ra, Lb. acidophilus-ra

és

Lb.

caseire

gyakorolt

szaporodás-serkentő

hatását

agardiffúziós lyuktesztek elvégzésével igazolta volna. A fajtamézek Lb. acidophilus ATCC 314 szaporodására kifejtett hatását a 22. táblázat mutatja. Valamelyest meglepő módon, a Lb. acidophilus ATCC 314 törzsre csupán a 25, az 50 és a 100%-os töménységben adagolt gesztenyeméz hatott serkentőleg. Bogdanov és mtsai (2008) arról számoltak be, hogy a mézek oligoszacharid tartalmuknak köszönhetően elősegítik a laktobacilluszok és a bifidobaktériumok szaporodását. In vitro és in vivo kísérletsorozataikban Shamala és mtsai (2000) arra keresték a választ, hogy a méz, a glükóz, a szacharóz és a laktóz milyen hatást gyakorol a Lb. acidophilus és a Lb. plantarum szaporodására. Úgy találták, hogy a méz mindkét laktobacillusz fajt jobban stimulálta, mint a vizsgált cukrok. Das és mtsai (2015) hasonló

hatásokról

számoltak

be

szezámfű-méz

in

vitro

vizsgálata

eredményeként, ugyanis a méz ‒ a kontrollhoz képest ‒ közel egy nagyságrenddel megnövelte a 24 órás inkubálás után mérhető Lb. acidophilus élősejt-számot.

111

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 21. táblázat: Különböző mézek Streptococcus thermophilus ATCC 19258 szaporodására gyakorolt serkentő hatása* Mézfajta

Mézkoncentáció 2,5% (w/v)

5% (w/v)

10% (w/v)

25% (w/v)

50% (w/v)

100% (w/v)

Akácméz

0

0

0

21,67 ± 1,15

23,00 ± 2,00

11,67 ± 0,58

Hársméz

0

0

0

23,33 ± 2,08

24,67 ± 1,15

12,33 ± 1,53

13,67 ± 1,53

16,33 ± 0,58

20,00 ± 1,73

22,67 ± 1,53

22,67 ± 2,52

14,67 ± 2,08

Erdei méz

0

0

0

20,00 ± 2,00

21,33 ± 0,58

18,00 ± 2,65

Gesztenyeméz

0

0

0

24,00 ± 3,46

24,00 ± 2,65

17,33 ± 3,06

Vegyes virágméz

*Az adatok a serkentési zóna átmérőjét (mm) jelzik három párhuzamos vizsgálat átlag ± szórás értékeként.

22. táblázat: Különböző mézek Lactobacillus acidophilus ATCC 314 szaporodására gyakorolt serkentő hatása* Mézfajta

Mézkoncentáció 2,5% (w/v)

5% (w/v)

10% (w/v)

25% (w/v)

50% (w/v)

100% (w/v)

Akácméz

0

0

0

0

0

0

Hársméz

0

0

0

0

0

0

Vegyes virágméz

0

0

0

0

0

0

Erdei méz

0

0

0

0

0

0

Gesztenyeméz

0

0

0

21,67 ± 2,89

20,00 ± 1,00

18,00 ± 2,65

*Az adatok a serkentési zóna átmérőjét (mm) jelzik három párhuzamos vizsgálat átlag ± szórás értékeként.

112

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 23. táblázat: Különböző mézek Lactobacillus casei ATCC 334 szaporodására gyakorolt serkentő hatása* Mézfajta

Mézkoncentáció 2,5% (w/v)

5% (w/v)

10% (w/v)

25% (w/v)

50% (w/v)

100% (w/v)

Akácméz

0

0

0

26,00 ± 0,00

21,67 ± 1,53

32,00 ± 1,00

Hársméz

0

0

0

28,67 ± 3,79

21,33 ± 0,58

23,67 ± 4,62

Vegyes virágméz

0

0

0

25,00 ± 1,73

19,67 ± 2,08

20,00 ± 1,73

Erdei méz

0

0

0

0

0

0

Gesztenyeméz

0

0

0

0

0

0

*Az adatok a serkentési zóna átmérőjét (mm) jelzik három párhuzamos vizsgálat átlag ± szórás értékeként.

113

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük A vizsgált mézek Lb. casei ATCC 334 törzsre gyakorolt hatásait összegzi a 23. táblázat. Látható, hogy a Lb. casei szaporodására az öt különböző fajtaméz közül csak három (akác-, hárs- és vegyes virágméz) hatott serkentőleg, míg a másik kettő (erdei- és gesztenyeméz) nem gátolta, ugyanakkor nem is stimulálta e laktobacillusz törzs szaporodását. Kiemelendő, hogy a serkentő hatású mézek 25, 50, ill. 100%-os töménységben fejtették ki jótékony hatásukat, kisebb koncentrációkban alkalmazva hatástalanok maradtak. Legnagyobb serkentési zónát a hígítatlan akácméz, valamint a 25%-os hárs- és vegyes virágméz esetében figyeltem meg. Megjegyzem, hogy nem találtam az általam elvégzett lyuktesztekhez hasonló kísérletekről szóló olyan szakirodalmi beszámolót, amely mézek Lb. caseire kifejtett hatásáról szólt volna. Az akác-, a hárs-, a vegyes virág-, az erdei- és a gesztenyeméz nem befolyásolta az alábbi hasznos baktériumtörzsek szaporodását: Lb. rhamnosus ATCC 7469, Lb. paracasei subsp. paracasei ATCC BAA-52 és B. breve ATCC 15700. Az a tény, hogy a szaporodásserkentő hatás nem mindegyik hasznos baktériumfajnál jelentkezett, minden bizonnyal az egyes fajok (törzsek) eltérő tápanyagigényével magyarázható. 4.5. Tevetejből és tehéntejből akácméz hozzáadásával készített probiotikus savanyú tejtermékek érzékszervi bírálata A tevetejből és tehéntejből készített natúr, ill. akácmézzel kiegészített ABT típusú savanyú tejtermékek érzékszervi bírálata során a kóstolást végző személyek által felállított rangsorok és rangszám-összegek láthatók a 24.-27. táblázatban. A 24. táblázat a teve-, ill. tehéntejből készült probiotikus fermentált

tejtermékek

0.

napon

elvégzett

eredményét szemlélteti.

114

organoleptikus

bírálatának

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 24. táblázat: Probiotikus savanyú tejtermékek érzékszervi bírálatának eredménye* a hűtve tárolás kezdetén (a 0. napon) Bíráló

Termék ST-1

ST-2

ST-3

ST-4

ST-5

ST-6

A

1

2

3

5

6

4

B

1

2

3

5

6

4

C

1

2

3

6

5

4

D

1

2

3

6

4

5

E

1

1

2

3

4

5

F

2

3

1

5

6

4

Rangszám-összeg

7

12

15

30

31

26

* A számok (1-6) az egyes bírálók (A-F) által kialakított helyezési sorrendet tükrözik; ST-1: natúr savanyú tejtermék tehéntejből; ST-2: 5% akácmézet tartalmazó savanyú tejtermék tehéntejből; ST-3: 10% akácmézet tartalmazó savanyú tejtermék tehéntejből; ST-4: natúr savanyú tejtermék tevetejből; ST-5: 5% akácmézet tartalmazó savanyú tejtermék tevetejből; ST-6: 10% akácmézet tartalmazó savanyú tejtermék tevetejből.

A Kramer-táblázatból (15. melléklet) 6 mintához és 6 bírálóhoz kikeresett rangszám-összegek: 11 és 31, tehát azok a minták, amelyek rangszám-összege 11-nél kisebb, vagy 31-nél nagyobb, szignifikánsan (P < 0,05) különböznek a többitől. Ennek alapján elmondható, hogy a vizsgált minták közül az ST-1 jelű, azaz a tehéntejből készült natúr termék jobbnak (P < 0,05) bizonyult a másik ötnél, amelyek viszont nem különböztek egymástól (P > 0,05). Az ST-1 jelű terméket a következő megjegyzésekkel illették a bírálók a bírálati lapon: “fehér, fényes, egynemű, lágy alvadék, kellemesen savanykás, tiszta ízű termék”. Ellenben a tevetejből készített probiotikus savanyú tejtermékek tisztátalan ízét is szóvá tette több bíráló. A hűtve tárolás 14. napján ismét érzékszervi bírálatra kínáltam fel a termékeket. Ennek eredményét a 25. táblázat szemlélteti.

115

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 25. táblázat: Probiotikus savanyú tejtermékek érzékszervi bírálatának eredménye* a hűtve tárolás 14. napján Bíráló

Termék ST-1

ST-2

ST-3

ST-4

ST-5

ST-6

A

1

3

2

5

6

4

B

1

2

3

5

4

6

C

1

2

3

5

6

4

D

1

2

3

4

5

6

E

1

2

3

4

5

6

F

3

1

2

4

5

5

Rangszám-összeg

8

12

16

27

31

31

* A számok (1-6) az egyes bírálók (A-F) által kialakított helyezési sorrendet tükrözik; ST-1: natúr savanyú tejtermék tehéntejből; ST-2: 5% akácmézet tartalmazó savanyú tejtermék tehéntejből; ST-3: 10% akácmézet tartalmazó savanyú tejtermék tehéntejből; ST-4: natúr savanyú tejtermék tevetejből; ST-5: 5% akácmézet tartalmazó savanyú tejtermék tevetejből; ST-6: 10% akácmézet tartalmazó savanyú tejtermék tevetejből.

Kéthetes tárolás után még mindig a tehéntejből készült natúr savanyú tejterméket (ST-1) ítélték legjobbnak (P < 0,05) a bírálók, és a másik öt termék (ST-2–ST-5) továbbra sem különbözött egymástól (P > 0,05). A tevetej-alapú mézes savanyú tejtermékek kóstolásakor a bírálók egyszerre édes és sós ízt is felfedeztek, amely eltért az általuk megszokott ízvilágtól, ezért az ST-5 és az ST-6 jelű terméket a rangsorolásnál többnyire a két utolsó helyre tették. A bírálók egybehangzó véleménye alapján, a termékek érzékszervi minősége nem lett rosszabb az előző kóstolási időponthoz képest. A 4°C-os tárolás 4. hetének végén elvégzett kóstolási próba eredményeit a 26. táblázatban foglaltam össze.

116

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 26. táblázat: Probiotikus savanyú tejtermékek érzékszervi bírálatának eredménye* a hűtve tárolás 28. napján Bíráló

Termék ST-1

ST-2

ST-3

ST-4

ST-5

ST-6

A

1

2

3

5

6

4

B

1

2

3

4

5

6

C

1

2

3

5

6

4

D

2

3

1

4

6

5

E

1

2

4

6

3

5

F

3

2

1

4

5

5

Rangszám-összeg

9

13

15

28

31

29

* A számok (1-6) az egyes bírálók (A-F) által kialakított helyezési sorrendet tükrözik; ST-1: natúr savanyú tejtermék tehéntejből; ST-2: 5% akácmézet tartalmazó savanyú tejtermék tehéntejből; ST-3: 10% akácmézet tartalmazó savanyú tejtermék tehéntejből; ST-4: natúr savanyú tejtermék tevetejből; ST-5: 5% akácmézet tartalmazó savanyú tejtermék tevetejből; ST-6: 10% akácmézet tartalmazó savanyú tejtermék tevetejből.

Négyhetes tárolást követően sem változott jelentősen a helyzet, mert még ekkor is a tehéntejből készült natúr savanyú tej volt a legkedveltebb (P < 0,05). A bírálók hangsúlyozták, hogy az összes közül egyértelműen ezt a terméket vásárolnák meg legszívesebben. Az 5% akácmézet tartalmazó tevetej-alapú fermentált termékről az alábbi vélemények születtek: “a legfurcsább ízű termék a hat közül; egyszerre édes, sós és savanyú ízű”. Az utolsó kóstolópróbára a 4°C-on tárolt minták hathetes korában került sor. Ekkor már egyik termék érzékszervi tulajdonságai sem voltak jobbak (P > 0,05) a többiénél (27. táblázat).

117

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 27. táblázat: Probiotikus savanyú tejtermékek érzékszervi bírálatának eredménye* a hűtve tárolás 42. napján Bíráló

Termék ST-1

ST-2

ST-3

ST-4

ST-5

ST-6

A

4

1

2

3

6

5

B

1

3

4

2

6

5

C

5

1

2

3

4

6

D

1

3

5

2

4

6

E

5

1

3

2

4

5

F

1

3

5

4

6

2

Rangszám-összeg

17

12

21

16

30

29

* A számok (1-6) az egyes bírálók (A-F) által kialakított helyezési sorrendet tükrözik; ST-1: natúr savanyú tejtermék tehéntejből; ST-2: 5% akácmézet tartalmazó savanyú tejtermék tehéntejből; ST-3: 10% akácmézet tartalmazó savanyú tejtermék tehéntejből; ST-4: natúr savanyú tejtermék tevetejből; ST-5: 5% akácmézet tartalmazó savanyú tejtermék tevetejből; ST-6: 10% akácmézet tartalmazó savanyú tejtermék tevetejből.

A bírálók a 42. napon hanyatlást érzékeltek a savanyú tejtermékek érzékszervi tulajdonságaiban. A tevetej alapú termékek kedveltsége továbbra is csak

mérsékeltnek

volt

nevezhető.

“A

tevetejből

készített

termékek

fogyasztására nehezebben lehetne rábeszélni az európai, különösképpen a magyar fogyasztókat” ‒ vélekedett az egyik bíráló a kóstolópróba végén. Ennek magyarázata az lehet, hogy a tehéntej alvadékától jelentősen eltérő, diszpergált kazeinpelyheket tartalmazó, meglehetősen vizes, törékeny, gyenge struktúrájú, nem kellően homogén gélszerkezetű alvadék jött létre a tevetej savas alvasztása során (Attia és mtsai, 2001; Rahman és mtsai, 2009). Rahman és mtsai (2009) kísérleteket végeztek a tevetej savanyítására legalkalmasabb tejsavbaktérium starterkultúra kiválasztására, amellyel optimális érzékszervi tulajdonságokkal rendelkező savanyú tevetej-termék állítható elő. Organoleptikus bírálataik eredménye szerint a Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus és a S. thermophilus 1:1 arányú keverékkultúrájával előállított tevetej-joghurt

118

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük rendelkezett a legkedvezőbb (P < 0,05) tulajdonságokkal. Ennek alapján talán érdemes

lenne

a

továbbiakban

a

tevetej

savanyítását

klasszikus

joghurtkultúrával végezni, és nem édes, hanem inkább más ízű (pl. sós, ill. fűszeres) savanyú tejterméket kifejleszteni.

119

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Következtetések és javaslatok 5. KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK Az első kísérletsorozat eredményei alapján az alábbi főbb megállapítások tehetők:  CASO agaron az összes megvizsgált faj legalább egyik törzse kiválóan szaporodott, ezért ez a tápközeg, 37°C-on 72 órán keresztül anaerob körülmények között inkubálva, alkalmas a laktobacilluszok és a bifidobaktériumok összes élősejt-számának meghatározására.  A tesztelt MRS táptalajok alkalmasnak bizonyultak a probiotikus laktobacilluszok savanyú tejtermékekből történő szelektív elkülönítésére és számbeli meghatározására, amennyiben a kultúrakomponensek között nem volt jelen a mezofil Lc. lactis subsp. lactis.  A savanyú tejtermékek gyártásához világszerte elterjedten alkalmazott probiotikus bifidobaktérium törzs, a B. animalis subsp. lactis BB-12 szelektív tenyésztésére kiválóan alkalmas a 37°C-on 72 óráig anaerob módon inkubált, Li-mupirocinnal kiegészített TOS agar, mely lehetővé teszi a bifidobaktériumok szelektív elkülönítését azokból a termékekből, amelyekben a következő tejsavbaktérium fajok is jelen vannak: S. thermophilus, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. acidophilus, Lb. casei, Lc. lactis és Ln. mesenteroides subsp. dextranicum.  A Lb. acidophilus szelektív kimutatása kétféleképpen lehetséges: 45°Con, 48 óráig, anaerob módon inkubált, 5,4-es pH-jú MRS agaron, vagy 37°C-on, 72 óráig, anaerob körülmények között inkubált, clindamycinnel és ciprofloxacinnal kiegészített MRS agaron, de utóbbi esetben csak akkor, ha Lb. casei nincs a Lb. acidophilus-szal azonos, vagy azt meghaladó koncentrációban jelen a vizsgálandó termékben.  A 37°C-on, 72 óráig, anaerob viszonyok között inkubált, 5,4-es pHértékű MRS agar lehetővé teszi a Lactobacillus fajok elkülönítését.

120

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Következtetések és javaslatok  Joghurt

esetében

a

termékazonos

mikroorganizmusok

szelektív

elkülönítése úgy valósítható meg leghatékonyabban, ha a mintákat M17 agaron, 37°C-on, 48 óráig, aerob módon (S. thermophilus), illetve 6,2-es pH-jú MRS agaron, 37°C-on, 72 óráig anaerob körülmények között (Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus) inkubáljuk.  ABT-típusú tejtermékek kultúra eredetű komponenseinek szelektív elkülönítését 37°C-on 72 óráig anaerob módon inkubált MRS‒CC agaron, vagy 5,4-es pH-jú MRS agaron (Lb. acidophilus), 37°C-on 72 órán át anaerob módon inkubált, Li-mupirocinnal kiegészített TOS agaron (Bifidobacterium spp.), ill. 45°C-on, 24 órán keresztül aerob körülmények között inkubált M17 agaron (S. thermophilus) célszerű végezni.  A Lb. casei az ugyancsak probiotikus Lb. acidophilus-éhoz és a szintén mezofil Lc. lactis subsp. lactis-éhoz hasonló tenyésztési körülményeket igényel, a joghurtbaktériumoktól és a bifidobaktériumoktól viszont egyszerűen elkülöníthető. A második kísérletsorozat eredményei rávilágítottak arra, hogy a tehéntej, a tevetej, a juhtej és a kecsketej egyaránt alkalmas ABT-típusú savanyú tejtermékek előállítására. A laboratóriumi körülmények között elkészített és 6 héten keresztül hűtve tárolt termékek összes megvizsgált mintája megfelelő számú (106-107 cfu/ml) probiotikus laktobacillusz és bifidobaktérium élősejttel volt jellemezhető, a nem probiotikus tejsavbaktériumokból (S. thermophilus) pedig a Magyar Élelmiszerkönyv vonatkozó minimum előírásait 1-2 nagyságrenddel meghaladó mennyiséget tartalmazott. A harmadik kísérletsorozat eredményei bizonyították, hogy 5% akácmézkiegészítés csökkenti (P < 0,05), sőt megakadályozza a B. animalis subsp. lactis BB-12 pusztulását tehéntej-, ill. tevetej-alapú probiotikus savanyú tejekben a termékek öthetes hűtve tárolása során. Táplálkozás-élettani és mikrobiológiai megfontolásból is javasolható tehát a savanyú tejtermékek akácmézzel történő kiegészítése.

121

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Következtetések és javaslatok A negyedik kísérletsorozat agardiffúziós lyuktesztjeinek eredménye szerint az akác-, a hárs-, a vegyes virág-, az erdei- és a gesztenyeméz 25-100%os oldatai gátolják egyes Gram-negatív baktériumok (P. aeruginosa HNCMB 170001, Salm. arizonae HNCMB 42021, E. coli HNCMB 35035) szaporodását, ugyanakkor a mézek többsége stimulálja bizonyos tejsavbaktériumok (Lb. acidophilus ATCC 314, Lb. casei ATCC 334 és S. thermophilus ATCC 19258) szaporodását; tehát a mézadagolás összességében javíthatja a savanyú tejtermékek mikrobiológiai élelmiszer-biztonságát. Az ötödik kísérletsorozat eredményei alapján elmondható, hogy mind a natúr, mind a méztartalmú probiotikus savanyú tevetej-termékek érzékszervi minősége mérsékelt. Megfelelő organoleptikus tulajdonságok kialakítása érdekében érdemes lenne a tevetej savanyítását klasszikus joghurtkultúrával végezni, ill. megvizsgálni egyéb, nem édes karakterű ízesítő anyagok felhasználási lehetőségét is.

122

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Összefoglalás 6. ÖSSZEFOGLALÁS Kezdeti kísérleteim céljául azt tűztem ki, hogy a savanyú tejtermékek előállításához alkalmazott probiotikus, ill. nem probiotikus tejsavbaktérium- és bifidobaktérium-fajok (törzsek) szelektív tenyésztésére szolgáló eljárásokat összehasonlítsam, és megállapítsam, hogy a különféle kultúrakombinációkkal készülő

termékek

esetében

miként

valósítható meg a

termékazonos

mikroorganizmusok egymástól történő szelektív elkülönítése és élősejt-számuk meghatározása. A vizsgálatokat nyolc faj tizenhárom törzsével végeztem. A kiválasztott

nyolc

módszer

szelektivitását

a

táptalajok

antibiotikum-

komponensei (ciprofloxacin, clindamycin, lítium‒mupirocin), az alkalmazott inkubációs hőfokok és időtartamok, az aerob és anaerob tenyésztési körülmények, ill. ezek kombinációi biztosították. Mindegyik módszerrel teszteltem a törzsek szaporodási és telepképzési tulajdonságait. Eredményeim igazolták,

hogy

oligoszacharidokat

a

lítium-mupirocinnal tartalmazó

kiegészített,

(TOS‒MUP)

agar

transzgalaktozilált lehetővé

teszi

a

bifidobaktériumok élősejt-számának szelektív meghatározását tejsavbaktérium fajok jelenlétében. A Lactobacillus acidophilus elkülönítését a 45°C-on, anaerob körülmények között 48 óráig inkubált 5,4-es pH-jú MRS agar biztosította. A clindamycinnel és ciprofloxacinnal kiegészített MRS (MRS‒CC) agar szintén alkalmas volt Lb. acidophilus szelektív elkülönítésére, jóllehet ez a tápközeg nem gátolta teljesen a Lb. casei szaporodását, ezért az MRS‒CC agar csak abban az esetben ajánlható a Lb. acidophilus szelektív elkülönítésére, ha Lb. casei egyáltalán nincs jelen, vagy csak a Lb. acidophilus-ét nem meghaladó mennyiségben kimutatható a termékben. Joghurt esetében a termékazonos mikroorganizmusok

szelektív

elkülönítése

úgy

valósítható

meg

leghatékonyabban, ha a mintákat M17 agaron, 37°C-on, 48 óráig, aerob módon (Streptococcus thermophilus), ill. 6,2-es pH-jú MRS agaron, 37°C-on, 72 óráig anaerob körülmények között (Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus) inkubáljuk. A

123

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Összefoglalás Lactobacillus fajok szelektív elkülönítése 37°C-on, 72 óráig, anaerob módon inkubált, 5,4-es pH-jú MRS agaron valósítható meg. Második kísérletsorozatom célja az volt, hogy tehén-, kecske-, juh-, ill. tevetejből ABT-5 kultúrával készített probiotikus savanyú tejtermékekben nyomon kövessem a Lb. acidophilus LA-5 (A), a Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 (B) és a S. thermophilus CHCC 742/2130 (T) élősejtszámának változásait hathetes hűtve tárolás alatt. Mind a négy állatfaj teje megfelelő alapanyagul szolgált probiotikus savanyú tejtermékek előállításához, melyek a 4°C-on végzett tárolás során mindvégig kellően nagy számban (106107 cfu/ml) tartalmazták a Lb. acidophilus LA-5 és a B. animalis subsp. lactis BB-12 törzset. A nem probiotikus S. thermophilus CHCC 742/2130 élősejtszáma az összes megvizsgált mintában egy-két nagyságrenddel meghaladta a Magyar Élelmiszerkönyv által előírt vonatkozó minimumértéket (107 cfu/ml). A laktobacilluszok esetében lassú és közel egyenletes mértékű pusztulást tapasztaltam, amely azt eredményezte, hogy a 6. hét végén mért túlélési arányszámokat illetően nem volt különbség (P > 0,05) a termékek között. A fermentált kecsketejben a tárolás kezdetén szaporodóképes Lb. acidophilus sejteknek több mint egyharmada, a juhtejből készített termékben pedig kb. felük maradt életben a 6 hetes hűtve tárolást követően. Mindent egybevetve, a Lb. acidophilus számára nagyjából azonos túlélési feltételeket biztosított a négyféle alapanyag-tej. A hűtve tárolás alatti életképesség-megőrzés szempontjából a kecsketej rosszabb feltételeket kínált a bifidobaktériumoknak, mint a másik három tej-alapanyag: a teve-, a juh- és a tehéntejből készült probiotikus savanyú tejekben 6 hét alatt nem csökkent (P > 0,05) a bifidobaktériumok élősejt-száma, míg a kecsketej alapú termékben közel 80%-os pusztulást mértem. A harmadik kísérletsorozatban arra kerestem a választ, hogy 5% mézkiegészítés javítja-e a tehéntejből, ill. tevetejből készített ABT-típusú savanyú tejtermékek kultúrakomponenseinek hűtve tárolás alatti túlélését. A mézadagolásnak egyik alapanyag-tej esetében sem volt szignifikáns hatása (P > 0,05) a sztreptokokkuszokra a fermentáció, ill. az azt követő tárolási periódus

124

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Összefoglalás alatt. A kontroll tehéntej jobb körülményeket (P < 0,05) biztosított a Lb. acidophilus LA-5 elszaporodásához, mint a mézkiegészítés nélküli tevetej; 5% akácméz jelenléte azonban jelentősen javította a laktobacilluszok szaporodását a tevetej alapanyagban. Megállapítottam, hogy az akácméz jelenléte mindkét termékben csökkentette (P  0,05) a B. animalis subsp. lactis BB-12 pusztulását, sőt az 5. hét végén nagyobb bifidobaktérium-sejtszámokat mértem a mézes savanyú tejekben, mint a tárolás kezdetén. A méz nem csupán természetes

édesítőszer,

hanem

táplálkozásbiológiai,

érzékszervi

és

mikrobiológiai előnyöket hordozó szénhidrátforrás is egyben. A negyedik kísérletsorozatban ötfajta méz (akác-, hárs-, vegyes virág-, erdei- és gesztenyeméz) különféle baktériumokra és mikroszkopikus gombákra gyakorolt

szaporodásgátló,

ill.

szaporodásserkentő

hatását

vizsgáltam

agardiffúziós lyuktesztek segítségével. A mézek a vizsgálatba bevont élelmiszer-szennyező és kórokozó baktériumok közül három Gram-negatív baktériumtörzs (Pseudomonas aeruginosa HNCMB 170001, Salmonella enterica subsp. arizonae HNCMB 42021, Escherichia coli HNCMB 35035) szaporodását gátolták, az élesztőgomba- és penészgomba-törzsekre viszont nem gyakoroltak gátló hatást. Fontos megfigyelés, hogy a mézek többsége stimulálta egyes tejsavbaktérium-törzsek (Lb. acidophilus ATCC 314, Lb. casei ATCC 334 és S. thermophilus ATCC 19258) szaporodását. Az ötödik kísérletsorozat tevetejből és tehéntejből készített natúr, ill. 510% akácmézzel kiegészített, ABT-5 kultúrával savanyított tejtermékek érzékszervi bírálatát foglalta magába. Hat bírálónak kínáltam fel az elkészített, majd 4°C-on tárolt termékeket a gyártást követő 0., 14., 28. és 42. napon. A tevetej alapú termékek kedveltsége mindvégig mérsékelt volt. Megfelelő érzékszervi tulajdonságok kialakítása érdekében érdemes lenne a továbbiakban a tevetej savanyítását klasszikus joghurtkultúrával végezni, valamint más jellegű ízesítőanyagok hatását is megvizsgálni.

125

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Új tudományos eredmények 7. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK 1.

A CASO agar, 37ºC-on 72 órán keresztül anaerob körülmények között inkubálva, alkalmas a savanyú tejtermékek előállításához elterjedten alkalmazott probiotikus baktériumok (Lactobacillus és Bifidobacterium fajok törzsei) összes élősejt-számának meghatározására; az 5,4-es pHértékű MRS táptalaj pedig ‒ ugyanilyen inkubációs viszonyok mellett ‒ célszerűen alkalmazható a Lactobacillus spp. szelektív elkülönítésére és számbeli meghatározására.

2.

A

37°C-on

72

óráig

anaerob

módon

inkubált,

50

mg/l

lítium‒mupirocinnal kiegészített, transzgalaktozilált oligoszacharidokat tartalmazó (TOS‒MUP) agar alkalmas a probiotikus Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 és B. breve M-16V törzsek élősejtszámának szelektív meghatározására tejsavbaktériumok jelenlétében.

3.

A Lactobacillus acidophilus élősejt-számának szelektív meghatározása leghatékonyabban 45°C-on, 48 órán át, anaerob módon inkubált, 5,4-es pH-jú MRS agaron valósítható meg. A vonatkozó nemzetközi szabványban szereplő módszer [0,1 mg/l clindamycinnel és 10 mg/l ciprofloxacinnal kiegészített MRS agar (MRS‒CC agar), 37°C-on 72 óráig anaerob körülmények között inkubálva (ISO és IDF, 2006)] csak abban az esetben alkalmas ugyanerre, ha a vizsgálandó termékben Lb. casei nincs jelen a Lb. acidophilus-szal azonos, vagy azt meghaladó koncentrációban.

4.

ABT-típusú

probiotikus

savanyú

tejtermékek

kultúra

eredetű

komponenseinek szelektív elkülönítését 37°C-on 72 óráig anaerob módon inkubált MRS‒CC agaron, vagy 5,4-es pH-jú MRS agaron (Lb. acidophilus), 37°C-on 72 órán át anaerob módon inkubált TOS‒MUP

126

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Új tudományos eredmények agaron (Bifidobacterium spp.), ill. 45ºC-on, 24 órán keresztül aerob körülmények között inkubált M17 agaron (Streptococcus thermophilus) célszerű végezni.

5.

5% akácméz-kiegészítés csökkenti (P < 0,05), sőt megakadályozza a B. animalis subsp. lactis BB-12 pusztulását tehéntej-, ill. tevetej-alapú probiotikus savanyú tejekben a termékek 4°C-on történő öthetes tárolása során. Az akác-, a hárs-, a vegyes virág-, az erdei- és a gesztenyeméz 25100%-os oldatai gátolják a Pseudomonas aeruginosa HNCMB 170001, a Salmonella enterica subsp. arizonae HNCMB 42021 és az Escherichia coli HNCMB 35035 szaporodását, miközben a mézek többsége ugyanilyen koncentrációban stimulálja egyes tejsavbaktérium-törzsek (Lb. acidophilus ATCC 314, Lb. casei ATCC 334 és S. thermophilus ATCC 19258) szaporodását; tehát a mézadagolás optimális esetben javítja a savanyú tejtermékek mikrobiológiai élelmiszer-biztonságát.

127

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Köszönetnyilvánítás KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS “Sokat tettél értünk, Uram, Istenem, csodáiddal és terveiddel. Nincs Hozzád hasonló. Hirdetném és elbeszélném, de több az annál, semhogy fölsorolhatnám.” (Zsolt 40,6.) Ezúton szeretném megköszönni témavezetőmnek, Prof. Dr. Varga László egyetemi tanár úrnak, hogy már diplomamunkám témájának kiválasztásától kezdődően, PhD tanulmányaim teljes időszaka alatt mindvégig segítette és irányította szakmai munkámat és mindig volt ideje, türelme kérdéseim, kéréseim meghallgatására, valamint az évek során mindig bátorító szavakkal ösztönzött. Külön köszönöm Professzor Úrnak a disszertáció elkészítésében nyújtott alapos munkáját és segítségét. Köszönettel tartozom Prof. Dr. Szigeti Jenő ny. intézetigazgató úrnak, aki megteremtette számomra a zavartalan kutatómunka feltételeit a Nyugatmagyarországi Egyetem Mezőgazdaság- és Élelmiszer-tudományi Karának Élelmiszer-tudományi Intézetében. Szeretném megköszönni Hucker Attilának, a Magyar Tejgazdasági Kísérleti Intézet Kft. mikrobiológiai laboratóriuma vezetőjének és a laboratóriumi

asszisztenseknek

kísérleteim

kivitelezése

során

nyújtott

segítségüket. E doktori értekezés nem jöhetett volna létre Dr. Nagy Péter Pál c. egyetemi tanár, a dubaji Emirates Industries for Camel Milk & Products (EICMP) cég osztályvezetője és vezető szaporodásbiológus állatorvosa nélkül, aki a kísérleteimhez szükséges tevetejet az Egyesült Arab Emírségekből eljuttatta Mosonmagyaróvárra. Köszönöm továbbá a Tebike Kft.-nek a kecsketejet, a PharmaGene-Farm Kft.-nek a juhtejet és a Lajta Hanság Zrt.-nek a tehéntejet, melyeket a kísérletekhez rendelkezésemre bocsátottak. Köszönöm a Globál Vép Kft.-nek, hogy a termékfejlesztéshez szükséges stabilizálószert ajándékba adta.

128

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Köszönetnyilvánítás Köszönöm Takaró Lajosnak, az MTKI Kft. munkatársának a probiotikus savanyú tevetej-termék gyártásánál nyújtott gyakorlati segítségét. Hálás vagyok Bukovics Solveignek, Takaró Lajosnak, Dr. Szafner Gábornak, Dr. Krász Ádámnak, Korcz Evelinnek, Fábri Zsófia Nórának és Pörneczi Attilának az érzékszervi vizsgálatokban való aktív részvételükért. Külön köszönöm Dr. Ajtony Zsolt egyetemi docens úrnak az értekezés tartalmával és formátumával kapcsolatos észrevételeit és azt, hogy a disszertáció elkészítése alatt mindvégig bíztatott. Köszönöm Dr. Krász Ádám c. egyetemi docens úrnak és Prof. Dr. Varga László egyetemi tanár úrnak, témavezetőmnek a tejtudományok oktatását, a szakma szeretetének átadását. Hálás szívvel köszönöm Dr. Zsédely Eszter egyetemi adjunktusnak, testvéremnek az Úrban, a disszertáció írásánál nyújtott fáradhatatlan segítségét, és azt, hogy kitartó imában hordozott az Úr előtt az elmúlt években. Külön köszönet illeti Dr. Farkas Lászlót, Dr. Ásványi Balázst, Szücs Petrát, Fábri Zsófia Nórát, Korcz Evelint és Lökösházi Évát segítő szándékú tanácsaikért, valamint Ankhelyi Istvánnét, Göncz Ferencnét és Németh Ferencet a laboratóriumi munkában nyújtott segítségükért. A legnagyobb hálával gondolok Családom minden tagjára, akik szeretetükkel, megértésükkel, anyagi és lelki áldozataikkal sok esetben erejükön felül támogattak céljaim elérésében. KÖSZÖNÖM!

129

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalomjegyzék 8. IRODALOMJEGYZÉK 1.

Abu-Taraboush, H.M. – Al-Dagal, M.M. – Al-Royli, M.A. (1998): Growth, viability, and proteolytic activity of bifidobacteria in whole camel milk. Journal of Dairy Science 81, 354-361.

2.

Agbagwa, O.E. – Frank-Peterside, N. (2010): Effect of raw commercial honeys from Nigeria on selected pathogenic bacteria. African Journal of Microbiology Research 4, 1801-1803.

3.

Agrawal, R.P. – Budania, S. – Sharma, P. – Gupta, R. – Kochar, D.K. – Panwar, R.B. – Sahani, M.S. (2007): Zero prevalence of diabetes in camel milk consuming Raica community of north-west Rajasthan, India. Diabetes Research and Clinical Practice 76, 290-296.

4.

Ahmadi-Motamayel, F. – Hendi, S.S. – Alikhani, M.Y. – Khamverdi, Z. (2013): Antibacterial activity of honey on cariogenic bacteria. Journal of Dentistry of Tehran University of Medical Sciences 10, 10-15.

5.

Al haj, O.A. – Al Kanhal, H.A. (2010): Compositional, technological and nutritional aspects of dromedary camel milk. International Dairy Journal 20, 811-821.

6.

Alhaj, O.A. – Taufik, E. – Handa, Y. – Fukuda, K. – Saito, T. – Urashima, T. (2013): Chemical characterization of oligosaccharides in commercially pasteurized dromedary camel (Camelus dromedarius) milk. International Dairy Journal 28, 70-75.

7.

Al-Saleh, A.A. (1996): Heat coagulation of camel milk. Journal of King Saud University, Agricultural Sciences 8, 107-117.

8.

AMC (Agrármarketing Centrum) (2012): A Magyar Méz. Földművelésügyi és Vidékfejlesztési Minisztérium, Magyar Közösségi Agrármarketing Centrum (AMC) Közhasznú Társaság, Budapest, 8 pp.

9.

Amnah, A.H.R. (2012): Enhancement of probiotic bioactivity by some prebiotics to produce bio-fermented milk. Life Science Journal 9, 22462253.

10.

Antunes, A.E.C. – Cazetto, T.F. – Bolini, H.M.A. (2005): Viability of probiotic micro-organisms during storage, postacidification and sensory analysis of fat-free yogurts with added whey protein concentrate. International Journal of Dairy Technology 58, 169-173.

130

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalomjegyzék 11.

Antunes, A.E.C. – Grael, E.T. – Moreno, I. – Rodrigues, L.G. – Dourado, F.M. – Saccaro, D.M. – Lerayer, A.L.S. (2007): Selective enumeration and viability of Bifidobacterium animalis subsp. lactis in a new fermented milk product. Brazilian Journal of Microbiology 38, 173-177.

12.

Anukam, K.C. – Reid, G. (2007): Probiotics: 100 years (1907-2007) after Elie Metchnikoff’s observation. In: Communicating Current Research and Educational Topic and Trends in Applied Microbiology. Ed. Méndez-Vilas, A., Vol. 1. Formatex, Badajoz, Spain, pp. 466-474.

13.

Anyanwu, C.U. (2012): Investigation of in vitro antifungal activity of honey. Journal of Medicinal Plants Research 6, 3512-3516.

14.

Araújo, E.A. – Pires, A.C.S. – Pinto, M.S. – Jan, G. – de Carvalho, A.F. (2012): Probiotics in dairy fermented products. In: Probiotics. Ed. Rigobelo, E.C. InTech, Rijeka, Croatia, pp. 129-148.

15.

Ashraf, R. – Shah, N.P. (2011). Selective and differential enumeration of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei and Bifidobacterium spp. in yoghurt – a review. International Journal of Food Microbiology 149, 194-208.

16.

Ashraf, R. – Smith, S.C. (2015): Selective enumeration of dairy based strains of probiotic and lactic acid bacteria. International Food Research Journal 22, 2576-2586.

17.

Ásványi-Molnár, N. (2009): Funkcionális hatású tejtermék előállítása Spirulina (Arthrospira platensis) felhasználásával. Doktori (PhD) Értekezés. Nyugat-magyarországi Egyetem, Mosonmagyaróvár, 139 pp.

18.

Attia, H. – Kherouatou, N. – Dhouib, A. (2001): Dromedary milk lactic acid fermentation: microbiological and rheologoical characteristics. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 26, 263-270.

19.

Axelsson, L. (2004): Lactic acid bacteria: classification and physiology. In: Lactic Acid Bacteria, Microbiological and Functional Aspects. Eds Salminen, S. ‒ von Wright, A. ‒ Ouwehand, A., 3rd Ed. Marcel Dekker, New York, NY, pp. 1-96.

20.

Belák, Á. – Kiskó, G. – Kovács, M. – Maráz, A. – Mohácsiné Farkas, Cs. – Pomázi, A. (2011): Szelektív és differenciáló táptalajok általános jellemzése. In: Gyors és Molekuláris Biológiai Módszerek Alkalmazása Élelmiszerek Mikrobiológiai Vizsgálatára: Gyakorlati Kézikönyv. Nemzeti Tankönyvkiadó, Budapest.

131

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalomjegyzék http://www.tankonyvtar.hu/hu/tartalom/tamop425/0011_2A_6_modul/11 44/index.scorml. 21.

Bernardeau, M. – Vernoux, J.P. – Henri-Dubernet, S. – Guéguen, M. (2008): Safety assessment of dairy microorganisms: the Lactobacillus genus. International Journal of Food Microbiology 126, 278-285.

22.

Binnendijk, K.H. – Rijkers, G.T. (2013): What is health benefit? An evaluation of EFSA opinions on health benefits with reference to probiotics. Beneficial Microbes 4, 223-230.

23.

Biró, L. – Antal, M. (2009): A tejfogyasztás élettani hatásai. In: A Tej Szerepe a Humán Táplálkozásban. Szerk.: Kukovics, S. Melánia Kiadó, Budapest, pp. 281-282.

24.

Bogdanov, S. – Jurendic, T. – Sieber, R. – Gallmann, P. (2008): Honey for nutrition and health: a review. American Journal of College of Nutrition 27, 677-689.

25.

Candiracci, M. – Citterio, B. – Diamantini, G. – Blasa, M. – Accorsi, A. – Piatti, E. (2011): Honey flavonoids, natural antifungal agents against Candida albicans. International Journal of Food Properties 14, 799-808.

26.

Van de Casteele, S. – Vanheuverzwijn, T. – Ruyssen, T. – Van Assche, P. – Swings, J. – Huys, G. (2006). Evaluation of culture media for selective enumeration of probiotic strains of lactobacilli and bifidobacteria in combination with yoghurt or cheese starters. International Dairy Journal 16, 1470-1476.

27.

Charteris, W.P. – Kelly, P.M. – Morelli, L. – Collins, J.K. (1998): Antibiotic susceptibility of potentially probiotic Bifidobacterium isolates from the human gastrointestinal tract. Letters in Applied Microbiology 26, 333-337.

28.

Chick, H. – Shin, H.S. – Ustunol, Z. (2001): Growth and acid production by lactic acid bacteria and bifidobacteria grown in skim milk containing honey. Journal of Food Science 66, 478-481.

29.

Collins, M.D. – Rodrigues, U. – Ash, C. – Aguirre, M. – Farrow, J.A.E. – Martinez-Murcia, A. ‒ Phillips, B.A. – Williams, A.M. – Wallbanks, S. (1991): Phylogenetic analysis of the genus Lactobacillus and related lactic acid bacteria as determined by reverse transcriptase sequencing of 16S rRNA. FEMS Microbiology Letters 77, 5-12.

132

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalomjegyzék 30.

Conesa, C. – Sánchez, L. – Rota, C. – Pérez, M.D. – Calvo, M. – Farnaud, S. – Evans, R.W. (2008): Isolation of lactoferrin from milk of different species: calorimetric and microbial studies. Comparative Biochemistry and Physiology B 150, 131-139.

31.

Csanádi, Zs. (2008): Prebiotikus hatású fruktooligoszacharidok enzimkatalitikus szintézise integrált rendszerben. Doktori (PhD) Értekezés. Pannon Egyetem Műszaki Kémiai Kutató Intézet, Veszprém, 115 pp.

32.

Csanádi, J. – Fenyvessy, J. – Jávor, A. (1999): Juhsavó humán célú felhasználásának lehetőségei. In: Tisztántúli Mezőgazdasági Tudományos Napok Kiadványa. Szerk.: Jávor, A. – Mihók, S. – Komlósi, I. Debreceni Agrártudományi Egyetem, Debrecen, pp. 159-165.

33.

Csanádi, J. – Horváth, Zs. – Fenyvessy, J. – Hodúr, C. – Bajúsz, I. (2008): Zsírgolyócskák méreteloszlása tehén- és kecsketejben. Tejgazdaság 68, 77-82.

34.

Csapó, J. – Csapóné, K. Zs. (2002): Tej és tejtermékek a táplálkozásban. Mezőgazda Kiadó, Budapest, 464 pp.

35.

Csapóné, K.Zs. – Kukovics, S. – Csapó, J. (2009): A juh- és kecsketej táplálkozástudományi szempontból legfontosabb összetevői. In: A Tej Szerepe a Humán Táplálkozásban. Szerk.: Kukovics, S. Melánia Kiadó, Budapest, pp. 187-206.

36.

Darukaradhya, J. – Phillips, M. – Kailasapathy, K. (2006): Selective enumeration of Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium spp., starter lactic acid bacteria and non-starter lactic acid bacteria from Cheddar cheese. International Dairy Journal 16, 439-445.

37.

Das, A. – Datta, S. – Mukherjee, S. – Bose, S. – Ghosh, S. – Dhar, P. (2015): Evaluation of antioxidative, antibacterial and probiotic growth stimulatory activities of Sesamum indicum honey containing phenolic compound and lignans. LWT ‒ Food Science and Technology 61, 244250.

38.

Dave, R.I. – Shah, N.P. (1996): Evaluation of media for selective enumeration of Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, and bifidobacteria. Journal of Dairy Science 79, 1529-1536.

39.

Deák, T. (2005): A mikrobavilág molekuláris szemlélete. Élelmezési Ipar 59, 105-111.

133

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalomjegyzék 40.

Deák, T. (Szerk.) (2006): Élelmiszer-mikrobiológia. Mezőgazda Kiadó, Budapest, 382 pp.

41.

Delcenserie, V. – Bechoux, N. – China, B. – Daube, G. – Gavini, F. (2005): A PCR method for detection of bifidobacteria in raw milk and raw milk cheese: comparison with culture-based methods. Journal of Microbiological Methods 61, 55-67.

42.

Deraz, S.F. – Nordberg-Karlsson, E. – Hedström, M. – Andersson, M.M. – Mattiasson, B. (2005): Purification and characterisation of acidocin D20079, a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus DSM 20079. Journal of Biotechnology 117, 343-354.

43.

Dubernet, S. – Desmasures, N. – Guéguen, M. (2002): A PCR-based method for identification of lactobacilli at the genus level. FEMS Microbiology Letters 214, 271-275.

44.

El-Agamy, E.I. (2006): Camel milk. In: Handbook of Milk of Non-Bovine Mammals. Eds Park, Y.W. ‒ Haenlein, G.F.W. Blackwell Publishing, Ames, IA, pp. 297-344.

45.

El-Agamy, E.I. – Ruppanner, R. – Ismail, A. – Champagne, C.P. – Assaf, R. (1996): Purification and characterization of lactoferrin, lactoperoxidase, lysozyme and immunoglobulins from camel’s milk. International Dairy Journal 6, 129-145.

46.

Elahi, S. – Farnell, P. – Thurlow, K.J. – Scotti, C. – Varnam, A.H. (2008): Referee analysis of probiotic food supplements. Food Control 19, 925-929.

47.

Eljack, M.S. – Kafi, S.K. (2014): Evaluation of the antibacterial activity of Sudanese honey against typhoidal and non-typhoidal salmonellae. World Journal of Pharmaceutical Research 3, 1431-1438.

48.

Ereifej, K.I. – Alu’datt, M.H. – AlKhalidy, H.A. – Alli, I. – Rababah, T. (2011): Comparison and characterisation of fat and protein composition for camel milk from eight Jordanian locations. Food Chemistry 127, 282289.

49.

Erejuwa, O.O. – Sulaiman, S.A. – Wahab, M.S.A. (2012): Honey: a novel antidiabetic agent. International Journal of Biological Sciences 8, 913934.

134

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalomjegyzék 50.

Eteraf-Oskouei, T. – Najafi, M. (2013): Traditional and modern uses of natural honey in human diseases: a review. Iranian Journal of Basic Medical Sciences 16, 731-742.

51.

Európai Bizottság (2012): Élelmiszerek: a Bizottság az egészségre vonatkozó állításokat tartalmazó korszakalkotó listát fogadott el. Sajtóközlemény. Brüsszel, Belgium, 2012. május 16. 2 pp.

52.

Fábri, Zs.N. – Varga, L. – Nagy, P. (2014a): A tevetej termelése, általános jellemzői, összetétele és egészségre gyakorolt jótékony hatásai. Irodalmi összefoglaló. 1. Fizikai és kémiai jellemzők, fehérje- és zsírtartalom. Magyar Állatorvosok Lapja 136, 485-493.

53.

Fábri, Zs.N. – Varga, L. – Nagy, P. (2014b): A tevetej termelése, általános jellemzői, összetétele és egészségre gyakorolt jótékony hatásai. Irodalmi összefoglaló. 2. Tejcukor-, ásványianyag- és vitamintartalom, egészségügyi előnyök. Magyar Állatorvosok Lapja 136, 553–557.

54.

Fachin, L. – Moryia, J. – Gândara, A.L.N. – Viotto, W.H. (2008): Evaluation of culture media for counts of Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB 12 in yoghurt after refrigerated storage. Brazilian Journal of Microbiology 39, 357-361.

55.

Farah, Z. (1993): Composition and characteristics of camel milk. Journal of Dairy Research 60, 603-626.

56.

Farah, Z. (2011): Camel milk. In: Encyclopedia of Dairy Sciences. Eds Fuquay, J.W. ‒ Fox, P.F. ‒ McSweeney, P.L.H., Vol. 3., 2nd Ed. Academic Press, London, UK, pp. 512-517.

57.

Fenyvessy, J. (1995): Adatok a juhtej zsírsavösszetételéhez. Tejgazdaság 55, 39-41.

58.

Fenyvessy, J. (2009): A kiskérődzők tejének értékes tulajdonságai a fogyasztás és a feldolgozás szempontjából. In: A Tej Szerepe a Humán Táplálkozásban. Szerk.: Kukovics, S. Melánia Kiadó, Budapest, pp. 417424.

59.

Fenyvessy, J. – Csanádi, J. (1999): A kiskérődzők (juh, kecske) tejalkotórészeinek táplálkozási megítélése. Tejgazdaság 59, 23-26.

60.

Ferraris, L. – Aires, J. – Waligora-Dupriet, A.J. – Butel, M.J. (2010): New selective medium for selection of bifidobacteria from human feces. Anaerobe 16, 469-471.

135

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalomjegyzék 61.

Fukuda, K. (2013): Camel milk. In: Milk and Dairy Products in Human Nutrition: Production, Composition and Health. Eds Park, Y.W. ‒ Haenlein, G.F.W. Wiley, Oxford, UK. pp. 578-593.

62.

Fukuda, K. – Yamamoto, A. – Ganzorig, K. – Khuukhenbaatar, J. – Senda, A. – Saito, T. – Urashima, T. (2010): Chemical characterization of the oligosaccharides in bactrian camel (Camelus bactrianus) milk and colostrum. Journal of Dairy Science 93, 5572-5587.

63.

García-Cayuela, T. – Tabasco, R. – Peláez, C. – Requena, T. (2009): Simultaneous detection and enumeration of viable lactic acid bacteria and bifidobacteria in fermented milk by using propidium monoazide and realtime PCR. International Dairy Journal 19, 405-409.

64.

Ghoddusi, H.B. – Hassan, K. (2011): Selective enumeration of bifidobacteria: a comparative study. Milchwissenschaft 66, 149-151.

65.

Giraffa, G. – Chanishvili, N. – Widyastuti, Y. (2010): Importance of lactobacilli in food and feed biotechnology. Research in Microbiology 161, 480-487.

66.

Granato, D. – Branco, G.F. – Cruz, A.G. – Faria, J.A.F. – Shah, N.P. (2010): Probiotic dairy products as functional foods. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 9, 455-470.

67.

Gueimonde, M. – Delgado, S. – Mayo, B. – Ruas-Madiedo, P. – Margolles, A. – De Los Reyes-Gavilán, C.G. (2004): Viability and diversity of probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium populations included in commercial fermented milks. Food Research International 37, 839-850.

68.

Haddad, I. – Mozzon, M. – Strabbioli, R. – Frega, N.G. (2011): Electrospray ionization tandem mass spectrometry analysis of triacylglycerols molecular species in camel milk (Camelus dromedarius). International Dairy Journal 21, 119-127.

69.

Halász, A. (2009): Lactic acid bacteria. In: Food Quality and Standards. Ed. Lásztity, R., Vol. 3. EOLSS Publishers, Oxford, UK, pp. 70-83.

70.

Hammes, W.P. – Vogel, R.F. (1995): The genus Lactobacillus. In: The Genera of Lactic Acid Bacteria. Eds Wood, B.J.B. ‒ Holzapfel, W.H., Vol. 2. Blackie Academic & Professional, London, UK, pp. 19-54.

71.

Hammes, W.P. – Weiss, N. – Holzapfel, W.H. (1991): The genera Lactobacillus and Carnobacterium. In: The Prokaryotes. Eds Balows, A.

136

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalomjegyzék ‒ Trüper, H.G. ‒ Dworkin, M. ‒ Harder, W. ‒ Schleifer, K.H., Vol. 2., 2nd Ed. Springer, New York, NY, pp. 1535-1594. 72.

Herbel, S.R. – Vahjen, W. – Wieler, L.H. – Guenther, S. (2013): Timely approaches to identify probiotic species of the genus Lactobacillus. Gut Pathogens 5, 1-13.

73.

Hill, C. – Guarner, F. – Reid, G. – Gibson, G.R. – Merenstein, D.J. – Pot, B. – Morelli, L. – Canani, R.B. – Flint, H.J. – Salminen, S. – Calder, P.C. – Sanders, M.E. (2014): The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics consensus statement on the scope and appropriate use of the term probiotic. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology 11, 506-514.

74.

Holzapfel, W.H. – Haberer, P. – Geisen, R. – Björkroth, J. – Schillinger, U. (2001): Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition. American Journal of Clinical Nutrition 73 (Suppl.), 365S-373S.

75.

IDF (1995): Detection and enumeration of Lactobacillus acidophilus. Bulletin No. 306. International Dairy Federation (IDF), Brussels, Belgium, 23 pp.

76.

IDF (2013): The world dairy situation 2013. Bulletin No. 470. International Dairy Federation (IDF), Brussels, Belgium, 237 pp.

77.

ISO ‒ IDF (2006): Milk products – Enumeration of presumptive Lactobacillus acidophilus on a selective medium – Colony-count technique at 37°C. International Standard ISO 0128:2006(E) / IDF 192:2006(E). International Organization for Standardization (ISO), Geneva, Switzerland / International Dairy Federation (IDF), Brussels, Belgium, 11 pp.

78.

ISO ‒ IDF (2010): Milk products – Enumeration of presumptive bifidobacteria – Colony count technique at 37°C. International Standard ISO 29981:2010(E) / IDF 220:2010(E). International Organization for Standardization (ISO), Geneva, Switzerland / International Dairy Federation (IDF), Brussels, Belgium, 17 pp.

79.

Isolauri, E. – Arvola, T. – Sütas, Y. – Moilanen, E. – Salminen, S. (2000): Probiotics in the management of atopic eczema. Clinical Experimental Allergy 30, 1604-1610.

137

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalomjegyzék 80.

Juhász, J. – Nagy, P. (2012): A nagyüzemi tevetej termelési rendszer kifejlesztése és működtetése. Kihívások, tapasztalatok és eredmények. Magyar Állatorvosok Lapja 134, 52-62.

81.

Jumah, R.Y. – Shaker, R.R. – Abu-Jdayil, B. (2001): Effect of milk source on the rheological properties of yogurt during the gelation process. International Journal of Dairy Technology 54, 89-93.

82.

Kajiwara, S. ‒ Gandhi, H. ‒ Ustunol, Z. (2002): Effect of honey on the growth of and acid production by human intestinal Bifidobacterium spp.: an in vitro comparison with commercial oligosaccharides and inulin. Journal of Food Protection 65, 214-218.

83.

Karimi, R. – Mortazavian, A.M. – Amiri-Rigi, A. (2012): Selective enumeration of probiotic microorganisms in cheese. Food Microbiology 29, 1-9.

84.

Kechagia, M. – Basoulis, D. – Konstantopoulou, S. – Dimitriadi, D. – Gyftopoulou, K. – Skarmoutsou, N. – Fakiri, E.M. (2013): Health benefits of probiotics: a review. ISRN Nutrition 2013, Article ID 481651, 7 pp.

85.

Keohane, J. – Ryan, K. – Shanahan, F. (2009): Lactobacillus in the gastrointestinal tract. In: Lactobacillus Molecular Biology: From Genomics to Probiotics. Eds Ljungh, A. ‒ Wadström, T. Caister Academic Press, Norfolk, UK, pp. 169-181.

86.

Khaskheli, M. – Arain, M.A. (2005): Physico-chemical quality of camel milk. Journal of Agriculture and Social Sciences 1, 164-166.

87.

Klein, G. – Pack, A. – Bonaparte, C. – Reuter, G. (1998): Taxonomy and physiology of probiotic lactic acid bacteria. International Journal of Food Microbiology 41, 103-125.

88.

Kołakowski, P. – Malinowska, M. – Gerlich, J. (2010): The use of transoligosaccharide (TOS) propionate agar medium with mupirocin for selective enumeration of bifidobacteria in dairy cultures and in fermented dairy products. Milchwissenschaft 65, 380-384.

89.

Konuspayeva, G. – Faye, B. – Loiseau, G. (2009): The composition of camel milk: a meta-analysis of the literature data. Journal of Food Composition and Analysis 22, 95-101.

90.

Kramer, A. (1960): A rapid method for determining significance of differences from rank sums. Food Technology 11, 576-581.

138

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalomjegyzék 91.

Kudełka, W. (2010): Probiotics in natural bio-yoghurts of goats’ milk. Milchwissenschaft 65, 407–410.

92.

Kukovics, S. – Unger, A. – Bakos, E. – Szakály, S. (2009): A tej és a tejtermékek jelentősége. In: A Tej Szerepe a Humán Táplálkozásban. Szerk.: Kukovics, S. Melánia Kiadó, Budapest, pp. 19-34.

93.

Kumar, B.V. – Vijayendra, S.V.N. – Reddy, O.V.S. (2015): Trends in dairy and non-dairy probiotic products – a review. Journal of Food Science and Technology 52, 6112-6124.

94.

Larsen, C.N. – Nielsen, S. – Kæstel, P. – Brockmann, E. – Bennedsen, M. – Christensen, H.R. – Eskesen, D.C. – Jacobsen, B.L. – Michaelsen, K.F. (2006): Dose–response study of probiotic bacteria Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 and Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CRL-341 in healthy young adults. European Journal of Clinical Nutrition 60, 1284-1293.

95.

Leahy, S.C. – Higgins, D.G. – Fitzgerald, G.F. – van Sinderen, D. (2005): Getting better with bifidobacteria. A review. Journal of Applied Microbiology 98, 1303-1315.

96.

Lima, K.G.D.C. – Kruger, M.F. – Behrens, J. – Destro, M.T. – Landgraf, M. – Franco, B.D.G.M. (2009): Evaluation of culture media for enumeration of Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei and Bifidobacterium animalis in the presence of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus. LWT – Food Science and Technology 42, 491-495.

97.

Macedo, L.N. – Luchese, R.H. – Guerra, A.F. – Barbosa, C.G. (2008): Efeito prebiótico do mel sobre o crescimento e viabilidade de Bifidobacterium spp. e Lactobacillus spp. em leite (Prebiotic effect of honey on growth and viability of Bifidobacterium spp. and Lactobacillus spp. in milk). Ciência e Tecnologia de Alimentos 28, 935–942.

98.

Magyar Élelmiszerkönyv Bizottság (2002): Méz. In: Magyar Élelmiszerkönyv – 1-3-2001/110 számú előírás. Magyar Élelmiszerkönyv Bizottság, Budapest, 7 pp.

99.

Magyar Élelmiszerkönyv Bizottság (2004): Savanyú tejtermékek. In: Magyar Élelmiszerkönyv – 2-51/03 Tej és Tejtermékek. Magyar Élelmiszerkönyv Bizottság, Budapest, pp. 21-24.

139

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalomjegyzék 100. Marshall, V.M. – Tamime, A.Y. (1997): Starter cultures employed in the manufacture of biofermented milks. International Journal of Dairy Technology 50, 35-41. 101. Masco, L. – Huys, G. – Gevers, D. – Verbrugghen, L. – Swings, J. (2003): Identification of Bifidobacterium species using rep-PCR fingerprinting. Systematic and Applied Microbiology 26, 557-563. 102. Matijašic, B.B. – Obermayer, T. – Rogelj, I. (2010): Quantification of Lactobacillus gasseri, Enterococcus faecium and Bifidobacterium infantis in a probiotic OTC drug by real-time PCR. Food Control 21, 419-425. 103. Medina, L.M. – Jordano, R. (1995): Population dynamics of constitutive microbiota in BAT type fermented milk products. Journal of Food Protection 58, 70-76. 104. Merk, K. – Borelli, C. – Korting, H.C. (2005): Lactobacilli – bacteria‒host interaction with special regard to the urogenital tract. International Journal of Medical Microbiology 295, 9-18. 105. Miranda, R.O. – Neto, G.G. – De Freitas, R. – De Carvalho, A.F. – Nero, L.A. (2011): Enumeration of bifidobacteria using PetrifilmTM AC in pure cultures and in a fermented milk manufactured with a commercial culture of Streptococcus thermophilus. Food Microbiology 28, 1509-1513. 106. Mistry, R. – Shah, G. (2013): Study of inhibitory effect of honey on various pathogenic and non-pathogenic microorganisms. International Journal of Applied Sciences and Biotechnology 1, 279-281. 107. Molan, P.C. (1992): The antibacterial activity of honey: 1. The nature of the antibacterial activity. Bee World 73, 5-28. 108. Molis, C. – Flourié, B. – Ouarne, F. – Gailing, M.F. – Lartigue, S. – Guibert, A. – Bornet, F. – Galmiche, J.P. (1996): Digestion, excretion, and energy value of fructooligosaccharides in healthy humans. American Journal of Clinical Nutrition 64, 324-328. 109. Moriya, J. – Fachin, L. – Gândara, A.L.N. – Viotto, W.H. (2006): Evaluation of culture media for counts of Bifidobacterium animalis in the presence of yoghurt bacteria. Brazilian Journal of Microbiology 37, 516520. 110. Mortazavian, A.M. – Ehsani, M.R. – Sohrabvandi, S. – Reinheimer, J.A. (2007): MRS-bile agar: its suitability for the enumeration of mixed

140

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalomjegyzék probiotic cultures in cultured dairy products. Milchwissenschaft 62, 270272. 111. Möller, C. – de Vrese, M. (2004): Review: probiotic effects of selected acid bacteria. Milchwissenschaft 59, 597-600. 112. Muhammad, H.S. – Muhammad, S. (2005): The use of Lawsonia inermis linn. (henna) in the management of burn wound infections. African Journal of Biotechnology 4, 934-937. 113. Nagy, P. – Thomas, S. – Markó, O. – Juhász, J. (2013): Milk production, raw milk quality and fertility of dromedary camels (Camelus dromedarius) under intensive management. Acta Veterinaria Hungarica 61, 71-84. 114. National Honey Board (1996): Honey Information Kit of the Food and Beverage Industries. National Honey Board, Longmont, CO. 115. Nighswonger, B.D. – Brashears, M.M. – Gilliland, S.E. (1996): Viability of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei in fermented milk products during refrigerated storage. Journal of Dairy Science 79, 212219. 116. Olaitan, P.B. – Adeleke, E.O. – Ola, O.I. (2007): Honey: a reservoir for microorganisms and an inhibitory agent for microbes. African Health Sciences 7, 159-165. 117. Olson, D.W. – Aryana, K.J. (2008): An excessively high Lactobacillus acidophilus inoculation level in yoghurt lowers product quality during storage. LWT – Food Science and Technology 41, 911-918. 118. Omafuvbe, B.O. – Akanbi, O.O. (2009): Microbiological and physicochemical properties of some commercial Nigerian honey. African Journal of Microbiology Research 3, 891-896. 119. Orla-Jensen, S. (1919): The lactic acid bacteria. In: Dairy Bacteriology. Host and Son, Copenhagen, Denmark, pp. 1-118. 120. Perotti, M.C. – Wolf, I.V. – Addis, M. – Comunian, R. – Paba, A. – Meinardi, C.A. (2014): Incorporation of probiotic bacteria (Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp.) in Argentinian ovine cheese. Dairy Science and Technology 94, 255-267.

141

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalomjegyzék 121. Pitlik, E. (2007): Probiotikum, prebiotikum, szinbiotikum. In: A Probiotikumok. A Jó Egészség és a Hosszú Élet Titka? Anonymus Kiadó, Budapest, pp. 20-44. 122. Pot, B. (2008): The taxonomy of lactic acid bacteria. In: Bactéries Lactiques de la Génétique aux Ferments. Eds Corrieu, G. ‒ Luquet, F.M. Lavoisier, Paris, France, pp. 1-152. 123. Pot, B. – Ludwig, W. – Kersters, K. – Schleifer, K.H. (1994): Taxonomy of lactic acid bacteria. Microbiology, genetics and applications. In: Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria. Eds de Vuyst, L. ‒ Vandamme, E.J. Chapman and Hall, Blackie Academic and Professional, Glasgow, UK, pp. 13-90. 124. Pot, B. ‒ Tsakalidou, E. (2009): Taxonomy and metabolism of Lactobacillus. In: Lactobacillus Molecular Biology: From Genomics to Probiotics. Eds Ljungh, A. ‒ Wadström, T. Caister Academic Press, Norfolk, UK, pp. 3-58. 125. Pulay, G. (1972): Tejgazdasági Mikrobiológia. Gödöllői Agrártudományi Egyetem, Gödöllő, 119 pp. 126. Pulay, G. – Krász, Á. (1980): A tejsavbaktérium tenyészetek életműködéséről különböző zsírtartalmú tejekben. Tejipar 29, 49-60. 127. Rada, V. – Koc, J. (2000): The use of mupirocin for selective enumeration of bifidobacteria in fermented milk products. Milchwissenschaft 55, 65-67. 128. Rahman, I.E.A. – Dirar, H.A. – Osman, M.A. (2009): Microbiological and biochemical changes and sensory evaluation of camel milk fermented by selected bacterial starter cultures. African Journal of Food Science 3, 398-405. 129. Rahman, S. – Salehin, F. – Asif, I. (2011): Antibacterial efficacy of raw and commercially available honey. African Journal of Biotechnology 10, 11269-11272. 130. Rašić, J.L. – Kurmann, J.A. (1978): Yoghurt. Scientific Grounds, Technology, Manufacture and Preparations. Technical Dairy Publishing House, Vanløse, Copenhagen, Denmark, 466 pp. 131. Ravula, R.R. – Shah, N.P. (1998): Selective enumeration of Lactobacillus casei from yogurts and fermented milk drinks. Biotechnology Techniques 12, 819-822.

142

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalomjegyzék 132. Reddy, G. – Altaf, M. – Naveena, B.J. – Venkateshwar, M. – Kumar, E.V. (2008): Amylolytic bacterial lactic acid fermentation: a review. Biotechnology Advances 26, 22-34. 133. Riazi, A. – Ziar, H. (2012): Effect of honey and starter culture on growth, acidification, sensory properties and bifidobacteria cell counts in fermented skimmed milk. African Journal of Microbiology Research 6, 486-498. 134. Rigó, J. (2009): A tejfogyasztás jelentősége gyermek- és időskorban. In: A Tej Szerepe a Humán Táplálkozásban. Szerk.: Kukovics, S. Melánia Kiadó, Budapest, pp. 339-348. 135. Robinson, R.K. (2003): Yoghurt: role of starter cultures. In: Encyclopedia of Dairy Sciences. Eds Roginski, H. ‒ Fuquay, J.W. ‒ Fox, P.F., Vol. 2., 1st Ed. Academic Press, London, UK, pp. 1059-1063. 136. Rockova, S. – Rada, V. – Marsik, P. – Vlkova, E. – Bunesova, V. – Sklenar, J. – Splichal, I. (2011): Growth of bifidobacteria and clostridia on human and cow milk saccharides. Anaerobe 17, 223-225. 137. Roderick, J.W. – Lise, K.B. – Lu, Y.R. (2000): Identification and quantitative level of antibacterial components of some New Zealand honeys. Food Chemistry 70, 427-435. 138. Roy, D. (2001): Media for the isolation and enumeration of bifidobacteria in dairy products. International Journal of Food Microbiology 69, 167182. 139. Saccaro, D.M. – Hirota, C.Y. – Tamime, A.Y. – De Oliveira, M.N. (2012): Evaluation of different selective media for enumeration of probiotic micro-organisms in combination with yogurt starter cultures in fermented milk. African Journal of Microbiology Research 6, 2239-2245. 140. Sanders, M.E. – Huis in’t Veld, J. (1999): Bringing a probiotic-containing functional food to the market: microbiological, product, regulatory and labelling issues. Antonie van Leeuwenhoek 76, 293-315. 141. Scardovi, V. (1986): Genus Bifidobacterium. In: Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Eds Sneath, P.H.A. ‒ Mair, N.S. ‒ Sharpe, M.E. ‒ Holt, J.G., Vol. 2. Williams and Wilkins, Baltimore, MD, pp. 14181434. 142. Schleifer, K.H. (1987): Recent changes in the taxonomy of lactic acid bacteria. FEMS Microbilogy Reviews 46, 201-203.

143

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalomjegyzék 143. Schmidt, D.G. – Koops, J. (1977): Properties of casein micelles. 2. Stability towards ethanol, dialysis, pressure and heat in relation to casein composition. Netherlands Milk and Dairy Journal 31, 342-357. 144. Senaka Ranadheera, C. – Evans, C.A. – Adams, M.C. – Baines, S.K. (2012): Probiotic viability and physico-chemical and sensory properties of plain and stirred fruit yoghurts made from goat’s milk. Food Chemistry 135, 1411-1418. 145. Serafini, F. – Bottacini, F. – Viappiani, A. – Baruffini, E. – Turroni, F. – Foroni, E. – Lodi, T. – Van Sinderen, D. – Ventura, M. (2011): Insights into physiological and genetic mupirocin susceptibility in bifidobacteria. Applied and Environmental Microbiology 77, 3141-3146. 146. Shah, N.P. (2000): Probiotic bacteria: selective enumeration and survival in dairy foods. Journal of Dairy Science 83, 894-907. 147. Shah, N.P. – Ravula, R.R. (2000): Microencapsulation of probiotic bacteria and their survival in frozen fermented dairy desserts. Australian Journal of Dairy Technology 55, 139-144. 148. Shamala, T.R. – Jyothi, Y.S. – Saibaba, P. (2000): Stimulatory effect of honey on multiplication of lactic acid bacteria under in vitro and in vivo conditions. Letters in Applied Microbiology 30, 453-455. 149. Sharma, R. (2014): Selective enumeration, isolation and identification of Streptococcus thermophilus from Indian traditional curd to produce starter culture along with elevation of nutrient media for its mass commercial production. PhD Thesis. Rani Durgavati University, Jabalpur, India, 227 pp. 150. Sherlock, O. – Dolan, A. – Athman, R. – Power, A. – Gethin, G. – Cowman, S. – Humphreys, H. (2010): Comparison of the antimicrobial activity of ulmo honey from Chile and manuka honey against methicillinresistant Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa. BMC Complementary and Alternative Medicine 10, 1-5. 151. Shin, H.S. – Ustunol, Z. (2005): Carbohydrate composition of honey from different floral sources and their influence on growth of selected intestinal bacteria: an in vitro comparison. Food Research International 38, 721-728. 152. Simpson, P.J. – Fitzgerald, G.F. – Stanton, C. – Ross, R.P. (2004): The evaluation of a mupirocin-based selective medium for the enumeration of

144

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalomjegyzék bifidobacteria from probiotic animal feed. Journal of Microbiological Methods 57, 9-16. 153. Singh, S. – Goswami, P. – Singh, R. – Heller, K.J. (2009): Application of molecular identification tools for Lactobacillus, with a focus on discrimination between closely related species: a review. LWT ‒ Food Science and Technology 42, 448-457. 154. Snydman, D.R. (2008): The safety of probiotics. Clinical Infectious Diseases 46, S104-S111. 155. Sohier, D. – Pavan, S. – Riou, A. – Combrisson, J. – Postollec, F. (2014): Evolution of microbiological analytical methods for dairy industry needs. Frontiers in Microbiology 5, 1-10. 156. Sohrabvandi, S. – Mortazavian, A.M. – Dolatkhahnejad, M.R. – Monfared, A.B. (2012): Suitability of MRS-bile agar for the selective enumeration of mixed probiotic bacteria in presence of mesophilic lactic acid cultures and yoghurt bacteria. Iranian Journal of Biotechnology 10, 16-21. 157. Stiles, M.E. – Holzapfel, W.H. (1997): Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy. International Journal of Food Microbiology 36, 1-29. 158. Süle, J. (2009): Méz hatása egy probiotikus savanyú tejtermék mikrobiótájának alakulására. Diplomamunka. Nyugat-magyarországi Egyetem, Mezőgazdaságés Élelmiszer-tudományi Kar, Mosonmagyaróvár, 31 pp. 159. Süle, J. – Varga, L. (2009): Méz hatása egy probiotikus savanyú tejtermék mikrobiótájának alakulására. Tejgazdaság 69, 17-22. 160. Szakály, S. (1996): A juhtejtermékek márkavédelme. Magyar Juhászat 5, 6-9.

fejlesztése,

eredet-

és

161. Szakály, S. (2001): Tejgazdaságtan. Dinasztia Kiadó, Budapest, 478 pp. 162. Szakály, S. (2004): A probiotikumokkal kapcsolatos alapismeretek. In: Probiotikumok és Humánegészség: Vissza a Természethez! Szerk.: Szakály, S. Magyar Tejgazdasági Kísérleti Intézet, Budapest, pp. 4-17. 163. Szakály, S. (2007): A bélflóra módosulásának főbb okai – A probiotikumok prevenciós és terápiás jótéteményei. Tejgazdaság 67, 2-6.

145

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalomjegyzék 164. Szakály, S. (2009): A pro- és prebiotikumok kérdése és jelentősége. In: A Tej Szerepe a Humán Táplálkozásban. Szerk. Kukovics, S. Melánia Kiadó Kft. Budapest, pp. 207-215. 165. Szakály, S. – Schäffer, B. – Krász, Á. (1998): A savanyított tejkészítmények szerepe az emberi egészség megóvásában. XXVII. Óvári Tudományos Napok: “Új Kihívások a Mezőgazdaság Számára az EUcsatlakozás Tükrében”. Pannon Agrártudományi Egyetem, Mezőgazdaság-tudományi Kar, Mosonmagyaróvár, pp. 874-882. 166. Tabasco, R. – Paarup, T. – Janer, C. – Peláez, C. – Requena, T. (2007): Selective enumeration and identification of mixed cultures of Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus, L. paracasei subsp. paracasei and Bifidobacterium lactis in fermented milk. International Dairy Journal 17, 1107-1114. 167. Talwalkar, A. – Kailasapathy, K. (2004). Comparison of selective and differential media for the accurate enumeration of strains of Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium spp. and Lactobacillus casei complex from commercial yoghurts. International Dairy Journal 14, 143-149. 168. Tamime, A.Y. – Marshall, V.M.E. – Robinson, R.K. (1995): Microbiological and technological aspects of milks fermented by bifidobacteria. Journal of Dairy Research 62, 151-187. 169. Teuber, M. – Geis, A. (2006): The genus Lactococcus. In: The Prokaryotes: A Handbook on the Biology of Bacteria. Bacteria: Firmicutes, Cyanobacteria. Eds Dworkin, M. ‒ Falkow, S. ‒ Rosenberg, E. ‒ Schleifer, K.H. ‒ Stackebrandt, E., Vol. 4., 3rd Ed. Springer, New York, NY, pp. 205-228. 170. Tharmaraj, N. – Shah, N.P. (2003): Selective enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, bifidobacteria, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, and propionibacteria. Journal of Dairy Science 86, 2288-2296. 171. Ustunol, Z. – Ghandi, H. (2001): Growth and viability of commmercial Bifidobacterium spp. in honey-sweetened skim milk. Journal of Food Protection 64, 1775-1779. 172. Vandamme, P. – Pot, B. – Gillis, M. – de Vos, P. – Kersters, K. – Swings, J. (1996): Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiological Reviews 60, 407-438.

146

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalomjegyzék 173. Varga, L. (1999): Effect of a cyanobacterial biomass enriched with trace elements on thermophilic dairy starter cultures. PhD Dissertation. Pannon Agricultural University, Mosonmagyaróvár, Hungary, 149 pp. 174. Varga, L. (2006): Effect of acacia (Robinia pseudo-acacia L.) honey on the characteristic microflora of yoghurt during refrigerated storage. International Journal of Food Microbiology 108, 272-275. 175. Varga, L. (2008): A tejsavbaktériumok. Habilitációs Előadás. Nyugatmagyarországi Egyetem, Mosonmagyaróvár, 2008. április 10. 176. Varga, L. – Szigeti, J. – Csengeri, É. (2003): Effect of oligofructose on the microflora of an ABT-type fermented milk during refrigerated storage. Milchwissenschaft 58, 55-58. 177. Varga, L. – Szigeti, J. – Gyenis, B. (2006): Influence of chicory inulin on the survival of microbiota of a probiotic fermented milk during refrigerated storage. Annals of Microbiology 56, 139-141. 178. Varga, L. – Szigeti, J. – Kovács, R. – Földes, T. – Buti, S. (2002): Influence of a Spirulina platensis biomass on the microflora of fermented ABT milks during storage. Journal of Dairy Science 85, 1031-1038. 179. de Vries, M. ‒ Vaughan, E. – Kleerebezem, M. – de Vos, V.M. (2006): Lactobacillus plantarum: survival, functional and potential probiotic properties in the human gastrointestinal tract. International Dairy Journal 16, 1018-1028. 180. Wernery, U. (2006): Camel milk, the white gold of the desert. Journal of Camel Practice and Research 13, 15-26. 181. Woese, C.R. (1987): Bacterial evolution. Microbiology Review 51, 221271. 182. Yagil, R. (1982): Camels and camel milk. FAO Animal Production and Health Paper, No. 26. FAO, Rome, Italy, 71 pp. 183. Zacarchenco, P.B. – Massaguer-Roig, S. (2004): Enumeration of Streptococcus thermophilus in the presence of Bifidobacterium longum and Lactobacillus acidophilus – Effect of incubation temperature and atmospheric conditions. Milchwissenschaft 59, 370-372. 184. Zacarchenco, P.B. – Massaguer-Roig, S. (2006): Properties of Streptococcus thermophilus fermented milk containing variable

147

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Irodalomjegyzék concentrations of Bifidobacterium longum and Lactobacillus acidophilus. Brazilian Journal of Microbiology 37, 338-344. 185. Zainol, M.I. – Yusoff, K.M. – Yusof, M.Y.M. (2013): Antibacterial activity of selected Malaysian honey. BMC Complementary and Alternative Medicine 13, 129. 186. Zalán, Zs. (2008): Tejsavbaktériumok szelektálása romlást okozó élesztők szaporodásának gátlására. Doktori (PhD) Értekezés. Budapesti Corvinus Egyetem, Budapest, 121 pp. 187. Zavisic, G. – Petricevic, S. – Radulovic, Z. – Begovic, J. – Golic, N. – Topisirovic, L. – Strahinic, I. (2012): Probiotic features of two oral Lactobacillus isolates. Brazilian Journal of Microbiology 43, 418-428. 188. URL1: http://www.oeti.hu/?m1id=7&m2id=78

189. URL2: https://hu.wikipedia.org/wiki/Ilja_Iljics_Mecsnyikov 190. URL3: http://www.magyar-mez.hu/mezfajtak.html 191. URL4: http://www.nnmeheszet.hu/erdei_mez.php 192. URL5: http://net.jogtar.hu/jr/gen/hjegy_doc.cgi?docid=99800004.EUM

148

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek MELLÉKLETEK 1. melléklet: A Lactobacillus (Lb.) nemzetség fajainak szénhidrátbontó képesség szerinti felosztása (Pot és mtsai, 1994; Hammes és Vogel, 1995; Vandamme és mtsai, 1996) 1. csoport:

2. csoport:

3. csoport:

Obligát

Obligát

Fakultatív

homofermentatív fajok

heterofermentatív

heterofermentatív

fajok

fajok

Lb. acidophilus

Lb. brevis

Lb. acetotolerans

Lb. amylophilus

Lb. buchneri

Lb. agilis

Lb. amylovorus

Lb. collinoides

Lb. alimentarius

Lb. aviarius subsp.

Lb. fermentum

Lb. bifermentans

Lb. fructivorans

Lb. casei

Lb. fructosus

Lb. coryniformis

araffinosus Lb. aviarius subsp. aviarius Lb. crispatus

subsp. coryniformis Lb. delbrueckii subsp.

Lb. hilgardii

bulgaricus Lb. delbrueckii subsp.

Lb. coryniformis subsp. torquens

Lb. kefir

Lb. curvatus

Lb. malefermentans

Lb. graminis

Lb. farciminis

Lb. ovis

Lb. hamsteri

Lb. gallinarum

Lb. panis

Lb. homohiochii

Lb. gasseri

Lb. parabuchneri

Lb. intestinalis

Lb. helveticus

Lb. parakefir

Lb. murinus

Lb. jensenii

Lb. pontis

Lb. paracasei subsp.

delbrueckii Lb. delbrueckii subsp. lactis

149

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek 1. csoport:

2. csoport:

3. csoport:

Obligát

Obligát

Fakultatív

homofermentatív fajok

heterofermentatív

heterofermentatív

fajok

fajok paracasei

Lb. johnsonii

Lb. reuteri

Lb. paracasei subsp. tolerans

Lb. kefiranofaciens

Lb. sanfrancisco

Lb. paraplantarum

Lb. kefirgranum

Lb. suebicus

Lb. pentosus

Lb. mali

Lb. vaccinostercus

Lb. plantarum

Lb. ruminis

Lb. vaginalis

Lb. rhamnosus

Lb. salivarius subsp.

Lb. sake

salicinus Lb. salivarius subsp. salivarius Lb. sharpeae

150

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek 2. melléklet: A probiotikus készítményekben leggyakrabban alkalmazott, egészségre gyakorolt jótékony hatással igazoltan rendelkező Lactobacillus törzsek (Keohane és mtsai, 2009) Kereskedelmi forgalomban lévő,

Faj megnevezése

igazoltan jótékony hatású törzs Lactobacillus acidophilus

La-1, La-5

Lactobacillus johnsonii

La-1, NCFM, DDS-1, SBT-2062

Lactobacillus (para)casei

F19, CRL 431, Immunitas, Shirota,

Lactobacillus rhamnosus

GG, LB21, 271, GR-1, VTT E-97800

Lactobacillus plantarum

299v, Lp01

Lactobacillus delbrueckii subsp.

Lb12

bulgaricus Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis

L1a

Lactobacillus cellobiosus Lactobacillus curvatus Lactobacillus fermentum

RC-14

Lactobacillus reuteri

MM2

Lactobacillus brevis Lactobacillus salivarius

UCC-118

Lactobacillus helveticus

B02

Lactobacillus amylovorus Lactobacillus crispatus Lactobacillus gallinarum Lactobacillus gasseri

LG21

151

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 3. melléklet: A Streptococcus thermophilus szelektív kimutatására alkalmas táptalajok Szelektív táptalaj

Alaptáptalaj

hőfok (°C)

idő (h)

körülmény

M17 agar

Szelektív komponens / tényező megnevezése β-glicerofoszfát

M17 agar

Tenyésztési

Kísérő mikroba

37

24

Aerob

M17‒laktóz agar

M17 agar

Laktóz

45

48-72

Aerob

M17‒laktóz agar

M17 agar

Laktóz

45

24

Aerob

ST agar (Streptococcus thermophilus agar)

ST agar

pH: 6,8 ± 0,1

37

24

Aerob

ST agar (Streptococcus thermophilus agar)

ST agar

pH: 6,8 ± 0,1

30

48

Aerob

152

Megjegyzés

Forrás

Ravula és Shah (1998)

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

Van de Casteele és mtsai (2006) Tabasco és mtsai (2007); García-Cayuela és mtsai (2009)

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. acidophilus, Lb. paracasei subsp. paracasei, Bifidobacterium lactis A táptalaj szelektivitását a pH-értéke adja

Dave és Shah (1996); Shah (2000); Tharmaraj és Shah (2003); Ashraf és Shah (2011) Zacarchenco és Massaguer-Roig (2006)

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Eredmények és értékelésük 4. melléklet: A Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus szelektív kimutatására alkalmas táptalajok Szelektív táptalaj

Alaptáptalaj

Szelektív komponens / tényező megnevezése pH: 5,3

RCA agar (pH: 5,3)

RCA agar (Reinforced Clostridial Agar)

MRS agar (pH: 5,2)

MRS agar (pH: 4,58)

hőfok (°C)

idő (h)

körülmény

37

72

Anaerob (10% CO2, 5% H2, 85% N2)

MRS agar

pH: 5,2

45

72

Anaerob

MRS agar

pH: 4,58

45

72

Anaerob

MRS leves + agar-agar

Fruktóz, Tween 80, savkazeinhidrolizátum, cisztein

45

72

Anaerob

MRS agar (pH: 5,4)

MRS agar

pH: 5,4

37

48

Aerob

MRS agar (pH: 5,2)

MRS agar

pH: 5,2

45

72

Anaerob

MRS‒fruktóz agar

Tenyésztési

Kísérő mikroba

153

Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Lb. paracasei subsp. paracasei, Bifidobacterium lactis Streptococcus thermophilus

Lactobacillus rhamnosus, Streptococcus thermophilus, Bifidobacterium lactis, Lactococcus lactis

Megjegyzés

Forrás

Nem szelektív tápközeg, mert a Lb. acidophilus, a Lb. rhamnosus és a bifidobaktériumok is szaporodnak rajta Ha Lb. rhamnosus és Lb. acidophilus nincs jelen a mintában

Dave és Shah (1996); Shah (2000); Van de Casteele és mtsai (2006) Shah (2000); Tharmaraj és Shah (2003); Van de Casteele és mtsai (2006); Ashraf és Shah (2011) Tharmaraj és Shah (2003)

Ha Lb. rhamnosus és Lb. acidophilus nincs jelen a mintában Az alap MRS agar nem tartalmaz glükózt és húskivonatot

Tabasco és mtsai (2007); GarcíaCayuela és mtsai (2009) Saccaro és mtsai (2012) Ashraf és Smith (2015)

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek 5. melléklet: A Lactobacillus acidophilus szelektív kimutatására alkalmas tápközegek Szelektív táptalaj

MRS‒szalicin agar vagy MRS‒szorbitol agar MRS‒maltóz agar

MRS agar BA‒szorbitol agar MRS‒trehalóz agar

Alaptáptalaj

MRS agar

Szelektív komponens / tényező megnevezése Szalicin vagy szorbitol

Tenyésztési hőfok (°C)

idő (h)

körülmény

37

72

Anaerob

MRS leves + agar-agar

Maltóz, Tween 80, cisztein

37

72

20% CO2

MRS agar

Inkubációs hőfok Szorbitol

43

72

Anaerob

37

72

Anaerob

Trehalóz

37

72

Anaerob

BA agar (Basal Agar) MRS agar

NA‒szalicin agar

Nutrient agar (tápagar)

Szalicin

37

48-72

Anaerob

MRS‒clindamycin agar

MRS agar

Clindamycin

37

48-72

Anaerob

154

Kísérő mikroba

Megjegyzés

Forrás

Streptococcus thermophilus, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Bifidobacterium spp. Streptococcus thermophilus, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. paracasei subsp. paracasei, Bifidobacterium lactis

Szelektív, ha Lb. casei nincs jelen a mintában

Dave és Shah (1996); Shah (2000) Shah (2000); Tabasco és mtsai (2007)

Kereskedelmi forgalomban lévő savanyú tejtermékeket vizsgáltak a szerzők

Tharmaraj és Shah (2003) Tharmaraj és Shah (2003) Gueimonde és mtsai (2004)

Van de Casteele és mtsai (2006) Van de Casteele és mtsai (2006)

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek 5. melléklet: A Lactobacillus acidophilus szelektív kimutatására alkalmas tápközegek (folyt.) Szelektív táptalaj

Alaptáptalaj

Szelektív komponens / tényező megnevezése Brómkrezolzöld, clindamycin

Tenyésztési hőfok (°C)

idő (h)

körülmény

37

48

Anaerob

37

72

Anaerob

37

72

Aerob

Kísérő mikroba

Megjegyzés

Forrás

Bifidobacterium spp., starter tejsavbaktériumok

Probiotikus Cheddar sajtból is lehetséges a Lb. acidophilus szelektív elkülönítése

Darukaradhya és mtsai (2006)

RCABC agar (Reinforced Clostridium agar brómkrezol-zölddel és clindamycinnel)

RCA agar (Reinforced Clostridium Agar)

MRS‒CC agar (clindamycinnel és ciprofloxacinnal kiegészített MRS agar) MRS‒epe agar

MRS agar

MRS agar

Clindamycin, ciprofloxacin , (pH: 6,2 ± 0,2) Epe

MRS‒epe agar

MRS agar

Epe

37 vagy 42

72

Aerob

LC agar Shah és Ravula (2000) szerint MRS agar

‒

42

72

Aerob / anaerob

Lb. casei Lc01 B. animalis Bb32

Clindamycin (pH: 6,2)

37

72

Anaerob

S. thermophilus, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. rhamnosus, B. animalis subsp. lactis

LC agar

MRS‒clindamycin agar

155

ISO és IDF (2006)

Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus

Mortazavian és mtsai (2007) Tisztatenyészet vizsgálatához javasolt Keverékkultúrákhoz javasolt

Lima és mtsai (2009)

Probiotikus savanyú tejtermékek vizsgálata

Saccaro és mtsai (2012)

Lima és mtsai (2009)

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek 5. melléklet: A Lactobacillus acidophilus szelektív kimutatására alkalmas tápközegek (folyt.) Szelektív táptalaj

MRS‒epe agar

Alaptáptalaj

MRS agar

Szelektív komponens / tényező megnevezése Epesavas sók

Tenyésztési

Kísérő mikroba

hőfok (°C)

idő (h)

körülmény

37

72

Anaerob

156

Megjegyzés

Forrás

Nem lehet sikeresen elkülöníteni a Lb. acidophilus-t MRS‒epe agaron

Ashraf és Smith (2015)

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek 6. melléklet: A Bifidobacterium spp. szelektív kimutatására alkalmas tápközegek Célmikroba

Szelektív táptalaj

Alaptáptalaj

Szelektív komponens / tényező Nalidixsav, neomicinszulfát, lítium-klorid, paramomycin -szulfát

Tenyésztési hőfok (°C)

idő (h)

körülmény

37

72

Anaerob

Bifidobacterium spp.

MRS‒NNLP agar

MRS agar

Bifidobacterium spp.

RCA‒anilinkék‒di cloxacillin agar

Anilinkék, dicloxacillin (pH: 7,1)

37

48

Anaerob

Bifidobacterium spp.

TOS‒MUP agar (transzgalaktozilált oligoszacharidokat tartalmazó agar + lítium‒ mupirocin) TOS‒MUP agar (transzgalaktozilált oligoszacharidokat tartalmazó agar + lítium‒ mupirocin)

RCA agar (Reinforced Clostridium Agar) TOS agar

Lítium‒ mupirocin

37

72

Anaerob

TOS agar

Lítium‒ mupirocin

37

72

Anaerob (80% N2, 10% CO2, 10% H2)

Bifidobacterium spp.

157

Kísérő mikroba

Lb. acidophilus

Megjegyzés

Lb. acidophilus -t gátolja

Forrás

Dave és Shah (1996); Shah (2000); Roy (2001); Tharmaraj és Shah (2003); Van de Casteele és mtsai (2006) Darukaradhya és mtsai (2006) ISO és IDF (2010)

Tisztatenyészetek használatáva l

A szelektivitás és a visszanyeré s jobb, mint BIM-25 agaron

Kołakowski és mtsai (2010); Ghoddusi és Hassan (2011)

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek 6. melléklet: A Bifidobacterium spp. szelektív kimutatására alkalmas tápközegek (folyt.) Célmikroba

Szelektív táptalaj

Alaptáptalaj

Bifidobacterium spp.

BIM-25 agar

RCA agar (Reinforced Clostridial Agar)

Bifidobacterium spp.

ABC agar

MRS leves + agar-agar

MRS‒raffinóz agar

MRS agar

MRS agar

MRS agar

B. lactis

B. animalis subsp. lactis

Szelektív komponens / tényező Nalidixsav, polimixin-Bszulfát, kanamicinszulfát, jódecetsav, 2,3,5 trifeniltetrazóliumklorid A: dicloxacillin, B: lítium‒klorid, C: L‒cisztein‒ HCl Raffinóz, lítium‒klorid, cisztein + inkubációs hőfok Inkubációs hőfok

Tenyésztési

Kísérő mikroba

hőfok (°C)

idő (h)

körülmény

37

120

Anaerob (80% N2, 10% CO2, 10% H2)

Tisztatenyészetek használatáva l

37

48

Anaerob

S. thermophilu s

45

72

Anaerob

Tisztatenyészetek használatáva l

45

72

Anaerob

Mezofil aromatermelő tejsavbaktérium fajok

158

Megjegyzés

Forrás

Ghoddusi és Hassan (2011)

Jobb a visszanyeré smint NNLP agaron

Miranda és mtsai (2011)

Tabasco és mtsai (2007)

A célmikroba lencse alakú, fényes, kék telepeket képez

Antunes és mtsai (2007)

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek 6. melléklet: A Bifidobacterium spp. szelektív kimutatására alkalmas tápközegek (folyt.) Célmikroba

Szelektív táptalaj

Alaptáptalaj

Szelektív komponens / tényező Raffinóz

Tenyésztési hőfok (°C)

idő (h)

körülmény

45

72

Anaerob

B. animalis subsp. lactis

MRS‒raffinóz agar

MRS agar

B. animalis subsp. lactis

MRS‒LP agar

MRS agar

Lítium‒klorid , nátrium‒ propionát,

37

72

Anaerob

B. animalis subsp. lactis

RCPB (Reinforced Clostridial Agar with Prussian Blue) Agar + májinfúzió

RCA agar + berlini kék

Májinfúzió (pH: 5,0)

37

72

Anaerob

B. animalis subsp. lactis BB12

MRS‒dicloxacillin agar

MRS agar

Dicloxacillin

37 vagy 42

72

Anaerob

B. animalis subsp. lactis BB12

ABC‒MRS agar

MRS agar

A: dicloxacillin, B: lítium‒klorid, C: cisztein

42

72

Anaerob

159

Kísérő mikroba

S. thermophilus Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus S. thermophilus Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus

Lb. acidophilus La05, Lb. casei Lc01

Megjegyz és

Szelektív, de nem differenci áló tápközeg A májinfúzi ó hatására nagyobb telepek képződtek Tisztatenyészet hez javasolhat ó Keverékkultúrákh oz javasolhat ó

Forrás

Tabasco és mtsai (2007); GarcíaCayuela és mtsai (2009) Fachin és mtsai (2008)

Fachin és mtsai (2008)

Lima és mtsai (2009)

Lima és mtsai (2009)

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek 6. melléklet: A Bifidobacterium spp. szelektív kimutatására alkalmas tápközegek (folyt.) Célmikroba

B. animalis subsp. lactis

Szelektív táptalaj

RCA‒anilinkék‒ dicloxacillin agar

Alaptáptalaj

RCA agar (Reinforced Clostridial Agar)

Szelektív komponens / tényező Anilinkék, dicloxacillin (pH: 7,1)

Tenyésztési hőfok (°C)

idő (h)

körülmény

37

72

Anaerob

160

Kísérő mikroba S. thermophilus Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. acidophilus, Lb. rhamnosus

Megjegyz és

Forrás

Saccaro és mtsai (2012)

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek 7. melléklet: A Lactobacillus casei szelektív elkülönítésére alkalmas táptalajok Szelektív táptalaj

Alaptáptalaj

Szelektív komponens

MRS‒vankomycin agar

MRS agar

MRS‒LP agar

MRS agar

MRS‒glükóz agar

LC agar (Lactobacillus casei agar) LC agar (Lactobacillus casei agar)

Tenyésztési hőfok (°C)

idő (h)

körülmény

Vankomycin

37

72

Anaerob

37 vagy 42

72

MRS agar

Lítium-klorid, nátrium‒propionát Glükóz

30

48

Aerob / anaerob Aerob

MRS agar

Ribóz

27

72

Anaerob

MRS agar

Ribóz

25

72

Anaerob

161

Megjegyzés

Forrás

Amennyiben Lb. rhamnosus nincs jelen a mintában

Tharmaraj és Shah (2003) Lima és mtsai (2009) GarcíaCayuela és mtsai (2009) Tharmaraj és Shah (2003) Ashraf és Smith (2015)

Nem alkalmas Lb. casei szelektív kimutatására (a Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, a Lb. reuteri és a S. thermophilus is képez telepeket)

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek 8. melléklet: A Lactococcus és Leuconostoc fajok szelektív kimutatására alkalmas tápközegek Célmikroba

Szelektív táptalaj

Alaptáptalaj

Szelektív komponens

Mezofil aromatermelő kultúra (Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis és Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris)

Módosított Nickels és Leesment agar

Nickels és Leesment agar

X-gal oldat hozzáadása 72 óra inkubációt követően

Starter Lactococcus spp.

M17 agar

M17 agar

Inkubációs hőfok

Tenyésztési hőfok (°C) 25

idő (h)

körülmény

72 + 24

Aerob

30

72

Aerob

162

Kísérő mikroba

Megjegyzés

Forrás

Bifidobacterium animalis subsp. lactis

Lc. diacetylactis: fehér telepek; Ln. cremoris: kék telepek; Lc. lactis és Lc. cremoris: zóna nélküli fehér telepek; szelektív elkülönítés nem lehetséges

Antunes és mtsai (2007)

Karimi és mtsai (2012)

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek 9. melléklet: A Microbank™ törzsfenntartó rendszer sematikus ábrája

163

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek 10. melléklet: A kísérletekben használt tápközegek Megjegyzés: az alábbiakban részletezem a vizsgálatok során alkalmazott tápközegek pontos összetételét. A tápközegek nagy részét 121°C-on, 15 percig sterileztem autoklávban. Abban az esetben, amikor ettől eltérő sterilezési paraméterek alkalmazására volt szükség, ott külön ismertetem. Hígítófolyadék a decimális hígítási sor elkészítéséhez: Bakteriológiai pepton hígítóvíz (0,1%) Összetevő

Mennyiség

Pepton (Oxoid)

1,00 g

Ioncserélt víz

1000 ml

Végső pH: 7,0 ± 0,2 (25°C-on) Kiszerelés: 9,30 ml-t adagolunk kémcsövekbe sterilezés előtt Dúsító táplevesek a vizsgálatba bevont törzsek felélesztéséhez: CASO-leves Összetevő

Mennyiség

Pankreásszal emésztett kazein

17,00 g

Szójapepton

3,00 g

Nátrium-klorid

5,00 g

Dikálium-hidrogénfoszfát

2,50 g

Glükóz

2,50 g

Sovány tejpor

1,00 g

Ioncserélt víz

1000 ml

Végső pH-értéke: 7,3 ± 0,2 (25°C-on)

164

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek De Man–Rogosa–Sharpe (MRS) tápleves Összetevő

Mennyiség

Pepton kazeinből

10,00 g

Húskivonat

9,00 g

Élesztőkivonat

4,00 g

D(+)-glükóz

20,00 g

Dikálium-hidrogénfoszfát

2,00 g

®

Tween 80

1,00 ml

Diammónium-hidrogéncitrát

2,00 g

Nátrium-acetát trihidrát

5,00 g

Magnézium-szulfát heptahidrát

0,20 g

Mangán-szulfát tetrahidrát

0,04 g

Ioncserélt víz

1000 ml

A szelektív kimutatáshoz alkalmazott táptalajok: CASO-agar Összetevő

Mennyiség

Pankreásszal emésztett kazein

15,00 g

Papainnal emésztett szójapepton

5,00 g

Sovány tejpor

1,00 g

Nátrium-klorid

5,00 g

Dikálium-hidrogénfoszfát

2,50 g

Glükóz

1,00 g

Élesztőkivonat

4,00 g

®

Tween 80

5,00 g

Agar-agar

15,00 g

Ioncserélt víz

1000 ml

Végleges pH-értéke: 7,3 ± 0,2 (25°C-on)

165

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek M17 agar (Terzaghi szerint) Összetevő

Mennyiség

Pepton szójalisztből

5,00 g

Pepton húsból

2,50 g

Pepton kazeinből

2,50 g

Élesztőkivonat

2,50 g

Húskivonat

5,00 g

Laktóz monohidrát

5,00 g

Aszkorbinsav

0,50 g

Nátrium-β-glicerofoszfát Magnézium-szulfát heptahidrát Agar-agar

19,00 g 0,25 g 12,75 g

Ioncserélt víz

1000 ml

Végleges pH-értéke: 6,8 ± 0,2 (25°C-on)

166

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek De Man–Rogosa–Sharpe (MRS) agar Összetevő

Mennyiség

Pepton kazeinből

10,00 g

Húskivonat

9,00 g

Élesztőkivonat

4,00 g

D(+)-glükóz

20,00 g

Dikálium-hidrogénfoszfát Tween®80

2,00 g 1,00 mL

Diammónium-hidrogéncitrát

2,00 g

Nátrium-acetát trihidrát

5,00 g

Magnézium-szulfát heptahidrát

0,20 g

Mangán-szulfát tetrahidrát

0,04 g

Agar-agar

14,00 g

Ioncserélt víz

1000 ml

Végleges pH-értéke: 5,4 ± 0,2 vagy 6,2 ± 0,2 (25°C-on)

167

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek Transzgalaktozilált Oligoszacharid‒Propionát (TOS) agar Összetevő

Mennyiség

Kazein pepton

10,00 g

Élesztőkivonat

1,00 g

Kálium-dihidrogénfoszfát

3,00 g

Dikálium-hidrogénfoszfát

4,80 g

Ammónium-szulfát

3,00 g

Magnézium-szulfát heptahidrát

0,20 g

L-cisztein-hidroklorid

0,50 g

Nátrium-propionát

15,00 g

Galakto-oligoszacharidok

10,00 g

Agar-agar

15,00 g

Ioncserélt víz

1000 ml

Végleges pH-értéke: 6,3 ± 0,2 (25°C-on)

ST (Streptococcus thermophilus) agar Összetevő

Mennyiség

Tripton

10,00 g

Szacharóz

10,00 g

Élesztőkivonat

5,00 g

Dikálium-hidrogénfoszfát

2,00 g

Brómkrezol- bíbor (0,5 %-os oldat)

6,00 ml

Agar-agar

12,00 g

Ioncserélt víz

1000 mL

Végleges pH-értéke: 6,8 ± 0,1 (25°C-on)

168

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek Tripton-szója-agar (TSA) Összetevő

Mennyiség

Tripton

17,00 g

Szója pepton

3,00 g

Glükóz

2,50 g

NaCl

5,00 g

Pufferek

2,50 g

Agar-agar

15,00 g

Ioncserélt víz

1000 ml

Végleges pH-értéke: 7,3 ± 0,2 (25°C-on) Burgonya-keményítő agar (PDA) Összetevő

Mennyiség

Burgonya infúzió

4,00 g

D(+)-glükóz

20,00 g

Agar-agar

15,00 g

Ioncserélt víz

1000 ml

Végleges pH-értéke: 5,6 ± 0,2 (25°C-on) Glükóz‒élesztőkivonat‒pepton (GYP) agar Összetevő

Mennyiség

D(+)- glükóz

10,00 g

Élesztőkivonat

10,00 g

Bactopepton

19,00 g

Agar-agar

16,00 g

Ioncserélt víz

1000 ml

Végleges pH-értéke: 7,0 ± 0,2 (25°C-on)

169

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek 11. melléklet: Hoskins-táblázat a milliliterenkénti legvalószínűbb élősejt-szám megállapításához (hígításonként 3-3 leoltás esetén) Kulcsszám

Alapérték

000

0

100

0,36

110

0,73

111

1,1

200

0,91

210

1,5

211

2,0

220

2,1

221

2,8

222

3,5

300

2,3

310

4,3

311

7,5

320

93

321

15

322

21

330

24

331

46

332

110

333

Tovább hígítani!

170

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek 12. melléklet: Az ABT-5 DVS kultúra mikrobiológiai minősége Paraméter

Eredmény

Élesztő- és penészgombák

< 10 cfu/g

Kóliform baktériumok

< 10 MPN/g

Staphylococcus aureus

< 10 cfu/g

Enterococcus spp.

< 100 cfu/g

Nem tejsavbaktérium fajok

< 500 cfu/g

Salmonella spp.

Negatív (25 g-ban)

Listeria spp.

Negatív (1 g-ban)

Forrás: Chr. Hansen Product Range (Dairy Cultures)

171

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek 13. melléklet: Érzékszervi bírálati lap Minta vizsgálati időpontja: Szabvány száma:

MSZ 12292-87

Minták megnevezése:

Probiotikus savanyú tejtermékek

Minőségi paraméter

Hagyományos (1-20

Szöveges MINTÁK AZONOSÍTÓ SZÁMA

pontos)

megjegy-

bírálati módszer Érzékszervi minőség

Adható pontszám

zés

ST-1

jellemzői Alak, szín, külső megjelenés

5

Állag

5

Illat

5

Íz

5

ÖSSZPONTSZÁM

20

Bírálatot végezte: ________________________________

172

ST-2

ST-3

ST-4

ST-5

ST-6

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek 14. melléklet: MSZ 12292-87 ‒ Általános utasítás az új (egységes) bírálati rendszerhez Pontszám 5

Jellemzők A termék a tulajdonságcsoportra vonatkozóan kifejezetten pozitív tulajdonságokkal rendelkezik, az összbenyomás teljesen harmonikus. Felismerhető hibák és hiányosságok egyáltalán nem fordulnak elő.

4

A termék a tulajdonságcsoportra vonatkozóan már felismerhető hiba, hiányosság mellett még az átlagosnál jobb élvezeti értékű.

3

A termék a tulajdonságcsoportra vonatkozóan csökkent intenzitású pozitív tulajdonságokkal és jól felismerhető hibákkal, hiányosságokkal rendelkezik, de élvezeti értéke eléri az átlagos minőségi szintet.

2

A termék a tulajdonságcsoportra vonatkozóan olyan hibákat és hiányosságokat tartalmaz, amelyek miatt nem éri el az átlagos minőségi szintet. A termék csökkent élvezeti értékű.

1

A termék a tulajdonságcsoportra vonatkozóan jelentős hiányosságokat tartalmaz, amelyek miatt nem használható fel az eredeti célra. A termék azonban még nem romlott, megfelelő átdolgozással, bekeveréssel, stb. élelmiszergyártásra alapanyagként használható.

0

A termék a tulajdonságcsoportra vonatkozóan olyan, a romlottságot

egyértelműen

jelző

hibákat

tartalmaz,

amelyek miatt emberi fogyasztásra semmilyen formában nem alkalmas.

173

DOI: 10.15477/SZE.WAMDI.2016.002

Mellékletek 15. melléklet: Kramer-táblázat

174