DETEKSI MUTASI DAERAH RRDR GEN rpoB PADA ISOLAT DNA SPUTUM PASIEN MULTIDRUG RESISTANT Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) DENGAN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION-RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (PCR-RFLP) Skripsi
MADE RAI DWITYA WIRADIPUTRA 1208505055
JURUSAN FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA 2016
DETEKSI MUTASI DAERAH RRDR GEN rpoB PADA ISOLAT DNA SPUTUM PASIEN MULTIDRUG RESISTANT Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) DENGAN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION-RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (PCR-RFLP) Skripsi
MADE RAI DWITYA WIRADIPUTRA 1208505055
JURUSAN FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS UDAYANA 2016
i
ii
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Tuhan Yang Maha Esa, Ida Sang Hyang Widhi Wasa, karena berkat rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “DETEKSI MUTASI DAERAH RRDR GEN rpoB PADA ISOLAT DNA SPUTUM PASIEN MULTIDRUG RESISTANT Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) DENGAN METODE POLYMERASE CHAIN
REACTION-RESTRICTION
FRAGMENT
LENGTH
POLYMORPHISM (PCR-RFLP)” tepat pada waktunya. Skripsi ini diajukan sebagai syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana. Penyusunan skripsi ini tentunya tidak terlepas dari dukungan, bantuan, serta bimbingan dari berbagai pihak, baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu, penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih kepada: 1. Drs. Ida Bagus Made Suaskara, M. Si., selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana. 2. Dr. rer. nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, M.Si., Apt., selaku Ketua Jurusan Farmasi Fakultas MIPA Universitas Udayana. 3. Dr. Sagung Chandra Yowani, S.Si., Apt., M.Si., selaku dosen pembimbing I yang telah membantu dalam membimbing serta tak hentinya memberikan semangat dan dukungan hingga akhir penyusunan tugas akhir I ini. 4. Dr. I Nengah Wirajana, S.Si., M.Si., selaku dosen pembimbing II yang juga telah banyak membimbing demi kelancaran penyusunan tugas akhir I ini. 5. Seluruh teknisi di Laboratorium Biologi Molekular FK UNUD, khususnya Mbok Nanik, Mok Echi, dan Bu Komang yang telah banyak memberi bantuan dan dukungan. 6. Bagian/SMF Mikrobiologi Klinik FK UNUD/RSUP Sanglah yang telah membantu dalam pengadaan sampel pada penelitian ini. 7. Seluruh dosen beserta staf/pegawai di Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana yang telah banyak
iii
memberikan ilmu serta dukungan sejak awal penulis mengenyam pendidikan di jurusan ini. 8. Kedua orangtua penulis, I Gede Putu Wirajaya dan Ni Luh Made Adi Gunasih, yang tak pernah henti memberi dukungan, doa, dan semangat. 9. Keluarga besar penulis yang selalu memberi dukungan serta motivasi bagi penulis. 10. Tim Tugas Akhir TB Ratih, Linda, Dektri, Widya, dan Ebi yang telah menjadi teman diskusi dan berbagi suka duka selama pembuatan Tugas Akhir. 11. Teman-teman mahasiswa Jurusan Farmasi Fakultas MIPA Universitas Udayana, khususnya Dioscuri Hygeia yang telah berjuang bersama penulis. 12. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu. Penulis sepenuhnya menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Untuk itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun dari berbagai pihak demi karya yang lebih baik di masa yang akan datang. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.
Bukit Jimbaran, Juni 2016
Penulis
iv
DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN SAMPUL ..............................................................................
i
LEMBAR PENGESAHAN .......................................................................
ii
KATA PENGANTAR ...............................................................................
iii
DAFTAR ISI..............................................................................................
v
DAFTAR SINGKATAN ...........................................................................
viii
DAFTAR ISTILAH ...................................................................................
x
DAFTAR TABEL......................................................................................
xiii
DAFTAR GAMBAR .................................................................................
xiv
DAFTAR LAMPIRAN..............................................................................
xv
ABSTRAK ................................................................................................
xvi
BAB I
PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang ......................................................................
1
1.2 Rumusan Masalah .................................................................
5
1.3 Tujuan Penelitian ..................................................................
6
1.4 Manfaat Penelitian ................................................................
6
1.4.1 Manfaat Keilmuan........................................................
6
1.4.2 Manfaat Praktis ............................................................
6
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Mycobacterium tuberculosis .................................................
7
2.2 Multidrug Resistant Tuberculosis (MDR-TB) .....................
7
v
2.3 Resistensi RIF .......................................................................
9
2.4 Mutasi Gen ............................................................................
11
2.4.1 Point mutation..............................................................
12
2.4.2 Frameshift mutation .....................................................
14
2.5 Enzim Restriksi .....................................................................
15
2.6 Pemilihan Enzim Restriksi ...................................................
19
2.7 PCR ......................................................................................
20
2.8 PCR-RFLP ............................................................................
23
2.9 Elektroforesis ........................................................................
26
BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Rancangan Penelitian ............................................................
29
3.2 Waktu dan Lokasi Penelitian ................................................
30
3.3 Bahan Penelitian....................................................................
30
3.4 Alat Penelitian.......................................................................
31
3.5 Prosedur Penelitian................................................................
31
3.5.1 Pemilihan Enzim Restriksi...........................................
31
3.5.2 Isolasi DNA dari Spesimen Sputum Pasien .................
32
3.5.3 Amplifikasi Gen rpoB MDR-TB dengan PCR ............
33
3.5.4 Deteksi Produk PCR ....................................................
33
3.5.5 Digesti Produk PCR dengan Enzim Restriksi PvuII ....
34
3.5.6 Deteksi Hasil Digesti Produk PCR ..............................
34
3.5.7 Interpretasi Hasil ..........................................................
35
vi
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Pemilihan Enzim Restriksi secara In Silico ..........................
36
4.2 Isolasi DNA M. tuberculosis.................................................
42
4.3 Amplifikasi Fragmen 990-1496 pb Gen rpoB M. tuberculosis dengan Teknik PCR dan Deteksi Produk PCR dengan Elektroforesis Gel Agarosa ...............................................................
45
4.4 Optimasi Digesti Produk PCR dengan Enzim PvuII ............
50
4.5 Digesti Produk PCR rpoB dengan Enzim Restriksi PvuII ....
55
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan ...........................................................................
61
5.2 Saran......................................................................................
61
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................
63
LAMPIRAN...............................................................................................
71
vii
DAFTAR SINGKATAN
A
: Adenine
ACP
: acyl carrier protein
BSA
: bovine serum albumin
BSC
: biological safety cabinet
BTA
: Basil tahan asam
C
: Cytosine
DNA
: Deoxyribose nucleic acid
DST
: Drug susceptibility testing
dATP
: deoksiadenosin trifosfat
dCTP
: deoksisitidin trifosfat
dGTP
: deoksiguanosin trifosfat
dNTPs
: Deoxynucleotide triphospates
dTTP
: deoksitimidin trifosfat
dsDNA
: Double stranded deoxyribose nucleic acid
EDTA
: Ethylene diamine tetraacetic acid
FI
: Fidelity index
G
: Guanine
INH
: Isoniazid
kpb
: kilo pasang basa
LJ
: Lowenstein-Jensen
MDGs
: Millenium Development Goals
viii
MDR-TB
: Multidrug Resistant-Tuberculosis
MIC
: Minimum inhibitory concentration
mRNA
: Messenger ribonucleic acid
Mtb
: Mycobacterium tuberculosis
OAT
: Obat antituberkulosis
Pb
: pasang basa
PCR
: Polymerase Chain Reaction
PCR-SSCP
: Polymerase
Chain
Reaction
–
Single-Stranded
Conformational Polymorphism PCR-RFLP
: Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment Length Polymorphism
RIF
: Rifampisin
RNA
: Ribonucleic acid
RRDR
: Rifampicin Resistant Determinant Regio
RT-PCR
: Real Time-Polymerase Chain Reaction
ssDNA
: Single stranded deoxyribose nucleic acid
T
: Thymine
TB
: Tuberkulosis
TBE
: Tris-Boric Acid-EDTA
WHO
: World Health Organization
ix
DAFTAR ISTILAH
Amplifikasi DNA
: perbanyakan DNA
Amplikon
: produk amplifikasi DNA
Building block
: unit monomer penyusun komponen
Comb
: alat menyerupai sisir yang digunakan untuk membentuk kolom (well) pada gel agarosa
Chamber
: wadah untuk meletakkan gel agarosa
DNA polimerase
: enzim yang diperlukan dalam proses sintesis DNA
DNA templat
: DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan
DNA ladder
: DNA dengan ukuran yang diketahui dan digunakan sebagai
pembanding
ukuran
DNA
lain
dalam
elektroforesis Gen
: urutan DNA yang menyandi suatu protein
GenBank
: database utama dalam biologi molekuler yang dikelola oleh NCBI
Genom
: keseluruhan materi genetik (DNA/RNA) pada makhluk hidup
In vitro
: percobaan dilakukan menyerupai sistem in vivo agar dapat memberikan hasil yang sama dengan proses in vivo
In silico
: dilakukan pada komputer
x
Kodon
: deret nukleotida pada mRNA yang terdiri atas kombinasi tiga nukleotida berurutan yang menyandi suatu asam amino tertentu
Mutasi
: terjadinya perubahan basa dari urutan nukleotida yang lazim dari suatu sekuen DNA organisme yang dapat menyebabkan perubahan sifat fenotip
Nukleotida
: unit monomer pembentuk DNA
Open reading frame : segmen dari urutan nukleotida yang diawali dengan start kodon dan diakhiri dengan stop kodon dan memiliki panjang yang cukup untuk mengkode protein PCR
: teknik perbanyakan urutan DNA dengan menggunakan reaksi enzimatis
Primer
: oligonukleotida
pendek
yang
mempunyai
urutan
nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat Resistensi
: kemampuan bakteri untuk bertahan terhadap adanya obat yang dengan konsentrasi normal dapat membunuh atau menghambat pertumbuhannya
Sekuen
: urutan DNA
Sekuensing
: proses penentuan urutan basa nukleotida pada suatu molekul DNA
Transkripsi
: proses sintesis RNA dengan menggunakan DNA sebagai templat
xi
Tray
: alat yang digunakan sebagai cetakan gel agarosa
Wildtype
: organisme yang memunculkan karakter dalam populasi aslinya
xii
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel 2.1 Mutasi gen yang berperan terhadap resistensi OAT..................
9
Tabel 2.2 Frekuensi mutasi pada kodon di daerah RRDR ........................
10
Tabel 2.3 Perbedaan tipe enzim restriksi ...................................................
17
Tabel 2.4 Rentang pemisahan pada gel agarosa ........................................
28
Tabel 4.1 Enzim restriksi dengan situs restriksi pada titik mutasi daerah RRDR ........................................................................................
xiii
37
DAFTAR GAMBAR
Halaman Gambar 2.1 Contoh missense mutation ....................................................
13
Gambar 2.2 Contoh nonsense mutation ....................................................
13
Gambar 2.3. Contoh frameshift mutation akibat delesi dan insersi ...........
14
Gambar 2.4 Mekanisme pemotongan DNA oleh enzim restriksi .............
16
Gambar 2.5 Pemotongan enzim restriksi tipe II pada untai DNA ............
18
Gambar 2.6 Tiga tahapan utama PCR.......................................................
22
Gambar 2.7 Mutasi gen yang menyebabkan inaktivasi situs pengenalan enzim restriksi........................................................................
25
Gambar 2.8 Contoh elektroforegram hasil pemotongan produk PCR dengan enzim restriksi spesifik (Fratamico et al., 2005).......
25
Gambar 3.1 Skema rancangan penelitian..................................................
29
Gambar 4.1 Peta restriksi enzim PvuII pada fragmen rpoB 990-1496pb..
40
Gambar 4.2 Elektroforegram produk PCR hasil optimasi suhu annealing primer.....................................................................................
46
Gambar 4.3 Elektroforegram produk PCR fragmen 990-1496pb DNA Mtb Isolat H37Rv, 134, DNA sputum...................................
48
Gambar 4.4 Elektroforegram produk PCR fragmen 990-1496pb DNA Mtb Isolat P10, P11, P16 .......................................................
48
Gambar 4.5 Elektroforegram hasil optimasi digesti produk PCR ...........
54
Gambar 4.6 Elektroforegram produk digesti isolat M. tuberculosis........
56
Gambar 4.7 Elektroforegram hasil optimasi formula digesti isolat P11..
58
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman Lampiran 1. Pembuatan Larutan ................................................................
71
Lampiran 2. Skema Kerja Isolasi DNA M. tuberculosis H37Rv...............
71
Lampiran 3. Sekuen Nukleotida Gen rpoB M. tuberculosis H37Rv..........
73
Lampiran 4. Daftar enzim restriksi yang memotong pada fragmen 990 -1496pb gen rpoB Mtb H37Rv (GenBank U12205.1) ..........
75
Lampiran 5. Daftar ukuran fragmen restriksi dari hasil pemotongan enzim restriksi pada fragmen 990-1496pb gen rpoB Mtb H37Rv ..................................................................................
77
Lampiran 6. Formula amplifikasi fragmen 990-1496 pb gen rpoB M. tuberculosis dan formula optimasi digesti produk PCR .......
79
Lampiran 7. Surat keterangan kelaikan etik .............................................
80
xv
ABSTRAK Resistensi terhadap rifampisin diketahui sebagai surrogate marker kejadian MDR-TB. Sebagian besar isolat M. tuberculosis yang resisten terhadap rifampisin mengalami mutasi di daerah sepanjang 81 pb pada gen rpoB atau disebut dengan Rifampin Resistance Determining Region (RRDR). Berbagai metode molekuler telah dikembangkan untuk deteksi MDR-TB secara cepat berdasarkan kejadian mutasi pada daerah RRDR. Penelitian ini merupakan penelitian eksploratif laboratoris yang bertujuan untuk mendeteksi mutasi daerah RRDR dari isolat DNA sputum pasien MDR-TB dengan metode PCR-RFLP menggunakan enzim restriksi yang sesuai. Sampel penelitian diperoleh dari koleksi kultur isolat Bagian Mikrobiologi Klnik RSUP Sanglah. Tahapan penelitian yang dilakukan meliputi pemilihan enzim restriksi, isolasi DNA M. tuberculosis H37Rv, amplifikasi fragmen 990-1496 gen rpoB M. tuberculosis, deteksi produk PCR, digesti produk PCR dengan enzim restriksi PvuII, dan deteksi hasil digesti produk PCR. Amplifikasi fragmen 990-1496 pb gen rpoB M. tuberculosis dilakukan terhadap DNA isolat H37Rv, 134, P10, P11, P16, DNA sputum pasien A dan B. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa enzim PvuII dapat mendeteksi mutasi pada kodon 510 dan 511 daerah RRDR M. tuberculosis dengan teknik PCR-RFLP. Beradasarkan elektroforegram hasil digesti, mutasi pada kodon 510 ditemukan pada isolat 134, sedangkan pada isolat P10, P11, dan P16 tidak ditemukan adanya mutasi pada kodon 510 maupun 511. Namun, primer pada penelitian ini belum mampu mengamplifikasi fragmen 990-1496 pb gen rpoB M. tuberculosis secara spesifik dari isolat DNA sputum pasien MDR-TB. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa PCR-RFLP dengan enzim PvuII terbukti dapat digunakan untuk deteksi mutasi kodon 510 dan 511 daerah RRDR M. tuberculosis. Mutasi pada kodon 510 hanya ditemukan pada isolat 134. Kata kunci : MDR-TB, RRDR, mutasi, PCR-RFLP; DNA sputum
xvi
ABSTRACT Resistance to rifampicin is known as surrogate marker of MDR-TB. Most of rifampicin resistant M. tuberculosis isolates have mutations in 81 bp of rpoB gene called Rifampin Resistance Determining Region (RRDR). Various molecular techniques have been developed for rapid detection of MDR-TB based on evidence of mutations in RRDR. The aim of this laboratory explorative experiment is to detect mutation in the region of RRDR from DNA isolate of MDR-TB respiratory specimens using PCR-RFLP method with proper restriction enzyme. The samples were obtained from isolate culture collection in Clinical Microbiology Department of Sanglah Hospital. Several steps were conducted, which are: selection of restriction enzyme, DNA isolation of M. tuberculosis H37Rv isolate, amplification of fragment 990-1496 bp of M. tuberculosis rpoB gene, detection of PCR products, digestion of PCR products using a selected restriction enzyme (PvuII), and detection of restriction fragment as a result of PCR product digestion. In the amplification process, DNA isolates of M. tuberculosis H37Rv, P10, P11, P16, 134, DNA isolate of MDR-TB patient’s sputum A and B were used as DNA template. The result of this experiment showed that PvuII enzyme could detect mutation of codon 510 and 511 in the region of RRDR using PCR-RFLP. Mutation at codon 510 has been detected in isolate 134 while there were no mutation of codon 510 and 511 detected in P10, P11, and P16 isolates. However, the primer used in this experiment was unable to amplify fragment 990-1496 bp of M. tuberculosis rpoB gene specifically from DNA isolate of MDR-TB patient’s sputum. In conclusion, this experiment has proved the ability of PCR-RFLP with PvuII enzyme to detect mutation in codon 510 and 511 of RRDR M. tuberculosis. Mutation at codon 510 was only found in isolate 134. Keywords : MDR-TB, RRDR, mutation, PCR-RFLP; DNA of sputum
xvii
