Jurnal Natur Indonesia 12(1), Oktober 2009: 21-27 ISSNSenyawa 1410-9379,Aktif Keputusan Akreditasi No 65a/DIKTI/Kep./2008 Anti Bakteri Escherichia coli ATCC 35218 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923
21
Senyawa Antibakteri Escherichia coli ATCC 35218 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923 dari Kapang Endofit Taman Nasional Gunung Halimun Ruth Melliawati*) dan Harni Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI, Jl. Raya Bogor KM. 46 Cibinong Diterima 13-03-2009
Disetujui 03-08-2009
ABSTRACT Endophytic fungus is a microorganism which live in the interstitial spaces healthy tissues of the host plant, and has capability to produce secondary metabolite such as micotoxin, antibiotic and antiviral. This research was aimed to find out the isolates of endophytic fungus produce antibacterial compounds to inhibit Escerichia coli ATCC 35218 and Staphylococcus aureus ATCC 25923, and to investigate the Retention time (Rt) of the antibacterial compounds produced by endophytic fungus with High Performance Liquid Chromatography (HPLC) methods. Diffusion Agar Plate Method was used to examine the antibacterial compounds on Escerichia coli ATCC 35218 and Staphylococcus aureus ATCC 25923. While the antibacterial compounds were examined with Thin Layer Chromatography (TLC) and High Performance Liquid Chromatography (HPLC) methods, and the result were compared with Chloramphenicol and Ampicillin antibiotic standart. Two isolates of endophytic fungus namely Hl.46F.211 and HL.57F.258 were inhibited the growth Escherichia coli ATCC 35218 and three isolates namely HL.48F217, HL.53F.243 and HL.57F.258 showed antagonistic action against Staphylococcus aureus ATCC 25923. The results of TLC and HPLC analysing method show that antibacterial compounds produced by endophytic fungus HL.46F.211 had Rt (Retention Time) rate similar with antibiotic Chloramphenicol at 2,796 (at water fraction) and Rt antibiotic Amphycillin at 2,662 (at Chloroform fraction). While antibacterial compounds produced by endophytic fungus HL.57F.258 had Rt rate similar with antibiotic Amphycillin at 2,650 (at Chloroform fraction). Keywords: Endophytic fungus, Gunung Halimun National Park, selection, antibacterial, HPLC.
antibiotik antara lain Escherichia coli dan Klebsiella
PENDAHULUAN Alam tropis Indonesia menyimpan kekayaan alam
pneumonia. Tingkat kekebalan kedua bakteri ini
yang begitu beraneka ragam, baik flora, maupun
meningkat 2-3 kali lipat sejak tahun 1997. Sedang
faunanya. Keanekaragaman mikrobiologisnya pun
Escherichia coli kekebalannya meningkat dari 19%
sangat melimpah (Handayani, 2004). Berbagai jenis
menjadi 32% terhadap antibiotik pada tahun 1997. Di
mikroorganisme terutama mikroorganisme endofitnya
Indonesia diketahui ada sekitar 23 jenis bakteri
berpotensi, tetapi belum banyak dimanfaatkan untuk
Escherichia coli dan 33 Klebsiella pneumonia yang
kesejahteraan masyarakat (Kahono & Amir, 2002). Sementara itu, dengan berkembangnya ilmu dan teknologi, m aka semakin berkembang pula
kebal terhadap antibiotik. Sementara itu menurut Tjay
pengetahuan tentang penyakit dan pengendaliannya.
terhadap penisillin. Sanglard (2001) dan Bonjar et al.,
Sampai saat ini penyakit infeksi pada manusia yang
(2004) menyampaikan bahwa jumlah dan jenis infeksi
disebabkan oleh mikroorganisme patogen, merupakan
terhadap manusia semakin luas, zat antimikroba
permasalahan kesehatan yang cukup serius dan
semakin berspektrum sempit sehingga hanya efektif
pengobatan dilakukan dengan pemberian antibiotik.
untuk jenis patogen tertentu saja dan ada
Hasil penelitian Neneng, (2000), melaporkan bahwa
kecenderungan resistensi mikroba hanya terhadap zat
pemakaian
antimikroba tertentu saja.
antibiotik
dapat
m enyebabkan
(2002) sejak akhir tahun 1980-an muncul berbagai kuman dari kelompok Staphylococcus yang resisten
mikroorganisme patogen menjadi resisten. Selain
Salah satu mikroorganisme penghasil antibiotik
resisten juga mengalami mutasi (Brooks et al., 2001).
yang mulai banyak diteliti sekarang ini adalah kapang
Bakteri yang meningkat kekebalannya terhadap
endofit yang terdapat di dalam sistem jaringan tumbuhan, seperti daun, batang, bunga, ranting atau
*Telp: +6285691083634 Email:
[email protected]
pun akar tumbuhan (Clay, 1988). Kapang endofit ini menginfeksi tumbuhan sehat pada jaringan tertentu
22
Jurnal Natur Indonesia 12(1): 21-27
Melliawati, et al.
tanpa menimbulkan gejala yang tampak sebagai
Fermentasi.Kapang endofit yang terseleksi positif
penyakit (Bills, 1996; Tan & Zau, 2001; Faeth, 2002),
menghasilkan zona hambat, dilarutkan dengan 5 ml
dan mampu manghasilkan senyawa metabolit sekunder
aquades steril. Tiga persen cairan spora/misellium
seperti mikotoksin, enzim dan antibiotik (Carrol, 1988;
kapang endofit tersebut diinokulasikan ke dalam 300
Clay, 1988). Banyak kelompok kapang endofit mampu
ml Potato Dextrose Broth dan diinkubasi selama 5 hari
memproduksi senyawa antibiotik yang aktif melawan
dalam inkubator shaker dengan kecepatan 150 rpm
bakteri maupun fungi patogenik terhadap manusia,
pada suhu kamar 28-30 0C (Castillo et al., 2002;
hewan dan tumbuhan, terutama dari genus Coniothirum
Simanjutak et al., 2002).
dan Microsphaeropsis (Petrini et al., 1992).
Analisis. Analisis dilakukan menggunakan
Untuk mengatasi permasalahan tersebut, maka
Kromatografi Lapis Tipis (Stahl, 1969), spot yang
perlu dicari senyawa aktif baru yang mampu membasmi
terditeksi ditentukan nilai Rf nya dgn rumus dalam
bakteri patogen. Oleh karena itu dalam penelitian ini
Khopkar (1990). Analisis selanjutnya menggunakan
dilakukan seleksi terhadap 29 isolat kapang endofit
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) menurut Gritter
yang berasal dari Taman Nasional Gunung Halimun,
et al., (1990) dan sebagai eluen disiapkan Kloroform :
sebagai sumber pencarian senyawa aktif baru, dengan
Methanol (2 : 4) dan (4 : 2), larutan standar yang
tujuan untuk mendapatkan senyawa aktif antibakteri
digunakan antibiotik Kloramfenikol dan Ampisillin.
Escherichia coli ATCC 35218 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923 (kedua bakteri ini sangat erat hubungannya dengan bagian dalam tubuh manusia).
HASIL DAN PEMBAHASAN Seleksi kapang endofit terhadap mikroba patogen. Dua puluh sembilan (29) isolat kapang endofit
BAHAN DAN METODE
yang berasal dari 9 jenis tumbuhan yang berhasiat obat
Mikroorganisme. Kapang endofit yang digunakan
diseleksi. Hasil seleksi diperoleh, 2 isolat kapang
sebanyak 29 isolat yang berasal dari 9 sampel tumbuhan
endofit positif menghambat pertumbuhan Escherichia
berkhasiat obat di Taman Nasional Gunung Halimun
coli ATCC 35218 dan 3 isolat terhadap Staphylococcus
(TNGH) Jawa Barat. Isolat tersebut merupakan koleksi
aureus ATCC 25923.(Tabel 1).
Puslit Bioteknologi LIPI Cibinong. Mikroorganisme uji
Menurut Holler (1999) bila suatu senyawa dapat
yang digunakan adalah Escherichia coli ATCC 35218
membentuk zona hambat 3,14 mm2, maka senyawa
dan Staphylococcus aureus ATCC 25923. Kedua bakteri
tersebut
ini merupakan kelompok bakteri enteropatogenik yang
mikroorganisme uji. Kapang endofit HL.46F.211 dan
telah resisten terhadap antibiotik penisillin (Salle, 1961).
HL.57F.258 positif menghambat pertumbuhan bakteri
diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas
Escherichia coli ATCC 35218. Sementara kapang
Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta.
endofit HL.48F.217, Hl.53F.243 dan HL.57F.258 positif
positif
menghambat
pertumbuhan
Seleksi kapang potensial. Seleksi kapang endofit
menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus
penghasil senyawa antibakteri dilakukan dengan
ATCC 25923. Daya hambat isolat kapang HL46F.211
metode difusi agar padat (Diffusion Agar Plate Method).
terhadap E. coli ATCC 35218 diperlihatkan pada Gambar
Bakteri uji sebanyak 1 mL diinokulasikan ke dalam
1 A dan. Hl.53F.243 terhadap S. aureus ATCC 25923
cawan Petri dan tambahkan medium Nutrient agar cair
pada Gambar 1 B. Isolat kapang HL.57F.258 mampu
yang tidak terlalu panas sebanyak 15 ml kemudian
menghambat kedua bakteri uji, sehingga kapang
dihomogenkan dengan cara digoyang dan dibiarkan
tersebut dikatagorikan mempunyai spectrum luas
sampai dingin. Setelah medium padat, potongan
karena dapat menghambat dua bakteri uji sekaligus,
kapang endofit (berdiameter 6 mm) yang akan diseleksi
sementara itu isolat yang lain hanya dapat menghambat
ditempelkan diatas permukaan medium, selanjutnya
satu bakteri uji saja dan dikelompokan ke dalam
diinkubasikan selama 2-3 hari pada suhu kamar (28-
kelompok antibiotik berspektrum sempit (Tjay. 2002).
30 0C). Pengamatan dilakukan dengan mengukur
Menurut Brook et al., (2001) bakteri Escherichia
diameter zona hambat di sekitar kapang endofit (Desriani
coli ATCC 35218 dan Staphylococcus aureus ATCC
et al., 2004; Strobel et al., 2001). Luas zona hambat
25923 sudah resisten terhadap antibiotik terutama
dihitung dengan rumus dalam Sukara et al., (1992).
kelompok antibiotik -laktam. Resistensi kedua bakteri
Senyawa Aktif Anti Bakteri Escherichia coli ATCC 35218 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923
a
a
b
b
A
23
B
Gambar 1. Zona hambat kapang endofit HL.46F.211 terhadap Escherichia coli ATCC 35218 (A) dan HL.57F.243 terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923 (B) a. Zona jernih b. Kapang endofit Tabel 1. Hasil uji kapang endofit terhadap Escherichia coli ATCC 35218 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923 (dari 29 isolat) Zona Hambat terhadap No Kode Isolat E. coli ATCC S. aureus ATCC Isolat 35218 25923 17. HL.46F.211 +++ 20. HL.48F.217 + 25. HL.53F.243 + 26. HL.57F.258 ++ +++ Keterangan :+ ++ +++
: Terbentuk zona jernih (7 d 10 mm) : Terbentuk zona jernih (11 d 14 mm) : Terbentuk zona jernih (d > 15 mm)
proses fermentasi dan pemanenan. Hal ini menjadi penting karena senyawa metabolit sekunder dihasilkan pada saat akhir fase logaritmik atau awal fase stasioner. Pada fase ini terjadi akumulasi senyawa metabolit sekunder pada medium fermentasi (Ingrahman, 2000). Langkah selanjutnya yang harus segera dilakukan adalah recovery, yaitu upaya memanen senyawa antibiotik (metabolit sekunder) sebelum terjadi autolisis misellium yang mengakibatkan penurunan pertumbuhan dan autolisis sel yang dapat mengakibatkan rusaknya
tsb disebabkan karena bakteri tsb memproduksi enzim
antibiotik (El Sayed, 1994). Pola pertumbuhan kapang
-laktamase, enzim ini dapat memotong cincin -
endofit HL.46F.211 dan HL.57F.258 diperlihatkan pada
laktam sehingga aktivitas antibiotik tersebut menjadi
gambar 2 dan 3. Dari Gambar 2 dapat diketahui bahwa,
hilang. Menurut Neneng (2000) bakteri Escherichia coli
fase adaptasi kapang endofit HL. 46F.211 dimulai pada
ATCC 35218 diketahui sebagai bakteri yang mampu
hari ke-0 sampai hari ke-1. Pada fase ini terjadi
menghasilkan enzim -laktamase Tipe TEM-1,
penyesuaian diri kapang endofit pada lingkungan
sehingga bakteri ini resisten terhadap antibiotik
barunya. Pada fase ini belum terjadi pembelahan sel
kelompok -laktam. Jadi, senyawa antibakteri yang
melainkan terjadi pertambahan ukuran atau besar sel.
dihasilkan oleh kapang endofit yang menghambat
Selanjutnya masuk fase permulaan pembiakan (hari
pertumbuhan kedua bekteri uji ini merupakan senyawa
ke-1-2). Fase berikutnya adalah fase pembiakan cepat
antibiotik yang tahan terhadap aktivitas enzim -
(fase Logaritmik/ fase eksponensial), yaitu terjadi pada
laktamase.
hari ke-2 sampai hari ke 4 tetapi pada hari ke 4 terlihat
Pola Pertumbuhan Kapang Endofit Potensial.
populasi menurun, hal ini kemungkinan terjadi
Dalam penelitian ini 2 kapang endofit (HL.46F.211 dan
kesalahan dalam pengambilan sampel (hari ke 4) yang
HL.57F.258) terpilih untuk penelitian lebih lanjut, karena
kurang homogen sehingga populasi menurun.
kedua kapang tersebut mempunyai kemampuan dalam
Pertambahan jumlah sel mengikuti kurva
menghambat pertumbuhan bakteri uji, dengan
logaritmik. Berakhirnya fase ini, kemudian diikuti fase
menunjukkan hasil zona hambat yang luas (Tabel 1),
pembiakan diperlambat (hari ke 4-5). Pada fase ini
yaitu masing masing terhadap E. Coli dan S. aureus.
pembelahan sel mulai melambat, sehingga jumlah sel
Senyawa aktif akan diproduksi dari kedua kapang
yang hidup hampir sama dengan sel yang mati, karena
tersebut namun sebelumnya dicari lebih dulu pola
dipengaruhi jumlah nutrisi yang mulai habis. Akhir fase
pertumbuhan dari masing masing kapang tersebut
logaritmik atau memasuki fase stasioner merupakan
untuk mendapatkan informasi waktu yang tepat pada
saat metabolit sekunder mulai dihasilkan dengan titik
Melliawati, et al.
Jumlah sel kapang (CFU/ml) x 10
7
40 35 30 25 20 15 10 5 0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
-5
Jumlah sel kapang (CFU/ml) x 107
Jurnal Natur Indonesia 12(1): 21-27
24
30 25
20 15 10 5
0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
-5
Gambar 2. Grafik pola pertumbuhan kapang endofit HL.46F.211
Lama fermentasi (hari) Gambar 3. Grafik pola pertumbuhan kapang HL.57F.258
pertumbuhan kultur sel tertinggi, seperti ditunjukkan
optimal apabila faktor aerasi, suhu, pH medium dan
pada gambar 2. Pada hari ke-5 sel mencapai jumlah
ketersediaan nutrisi cukup untuk pertumbuhan kapang
Lama fermentasi (hari)
8
tertinggi yaitu 3,61 x 10 CFU/mL, sehingga hari ke-5
endofit selama proses fermentasi, demikian juga
adalah waktu yang tepat untuk memanen senyawa
bahan-bahan organik seperti karbon, nitrogen, dan
antibiotik, karena diduga pada saat sel mencapai jumlah
mineral yang dibutuhkan oleh kapang endofit untuk
yang tertinggi diperkirakan senyawa metabolit sekunder
biosintesis. Seperti yang dilaporkan oleh Madigan et
yang terak umulasi juga mencapai maksimal
al., (2000) bahwa akumulasi pembentukan antibiotik
(Simanjutak et al., 2002). Pada Gambar 3, pola
penisillin terjadi secara optimum apabila medium
pertumbuhan kapang endofit HL.57F.258 tidak jauh
mengandung sumber karbon, nitrogen, mineral dan
berbeda dan diketahui pada hari ke-5 merupakan waktu
prekursor. Dalam penelitian ini digunakan Corn-steep
yang tepat untuk memanen senyawa antibakteri pada
liquor untuk memenuhi kebutuhan tersebut.
proses fermentasi karena jumlah sel mencapai nilai 8
tertinggi yaitu 2,40 x 10 CFU/mL.
Isolasi senyawa antibakteri dilakukan dengan cara ekstraksi menggunakan kloroform. Ekstraksi dilakukan
Pengukuran pH juga dilakukan, pada awal dan
sebanyak tiga kali agar senyawa aktif yang diinginkan
akhir fermentasi. Derajat keasaman (pH) awal medium
terekstrak sempurna di dalam pelarut kloroform
kultur kapang endofit HL.46F.211 adalah 5,63 kemudian
(Houghton & Raman, 1998 dalam Simanjutak et al.,
terjadi kenaikan pH yaitu menjadi 7,19. Pada kultur
2002). Setiap kali ekstraksi, dilakukan inkubasi dengan
kapang endofit HL.57F.258 juga terjadi kenaikan dari
tujuan untuk penjenuhan. Penjenuhan dilakukan untuk
5,67 menjadi 7,23. Peningkatan nilai pH terjadi karena
menyediakan semacam jembatan agar terjadi
senyawa asam yang terakumulasi dalam medium
pemindahan senyawa metabolit sekunder (antibakteri)
dimanfaatkan oleh sel sebagai sumber energi selama
ke dalam fase kloroform (El Sohly et al., 1990 dalam
sporulasi (Benoit et al., 1990 dalam Simanjutak et al.,
Simanjutak et al., 2002). Sehingga akan terbentuk dua
2002). Selain itu, kenaikan pH mungkin juga disebabkan
lapisan yang berbeda. Hasil ekstraksi berupa ekstrak
karena terakumulasinya bahan-bahan alkali dalam
fase kloroform dan ekstrak fase air (medium). Ke dua
medium (Simanjutak et al., 2002). Menurut El-Sayed
ekstrak di evaporasi untuk mendapatkan ekstrak kering.
(1994) kisaran pH yang diperlukan untuk produksi
Analisis senyawa antibakteri
melalui
penisillin (antibiotik) berkisar antara 5 sampai 7,5.
Kromatografi Lapis Tipis. Kromatografi merupakan
Sementara pH medium hasil fermentasi oleh kedua
metode pemisahan senyawa, dalam suatu campuran
kapang masuk dalam kisaran tersebut sehingga
berdasarkan berat molekulnya. Hasil perbandingan yang
kemungkinan cocok untuk pertumbuhan kapang endofit
tepat antara eluen kloroform : methanol adalah 4 : 2
dan untuk produksi senyawa antibiotik.
dan 2 : 4. Sebagai antibiotik standar menggunakan
Fermentasi dan ekstraksi kapang endofit.
Kloramfenikol dan Ampisillin.
Fermentasi dilakukan pada kedua kapang endofit
Hasil uji KLT terhadap ekstrak kapang endofit
terseleksi (HL.46F.211 dan HL.57F.258). Senyawa
HL.46F.211 pada fase kloroform (a) dan fase air (b)
bioaktif (metabolit sekunder) diharapkan dapat
menunjukkan indikasi positif (Gambar 4). Ekstrak fase
dikeluarkan secara ekstraseluler ke dalam medium
kloroform mempunyai nilai Rf yang mendekati nilai Rf
fermentasi. Senyawa aktif dapat dihasilkan secara
Kloramfenikol (0,84) dan Ampisillin (0,76), sedangkan
Senyawa Aktif Anti Bakteri Escherichia coli ATCC 35218 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923
d
a
a
d c
c
b
25
b
Gambar 4. Hasil KLT ekstrak kapang endofit HL.46F.211 pada si lika gel F254. a. Spot ekstrak fase kloroform b. Spot ekstrak fase air c. Spot Kloramfenikol d. Spot Ampisilin
Gambar 5. Hasil uji KLT ekstrak kapang endofit HL.57F.258 pada silika gel F254 a. Spot ekstrak fase kloroform b. Spot ekstrak fase air c. Spot Kloramfenikol d. Spot Ampisillin
ekstrak fase air belum dapat terangkat sempurna
pada menit 2,708 mendekati kisaran Rt Kloramfenikol
karena diduga ekstrak fase air tercampur dengan
(pada menit 2,796). Dari hasil kromatogram tersebut
senyawa metabolit lain yang terdapat dalam kultur
diketahui pula bahwa senyawa pada fraksi HL.46F.211(1)
fermentasi. Hasil identifikasi menunjukkan positif pada
hasilnya benar-benar murni, karena Peak yang
ekstrak fase kloroform hanya memiliki atau
terbentuk hanya satu dengan luas area 100 %. Pada
menunjukkan noda tipis.
kromatogram HL.46F.211(2) dan HL.46F.211(3) pada
Noda pada masing-masing ekstrak dan antibiotik
fase air, nilai Rt senyawa yang terdeteksi masing
standar hanya terdeteksi dibawah sinar UV dengan
masing pada menit 2,725 dan 2,792, waktu Rt nya
panjang gelombang 254 nm. Senyawa tersebut tampak
mendekati Rt Kloramfenikol. Sehingga dari hasil
sebagai bercak/ noda gelap pada latar belakang yang
tersebut dapat dikatakan bahwa ekstrak fungi endofit
berfluoresensi kuning-hijau. Setelah disemprot dengan
Hl.46F.211 menghasilkan senyawa metabolit sekunder
penapak bercak CeSO4 (Cerium Sulfat) warna noda
yang mendekati Kloramfenikol dan Ampisillin atau
yang terbentuk ungu.
senyawa turunannya. Bila dilihat dari hasil seleksi awal,
Analisis KLT terhadap ekstrak fase kloroform dan
isolat HL.46F.211 dapat menghambat pertumbuhan E.
fase air kapang endofit HL.57F.258 juga menunjukkan
Coli (+++) dan tidak menghambat pertumbuhan S.
hasil positif (Gambar 5), yaitu contoh uji mempunyai
aureus (Tabel 1) sementara hasil KCKT dari ekstrak
kisaran nilai Rf mendekati Rf antibiotik standar
isolat ini menunjukkan bahwa ekstrak mengandung
Kloramfenikol (0,84) dan Ampisillin (0,76). Sementara
senyawa yang mendekati Kloramfenikol dan Ampisillin.
itu hasil positif pada ekstrak fase air hanya memiliki
Kloramfenikol dan Ampisilin merupakan 2 macam
noda tipis. Noda tipis tersebut mengindikasikan bahwa
antibiotik yang sama sama dapat membinasakan
senyawa metabolit sekunder pada ekstrak kapang
bakteri gram negatif dan positif. Jadi dari hasil tersebut
endofit HL.57F.258 terlarut dalam kloroform, atau
dapat dikatakan bahwa senyawa aktif anti bakteri dari
senyawa metabolit sekunder tersebut bersifat non polar.
isolat HL.46F.211 baru terlihat setelah melalui
Analisis senyawa antibakteri dengan metode
fermentasi dan ekstraksi.
KCKT. Hasil analisis menggunakan KCKT diperlihatkan
Kromatogram hasil analisis KCKT fraksi kloroform
pada Tabel 2 dan 3. Pada kromatogram hasil analisis
pada ekstrak HL57F.258(1) dan HL57F.258(2) serta
fraksi kloroform (HL46F211), diketahui bahwa nilai Rt
HL.57F.258 fase air menunjukkan bahwa senyawa
senyawa tersebut terdeteksi pada menit 2,679,
metabolit sekunder tersebut mempunyai waktu retensi
mendekati kisaran Rt Ampisillin pada menit 2,650. Pada
yang kisarannya mendekati nilai Rt Kloramfenikol
kromatogram HL.46F.211(1) nilai Rt senyawa, terdeteksi
standar (3,267), Rt masing masing adalah 3,258 dan
Jurnal Natur Indonesia 12(1): 21-27
26
Melliawati, et al.
Tabel 2. Hasil analisis ekstrak kapang HL.46F.211 menggunakan KCKT pada eluen Kloroform : Metanol = 2 : 4 No 1 2 3 4
Kode sampel HL.46F.211 (1) (fase air) HL.46F.211 (1) (fase Kloroform) HL.46F.211 (2) (fase air) HL.46F.211 (3) (fase air)
RT 2,708 2,679 2,725 2,792
Luas Area (%) 100 3,16 82,55 39,79
Senyawa pembanding Kloramfenikol Ampisillin Kloramfenikol Kloramfenikol
RT Senyawa pembanding 2,796 2,650 2,797 2,797
Tabel 3. Hasil analisis ekstrak kapang HL.57F.258 menggunakan KCKT pada eluen Chloroform : Metanol = 4 : 2 No.
Kode sampel
1 2
HL.57F.258 (1) (fase Kloroform) HL.57F.258 (2) (fase Kloroform)
3 4
HL.57F.258 (3) (fase Kloroform) HL.57F.258 (fase air)
RT 3,258 3,204 2,829 2,812 3,254 2,887
Luas area (%) 25,13 60,45 23,99 91,04 14,26 36,09
Senyawa pembanding Kloramfenikol Kloramfenikol Ampisillin Ampisillin Kloramfenikol Ampisillin
RT senyawa pembanding 3,267 3,267 2,883 2,883 3,267 2,883
3,204 serta 3,254. Selain itu ekstrak HL57F.258(2) dan
semua pihak yang membantu kelancaran dalam
HL57F.258(3) dari fraksi kloroform serta HL57F.258 fase
kegiatan penelitian ini.
air mengandung senyawa metabolit sekunder yang mendekati Rt.Ampisillin standar (2,883), yaitu masing masing 2,829, 2,812 dan 2,887 (Tabel 3). Khususnya untuk ekstrak HL.57F.258 (3) pada fase kloroform diperoleh luas area 91,04 %. Metabolit sekunder yang dihasilkan oleh kapang HL57F.258 mendekati Kloramfenikol dan Ampisilin atau menghasilkan senyawa aktif yang dapat menghambat pertumbuhan Escherichia coli ATCC 35218 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923. KESIMPULAN DAN SARAN Diperoleh 2 isolat kapang endofit yaitu HL.46F.211 dan HL.57F.258 positif menghambat pertumbuhan Escherichia coli ATCC 35218 dan 3 isolat yaitu HL.48F.217, HL.53F.243 dan HL.57F.258 positif menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus ATCC 25923. Hasil analisis senyawa antibakteri dengan KCKT menunjukkan bahwa senyawa aktif dari ekstrak kapang HL.46F.211 dan HL.57F.258 mempuyai nilai waktu retensi (Rt) mendekati antibiotik standar kloramfenikol dan Ampisillin. Khususnya HL.46F.211(1) pada fase air menghasilkan luas area 100% terhadap antibiotik standar Kloramfenikol dan HL.57F.258 (3) fase Kloroform menghasilkan luas area 91,04% terhadap antibiotik standar Ampisillin. UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terima kasih disampaikan kepada Pimpinan Proyek Penelitian Bioteknologi yang telah memberikan dana dan kesempatan dalam melakukan penelitian. Disampaikan pula ucapan terima kasih kepada Saudara Bustan dan Saudari Nuryati serta
DAFTAR PUSTAKA Bills, G.F. 1996. Isolation and analysis of endophytic fungal communities from woody plants. World Mycologia Journal: 31-65. Bonjar, J.G., Fooladi, M.H., Mahdavi, M.J., & Shahghasi, A. 2004. Broad-spectrum, A novel antibacterial from Streptomyces sp. Biotechnol 3: 126-130. Brooks, G.F., Butel, J.S., & Morse, S.F. 2001. Medical Microbiology. 2th edition. New York: Mc. Graw Hill. Carroll, G.C. 1988. Fungal endophytes in stems and leaves: From latent pathogen to mutualistic simbiont. Ecology 62: 2-9. Carroll, G.C. 1991. Bey and pest detterence alternative strategies and hidden cost of endophytic microorganism in vascular plants. Di dalam: Andrew, J.H. & Manamo, S.S. (eds.). Microbial Ecology of Leaves. Springer-Verlag. Castillo, U.F., Strobel, G.A., Frod, E.J., Hess, W.M., Porter, H., Jensen, J.B., Albert, H., Robison, R., Condron, M.A., Teplow, D.B., Stevens, D., & Yaver, D. 2002. Mumubicins wide-spectrum antibiotic produced by Streptomyces NRRL 30562, endophytes on kennedia nigricans. Microbiology 148: 2675-2685. Clay, K. 1988. Fungal endophytes of grasses: A devense mutualism between plants and fungi. Ecology 69(1): 10-16. Desriani A.M. & Lestari, Y. 2004. Screening of Stretomyces spp. producing β-laktamase inhibitory protein. Hayati 11: 8892. El-Sayed, A.H.M . 1994. Production of penicillins and chepalosporins by fungi. Di dalam: The Mycota. Tokyo: Springer. Halaman 517. Faeth, S. H. 2002. Are endophytic fungi defensive plant mutualism?. Journal Oikos 98: 25-36. Gritter, R.J., Bobbitt, J.M., & Schwarting, A.E. 1991. Pengantar Kromatografi. Bandung: Penerbit ITB. Handayani, D.L. 2004. Mikrofungi Endofit Penghasil Antibakteri Penghambat Escherichia coli. Skripsi. Fakultas Biologi UGM. Yogyakarta: Universitas Gajah Mada. Holler, U. 1999. Isolation, biological activity and secondary metabolite investigations of marine derived fungi and selected host sponges. W ihelmina. Carolo University. www.opus.tu_bs.de/opus/volltexte/1999/40 Ingraham, J.L. & Ingraham, C.A. 2000. Introductionary of Microbiology. Second edition. Washington: Brooks Cole. Kahono, S. & Arief, A.J. 2002. Kegiatan Penelitian Keanekaragaman Hayati di TNGH: Kerjasama LIPI-PHKA-JICA. Workshop Riew BCP-JICA.Jakarta. Halaman 10. Khopkar S.M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: Penerbit UI Madigan, M.T. Martinko, J. M., & Parker, J. 2000. Brock Biology of Microorganism. New Jersey: Prentice Hall Inc.
Senyawa Aktif Anti Bakteri Escherichia coli ATCC 35218 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923 Neneng, L. 2000. Karakterisasi Senyawa Antibiotik Yang Resisten Terhadap Beta-laktamase Tipe TEM-1 dari Isolat ICBB 1171 Asal Ekosistem Air Hitam Kalimantan Tengah. Http:/ /www.icbb.org/indonesia/penelitian/penelitian01.htm Petrini, D., Sieber, T.N., Toti, T., & Viret, D. 1992. Ecology metabolite production and substrate utilization in endophytic fungi. Natural Toxin 1: 185-196. Sanglard, D. 2001. Integrated Antifungal Drug Discovery in Candida albicans. Nature Biotechnology 19: 212-213. Salle, B. S. 1961. Fundamentals Principles of Bacteriology. 5 th edition. Philadelphia: Mc. Graw Hill Book Co. Halaman 265. Simanjutak, P., Melliawati, R., Soeksmanto, A., Parwati, T., & Bustanussalam. 2002. Pengembangan bahan baku zat bioaktif antimalaria dari mikroba endofit tumbuhan obat Indonesia. Laporan Teknik Penelitian Puslit Bioteknologi-LIPI. Cibinong-Bogor.
27
Stahl, E. 1969. Thin Layer Chromatography: A Laboratory Hand Book. Translated by M.R.F. Ashworth. New York: SpringerVerlag. Halaman 101, 148. Strobel, G.A., Dirkse, E., Sears, J., & Markworth, C. 2001. Volatile antimocrobilas from Muscudor albus a novel endophytic fungus. Journal Microbiology 147: 2943-2950. Sukara E, Melliawati, R., & Saono, .S. 1992. Amylases production from Cassava by an indigenous yeast. J. Sci. Tech. Develop 9: 157-168. Tan, R.X. & Zou, W.X. 2001. Endophytes: a rich source of funcional metabolites. Journal Natural Product The Royal Society of Chemistry 18: 448-459. Tjay, T.H. & Raharja, K. 2002. Obat-obat Penting, Khasiat, Penggunaan, dan Efek Sampingnya. Jakarta: PT. Exel Media Komputindo.
