Samenvatting
Samenvatting Hoofdstuk 1 geeft een overzicht van de achtergronden van biomateriaalgerelateerde infecties (BAI) en de mogelijke strategieën om deze infecties te voorkomen. De lezer wordt meegenomen in het onderwerp door het geven van theoretische kennis met betrekking tot BAI als een van de belangrijkste oorzaken van implantaat falen in een tijd waarin het aantal patiënten die biomaterialen nodig hebben gestaag toeneemt. BAI begint met de initiële hechting van infectieuze organismen die vervolgens uitgroeien tot een biofilm. Bacteriën in een biofilm zijn beter bestand tegen antibiotica, desinfecterende middelen en detergenten. Ondanks langdurige behandeling met antibiotica is het vaak noodzakelijk om geïnfecteerde implantaten te verwijderen. Quaternaire ammoniumverbindingen (QAC) zijn veelbelovende verbindingen omdat ze veel antimicrobiële eigenschappen blijken te bezitten, zowel bij toepassing in oplossing als geïmmobiliseerd op een oppervlak. Ondanks dat er hypothesen zijn over het werkingsmechanisme van QACs op het bacteriële celoppervlak, is er geen duidelijk bewijs wat deze hypothesen ondersteunt. Voordat er kan worden overgegaan tot praktische toepassing van QACs moet het werkingsmechanisme van het beïnvloeden van bacteriële hechting en de daaropvolgende biofilmvorming beter worden begrepen. Daarom is de hoofddoelstelling van dit proefschrift het onderzoeken en begrijpen van het bactericide mechanisme van QACs op stafylokokken die betrokken zijn bij BAI. De studie gepresenteerd in hoofdstuk 2 werd opgezet om de invloed van
een
QAC
(Ethoquad
C/25
(Cocoalkyl-methyl-(polyoxyethyleen)-
ammonium-chloride)) op de overleving van gehechte stafylokokken te bestuderen met behulp van een atomaire kracht microscoop (AFM). Vier aan glas gehechte bacteriestammen, met verschillende minimale remmende (MIC) en bactericide (MBC) concentraties voor de QAC, werden blootgesteld aan drie verschillende concentraties van de QAC in kaliumfosfaatbuffer (0,5, 1 en 2 x MBC). Met de AFM in de contact-modus werden gehechte stafylokokken herhaaldelijk afgebeeld en het celoppervlak bleek te gaan rimpelen bij
126
Samenvatting progressieve blootstelling aan de QAC, totdat de bacteriën loslieten van het oppervlak. Hogere QAC concentraties zorgden ervoor dat de bacteriën sneller gingen rimpelden en loslieten van het oppervlak. De twee slijm producerende stafylokokken overleefden langer op het glasoppervlak dan de twee niet-slijm producerende stammen, ondanks vergelijkbare MIC en MBC waarden. Alle gehechte stafylokokken in de niet-gescande gebieden bleven gehecht tijdens blootstelling aan QAC. Aangezien MIC en MBC waarden niet gerelateerd waren aan de hydrofobiciteit en zeta-potentiaal van de bacterie, is overleving op het glasoppervlak waarschijnlijk niet bepaald door directe interactie van QAC moleculen met het celoppervlak. In plaats daarvan wordt gesuggereerd dat de druk van de AFM naald de opname van QAC moleculen in de celmembraan bevordert en hiermee de bactericide werkzaamheid verbetert. Bovendien, de verlengde overleving van slijm producerende stammen op een oppervlak onder druk kan wijzen op een nieuwe beschermende rol van slijm als een “stress-absorber”, resulterend in een belemmerde opname van QAC moleculen. Tegelijkertijd demonstreerde dit onderzoek dat de aanwezigheid van 0.,1 M Ca2+-ionen de bactericide werking van QAC moleculen vermindert. Toevoeging van Ca2+-ionen aan een QAC oplossing resulteerde namelijk in een verlengde overleving van intacte gehechte stafylokokken, suggererende dat Ca2+-ionen de uitwisseling van membraan Ca2+-ionen, nodig voor QAC opname, belemmert. In hoofdstuk 3 werd de invloed van de Ethoquad C/25 verbinding op de groei en de metabolische activiteit van stafylokokken in een biofilms bepaald, terwijl mogelijk celwand schade van bacteriën in een biofilm zichtbaar werd gemaakt met behulp van een “Focused Ion Beam - Scanning Electron Microscopy” (FIB-SEM) 3D-tomografische beeldvorming. Drie stammen (één niet-slijm- en twee slijm producerende stafylokokken) met verschillende MIC en MBC waarden werden gebruikt in deze studie. Zetapotentiaalen, water contacthoeken randhoeken en elementaire samenstelling
127
Samenvatting van het celoppervlak werden bepaald. Metaboleische activiteit van bacteriën in biofilms, blootgesteld aan 1 x MBC en 3 x MBC QAC oplossingen, werd gekwantificeerd met behulp van de tetrazoliumzout (MTT) test en uitgedrukt per eenheid levend biovolume, bepaald uit confocale laser scanning microscopie afbeeldingen. FIB-SEM werd gebruikt voor 3D-visualisatie van de stafylokokken in de biofilm na QAC blootstelling. Slijm producerende stafylokokken waren minder negatief geladen, hydrofober en hadden meer stikstofrijke groepen op hun celoppervlak dan de niet-slijm producerende stam. QAC oplossingen met 1 x MBC voor planktonische bacteriën waren niet in staat om de stafylokokken in een biofilm te doden en verminderden de metaboleische activiteit alleen van de niet-slijm producerende stam. Slijm producerende stammen werden niet beïnvloed in hun metaboleische activiteit, terwijl celwand schade bleek uit FIB-SEM. Met 3 x MBC werd zowel de hoeveelheid biofilm als de metaboleische activiteit van de bacteriën in de biofilm sterk gereduceerd en de weinige bacteriën die konden worden gevisualiseerd met FIB-SEM hadden meerdere gaten in hun celwand. Samenvattend, stafylokokken in biofilms kunnen metaboolisch actief blijven tijdens blootstelling aan 1 x MBC van een QAC oplossing, ondanks schade aan hun celwand. Met een hogere QAC concentratie (3x MBC) werd ernstige schade gevonden. Na blootstelling bleef een lage metaboleische activiteit meetbaar, zelfs voor een slijm producerende stam die bekend staat beter antimicrobiële aanvallen te kunnen weerstaan. In een addendum bij hoofdstuk 3 werden de effecten van QACs op de groei en biofilmvorming van stafylokokken geanalyseerd en vergeleken met gentamicinesulfaat, een antibioticum datie tot de groep aminoglycosiden behoort en vaak gebruikt wordt binnen de orthopedie voor lokale behandeling van botinfecties. Gentamicinesulfaat oplossingen met hun planktonische MBC waarde waren niet in staat om stafylokokken in een biofilm te doden en verlaagden alleen de metaboleische activiteit van een niet-slijm producerende
128
Samenvatting stam. Echter, biofilms van de slijm producerende stammen lieten een verhoogde slijmproductie en metaboleische activiteit zien na blootstelling aan hun planktonische MBC. Dit wijst erop dat de aanwezigheid van slijm een belangrijke
rol
speelt
bij
de
bescherming
van
bacteriën
tegen
gentamicinesulfaat, waardoor de bacteriën bestand zijn tegen ongunstige omgevingsinvloeden,
zoals
de
aanwezigheid
van
antibiotica.
Het
werkingsmechanisme van gentamicinesulfaat op de groei en biofilmvorming van stafylokokken lijkt dus anders dan het mechanisme dat gevonden werd in hoofdstuk 3 voor QACs. Antimicrobiële peptiden, zoals gramicidine S, hebben een tertiaire structuur waarin de kationische groepen ruimtelijk gezien aan één zijde van de peptide zitten en de hydrofobe groepen aan de andere zijde. Evenzo, kationische verbindingen zoals QACs vertonen alleen antibacteriële activiteit als ze een hydrofoobe eenheid bezitten, naast de quaternaire ammonium groep. De gelijkenis tussen deze vereisten voor beide klassen van verbindingen om antibacterieel gedrag te kunnen vertonen suggereert een vergelijkbare werkingsmechanisme. Daarom hebben we in hoofdstuk 4 de initiële effecten van verschillende kationische antimicrobiële middelen (QAC, gramicidine S en gentamicinesulfaat) op het celoppervlak
van gehechte
stafylokokken onderzocht en vergeleken met behulp van “Peak-ForceTapping” AFM. Gehechte Staphylococcus epidermidis ATCC 14990 werd blootgesteld aan verschillende antibiotica oplossingen (1 x MBC) en aan kaliumfosfaat buffer (controle). Tijdens blootstelling werden gehechte bacteriën herhaaldelijk in de AFM bekeken met een kracht van 3 nN en het percentage stafylokokken dat gehecht bleef werd geregistreerd als functie van de tijd. Oppervlakteruwheid van de bacteriën die gehecht bleven werd berekend uit de AFM beelden. Bij progressieve blootstelling aan alle drie de kationische antimicrobiële middelen werd rimpelvorming en loslating van bacteriën waargenomen tijdens het scannen met de AFM naald. Buffer
129
Samenvatting resulteerde niet in rimpelvorming of loslating van gehechte stafylokokken, terwijl meer bacteriën zich hadden losgemaakt na 300 min blootstelling aan gentamicinesulfaat dan na blootstelling aan de andere twee kationische antimicrobiële stoffen. Oppervlakteruwheid van de bacteriën steeg van 15 nm voorafgaand aan het experiment tot 138 nm na blootstelling aan QAC en gramicidine S en tot 145 nm na blootstelling aan gentamicinesulfaat. De oppervlakteruwheid van gehechte stafylokokken werd dus beïnvloed door blootstelling aan de antimicrobiële verbindingen en dit bevestigt dat membraan degradatie een belangrijke factor is die bijdraagt aan hun bactericide activiteiten. Antimicrobiële effecten op het celoppervlak van gehechte stafylokokken tussen een QAC, een antimicrobiële peptide en een aminoglycoside bleken vergelijkbaar, hetgeen soortgelijke membraan interacties suggereert. Tenslotte veronderstellen we in hoofdstuk 5 dat QAC moleculen die geïmmobiliseerd zijn op een oppervlak een hele andere generieke werkingsmechanisme bezitten dan QAC moleculen in oplossing. Terwijl het werkingsmechanisme van QACs in oplossing is gebaseerd op adsorptie, ionenuitwisseling en membraanschade, verbeteren geïmmobiliseerde QAC moleculen de hechtingkrachten tussen een bacterie en een substraat om uiteindelijk te leiden tot verminderde groei, stress de-activering en celdood.
130
Samenvatting
131
Samenvatting
132
