Jurnal Veteriner Juni 2009 ISSN : 1411 - 8327
Vol. 10 No. 2 : 57-62
Respon Antibodi Antikapsid pada Mencit yang Divaksin Vaksin Limpa dan Vaksin Kultur Virus Penyakit Jembrana (ANTICAPSID ANTIBODY RESPONSE OF BALB/C MICE VACCINATED WITH SPLEEN AND TISSUE CULTURE VACCINE OF JEMBRANA DISEASE VIRUS) Ni Luh Putu Manik Widiyanti1 , Ketut Suata2, Nyoman Mantik Astawa3, Hartaningsih4 Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Pendidikan Ganesha, Jl Udayana Singaraja-Bali Telp. 08124665149, Fax : (0362) 25335 Email :
[email protected] 2 Lab Mikrobiologi, Fakultas Kedokteran Universitas Udayana, Denpasar 3 Lab Virologi, Fakultas Kedokteran Hewan Unud, Denpasar 4 Balai Besar Veteriner, Pegok Sesetan Denpasar 1
ABSTRACT Bali cattle are one of Indonesia national asset which need to be conserved as they have many advantages. They are however susceptible to many infections diseases such as jembrana disease. Currently, the disease is prevented by vaccination using vaccine derived from jembrana disease virus (JDV)-infected bali cattle. An alternative vaccine using JDV-infected lymphocyte culture is expected to increase the virus yield and is therefore likely to increase the antibody response in the vaccinated animals. A study therefore was therefore conducted to compare the anti-capsid antibody response of Balb/c mice immunized with vaccine derived from the spleen of infected cattle (spleen vaccine) and those immunized with vaccine derived from infected lymphocyte culture (culture vaccine). As many as 16 female Balb/c mice were divided into two groups, Each group was vaccinated 4 times weekly respectively with spleen and culture vaccines. The antibody response against the capsid protein of JDV was determined using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and the absorbance reading of mice sera from each group was compared. Tstudent and univariate analysis showed that the average absorbance reading sera of sera derived from mice vaccinated with spleen vaccine (0.15) was not significantly different from those vaccinated with culture vaccine (0.18). It appears that culture vaccine is able to induce anti-capsid antibody response as high as spleen vaccine. Key words : Anticapsid antibody, spleen vaccine, tissue culture vaccine, jembrana disease virus
PENDAHULUAN
sangat baik untuk dikembangkan sebagai sapi potong (Darmadja, 1981). Keunggulan yang dimiliki oleh sapi bali, menyebabkan penyebarannya hampir ke seluruh pulau-pulau yang ada di Indonesia. Salah satu kelemahan penting yang dimiliki oleh sapi bali adalah kerentanannya terhadap penyakit Jembrana (Jembrana Disease/JD). Penyakit tersebut hanya ditemukan di Indonesia dan secara klinis hanya menyerang sapi bali (Ramachandran, 1981., Teuscher et al., 1981., Soeharsono et al., 1990) Upaya pengendalian penyakit Jembrana di Indonesia terus dilakukan. Salah satu di antaranya adalah dengan vaksinasi. Vaksin yang telah terbukti dapat menurunkan tingkat kematian sapi bali yang terserang Jembrana
Indonesia adalah negara yang kaya akan plasma nutfah, baik flora mau pun fauna dan salah satu di antaranya adalah sapi bali (Bos javanicus) yang perlu dilindungi dari kepunahan. Pusat domestikasi sapi (Bibos) adalah Indo-China dan Malaysia kemudian menyebar ke Bali (Copland, 1996). Sapi bali merupakan ternak yang sangat diminati petani karena tenaga kerja yang tangguh, memiliki adaptasi lingkungan yang tinggi, dan fertilitas yang tinggi, yaitu rata-rata 83%. Selain itu, sapi bali juga sangat diminati oleh konsumen karena memiliki pertumbuhan badan yang kompak, persentase karkas yang tinggi (56%), dan lemak sekitar 3%, sehingga 57
Widiyanti etal
Jurnal Veteriner
Disease Virus (JDV), yang dipakai secara luas di lapangan adalah vaksin yang dibuat dari limpa sapi bali terinfeksi JDV (vaksin limpa). Vaksin jenis tersebut hanya mampu menginduksi kekebalan dengan tingkat proteksi sekitar 70% (Hartaningsih et al., 2000) Tingkat proteksi yang rendah oleh vaksin limpa disebabkan oleh sedikitnya sel yang terinfeksi JDV dalam limpa yang digunakan untuk membuat vaksin yaitu berkisar 10-15% sel limfosit di daerah parafolikel (daerah sel T) dan kurang dari 1% limfosit di daerah folikel (daerah sel B) (Chadwick et al., 1997; Dharma, 1997). Karena tingkat proteksi yang diinduksi oleh vaksin limpa masih jauh memadai dan permintaan akan vaksin JDV yang bermutu lebih baik makin meningkat serta produksinya yang mahal, maka perlu dicari vaksin alternatif yang mampu meningkatkan kualitas vaksin. Salah satu cara meningkatkan kualitas vaksin adalah meningkatkan jumlah sel-sel terinfeksi yang bisa dibuat pada kultur jaringan sel limfosit. Dalam mengkultur sel limfosit sapi bali, diperlukan bantuan mitogen tertentu yaitu interleukin-2 (IL-2). Dari penelitian Astawa et al., (2005), terbukti bahwa JDV dapat bereplikasi pada kultur limfosit darah tepi, sehingga berpeluang untuk dijadikan vaksin kultur. Potensi dari vaksin kultur tersebut dalam merangsang terbentuknya antibodi belum pernah dilaporkan. Untuk mendeteksi protein JDV tersebut digunakan antigen rekombinan kapsid (Ca) yang difusikan dengan histidine (Barboni et al., 2000). Vaksin kultur adalah vaksin yang berasal dari kultur jaringan limfosit sapi bali. Pada lentivirus, penggunaan mencit untuk pertumbuhan virus telah banyak dilakukan antara lain mencit betina DBA2 pada Polycythemia-inducing Friend Leukemia Virus (FLV-P) (Iffa Credo Laboratories, Grenoble, France) Launay et al (1990), mendeteksi jumlah protein virus p24 dari medium kultur dari serum dengan immunosorben assay (ZeptoMetrix, Buffalo, N.Y) Cui et al., (2002), dan penanganan hewan coba mencit (Keddie, 1990). Khusus mencit yang biasa digunakan untuk penelitian adalah mencit balb/c, karena hewan tersebut mudah untuk ditangani (Newell et al., 1988). Pada penelitian Respiratory Syncytial Virus (RSV) digunakan untuk studi imunopatologi, dan untuk mendeteksi peningkatan produksi imunoregulator sitokin antara lain IL-12 (Kong et al., 2005
Berdasarkan penelitian tersebut di atas, maka untuk mengetahui potensi vaksin kultur JDV dilakukan pada mencit balb/c dengan mendeteksi respon kekebalan humoral terhadap protein Ca JDV. Pada umumnya, protein Ca adalah protein yang pertama kali terdeteksi (Barboni et al., 2000) dan merupakan imunodominan terhadap infeksi JDV (Kertayadnya et al., 1993). Untuk mendeteksi antibodi terhadap protein Ca, digunakan protein rekombinan Ca yang dibuat dengan mengklon rangkaian nukleotida yang mengkode protein Ca JDV (nt 605-1282) dengan PCR dari plasmid pT7T3 klon 139 (Chadwick et al., 1995) menggunakan Taq polimerase dan primer CAF dan CAR JDV (Barboni et al., 2000). Produk PCR itu, diklon dalam vektor pGEM-T (Promega) dan diferifikasi sebelum disubkloning ke dalam pTRCHisB (Invitrogen) untuk diekspresikan oleh bakteri E. coli strain TOP 10 (Invitrogen), sebagai protein fusi dengan histidine (Barboni et al., 2000). METODE PENELITIAN Rancangan Penelitian Rancangan penelitian yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah rancangan acak lengkap. Rancangan eksperimental menggunakan Randomized Post Test Only Control Group Design. Populasi dan Sampel Populasi dalam penelitian ini adalah mencit balb/c. Sedangkan sampel penelitian adalah mencit balb/c betina, berumur 2 bulan, dengan berat badan 20-30 gram (Malole, 1989). Kultur Sel Limfosit Limfosit normal sapi bali diperoleh dari Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) yang kemudian disentrifugasi sehingga didapatkan endapan limfosit. Endapan limfosit normal ditambahkan media DMEM yang mengandung 10% FCS, 2 mg ConA dan IL-2. Kultur ini diinfeksikan JDV yang diperoleh dari sel limfosit terinfeksi JDV dari limpa pada demam hari kedua pasca inokulasi. Suspensi sel dimasukkan ke dalam biakan sel 96 sumuran dan diinkubasikan pada inkubator CO2 5% pada suhu 37oC. Identifikasi protein JDV dari sel limfosit terinfeksi pada kultur sel dilakukan dengan uji Westernimmunoblotting. 58
Jurnal Veteriner Juni 2009
Vol. 10 No. 2 : 57-62
sitoplasma sel tidak terinfeksi JDV ditemukan berwarna transparan dengan nukleus berwarna ungu kebiruan. Uji westerimmunoblotting menggunakan antibodi monoklonal, endapan medium kultur PBMC dan plasma sapi bali terinfeksi JDV teridentifikasi protein dengan berat molekul 16 kDa dan 26 kDa. Sedangkan dengan menggunakan antibodi poliklonal, dari medium kultur PBMC dan endapan plasma sapi bali terinfeksi JDV, teridentifikasi protein dengan berat molekul 16 kDa, 21,5 kDa, 26 kDa, 29,7 kDa, 40 kDa, dan 50 kDa.
Nilai Absorban Antibodi Mencit balb/c dengan ELISA Pemeriksaan Enzym Linked Immunosorbent Assay (ELISA) dilakukan dengan cara : melapisi lempengan sumuran dengan antigen Ca JDV. Dilakukan bloking dengan susu 3%, ditambahkan serum, antimouse IgG yang dilabel dengan enzim horseradish peroxidase dan antibodi monoklonal terhadap antigen Ca JDV serta terakhir ditambahkan substrat TMB. Reaksi dihentikan dengan penambahan asam asetat 10%. Pemeriksaan ELISA dibaca dengan ELISA Reader/Titertek Multiskan/Biorad 550 menggunakan filter dengan panjang gelombang 405 nm.
2.
Respon Kekebalan Humoral Mencit Balb/c yang Divaksinasi dengan Vaksin Limpa dan Vaksin Kultur Terhadap Protein Ca Virus Penyakit Jembrana Nilai absorban antibodi mencit balb/c yang divaksinasi dengan vaksin limpa dan vaksin kultur penyakit Jembrana dilakukan dengan uji (ELISA), menggunakan protein Ca. Reaksi biokimia dari uji ELISA ini adalah reaksi warna, dimana reaksinya memperlihatkan warna biru jika terjadi reaksi enzim dengan substrat (Gambar 1).
Perbandingan Nilai Absorban Antibodi Vaksin Limpa dan Vaksin Kultur terhadap Protein Ca Untuk membandingkan nilai absorban antibodi mencit balb/c yang divaksinasi dengan vaksin limpa dan vaksin kultur penyakit Jembrana terhadap protein Ca dilakukan dengan uji t (Sugiyono, 2007) dan analisis univariat (Trihendradi, 2005).
Tabel 1. Nilai absorban antibodi terhadap antigen Ca,JDV pada mencit balb/c yang divaksinasi dengan vaksin limpa dan vaksin kultur penyakit Jembrana
HASIL DAN PEMBAHASAN 1. Karakteristik Kultur Limfosit yang Terinfeksi JDV pada Media Kultur Untuk melihat pertumbuhan sel limfosit, limfosit sapi bali normal yang ditumbuhkan pada media RPMI-1640 yang mengandung concanavalin A sebagai mitogen. Dalam penelitian ini ditemukan bahwa terjadi pertumbuhan dengan cepat. Pertumbuhan sel tersebut dapat dipertahankan dengan mengganti Con-A dengan IL-2 konsentrasi 5 unit per meliliter medium. Morfologi limfosit yang ditumbuhkan dengan cara tersebut tampak sedikit berubah dengan munculnya sel berbentuk lonjong dan berukuran yang lebih besar dari normal. Sampai hari ke 21 pasca koinfeksi tidak ditemukan adanya efek sitopatik pada kultur, ditandai dengan sel-sel limfosit dalam pertumbuhan masih rapat dan sel yang berinti banyak. Jumlah sel-sel limfosit terinfeksi yang terhitung pada kultur sel limfosit adalah 57,43%. Sedangkan sel-sel limfosit terinfeksi JDV pada limpa sebesar 9,5%. Hasil penelitian dengan uji imunoperoksidase menggunakan antigen Ca, yang sudah dikarakterisasi, ditemukan sitoplasma sel limfosit sapi bali terinfeksi JDV berwarna coklat dan nukleus berwarna ungu. Sedangkan 59
Mencit
Vaksin limpa Ca
Vaksin kultur Ca
M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 X x K(+) K(-) Blank
0,377 0,123 0,274 0,148 0,094 0,036 0,099 0,125 0,226 0,086 0,065 0,489 0,094 0,037 0,078 0,088 2,44 0,15 2,29 0,08 0,15
0,203 0,090 0,253 0,503 0,692 0,069 0,058 0,402 0,098 0,089 0,048 0,113 0,043 0,211 0,025 0,060 2,95 0,18 2,29 0,08 0,15
Widiyanti etal
Jurnal Veteriner
Gambar 1. Contoh hasil ELISA serum mencit balb/c yang divaksinasi terhadap antigen Ca. Keterangan : Lubang sumuran 1 : Blanko Lubang sumuran 2 : Kontrol positif (dari hiperimun sapi) Lubang sumuran 3 : Kontrol negatif (mencit tanpa vaksinasi) Lubang sumuran 4 : Serum mencit balb/c yang divaksinasi Nilai absorban antibodi mencit balb/c dibaca menggunakan ELISA Reader Type Model 550 dengan panjang gelombang 405 nm. Rata-rata nilai absorban antibodi mencit balb/c yang divaksinasi dengan vaksin limpa terhadap antigen Ca penyakit jembrana, adalah sebesar 0,15. Sedangkan rata-rata nilai absorban antibodi menggunakan vaksin kultur terhadap antigen Ca sebesar 0,18 (Tabel 1) Uji ELISA menunjukkan bahwa hewan coba mencit balb/c mampu membentuk antibodi terhadap JDV. Dari penelitian Wilcox et al., (1993), Kertayadnya et al., (1993), dan Chadwick et al., (1995) didapatkan bahwa salah satu sifat JDV sulit hidup pada hewan percobaan kecil dan tidak membunuh mencit. Tetapi dalam penelitiannya tidak meneliti apakah terbentuk antibodi pada hewan percobaan kecil yang terinfeksi JDV. Dari uji t menurut Sugiyono (2007), ratarata nilai absorban antibodi mencit yang divaksinasi dengan vaksin limpa penyakit Jembrana terhadap antigen Ca sebesar 0,152, dengan S12= 0,0163. Sedangkan rata-rata nilai absorban antibodi mencit yang divaksinasi dengan vaksin kultur penyakit jembrana terhadap antigen Ca sebesar 0,185, dengan S12= 0,0368, dengan varian sebesar 2,2576. Dengan uji t, t hitung (0,405) < t tabel 5% (2,042) sehingga
tidak terdapat perbedaan yang signifikan nilai absorban antibodi mencit balb/c yang divaksinasi dengan vaksin limpa dan vaksin kultur terhadap antigen Ca JDV. Analisa univariat pada mencit balb/c yang divaksinasi dengan vaksin limpa dan vaksin kultur terhadap antigen Ca JDV juga menunjukkan perbedaan yang tidak bermakna (p>0,05). Menurut Sullivan et al., (1998); dan Kortrikis et al., (1996) bahwa antibodi terhadap HIV-1 dapat meningkatkan replikasi virus dalam model sel kultur. Dalam penelitian ini diperoleh hasil nilai absorban antibodi yang tidak berbeda nyata antara mencit yang divaksinasi dengan vaksin limpa dan vaksin kultur. Ini dimungkinkan karena dilihat dari struktur JDV dan patogenesisnya pada waktu menginfeksi sel, antigen yang terluar adalah surface unit (SU). SIMPULAN Respon antibodi antikapsid yang ditimbukan vaksinasi dengan vaksin kultur sama dengan vaksin limpa. Vaksin kultur mampu menggertak antibodi antikapsid dengan titer setara dengan yang ditimbulkan vaksin limpa. 60
Jurnal Veteriner Juni 2009
Vol. 10 No. 2 : 57-62
Cui Y, Golob J, Kelleher E, Ye Z, Pardoll D, Cheng L. 2002. Targeting Transgene Expression to Antigen-Presenting Cells Derived from Lentiviruses Transduced Engrafting Human Hemapoietic Stem/ Progenitor Cells. American Society of Hematology : 99 (2) : 399-408 Darmadja D. 1981. Masalah Peningkatan Potensi Produksi Ternak Sapi di Indonesia. Pidato Pengukuhan Jabatan Guru Besar Dalam Ilmu Produksi Ternak. Denpasar : Universitas Udayana Dharma DN, Putra AAG. 1997. Penyidikan Penyakit Hewan. Denpasar. CV Bali Media Adhikarsa. Hartaningsih N, Tenaya IWM, Agustini NLP. 2000. Infeksi Dua Lentivirus Pada Populasi Sapi Bali. Bull. Vet. BPPH Wilayah VI. 56 (12): 2-4 Keddie JR. 1990. Safety in the Use of Animal Models for AIDS. Elsevier Pub B.V (Biomedical Division). Kertayadnya G, Wilcox GE, Soeharsono S, Hartaningsih N, Coelen RJ, Cook RD, Collins ME, Brownlie J. 1993. Characteristics of a Retrovirus Associated with Jembrana Disease in Bali Cattle. J Gen. Virol. 74 : 1765-1773 Kostrikis LG, Cao Y, Ngai H, Moore JP, Ho DD. 1996. Quantitative Analysis of Serum Neutralization of Human Immunodeficiency Virus Type 1 from Subtypes A,B,C,D,E,F and I: Lack of Direct Correlation Between Neutralization Serotypes and Genetic Subtype and Evidence for Prevalent SerumDependent Infectivity Enhancement. J Virol. 70 : 445-458 Kong X, Hellermann GR, Patton G, Kumar M, Behera A, Randall TS, Zhang J, Lockey RF, Mohapatra SS. 2005. An Immunocompromised Balb/c Mouse Model for Respiratory Syncytial Virus Infection. J Virol 2. (3). Launay O, Sinet M, Varlet P, Pocidalo JJ. 1990. Mouse Model of Retroviral Infection : Early Combination Therapy of Azidothymidine with Synthetic Double-Stranded RNA (Poly I) (Poly C). Elsevier Sci.Pub. (Biomedical Division). Newel DG, McBride BW, Clark SA. 1988. Making Monoclonals : Salisbury. The Laverham Press
SARAN Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk mengetahui respon kekebalan humoral mencit balb/c yang divaksinasi dengan vaksin limpa dan vaksin kultur terhadap antigen yang lain. UCAPAN TERIMAKASIH Penulis mengucapkan terima kasih kepada ACIAR, Balai Besar Veteriner (BBVet) Denpasar, dan semua pihak yang telah membantu sehingga terlaksananya penelitian ini. DAFTAR PUSTAKA Abbas AK, Lichtman AH, Pober JS. 2000. Cellular and Molecular Immunology. 4th . ed. USA : W.B. Saunders Company Astawa NM, Hartaningsih N, Dharma DMN, Tenaya WM, Budiantono dan Ekaana, W. 2005. Replikasi Virus Penyakit Jembrana pada Kultur Limfosit Darah Tepi Asal Sapi Bali. J Vet. 6 (4) : 132-142. Astawa NM, Hartaningsih N, Agustini LP, Tenaya WM, Berata K, Widiyanti LPM. 2006. Detection of Jembrana Disease Viral Antigen in Peripheral Blood Lymphocytes by Monoclonal Antibodies. Media Kedokteran Hewan. 22 : (3) Barboni P, Thompson I, Brownlie J, Hartaningsih N, Collins ME 2001. Evidence for the Presence of Two Bovine Lentiviruses in the Cattle Population of Bali. Vet.Microbiol. 80 :313-327 Chadwick BJ, Coelen RJ, Samuels LM, Kertayadnya G, Wilcox GE. 1995. Genomic Sequence Analysis Identifies Jembrana Disease Virus as a New Bovine Lentivirus. J Gen Virol. 76 (1): 189-192 Chadwick BJ, Desport M, Dharma DMN, Brownlie J, Wilcox GE. 1996. Detection of Jembrana Disease Virus in Paraffinembedded Tissue Sections by In Situ Hybridization. In Wilcox GE, Soeharsono S, Darma DMN, Copland JW. 1997. ACIAR Proceeding : 75: 66-71 Copland J. 1996. Bali Cattle : Origins in Indonesia. In Wilcox GE, Soeharsono S, Darma DMN, Copland JW . 1997. :ACIAR Proseeding. 75:29-33.
61
Widiyanti etal
Jurnal Veteriner
Ramachandran S. 1981. Final Report to the Project Manager UNDP/FAO Project : Strengthening of Animal Health Services in the Eastern Island of Indonesia, bali Indonesia. Soeharsono S, Hartaningsih N, Soetrisno M, Kertayadnya G, Wilcox GE. 1990. Studies of Experimental Jembrana Disease in Bali Cattle. Transmission and Persistence of the Infectious Agent in Ruminant and Pigs, and Resistance of Recovered Cattle to Reinfection. J Comparative Pathol. 103 : 61-69 Soeharsono S, Putra AA, Hartaningsih N, Sulistyana K, Tenaya M, Wilcox GE. 1996. The Transmission and Persistence of Jembrana Disease Virus in Cattle. In Wilcox GE, Soeharsono S, Darma DMN, Copland, JW. 1997: 75: 76-78.ACIAR Proceeding
Sugiyono. 2007. Statistika untuk Penelitian. Bandung : Alfabeta Sullivan N, Sun Y, Li J, Hofmann W, Sodroski J. 1995. Replicative Function and Neutralization Sensitivity of Envelope Glycoproteins from Primary and T-Cell LinePassaged Human Immunodeficiency Virus Type 1 Isolates. J Virol. 69 : 4413-4422 Teuscher E, Ramachandran S., harding HP. 1981. Observation on the Pathology of Jembrana Disease in Bali Cattle. Zentralbalt fuer Veterinaermedizin Reihe A. 28. 608-622 Wilcox GE, Kertayadnya G, Hartaningsih N, Dharma DMN, Soeharsono S, Robertson T. 1992. Evidence for Viral Aetology of Jembrana Disease in Bali Cattle. Vet Micrbiol. 33 : 367-374
62
