POTENSI ISOLAT BAKTERI SELULOLITIK UNTUK PRODUKSI DEKOMPOSER
SKRIPSI
Disusun Oleh : Dharma Sabaya (062108015)
PROGAM STUDI KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PAKUAN 2012
POTENSI ISOLAT BAKTERI SELULOLITIK UNTUK PRODUKSI DEKOMPOSER
SKRIPSI
Diajukan sebagai salah satu syarat mencapai gelar Sarjana Sains pada Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pakuan, Bogor
Disusun Oleh : Dharma Sabaya (062108015)
PROGAM STUDI KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PAKUAN 2012
DHARMA SABAYA. 062108015. 2012. Potensi Isolat Bakteri Selulolitik Untuk Produksi Dekomposer.
Dibawah bimbingan
Dr. Tri Panji, MS
dan Ir. Suharyanto, M.Si
RINGKASAN
Bioetanol dapat diproduksi dari limbah lignoselulosa melalui pemecahan limbah tersebut oleh enzim selulase menjadi gula sederhana yang dilanjutkan dengan fermentasi. Teknologi bioetanol generasi kedua (G-II) ini mampu meningkatkan nilai tambah limbah. Di samping itu, mikroba penghasil selulase dapat dimanfaatkan untuk mempercepat proses pengomposan. Tujuan penelitian ini adalah untuk memperoleh isolat bakteri selulolitik potensial untuk mempercepat proses dekomposisi limbah lignoselulosa jerami padi. Pada penelitian ini, isolat berasal dari jerami padi dan tanah bambu yang diisolasi dan dimurnikan , serta kemampuan isolat dalam mendegradasi selulosa diuji menggunakan medium Cellulose Congo Red Agar (CCRA). Aktivitas enzim dalam mendegradasi selulosa diuji dengan metode asam dinitrosalisilat (DNS). Sebanyak 1,5kg jerami padi diinkubasi dengan 5% inokulan. Variasi isolat yang diaplikasikan adalah isolat DDH92, isolat JP72, dan air steril sebagai kontrol, dengan waktu inkubasi selama 10, 20, dan 30 hari. Analisi yang dilakukan meliputi pengujian kadar selulosa dan rasio C/N pada waktu inkubasi 30 hari. Hasil penelitian menunjukkan bahwa isolat bakteri selulolitik DDH92 dari kelompok Actinomycetes ini mampu menghasilkan selulase dengan aktivitas tertinggi sebesar 50,675x10-3 Unit/mL Pemanfaatan bakteri ini untuk untuk mempercepat pengomposan jerami padi berhasil mempercepat penurunan C/N rasio menjadi sebesar 19,38 selama
30 hari, lebih cepat dibandingkan hasil
penelitian sebelumnya yang membutuhkan waktu hingga 6 minggu.
Kata Kunci : Bakteri selulolitik, enzim selulase, bakteri actinomycetes, bioetanol G-II, pengomposan limbah.
DHARMA SABAYA. Microbes
for the
062108015. 2012. The Potential of isolates Cellulolytic
Production
of
Decomposers.
Under
the Direction of
Dr. Tri Panji, MS and Ir. Suharyanto, M.Si
SUMMARY
Bioethanol can be produced from lignocellulosic waste through waste breakdown by cellulase enzymes into simple sugars followed by fermentation. This second generation bioethanol technology (G-II) is able to increase the valueadded waste. In addition, cellulase-producing microbes can be used to speed up the composting process. The purpose of this study was to obtain cellulolytic bacterial isolates potential to accelerate the decomposition process of waste rice straw lignocellulose. In this study, isolates derived from rice straw and bamboo ground was isolated and purified, and the capability of isolates to degade cellulose was tested using the medium of Cellulose Congo Red Agar (CCRA). Enzyme activity in degading cellulose was tested with dinitrosalycilic acid (DNS). A total of 1.5 kg of rice straw was incubated with 5% inoculant. Various isolates applied were isolate DDH92, isolate JP72, and sterile water as a control with the incubation time of 10, 20, and 30 days. The analyses included levels of cellulose and C/N ratio in the incubation time of 30 days. The results showed that cellulolytic bacterial isolates DDH92 of Actinomycetes goup was capable of producing highest cellulase activity of 50.675 x10-3 Units/mL Utilization of these bacteria to speed up the composting of rice straw to successfully accelerate the decline in C/N ratio to be 19.38 for 30 days, faster than the result of research before that takes up to 6 weeks.
Keywords : cellulolytic bacteria, cellulase enzymes, actinomycetes bacteria, bioethanol G-II, composting waste.
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas rahmat dan pertolongan-Nya, dalam menyelesaikan Skripsi dengan judul
“Potensi Isolat
Bakteri Selulolitik Untuk Produksi Dekomposer”. Skripsi ini disusun berdasarkan penelitian yang dilakukan di Laboratorium Mikroba dan Bioproses Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia di Jalan Taman Kencana No.1 Bogor Jawa Barat. Skripsi ini disusun sebagai kelengkapan salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana sains, Progam Studi Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pakuan Bogor. Penulis menyadari bahwa Skripsi ini jauh dari sempurna, oleh karena itu penulis mengharapkan saran dan masukan untuk penyempurnaan Skripsi ini. Akhirnya penulis berharap agar Skripsi ini bermanfaat bagi semua pihak. Pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada : 1. Bapak Dr. Darmono Taniwiryono, M.Sc. selaku Kepala Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia. 2. Ibu Dr. Prasetyorini, MS selaku Dekan Fakultas MIPA Universitas Pakuan Bogor. 3. Bapak Drs. Husain Nashrianto, M.Si selaku Ketua Jurusan Progam Studi Kimia FMIPA Universitas Pakuan Bogor. 4. Ibu Ade Heri Mulyati, M.Si selaku Sekretaris Jurusan Progam Studi Kimia FMIPA Universitas Pakuan Bogor. 5. Bapak Dr. Tri Panji, MS selaku Pembimbing I yang telah memberikan saran dalam pembuatan makalah rencana tugas akhir ini. 6. Bapak Ir. Suharyanto, M.Si selaku Pembimbing II yang telah berkenan membimbing dan memberikan saran dalam proses penelitian dan pembuatan makalah rencana tugas akhir ini. 7. Kak Haryo, kak Deden, Bu Ida, Mbak Ning, Mbak Uchi, Mbak Wulan, Mbak devi, Pak Ari, Pak Mustari, Pak Jumino, dan Pak Latief yang telah membimbing saat berjalannya penelitian ini. 8. Orang tua tercinta yang selalu memberikan dukungan moril dan materiil. 9. Kakak-kakak dan adik tercinta yang telah memberikan dukungan. i
10. Teman-teman kimia 2008 yang telah berjuang bersama-sama (Novi, Agung, Oskar, Zaenal, Amen, Deo, Shelvi, Dea, Tiar, Siska, Retno, Anggun, Kania, Desi, Giya, dan Icha).
Bogor , November 2012
Dharma S
ii
DAFTAR ISI KATA PENGANTAR ............................................................................................ i DAFTAR ISI ......................................................................................................... iii DAFTAR TABEL ................................................................................................. v DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ vi DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... vii PENDAHULUAN .................................................................................................. 1 1.1 Latar Belakang .............................................................................................. 1 1.2 Tujuan Penelitian .......................................................................................... 2 1.3 Manfaat Penelitian ........................................................................................ 2 1.4 Hipotesis........................................................................................................ 2 TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................................ 3 2.1 Jerami Padi .................................................................................................... 3 2.2 Lignoselulosa ................................................................................................ 4 2.2.1 Selulosa .................................................................................................. 4 2.2.2 Hemiselulosa .......................................................................................... 5 2.2.3 Lignin ..................................................................................................... 6 2.3 Manfaat Dekomposisi Lignoselulosa ............................................................ 7 2.3.1 Proses Pembuatan Pupuk Organik/ Kompos ........................................ 7 2.3.2 Proses Pembuatan Bioetanol Generasi Kedua ....................................... 9 2.4 Mikroorganisme Pendegadasi Selulosa (Bakteri Selulolitik) ..................... 10 2.5 Enzim Selulase ............................................................................................ 10 2.6 Spektrofotometer ......................................................................................... 12 METODE KERJA .............................................................................................. 15 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ..................................................................... 15 3.2 Alat dan Bahan ............................................................................................ 15 iii
3.3 Isolasi Bakteri Pendegadasi Selulosa .......................................................... 15 3.4 Pemurnian Kultur ........................................................................................ 16 3.5 Uji Kapasitas Hidrolisis Selulosa ................................................................ 16 3.6 Aktivitas Enzim Selulase ............................................................................ 17 3.7 Hidrolisis Selulosa Jerami Padi ................................................................... 17 3.8 Analisis Kadar Selulosa .............................................................................. 18 3.9 Preparasi Dan Analisis Rasio C/N Contoh ................................................. 18 3.9.1 Penetapan Kadar C-Organik ................................................................ 19 3.9.2 Penetapan Kadar N (Nitrogen) ............................................................. 19 HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................... 21 4.1 Isolasi Bakteri.............................................................................................. 21 4.2 Uji Degadasi Semi Kuantitatif .................................................................... 22 4.3 Analisis Kompos Jerami Padi ..................................................................... 23 4.3.1 Bobot .................................................................................................... 23 4.3.2 Tinggi ................................................................................................... 24 4.3.3 Kadar Selulosa ..................................................................................... 24 4.3.4 Kadar Lignin ........................................................................................ 25 4.4 Aktivitas enzim selulase .............................................................................. 26 4.5 Rasio C/N .................................................................................................... 27 KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................................... 29 5.1 Kesimpulan ................................................................................................. 29 5.2 Saran ............................................................................................................ 29 DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 30
iv
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Kandungan Lignoselulosa Pada Limbah Pertanian ................................ 4 Tabel 2. Jenis-Jenis Enzim Selulase...................................................................... 11 Tabel 3. Morfologi Koloni .................................................................................... 21 Tabel 4. Hasil Uji Penurunan Bobot Jerami Padi Setelah Inkubasi Selama 30 hari ..................................................................................................... 23 Tabel 5. Rasio C/N Dengan Variasi Inokulan....................................................... 28
v
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Jerami Padi .......................................................................................... 3 Gambar 2. Struktur Selulosa ................................................................................. 5 Gambar 3. Mikrofibril Selulosa ............................................................................ 5 Gambar 4. Produk Nilai Tambah Dari Bahan Lignoselulosa ............................... 7 Gambar 5. Proses Pembuatan Bioetanol di IOGEN Corporation ......................... 9 Gambar 6. Skema Mekanisme Degadasi Selulosa Oleh Enzim Selulase ............. 12 Gambar 7. Penurunan Tinggi Penumpukan Jearmi Padi ...................................... 24 Gambar 8. Penurunan Kadar Selulosa Selama 30 Hari......................................... 25 Gambar 9. Penurunan Kadar Lignin Selama 30 Hari ........................................... 26 Gambar 10. Aktivitas Enzim Selulase Umur 30 Hari ........................................... 27
vi
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Diagam Alir Penelitian ..................................................................... 34 Lampiran 2. Diagam Alir Pengenceran Bertingkat ............................................... 35 Lampiran 3. Diagam Alir Proses Metode Kuadran 4 goresan .............................. 36 Lampiran 4. Diagam Alir Proses Pembuatan NA miring ..................................... 37 Lampiran 5. Diagam Alir Hidrolisis Selulosa ....................................................... 38 Lampiran 6. Diagam Alir Proses Uji Aktivitas Enzim Selulase ........................... 39 Lampiran 7. Tabel Rasio HC ................................................................................ 40 Lampiran 8. Perhitungan Penurunan Bobot Jerami Padi ...................................... 41 Lampiran 9. Contoh Perhitungan Kadar Selulosa ................................................. 42 Lampiran 10. Contoh Perhitungan Kadar Lignin .................................................. 43 Lampiran 11. Contoh Perhitungan Aktivitas Enzim Selulase............................... 44 Lampiran 12. Contoh Perhitungan Kadar C-organik ............................................ 45 Lampiran 13. Contoh Perhitungan Kadar N (Nitrogen) ....................................... 46 Lampiran 14. Hasil Analisis Rasio C/N Dekomposisi Jerami Padi ...................... 47 Lampiran 15. Gambar Hasil Penelitian ................................................................. 48
vii
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi dalam bidang perkebunan dan pertanian meningkatkan produk yang menyebabkan tingginya hasil limbah seperti jerami padi. Jerami padi belum dinilai sebagai produk yang memiliki nilai ekonomis. Pada sistem usaha tani yang intensif, jerami sering dianggap sebagai sisa tanaman yang mengganggu pengolahan tanah dan penanaman padi. Oleh karena itu, 75-80% petani membakar jerami di tempat. Tujuan utama petani membakar jerami adalah untuk menyingkirkan jerami dari petakan sawah dengan cara yang praktis. Perhitungan untung rugi atas tindakan pembakaran jerami belum dipertimbangkan. Pembakaran jerami dapat meningkatkan suhu udara dipermukaan tanah mencapai 700oC, sehingga dapat memusnahkan mikroba yang berguna dalam proses biologis. Jerami padi memiliki komponen utama lignoselulosa sehingga sukar didegadasi. Lignoselulosa adalah bahan organik di alam yang berlimpah dan terdiri dari tiga tipe polimer, yaitu selulosa, hemiselulosa dan lignin. Ketiganya membentuk suatu ikatan kimia yang kompleks yang menjadi bahan dasar dinding sel tumbuhan. Selulosa merupakan polimer linier dari D-glukosa yang terikat pada ikatan 1,4 glikosidik dan sangat erat berasosiasi dengan hemiselulosa dan lignin. Hemiselulosa merupakan salah satu penyusun dinding sel tumbuhan yang terdiri dari kumpulan beberapa unit gula/heteropolisakarida dan dikelompokkan berdasarkan residu gula utama sebagai penyusunnya seperti xilan, mannan, galactan dan glucan (Fengel dan Wegener, 1995). Hemiselulosa mempunyai berat molekul rendah dibandingkan dengan selulosa dan terdiri dari D-xilosa, Dmannosa, D-galaktosa, D-glukosa, L-arabinosa, 4-0-metil glukoronat, Dgalakturonat dan asam D-glukoronat (Perez et al., 2002). Lignin merupakan polimer aromatik yang berasosiasi dengan polisakarida pada dinding sel sekunder tanaman. Pada umumnya, lignin mengandung tiga jenis alkohol aromatik yaitu coniferyl, sinapyl dan p-coumaryl (Howard et al., 2003). 1
.
2
Sejalan dengan perkembangan bioteknologi dan kekayaan Indonesia akan sumber daya hayati, pemanfaatan mikroba dalam proses biokonversi limbah lignoselulosa dapat dilakukan guna mendapatkan nilai tambah menjadi produk lain seperti pupuk dan bioetanol. Proses hidrolisis selulosa dilakukan dengan bantuan bakteri selulolitik secara enzimatik. Proses hidrolisis ini lebih disukai karena ramah lingkungan walaupun laju hidrolisisnya rendah. Tanah merupakan habitat yang didominasi oleh mikroorganisme seperti bakteri, fungi, alga dan protozoa. Kualitas dan kuantitas mikroba tersebut mempengaruhi kesuburan tanah karena beberapa mikroba berperan sebagai dekomposer. Penelitian mengenai potensi bakteri selulolitik sangat penting dilakukan, karena mikroba penghasil enzim selulase menawarkan potensi yang besar di bidang penanganan limbah selulosa.
1.2 Tujuan Penelitian Memperoleh isolat bakteri selulolitik potensial untuk mempercepat proses dekomposisi limbah lignoselulosa dari jerami padi.
1.3 Manfaat Penelitian Mendapatkan isolat bakteri selulolitik yang potensial untuk produksi dekomposer. Diharapkan dekomposer yang diperoleh dapat diaplikasikan untuk hidrolisis selulosa menjadi glukosa dan etanol serta mempercepat pengomposan jerami padi.
1.4 Hipotesis Isolat bakteri selulolitik terpilih mampu mempercepat proses dekomposisi jerami padi.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
Perkembangan dalam bidang pertanian dan perkebunan di Indonesia menimbulkan peningkatan residu tanaman. Residu tanaman ini sebagian besar menghasilkan produk sampingan yang mengandung lignoselulosa. Produk samping tanaman seperti jerami padi, serasah kacang tanah, serasah jagung dan sabut kelapa sangat berperan sebagai sumber hara dan dijadikan sebagai bahan organik dan berpotensi sebagai salah satu sumber energi melalui proses konversi, baik proses fisika, kimia maupun biologis.
2.1 Jerami Padi Jerami padi adalah bagian vegetatif dari tanaman padi (batang, daun, tangkai malai), pada waktu tanaman padi dipanen, jerami adalah bagian tanaman yang tidak diambil. Jerami merupakan golongan kayu lunak yang mempunyai komponen utama lignoselulosa. Selulosa adalah serat polisakarida yang berwarna putih yang merupakan hasil dari fotosintesis tumbuh - tumbuhan. Jumlah kandungan selulosa dalam jerami antara 35 - 40 %.
Gambar 1. Jerami Padi
3
4
Tabel 1. Kandungan lignoselulosa pada limbah pertanian (Howard et al., 2003) Bahan lignoselulosa
Selulosa (%)
Hemiselulosa (%)
Tangkai kayu keras
40-55
24-40
18-25
Tangkai kayu lunak
45-55
25-35
25-35
Kertas
85-99
0
0-15
30
50
15
32,1
24
18
60
20
20
Daun
15-20
80-85
0
Bagas segar
33,4
30
18,9
Rumput
25-40
25-50
10-30
Jerami gandum Jerami padi Buangan sampah
Lignin (%)
2.2 Lignoselulosa Lignoselulosa
merupakan
komponen
utama
tanaman
yang
menggambarkan jumlah sumber bahan organik yang dapat diperbaharui. Lignoselulosa terdiri dari selulosa, hemiselulosa, lignin dan beberapa bahan ekstraktif lain. Semua komponen lignoselulosa terdapat pada dinding sel tanaman.
2.2.1 Selulosa Selulosa adalah polisakarida yang mempunyai fungsi sebagai unsur struktural pada dinding sel tumbuhan tingkat tinggi. Selulosa berbentuk serabut, liat, tidak larut di dalam air, dan ditemukan terutama pada bagian berkayu pada tumbuhan sekitar 40-45%. Selulosa merupakan bahan kimia organik yang memiliki berat molekul tinggi dan polimer yang tidak bercabang yang terdiri dari 100-14.000 monosakarida atau lebih (Lehninger, 1982). Ikatan β(1→4) glikosida yang berbentuk linier dan mempunyai kecenderungan kuat membentuk ikatan hidrogen intra dan intermolekul (Lehninger, 1982).
5
Gambar 2. Struktur selulosa ( Lehninger, 1982).
Molekul selulosa tersusun dalam bentuk fibril. Pada kayu, fibril-fibril membentuk struktur kristal dibungkus oleh lignin. Lignin berperan sebagai pelindung selulosa dari serangan enzim pemecah selulosa (Judoamidjojo, 1989). Kumpulan fibril disebut mikrofibril, sedangkan kumpulan mikrofibril membentuk makrofibril. Bagian mikrofibril yang mengandung banyak ikatan hidrogen bersifat sangat kuat, tidak dapat ditembus oleh air dan disebut bagian kristalin. Bagian mikrofibril yang sedikit atau sama sekali tidak mengandung ikatan hidrogen disebut bagian amorf (Tsao et al., 1978 dalam Judoamidjojo, 1989).
Gambar 3. Mikrofibril selulosa ( Tsao et al., 1978 dalam Judoamidjojo, 1989).
2.2.2 Hemiselulosa Hemiselulosa adalah molekul bercabang yang hanya memiliki 150-200 monomer (Mulcahy, 1996). Hemiselulosa adalah polimer yang mirip dengan selulosa. Backbone (rangka utama) dari hemiselulosa adalah terbentuk dari ikatan β 1,4-D-pyranosyl dari unit penyususnnya.. Hemiselulosa mempunyai banyak cabang, secara umum dapat dikatakan bahwa hemiseluloasa merupakan polimer noncrystalline heteropolysaccharides. Komponen yang menyusun hemiselulosa adalah gula pentosa ( D-xylose, L-arabinose ), gula heksosa ( D-galactose, L
6
galactose, D-mannose, Lrhamnose,\ L-fucose ) dan asam uronik (Lglucomonic acid ) (Glazer dan Nikaido, 2007). Hemiselulosa adalah polimer polisakarida yang komplek, komposisi dan frekuensinya tergantung kepada jenis jaringan tanaman, jenis spesies dan tahapan pertumbuhan pada tanaman. Hemiselulosa tidak hanya ditemukan berupa xylan, namun juga ditemukan dalam jumlah yang banyak berupa glucomannans, galactomannans, arabinogalactans dan senyawa yang lain (Mulcahy, 1996).
2.2.3 Lignin Lignin merupakan fraksi non karbohidrat yang bersifat kompleks dan sulit dikarakterisaasi. Pada dasarnya lignin merupakan polimer aromatik heterogen dengan sistem jaringan yang bercabang serta tidak memiliki bentuk yang tetap (Mc Donald dan Franklin, 1969 dalam Enny, 2008). Pada saat dilakukan perlakuan dengan menggunakan suhu di atas 200°C, maka lignin akan mengalami degadasi menjadi senyawa partikel dengan ukuran yang kecil dan terlepasnya ikatan dengan selulosa (Tanahashi et al., 1983 dalam Palonen, 2004). Untuk mempermudah dalam mendegadasi lignin maka diperlukan delignifikasi. Delignifikasi adalah suatu proses dalam menghilangkan lignin yang dilakukan dengan menggunakan bahan kimia (Ahmed et al., 2001) sehingga terputusnya ikatan ester dalam makro molekul lignin. Telah ditemukan mikroorganisme yang dapat mendegadasi lignin dengan cepat dan telah disadari bahwa menggunakan bahan kimia dalam proses penghilangan lignin akan mengakibatkan limbah yang sangat berbahaya bagi lingkungan (Glazer dan Nikaido, 2007). Lignin tersusun oleh unit yang disebut dengan lignol, yang terdiri dari aryl propanol yang tersusun pada senyawa aromatik dan tiga karbon rantai karbon. Lignol secara struktural sangat berhubungan dengan asam amino phenylalanine dan tyrosin.
7
2.3 Manfaat Dekomposisi Lignoselulosa
Gambar 4. Produk nilai tambah dari bahan lignoselulosa (Mtui, 2009)
2.3.1 Proses Pembuatan Pupuk Organik/ Kompos Pupuk adalah zat atau unsur yang ditambahkan ke dalam tanah dengan maksud untuk menyuburkan tanah. Secara umum pupuk terbagi atas pupuk organik (pupuk kandang, pupuk kompos, pupuk hayati) dan pupuk anorganik (pupuk kimia, bahan sintetis). Pupuk organik menjadi salah satu alternatif untuk mengurangi penggunaan pupuk anorganik yang saat ini banyak digunakan petani. Pupuk organik dapat menyediakan semua unsur hara yang dibutuhkan oleh tanaman oleh karena itu bersifat multiguna. Pupuk yang bersifat ramah lingkungan ini dapat memperbaiki sifat fisika, biologi dan kimia tanah serta dapat meningkatkan kehidupan mikroba tanah yang merupakan sumber hara bagi tanaman. Beberapa jenis mikroba yang berperan dalam proses penyuburan tanah antara
lain
mikroba
pendegadasi
selulosa,
Azospirilum,
Lactobacillus,
Acetobacter, mikroba pelarut fosfat, mikroba penambat nitrogen, mikroba penghasil hormon pertumbuhan, mikroba penghasil metabolit sekunder dan mikroba yang mampu melakukan biotransformasi logam berat sehingga dapat menurunkan toksisitas pada lahan. Selain itu, jenis mikroba lain dari golongan
8
Actinomycetes juga berperan dalam proses pembuatan pupuk organik (Abdulla, 2007). Bahan lignoselulosa sangat potensial untuk bahan dasar pembuatan pupuk organik, disamping untuk bahan bakar, makanan ternak dan bahan pembuatan kertas (Singhania, 2009). Penggunaan limbah selulosa untuk produksi pupuk organik bertujuan untuk memberikan nitrogen dan berperan sebagai penggembur tanah (Malik et al., 2001). Kompos, adalah pupuk organik yang kaya nutrien dan bermanfaat sebagai penyubur tanah. Prosesnya merupakan hasil perombakan senyawa komplek menjadi senyawa sederhana dengan bantuan kombinasi mikroba yang terdiri dari bakteri, kapang, aktinomisetes dan cacing yang dapat meningkatkan nilai limbah lignoselulosa (Mtui, 2009). Pada proses pembuatannya, pH, suhu, struktur bahan yang digunakan akan menentukan populasi mikroba. Kompos yang banyak digunakan adalah kompos jerami padi. Bahan lignoselulosa dapat digunakan sebagai sumber C bagi organisma lignoselulolitik. Disamping unsur hara yang tersedia, organisma dapat menghasilkan C sederhana dalam proses metabolisma yang dapat digunakan sebagai bahan baku pupuk organik (Widiastuti et al., 2009). Kandungan hara kompos jerami padi terdiri dari ratio C/N 18,88, C organik (%) 35,11, N (%) 1,86, P O (%) 0,21, K O (%) 5,35, kadar air (%) 55. (Isroi, 2010). Pemanfaatan jerami 2
5
2
padi sebagai pupuk organik diantaranya memiliki kandungan C organik yang tinggi, kandungan bahan organik tanah dapat dinaikkan dan kesuburan tanah dapat dikembalikan dengan pemakaian kompos jerami padi secara konsisten. Parameter standar mutu pupuk organik menurut Menteri Pertanian No.06/Permentan/SR.130/2/2011, terdiri dari C organik, C/N ratio, bahan ikutan (plastik, kaca, kerikil), kadar air, kadar logam berat (As, Hg, Pb, Cd), pH, kadar total (N, P O , K O), mikroba patogen (E. coli, Salmonella), mikroba fungsional, 2
5
2
ukuran butiran dan unsur mikro (Fe, Mn, Cu, Zn, B, Co, Mo). Persyaratan teknis mutu pupuk organik meliputi ganula/pelet, cair/pasta dan remah/curah. C organik dan C/N ratio merupakan parameter utama pupuk organik. C organik terdiri atas ganula/ pelet baik yang murni maupun yang diperkaya mikroba sebesar > 12%, cair/ pasta sebesar ≥ 4% dan remah/ curah baik yang murni maupun yang
9
diperkaya mikroba sebesar ≥ 12%. C/N ratio murni dan yang diperkaya mikroba baik ganula/pelet maupun remah/curah masing masing sebesar 15-25%.
2.3.2 Proses Pembuatan Bioetanol Generasi Kedua Fibre Pretreatment Enzymatic hidrolysis Separation Power generation Fermentation Distilation
Electricity
Bioethanol G2 Gambar 5. Proses pembuatan bioetanol di IOGEN Corporation. Iogen Corporation merupakan perusahaan yang berasal dari kanada yang memproduksi bioetanol generasi kedua. Bahan yang digunakan untuk pembuatan bioetanol adalah limbah lignoselulosa \ serat. sebelum tahap hidrolisis enzimatis, dilakukan tahap pretrearment, yaitu meningkatkan luas permukaan dan aksesbilitas dari serat tanaman untuk enzim dengan proses ledakan uap. Tahap hidrolisis enzimatis merupakan tahap konversi tinggi selulosa menjadi glukosa. Tahap separation merupakan tahap penggunaan lignin untuk menghasilkan tenaga untuk menjalankan fasilitas dan C5 dan C6 gula sederhana difermentasikan menjadi etanol. Hasil fermentasi etanol kira-kira menghasilkan etanol 3% sehingga perlu didestilasi. Etanol dari selulosa mengurangi gas rumah kaca dibandingkan dengan bahan bakar fosil seperti bensin serta mengurangi ketergantungan bahan bakar fosil.
10
2.4 Mikroorganisme Pendegadasi Selulosa (Bakteri Selulolitik) Bakteri selulolitik merupakan bakteri yang dapat mendegadasi selulosa. Beberapa bakteri pendegadasi selulosa adalah bakteri mesofilik dan termofilik aerobik (Cellumonas sp, celvibrio sp, Microbispora bispora, Thermomonospora sp), bakteri mesofilik dan termofilik anaerobik (Acentivibrio cellulolyticus, Bacteriodes cellulosolvent, Bacteriodes succinogenes, Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens dan Clostridium termocellum). Bakteri pendegadasi selulosa termofil dapat menghasilkan enzim selulase yang relatif stabil (tahan pada kondisi asam atau basa dan pada suhu tinggi hingga 90°C) (Bhat dan Bhat, 1997). Bakteri selulolitik sering diisolasi dari tanah yang mengandung seresah daun. Hal ini disebabkan karena tanah mengandung bahan organik yang relatif kaya dan terdapat seresah daun dengan kandungan polisakarida yang relatif komplek. Kondisi tersebut menyebabkan tanah dan seresah daun menjadi habitat yang baik untuk berbagai mikroorganisme (William dan Govind, 2003). Pada penelitian yang dilakukan oleh Hatami et al., (2008) diketahui bahwa jumlah bakteri yang berhasil diisolasi pada tanah hutan lebih banyak dibandingkan dengan yang berhasil diisolasi pada lahan pertanian. Dari total bakteri yang berhasil diisolasi juga diketahui bahwa jumlah total isolat bakteri pendegadasi selulosa lebih banyak dibandingkan dengan yang diisolasi dari lahan pertanian. Hal ini terjadi karena terdapat perbedaan material organik yang terdapat pada hutan dan lahan pertanian. Hutan memiliki keanekaragaman material organik yang lebih tinggi dibandingkan dengan lahan pertanian.
2.5 Enzim Selulase Selulase adalah nama bagi semua enzim yang memutuskan ikatan glikosidik beta-1,4 di dalam selulosa, selobiosa, dan turunan selulosa lainnya. Di alam, enzim selulase ditemukan di berbagai ekosistem, terutama ditemukan pada proses dekomposisi serasah daun, hingga keadaan anaerobik pada rumenansia (Denman et al., 1996). Sistem enzim selulosa sangat penting karena berperan dalam mengubah selulosa menjadi gula sederhana. Enzim selulase merupakan system enzim yang
11
terdiri dari enzim Endoglukanase, Eksoglukanase, dan β- glukosidase (tabel 2). Enzim selulase adalah enzim yang dapat mengkatalisis dan menghidrolisis ikatan β 1-4 glukosidik pada selulosa (ikatan yang paling banyak di selulosa) (Bhat, 2000). Enzim endoglukanase (EC 3.2.1.4) terdiri dari satu jenis enzim yaitu 1,4D-glucan-4-glucanohydrolases (Bhat dan Bhat, 1997). Endoglucanases atau yang sering disebut dengan CM-cellulases (carboxymethylcellulose) atau Cx enzim, menghidrolisis secara acak ikatan pada serat selulosa (Wood, 1985). Hal ini mengakibatkan rantai polisakarida yang telah terpotong (oligosakarida) mempunyai panjang rantai yang berbeda-beda (Bhat, 2000). Hasil dari hidrolisis serat selulosa adalah glukosa, cellobiose, cellotriose, dan oligosakarida yang lebih tinggi (Wood, 1985). Cellobiohydrolyase yang sering disebut dengan eksoglukanase adalah enzim pendegadasi selulosa yang ditemukan pada mayoritas fungi yang dapat mendegadasi selulosa (Wood, 1985). eksoglukanase dapat menghidrolisis mikrokristalline namun tidak dapat menghidrolisis carboxymethylcellulose (Kim dan Kim, 1995). Enzim eksoglukanase (EC 3.2.1.91) terdiri dari 1,4- D-glucan glucanohydrolases (lebih dikenal dengan cellodextrinases) dan 1,4-D-glucan cellobiohydrolases (cellobiohydrolases). Enzim eksoglukanase adalah enzim yang aktif pada sisi crystalline selulosa (Mattinen, 1998). Tabel 2. Jenis-jenis enzim selulase (Bhat dan Bhat, 1997) Jenis enzim
Kode EC
Sinonim
Mekanisme reaksi
Endo-(1-4)-β-
EC
Endoselulase atau
-G-G-G-G
Dselulase
3.2.1.4
endoglukanase
↑
↑
Memutuskan ikatan secara acak Ekso-(1-4)-
EC
Selobiohidrolase atau
β-Dselulase
3.2.1.91
eksoselulase
G-G-G-G ↑ Melepaskan selobiosa baik yang reducing atau nonreducing end
Ekso-(1-4)-
EC
Eksoglukanase
β-Dselulase
3.2.1.74
atau
β-glukosidase
EC 3.2.1.21
G-G-G-G ↑
glukohidrolase
Melepaskan glukosa dari non-reducing end
Selobiose
G-G, G-G-G ↑
↑
Melepaskan glukosa dari selobiosa atau rantai cellooligosakarida pendek
12
β-glucoside glucohydrolases lebih dikenal sebagai β-glukosidase. βglukosidase adalah enzim yang digunakan untuk menghidrolisis cellobiose dan pada beberapa kasus dapat menghidrolisis cello-oligosakarida menjadi glukosa. Enzim endogluconases dan β- glukosidase dapat menghidrolisis selulosa menjadi glukosa. β-glukosidase dibutuhkan untuk menghidrolisis inhibitor cellobiose (Wood, 1985). Laju hidrolisis enzim selulase ditentukan oleh struktur enzim dan struktur substrat (Mandels, 1985), dimana struktur Kristal dari selulosa relatif lebih sulit dihidrolisis dibandingkan dengan struktur amorf (Coughlan, 1985). Mekanisme skematis kerja enzim selulase seperti pada Gambar 6.
Gambar 6. Skema mekanisme degadasi selulasa oleh enzim selulase (Beguin dan Aubert, 1994) 2.6 Spektrofotometer Spektrofotometer absorbansi adalah sebuah instrumen untuk mengukur absorbs cahaya dalam panjang gelombang tertentu oleh suatu atom atau molekul.
13
Untuk daerah ultraviolet sampai cahaya tampak, nilai panjang gelombang berkisar antara 160-780 nm. Kemampuan suatu senyawa mampu menyerap radiasi sinar UV-VIS yaitu adanya spesi pengabsorbsi yang disebut dengan kromofor. Kromofor merupakan gugus fungsional yang dapat menyerap radiasi UV-VIS. Aplikasi dari spektrofotometri UV-VIS, yaitu analisis kuantitatif senyawa organik dan anorganik, untuk analisis kualitatif tidak terlalu berguna karena spektrum yang dihasilkan cenderung mempunyai pita yang melebar sehingga informasi yang didapat sangat sedikit. Dalam analisis kuantitatif dilakukan pada panjang gelombang maksimum yaitu panjang gelombang yang menberikan absorbs terbesar (dapat ditentukan dari spektrum absorbsinya). Pada λmaks respon sinyal (absorbans) berada dalam kondisi maksimum sehingga akan memiliki sensitivitas yang baik dan limit deteksi yang rendah serta mereduksi kesalahan dalam pengukuran (Skoog et al., 2004). Instrumentasi spektrofotometer secara sederhana terdiri dari sumber cahaya, monokromator, yang berfungsi sebagai penyeleksi cahaya dengan panjang gelombang (energi) tertentu, kompartemen sampel, detektor, dan pengukur intensitas cahaya (Skoog et al., 2004). Berikut penjelasan empat bagian penting dari spektrofotometer, yaitu: a. Sumber Cahaya Sumber cahaya pada spektrofotometer haruslah memiliki pancaran radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber energi cahaya yang biasa untuk daerah tampak, ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar dengan kawat terbuat dari wolfarm (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola lampu pijar dengan biasa dengan daerah panjang gelombang (λ) berkisar antara 350-2200 nm. Paling lazim adalah lampu tabung tidak bermuatan (discas) hidrogen (atau deuterium) 175 ke 375 atau 400 nm. Lampu hidrogen atau lampu deuterium digunakan untuk sumber pada daerah ultraviolet.
b. Monokromator Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk menguraikan cahaya polikromatis
menjadi
beberapa
komponen
panjang
gelombang
tertentu
(monokromatis) yang berbeda (terdispersi). Ada dua macam monokromator, yaitu
14
prisma dan gating (kisi difraksi). Cahaya monokromatis ini dapat dipilih panjang gelombang tertentu yang sesuai untuk kemudian dilewatkan melalui celah sempit yang disebut slit. Ketelitian dari monokromatis dipengaruhi juga oleh lebar celah (slith width) yang dipakai. c. Kuvet Kuvet spektrofotometer adalah suatu alat yang digunakan sebagai tempat contoh atau cuplikan yang akan dianalisis. Kuvet biasanya terbuat dari kwarsa, kaca, plastik dengan bentuk tabung empat persegi panjang 1 x 1 cm dan tinggi 5 cm. Pada pengukuran di daerah ultraviolet dipakai kuvet kwarsa atau plexiglass, sedangkan kuvet dari kaca tidak dapat dipakai sebab kaca mengabsorbsi sinar UV. Semua macam kuvet dapat dipakai untuk pengukuran di daerah sinar tampak (visible). d. Detektor Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai panjang gelombang. Detektor akan mengubah cahaya menjadi sinyal listrik yang selanjutnya akan ditampilkan oleh penampil data dalam bentuk jarum penunjuk atau angka digital. Detektor yang biasa digunakan untuk Spektrofotometer UV-VIS adalah detektor photo tube, Barrier Layer Cell, dan Photo Multiplier Tube. Spektrofotometer UV-VIS termasuk dalam spektroskopi absorbs. Prinsip dasarnya ialah penyerapan (absorbs) gelombang elektromagnetik yang dilewatkan pada sampel. Gelombang elektromagnetik yang digunakan pada daerah panjang gelombang 160-780 nm. Absorbansi yang diperoleh dari sampel setelah diukur, digunakan untuk membandingkan intensitas sinar yang dilalui menuju sampel (I) dengan intensitas sinar sebelum dilewatkan ke sampel (I0). Transmitan diperoleh dari rasio I/I0 dan absorban diperoleh dari nilai transmitan (Skoog et al., 2004). Jenis spektrofotometer berdasarkan sistem optiknya terdapat 2 jenis, yaitu spektrofotometer single beam (berkas tunggal) dan spektrofotometer double beam (berkas ganda). Spektrofotometer single beam pada spektrofotometer ini hanya terdapat satu berkas sinar yang dilewatkan melalui kuvet. Blanko, larutan standar, dan contoh diperiksa secara bergantian.
BAB III METODE KERJA
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikroba dan Bioproses, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor Jawa Barat. Waktu penelitian adalah dari bulan Mei 2012 sampai dengan Oktober 2012.
3.2 Alat dan Bahan Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf, oven, refluks, desikator, penangas air, shaker incubator, vortex, neraca analitik digital, ayakan 50 mesh, laminar, spektrofotometer UV-VIS, hotplate, perangkat destilasi Markham, pH-meter, kertas saring, botol selai, cawan petri, mikropipet, thermometer, loop inokulan, bunsen, indicator universal, kapas, alumunium foil, kaca arloji, gelas piala 1 L, labu takar 100 mL, corong, batang pengaduk, spatula, pipet tetes, buret, pipet volumetrik, erlenmeyer, kuvet, labu semprot dan tisu. Peralatan dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini harus selalu dalam keadaan steril. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah jerami padi yang diperoleh dari sawah Dramaga dan tanah dari rhizosfer bambu Kota Bogor. Bahan yang digunakan dalam isolasi bakteri pendegadasi selulosa diantaranya Media Cellulose Congo Red Agar (CCRA), Media Nutrient Agar (NA) dan Media Nutrient Broth (NB), H2SO4 pekat, NaOH, H3BO3, Na2B4O7, K2Cr2O7, indikator Conway, indikator selenium, sedang bahan kimia untuk analisis komponen kimiawi terdiri DNS (Dinitri Salicylic Acid), fenol, Kalium Natrium Tartrat.
3.3 Isolasi Bakteri Pendegadasi Selulosa Untuk mengisolasi bakteri pendegadasi selulosa digunakan medium CCRA (Hendricks et al., 1995). Medium CCRA dibuat dengan dengan komposisi
15
16
K2HPO4 sebanyak 0,5 g, MgSO4 0,25 g, congo red 0,5 g, gelatin 2 g, CMC 1,88 g, 100 mL filtrat serbuk jerami padi dan 900 mL akuades steril. Bahan-bahan tersebut dicampurkan kecuali agar dan gelatin. Keasaman medium adalah pH 7,0, agar dan gelatin kemudian dilarutkan dalam medium dengan pemanasan menggunakan hot plate. Medium kemudian diautoklaf selama 15 menit pada suhu 121°C dengan tekanan 1,5 atm, didinginkan lalu dituangkan ke cawan Petri steril dan disimpan pada suhu 4°C. Pengenceran bertingkat dilakukan untuk memudahkan isolasi dengan cara sebanyak 10 g sampel dimasukkan ke dalam botol selai yang berisi 90 mL akuades steril lalu dimasukkan ke dalam shaker inkubator dengan kecepatan 200 rpm selama 3 jam (pengenceran tingkat 10-1). Selanjutnya dilakukan pengenceran secara bertingkat hingga 10-9. Isolasi bakteri selulolitik dilakukan dengan cara meratakan 0,1 mL larutan dari tingkat pengenceran 10-6 sampai 10-9 pada permukaan medium padat (CCRA) spatula (Lampiran 2). Metode isolasi bakteri yang digunakan pada penelitian ini adalah Spread Plate Methode. Koloni bakteri selulolitik yang tumbuh akan menimbulkan zona bening di sekitarnya. Zona bening yang terbentuk menunjukkan bahwa koloni bakteri tersebut menghasilkan enzim yang mendegadasi selulosa yang ada disekitarnya.
3.4 Pemurnian Kultur Setiap koloni terpisah yang memunculkan zona bening dimurnikan dengan metode kuadran pada medium CCRA (Lampiran 3). Koloni bakteri yang dimurnikan adalah koloni tunggal yang berada di ujung goresan kuadran. Dari Isolat yang didapat diberi nama dan di kulturkan kembali pada medium CCRA dan medium NA miring sebagai kultur stok (lampiran 4).
3.5 Uji Kapasitas Hidrolisis Selulosa Uji kapasitas hidrolisis (HC) merupakan pengujian yang dilakukan untuk mengetahui kemampuan isolat bakteri dalam laju degadasi selulosa di lingkungan sekitarnya. rasio HC adalah rasio antara diameter zona bening dengan diameter koloni yang menghasilkan zona bening (Lu et al., 2005). Medium CCRA padat
17
digunakan pada pengujian ini. Biakan dari isolat murni diambil dengan menggunakan jarum ose kemudian disentuhkan bagian ujung jarum yang mengandung biakan pada bagian tengah medium CCRA. Biakan diinkubasikan di dalam inkubator pada suhu 37º C. Pengukuran zona bening dan diameter koloni dilakukan setiap hari selama 5 hari. Maka akan terlihat laju degradasi dengan persamaan reaksi A
𝒌
𝜹𝑨
B. k = − 𝜹𝒕 = +
𝜹𝑩 𝜹𝒕
3.6 Aktivitas Enzim Selulase Aktivitas enzim selulase dihitung berdasarkan metode DNS (Dinitro Salicylic Acid). Sampel tiap-tiap perlakuan yang dikomposkan diambil masingmasing sebanyak 10 g dan ditambahkan 30 mL buffer phosphat kemudian diblender sampai halus dan disaring. Filtat diambil lalu disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm, kemudian larutan jernih (supernatan) diambil sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 1 mL substrat CMC 1% diinkubasi selama 30 menit pada suhu 500C. Larutan tersebut kemudian ditambahkan dengan 3 mL pereaksi DNS, dikocok hingga homogen menggunakan vortex, dan ditempatkan dalam air mendidih selama 15 menit, lalu ditambahkan 1 mL KNa-Tartrat 40% dinginkan sampai suhu ruang. Larutan yang telah didinginkan tadi diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 570 nm. Untuk pengukuran blanko, supernatan sebanyak 1 mL ditambahkan dengan 1 mL buffer phosphat pH 7. Kurva standar dibuat dengan menggunakan larutan glukosa standar dengan kisaran 100-500 mg/L. Penghitungan aktivitas enzim selulase dilakukan dengan rumus berikut, Aktivitas enzim unit/mL =
Kadar glukosa x factor pengenceran BM glukosa x waktu inkubasi
3.7 Hidrolisis Selulosa Jerami Padi Jerami kering ditimbang sebanyak 1,5 kg, kemudian direndam dalam ember selama 1 malam. Lalu ditiriskan selama 2 jam, kemudian dimasukkan ke dalam keranjang plastik dan ditambahkan inokulan 5% yang berasal dari isolat JP72, DDH92, dan kontrol, kemudian diaduk rata. Proses inkubasi dilakukan
18
selama 30 hari dan juga dicek kelembabannya agar tetap terjaga. Proses pengomposan ini dapat dilihat pada lampiran 5.
3.8 Analisis Kadar Selulosa Metode untuk mengukur kandungan selulosa dan lignin berdasarkan metode Chesson yang dikemukakan oleh Datta (1981). Sebanyak satu g sampel kering (berat a) ditambahkan 150 mL H2O atau alkoholbenzene dan direfluk pada suhu 100°C dengan water bath selama 1 jam. Hasilnya disaring, residu dicuci dengan air panas 300 mL. Residu kemudian dikeringkan dengan oven sampai beratnya konstan dan kemudian ditimbang (berat b). Residu kemudian ditambahkan 150 mL H2SO4 1 N, dan direfluk dengan water bath selama 1 jam pada suhu 100°C. Hasilnya disaring dan dicuci sampai netral (300 mL) kemudian residunya dikeringkan hingga beratnya konstan. Berat ditimbang (berat c). Residu kering ditambahkan 100 mL H2SO4 72% dan direndam pada suhu kamar selama 4 jam kemudian ditambahkan 150 mL H2SO4 1 N dan direfluk pada suhu 100oC dengan water bath selama 1 jam pada pendingin balik. Residu disaring dan dicuci dengan H2O sampai netral (400 mL). Residu kemudian dipanaskan dengan oven dengan suhu 105oC sampai beratnya konstant dan ditimbang (berat d). Selanjutnya residu diabukan dan ditimbang (berat e). Perhitungan kadar selulosa dan kadar lignin menggunakan rumus berikut ini: Kadar selulosa = (c-d)/a x 100% Kadar lignin = (d-e)/a x 100%
3.9 Preparasi Dan Analisis Rasio C/N Contoh Contoh diambil dari jerami padi yang sudah diinkubasi dengan pengambilan pada hari ke-30. Diambil beberapa bagian dari jerami padi lalu dikeringkan. Setelah kering, contoh diblender dan diayak menggunakan saringan berukuran 50 mesh, akan dihasilkan serbuk contoh. Serbuk ini kemudian ditentukan kadar karbon (C) dan nitrogen (N).
19
3.9.1 Penetapan Kadar C-Organik Kadar C-organik ditentukan dengan metode Walkley dan Black. Timbang 0,010-0,050 g contoh, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL. tambahkan 5 mL K2Cr2O7 2N, lalu dikocok. Tambahkan 7 mL H2SO4 pekat, dikocok lalu diamkan selama 30 menit. Encerkan, biarkan dingin dan ditepatkan. Keesokan harinya diukur absorbansi larutan jernih dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 561 nm. Sebagai pembanding dibuat standar 0 dan 150 ppm C, dengan memipet 0 dan 3 mL larutan standar 5.000 ppm C ke dalam labu ukur 100 mL dengan perlakuan yang sama dengan contoh. Kadar C dihitung dengan persamaan berikut: Kadar C-organik(%)= ppm kurva x mL ekstrak1.000 mL-1 x 100 contoh-1 x fk = ppm kurva x 100 1.000-1x 100 10-1x fk = ppm kurva x 10 10-1 x fk Keterangan:
Larutan standar : 12,510 g glukosa dalam 1L. 100
: faktor konversi ke %
Fk
: faktor koreksi kadar air = 100/(100-%kadar air)
Reaksi : 2 K2Cr2O7 + 8 H2SO4 + 3 C → 2 Cr2(SO4)3 + 3 CO2 + 2 K2SO4 + 8 H2O
3.9.2 Penetapan Kadar N (Nitrogen) Kadar N ditentukan dengan menggunakan metode kjeldahl. Sebanyak 0,2g serbuk contoh ditimbang lalu dimasukkan ke labu kjehdahl 100 mL, ditambahkan serbuk selenium sebanyak 1 g sebagai katalis dan 5 mL H2SO4 pekat, kemudian didestruksi hingga didapatkan larutan jernih. Hasil destruksi dimasukkan ke alat destilasi Markham, dibilas dengan air, ditambah 30 mL NaOH 30% kemudian didestilasi. Hasil destilasi ditampung dengan 20 mL asam borat (H3BO3) 1% dan empat tetes indikator Conway (merah). Setelah destilat berwarna hijau kemudian destilasi dilanjutkan selama 10 menit. Destilat kemudian dititar dengan H2SO4 0,05 N hingga didapat titik akhir titrasi, larutan berwarna merah muda. Kadar Nitrogen dihitung dengan persamaan: Kadar N =
𝑽𝒄−𝑽𝒃 𝒙 𝑵 𝑯𝟐 𝑺𝑶𝟒 𝒙 𝟏𝟒,𝟎𝟎𝟖 𝒎𝒈 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒐𝒉
x 100 %
20
Keterangan: Vc : Titran H2SO4 0,05N contoh (mL) Vb: Titran H2SO4 0,05N blanko (mL) Standarisasi H2SO4 Sebanyak 10 mL dinatriun tetraborat (Na2B4O7) 0,05 N dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 250 mL, ditambahkan dua tetes indikator merah metil (larutan menjadi berwarna kuning), kemudian dititar dengan H2SO4 yang akan distandarisasi hingga didapat titik akhir merah muda. Reaksi yang terjadi : N-organik + H2SO4 pekat
→ CO2+H2O+(NH4)2SO4(N-anorganik) (Destruksi)
(NH4)2SO4 + 2 NaOH
→ Na2SO4 + 2 NH3 + 2 H2O
(Destilasi)
NH3 + H3BO3 + Conway
→ NH4H2BO3 (hijau)
(Destilasi)
NH4H2BO3 + H2SO4
→ (NH4)2SO4 + H3BO4
(Titrasi)
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Isolasi Bakteri Pada penelitian ini berhasil diisolasi 4 isolat bakteri yang berpotensi sebagai bakteri pendegadasi selulosa yang berasal dari jerami padi di daerah sawah Dramaga dan 1 isolat yang berasal dari rhizosfer tanah bambu di daerah kota Bogor. Keempat isolat yang berasal dari jerami padi diberi kode dengan nama JP71, JP72. JP91, dan JP92. Huruf JP pada kode isolat adalah kependekan dari jerami padi dan satu isolat yang berasal dari rhizosfer tanah bambu diberi kode dengan nama DDH92. Tabel 3 menunjukkan karakter koloni tersebut. Karakter isolat DDH92 berbeda dengan keempat isolat yang berasal dari jerami padi. Koloni dari isolat DDH92 menunjukkan adanya miselium. Koloni Actinomycetes muncul perlahan ,menunjukkan konsistensi berbubuk dan melekat erat pada permukaan media. Pengamatan di bawah mikroskop menunjukkan adanya miselium ramping bersel satu yang bercabang membentuk spora aseksual untuk perkembangbiakannya (Nonomura dan Ohara, 1971). Rentang pH yang paling cocok untuk perkembangbiakan Actinomycetes adalah antara 6,5-8,0. Tanah yang tergenang air tidak cocok untuk pertumbuhan Actinomycetes, sedangkan tanah gurun yang kering atau setengah kering dapat mempertahankan populasi dalam jumlah cukup besar, karena adanya spora (Nonomura dan Ohara, 1971). Table 3. Morfologi koloni bakteri No
Kode Isolat
Bentuk
Pinggiran
Warna
miselium
1
JP71
Bulat
Utuh
Merah
-
2
JP72
Bulat
Utuh
Merah
-
3
JP91
Bulat
Utuh
Merah
-
4
JP92
Bulat
Utuh
Merah
-
5
DDH92
Bulat
Utuh
Merah
+
21
22
4.2 Uji Degadasi Semi Kuantitatif Uji degadasi adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui seberapa besar kemampuan isolat bakteri untuk mendegadasi selulosa. Uji HC dilakukan dengan menggunakan medium padat Congo Red Agar (CCRA) yang mengandung 2 macam material selulotik yaitu Carboxymethylcellulose (CMC) dan filtrat dari serbuk jerami padi. Ratio HC menunjukkan kemampuan isolat bakteri yang diperoleh dalam mendegadasi selulosa yang diindikasikan dengan terbentuknya zona bening. Ratio HC adalah perbandingan antara diameter zona bening dengan diameter koloni. (Sudiana et al., 2002). Uji degadasi dengan menggunakan metode zona bening adalah uji semi karena data hanya berupa perbandingan antara diameter zona bening dan dengan diameter koloni. Kesulitan metode ini adalah apabila bentuk koloni atau zona bening yang dihasilkan tidak benar-benar berbentuk bulat, atau bahkan tidak bulat sama sekali. Zona bening yang terbentuk terkait dengan kelarutan dari enzim selulase. Semakin tinggi tingkat kelarutan suatu enzim maka akan semakin besar zona bening yang terbentuk. Diameter zona bening umumnya berukuran lebih besar dibandingkan dengan diameter koloni, karena enzim selulase disekresikan ke lingkungan sekitarnya oleh bakteri pendegadasi selulosa. Bakteri tidak dapat memasukkan molekul selulosa, karena ukuran selulosa lebih besar daripada ukuran sel bakteri. ( Zverlova et al., 2003) Luas zona bening tergantung pada konsentrasi CMC dan agar yang digunakan. Semakin banyak CMC dan agar yang digunakan semakin tinggi kepadatan medium. Semakin tinggi konsentrasi agar, semakin kecil pori medium sehingga enzim selulase yang disekresikan lebih sulit melewati pori tersebut dan mengakibatkan terhambatnya proses degadasi. Demikian pula sebaliknya. Namun penggunaan agar pada medium yang digunakan juga tidak boleh terlalu sedikit, penggunaan agar dibawah 0,8% menyulitkan proses isolasi bakteri (Hankin and Anagnostakis, 1997), medium menjadi terlalu lunak sehingga sulit untuk isolasi dan inokulasi. Pada awal penelitian ini agar yang semula digunakan adalah 0,5 %, namun karena medium yang dihasilkan terlalu lunak maka agar ditingkatkan menjadi 1,5%.
23
Berdasarkan ratio HC pada hari ke-5 masa inkubasi, isolat JP 72 adalah yang mempunyai kemampuan tertinggi dalam mendegadasi CMC dan filtrat serbuk jerami padi sebesar 6,67 yang kemudian diikuti oleh isolat JP71 sebesar 4,5, JP91 sebesar 4,5, JP92 sebesar 3,09 dan DDH92 sebesar 1,25 (Lampiran 7). Sedangkan untuk isolat DDH92 ratio HC lebih kecil dibandingkan isolat yang lain, akan tetapi zona beningnya dapat terlihat dengan jelas. Hal ini disebabkan oleh pembentukan koloni yang perlahan.
4.3 Analisis Kompos Jerami Padi Analisis kompos jerami padi dilakukan untuk menentukan penurunan ratarata bobot, tinggi tumpukan, kadar selulosa, dan kadar lignin dari jerami padi. Hidrolisis selulosa jerami padi menggunakan 2 isolat saja yaitu isolat JP72 yang berasal dari jerami padi dan isolat DDH92 yang berasal dari rhizosfer tanah bambu, dilihat dari rasio HC terbesar dan perbedaan sampel. Proses inkubasi selama 30 hari dilakukan secara non steril karena pengaplikasian ini secara aerobik dan prosesnya lebih mudah dibandingkan jika harus steril. Sehingga menggunakan kontrol sebagai pembanding isolat yang diinkubasikan dan kontrol juga mengalami penurunan dalam analisis karena masih terdapat mikroba alami pada jerami padi.
4.3.1 Bobot Jerami Padi Analisis hasil inkubasi jerami padi selama 30 hari, didapatkan bahwa isolat DDH92 lebih banyak menurunkan bobot jerami padi sebesar 26,67%. Isolat JP72 sebesar 20% dan kontrol sebesar 13,33%. Hal ini membuktikan bahwa semakin menurun bobot jerami padi yang diinkubasi maka semakin menurun kadar C-0rganik pada jerami padi, maka isolat DDH92 lebih baik dalam mendegadasi jerami padi. Tabel 4. Hasil uji penurunan bobot jerami padi setelah inkubasi selama 30 hari No
Kode Isolat
Rata-rata penurunan berat kering (%)
1
JP72
20,00
2
DDH92
26,67
3
Kontrol
13,33
24
4.3.2 Tinggi Tumpukan Jerami Padi Proses inkubasi jerami padi menggunakan keranjang yang berukuran panjang 37 cm, lebar 32,5 cm dan tinggi 18,5 cm. Proses inkubasi ini akan menurunkan tinggi dari jerami padi karena glukosa yang terbentuk sebagian akan dijadikan sebagai sumber makanan bakteri. Glukosa diubah menjadi CO2 dan H2O yang nantinya CO2 akan terbang ke udara karena bersifat gas. Pada penelitian ini, isolat DDH92 mampu menurunkan tinggi menjadi 6 cm, isolat JP72 menjadi 7cm dan kontrol menjadi 8 cm.
12
10 Tinggi tumpukan (cm)
Kontrol 8
JP72 DDH92
6
4
2
0 0
5
10
15
20
25
30
Waktu Inkubasi (hari)
Gambar 7. Penurunan tinggi Tumpukan jerami padi
4.3.3 Kadar Selulosa Jerami padi adalah limbah selulosa yang merupakan unsur pokok pada tanaman dan merupakan komponen yang dihidrolisis menjadi glukosa sehingga perlu untuk mengetahui penurunan kadar selulosa selama inkubasi. Penurunan kadar selulosa setelah inkubasi selama 30 hari secara non steril tertinggi adalah pengomposan oleh isolat DDH92 menjadi 8,047%. Sedangkan isolat JP72 selama 30 hari menjadi 10,704% dan kontrol mengalami penurunan menjadi 11,119%.
25
Hal ini membuktikan bahwa isolat DDH92 mampu menghidrolisis jerami padi lebih cepat dibandingkan dengan isolat JP72.
45 40
Kadar Selulosa (%)
35 Kontrol
30
JP72
25
DDH92
20 15 10 5 0 0
5
10
15
20
25
30
Waktu Inkubasi (hari)
Gambar 8. Penurunan kadar selulosa selama 30hari.
4.3.4 Kadar Lignin Fungsi utama lignin adalah memperkuat struktur tanaman dalam menahan terhadap serangan mikroba dan tekanan oksidasi (Hendriks dan Zeeman, 2009). Sehingga perlu adanya penghilangan lignin agar dalam mendegadasi selulosa tidak terhalangi oleh senyawa ini. Pada penelitian ini. Isolat DDH92 mampu menurunkan kadar lignin menjadi 7,56% yang semula kadarnya adalah 14,4%. Hal ini menunjukkan bahwa isolat DDH92 mampu mendegadasi lignin sebesar 47,5%.
26
16 14
Kadar Lignin (%)
12 10
Kontrol
8
JP72
6 DDH92 4 2 0 0
5
10
15
20
25
30
Waktu Inkubasi (hari)
Gambar 9. Penurunan kadar lignin selama 30 hari. 4.4 Aktivitas enzim selulase umur 30 hari Aktivitas enzim didefinisikan sebagai kecepatan pengurangan substrat atau kecepatan pembentukan produk pada kondisi optimum. Satu unit aktivitas enzim selulase didefinisikan sebagai jumalah enzim yang menghasilkan satu mikromol gula reduksi (glukosa) setiap menit (Lehninger, 1982). Penelitian ini aktivitas enzim selulase pada isolat DDH92 cukup besar yaitu sebesar 50,675x10-3 U/mL sedangkan isolat JP72 sebesar 26,9x10-3 U/mL. Pada uji rasio HC, isolat JP72 lebih besar dibandingkan dengan isolat DDH92 yaitu 6,67:1,25. Tetapi pembentukan zona bening pada isolat JP72 tidak terlalu jelas seperti isolat DDH92. Hal ini membuktikan bahwa enzim selulase dari isolat DDH72 mampu mendegadasi substrat dalam bentuk amorf dan kristalin. Sehingga aktivitas enzim dari isolat DDH92 lebih besar dibandingkan dengan isolat JP72.
27
0.06
Laju Hidrolisi (Unit/mL)
0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 Kontrol
JP72
DDH92
Kode Isolat
Gambar 10. Aktivitas enzim selulase umur 30 hari. Pada penelitian yang dilakukan oleh LIPI, menyatakan bahwa isolat Actynonomycetes dari genus streptomyces yang berasal dari Taman Nasional Bukit Duabelas Jambi memiliki aktivitas selulase sebesar 13,4 x 10-3 U/mL. Isolat DDH92 sangat potensial
untuk bahan dekomposer karena laju hidrolisisnya
sangat berpotensi untuk mendekomposisi jerami padi. 4.5 Rasio C/N Kompos adalah pupuk organik yang kaya nutrien dan bermanfaat sebagai penyubur tanah. Prosesnya merupakan hasil perombakan senyawa komplek menjadi senyawa sederhana dengan bantuan kombinasi mikroba yang terdiri dari bakteri, kapang, Actinomycetes dan cacing yang dapat meningkatkan nilai limbah lignoselulosa (Mtui, 2009). Dalam
permentan
No.06/Permentan/SR.130/2/2011,
tentang
pupuk
organik pembenah tanh, dikemukakan bahwa rasio C/N dari bahan organik <20. Definisi tersebut menunjukkan bahwa pupuk organik lebih ditujukan kepada kandungan C-organik, nilai C-organik itulah yang menjadi pembeda pupuk organik dengan pupuk anorganik. Dalam penelitian, isolat DDH92 mampu menurunkan rasio C/N menjadi 19,38 selama 30 hari. Hal ini membuktikan bahwa isolat DDH92 dapat dijadikan
28
sebagai bahan dekomposer karena mampu menurukan rasio C/N di bawah 20 sesuai dengan peraturan pemerintah.
Tabel 5. Rasio C/N jerami padi yang diberi decomposer selama 30 hari inkubasi nonsteril. Kode Isolat
Kadar C (%)
Kadar N (%)
Rasio C/N
Kontrol
86,938
1,682
51,687
JP72
59,479
1,647
36.113
DDH92
33,258
1,716
19,381
Dari data tabel diketahui bahwa rasio C/n dari Kontrol dan isolate JP72 masih di atas 20, padahal kadar selulosa dari ketiga perlakuan ini hamper sama. Dikarenakan mikroba pada Kontrol dan JP72 baru memotong ikatan hingga ke tahap oligosakarida dan disakarida belum mencapai glukosa yang nantinya dijadikan sumber makanan bagi mikroba yang akan menghasilkan CO2 yang akan terbang ke udara, sehingga kadar C-organik dalam kontrol dan JP72 masih tinggi.
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan Isolat DDH92 yang merupakan golongan dari Actinomycetes berpotensi sebagai agensia dekomposer jerami padi. Isolat ini memiliki aktivitas enzim selulase yang tinggi, yaitu sebesar 50,675x10-3 U/mL, sehingga baik untuk proses hidrolisis enzimatis lignoselulosa menjadi glukosa sebagai bahan baku fermentasi bioetanol. Nilai tambah dari isolat DDH72 adalah untuk pengomposan jerami padi karena mampu menurunkan rasio C/N menjadi sebesar 19,38 selama 30 hari sesuai dengan standar kriteria kompos yang bagus yaitu rasio C/N 20. Kompos jerami padi yang dihasilkan bertekstur lunak dan berwarna kehitaman mirip humus.
5.2 Saran Penelitian selanjutnya disarankan untuk mengidentifikasi spesies mikroba selulolitik pada penelitian ini. Aplikasi isolat mikroba ini pada media CCRA hendaknya dilakukan optimasi pertumbuhan mikroba lebih dahulu. Pengomposan limbah lignoselulosa tidak hanya untuk jerami padi tapi diharapkan untuk bahan lignoselulosa lain yang memiliki kadar C-organik yang tinggi.
29
DAFTAR PUSTAKA
Abdulla, H.M. 2007. Enhancement of rice straw composting by lignocellulolytic actinomycete strains. Int. J. of Agiculture & Biology. Vol. 9(1), 106-109. Ahmed, Z., H. Banu, M.M, Rahman, F. Akhter & M.S. Haque. 2001. Microbial activity on the degradation of lignocellulosic polysaccharides. Journal of biological sciences. 1(10):993- 997. Beguin, P. & J.P. Aubert. 1994. The Biological degradation of cellulose. FEMS Microbiology Reviews, 13: 25-58. Bhat, M.K. & S. Bhat. 1997. Cellulose degrading enzymes and their potensial industrial applications. Biotechnology Advances, 15: 583. Bhat, M. K. 2000. Cellulose and releted enzymes ln biotechnology. Biotecnology Advanteces, 18: 355-358. Coughlan, M. P. 1985. The properties of fungal and bacterial cellulases with comment on their production and application. Biotechnology Genetic Engineering. Review, 3: 39-109. Datta, A., A. Betterman, & T.K. Kirk. 1981. Identification of spesific manganese peroxidase
among
lignolitic
enzym
secreted
by
Phanerochaete
chrysosporium during wood decay, Appl. Environ. Microbiol. 57 : 1453 – 1460. Denman, S., G. Xue, & B. Patel. 1996. Characterisation of Neocallomastix patriciarum cellulose cDNA (CelA) homologus to Tricoderma reesei cellobiohydrolase II. Applied. Environ. Microbiol, 62:1889- 1896. Enny, H.L. 2008. Optimasi proses hidrolisis kimiawi dan enzimatis tandan kosong kelapa sawit menjadi glukosa untuk produksi etanol. Thesis. PAU Bioteknologi IPB, Bogor. Fengel, D., & G. Wegener. 1995. Kayu : Kimia, Ultrastruktur, Reaksi-reaksi. Diterjemahkan oleh Hardjono Sastrohamidjoyo. Cetakan I, Gajah Mada University Press, Yogyakarta. Hal. 124-154. Glazer, A. N., & H. Nikaido. 2007. Microbial biotechnology: Fundamentals of Applied
Microbiology,
second
30
edition.
Cambridge
:
USA
31
Hankin,
L.,
&
S.L.
Anagnostakis.
1997.
Solid
media
containing
carboxymethylcellulose to detect Cx cellulase activity of microorganisms. Journal of General Microbiology. 98:109- 115. Hatami, S., H.A. Alikhani, H. Besharati, N. Salehrastin, M. Afrousheh, & Y.Z. Jahromi. 2008. Investigation on aerobic cellulolytic bacteria in some of north forest and farming soils. American-Eurasian J. Agic. & Environ. Sci. 3 (5): 713-716. Hendricks, C.W., J.D. Doyle & B. Hugley. 1995. A new solid media for enumerating cellulose-utilizing Bacteria in soil. Environmental Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency,1 and Mantech Environmental Technology, inc.,2 corvallis: Oregon. Hendriks, A.T.W.M., & G. Zeeman. 2009. Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulose biomass. Biores Technol. 100, 10-18. Howard R.L., E. Abotsi, E.L.J. van Rensburg & S. Howard. 2003. Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production. African J. Biotechnol. 2(12):602-619. Isroi. 2010. Pemanfaatan jerami padi sebagai pupuk organik in situ untuk mengurangi
penggunaan
pupuk
kimia
dan
subsidi
pupuk.
http://isroi.wordpress.com/2010/02/12/4905/. Judoamidjojo R.M Said EG & L. Hartoto. 1989. Biokonversi. PAU Bioteknologi IPB, Bogor. Kim, C. H., & D. S. Kim. 1995. Purification and specificity of a specific endo-βD-glucanase (Avicelase II) resembling exocellobiohydrolase from Bacillus circulans. Enzyme and Microbial Technology, 17: 248-254. Lehninger, A. L. 1982. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta: Erlangga. Lu, W.J., H. Wang, S. Yang, Z. Wang, & Y. Nie. 2005. Isolation and characterization of mesophilic cellulose-degading bacteria from flower stalks- vegetable waste co-composting system. J.Gen.Appl.Microbiol. 51: 353- 360. Malik, F.R., S. Ahmed, & Y.M. Rizki. 2001. Utilization of lignocellulosic waste for the preparation of nitrogenous biofertilizer. Pakistan J. Biological Sciences 4(10), 1217-1220.
32
Mandels, M. 1985. Aplication of cellulases. Biochem Society Trans., 13:414-16.. Mattinen, M.L. 1998. Structural and functional studies of fungal cellulose binding domain by NMR spectroscopy. Academic Dissertation. University of Helsinki, Finland. Mtui, Y.S. 2009. Recent advances in pretreatment of lignocellulosic wastes and production of value added products. African J. of Biotechnology Vol. 8(8), 1398-1415. Mulcahy. 1996. An investigation of cellulose Binding Domain in non-celululose binding domains in non-cellulolytic enzymes. Final Year Project University of Limerick. Nonomura, H., & Y. Ohara. 1971. Distribution of soil actinomycetes. VIII. Geen spore Goup of Microtetraspora, Its Preferential Isolation and Taxonomic Characteristics. 49: 1-7. Palonen, H. 2004. Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocelluloses. Disertation. University of Technology.Helsinki Finland. Perez, J., J.M. Dorado, T. Rubia, & J. Martinez. 2002. Biodegadation and biological treatments of cellulose, hemicellulose and lignin: an overview. Int. Microbiol. 5, 53-63. Singhania. 2009. Cellulolytic enzymes. Biotechnology for Ago-Industrial Residues Utilization. Chapter 20, 371-381. Skoog D.A., D.M. West, F.J. Holler, & S.R. Crouch. 2004. Fundamentals of Analytical Chemistry 8th Ed. UK : Thomson Brooks. Sudiana, I. M., A. Kanti, M. Rahmansyah, S. Widawati, Suliasih, R. W. Rahayu & H. Imanuddin. 2002. Populasi dan karakterisasi bakteri selulotik yang diisolasi berbegai ketinggian lokasi di taman nasional gunung Halimun. Laporan Teknik Proyek Inventarisasi dan Karakterisasi Sumberdaya Hayati, Puslit biologi-LIPI, Indonesia. Widyastuti, H., Siswanto, & Suharyanto. 2007. Optimasi pertumbuhan dan aktivitas enzim lignolitik Omphalina sp dan Pleurotus ostreatus pada fermentasi padat. Menara Perkebunan, 75(2): 93-105. William, R. & N.S. Govind. 2003. Identification of carbohydrate degading bacteria in sub-tropical regions. Rev. Biol. Trop., 51, Supl. 4: 205-210.
33
Wood, T. M. 1985. Properties of cellulolytic enzyme systems. Biochem Society Trans, 13: 407-10. Zverlova, V. V., W. Holl, & H. Schwarz. 2003. Enzymes for digestion of cellulose and other polysaccharides in the gut of longhorn beetle larvae, Rhagium inquisitor L. (Col., Cerambycidae). International Biodeterioration & Biodegadation. 51:175–179.
34
Lampiran 1. Diagam Alir Penelitian
Sampel Tanah dan jerami
Isolasi
Metode CCRA Kualitatif
Pemurnian
Metode Kuadran Kuadran Metode
penyimpanan
NA/CCRA /CCRA (agar (agar miring) NA miring)
n Kapasitas Hidrolisis (Diukur setiap hari selama 5 hari)
Hidrolisis selulosa Selama 30 hari
Aktivitas Enzim Selulase
Uji Kadar Selulosa
Rasio C/N
Metode DNS
Metode Chesson
Hari ke-30
35
Lampiran 2. Diagam Alir Pengenceran Bertingkat
90 mL x 1 buah
99 mL x 4 buah
9 mL x 1 buah
1000 mL Buffer Salin 0,85 %
Autoclaf 1210C 15
90
menit 1,5 atm 1 mL 99 + sampel 10 gr 1 mL
90
ml ml 99 Shaker inkubator 9
1 mL
1 mL
ml 99 1 mL 99 0,1 mL
3 jam
36
Lampiran 3. Diagam Alir Proses Metode Kuadran 4 Goresan
Diambil 1 Ose
IV
I Digoreskan berurutan dimulai
III
II
dari I sampai IV Dengan diputar setiap goresan. Pengerjaan dilakukan secara aseptis dan loop inokulan dibakar setiap mulai menggores.
Koloni yang terpisah diujung goresan disebut kultur murni.
37
Lampiran 4. Diagam Alir Proses Pembuatan Na Miring
Dihomogenkan
1000 mL aquadest + nutrient agar 15
Dimasukkan 5 mL Na ke dalam tabung ulir
gr/L Disterilkan
Dimiringkan
38
Lampiran 5. Diagam Alir Hidrolisis Selulosa
Jerami 1,5 kg dianalisis
Dicacah
kadar selulosa
Direndam selama 1 malam
Ditiriskan selama 2 jam
Disimpan dalam keranjang plastik A, B, C
A → Air Steril B → Jerami C → Bambu
Dicampurkan inokulan 5% dan diaduk rata
Diinkubasi selama 30 hari
Dijaga kelembabannya dengan disemprotkan dengan air
39
Lampiran 6. Diagam Alir Proses Uji Aktivitas Enzim Selulase Pengambilan enzim → 10 g sampel yang dikomposkan + 30 mL buffer phosphate pH 7,0 diblender dan sentrifugasi 10.000rpm, supernatan di ambil. Sample
blanko
1mL supernatan
1mL supernatan
+ 1mL substrat
+ 1mL A
baku glukosa 1mL A + 1mL B
Inkubasi 30menit 500C + 3 mL larutan C
+ 3 mL larutan C + 1 mL larutan D
+ 1 mL larutan D Dididihkan 5-15 menit Didinginkan
Ukur ABS λ= 570 nm
Ukur ABS λ= 570 nm
Ket : Larutan A : Larutan buffer phosphat 1,779 gr Na2HPO4 dilarutkan dalam 100 ml H2O Larutan B : Larutan stok glukosa 0,1 M (dalam larutan A) Larutan C : Larutan DNS 1% → DNS 10 gr, fenol 2 gr, NaSO4 0,5 gr, NaOH 10 gr dalam 1 L
H2O
Larutan D : K Na tartrat 40% Larutan Substrat : CMC 1% ( 1 gr dalam 100 mL larutan A)
40
Lampiran 7. Tabel Rasio HC
Kode
JP71
JP72
JP91
JP92
DDH92
Isolat Waktu
DZB
DK
(Hari)
(cm)
(cm)
1
2,7
1
2
4,0
3
HC
DZB
DK
(cm)
(cm)
2,7
2,0
0,5
1
4,0
3,0
4,2
1
4,2
4
4,4
1
5
4,5
1
HC
DZB
DK
(cm)
(cm)
4,0
2,5
0,9
0,5
6,0
3,2
3,5
0,6
5,8
4,4
3,8
0,6
4,5
4,0
0,6
DZB
DK
(cm)
(cm)
2,8
1,0
0,5
0,9
3,5
2,0
4,0
0,9
4,4
6,3
4,1
0,9
6,6
4,5
1,0
Keterangan : DZB = Diameter Zona bening DK = Diameter Koloni HC = Hidrolysis Capacity
HC
HC
DZB
DK
HC
(cm)
(cm)
2,0
0,10
0,05
2,00
0,5
4,0
0,15
0,05
3,00
2,7
0,7
3,8
0,20
0,10
2,00
4,5
3,0
0,9
3,3
0,30
0,20
1,50
4,5
3,4
1,1
3,1
0,50
0,40
1,25
41
Lampiran 8. Perhitungan Penurunan Bobot Jerami Padi
% penurunan bobot kontrol = % penurunan bobot kontrol =
𝐛𝐨𝐛𝐨𝐭 𝐚𝐰𝐚𝐥 – 𝐛𝐨𝐛𝐨𝐭 𝐚𝐤𝐡𝐢𝐫 𝒃𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒂𝒘𝒂𝒍 𝟏,𝟓 𝐤𝐠 − 𝟏,𝟑 𝐤𝐠 𝟏,𝟓 𝒌𝒈
x 100%
x 100%
% penurunan bobot kontrol = 13,33 %
% penurunan bobot JP72 = % penurunan bobot JP72 =
𝐛𝐨𝐛𝐨𝐭 𝐚𝐰𝐚𝐥 – 𝐛𝐨𝐛𝐨𝐭 𝐚𝐤𝐡𝐢𝐫 𝒃𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒂𝒘𝒂𝒍 𝟏,𝟓 𝐤𝐠−𝟏,𝟐 𝐤𝐠 𝟏,𝟓 𝒌𝒈
x 100%
x 100%
% penurunan bobot JP72 = 20 %
% penurunan bobot DDH92 = % penurunan bobot DDH92 =
𝐛𝐨𝐛𝐨𝐭 𝐚𝐰𝐚𝐥 – 𝐛𝐨𝐛𝐨𝐭 𝐚𝐤𝐡𝐢𝐫 𝒃𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒂𝒘𝒂𝒍 𝟏,𝟓 𝐤𝐠−𝟏,𝟏 𝐤𝐠 𝟏,𝟓 𝒌𝒈
% penurunan bobot DDH92 = 26,67 %
x 100%
x 100%
42
Lampiran 9. Contoh Perhitungan Kadar Selulosa
Kadar a = 1,000 g Kadar b = 0,736 g Kadar c = 0,711 g Kadar d = 0,299 g Kadar e = 0,137 g % selulosa = % selulosa =
𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒄−𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒅 𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒂 𝟎,𝟕𝟏𝟏 –𝟎,𝟐𝟗𝟗 𝟏,𝟎𝟎𝟎
x 100 %
x 100 %
% selulosa = 𝟒𝟏, 𝟐 %
Hari ke0 10 20 30
Kadar Selulosa Kontrol (%) 39,400 34,340 15,305 11,119
Kadar Selulosa JP72 (%) 39,400 32,213 10,746 10,704
Kadar Selulosa DDH92 (%) 39,400 22,413 8,613 8,047
43
Lampiran 10. Contoh Perhitungan Kadar Lignin
Kadar a = 1,000 g Kadar b = 0,736 g Kadar c = 0,711 g Kadar d = 0,299 g Kadar e = 0,137 g
% Lignin = % Lignin =
𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒅 − 𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒆 𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒂 𝟎,𝟐𝟗𝟗 –𝟎,𝟏𝟑𝟕 𝟏,𝟎𝟎𝟎
x 100 %
x 100 %
% Lignin = 𝟏𝟔, 𝟐 %
Hari ke0 10 20 30
Kadar Lignin Kontrol Kadar Lignin (%) JP72 (%) 14,400 14,400 10,940 10,467 8,885 8,792 7,913 7,624
Kadar Lignin DDH92 (%) 14,400 10,647 8,112 7,560
44
Lampiran 11. Contoh Perhitungan Aktivitas enzim selulase 𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒈𝒍𝒖𝒌𝒐𝒔𝒂 𝒙 𝒇𝒂𝒌𝒕𝒐𝒓 𝒑𝒆𝒏𝒈𝒆𝒏𝒄𝒆𝒓𝒂𝒏
Aktivitas selulase ( U/mL ) = 𝑩𝑴 𝒈𝒍𝒖𝒌𝒐𝒔𝒂 𝒙 𝒘𝒂𝒌𝒕𝒖 𝒊𝒏𝒌𝒖𝒃𝒂𝒔𝒊 (𝒎𝒆𝒏𝒊𝒕) Aktivitas selulase ( U/mL ) =
𝟐𝟗𝟑,𝟎𝟐 𝒙 𝟏 𝟏𝟖𝟎 𝒙 𝟑𝟎
Aktivitas selulase ( U/mL ) = 54,43 No
Kode islolat
Absorbansi
Konsentrasi (ppm)
Aktivitas enzim (U/mL)
1
Kontrol 1
0,091
105,39
25,07 x 10-3
2
Kontrol 2
0,092
105,39
25,07 x 10-3
3
JP72 1
0,142
144,36
26,72 x 10-3
4
JP72 2
0.145
146,32
27,09 x 10-3
5
DDH92 1
0,336
293,02
54,43 x 10-3
6
DDH92 2
0,284
253,40
46,92 x 10-3
1.2 y = 0.002x - 0.009 R² = 0.990
1
absorbansi
0.8 0.6
Kurva Standar Glukosa
0.4
Linear (Kurva Standar Glukosa)
0.2 0 0 -0.2
100
200
300
400
500
ppm
Gambar kurva standar Glukosa
45
Lampiran 12. Contoh Perhitungan Kadar C-organik
% C-organik Kontrol = % C-organik Kontrol =
𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒔𝒂𝒎𝒑𝒆𝒍 𝒙 𝒎𝑳 𝒆𝒌𝒔𝒕𝒓𝒂𝒌 𝒙 𝒇𝒌
x 100%
𝒃𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒐𝒉 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝒍 𝟖𝟓,𝟐 𝒑𝒑𝒎 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝒎𝑳 𝒙 𝟏𝟎𝟎/𝟗𝟖 𝟏𝟎 𝒎𝒈 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝑳
x 100%
% C-organik Kontrol = 86,938 %
% C-organik JP72 = % C-organik JP72 =
𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒔𝒂𝒎𝒑𝒆𝒍 𝒙 𝒎𝑳 𝒆𝒌𝒔𝒕𝒓𝒂𝒌 𝒙 𝒇𝒌 𝒃𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒐𝒉 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝒍 𝟓𝟕,𝟏 𝒑𝒑𝒎 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝒎𝑳 𝒙 𝟏𝟎𝟎/𝟗𝟔 𝟏𝟎 𝒎𝒈 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝑳
x 100%
x 100%
% C-organik JP72 = 59,479 %
% C-organik DDH92 = % C-organik DDH92 =
𝒌𝒂𝒅𝒂𝒓 𝒔𝒂𝒎𝒑𝒆𝒍 𝒙 𝒎𝑳 𝒆𝒌𝒔𝒕𝒓𝒂𝒌 𝒙 𝒇𝒌 𝒃𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒐𝒉 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝒍 𝟑𝟏,𝟓𝟗𝟔 𝒑𝒑𝒎 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝒎𝑳 𝒙 𝟏𝟎𝟎/𝟗𝟓 𝟏𝟎 𝒎𝒈 𝒙 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝑳
x 100%
x 100%
% C-organik DDH92 = 33,258 %
160
y = 601.2x - 0.677 R² = 0.999
140 120
absorbansi
100 Konsentrasi (ppm)
80 60
Linear (Konsentrasi (ppm))
40 20 0 0.000 -20
0.050
0.100
0.150
0.200
0.250
0.300
ppm
Gambar Kurva Standar C-organik
46
Lampiran 13. Contoh Perhitungan Kadar N (nitrogen)
% kadar N Kontrol = % kadar N Kontrol =
𝒗𝒐𝒍𝒖𝒎 𝒔𝒂𝒎𝒑𝒆𝒍−𝒗𝒐𝒍𝒖𝒎 𝒌𝒐𝒏𝒕𝒓𝒐𝒍 𝒙 𝑵 𝑯𝟐𝑺𝑶𝟒 𝒙 𝑨𝒓 𝑵 𝒃𝒐𝒃𝒐𝒕 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒐𝒉 𝟐𝟒,𝟗𝒎𝑳 –𝟐𝟎𝒎𝑳 𝒙 𝟎,𝟎𝟒𝟗𝑵 𝒙 𝟏𝟒,𝟎𝟎𝟖
% kadar N Kontrol = 𝟏, 𝟔𝟖𝟐 % % kadar N JP72 = 𝟏, 𝟔𝟒𝟕 % % kadar N DDH92 = 𝟏, 𝟕𝟏𝟔 %
𝟐𝟎𝟎𝒎𝒈
x 100 %
x 100 %
47
Lampiran 14. Hasil Analisis Rasio C/N Dekomposisi Jerami Padi 𝑲𝒂𝒅𝒂𝒓 𝑪
Rasio C/N DDH92 = 𝑲𝒂𝒅𝒂𝒓 𝑵 Rasio C/N DDH92 =
𝟑𝟑,𝟐𝟓𝟖 𝟏,𝟕𝟏𝟔
Rasio C/N DDH92 = 19,381
Kode Isolat
Kadar C (%)
Kadar N (%)
Rasio C/N
Kontrol
86,938
1,682
51,687
JP72
59,479
1,647
36.113
DDH92
33,258
1,716
19,381
48
Lampiran 15. Gambar hasil Penelitian
Gambar kontrol dan bakteri selulolitik berasal dari jermi padi
Gambar medim cair isolat DDH92 Gambar isolat DDH92 pada media CCRA
Gambar kompos jerami padi dari kiri, control, JP72, dan DDH92.
49
Gambar isolat DDH92
Gambar jerami padi sebelum perlakuan
Gambar jerami sesudah perlakuan selama 30 hari dengan inokulum isolat DDH92
