Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput Amnion Terhadap Jaringan Paru yang Terpapar Asap Rokok; (Studi eksperimental pada mencit)

Handi Priambodo: Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput Amnion Terhadap Jaringan Paru yang Terpapar Asap Rokok

Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput Amnion Terhadap Jaringan Paru yang Terpapar Asap Rokok; (Studi eksperimental pada mencit) Handi Priambodo,1 Suradi,1 Reviono,1 Yusup S Sutanto,1 Ana Rima,1 Harsini,1 Yuyun Rindiastuti,2 Abdurahman Laqif,3 Indah Julianto2 1

Departemen Pulmonologi dan Kedokteran Respirasi, Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret, RSUD Dr. Moewardi, Surakarta 2 Departemen Kulit dan Kelamin, Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret, RSUD Dr. Moewardi, Surakarta 3 Departemen Obstetri dan Ginekologi, Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret, RSUD Dr. Moewardi, Surakarta

Abstrak

Latar belakang: Asap rokok menyebabkan peradangan paru dan apoptosis yang bermuara terjadinya PPOK. Sekresi sel punca mesenkimal (SPM) berperan penting dalam regenerasi jaringan paru. Penggunaan media terkondisi sel punca mesenkimal dapat menjadi alternatif untuk transplantasi sel punca mesenkimal. Media terkondisi yang diperoleh dari biakan3D SPM selaput amnion dalam kondisi hipoksia. Tujuan penelitian ini untuk menganalisis pengaruh media terkondisi SPM selaput amnion sebagai anti apoptosis pada kerusakan paru akibat asap rokok. Metode: Penelitian dilakukan dari Februari-Juni 2015. Penelitian ini dilakukan setelah mendapat persetujuan dari komite etik hewan. Untuk menyelesaikan penelitian ini digunakan sebanyak 30 ekor mencit yang diberi asap rokok selama 12 minggu, 15 ekor mencit diberi media terkondisi sel punca mesenkimal selaput amnion dan sisanya tidak, selanjutnya dilakukan pemeriksaan histopatologi melalui nilai mean linier intercept dan ekspresi active caspase 3 pada jaringan paru hewan coba yang dipapar asap rokok. Dengan uji in vitro sel fibroalveolar yang telah diberi media terkondisi sel punca mesenkimal dan diberi ekstrak asap rokok dinilai menggunakan MTT asay dan konsentrasi VEGF A. Hasil: Media terkondisi sel punca mesenkimal menghambat kerusakan paru yang dikonfirmasi dengan mLi yang rendah, selanjutnya menghambat terjadinya apoptosis sel paru yang dikonfirmasi dengan rendahnya tingkat caspase-3 (p=0.00). selanjutnya secara In-vitro menjelaskan bahwa media terkondisi sel punca mesenkimal selaput amnion mendorong proliferasi sel fibroalveolar (MTT assay; p=0.00), efek anti apoptosis dengan VEGF (VEGF pada media terkondisi sel punca mesenkimal =1082.06 pg/ml; grup kontrol= 261.027 pg/ml) Kesimpulan: Media terkondisi sel punca mesenkimal selaput amnion berpotensi menghambat kerusakan paru akibat asap rokok pada mencit dengan menghambat apoptosis sel dengan merangsang VEGF. (J Respir Indo. 2016; 36: 249-56) Kata kunci: Media terkondisi sel punca smesenkimal, apoptosis, asap rokok.

The Effect of Amniotic Membrane Mesenchymal Stem Cell Conditioned Media (MSC-CM) on Cigarette Smoke Induced Lung Damage (an experimental study in mice) Abstract

Background: Cigarette smoking causes pulmonary inflammation and apoptosi simplicated in COPD. MSC secreting factors plays crucial role in tissue regeneration. Using MSC conditioned media (MSC-CM) might be an alternativeto MSC transplantation. Conditioned media was obtained from hypoxic 3D culture of amniotic membrane MSC. This study aimed to test the effect of administration of MSC-CM in inhibiting apoptosis in cigarette smoke lung damage. The aim of this study is to test the effect of administration of MSC-CM in inhibiting apoptosis in cigarette smoke induced lung damage Methods: Research was conducted in 5 months from February to Juni 2015 and under ethical clearance approval. To accomplish this study, 30 mice were exposed to cigarrete smoke for 12 weeks, 15 mice followed by MSC-CM administration and others with unconditioned media, mean linier intercept (mLi) and Caspase-3 were measured from lung histophatology. In vitro study using fibroalveolar cell exposed to cigarette smoke exctract (2%CSE) followed with MSC-CM was conducted to confirm effect of MSC-CM by MTT assay and VEGF level measurement. Result: This research revealed that MSC-CM inhibit lung damage confirmed with significantly lower mLi, while inhibit pulmonary cell apoptosis with significantly lower Caspase-3 level in mice administered with MSC-CM (p=0.00). In vitro study provides the evidence that MSC-CM promote fibroalveolar proliferation (MTT assay; p=0.00), while mediates anti-apoptosis effect which partly depends on up regulating of VEGF (VEGF level of MSC-CM group=1082.06 pg/ml; control group 261.027 pg/ml) Conclusion: MSC-CM has therapeutic potential in cigarette smoke induced lung damage in mice by inhibiting cell apoptosis as well as upregulating VEGF. (J Respir Indo. 2016; 36: 249-56) Keywords: Cigarette smoke, apoptosis, stem cell conditioned media Korespondesi: Handi Priambodo E-mail: [email protected]; Hp: 08123185027

J Respir Indo Vol. 36 No. 4 Oktober 2016

249


PENDAHULUAN

media terkondisi sel punca mesenkimal mencegah

Pajanan asap rokok menyebabkan kerusakan jaringan paru melalui mekanisme stress oksidatif, infla masi menetap, degradasi matriks ekstraseluler oleh aktivitas protease, apoptosis, serta perbaikan abnormal jaringan paru yang bermuara pada terjadinya penyakit paru obstruksi kronik (PPOK).1 Penyakit paru obstruksi kronik adalah salah satu penyebab kematian utama karena merokok dan telah menjadi masalah kesehatan global.2 Stres oksidatif menyebabkan apoptosis sel epi tel alveolar dan emfisema melalui blokade reseptor vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A).3 Terapi terkini PPOK meliputi terapi suportif dan belum terdapat bukti yang cukup mengenai terapi regenerasi untuk memperbaiki

emfisema.2 Schweitzer

dkk1

menun

jukkan penurunan infiltrasi mediator inflamasi dan peru bahan emfisematous dengan transplantasi sel punca mesenkimal (SPM) jaringan adiposit dan didapatkan perbaikan endotel paru dengan pemberian media terkondisi sel punca mesenkimal pada jaringan paru tikus model yang dirusak dengan asap rokok. Hal ter sebut menunjukkan bahwa efek perbaikan sel punca mesen kimal mungkin dimediasi oleh mekanisme parakrin.4 Selaput amnion merupakan salah satu sumber sel punca mesenkimal yang berasal dari jaringan fetal. Selaput amnion telah menjadi sumber sel punca pilihan karena

pengambilan sampel

yang mudah, tidak

dibatasi kendala etik, potensi diferensiasi lebih baik daripada sel punca jaringan dewasa, serta toleransi imunologis yang lebih baik sehingga mudah dan aman untuk ditransplantasikan.5,6 Penelitian mengenai pengaruh media terkondisi sel punca mesenkimal (MT SPM) selaput amnion yang dihasilkan melalui metode biakan 3 dimensi kondisi hipoksia pada hewan model yang dipapar asap rokok untuk menginduksi kerusakan jaringan paru belum pernah dilakukan. Penelitian ini dilakukan untuk menganalisis kemampuan MT SPM dalam menghambat apoptosis jaringan paru akibat pajanan asap rokok melalui upregulasi VEGF A yang sejalan dengan peningkatan viabilitas dan proliferasi sel fibroalveolar. Penelitian ini menunjukkan kemampuan

250

apoptosis jaringan paru mencit (mus musculus) galur Balb-c yang dipapar dengan asap rokok. Uji in-vivo menunjukkan bahwa pada kelompok II yang diberi media terkondisi sel punca mesenkimal didapatkan nilai mLi sebagai penanda kerusakan alveolar yang lebih rendah dan ekspresi active caspase-3 sebagai penanda apoptosis yang lebih rendah. Uji in-vitro menunjukkan bahwa pada biakan sel fibroalveolar yang diberi ekstrak asap rokok 2% bersama media terkondisi sel punca mesenkimal memiliki viabilitas dan tingkat proliferasi sel yang lebih tinggi dengan kadar VEGF-A 4 kali lebih tinggi.7 METODE Cell line yang berasal dari biakan SPM selaput amnion P-1 yang dikembangkan oleh Laqif.7 di thawing untuk dibiakkan kembali dalam media tumbuh (alpha MEM (Gibco), 1% NEAA 100x(Gibco), 1% penstrep (10.000U/10.000ug/ml), 1% fungizone 250ug/ml, dan 10% fetal bovine serum (Gibco) pada inkubator dengan CO2 5% dan 370C. Subkultur sel punca dilakukan pada biakan sel yang telah mencapai konfluensi 70%. Subkultur dilakukan dengan metode tripsinasi hangat. Sel punca mesenkimal selaput amnion P-2 dilakukan purifikasi dengan imunomagnetik sorting. Biakan sel punca dilabel dengan antibodi microbeads anti human CD105 kemudian dilewatkan dalam kolom magnetik yang dipasang dalam magnetic stand untuk memperoleh biakan sel dengan CD105 positif sesuai protokol yang dianjurkan oleh Myltenill Biotech.7 Uji diferensiasi dilakukan untuk memastikan multipotensi dan kemampuan diferensiasi SPM. Sel punca mesenkimal P-3 dibiakkan dalam osteogenik media: 192ml media kultur, 10nM dexametason, 20nM beta gliserolfosfat, 50uM L-ascorbic acid; atau adipogenik media: 200ml media kultur, 0.5uM dexametason, 0.5uM IBMX, 50uM indometasin. Setelah 21 hari, biakan SPM diwarnai dengan alizarin red dan oil red. Biakan SPM P-3 dibiakkan dalam neurogenik media: 200ml media kultur, 5ng/ml all trans retinoid acid, untuk mengetahui kemampuan transdiferensiasi menjadi galur sel lain. Setelah 5 hari, biakan sel tersebut diwarnai dengan neural specific enolase (NSE).7 J Respir Indo Vol. 36 No. 4 Oktober 2016


Media terkondisi sel punca mesenklimal dibuat

Yong Kim dkk.9 40 ml asap rokok yang berasal dari

dari biakan sel punca mesenkimal pasase-4 dengan

rokok filter yang mengandung 8,5mg tar dan 0,9mg

modifikasi metode biakan badan embrioid sel punca dan

nikotin dialirkan melalui spuit injeksi steril ukuran 50ml

biakan dalam stirred bioreaktor pada kondisi hipoksia

ke dalam 10ml DMEM tanpa serum sambil diagitasi.

(2.2% O2, 5%CO2, dan nitrogen balanced). Setelah 24

Ekstrak asap rokok tersebut disterilisasi menggunakan

jam inkubasi, media terkondisi sel punca mesenkimal

filter millipore 0.22um dan merupakan ekstrak dengan

dikumpulkan kemudian difilter dengan millipore 45um

konsentrasi 100%.10

dan disimpan dalam suhu -20oC sampai digunakan.8 Penelitian dilakukan di LPPT unit IV UGM berdasarkan ethical clearance yang diterbitkan oleh panitia kelaikan etik UGM. Sebanyak 30 mencit galur Balb-c dengan berat badan 20-30 gram diasapi dengan rokok 5 batang/hari selama 12 minggu. Mencit dibagi menjadi 2 kelompok yang masing-masing terdiri dari 15 mencit. Mencit pada kelompok I diberi suntikan DMEM 30ul iv, sedangkan kelompok II diberi suntikan 30ul MT SPM iv. Penyuntikan dilakukan pada minggu kedua sampai ke-12, satu jam sebelum pengasapan. Pengambilan jaringan paru dilakukan pada hari ke-90 untuk dilakukan pemeriksaan histopatologi.7 Potongan longitudinal jaringan paru diwarnai dengan hematoksilin eosin (HE) untuk analisis mean linier intercept (mLi) dan dengan antibodi anti caspase-3 sebagai penanda apoptosis. Analisis mLi dilakukan ber dasarkan protokol yang dikembangkan oleh Masaru Suzuki M dkk.8 dengan modifikasi menggunakan soft ware Image J. Penghitungan intercept dilakukan pada 20 lapang pandang (perbesaran 200x) secara acak dalam setiap potongan jaringan paru. Intercept yang dihitung adalah jarak antara dinding alveolar, sedang kan gambaran dengan bronkus, pembuluh darah, dan ruang alveolar yang terkompresi dieksklusikan dari penghitungan.8 Ekspresi active caspase-3 ditentukan secara

Isolasi jaringan fibroblas dilakukan dengan metode eksplan dan dibiakkan dengan media kultur DMEM, 10% bovine serum, 1% penstrep, 1% fungizone dalam inkubator CO2 5% dan suhu 370C. Isolasi dan biakan sel epitel alveolar dilakukan berdasarkan metode yang dikembangkan oleh Robert dkk10 dan dimodifikasi di laboratorium. Sel epitel alveolar dibiakkan dengan media kultur: DMEM-HamF12, 10% fetal bovine serum, 1% penstrep, 1% fungizone, 1% L glutamin, 10ng/ml EGF dalam inkubator CO2 5% dan suhu 370C. Subkultur dilakukan pada biakan sel dengan konfluensi 70-80% dengan metode tripsinasi hangat. Kokultur dilakukan dengan membiakkan sel fibroblas bersama dengan sel epitel alveolar P-3 dalam media: DMEM-HamF12, 10% fetal bovine serum, 1% penstrep, 1% fungizone, 1%NEAA, 1% L-glutamin, 10ng/ml bFGF, 10ng/ml EGF.10 Uji in-vitro dilakukan pada biakan ko kultur yang telah diinkubasi selama 24 jam. Biakan sel fibroalveolar dibagi menjadi 2 kelompok, Kelompok I diberi ekstrak asap rokok 2% dalam DMEM + 1% FBS, sedangkan kelompok II diberi ekstrak asap rokok 2% dalam media terkondisi sel punca mesenkimal dan diinkubasi selama 24 jam. Biakan sel fibroalveolar dalam piring mikro bersumur 96 digunakan untuk uji proliferasi sel dengan MTT

otomatis dengan software Image J dengan menentukan

((3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium

resolusi pixel tertentu sesuai dengan intensitas eks

bromide) assay. MTT assay((3-(4,5-dimethylthiazol-

presi positif yang telah ditentukan oleh ahli Patologi

2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide) assay pada

Anatomi. Ekspresi active caspase-3 (+) dinyatakan

penelitian ini dilakukan untuk mengukur jumlah sel

sebagai persentase intensitas warna dalam pixel yang

yang viabel dan proliferasi sel dengan reagen Thiazolyl

membandingkan ekspresi sel (+) dengan total seluruh

blue tetrazolium bromide berdasarkan protokol yang

sel dalam area perhitungan.7

diberikan oleh Sigma.7-10

Preparasi ekstrak asap rokok dilakukan ber

Supernatan biakan sel tersebut dikumpulkan

dasarkan metode yang di kembangkan oleh Sun

untuk mengetahui sitokin yang dilepaskan dalam


251


media dengan uji ELISA. Dalam uji ELISA ini akan

Media terkondisi diperoleh dari biakan badan

dilakukan pemeriksaan VEGF-A. Uji ELISA dilakukan

embrioid 3D dalam stirred bioreaktor sederhana pada

berdasarkan protokol yang diberikan oleh reagen

kondisi hipoksia dengan 2.2% O2, 5% CO2, dan nitrogen

VEGF-A ELISA kit (RayBio). Kadar VEGF supernatan

balance. Teknik ini memungkinkan aliran oksigen, nut

pada masing-masing kelompok dihitung menggunakan

rien, dan hasil metabolisme yang menyerupai kondisi

rumus regresi yang diperoleh dari larutan standar yang

in-vivo. Pada teknik ini didapatkan peningkatan via

ditentukan dengan software curve expert 1.4.

bilitas dan proliferasi sel yang ditunjukkan dengan

Perbedaan rerata nilai mLi, ekspresi active caspase-3, serta viabilitas dan tingkat proliferasi sel

peningkatan diameter koloni 3D setelah 24 jam seperti pada gambar berikut

dianalisis menggunakan uji t tidak berpasangan dengan software SPSS 19.0 Nilai signifikansi, p<0.05 digunakan untuk menentukan kemaknaan hasil uji statistik.

a

HASIL Sel punca mesenkimal selaput amnion yang digunakan dalam penelitian ini merupakan cell line P-1 yang telah dikembangkan oleh Laqif7 dengan penanda permukaan CD44 dan CD105 (+) >95% serta CD45 dan CD34 (-)<2%. Uji diferensiasi dilakukan pada biakan sel punca P-3 yang telah disorting dengan metode MACS menggu nakan antibodi anti CD105 untuk menjamin plastisitas sel. Gambar berikut menunjukkan hasil uji difersensiasi SPM menjadi sel osteoblas, adiposit, dan neuron.

b

Gambar 3. Gambaran badan embrioid 3D. (A) koloni badan embrioid 3D pada piring mikro berdasar bulat (B) Koloni badan embrioid 3D dalam stirred bioreaktor-hipoksia setelah 24 jam. Terlihat diameter 1.5x lebih besar daripada koloni sebelum dibiakkan dalam stirred bioreaktor-hipoksia. Diamati dengan mikroskop inverted perbesaran 100x

Uji in vivo dilakukan pada hewan coba mencit (Mus musculus) jantan galur Balb-c yang berusia 10 minggu. Rata-rata berat badan mencit sebelum perlakuan pada kelompok I adalah 26.55 ± 2.73 gram dan pada kelompok II adalah 28.56 ± 1.46 gram. Pada akhir penelitian didapatkan rata-rata berat badan mencit kelompok I sebesar 37.07 ± 3.49 gram dan kelompok II sebesar 35.64 ± 2.83 gram. Jaringan

a

b

c

Gambar 1. Gambar (a) biakan sel setelahthawing, viabilitas 94% (b) biakan sel 24 jam setelah ditanam dengan kepadatan 60% (c) biakan sel 48 jam setelah ditanam dengan kepadatan 70-80%. Diamati dengan mikroskop inverted perbesaran 100x

a

b

c

Gambar 2. Uji diferensiasi sel punca mesenkimal. (A) sel osteoblas dengan pewarnaan alizarin red (B) sel adiposit dengan pewarnaan oil red (C) sel neuron dengan pewarnaan NSE. Diamati dengan mikroskop inverted perbesaran 100x.

252

paru pada kedua kelompok diambil setelah 90 hari perlakuan dan dilakukan pewarnaan menggunakan HE. Berikut adalah gambaran sediaan histopatologi jaringan paru yang telah diwarnai dengan HE.

Gambar 4. Gambaran histopatologi jaringan paru dengan pewarnaan HE (pelebaran ruang alveolar; infiltrasi sel radang). (A) Kelompok I, terlihat pelebaran ruang alveolar dan inflitrasi sel radang (B) Kelompok II, terlihat pelebaran ruang alveolar dan infiltrasi sel radang lebih ringan daripada kelompok I. Diamati dengan mikroskop perbesaran 200x.



Analisis kerusakan jaringan paru dilakukan dengan analisis mLi. Rata-rata mLi pada kelompok satu didapatkan 693.43 ± 30.1 um, sedangkan pada kelompok II 480.74 ± 38.0 um. Pada penelitian ini didapatkan perbedaan nilai mLi yang bermakna secara statistik antara kelompok I dan II yang ditunjukkan dengan nilai p=0.000 (p<0.05) pada uji t tidak berpasangan, dengan rerata perbedaan 212.67. Nilai mLi pada kelompok I didapatkan lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok

Gambar 6. Ko-kultur sel fibroalveolar (A) Kelompok I: sel fibroalveolar yang diberi ekstrak asap rokok 2% dalam DMEM 1% FBS (B) Kelompok II: sel fibroalveolar yang diberi ekstrak asap rokok 2% dalam MT SPM.

II yang mengindikasikan kemampuan MT SPM dalam

Rata-rata viabilitas dan tingkat proliferasi sel

menghambat kerusakan paru yang dipapar asap rokok.

kelompok satu didapatkan 58.0 ± 1.31%, sedangkan

Pada penelitian ini dilakukan pewarnaan imuno

pada kelompok II 89.6 ± 7.9%. Pada penelitian ini

histokimia dengan antibodi anti mouse active caspase-3

didapatkan perbedaan viabilitas dan tingkat proliferasi

untuk mengetahui tingkat apoptosis jaringan paru

sel yang bermakna secara statistik antara kelompok I

pada kedua kelompok. Berikut merupakan gambaran

dan II yang ditunjukkan dengan nilai p=0.000 (p<0.05)

sediaan histopatologi yang diwarnai antibodi anti

pada uji t tidak berpasangan, dengan rerata perbedaan

mouse active caspase-3.

31.63. Pada penelitian ini didapatkan viabilitas dan tingkat proliferasi sel pada kelompok II lebih tinggi secara bermakna daripada kelompok I yang mengindikasikan kemampuan MT SPM dalam menghambat apoptosis dan menjaga viabilitas serta meningkatkan kemampuan proliferasi sel fibroalveolar in-vitro.

Gambar 5. Gambaran histopatologi jaringan paru dengan pewar naan imunohistokimia antibodi anti mouse active caspase-3 (active caspase-3 positif). (A) Kelompok I (B) Kelompok II. Diamati dengan mikroskop perbesaran 200x.

Rata-rata ekspresi active caspase-3 pada kelompok satu didapatkan 0.033 ± 0.09 %, sedangkan pada kelompok II 0.0045 ± 0.001%. Pada penelitian ini didapatkan perbedaan ekspresi active caspase-3 yang bermakna secara statistik antara kelompok I dan II yang ditunjukkan dengan nilai p=0.000 (p<0.05) pada uji t tidak berpasangan, dengan rerata perbedaan 0.0285. Pada penelitian ini didapatkan ekspresi active caspase-3 pada kelompok I lebih tinggi secara bermakna daripada kelompok II yang mengindikasikan kemampuan MT SPM dalam menghambat apoptosis. Biakan fibroalveolar yang diberi ekstrak asap rokok bersama MT SPM menunjukkan konfluensi sel yang lebih banyak dengan gambaran morfologi yang lebih intak. Sedangkan biakan fibroalveolar yang diberi ekstrak asap rokok dalam 1% FBS mengalami

Berdasarkan

persamaan

regresi

larutan

standar, diperoleh kadar VEGF-A pada kelompok I 261.027 pg/ml dan pada kelompok II 1082.06 pg/ml. Kadar VEGF-A kelompok II didapatkan 4.2 kali lebih tinggi (CI 95%) daripada kelompok I sejalan dengan tingkat proliferasi dan viabilitas sel yang lebih tinggi serta ekspresi active caspase-3 pada jaringan paru mencit yang lebih rendah daripada kelompok II. Hal tersebut mengindikasikan bahwa pengaruh MT SPM dalam meningkatkan proliferasi dan viabilitas sel fibroalveolar serta menghambat apoptosis jaringan paru yang dirusak dengan ekstrak asap rokok yang dimediasi oleh upregulasi VEGF-A. PEMBAHASAN Beberapa penelitian menyebutkan bahwa efek regenerasi sel punca tidak dimediasi oleh kemampuan diferensiasi sel punca untuk memperbaiki jaringan yang rusak, melainkan oleh kemampuan sel punca untuk mensekresikan metabolit bioaktif. Faktor-faktor yang

apoptosis dan kerusakan struktur sel yang ditandai

disekresikan oleh sel punca meliputi growth factor dan

dengan bentuk sitoplasma sel ireguler

sitokin (secretome), exosome, dan mikrovesikel yang


253


ditemukan dalam media tumbuh dan disebut sebagai

yang menyebabkan kematian sel endotel alveolar.

media terkondisi sel punca.

Gangguan mikrosirkulasi akibat kerusakan sel endotel

11

Sel punca mesenkimal selaput amnion P-3

menyebabkan kematian sel pneumosit. Apoptosis

digunakan untuk membuat media terkondisi dengan

sel epitel alveolar merupakan mekanisme penting

teknik badan embrioid 3D pada stirred bioreaktor dalam

yang terlibat dalam kerusakan dinding alveolar yang

kondisi hipoksia. Penggunaan sel pada P-3 sejalan

bermuara pada terjadinya emfisema.17,18

dengan penelitian yang menyebutkan bahwa pada

Ekspresi active caspase-3 pada kelompok I

tingkatan ini sel bersifat lebih stabil dengan stabilitas

didapatkan lebih tinggi secara signifikan dibandingkan

kromosom yang baik. Penelitian menyebutkan bahwa

dengan kelompok II yang diinjeksi MT SPM yang

metode biakan sel punca dalam kondisi hipoksia dapat

menunjukkan kemampuan media terkondisi dalam

meningkatkan pluripotensi, kemampuan diferensiasi

menghambat apoptosis pada jaringan paru yang

sel punca, stabilitas genetik, dan meningkatkan ber

dipapar asap rokok. Hal ini sejalan dengan penelitian

bagai sitokin dan growth factor dalam media terkondisi

yang menyebutkan bahwa transplantasi sel punca

sel punca. Pada penelitian ini, biakan badan embrioid

mesenkimal sum-sum tulang dapat memperbaiki

3D dalam stirred bioreaktor meningkatkan jumlah

emfisema akibat pajanan asap rokok. Pada penelitian

dan viabilitas sel yang ditunjukkan dengan pertam

tersebut tidak didapatkan engraftment sel punca pada

bahan diameter badan embrioid. Hal ini sesuai

jaringan paru tikus setelah 2 bulan yang menunjukkan

dengan penelitian yang menunjukkan bahwa biakan

bahwa sel punca memperbaiki emfisema melalui

3D meningkatkan jumlah sel dan viabilitas bila di

mekanisme parakrin yang dimediasi oleh sekresi

ban dingkan dengan biakan monolayer sehingga

metabolit bioaktif.14

12

jumlah growth factor yang disekresikan lebih banyak.

Penelitian menunjukkan bahwa peningkatan

Penggunaan bioreaktor memungkinkan aliran nutrisi,

apoptosis pada PPOK tidak diimbangi dengan pening

oksigen, dan metabolit sel yang menyerupai ling kungan mikro dalam tubuh.13

katan kapasitas proliferasi.19 Kerusakan paru pada emfisema ditentukan oleh kemampuan proliferasi sel

Kerusakan jaringan paru pada penelitian

alveolar yang mengikuti apoptosis sel alveolar.20 Uji

ini ditunjukkan dengan nilai mLi. Nilai mLi pada

in-vitro pada sel fibroalveolar paru dilakukan untuk

kelompok I didapatkan lebih tinggi secara signifikan

mengetahui mekanisme yang mungkin terlibat dalam

daripada kelompok II yang diinjeksi media terkondisi

pengaruh MT SPM terhadap perbaikan jaringan paru

yang mengindikasikan kemampuan MT SPM dalam

mencit yang dipapar asap rokok. Pada penelitian ini

menghambat kerusakan jaringan paru. Penelitian

didapatkan tingkat proliferasi sel fibroalveolar paru

melaporkan bahwa pemberian SPM intrapulmonal

yang lebih tinggi secara signifikan pada kelompok

dapat memperbaiki kerusakan jaringan paru akibat

II dibandingkan dengan kelompok I melalui uji MTT

pajanan asap rokok melalui penurunan sitokin pro

assay. Hasil tersebut sejalan dengan penelitian yang

inflamasi seperti TNFα, IL-1β, MCP-1, IL-6, MMP-9,

menunjukkan kemampuan sel punca sum-sum tulang

dan MMP12, peningkatan aktivasi VEGF, VEGFR, dan

dalam meningkatkan survival dan proliferasi biakan

TGFβ1 yang sejalan dengan penurunan apoptosis.

sel fibroblas paru yang dirusak dengan ekstrak asap

14,15

Pajanan asap rokok meningkatkan ekspresi

rokok.1

cleaved caspase-3 pada sel alveolar tipe II yang

Penelitian menyebutkan bahwa sel punca

bermuara pada terjadinya apoptosis. Jalur apoptosis

mampu menginduksi aktivasi jalur Akt yang merupakan

ekstrinsik maupun intrinsik menyebabkan fragmentasi

sinyal penting dalam survival dan proliferasi sel.

DNA yang bermuara pada apoptosis melalui aktivasi

Selain itu, SPM dapat menekan apoptosis sel alveolar

cleaved caspase-3. Salah satu penyebab apoptosis

melalui modifikasi ekspresi protein apoptosis dan

sel epitel paru adalah penurunan ekspresi VEGF

antiapoptosis. Penelitian melaporkan bahwa SPM

16

254



mampu menekan ekspresi gen apoptosis Bax dan

SPM pada hewan model emfisema yang diinduksi

menginduksi ekspresi gen antiapoptosis Bcl-2 pada

dengan asap rokok menunjukkan kemampuan

hewan model emfisema yang diinduksi dengan

populasi sel tersebut dalam menghmbat apoptosis

papain. Selain itu, sel punca mesenkimal mampu

melalui stimulasi sekresi VEGF dan induksi VEGF

menekan tingkat ekspresi cleaved caspase-3 pada

reseptor 2 pada sel alveolar.19

sel alveolar yang mengindikasikan kemampuan

Penelitian ini belum dapat menentukan sumber

SPM dalam menurunkan apoptosis sel alveolar pada

VEGF yang berperan secara fungsional. Pada penelitian

emfisema. Metabolit bioaktif dalam media terkondisi

ini kemungkinan VEGF yang berperan dapat berasal

sel punca mampu meningkatkan proliferasi sel

dari kandungan VEGF MT SPM yang tinggi berkaitan

dengan menghambat interaksi antara p21 dengan PCNA dan memacu pembentukan kompleks CDK4.9 Beberapa growth factor seperti FGF, EGF, dan VEGF berperan dalam menghambat apoptosis sel

dengan induksi HIF 1A yang dapat meningkatkan

endotel dan sel alveolar melalui peningkatan ekspresi

tersebut disebabkan oleh beberapa kekurangan dalam

20

protein antiapoptosis Bcl-2 dan NOS melalui jalur Akt. VEGF merupakan growth factor yang bersifat pluripoten dan berperan penting dalam proliferasi sel endotel, perkembangan jaringan paru, dan beberapa kondisi patologis seperti PPOK, kanker paru, dan cedera paru akut. Penelitian menyebutkan bahwa pada pasien PPOK terjadi penurunan ekspresi VEGF-A dan VEGFR 2. Selain itu, inhibisi VEGF-A menginduksi apoptosis sel epitel alveolar yang bermuara pada terjadinya emfisema.15 Di lain pihak, penelitian menyebutkan bahwa pada PPOK terjadi peningkatan kadar VEGF, tetapi kadar tersebut tidak mencukupi untuk regenerasi sel alveolar paru. Pada penelitian ini dilakukan pengukuran kadar VEGF-A yang disekresikan oleh biakan sel fibroalveolar yang dipapar ekstrak asap rokok dan diberi MT SPM untuk mengetahui peran VEGF dalam meningkatkan viabilitas dan proliferasi sel fibroalveolar yang sejalan dengan kemampuannya dalam menghambat apoptosis. Kadar VEGF-A supernatan didapatkan lebih tinggi 4.2 kali pada kelompok II dibandingkan dengan kelompok I yang mengindikasikan bahwa upregulasi VEGF-A

secara

fungsional

berperan

dalam

meningkatkan survival dan proliferasi sejalan dengan kemampuan dalam menghambat apoptosis sel

sekresi VEGF. Penelitian ini belum dapat menunjukkan pengaruh MT-SPM dalam memperbaiki kerusakan paru akibat asap rokok khususnya emfisema, Hal penelitian ini, antara lain; penggunaan hewan model pada penelitian ini belum dapat mewakili kompleksitas kerusakan paru akibat asap rokok khususnya PPOK dan masih dibutuhkan penelitian panjang dan lebih mendalam untuk aplikasi MT SPM pada uji klinis. Selain itu, rancangan penelitian yang digunakan pada penelitian ini hanya dapat menunjukkan efek proteksi, tetapi belum dapat menunjukkan kemampuan MTSPM dalam meregenerasi kerusakan jaringan paru yang dipapar asap rokok. KESIMPULAN Media terkondisi sel punca mesenkimal dapat menjadi modalitas terapi dalam menghambat kerusakan jaringan paru akibat pajanan asap rokok. Penelitian ini menunjukkan bahwa media terkondisi sel punca mesenkimal yang dibuat dengan teknik 3D hipoksia dapat menghambat kerusakan dan apoptosis jaringan paru pada mencit yang dipapar asap rokok. Selain itu, media terkondisi sel punca mesenkimaldapat mempertahankan viabilitas dan tingkat proliferasi biakan sel fibroalveolar yang diberi ekstrak asap rokok melalui upregulasi VEGF A.

fibroalveolar. Jin dkk19 menyatakan bahwa blokade

DAFTAR PUSTAKA.

jalur VEGF menyebabkan apoptosis sel alveolar

1. Huh JW, Kim SY, Lee JH. Bone marrow repair

dan penurunan interaksi VEGF-VEGF reseptor

cigarette smoke-induced emphysema in rats. Am

pada tingkat protein maupun mRNA ditemukan pada

J Physiol lung Cell mol physiol. 2011;301:255-

pasien perokok dengan emfisema. Transplantasi

66.


255


2. Barnes PJ. The cytokine network in asthma and

11. Lane SW, Williams DA, Watt FM. Modulating the

COPD. The journal of clinical investigation. Am J

stem cell niche for tissue regeneration. Nature

Respir Cell Mol Biol. 2008;41:3546-56.

Biotechnology. 2014;32:1-9.

3. Tuder RM, Zhen L, Cho CY, Stewart LT, Kasahara

12. Rungarunlert S, Techakumphu M, Pirity MK, Dinnyes

Y, Salvemini D. Oxidative stress and apoptosis

A. Embryoid body formation from embryonic and

interact and cause emphysema due to vascular

induced pluripotent stem cells: Benefits of bio

endothelial growth factor receptor blockade. Am J Respir Cell Mol Biol. 2003;29:88-97. 4. Schweitzer KS, Johnstone BH, Garrison J, Rush NI, Cooper S, Traktuev DO. Adipose stem cell treatment in mice attenuates lung and systemic injury induced by cigarette smoking. Am J Respir Crit Care Med. 2011;183:215-25. 5. Niknejad H, Pierovi H, Jorjani M. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. European

Cells and Materials.

2008;15:88-99. 6. Mihu CM, Ciuca DR, Soritau O. Isolation and characterization of

mesenchymal stem cells

from amniotic membrane. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 2009;50:73-7. 7. Laqif A. Kajian terapi media terkondisi sel punca mesenkimal (MT SPM) selaput amnion terhadap folikulogenesis pada kasus kegagalan ovarium prematur (penelitian pada hewan coba tikus sprague dawley). Disertasi program studi ilmu kedokteran dan kesehatan reproduksi Universitas Gajah Mada. Yogyakarta; 2013. 8. Suzuki M, Betsuyuku T, Ito Y. Curcumin atte

13. Pawitan JA. Prospect of stem cell conditioned medium

in

regenerative

medicine.

BioMed

Research International. 2014;96:14. 14. Zang X, Zheng H, Zhang H, Ma W, Wang F, Liu C, et al. Increased interleukin (IL)-8 and decreased IL-17 production in chronic obstructive pulmonary disease (COPD) provoked by cigarette smoke. ELSEVIER. 2011;56:717-25. 15. Guan XL, Song L, Han FF, Cui ZL, Chen X, Guo XJ, et al. Mesenchymal stem cells protect cigarette smoke-damaged lung and pulmonary function partly via VEGF–VEGF receptors. Journal of Cellular Biochemistry. 2013;114:323-35. 16. Ahmed A, Thliveris JA, Shaw A, Sowa M, Gilchrist J, Scott JJE. Cigarette smoke induces apoptosis by activation of caspase-3 in isolated fetal rat lung type II alveolar epithelial cells in vitro. Open Journal of Respiratory Diseases. 2013;3:4-12. 17. Degterev A, Boyce M, Yuan J. A decade of caspases. Oncogene. 2003;22:8543-67. 18. Platiki M, Eleni T, Raytila P. Apoptotic mechanism in the pathogenesis of COPD. International journal of COPD. 2006;1:161-17.

nuates elastaseand cigarette smokeinduced

19. Jin Z, Pan X, Zhou K, Bi H, Wang L, Yu L et al.

pulmonary emphysema in mice. Am J Physiol

Biological effects and mechanisms of action

Lung Cell Mol Physiol. 2009;296:L614-62.

of mesenchymal stem cell therapy in chronic

9. Kim SY, Lee JH, Kim HJ. Mesenchymal stem cell conditioned media recovers lung fibroblast from cigarette smoke induced damage. Am J Physiol lung cell mol physiol. 2012;302:891-908. 10. Robert FG and Leland GD. Isolation and culture of pulmonary alveolar epithelial type I and type II cells from rat lungs. Methods Mol Biol. 2013; 945:145-59.

256

reactors. WJSC. 2009;1:1-11.

obstructive pulmonary disease. Journal of Interna tional Medical Research. 2015;43:303-10. 20. Rangasamay T, Misra V, Zhen L. Cigarette smoke induced emphysema in A/J mice associated with oxidative stress, apoptosis of lung cells, and global alteration of gene expression. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2009;296:888900.


Pengaruh Media Terkondisi Sel Punca Mesenkimal Selaput Amnion Terhadap Jaringan Paru yang Terpapar Asap Rokok; (Studi eksperimental pada mencit)

Recommend Documents