Jurnal AgroBiogen 6(1):1-9
Pencarian Alel untuk Identifikasi Gen Ketahanan Penyakit Hawar Daun Bakteri, Xa7 pada Plasma Nutfah Padi Lokal Indonesia Dwinita W. Utami1, Endang M. Septiningsih2, Triny S. Kadir3, Fatimah1, dan Siti Yuriyah1 1
Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Jl. Tentara Pelajar 3A, Bogor 16111 2 International Rice Research Institute, DAPO Box 7777, Metro Manila, Philippines 3 Balai Besar Penelitian Tanaman Padi, Jl. Raya 9, Sukamandi–Subang 41256
ABSTRACT Allele Mining of Bacterial Blight Resistance Gene, Xa7 on Indonesian Local Rice Germplasm. Dwinita W. Utami, Endang M. Septiningsih, Trini S. Kadir, Fatimah, and Siti Yuriyah. The abundance of novel genetic variation existing in germplasm collections is the foundation for variety improvement in plant breeding program. Nevertheless, studies on Indonesian genetic diversity rice germplasm using molecular markers are still poorly. Recent advances in utilizing of simple sequence repeat (SSR) in QTL mapping and whole rice genome sequences were positive support on genetic diversity of rice germplasm research. Based on these advance technology, we developed the research to discover new alleles at important gene loci that can be used for rice improvement. This approach is recognized as allele mining technology. On this study the target genes for allele mining research is the resistance gene for bacterial leaf blight pathogen, Xa7. This point was introduced by identify the genetic diversity of 96 accessions Indonesian local rice germplasm. The Xa7 allele mining was done by SNP (single nucleotide polymorphism) designing primers based on DNA sequence around the gene target. The significant LD map was detected by association mapping between phenotype and SNP genotyping data of the selected germplasm which having superior performance on BLB resistance and representing on genetic diversity clustering. The results shown that Xa7 allele variation were found in Parekaligolara (Indica, 15141), and Gajah Mada (Indica, 5856), which resistant to BLB races IV and VIII on generative stage and field condition. The significant Xa7-SNP8 and Xa7-SNP11 markers were associating with the LD map position of Xa7 gene on 28, 05-28,1Mb of chromosome 6 in rice genome. Key words: Xa7, allele mining, Indonesian rice local.
PENDAHULUAN Hakekat dari kegiatan pemuliaan tanaman yang telah terjadi selama ratusan tahun yang lalu, pada dasarnya adalah memilih alel-alel yang menguntungkan pada lokus-lokus yang penting. Hal ini dilakukan secara tidak langsung, yaitu dengan memilih tanaman berpenampilan terbaik berdasarkan fenotipenya. Dasar dari kegiatan pemuliaan tanaman ini adalah meHak Cipta © 2010, BB-Biogen
limpahnya keragaman genetik yang tersimpan dalam koleksi plasma nutfah di seluruh dunia. Kekayaan keragaman genetik ini merupakan bahan dasar untuk memperbaiki berbagai karakter tanaman, khususnya pada tanaman penting seperti padi. Kesulitan yang dihadapi dalam hal ini adalah bagaimana alel-alel menguntungkan yang cukup langka itu dapat ditemukan secara efisien di antara ribuan koleksi aksesi padi. Masalah ini menjadi lebih terasa ketika seleksi berdasarkan fenotipe saja sering tidak dapat digunakan untuk menemukan alel “terbaik” tersebut. Dengan pendekatan biologi molekuler, yaitu melalui teknologi pemetaan gen/Quantitative Trait Loci (QTL) diketahui bahwa alel-alel yang menguntungkan tersebut sering “tersembunyi” dan hanya dapat dideteksi dengan marka molekuler yang dapat secara langsung terpaut dengan alel menguntungkan yang diinginkan (Tanskley dan McCouch 1997). Perkembangan teknologi genomik, yang meliputi: pemetaan QTL, penemuan gen (gene discovery), dan tersedianya sekuen genom secara lengkap telah memungkinkan untuk mencari alel-alel yang berguna dalam koleksi plasma nutfah padi untuk perbaikan varietas melalui suatu strategi yang disebut dengan allele mining (pencarian alel). Secara umum, istilah ini mengacu pada tujuan untuk mendapatkan alel-alel yang menguntungkan dalam koleksi plasma nutfah menggunakan teknologi molekuler terkini. Definisi yang lebih spesifik mengacu pada proses untuk mendesain primer-primer untuk Polymerase Chain Reaction (PCR) berdasarkan sekuen DNA untuk suatu gen kandidat pada suatu varietas dari koleksi plasma nutfah yang ada dan bahkan juga dari kerabat liarnya. Alel-alel ini disekuen dan kemudian dibandingkan untuk menentukan perbedaan polimorfismenya. Dengan proses ini, berbagai alel dari suatu lokus dapat diisolasi (Latha et al. 2004, Rangan et al. 1999). Namun apabila gen kandidat belum tersedia, pendekatan lain harus ditempuh. Salah satu alternatifnya adalah menggunakan pendekatan pemetaan LD (linkage disequilibrium) untuk mendapatkan daerah genom yang sempit yang mengandung alel yang diinginkan (Morton 2005). Ber-
2
JURNAL AGROBIOGEN
lainan dengan pemetaan QTL, yang menggunakan populasi yang dikembangkan dari dua tetua saja, pemetaan LD dapat menggunakan secara langsung beberapa sampai ratusan aksesi yang berbeda untuk membuat peta tanpa harus melakukan persilangan (Flint-Garcia et al. 2003). Salah satu keunggulan dari teknologi pencarian alel (alllel mining) ini, yaitu kita dapat memilih daerah genom yang relatif kecil dengan lebih akurat menggunakan marker yang berpaut ketat dengan sifat penting yang diinginkan, sehingga dapat mengurangi atau bahkan meniadakan segregasi yang tidak diinginkan (negative linkage drag). Di samping itu, dengan teknologi ini dimungkinkan untuk memilih secara langsung alel yang kita inginkan pada suatu lokus, melalui proses yang disebut dengan pemilihan alel secara langsung (direct allele selection) (http:// smallgrains.cit.cornell.edu/about.html). Analisis gen kandidat dapat dilakukan dengan DNA sequencing dan Single Nucleotide Polymorphism (SNP) genotyping. Marka SNP mempunyai keunggulan dalam mendeteksi ada tidaknya polimorfisme dibandingkan dengan marka yang lain, karena marka ini dapat mendeteksi perbedaan hingga 1 nukleotida saja (Feltus et al. 2004). Hal ini sangat penting karena yang menjadi obyek penelitian dalam pencarian alel adalah daerah genom yang sudah sangat kecil, yaitu QTL atau gen. Dengan demikian perbedaan terkecil dalam QTL atau gen yang memberikan kontribusi yang nyata pada fenotipe dapat terdeteksi. Penyakit hawar daun bakteri (HDB) disebabkan oleh bakteri patogen Xanthomonas campestris pv. oryzae, merupakan salah satu penyakit utama pada pertanaman padi dan menyebabkan kehilangan hasil yang cukup signifikan setiap tahunnya, yaitu mencapai 15-25% (Yamamoto et al. 1977) dan bahkan perkembangan terakhir dapat mencapai 30-40% (Triny et al. 2007). Beberapa hasil pengujian pada tahun-tahun sebelumnya menunjukkan bahwa gen ketahanan terhadap penyakit HDB Xa7, belum “terpatahkan” oleh beberapa strain HDB yang dominan di lokasi endemik penyakit ini di Indonesia. Oleh karena itu gen Xa7 potensial sebagai kandidat gen pengendali penyakit HDB di Indonesia, sehingga pencarian alel gen Xa7 ini pada sejumlah koleksi plasma nutfah padi lokal Indonesia perlu dilakukan untuk mendapatkan sumber donor gen ini. Padi lokal adalah salah satu sumber genetik padi yang saat ini sudah terdesak oleh varietas unggul (Crowder 1997). Untuk itu perlu dilakukan eksploitasi plasma nutfah padi lokal yang selama ini masih banyak yang belum terkarakterisasi (Silitonga et al. 1995). Tujuan dari penelitian ini adalah mengidentifikasi alel gen Xa7 pada beberapa aksesi plasma nutfah padi
VOL. 6 NO. 1
lokal Indonesia dengan pendekatan allele mining menggunakan marka molekuler SNP yang spesifik untuk Xa7. BAHAN DAN METODE Material Genetik dan Evaluasi Tingkat Ketahanan Hawar Daun Bakteri Material genetik yang digunakan adalah 96 nomor aksesi plasma nutfah padi lokal yang memiliki keragaman genetik berdasarkan 30 marka SSR. Beberapa aksesi tersebut termasuk subspesies Indica dan Tropikal Japonica (Utami et al. 2006). Total 96 aksesi plasma nutfah tersebut tercantum pada Tabel 1. Sedangkan Ras/isolat HDB yang digunakan dalam penelitian ini adalah tiga ras HDB yang dominan di beberapa lokasi endemik penyakit ini di lapang, di Indonesia, yaitu RasIII, RasIV, dan RasVIII dan satu isolat yang secara relatif bersifat spesifik (correspond) untuk gen Xa7 yang belum diidentifikasi rasnya (Utami et al. 2007). Evaluasi tingkat ketahanan terhadap penyakit HDB dari 96 nomor aksesi plasma nutfah dilakukan di rumah kaca dan lapang, dengan menggunakan tiga ras dan satu isolat HDB. Pengujian dan penentuan tingkat ketahanan terhadap penyakit HDB di rumah kaca dilakukan dengan metode inokulasi pengguntingan terhadap 96 nomor aksesi plasma nutfah yang masing-masing ditanam 510 tanaman sebagai ulangan. Sedangkan pengujian di lapang juga dilakukan dengan metode inokulasi pengguntingan terhadap 5-10 tanaman di 4 titik diagonal dan 1 titik di tengah di setiap plot pengujian masingmasing nomor aksesi. Skoring tingkat serangan dilakukan berdasarkan skala intensitas serangan dan skala skor, sesuai dengan SES IRRI (1996). Data hasil pengujian fenotipe selanjutnya dianalisis statistik dengan metode Analisis Gerombol (Principal Component Analysis/PCA). Analisis ini dilakukan untuk mengelompokkan data berdasarkan kemiripan sifat tingkat ketahanan ke-96 nomor aksesi plasma nutfah yang diuji berdasarkan analisis perbaikan jarak dengan metode pautan rataan (Average Linkage) (Karson 1982). Tujuan dari analisis PCA ini adalah untuk memperoleh subsampel representatif yang meliputi aksesi-aksesi yang bersifat superior tahan ataupun yang bersifat peka (sebagai kontrol negatif untuk alel Xa7). Subsampel aksesi-aksesi plasma nutfah yang terpilih selanjutnya digunakan dalam analisis Xa7-LD dan Xa7-SNP genotyping.
2010
D.W. UTAMI ET AL.: Pencarian Alel untuk Identifikasi Gen Ketahanan Penyakit Hawar Daun Bakteri
3
Tabel 1. Sembilan puluh enam aksesi plasma nutfah padi lokal yang digunakan untuk evaluasi tingkat ketahanan penyakit HDB dan identifikasi alel Xa7. No. Plasma nutfah
No. reg
Subspesies
No. Plasma nutfah
No. reg
Subspesies
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49.
19285 19974 5643 5758 5856 6204 6601 6858 6877A 5730 5754 5758 7072 8146 8244 21290 8194 12571 13152 13160 13270 14716 14785 14964 14997 1514 15195 21165 21174 21175 12399 12674 12992 13102 13163 13194 13222 13232 13236 13253 13284 14657 14732 14749 14834A 14895 15138 15148
Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica
50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81. 82. 83. 84. 85. 86. 87. 88. 89. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96. 97. 98.
21256 20968 6332 5737 5742 5744 5648 C82 C98 C116 C119 C159 19780 19732 19736 19839 12348 15153 21177 21242 21244 21248 C2 C6 C13 C18 C20 C28 C37 C41 C47 C50 C60 C68 C75 C107 C109 C122 C126 C131 C135 C142 C146 C150 C166 C182 -
Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Indica Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Trop-Jap Kontrol peka Kontrol Xa7
Hawara Bunar P. Timai Mashuri Getik Menta Gajah Mada Pudak Kuning Djedah Tjere Bandung Komas a Utri Deli Markuti Mutu Gemas Kruet Sintang Rias Suling Sirentek Gondok Buban Bulang Kartuna Padi Lungkai Ileuy Jerai Nippon Parekaligolara Padi Banten IR54 Batanghari Indragiri Lima Bulan Kamang Padi Belanak K Puteh Gaca Teratai Pulut Pagae Inceklabu Kuntu Ameh Sirandah Hitam Ekor Lantiak Padi Tinggi Bintang Ladang Ketupat Condong Arias Halus Sipulut Merah A Nuri Bura Pare Bakatokaka Pare Mangata
Disain Primer Xa7-LD dan Xa7-SNP Berdasarkan Analisis Gen Kandidat dan DNA Sequencing Target dari penelitian allele mining ini adalah alel dari gen ketahanan HDB, Xa7. Gen ketahanan ini pada genom padi terdapat di kromosom 6 dengan ukuran ~1.200 kb. Untuk mengidentifikasi gen sebesar ini maka didisain 60 pasang PCR primer, yang ditandai dengan nama primer Xa7-LD. Primer-primer ini tersebar pada beberapa contig yang menjadi target, seperti terlihat pada Gambar 1. Primer-primer Xa7-LD tersebar
Pulut Namang Rumbay Pae Gudo Sampang Mendalet Manggar Ganefo P. ketan Alay P. Belanda P. A'gan P. Ba'an P. Jata Sibau Padi Jawa Melaya Semirit Gundil Pare Lambeun Ciganjur Pandan Bumbuy Inih Pulut Timuru Dupa P. Hitam P. Pulut Saleng P. Pulut Longbanga P. Ketan Merah P. Puti P. Timai P. Imban P. Atok Plong Liyo P. Mayun P. Pulut Jangan Pubek Bala P. ketan Sit P. Sekrit P. Krayan Pbat Kanjat P. Kelawit P. Kendanggang P. Pui P. Seribu P. Kley P. Telengusan P. Siam P. Libang TN1 IRBB7
dari contig AP004744 (pada posisi genom: 27.221.01527.221.432 bp) sampai dengan contig AP004797 (pada posisi genom: 28.409.251-28.409.822 bp). Disain primer dilakukan berdasarkan overlapping sekuen sepanjang 800 bp untuk setiap kali sekuen. Hasil sekuen dengan primer Xa7-LD selanjutnya dilakukan multiple alignment ke rice genome database (subspesies Japonica: http://rgp.dna.affrc.go.jp dan subspesies Indica: http://www.genomics.org.cn). Setiap hasil sekuen dari masing-masing produk PCR Xa7-LD yang diperoleh, selanjutnya digunakan
4
JURNAL AGROBIOGEN
untuk mengidentifikasi adanya situs SNP, yaitu adanya polimorfisme 1 basa nukleotida antara genom Indica dan genom Japonica. Berdasarkan situs SNP yang diperoleh selanjutnya didisain primer SNP, yang ditandai dengan nama Xa7-SNP dengan kriteria: primer yang berakhir satu basa sebelum lokasi SNP yang diminati. Target primer Xa7-SNP adalah produk PCR sebesar 700-800 pb (pasang basa), di setiap 20-30 kb daerah
VOL. 6 NO. 1
genom di sekitar dan dalam lokus gen-gen Xa7. Primer Xa7-SNP ini selanjutnya digunakan untuk kegiatan Xa7-SNP genotyping pada aksesi-aksesi plasma nutfah terpilih menggunakan Beckman SNP primer extension kit. Total primer Xa7-SNP yang digunakan adalah 12 primer yang tersebar di beberapa contig sekitar gen target Xa7 (Tabel 2).
AP003633: Xa7-LD16-Xa7-LD18
AP003628: Xa7-LD10-Xa7-LD15
Gambar 1. Beberapa contiq target primer Xa7-LD, yaitu AP003628 (27.413.412-27.487.479) didisain primer: Xa7LD10-15, AP003633 (27.413.804-27.541.675) didisain primer Xa7-LD16-18; AP003635 (27.633.05227.712.398) didisain primer: Xa7-LD19-22, AP005192 (27.734.724-27.781.279) didisain primer: Xa7-LD28. Tabel 2. Dua belas primer Xa7-SNP yang didisain dan digunakan untuk kegiatan Xa7-SNP genotyping. No. aksesi contig
Lokus TIGR
Primer Xa7-LD
Primer Xa7-SNP
AP004744 AP003633 AP003633
Posisi Motif Panjang Deskripsi gen Xa-LD SNP (bp) SNP (bp)
LOC_Os06g45120.1 (TIGR_LOCUS ID) LOC_Os06g45560.1 (TIGR_LOCUS ID) LOC_Os06g45590.1 (TIGR_LOCUS ID)
Xa7-LD3 Xa7-LD16 Xa7-LD17
Xa7-SNP1 Xa7-SNP2 Xa7-SNP3
746 664 100
C/T G/A G/A
25 30 35
AP003628
LOC_Os06g45480.1 (TIGR_LOCUS ID)
Xa7-LD13
Xa7-SNP4
582
C/T
40
AP006454 AP003628
LOC_Os06g46120.1 (TIGR_LOCUS ID) LOC_Os06g45500.1 (TIGR_LOCUS ID)
Xa7-LD34 Xa7-LD14
Xa7-SNP5 Xa7-SNP6
633 669
G/T T/C
45 50
AP003628 AP004989 AP003728
LOC_Os06g45510.1 (TIGR_LOCUS ID) LOC_Os06g46330.1 (TIGR_LOCUS ID) LOC_Os06g46370.1 (TIGR_LOCUS ID)
Xa7-LD15 Xa7-LD42 Xa7-LD43
Xa7-SNP7 Xa7-SNP8 Xa7-SNP9
418 342 583
G/A C/T C/T
55 60 65
AP003728
LOC_Os06g46380.1 (TIGR_LOCUS ID)
Xa7-LD44
Xa7-SNP10
709
A/T
70
AP004989
LOC_Os06g46310.1 (TIGR_LOCUS ID)
Xa7-LD40
Xa7-SNP11
705
T/C
75
AP004744
LOC_Os06g45350.1 (TIGR_LOCUS ID)
Xa7-LD9
Xa7-SNP12
309
A/G
80
V-type ATPase, A subunit hypothetical protein glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, type I, putative hyuC-like protein [imported]Arabidopsis thaliana polyubiquitin, putative copper-translocating P-type ATPase, putative thioredoxin, putative Protein kinase domain, putative 3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase, putative Protein prenyltransferase alpha subunit repeat, putative metal transporter nramp1 (atnramp1) expressed protein
2010
D.W. UTAMI ET AL.: Pencarian Alel untuk Identifikasi Gen Ketahanan Penyakit Hawar Daun Bakteri
Xa7-SNP Genotyping pada Akses-Aksesi Terseleksi Xa7-SNP genotyping dilakukan pada 22 aksesi plasma nutfah yang bersifat superior tahan berdasarkan analisis statistik untuk data hasil uji fenotipe di rumah kaca dan lapang ditambah dua galur kontrol, yaitu TN1 sebagai galur kontrol peka dan IRBB7 sebagai galur isogenik kontrol untuk gen Xa7. DNA dari plasma nutfah tersebut diamplifikasi dengan primer Xa7-LD, dengan komposisi PCR: 2 μl 10x bufer PCR; 0,6 μl MgCl2; 0,6 μl dNTP mix (10 mM); 1,2 μl Xa7-LD primer (F+R) (5 μM); 0,15 μl taq Polymerase; 2 μl DNA template (10 ng/μl). Program PCR yang digunakan sebagai berikut: 94C, 2 menit untuk denatuarasi awal; 94oC, 45 detik untuk denaturasi; 55oC, 45 detik untuk annealing; 68oC, 2 menit untuk proses pemanjangan (extension) dan total siklus yang digunakan 29 siklus, proses pemanjangan terakhir pada 72oC selama 7 menit. Setelah dilakukan purifikasi dengan enzim exonuclease I dan shirmp alkaline phosphatase (Exo/SAP), produk Xa7-LD yang diperoleh selanjutnya diamplifikasi dengan primer Xa7-SNP menggunakan Beckman SNP primer extension kit, untuk menandai posisi targer SNP di sekitar gen Xa7. Program PCR untuk Xa7-SNP adalah sebagai berikut: 96oC, 3 menit untuk denaturasi awal; 94oC, 20oC proses denaturasi; 50oC, 11 detik untuk annealing; total siklus sebanyak 25 siklus dan proses pemanjangan akhir dilakukan pada 72oC selama 30 detik. Hasil dari proses SNP genotyping selanjutnya di-running di mesin genetic analyzer CEQ8000 setelah dilakukan purifikasi SAP. Uji Gabungan (Association Test) Signifikansi korelasi antara keberadaan polimorfisme SNP dengan data fenotipe yang diperoleh di rumah kaca dan lapang untuk sifat ketahanan terhadap
5
penyakit HDB dianalisis dengan Uji Gabungan (Association Test) menggunakan software Tassel2_9_4i. Dari uji gabungan akan terdeteksi variasi alel gen Xa7 yang secara signifikan berkontribusi dalam membentuk keragaman sifat ketahanan terhadap ras dan isolat HDB uji. Secara garis besar tahapan analisis yang dilakukan dalam penelitian ini seperti pada diagram alur pada Gambar 2. HASIL DAN PEMBAHASAN Pengujian Fenotipe Tingkat Ketahanan terhadap Empat Isolat/Ras HDB Data hasil pengujian fenotipe tingkat ketahanan terhadap tiga ras dominan (Ras III, IV, dan VIII) dan satu isolat yang relatif correspond untuk gen Xa7 menunjukkan adanya keragaman dalam respon tingkat ketahanannya. Keragaman ini terlihat dari hasil analisis gerombol yang dilakukan berdasarkan dengan pemotongan dendrogram kesamaan pada tingkat 76,5%. Karakteristik setiap gerombol diperoleh berdasarkan nilai rata-rata masing-masing peubah yang diamati, yaitu tingkat ketahanan terhadap ras/isolat uji. Berdasarkan hasil analisis ini menunjukkan bahwa pada pengujian di rumah kaca pada fase bibit dan dewasa secara berurutan mengelompok menjadi 7 dan 6 gerombol. Sedangkan berdasarkan hasil pengujian di lapang, 96 aksesi plasma nutfah yang diuji berdasarkan tingkat ketahanannya terhadap penyakit HDB, mengelompok menjadi 9 gerombol (data tidak ditampilkan). Berdasarkan hasil analisis gerombol, selanjutnya dipilih aksesi plasma nutfah yang termasuk dalam gerombol terbaik (bersifat superior tahan) baik pada fase bibit, dewasa ataupun di lapang. Aksesi yang terpilih adalah Parekaligolara, Gajah Mada, Inceklabu, dan Pare Lambeun. Di samping aksesi-aksesi tersebut
96 aksesi plasma nutfah padi lokal Indonesia dengan 2 galur kontrol
Disain primer: Xa7-LD: untuk sekuensing Xa7-SNP: untuk SNP genotyping
Evaluasi tingkat ketahanan 3 ras dan 1 isolat HDB: →analisis statistik gerombol/PCA
Xa7-LD dan Xa7-SNP genotyping menggunakan 12 primer Xa7-LD dan Xa7-SNP yang telah didisain
Subset sampel: 22 aksesi plasma nutfah dan 2 galur kontrol (TN1 dan IRBB7)
Uji gabungan untuk memperoleh variasi alel Xa7 pada kandidat plasma nutfah Gambar 2. Diagram alur tahapan penelitian pencarian alel gen ketahanan terhadap penyakit HDB, Xa7.
6
JURNAL AGROBIOGEN
beberapa aksesi dengan penampilan terbaik di setiap gerombol yang lain juga dipilih sehingga total aksesi plasma nutfah terpilih sebanyak 22 aksesi ditambah dua galur kontrol, yaitu TN1 sebagai galur kontrol peka terhadap penyakit HDB dan IRBB7 sebagai galur isogenik untuk gen Xa7. Secara keseluruhan ke-24 nomor aksesi beserta respon tingkat ketahanannya ditampilkan pada Tabel 3. Hasil pada Tabel 3 menunjukkan bahwa respon tingkat ketahanan terhadap 4 ras/ isolat HDB pada 22 nomor aksesi plasma nutfah padi lokal beserta 2 galur kontrol (TN1 dan IRBB7) menunjukkan adanya respon ketahanan yang bervariasi dari respon sangat tahan (ST) sampai dengan sangat peka (SP). Keragaman respon ketahanan pada sampel material genetik yang digunakan ini penting untuk dipertahankan dalam penentuan subsampel karena untuk menjamin tersedianya semua kemungkinan variasi alel sehingga analisis LD untuk gen target Xa7 lebih terandal. Di samping itu, Tabel 3 juga menunjukkan bahwa galur kontrol peka TN1 bersifat peka (P) dengan demikian menunjukkan bahwa pengujian di atas telah optimum. Sedangkan tanaman kontrol galur isogenik Xa7, IRBB7 menunjukkan respon agak tahan (AT). Respon AT untuk semua isolat ras dan isolat HDB yang digunakan pada galur IRBB7 menunjukkan aktivasi gen Xa7 yang tidak optimum oleh isolat 93-229. Hal ini karena belum diketahuinya faktor virulensi yang terdapat pada ras-ras dan isolat uji yang digunakan, termasuk
VOL. 6 NO. 1
isolat 93-229, sehingga aktivasi spesifik gen Xa7 belum diperoleh. Namun demikian ketahanan beberapa aksesi plasma nutfah terpilih menunjukkan respon tahan terhadap ras-ras HDB dominan baik dalam pengujian di rumah kaca ataupun di lapang. Beberapa aksesi ini berpotensi memiliki alel ketahanan terhadap penyakit HDB. Data fenotipe di atas selanjutnya digunakan untuk analisis Xa7-SNP genotyping. Xa7-SNP Genotyping Analisis Xa7-SNP genotyping dilakukan menggunakan 12 primer SNP yang telah didisain di sekitar gen Xa7 (Tabel 2) pada 22 sampel nomor aksesi plasma nutfah padi lokal dan 2 galur kontrol. Salah satu hasil analisis genotyping dengan primer Xa7-SNP6 yang dirunning di mesin genetic analyzer CEQ8000, seperti pada Gambar 3. Salah satu hasil Xa7-SNP genotyping pada Gambar 3 menunjukkan bahwa salah satu aksesi plasma nutfah padi yang dianalisis menggunakan primer Xa7SNP6, yaitu Parekaligolara pada basa nuklotidanya ke47 memiliki basa T (Timin). Basa T pada lokus Xa7SNP6 ini menunjukkan bahwa Parekaligolara mempunyai tipe Xa7-SNP6 yang termasuk dalam kelompok padi subspesies Indica. Hal ini terlihat pada Tabel 2 bahwa Xa7-SNP6 memiliki motif SNP T/C. Hal ini me-
Tabel 3. Respon tingkat ketahanan 24 aksesi plasma nutfah padi lokal terhadap 3 ras HDB dominan di lapang, yaitu RasIII, RasIV, dan Ras VIII dan 1 isolat spesifik untuk gen Xa7, isolat 93-229. Sampel Gondok Pulut Namang Manggar Parekaligolara P. Pui P. Kley P. Belanda P. Puti Sampang P. Kendanggang Pae Gudo P. Siam Menta Kuntu Ameh Pulut Long Banga Gajah Mada Melaya Semirit Mahsuri Tjere Bandung Pandan TN1 IRBB7
Subspesies Indica Indica Indica Indica Trop Jap Trop Jap Indica Trop Jap Indica Trop Jap Indica Trop Jap Indica Indica Trop Jap Indica Trop Jap Trop Jap Indica Indica Trop Jap Japonica Indica
Stadia Bibit
93-229* AP P P AP P AP P AP AP AP P AP AP AP AP AP AT AT AT AT AT AT AT
Stadia Dewasa
Lapang
III
IV
VIII
III
IV
VIII
III
IV
VIII
AP T ST T AT AT T T T ST T ST AT T ST AT AP AT AT AT T AT AT
AP T MS T AT T T T T AP AT AT ST T AT T AP AT AT MS T T AT
T T AT T ST ST T T ST ST ST AP AP T ST AT P AP AP T AT
T AP AT AT AP AT AT MS AT AT T AP AT T AT AT T P AT AT AT AP AT
T AP AT AT AT AT AT MS AT AT AT AP T AT AT T AT AT AT AT
T T T T AT AT AT MS AT AT AT AP AP AT AT AT AT AT AP AT
AT AT MS AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AT AP AT AT T AT
AT AT MS AT AP MS P P P P AT AT AP AT P AT AP P P P P AT AT
AT AT MS AT P P P P P P AT AP AP AP P AT AP AP AP P P AT AT
* berdasarkan pengujian di rumah kaca. ST = sangat tahan (0%), T = tahan (1-5%), AT = agak tahan (6-25%), AP = agak peka (26-50%), P = peka (51-75%), SR = sangat rentan (76-100%).
2010
D.W. UTAMI ET AL.: Pencarian Alel untuk Identifikasi Gen Ketahanan Penyakit Hawar Daun Bakteri
nunjukkan adanya polimorfisme basa nukleotida T (Timin) pada subspesies Indica dan C (Cytisin) pada subspesies Tropical Japonica. IRBB7 sebagai tanaman kontrol isogenik gen Xa7, merupakan galur isogenik dari persilangan kultivar DV85 (Indica, asal Bangladesh) sebagai donor gen Xa7 dengan kultivar IR24 (Indica, asal IRRI, sebagai tetua pemulih) (Sidhu et al. 1978, Ogawa et al. 1991), memiliki tipe Xa7-SNP kelompok subspesies Indica. Berdasarkan data SNP genotyping dengan 12 primer Xa7-SNP selanjutnya dilakukan analisis LD mapping gen target Xa7 dan diperoleh hasil seperti tergambar dalam Gambar 4. Hasil tersebut menunjukkan adanya 3 region LD dengan tingkat signifikansi polimorfis paling tinggi. Ketiga region LD gen Xa7 adalah LD1: SNP2 sampai SNP12 (meliputi LD16-LD9 dengan posisi contig = 27.370.133-27.541.931); LDII: SNP4 sampai SNP10 (meliputi LD13-LD44 dengan posisi contig = 27.451.531-28.100.952); dan LDIII: SNP5 sampai SNP6 (meliputi LD34-LD14 dengan posisi contig = 27.475.112-27.914.495). Posisi LDI, LDII, dan LDIII yang bersifat signifikan digambarkan pada Gambar 4. Untuk menentukan region mana yang mempunyai keterpautan dengan gen target maka dilakukan
uji gabungan (association testing) antara data genotyping Xa7-SNP dengan data fenotipe. Uji lanjutan ini diperlukan untuk menentukan alel dari region LD mana dari lokus gen Xa7 yang berkontribusi secara nyata dalam membentuk sifat ketahanan terhadap penyakit HDB. Analisis dilakukan dengan Ujoint dan GLM test menggunakan program Tassel2_9_4i. Hasil analisis di atas juga merupakan hasil plot LD map dari 12 marka Xa7-SNP yang menandai lokus alel yang berbeda untuk gen Xa7. Hasil pada Gambar 4 menunjukkan bahwa dari 12 primer Xa7-SNP yang didisain berdasarkan sekuen region gen Xa7, terdapat 2 region yang signifikan terhadap data fenotipe tingkat ketahanan terhadap penyakit HDB. Region pertama yang signifikan tersebut terdapat pada region antara marka Xa7-SNP11 sampai dengan Xa7-SNP8 (pada contig AP004989) dengan tingkat signifikansi P-val: 0,00045. Region ini terdiskripsi sebagai gen protein kinase domain dan ditandai dengan fenotipe tanaman yang bersifat tahan pada pengujian lapang terhadap ras IV dan VIII. Plasma nutfah dengan penampilan seperti ini diperoleh pada plasma nutfah Parekaligolara (No. aksesi 15141). Region yang lain ditandai antara marka Xa7-SNP8 sampai dengan Xa7-SNP9 (contig
Parekaligolara_Xa7-SNP6
4000
3500 88
3000 Xa7-SNP6 T
13
2500
2000
1500
1000
500 89,21 0 0
10
20
30
40
7
50
60
70
80
90
Size (nt) Gambar 3. Genotipe salah satu sampel Parekaligolara dengan primer Xa7-SNP6. Pada lokus Xa7-SNP6, pada posisi basa ke-47 mempunyai basa nuklotida T (Timin) (warna biru). Puncak warna merah adalah DNA standard yang berukuran 13 dan 88 basa nukleotida.
8
JURNAL AGROBIOGEN Genomic position: 28.015.701-28.049.362 33,661 bp.
p-val 0,00045 LDIII: SNP5-SNP6
p-value 0,0035
VOL. 6 NO. 1
LDII: SNP4-SNP10 LDI: SNP12-SNP2 Xa7-SNP1
Xa7-SNP4
Xa7-SNP12
Xa7-SNP7
Xa7-SNP6
Xa7-SNP3
Xa7-SNP2
Xa7-SNP9
Xa7-SNP11
Xa7-SNP5
Parekaligolara (15141) Protein kinase dom, R di lapang terhadap ras IV dan VIII LOC_Os06g46330.1
Xa7-SNP8
Xa7-SNP10
Gajah Mada (5856) 3-hydroxyisobutirate dehidrogenase R in generative stg to race IV LOC_Os06g46370.1
Gambar 4. Analisis gabungan (association test) antara Xa7-SNP genotyping dengan data phenotyping tingkat ketahanan terhadap penyakit HDB, menggunakan ras III, IV, dan VIII, hasil pengujian di rumah kaca dan lapang.
AP003728) dengan tingkat signifikansi yang lebih rendah, yaitu P-val: 0,0035. Region ini terdiskripsi sebagai gen 3-hydroxyisobutirate dehidrogenase dan ditandai dengan fenotipe tanaman yang bersifat tahan pada fase dewasa terhadap ras IV. Plasma nutfah dengan penampilan seperti ini terdapat pada plasma nutfah Gajah Mada (No. aksesi 5856). Kedua aksesi, Parekaligolara dan Gajah Mada termasuk kelompok subspesies Indica. Kedua plasma nutfah ini memiliki genotipe Xa7-SNP yang sama dengan galur isogenik IRBB7 sebagai kontrol alel gen Xa7 yang juga memiliki tipe alel Indica. Namun demikian kedua aksesi plasma nutfah di atas memiliki variasi alel yang berbeda untuk gen Xa7. Variasi alel Xa7 yang terdapat pada plasma nutfah Parekaligolara berkaitan dengan protein kinase domain, sedangkan variasi alel yang terdapat pada plasma nutfah Gajah Mada berkaitan dengan protein 3-hydroxyisobutirate dehidrogenase. Meskipun masih perlu dikonfirmasi lebih lanjut, namun terdapat indikasi bahwa kedua aksesi plasma nutfah padi lokal di atas dapat dimanfaatkan sebagai sumber alel gen Xa7 yang selama ini belum diketahui. Salah satu posisi LD map yang signifikan, yaitu LD map pada posisi genomik: 28.015.701-28.049, yaitu yang terdapat pada contig AP004989 berdekatan dengan hasil pemetaan fisik melalui BAC klon gen Xa7 pada tanaman Nipponbare yang dilakukan oleh Chen at al. (2002) dan Porter et al. (2003), yang menyebutkan bahwa gen Xa7 terletak sepanjang contiq AP005192 sampai dengan contiq AP004989, yaitu posisi genomik: 27.735.172-28.015.701. Sedangkan hasil pe-
nelitian terbaru pemetaan gen Xa7 oleh Chen et al. (2008) diketahui bahwa gen Xa7 terdapat pada contig AP006056 dengan posisi genomik: 27.95354327976.665. Di samping itu, pada posisi genomik ini juga diketahui terdapat 3 marka mikrosatelit yang ber cosegregation dengan gen Xa7, yaitu RM20589, RM20590, dan RM20591 (Chen et al. 2008). Untuk pengembangan penelitian lanjutan, ketiga marka mikrosatelit tersebut dapat diaplikasikan ke aksesi Parekaligolara dan Gajah Mada untuk mendisain Xa7-SNP baru yang berco segregation langsung dengan gen Xa7. Berdasarkan hasil yang diperoleh maka marka Xa7-SNP8 dan Xa7SNP11 adalah marka yang terdekat dengan gen Xa7 dari 12 marka Xa7-SNP yang didisain yang dapat digunakan untuk membantu proses seleksi plasma nutfah ataupun hasil pemuliaan sebagai marka MAS (Marker Assisted Selection). KESIMPULAN DAN SARAN Telah diperoleh dua kandidat variasi alel gen Xa7, yaitu (1) variasi alel yang berkaitan dengan protein kinase domain, yaitu terdapat pada plasma nutfah Parekaligolara (Indica, 15141), dengan fenotipe tanaman yang bersifat tahan pada pengujian lapang terhadap ras IV dan VIII dan 2. Variasi alel yang berkaitan dengan protein 3-hydroxyisobutirate dehidrogenase, yaitu terdapat pada plasma nutfah Gajah Mada (Indica, 5856), dengan fenotipe tanaman yang bersifat tahan pada fase dewasa terhadap ras IV.
2010
D.W. UTAMI ET AL.: Pencarian Alel untuk Identifikasi Gen Ketahanan Penyakit Hawar Daun Bakteri
Kedua variasi alel untuk gen Xa7 terpetakan pada posisi LD map 28,05-28,1 Mb dari kromosom 6, yang ditandai dengan marka yang terpaut Xa7-SNP8 dan Xa7-SNP11. Kedua marka tersebut dapat digunakan untuk membantu proses seleksi plasma nutfah ataupun hasil pemuliaan sebagai marka MAS. Sebagai penelitian lanjutan, dalam rangka mengkonfirmasi dua kandidat variasi alel gen Xa7 yang diperoleh maka diperlukan identifikasi gen avr pada ras atau isolat HDB yang digunakan dalam pengujian yang secara spesifik correspond dengan gen Xa7. DAFTAR PUSTAKA Chen, M., G. Presting, W.B. Barbazuk, J.L. Goicoechea, B. Blackmon, G. Fang, H. Kim, D. Frisch, Y. Yu, S. Sun, S. Hgingbottom, J. Phimphilai, Dphimphilai, S. Thurmond, B. Gaudette, P. Li, J. Liu, J. Hatfield, D. Main, K. Farar, C. Henderson, L. Barnett, R. Costa, B. Williams, S. Walser, M. Atkins, C. Hall, M.A. Budiman, J.P. Tomkins, M. Luo, I. Bancroft, J. Salse, F. Regad, T. Mohapatra, N.K. Singh, A.K. Tyagi, C. Soderlund, R.A. Dean, and R.A. wing. 2002. An integrated physical and genetic map of the rice genome. Plant Cell 14:537-545. Chen, S., Z. Huang, L. Zeng, J. Yang, Q. Liu, and X. Zhu. 2008. High resolution mapping and gene prediction of Xanthomonas oryzae pv. oryzae resistance gene Xa7. Mol. Breed. 11032-009-9187-1. Crowder, L.V. 1997. Genetika Tumbuhan. Gadjah Mada University Press. Feltus, A.F., J. Wan, S.R. Schulze, J.C. Estill, N. Jiang, and A.H. Paterson. 2004. An SNP resource for rice genetics and breeding based on subspecies Indica and Japonica. J. Genome Res.14:1812-1819. Flint-Garcia, S.A., J.M. Thornsberry, and E.S. BucklerIV. 2003. Structure of linkage disequilibrium in plants. J. Annu. Rev. Plant. Biol. 54:357-374. IRRI. 1996. Standard International Rice Philippinnes.
Evaluation Research
System for Rice. Institute. Manila,
Karson, M.J. 1982. Multivariate Statistical Methods. The Iowa Stape University Press. Latha, R., L. Rubia, J. Bennett, and M.S. Swaminathan. 2004. Allele mining for stress tolerance genes in Oryza species and related germplasm. Mol. Biotechnol. 27:101-108. Morton, N.E. 2005. Linkage disequilibrium and association pemetaan. J. Clin. Invest. 115:1425-1430. Ogawa, T., T. Yamamoto, G.S. Khush, and T.W. Mew. 1991. Breeding of near-isogenic lines of rice with single genes for resistance to bacterial blight pathogen (Xanthomonas campestris pv. oryzae). Japan J. Breed. 41:523-529.
9
Porter, B.W., J.M. Chittoor, M. Yano, T. Sasaki, and F.F. White. 2003. Development and mapping of markers linked to the Rice Bacterial Blight resistance gene Xa7. Crop Sci. 43(4):1484-1492. Rangan, L., S. Constantino, G.S. Khush, and M.S. Swaminathan. 1999. The feasibility of PCR-based allele mining for stress tolerance genes in rice. Rice Genet. Newsletter 16:43-47. Shidu, G.S., G.S. Khush, and T.W. Mew. 1978. Genetic analysis of bacterial blight resistance in seventy-four cultivars of rice, Oryza sativa L. Theor. Appl. Genet. 53:105-111. Tanskley, S.D. and S.R. McCouch. 1997. Seed banks and molecular maps; unlocking genetics potential from the wild. Science 277:1063-1066. Triny, S.K., I. Hanarida, D.W. Utami, S. Koerniati, A.D. Ambarwati, A. Apriana, dan S. Sisharmini. 2007. Evaluasi ketahanan populasi haploid ganda silangan IR64 dan Oryza rufipogon terhadap hawar daun bakteri pada stadia bibit. Buletin Plasma Nutfah. Silitonga, T.S., H.R. Hifni, M. Amir, K. Kardin, dan A. Nasution. 1995. Evaluasi keragaman genetik plasma nutfah padi. Dalam Kinerja Penelitian Tanaman Pangan. Puslitbangtan. Bogor. hlm. 20-23. Utami, D.W., E.M. Septiningsih, A. Nasution, Santosa, Fatimah, dan S. Yuriyah. 2006. Pencarian alel-alel baru untuk gen-gen penting toleran cekaman biotic dan abiotik pada padi. Struktur populasi keragaman genetik plasma nutfah padi dan evaluasi ketahanan terhadap penyakit blas (Pyricularia grisea) untuk pencarian alelalel baru. Laporan Hasil Penelitian APBN. BB-Biogen, Badan Litbang Pertanian Departemen pertanian. Utami, D.W., E.M. Septiningsih, I. Hanarida, S. Yuriyah, dan I. Ridwan. 2007. Pencarian alel-alel baru untuk gen-gen penting toleran cekaman biotik dan abiotik pada padi. Pencarian alel gen ketahanan terhadap penyakit hawar daun bakteri, Xa7 menggunakan marka molekuler SNP (Single Nucleotide Polymorphism) dan Xa26 berdasarkan analisis sekuensing dan evaluasi tingkat toleransi plasma nutfah padi terhadap keracunan Fe di lapang dan disain primer Fe-SNP. Laporan Hasil Penelitian APBN. BB-Biogen, Badan Litbang Departemen pertanian. Yamamoto, T., H.R. Hifni, M. Machmud, T. Nishizawa, adn D.M. Tantera. 1977. Variation in phatogenicity of Xanthomonas oryzae and resistance varieties to the pathogen. Contribution 28. Centr. Res. Inst. Agric. Bogor. 22 p.
