15
LAMPIRAN
15
Lampiran 1 Tahapan penelitian
Pembuatan Media
Kultur Bakteri
Isolasi DNA kromosom bakteri
Pemotongan DNA dengan enzim restriksi
Kloning DNA
Isolasi DNA plasmid hasil kloning
Analisis dengan elektroforesis gel agarosa
Pemanenan sel bakteri
16
Lampiran 2 Standar Operational Procedure “High Pure PCR Template Preparation Kit” 1.Untuk bebas nuklease 1.5 ml tabung mikrosentrifus a. Sel bakteri ditambahkan 200 µl. b. Disentrifugasi selama 5 menit pada 3000 g. c. Pelet sel diresuspensi dalam 200 µl PBS. Ditambahkan 5µl lisozim (10 mg/ml dalam 10 mM Tris-HCl, pH 8.0) dan diinkubasi 15 menit pada suhu 37°C. 2. Untuk sampel bahan a. Ditambahkan 200 µl Binding Buffer. b. Ditambahkan 40 µl Proteinase K. c. Dicampur segera dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 70°C. Ditambahkan 100 µl Isopropanol dan dicampur dengan baik. a. Satu High Filter Tube disisipkan dalan satu Collection Tube. b. Cairan sampel dipipet ke dalam the upper buffer reservoir pada tabung filter. c. Di sisipkan the entire High Pure Filter Tube digabung ke dalam standar tabletop Centrifuge. d. Disentrifugasi 1 menit pada 8,000 g. Setelah disentrifugasi: a. Filter Tube dihilangkan dari tabung koleksi, dibuang cairan dan tabung koleksinya. b. Tabung filter dikombinasikan dengan tabung koleksi yang baru. c. Ditambahkan 500 µl buffer penghilang inhibitor ke the upper reservoir of the Filter Tube. d.
Disentrifugasi 1 menit pada 8.000 g.
e. Filter Tube dihilangkan dari tabung koleksi, buang cairan dan tabung koleksinya. f.
Tambahkan 500 µl buffer pencuci ke the upper reservoir of the Filter Tube.
g.
Tabung filter dikombinasikan dengan tabung koleksi yang baru.
17
h.
Disentrifugasi 1 menit pada 8,000 g dan buang cairannya.
i.
Filter Tube dihilangkan dari tabung koleksi, buang cairan dan tabung koleksinya.
j. Tabung filter dikombinasikan dengan tabung koleksi yang baru. k. Ditambahkan 500 µl buffer pencuci ke the upper reservoir of the Filter Tube . l. Disentrifugasi 1 menit pada 8,000 g dan dibuang cairannya. Setelah cairannya dibuang: a.
Disentrifugasi the entire High Pure assembly untuk tambahan 10 detik pada kecepatan penuh.
b. Tabung koleksi dibuang. Untuk mengelusikan DNA: a.
Filter Tube disisipkan ke dalam 1.5 ml tabung mikrosentrifus yang bersih dan steril.
b. Ditambahkan 200 µl buffer elusi yang belum dipanaskan ke the upper reservoir of the Filter Tube. c. Disentrifugasi 1 menit pada 8 000 g.
18
Lampiran 3 Metode digesti DNA dengan enzim endonuklease ( Louis 1992) ddH2O steril
Buffer restriksi
DNA
Enzim restriksi
Tabung Effendorf steril
Diinkubasi dalam waterbath 37ºC selama 2 jam
Reaksi enzim dihentikan melalui pemanasan pada suhu 60-70 ºC selama 15 menit
19
Lampiran 4 Metode ligasi DNA (Louis 1992) ddH2O steril
Buffer ligasi
DNA
Vektor plasmid
Tabung Effendorf steril
Diinkubasi overnight pada suhu 15ºC
Hasil ligasi disimpan pada suhu – 20 ºC.
Enzim ligase
20
Lampiran 5 Metode transformasi DNA ke dalam sel (Louis 1992)
100 µL sel kompeten (dalam kondisi beku)
10 µL DNA hasil ligasi campur
Dicairkan dengan digoyang pada kedua tangan
Ditempatkan dalam es selama 10 menit
Di heat shock pada waterbath 42ºC selama 2 menit
Ditambahkan 1 mL media LB cair
Diinkubasi 1 jam pada shaker dengan kecepatan 42 rpm suhu 37 ºC
Ditumbuhkan pada cawan yang mengandung antibiotik selama 12-18 jam
21
Lampiran 6 Isolasi plasmid dengan metode Lisis Alkali (Louis 1992) 1.
Tabung ependorf berisi larutan biakan bakteri dari media LB cair sebanyak 1.5 mL disentrifugasi selama 20 detik
2.
Pellet diresuspensi dalam 100 µL GTE ( Glucose Tris EDTA )
3.
Dibiarkan 5 menit pada suhu ruang
4.
Ditambahkan 200 µL larutan NaOH/SDS lalu diresuspensi
5.
Ditaruh dalam es selama 5 menit
6.
Ditambahkan potassium asetat sebanyak 150 µL kemudian divortex 2 detik
7.
Ditaruh 5 menit di dalam es
8.
Disentrifugasi 3 menit pada 12 000 rpm
9.
Dipindahkan 400 µL supernatan ke tabung eppendorf baru
10.
Ditambahkan 800 µL etanol 95%
11.
Dibiarkan 2 menit pada suhu ruang
12.
Disentrifugasi 3 menit pada suhu ruang dengan kecepatan 12 000 rpm
13.
Pellet dicuci dengan 1 mL etanol 70%
14.
Dikeringkan dengan vakum atau taruh di dalam laminar
15.
Pellet diresuspensi dalam dalam 30 µL buffer TE
16.
Disimpan pada suhu - 20ºC
22
Lampiran 7 Komposisi media seleksi klon rekombinan Media Heterotrof padat ( untuk 200 mL) a. 3.18 g Bacto peptone b. 0.78 g Triptone c. 1.0 g NaCl d. 3.0 g Agar e. 0.5 g K2HPO4 f. 0.02 g selenium Media LB padat (untuk 100 mL) a. 0.5 g yeast extract b. 1.0 g tripton c. 0.5 g NaCl d. 1.5 g bacto agar Media LB cair (untuk 100 mL) a. 0.5 g yeast extract b. 1.0 g tripton c. 0.5 g NaCl Media tumbuh koloni biru putih (ukuran untuk setiap cawan) a. media LB padat ( setiap 1 cawan berisi ± 15 mL) b. ampisilin 100 µg/mL Stock = 4 mg/mL M1.V1= M2.V2 4. V = 0.1 x 15 → V= 0.375 mL /375µL c. tetrasiklin 12.5 µg/mL Stock = 30 mg/mL M1.V1= M2.V2 30. V = 0.0125 x 15 → V= 0.00625 mL /6.25 µL d. IPTG 80 µM Stock = 200 mg/mL = 0.84 M M1.V1= M2.V2 0.84. V = 0.08 x 15 → V= 0.00143 mL /1.43 µL e. X –gal 70 µg/mL
Stock = 10 mg/mL M1.V1= M2.V2 10. V = 0.07 x 15 → V= 0.105 mL /105 µL Media Heterotrof + antibiotic a. media heterotrof padat 15 mL b. ampisilin 100 µg/mL Stock = 4 mg/mL M1.V1= M2.V2 4. V = 0.1 x 15 → V= 0.375 mL /375µL c. tetrasiklin 12.5 µg/mL Stock = 30 mg/mL M1.V1= M2.V2 30. V = 0.0125 x 15 → V= 0.00625 mL /6.25 µL Media LB cair + antibiotik a. media LB cair 10 mL per tabung b. ampisilin 100 µg/mL Stock = 4 mg/mL M1.V1= M2.V2 4. V = 0.1 x 10 → V= 0.25 mL /250 µL c. tetrasiklin 12.5 µg/mL Stock = 30 mg/mL M1.V1= M2.V2 30. V = 0.0125 x 10 → V= 0.00417 mL / 4.17 µL Cat: Bagi media padat, ukuran setiap cawan sekitar 15 mL Bagi media cair, u
23
Lampiran 8 Perhitungan bobot molekul DNA rekombinan No
Bobot molekul marker (bp)
Jarak (cm)
1
21226
0.5
2
5148
1.4
3
2027
2.4
4
1904
2.65
5
1584
2.8
6
947
3.1
7
564
3.5
Gambar Grafik hubungan bobot molekul dengan jarak marker Persamaan garis yang diperoleh : Y = 19473,807 – 6294,596 X Dimana : X= jarak Sehingga bobot molekul plasmid rekombinan adalah : Y = 19473,807 – 6294,596 X Y = 19473,807 – 6294,596 x 0.8 Y = 19473,807 – 5035.677
Y = 14438.13 bp
Y= pasang basa
