PEMBUATAN DNA REKOMBINAN
1
Nama enzim restriksi o Berdasarkan nama organisme dari mana enzim
diisolasi, mis.: n n n
Eco dari Escherichia coli Hin dari Haemophilus influenzae Hae dari Haemophilus aegyptius
o Diikuti oleh nama strain (bila perlu) o Diikuti oleh angka Romawi n
Menunjukkan ada lebih dari satu macam enzim restriksi dihasilkan dari organisme tersebut
2
Cara kerja enzim restriksi o Mengkatalisis hidrolisis ikatan fosfodiester dari
DNA.
3
Pemotongan DNA oleh enzim restriksi o Memotong DNA pada
urutan spesifik = urutan pengenalan (recognition sequence) n lokasi spesifik = sisi restriksi (restriction site) n
o Hasil pemotongan
Simetris: urutan pengenalan palindrom n Tidak simetris: urutan pengenalan panjang dan bukan palindrom n
4
Hasil pemotongan enzim restriksi o Simetris n Ujung lancip
n
Ujung tumpul
n
Ujung lancip
o Tidak simetris n
BstXI 5
Contoh beberapa macam enzim restriksi tipe II o HindII
o GTPy PuAC
o HindIII
o A AGCTT
o PstI
o CTGCA G
o MboI (frekuensi tinggi)
o N GATCN
o SmaI
o CCC GGG
o Xma I
o C CCGGG
o PspAI
o C CCGGG
n n
Py =T atau C; Pu = A atau G) Isoskizomer = Dua enzim restriksi yang dapat mengenali urutan DNA yang sama yang berasal dari organisme berbeda → sisi restriksi bisa sama atau berbeda
Palindrom : Go hang a salami! I’m a lasagna hog
6
Pemotongan dan penyambungan kembali DNA o Pemotongan DNA:
5’- NNNGAATTCNNN -3’ 3’- NNNCTTAAGNNN -5’ EcoRI
o Penyambungan
kembali
5’- NNNG 3’- NNNCTTAA
AATTCNNN -3’ GNNN -5’
5’- NNNG OH 3’- NNNCTTAAP
PAATTCNNN
-3’ OHGNNN -5’
ligase 5’- NNNGAATTCNNN -3’ 3’- NNNCTTAAGNNN -5’
7
4-9
Menyambung DNA
o Ligase
Berasal dari Bacteriophage (T4)
8
Ligasi ujung tumpul o Ujung tumpul dapat diligasi dengan ujung tumpul o Ujung lancip dapat dijadikan ujung tumpul: n n
Ujung 5’ yang ssDNA: dengan DNA polimerase I dan dNTP Melepaskan bagian yang ssDNA dengan T4 DNA polimerase p Mempunyai
n
aktivitas DNA polimerase 5’ → 3’ p Mempunyai aktivitas eksonuklease 3’ → 5’ Hasil ligasi tidak dapat dipotong lagi pada sisi yang sama
o Ligasi ujung tumpul tidak seefisien ligasi ujung lancip 9
Ligasi ujung lancip o Ujung ssDNA sama/komplementer, DNA dapat
diligasi n n n n
BamHI BclI Sau3AI BstYI
5’ -.....G ↓ GATCC.....-3’ 5’ -.....A ↓ GATCT.....-3’ 5’ -..... ↓ GATC .....-3’ 5’ -.....R ↓ GATCY .....-3’
o Bila DNA hasil pemotongan BamHI diligasi dengan
DNA hasil pemotongan BclI, hasil ligasinya dapat dipotong dengan enzim apa? 10
VEKTOR KLONING (1) o Molekul DNA yang: n dapat bereplikasi sendiri di dalam sel n dimana DNA asing dapat dimasukkan n Ada marker: p untuk
mendeteksi adanya vektor p untuk mendeteksi adanya DNA asing
o Macam-macam marker n gen resistensi antibiotik n gen lacZ (β-galaktosidase) n gen untuk sintesis asam amino 11
VEKTOR KLONING (2) o Plasmid o Virus n n
Bakteriofag lambda Bakteriofag M13
o Kombinasi dari plasmid dan virus n n
Kosmid Phagemid
o BAC (bacterial artificial chromosome)
12
Dasar pemilihan vektor Ukuran DNA asing yang akan dimasukkan ke dalam sel n Galur sel inang yang akan digunakan n Eksperimen yang akan dilakukan setelah kloning n
p Apakah
gen akan diekspresi? p Apakah diperlukan modifikasi pasca translasi pada protein yang akan dihasilkan?
13
Plasmid o dsDNA o berbentuk lingkaran tertutup o 1 – 200 kb o Jumlah plasmid di dalam sel: 1 – 700 (tergantung
macam plasmidnya) o Vektor kloning n n n n
Sisi pemotongan enzim restriksi yang unik Marker seleksi kehadiran plasmid (resistensi antibiotik) Marker seleksi kehadiran DNA sisipan (lacZ) pBR322, pUC10
o Shuttle vector n 14
n
Dapat bereplikasi di dalam > 1 spesies YEp24 dapat bereplikasi di E. coli & ragi
Plasmid pBR322 Ec o RI Hin d III
o Marker seleksi: gen
n
15
BamHI: sensitif tetrasiklin PstI: sensitif ampisilin
am
p
Sa lI
r
n
PstI
Ba m HI
r
t te
resistensi tetrasiklin dan ampisilin o Ori = origin of replication, sekuens yang memungkinkan plasmid dapat menggandakan diri dalam bakteri o DNA disisipkan ke dalam sisi kloning:
p BR3 2 2 4 ,3 6 kb A va I
o ri P vu I
Plasmid pUC18/pUC19 o Sisi kloning
p UC 1 8 /p UC 1 9 2 ,6 9 kb
o Seleksi biru-putih
o ri 16
MC S
la c I
n
lacZ aktif Xgal berubah menjadi biru
p
Z
n
am
r
la c
dalam gen lacZ o Ada IPTG & Xgal
EcoRI SacI KpnI SmaI XmaI BamHI XboI SalI AccI HincII PstI SphI HindIII
17
Blue-White Colony Selection
18
IPTG-XGal
19
Vektor kloning khusus o Vektor ekspresi
Gen asing diekspresi & produksi protein tinggi n Promoter n Sisi pengikatan ribosom (SD) n Kodon start dekat sisi kloning n Signal terminasi transkripsi n
o Vektor untuk mempelajari daerah regulator
pada DNA n
20
Reporter gene (gen pelapor)
Vector ekspresi pKK233-2 Marker seleksi Promoter tac RBS Sisi pengenalan enzim restriksi yang unik Txn = terminator Tidak ditunjukkan: ori replikasi DNA
21
Ekspresi gen dari promoter yang kuat dan dapat diregulasi o Transkripsi merupakan titik kontrol yang paling
penting n Dikontrol oleh promoter dari gen o Dua sifat penting dari promoter n Kuat p p p
n
Dapat diregulasi p
22
Afinitas tinggi terhadap RNA polimerase Ikatan kuat sering ditranskripsi Ikatan lemah RNA polimerase lepas tidak ada transkripsi
p
Kapan gen diekspresi dapat dikontrol gunakan induser / ko-represor
Promoter yang penting dalam vektor ekspresi E. coli o lac (atau lacUV5) o trp o tac (atau trc) o pL dari fag λ o gen 10 dari fag T7
23
tac (trc) promoter o Hibrid dari promoter lac dan trp
daerah -35 dari trp daerah -10 dari lac n terpisah 16 pb = promoter tac n terpisah 17 bp = promoter trc o 3x lebih kuat dari trp o 10x lebih kuat dari lac 24
Promoter λ pL o promoter pL diregulasi oleh represor λ o represor λ dikode gen cI o Digunakan gen cI mutan n n
Mutasi kondisional Mutan sensitif suhu p
28-30°C = suhu permisif n n
p
42°C = suhu restriktif
mutan • ada ekspresi gen yang dikontrol represor cI n
25
fenotipe normal Tidak ada ekspresi gen yang dikontrol represor cI
Regulasi oleh promoter pL A) 30°C
protein cI aktif
mRNA
pcI 26
cI
oL
pL
gen target
Regulasi oleh promoter pL B) 42°C
protein cI aktif
protein cI tidak aktif
mRNA
pcI 27
cI - ts
oL
pL
gen target
Promoter gen 10 fag T7 o Semua promoter fag T7 (termasuk gen
10) memerlukan RNA Polimerase T7 untuk ekspresinya n
n
28
Letakkan gen RNA Pol T7 di bawah kontrol promoter lac dalam sel E.coli Letakkan Gen target di bawah kontrol promoter gen 10
Promoter gen 10 fag T7 Induser
RNA Pol T7
pro lac Gen RNA Pol T7 Protein target T7 RNA Pol
pro g10 29
Gen target
Promoter gen 10 fag T7 o Ekspresi gen RNA polimerase T7
dikontrol oleh induser operon lac n n
Laktosa (allolaktosa) ATAU IPTG (iso-propil thio galaktosida) p Tidak
dimetabolisasi seperti laktosa p Tidak dipotong oleh β-galaktosidase
30
Transformasi o Transformasi
Memasukkan DNA ke dalam sel n Sel ditransformasi, sedangkan DNA mentransformasi sel n
o Transforman n
Sel yang telah ditransformasi
o Efisiensi transformasi = n
Jumlah transforman / µg DNA plasmid
Transformasi dengan metode CaCl2 o Bakteri
ditumbuhkan sampai <108 sel/ml (pertengahan fase logaritmik) n Diberi perlakuan dengan CaCl2 dingin n Diberi kejutan panas yang singkat. n
o Perlakuan ini menyebabkan sel bakteri
menjadi kompeten untuk sementara, sehingga dapat menerima DNA dari luar sel
Setelah transformasi sel bakteri o Bakteri ditumbuhkan o Seleksi sel bakteri yang berhasil ditransformasi
plasmid Medium diberi antibiotik n Bakteri perlu diberi kesempatan untuk mengekspresi gen resistensi antibiotik yang ada di plasmid sebelum antibiotik ditambahkan pada medium pertumbuhan bakteri n
o Seleksi bakteri yang berhasil ditransformasi
dengan plasmid rekombinan
