Bócsai Andera1 – Ancsin Zsolt1– Zándoki Erika2 – Fernye Csaba1 – Mézes Miklós1 – Balogh Krisztián1
Rövidtávú T-2 toxin terhelés hatása a máj egyes lipidperoxidációs és antioxidáns paramétereire különböző életkorú brojlercsirkékben Age-dependent effects of short-term T-2 toxin exposure on some lipid peroxidation and antioxidant parameter in broiler chicken liver
[email protected] Szent István Egyetem, Mezőgazdaság és Környezettudományi Kar, 2100 Gödöllő, Páter Károly u. 1. 2 MTA-Kaposvári Egyetem Mikotoxinok az élelmiszerláncban Kutatócsoport, 7400 Kaposvár, Guba Sándor u. 40. 1
Összefoglalás Kísérletünkben különböző dózisú T-2 toxin terhelés rövidtávú hatását mértük fel különböző életkorú brojlercsirkékben. A Cobb 500-as brojler kakasokkal (n=432) folytatott kísérletsorozatunkban 6 hétig tartó nevelés során hetente végeztünk T-2 toxin terhelést. A hat egymást követő rövidtávú terhelés során minden alkalommal egy kontroll és két különböző dózisú (3 mg/kg, illetve 5 mg/kg) T-2 toxinnal szennyezett takarmányt fogyasztó csoportot alakítottunk ki. A 36 órás mikotoxin-terhelés során a terhelés kezdetét követően 8, 12, 24 és 36 óra elteltével csoportonként 6-6 madárból vett májmintákból meghatároztuk a a lipidperoxidációs folyamatok intenzitását jelző markereket és a glutation redox rendszer egyes paramétereit. Megállapítottuk, hogy a T-2 toxin terhelés hatására a májban a lipidperoxidációs folyamatok iniciációs szakaszát jelző konjugált dién és –trién tartalom a 3. és a 6. élethéten mutatott dózisfüggő emelkedést. Az alkalmazott T-2 toxin dózisok tehát fokozott szabadgyök-képződést indukáltak a májban, amely aktiválta a glutation redox rendszert, szignifikáns mértékben megnövelve a glutation-peroxidáz aktivitását a 2., 4., 5. és 6. élethéten. A glutation redox rendszerben kitüntetett szerepet betöltő ko-szubsztrát (redukált glutation) mennyisége a 4., 5. és 6. héten mutatott szignifikáns mértékű növekedést a mikotoxin-terhelés hatására. Mindezek a változások az antioxidáns védelmi rendszerben azt eredményezték, hogy az hatékony védelmet jelentett az alkalmazott T-2 toxin szabadgyök-képződést előidéző hatásával szemben a vizsgált időtartam (36 óra) alatt, így a lipidperoxidációs folyamatok meta-stabil végterméke, a malondialdehid koncentráció nem mutatott statisztikailag is igazolható emelkedést a mikotoxin-terhelés hatására a 6 hetes vizsgálatsorozat alkalmával. Bevezetés A brojlercsirkék számára előállított teljes értékű takarmánykeverékek jelentős részarányát jelentő gabonamagvak gyakran szennyezettek mikotoxinokkal. Közép-Európában, így hazánkban is, a leggyakrabban a Fusarium penészgombák másodlagos anyagcseretermékei – elsődlegesen a trichotecén-vázas mikotoxinok – általi szennyezettség a legjellemzőbb (Kotal et al., 1999). Ebbe a csoportba tartozik a T-2 toxin is, melyet a mérsékelt éghajlati övben széleskörűen elterjedt Fusarium sporotrichioides penészgomba is termel (Binder et al., 2007). A takarmányban jelenlevő T-2 toxin dózisfüggő módon termeléscsökkenést okoz és toxikus hatású baromfi fajok esetében (Diaz, 2005); és az egyik legmérgezőbb trichotecén-toxinként tartják számon (Bamburg et al., 1968). A T-2 toxin, illetve annak az állati szervezetben képződő metabolitja, a HT-2 toxin az „A-típusú” epoxitrichotecének közé tartozó hőstabil molekula, így a takarmány-, illetve élelmiszer feldolgozás során változatlan formában jelen van a termékben (Lancova et al., 2008). Mindkét mikotoxin gátolja eukarióta sejtekben a fehérje- és a DNS szintézist (Holladay, 1995), reaktív epoxi-csoportja révén pedig elősegíti az oxigén szabadgyökök kialakulását, mely oxidatív stresszt idézhet elő a szövetekben (Iwahashi, 1982). A reaktív oxigéngyökök által elindított láncreakciót az állati szervezet enzimatikus és nem enzimatikus antioxidáns védőrendszere segítségével igyekszik fiziológiás szinten tartani (Davies, 1995). E rendszer részei a gyökfogó
53
antioxidáns molekulák (pl. redukált glutation) vagy az enzimatikus védelemben kitüntetett szereppel bíró szelénfüggő glutation-peroxidáz enzimcsalád (Erdélyi et al., 1999). A reaktív oxigén gyökök által kiváltott oxidáció iránt főként a többszörösen telítetlen zsírsavak érzékenyek, azonban a peroxidáció kisebb-nagyobb mértékben károsíthatja a fehérjéket és a nukleinsavakat is. A T-2 toxin által indukált oxidatív stresszt a hosszútávú kísérletek során képződött lipidperoxidációs termékek mennyiségi mérésével bizonyították, ugyanakkor kevés adattal rendelkezünk annak rövidtávú és különböző életkorú brojlercsirkékre kifejtett hatásáról. Jelen kísérletünk célja a különböző dózisú T-2 toxinterhelés rövidtávú (36 óráig tartó) hatásának lipidperoxidációra, és a glutation redox rendszer mennyiségére, illetve aktivitására gyakorolt hatásának vizsgálata volt különböző életkorú brojlercsirkékben. Anyag és módszer Kísérletsorozatunkat Cobb 500-as brojler kakasokkal (n=432) végeztük, 6 hétig tartó nevelés során. A hat egymást követő héten végzett rövidtávú terhelés során minden alkalommal egy kontroll és a T-2 toxin két különböző koncentrációjával (3 mg T-2 toxin/kg, illetve 5 mg T-2 toxin/kg takarmány) szennyezett takarmányt fogyasztó csoport került kialakításra. A kezelt csoportok által fogyasztott takarmányok T-2 toxinnal történt mesterséges szennyezése után annak pontos értéke HPLC módszerrel került visszamérésre. A 36 órás mikotoxin-terhelés során a 8., 12., 24. és 36. órában csoportonként 6-6 madárból post mortem májmintákat vettünk, amelyeket a biokémiai vizsgálatok elvégzéséig -20 oC-on tároltuk. Meghatároztuk a a lipidperoxidációs folyamatok intenzitását jelző markereket, nevezetesen a konjugált dién és -trién tartalmat és a malondialdehid (MDA) koncentrációt, valamint glutation redox rendszer néhány paraméterét, így a redukált glutation (GSH) koncentrációt és a glutation-peroxidáz (GPx) aktivitás. A konjugált dién és -trién tartalom meghatározása a májminták lipid tartalmának 2,2,4-trimetilpentánban való kivonását követően 232 nm-en, illetve 268 nm-en mutatott abszorpció alapján történt (AOAC, 1984). A malondialdehid koncentráció meghatározását Mihara és mtsai. (1980) módszere alapján végeztük savanyú közegben, magas hőmérsékleten, 2-tiobarbitursavval történő komplex képzés során. A redukált glutation koncentrációt Sedlak és Lindsay (1968) módszere alapján mértük 5,5’-ditio-bisz-2-nitrobenzoesav reagenssel. A glutation-peroxidáz aktivitást Matkovics és mtsai (1988) módszere alapján határoztuk meg egy végpontos direkt assay-vel, redukált glutation és kumol-hidroperoxid ko-szubsztrátok jelenlétében. A GSH koncentrációt és a GPx aktivitást a májhomogenizátum 10.000 g szupernatans frakciójában mértük, az értékeket a minták fehérjetartalmára vonatkoztatottuk, amelyet Folin-fenol reagenssel mértünk szarvasmarha szérum albumin standard felhasználásával (Lowry és mtsai, 1952). Az eredmények statisztikai értékelését GraphPad Prism for Windows 5.04 programmal (GraphPad Software Inc., 2010) végeztük. A normalitás vizsgálatot követően végzett varianciaanalízis (ANOVA) során a Tukey-féle többszörös összehasonlító tesztet alkalmaztuk a szignifikáns (p<0,05) különbségek megállapítására. Eredmények és értékelésük A T-2 toxin terhelés hatására a májban a lipidperoxidációs folyamatok kezdeti (iniciációs) szakaszát jelző konjugált dién és –trién tartalom csak a 3. és a 6. élethéten mutatott dózisfüggő emelkedést (1. táblázat).
54
1. táblázat A T-2 toxin különböző koncentrációinak hatása eltérő korú brojlercsirkék májának konjugált dién (CD OD232) és konjugált trién (CT OD268) tartalmára Kontroll
8. óra 3 mg/kg T-2
5 mg/kg T-2
Kontroll
12. óra 3 mg/kg T-2
C D C T
0,577± 0,044 0,206± 0,014
0,545± 0,062 0,193± 0,013
0,550± 0,052 0,190± 0,016
0,522± 0,053 0,188± 0,011
0,574± 0,043 0,195± 0,012
C D C T
0,444± 0,025 0,199± 0,006
0,474± 0,044 0,204± 0,014
0,457± 0,039 0,198± 0,011
0,424± 0,020 0,185± 0,005
0,430± 0,060 0,185± 0,017
C D C T
0,349± 0,111 0,175± 0,027
0,362± 0,154 0,174± 0,033
0,415± 0,140 0,177± 0,030
0,301a± 0,103 0,154a± 0,021
0,503b± 0,050 0,193b± 0,011
C D C T
0,534± 0,050 0,206± 0,014
0,468± 0,062 0,183± 0,014
0,497± 0,061 0,197± 0,019
0,544± 0,055 0,204b± 0,010
0,443± 0,029 0,175a± 0,006
C D C T
0,398± 0,124 0,180± 0,025
0,530± 0,088 0,198± 0,020
0,381± 0,165 0,171± 0,037
0,392± 0,132 0,168± 0,027
0,519± 0,049 0,195± 0,015
C D C T
0,570± 0,045 0,203± 0,014
0,540± 0,072 0,193± 0,026
0,552± 0,045 0,192± 0,015
0,460a± 0,050 0,173± 0,015
0,581b± 0,080 0,200± 0,024
5 mg/kg Kont-roll T-2 1. hetes madarak 0,521± 0,572± 0,048 0,058 0,176± 0,210b± 0,013 0,016 2. hetes madarak 0,440± 0,503ab± 0,048 0,023 0,185± 0,192± 0,013 0,009 3. hetes madarak 0,483b± 0,514± 0,025 0,049 0,183b± 0,202± 0,008 0,012 4. hetes madarak 0,483± 0,543± 0,120 0,128 0,192ab 0,212± ±0,026 0,027 5. hetes madarak 0,447± 0,637± 0,177 0,048 0,187± 0,209± 0,034 0,013 6. hetes madarak 0,556b± 0,471± 0,054 0,082 0,193± 0,180± 0,015 0,022
24. óra 3 mg/kg T-2
5 mg/kg T-2
36. óra Kontroll
3 mg/kg T-2
5 mg/kg T-2
0,560± 0,035 0,205b± 0,011
0,504± 0,053 0,182a± 0,012
0,585b± 0,053 0,209b± 0,014
0,539ab± 0,052 0,188a± 0,013
0,498a± 0,046 0,176a± 0,010
0,519b± 0,037 0,192± 0,015
0,477a± 0,016 0,180± 0,007
0,473± 0,054 0,176± 0,015
0,465± 0,020 0,169± 0,007
0,443± 0,035 0,162± 0,012
0,457± 0,125 0,187± 0,030
0,455± 0,062 0,176± 0,017
0,551± 0,074 0,207± 0,018
0,473± 0,062 0,180± 0,016
0,490± 0,099 0,179± 0,028
0,388± 0,170 0,169± 0,037
0,484± 0,093 0,190± 0,016
0,404± 0,145 0,169± 0,038
0,316± 0,089 0,154± 0,018
0,334± 0,122 0,156± 0,022
0,675± 0,064 0,214± 0,020
0,612± 0,052 0,202± 0,013
0,621± 0,084 0,203± 0,023
0,624± 0,063 0,205± 0,017
0,608± 0,040 0,194± 0,011
0,395± 0,037 0,162± 0,007
0,408± 0,033 0,168± 0,006
0,415± 0,034 0,163± 0,006
0,428± 0,024 0,168± 0,007
0,432± 0,019 0,168± 0,006
azonos sorban ez eltérő mintavételi időpontok esetében a különböző betűvel jelölt átlagértékek szignifikáns mértékben (p<0,05) különböznek. a,b
Az alkalmazott T-2 toxin dózisok fokozott szabadgyök-képződést indukáltak a májban, mely aktiválta a glutation redox rendszert, szignifikáns mértékben megnövelve annak aktivitását (glutation-peroxidáz aktivitás) a 2., 4., 5. és 6. élethéten (2. táblázat). A glutation redox rendszerben kitüntetett szerepet betöltő ko-szubsztrát (redukált glutation) mennyisége a 4., 5. és 6. héten mutatott szignifikáns mértékű növekedést a mikotoxin-terhelés eredményeképpen (2. táblázat). Mindezek a változások az antioxidáns védelmi rendszerben azt eredményezték, hogy az hatékony védelmet jelentett az alkalmazott T-2 toxin szabadgyök-képző hatásával szemben a vizsgált időtartam (36 óra) alatt, így a lipidperoxidációs folyamatok meta-stabil végterméke, a malondialdehid koncentráció (nem közölt adatok) nem mutatott statisztikailag is igazolható emelkedést a mikotoxin-terhelés hatására a 6 hetes vizsgálatsorozat alkalmával.
55
2. táblázat A T-2 toxin különböző koncentrációinak hatása eltérő korú brojlercsirkék májának redukált glutation koncentrációjára (GSH, umol/g fehérje) és glutation-peroxidáz aktivitására (GPx, E/g fehérje) 8. óra 3 mg/kg T-2
5 mg/kg T-2
Kontroll
4,43± 0,10
3,83± 0,40
4,30± 1,08
4,16± 0,88
3,72± 0,56
5,01± 1,28
4,04± 0,15
3,54± 0,52
3,63± 0,84
3,47± 0,53
3,20± 0,59
3,98± 1,40
3,15± 0,33
3,71± 0,64
3,86± 0,59
3,44± 0,25
3,62± 0,74
3,76± 0,63
2,72± 0,29
3,44± 0,58
3,76± 0,57
3,08± 0,19
3,45± 0,64
3,68± 0,62
Kontroll G S H G P x
12. óra 3 mg/kg T-2
24. óra 3 mg/kg T-2
5 mg/kg T-2
Kontroll
3,09ab± 0,56
3,96b± 0,61
2,71a± 0,65
2,92ab± 0,61
3,92b± 0,99
3,23± 1,19 2,41a± 0,66
5 Kontmg/kg roll T-2 1. hetes madarak
36. óra 3 mg/kg T-2
5 mg/kg T-2
2,98± 0,36
3,50± 0,88
2,85± 0,94
2,77a± 0,69
2,58± 0,29
3,46± 1,18
2,91± 0,96
3,93± 0,46
3,29± 0,36
2,80± 0,27
3,12± 0,51
2,73± 0,58
3,39b± 0,41
3,06ab± 0,24
2,24± 0,32
2,63± 0,37
2,57± 0,52
2. hetes madarak G S H G P x
3. hetes madarak G S H G P x
7,40b± 2,19
5,18ab± 1,08
5,07a± 1,38
6,21± 2,66
5,53± 1,44
4,80± 1,02
5,33± 0,91
5,35± 0,65
4,79± 0,99
4,95± 1,35
5,49± 1,07
5,02± 0,66
7,44± 1,83
5,03± 1,29
6,42± 2,43
6,21± 2,10
5,34± 1,70
5,37± 1,04
5,69± 1,08
5,61± 1,03
5,63± 1,17
5,25± 1,65
5,72± 1,07
5,98± 0,70
3,81a± 0,31
5,17b± 0,60
5,52b± 0,51
4,49a± 0,79
5,92b± 0,99
4,88ab ±0,77
4,94± 1,15
4,84± 0,55
5,57± 1,17
4,54± 0,85
5,49± 0,71
5,14± 1,12
3,11± 0,69
4,32± 0,84
4,78± 0,46
3,58± 0,88
4,34± 1,14
3,90± 0,63
4,15a± 0,42
4,26a± 0,46
4,99b± 0,41
3,89± 0,55
4,76± 0,87
4,11± 0,78
4. hetes madarak G S H G P x
5. hetes madarak G S H G P x
4,67± 0,46
5,17± 0,86
5,09± 0,76
5,92± 1,56
5,73± 0,72
6,07± 1,55
4,41a± 0,62
5,34b± 0,50
5,13ab± 0,46
3,31a± 0,68
4,77b± 1,00
4,39ab± 0,65
4,05± 1,01
5,04± 0,98
4,75± 0,47
5,43± 0,59
5,57± 0,33
6,02± 1,58
3,97± 0,94
4,80± 0,45
4,68± 0,48
2,89a± 0,77
4,36b± 0,75
4,13b± 0,31
6. hetes madarak G S H G P x
3,79a± 0,70
5,02b± 0,60
5,27b± 0,63
4,49± 1,04
4,95± 0,50
5,02± 0,57
5,11± 0,81
4,94± 1,11
4,34± 1,18
4,40± 0,35
4,93± 1,02
4,91± 1,34
2,87a± 0,58
3,54a± 0,68
5,04b± 0,65
3,43a± 0,83
3,99ab± 0,47
4,67b± 0,85
5,00± 1,03
4,80± 1,10
4,49± 1,23
4,06± 0,28
4,90± 0,97
4,90± 1,32
azonos sorban ez eltérő mintavételi időpontok esetében a különböző betűvel jelölt átlagértékek szignifikáns mértékben (p<0,05) különböznek. a,b
Köszönetnyilvánítás A kutatás a Bolyai János Kutatási Ösztöndíj (BO/261/13), az OTKA (PD-104823) és a Kutató Kari Kiválósági Támogatás - Research Centre of Excellence - 11476-3/2016/FEKUT támogatásával valósult meg.
56
Felhasznált irodalom AOAC (1984): Official Methods of Analysis (28.054) 14th edition. Arlington, VA, USA Bamburg, J.R., Riggs, N.V. - Strong, F.M. (1968): The structure of toxins from two strains of Fusarium tricinctum. Tetrahedron Lett. 24: 3329-3326. Binder, E.M., Tan, L.M., Chin, L.J., Handl, J., Richard, J. (2007): Worldwide occurrence of mycotoxins in commodities, feeds and feed ingredients. Anim. Feed Sci. Technol. 137: 265-282. Davies, K.J.A. (1995): Oxidative stress, the paradox of aerobic life. In: Rice-Evans, C., Halliwell, B., Land, G.G. (Eds.), Free Radical and Oxidative Stress: Environment, Drugs and Food Additives. London, Portland Press, pp. 1–31. Diaz, D.E. (ed.) (2005): The Mycotoxin Blue Book. Nottingham University Press, Nottingham Erdélyi, M., Mézes, M., Virág, Gy. (1999): A szeléndependens glutation-peroxidáz enzimek az állati szervezetben: 1. Szerkezet, funkció és szabályozás. Biokémia. 23(4): 82-88. Holladay, S.D., Smith, B.J., Luster, M.I. (1995): B lymphocyte precursor cells represent sensitive targets of T2 mycotoxin exposure. Toxicol. Appl. Pharmacol. 131(2): 309-315. Iwahashi, M. (1982): Mechanism of cytotoxic effect of T-2 toxin on a protozoa. Proc. Assoc. Jpn. Mycotoxin 4: 23-30. Kotal, F., Holadová, K., Hajslová, J., Poustka, J., Radová, Z. (1999): Determination of trichothecenes in cereals. J. Chromatograph. A. 830: 219-225. Lancova, K, Hajslová, J., Kostelanska, M., Kohoutkova, J., Nedelnik, J., Moravcova, H., Vanova, M. (2008): Fate of trichothecene mycotoxins during the provessing: milling and baking. Food Addit. Contam. Part A 25(5): 650659. Lawrence, R., Burk, R. (1978): Species, tissue and subcellular distribution of non Se-dependent glutathione peroxidase activity. J. Nutr. 108: 211-215. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. (1951): Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275. Matkovics, B., Szabó, L., Sz.Varga, I. (1988): Lipidperoxidáció és redukált glutation anyagcsere enzimek aktivitás meghatározása biológiai mintákban. Lab. Diagn. 15. 248-250. Mihara, M., Uchiyama, M., Fukuzawa, K. (1980): Thiobarbituric acid value of fresh homogenate of rat as parameter of lipid peroxidation in ageing, CCl4 intoxication and vitamin E deficiency. Biochemical Medicine 23: 302-311. Sedlak, I., Lindsay, R.H. (1968): Estimation of total, protein-bound and non-protein sulfhydryl groups in tissues with Ellmann’s reagent. Anal. Biochem. 25: 192-205.
57
