METODE Alur Penelitian Alur penelitian dan metode yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari 6 tahapan, yaitu: peremajaan bakteri Salmonella sp., verifikasi bakteri Salmonella sp., isolasi fage, penentuan kisaran inang, efektivitas lisis sel Salmonella sp. oleh fage, dan pengamatan morfologi lisis sel Salmonella sp. oleh fage dengan Scanning Electron Microscope (SEM) (Gambar 1).
A. Peremajaan Salmonella sp.
B. Verifikasi Salmonella sp.
C. Isolasi Fage a). b). c). d). e).
Pengambilan sampel Filtrasi Sampel Pencawanan Pemurnian Fage Kuantifikasi Fage (PFU/mL)
D. Penentuan Kisaran Inang
E. Efektivitas Lisis Sel Salmonella sp. oleh Fage
F. Pengamatan Morfologi Lisis sel Salmonella sp. oleh Fage dengan SEM Gambar 1 Diagram alir tahapan metode penelitian.
Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan September 2010 sampai dengan Agustus 2011, bertempat di Laboratorium Bioteknologi Hewan, IPB Darmaga; dan Laboratorium SEM LIPI Cibinong. Bahan Bakteri yang digunakan pada penelitian ini: bakteri Salmonella p15, p19, p38, dan p84 dan E. coli non patogen merupakan koleksi Dr. dr. Sri Budiarti. Media yang dipergunakan pada penelitian ini: Nutrien Broth (NB); molten top agar (1% bakto tripton, 0,8% NaCl, 0,7% agar); Nutrien agar (NA); soft agar (NB mengandung 0,7% agar); media kaldu Lauria Bertani (LB) (1% Bakto tripton, 0,5% Bakto yeast ekstrak, 1% NaCl); Media agar LB (1% Bakto tripton, 0,5% Bakto yeast ekstrak, 1% NaCl, 2,5% agar); Salmonella shigella (SS) agar; MRVP; Urea; TSIA; KCN; Simmons Sitrat; Tripton; media gula-gula: Glukosa, Laktosa, dan Sukrosa. Peremajaan Salmonella sp. Sebanyak satu lup bakteri Salmonella p15, p19, p38, dan p84 digoreskan pada media agar miring SS secara aseptik, kemudian diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 24 jam. Verifikasi Salmonella sp. Dilakukan pewarnaan gram dan uji fisiologis berupa: MR, VP, urea, KCN, indol, sitrat, H2S, dan uji fermentasi gula-gula: glukosa, laktosa, sukrosa pada isolat Salmonella p15, p19, p38, dan p84. Isolasi Fage Pengambilan sampel.
Sampel untuk isolasi fage berupa limbah cair
rumah tangga (LCRT) yang diambil di daerah Babakan, Darmaga Bogor. Sampel diambil dengan menggunakan botol steril. Sebelum dilakukan filtrasi sampel, terlebih dahulu sampel di homogenisasi dengan cara mengocoknya.
Filtrasi sampel. Filtrasi sampel dilakukan berdasarkan metode Pitt & Gaston (1995) yang dimodifikasi pada kecepatan sentrifugasi yang dipergunakan yaitu 2800 x g . Sebanyak 4.5 mL sampel LCRT dicampurkan dengan 0.5 mL kultur Salmonella OD600nm=1 dengan jumlah bakteri Salmonella sebanyak 108 CFU/ mL dan ditambahkan 0,5 mL dari 10x NB. Campuran diinkubasi di dalam Waterbath shaker (Certomat WR) selama 24-48 jam pada suhu 37 ºC. Kultur tersebut kemudian disentrifugasi dengan sentrifus Beckman pada kecepatan 2800 x g suhu 40 C selama 20 menit. Sebanyak 3 mL supernatan diambil dengan 5 mL syringe dan difiltrasi dengan membran filter milipore 0.22 µm. Supernatan yang telah difiltrasi dimasukkan ke dalam tabung steril. Pencawanan. Koloni tunggal isolat Salmonella p15, p19, p38, dan p84 diinokulasikan ke dalam media NB lalu diinkubasi di dalam Waterbath shaker (Certomat WR) dengan kecepatan 150-200 x g pada suhu 370 C selama 24 jam sampai OD600nm=1. Sebanyak 100 µL masing-masing kultur Salmonella p15, p19, p38, dan p84 dicampurkan dengan 100 µL supernatan yang telah difiltrasi ke dalam tabung steril dan diinkubasi pada suhu 370 C selama 30 menit. Campuran ditambahkan 5 mL soft agar yang bersuhu 470 C, dituang pada media NA. Inkubasi dilakukan pada suhu 370 C selama 24 jam (Atterbury et al. 2007). Pemurnian fage. Pemurnian fage dilakukan berdasarkan metode Goodridge et al. (2001) yang dimodifikasi pada kecepatan sentrifusgasi 2800 x g. Plak dipindahkan dengan menggunakan pipet Pasteur kemudian plak tersebut dicampurkan dengan 2-3 mL 25% pelarut Ringers. Suspensi fage divortex dan dibiarkan selama 5-10 menit pada suhu ruang. Suspensi tersebut kemudian di sentrifugasi pada kecepatan 2800 x g, suhu 4 ºC, selama 20 menit sebanyak 2 kali ulangan. Supernatan difiltrasi menggunakan membran filter milipore 0.22 µm, kemudian supernatan disimpan untuk stok atau bahan produksi. Kuantifikasi fage. Kuantifikasi fage diukur dengan cara menghitung jumlah plak yang terbentuk (Plague forming units (PFU/mL)). Plague forming units (PFU/mL) ditentukan berdasarkan metode Foschino et al. (1995). Stok fage diencerkan sampai 107, kemudian dari masing-masing pengenceran tersebut diambil 100 µL ditambahkan dengan 100 µL masing-masing kultur Salmonella
p15, p19, p38, dan p84 yang telah diinkubasi selama 3-4 jam pada media NB. Suspensi diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37 ºC. Sebanyak 5 mL soft agar yang masih bersuhu 42 ºC dicampurkan, selanjutnya dituang ke media NA, kemudian diinkubasi pada 37 ºC selama 24 jam.
Zona bening (plak) yang
terbentuk dihitung setelah diinkubasi selama 24 jam. Penentuan Kisaran Inang Fage Sebanyak 100 µL kultur bakteri Salmonella nomer 15, 19, 38, dan 84 yang telah ditumbuhkan di media NB selama 3-4 jam dan E. coli non patogen yang telah ditumbuhkan pada media kaldu LB selama 3-4 jam masing-masing dicampurkan dengan stok fage dengan konsentrasi 100 µL, lalu diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 15-30 menit. Uji pada E. coli non patogen, sebanyak 5 mL molten top agar yang masih bersuhu 42 ºC dicampurkan, selanjutnya dituang ke media agar cawan LB. Diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 24 jam. Uji pada Salmonella, sebanyak 5 mL soft agar yang masih bersuhu 42 ºC dicampurkan, selanjutnya dituang ke media NA. Diinkubasi pada 37 ºC selama 24 jam (CareySmith et al. 2006). Efektivitas Lisis Sel Salmonella oleh Fage Efektivitas lisis sel Salmonella oleh fage dilakukan berdasarkan metode Atterbury et al. (2007) yang dimodifikasi pada kecepatan sentrifugasi 2800 x g. Sebanyak 100 mL kultur bakteri Salmonella p15, p19, p38, dan p84 yang telah ditumbuhkan di media NB sampai OD600nm=1 dengan jumlah bakteri Salmonella sp. 108 CFU/mL dibagi kedalam dua tabung sentrifus masing-masing sebanyak 50 mL, sentrifugasi dilakukan dengan sentrifus Beckman pada kecepatan 2800 x g, suhu 4ºC, selama 30 menit dengan tiga kali ulangan. Supernatan dibuang, kemudian dibuat dua perlakuan yaitu kontrol (pelet tanpa penambahan fage) dan perlakuan pelet dengan penambahan 1 mL fage. Keduanya di inkubasi selama 30 menit pada suhu 37 ºC. Selanjutnya ditambahkan masing-masing 50 mL NB yang baru, kemudian dipindahkan ke dalam erlenmeyer dan dimasukkan ke dalam inkubator shaker dengan suhu 37 ºC. Masing- masing kultur diukur nilai ODnya setiap satu jam, mulai dari 0 jam sampai terjadi penurunan nilai OD.
Pengamatan Morfologi Lisis Sel Salmonella sp. oleh Fage dengan Scanning Electron Microscope (SEM) Sebanyak 5 mL kultur Salmonella sp. yang telah ditumbuhkan di media NB sampai OD600nm=1 ditambah 100 µL stok fage diinkubasi selama 2 jam. Kultur diamati dengan menggunakan SEM. Preparasi untuk pengamatan sampel dengan menggunakan SEM dilakukan dengan metode Wendelschafer-Crabb et al. (1975). Campuran tersebut disentrifus hingga sel-selnya mengendap. Endapan direndam glutaraldehida 2% selama 2 jam. Glutaraldehida dipisahkan dengan cara disentrifus, supernatan dibuang, direndam dalam larutan buffer caccodylate. Setelah direndam selam 10 menit, larutan buffer caccodylate dibuang dengan cara disentrifus, endapan direndam dengan osmium tetraoksida 1% selama 1 jam. Sampel disentrifus kembali, direndam dengan alkohol 50% selama 10 menit sebanyak dua kali. Secara berturut-turut sampel ditambahkan alkohol 70%, 80%, 90% dan alkohol absolut dengan perendaman masing-masing selama 10 menit. Larutan alkohol dibuang dengan cara disentrifus, direndam t-butanol selama 10 menit sebanyak 2 kali sampai terbentuk suspensi dalam butanol.
Cover slip
2
(cover glass yang dipotong dengan ukuran 0,25 cm ) dicuci dengan alkohol absolut, suspensi bakteri dioleskan di atasnya setelah cover slip kering. Sampel dikeringbekukan dan dilapisi ion Au. Semua tahapan sentrifus dilakukan pada kecepatan 4000x g selama 5 menit. Sampel diamati menggunakan mikroskop elektron payaran bervakum rendah model JSM-5310LV pada pembesaran 10000 x - 20000 x.
