Základy biochemie KBC / BCH
Metabolismus nukleotidů Inovace studia biochemie prostřednictvím e-learningu CZ.04.1.03/3.2.15.3/0407
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky.
Metabolismus nukleotidů
2
• • • • • • • • • • • • • • • •
Osnova Syntéza purinových ribonukleotidů Syntéza adeninových a guaninových ribonukleotidů Kontrola biosyntézay purinových nukleotidů Recyklace purinů Syntéza pyrimidinových nukleotidů Syntéza uridinmonofosfátu Syntéza uridintrifosfátu a cytidintrifosfáttu Kontrola biosyntézy pyrimidinových nukleotidů Tvorba deoxyribonukleotidů Tvorba deoxyribos Tvorba thyminu. Odbourávání nukleotidů Katabolismus purinů Dráha močové kyseliny Katabolismus pyrimidinů
Struktura purinu a pyrimidinu
N
1 2
6 3
N
5
7
4
9
N
Purin 3
N
8
5 6
N
4 1
3 2
N H
Pyrimidin
Ribosa a 2-deoxyribosa
HO
5´
CH2 4´
H
O H
3´
OH
Ribosa 4
OH H
2´
OH
1´
OH
HO
5´
CH2 4´
H
OH
O H
3´
OH
H
2´
H
2´-Deoxyribosa
1´
OH
β-N-glykosidová vazba. Ve vazbě je uhlík C1´.
NH2 N
β-N-Glykosidová vazba HO
CH2
N
O H
H
H
OH OH
5
OH
N N
Ribonukleotid a deoxyribonukleotid
Nukleosid je pouze báze a pentosa vázaná N-glykosidovou vazbou.
2-
O 3P O
Báze
5´
CH2 4´
H
HO
O H
3´
OH
H
2´
OH
5´-Ribonukleotid 6
1´
OH
Báze
5´
CH2 4´
O H
H
2-
O 3P O
3´
H
2´
1´
OH
H
3´-Deoxyribonukleotid
Názvy a zkratky bází nukleových kyselin, nukleosidů a nukleotidů Strukturní vzorec NH2 N
N N
N X
O H
N
N
H2N
N
N X
NH2 N N
O
X O H
N N
O
X O H
7
O
CH3
N N dX
Báze (X = H)
Nukleosid (X = ribosa, 2´-deoxyribosa)
Nukleotid (X = ribosafosfát, 2´-deoxyribosafosfát)
Adenin
Adenosin
Adenylová kyselina
Ade
Ado
Adenosinmonofosfát
A
A
AMP
Guanin
Guanosin
Guanosylová kyselina
Gua
Guo
Guanosinmonofosfát
G
G
GMP
Cytosin
Cytidin
Cytidylová kyselina
Cyt
Cyd
Cytidinmonofosfát
C
C
CMP
Uracil
Uridin
Uridylová kyselina
Ura
Urd
Uridinmonofosfát
U
U
UMP
Thymin
Deoxythymidin
Deoxythymidylová kyselina
Thy
dThd
Deoxythymidinmonofosfát
T
dT
dTMP
Biosyntéza purinových ribonukleotidů • Nukleotidy jsou fosforečné estery pentos (ribosy nebo deoxyribosy) ve kterých je purinová nebo pyrimidinová báze vázána na uhlík C1´sacharidu. • V roce 1948 John Buchanan dělal pokusy s holuby, které krmil různými izotopy značenými sloučeninami a zjišťoval pozici značených atomů ve vylučované močové kyselině. • Buchananovy závěry: HCO 3
Aminoskupina aspartátu Formiát
8
N C
C 1 2
6
3
N
5 4
Glycin N
C
7
C
9
8 C
N H
Amidoskupina glutaminu
Formiát
Schéma biosyntézy IMP, ATP, GTP, dATP a dGTP CO2
Aspartát
N
N 10-Formyltetrahydrofolát
C
Glutamin
C 1 2
6 3
N
5 4
Glycin N
C
7
C
9
N 10-Formyltetrahydrofolát
8 C
N
Glutamin
ribosa-P
Struktura purinového kruhu
IMP
9
ATP
GTP
RNA
dATP
dGTP
DNA
Inosinmonofosfát (IMP) – prekurzor AMP a GMP. O N
HN O O
-
P O
-
N
N O
Hypoxanthin
O H
H
H
OH OH
OH
Inosinmonofosfát (IMP)
10
Jednotlivé kroky biosyntézy inosinmonofosfátu • • • • • • •
11
1. Výchozím materiálem je produkt pentosafosfátové dráhy α-D-ribosa5-fosfát, která se aktivuje ATP na 5-fosforibosyl-α-pyrofosfát (PRPP). 2. Vstup atomu N9 purinu reakcí PRPP s Gln. Dochází k inverzi konfigurace na β. Kontrolní krok biosyntézy – současná hydrolýzy PPi !! Vznik β-5-fosforibosylaminu (PRA). 3. Vstup purinových atomů C4, C5 a N7. Atomy vstupují ve formě Gly na PRA a tvorby glycinamidribotidu (GAR). 4. Vstup purinového atomu C8. Volná aminoskupina GAR je formylována N 10-formyl THF za tvorby formylglycinamidribotidu (FGAR). 5. Vstup purinového atomu N3. Vstupuje ve formě Gln za účasti ATP → ADP + Pi. 6. Tvorba imidazolového kruhu purinu. Intramolekulární kondenzace za účasti ATP tvoří 5-aminoimidazolribotidu (AIR). 7. Vstup C6 atomu purinu. Vstupuje jako HCO3- za katalýzy AIR karboxylasy a vzniku karboxyaminoimidazolribotidu (CAIR).
Jednotlivé kroky biosyntézy inosinmonofosfátu (IMP) • • •
• •
•
12
8. Vstup N1 atomu purinu. Vstupuje formou aminoskupiny Asp za účasti ATP → ADP + Pi a tvorby 5-aminoimidazol-4-(N-sukcinylokarboxamid) ribotidu (SACAIR). 9. Odštěpení fumarátu z SACAIR. Podobná reakce reakci močovinového cyklu. Tvoří se 5-aminoimidazol-4-karboxamidribotid (AICAR). 10. Vstup C2 atomu purinu. Druhá formylace za účasti N 10-formyl THF a tvorby 5-formaminoimidazol-4-karboxamidribotidu (FAICAR). Tato reakce a reakce 4 jsou inhibovány sulfonamidy, strukturními analogy paminobenzoové kyseliny !! 11. Cyklizace za tvorby IMP. Eliminace vody. Na rozdíl od reakce 4 není nutné ATP. Poznámka: U živočichů jsou reakce 10 a11 katalyzovány bifunkčními enzymy, stejně jako reakce 7 a 8. Reakce 3, 4 a 6 probíhají na jednoduchém proteinu. Meziprodukty multifunkčních enzymů nejsou uvolňovány do prostředí, ale posouvány tunely k dalšímu enzymu. Podobná situace je u pyruvátdehydrogenasového komplexu, synthasy mastných kyselin, synthasy glutamátu a tryptofansynthasy.
1. Výchozím sloučeninou je produkt pentosafosfátové dráhy α-D-ribosa-5-fosfát, která se aktivuje ATP na 5-fosforibosyl-α-pyrofosfát (PRPP). 2-
CH2
O 3P O
H
O H
α
H
OH
H OH
OH
α-D-Ribosa-5-fosfát (R5P) ATP 1
Ribosafosfátpyrofosfátkinasa
AMP 2-
O 3P O
CH2
H
O H
H
O
H OH
13
α O
OH
P O
-
O O
P O
5-Fosforibosyl-α-pyrofosfát (PRPP)
-
O
-
2. Vstup atomu N 9 purinu reakcí PRPP s Gln. Dochází k inverzi konfigurace v poloze 1´na β. Kontrolní krok biosyntézy – současná hydrolýzy PPi !! Vznik β-5-fosforibosylaminu (PRA). 2-
O 3P O
CH2
H
O H
-
α O
H
H
P
O OH
O
OH
O
O
P
-
O
O
5-Fosforibosyl-α-pyrofosfát (PRPP) Glutamin + H2O 2
Amidofosforibosyltransferasa
Glutamát + PPi 2-
O3P O
CH2
NH2
O H
H
H
H OH
14
β
OH
β-5-Fosforibosylamin (PRA)
3. Vstup purinových atomů C4, C5 a N7. Atomy vstupují ve formě Gly na PRA a tvorby glycinamidribotidu (GAR).
2-
CH2
O 3P O
NH2
O H
β
H
H
H OH
OH
β-5-Fosforibosylamin (PRA) Glycin + ATP 3
GAR synthetasa
ADP + Pi
CH2 O
2-
O3P O
CH2
C NH
O H
H
H
H OH
15
β
OH
Glycinamidribotid (GAR)
NH2
4. Vstup purinového atomu C8. Volná aminoskupina GAR je formylována N10-formyl THF za tvorby formylglycinamidribotidu (FGAR). CH2 O 2-
O 3P O
CH2
NH2
C NH
O H
H
H
β H
OH
OH
Glycinamidribotid (GAR)
N 10-Formyl-THF 4
GAR transformylasa
THF
H2C O
C
H N
NH
CH O
ribosa-5-fosfát
16
Formylglycinamidribotid (FGAR)
5. Vstup purinového atomu N3. Vstupuje ve formě Gln za účasti ATP → ADP + Pi.
H2C O
C
H N
NH
CH O
ribosa-5-fosfát
Formylglycinamidribotid (FGAR) ATP + Glutamin + H2O
5
FGAM synthetasa
ADP + Glutamát + Pi
H2C HN
C
H N
NH
CH O
ribosa-5-fosfát
17
Formylglycinamidinribotid (FGAM)
6. Tvorba imidazolového kruhu purinu. Intramolekulární kondenzace za účasti ATP tvoří 5-aminoimidazolribotidu (AIR). H2C HN
C
H N
CH
NH
O
ribosa-5-fosfát
Formylglycinamidinribotid (FGAM) ATP 6
AIR synthetasa
ADP + Pi HC H2N
C5
N CH N
ribosa-5-fosfát
18
5-Aminoimidazolribotid (AIR)
7. Vstup C6 atomu purinu. Vstupuje jako HCO3- za katalýzy AIR karboxylasy a vzniku karboxyaminoimidazolribotidu (CAIR). N
HC H2N
C
5
CH N
ribosa-5-fosfát
5-Aminoimidazolribotid (AIR) ATP + HCO3-
-
7
AIR karboxylasa
ADP + Pi
OOC
H2N
C4 C5
N CH N
ribosa-5-fosfát
19
Karboxyaminoimidazolribotid (CAIR)
8. Vstup N1 atomu purinu. Vstupuje formou aminoskupiny Asp za účasti ATP → ADP + Pi a tvorby 5-aminoimidazol-4-(N-sukcinylokarboxamid) ribotidu (SACAIR). -
OOC
H2N
C4 C
5
N CH N
ribosa-5-fosfát
Karboxyaminoimidazolribotid (CAIR) Aspartát + ATP 8
SAICAIR synthetasa
ADP + Pi COO HC
-
NH
O C
CH2 COO
-
H2N
C4 C
5
N CH N
ribosa-5-fosfát
20
5-Aminoimidazol-4-(sukcinylokarboxamid)-ribotid (SAICAIR)
9. Odštěpení fumarátu z SACAIR. Reakce podobná reakci močovinového cyklu. Tvoří se 5-aminoimidazol-4karboxamidribotid (AICAR). COO HC
-
NH
O C
CH2 COO
-
H2N
C4 C5
N CH N
ribosa-5-fosfát
5-Aminoimidazol-4-(sukcinylokarboxamid)-ribotid (SAICAIR) 9 Fumarát
Adenylosukcinátlyasa
O H2N
C
H2N
C4 C5
N CH N
ribosa-5-fosfát
21
5-Aminoimidazol-4-karboxamidribotid (AICAIR)
10. Vstup C2 atomu purinu. Druhá formylace za účasti N 10-formyl THF a tvorby 5-formaminoimidazol4-karboxamidribotidu (FAICAR). Tato reakce a reakce 4 jsou inhibovány sulfonamidy, strukturními analogy p-aminobenzoové kyseliny !! O C
H2N
H2N
C4 C5
N CH N
ribosa-5-fosfát
5-Aminoimidazol-4-karboxamidribotid (AICAIR)
N 10-Formyl-THF 10
AICAR Transformylasa
THF O H2N O
22
CH
C
N H
C4 C
5
N CH N
ribosa-5-fosfát
5-Formaminoimidazol-4-karboxamidribotid (FAICAIR)
11. Cyklizace za tvorby IMP. Eliminace vody. Na rozdíl od reakce 4 není nutné ATP. O C
H2N O
CH
N
C4 C
N H
CH
5
N
ribosa-5-fosfát
5-Formaminoimidazol-4-karboxamidribotid (FAICAIR) 11 H2O
O C
HN HC 2-
O 3P O
IMP cyklohydrolasa
N H
C4 C
5
CH N
O H
H
OH OH
23
N
OH
Inosin-5´-monofosfát (IMP)
Biosyntéza adeninového a guaninového ribonukleotidu • • •
24
IMP se v buňkách neakumuluje a ihned se převádí na AMP a GMP. AMP se syntetizuje z IMP ve dvou krocích. Na IMP se naváže Asp, což je spojeno s hydrolýzou GTP → GDP a Pi. V další reakci se eliminuje fumarát z adenylsukcinátu za tvorby AMP. GMP se syntetizuje z IMP také ve dvou krocích. IMP se dehydrogenuje za účasti NAD+ → NADH za tvorby xanthinmonofosfátu (XMP). Druhým krokem je vstup amidodusíku Gln za účast ATP → AMP + PPi a tvorby GMP. Poznámka: V B a T lymfocytech, odpovídajících za imunitní odpověď organismu, je vysoká aktivita IMP dehydrogenasy vedoucí ke zvýšené tvorbě GMP nutných pro proliferaci. Produkt plísně, mykofenolová kyselina, tento enzym inhibuje a využívá se jako imunosupresivum po transplantacích !!
O
CH3
OH
OH O OCH3 CH3
Mykofenolová kyselina
O
První krok biosyntézy AMP a GMP O H
N
N N
Aspartát + GTP GDP + Pi
-
OOC
CH2
CH
N
ribosa-5-fosfát
Inosin-5´-monofosfát (IMP)
Adenylosukcinátsynthetasa
COO
-
IMP dehydrogenasa
NAD+ + H2O NADH + H+
NH
O N
N N
N
ribosa-5-fosfát
Adenylosukcinát
25
H
O
N
N N H
N
ribosa-5-fosfát
Xantosin-5´-monofosfát (XMP)
Druhý rok biosyntézy AMP a GMP -
OOC
CH2
CH
COO
-
NH N N
O N
H
N
O
ribosa-5-fosfát
Adenylosukcinát
Fumarát
Adenylosukcinátlyasa
N
ribosa-5-fosfát
26
N
H
ribosa-5-fosfát
Xantosin-5´-monofosfát (XMP) Glutamin + ATP + H2O
GMP synthetasa
O
N
N
N
Glutamát + AMP + PPi
NH2 N
N
N
Adenosin-5´-monofosfát (AMP)
H
H2N
N
N N H
N
ribosa-5-fosfát
Guanosin-5´-monofosfát (GMP)
Biosyntéza nuklosiddifosfátů a nukleosidtrifosfátů
•
Pro vstup nukleotidů do nukleových kyselin, musí nukleosidmonofosfáty převedeny na odpovídající trifosfáty.
•
Převedení na nukleosiddifosfáty: Nukleosidmonofosfátkinasy.
• •
Např. adenylátkinasa – Podobně guanylátkinasa –
•
Nukleosiddifosfáty jsou nukleosiddifosfátkinasou.
AMP + ATP ↔ 2 ADP GMP + ATP ↔ GTP + ADP převáděny
na
GDP + ATP ↔ GTP + ADP
27
být
nukleosidtrifosfáty
–
Regulace biosyntézy purinových nukleotidů •
Dvě hladiny regulace.
•
A) Rychlost tvorby IMP je nezávisle, ale synergicky kontrolována hladinou adeninových a guaninových nukleotidů. Vysoká hladina nukleotidů inhibuje syntézu IMP.
•
B) Místo regulace je za místem syntézy IMP. Rychlost syntézy GTP se zvyšuje s koncentrací [ATP], zatímco rychlost syntézy AMP s rostoucí koncentrací [GTP].
28
Schéma regulace biosyntézy purinových nukleotidů Ribosa-5-fosfát
PRPP
INHIBICE
AKTIVACE
5-Fosforibosylamin
IMP Adenylosukcinát
29
XMP
AMP
GMP
ADP
GDP
ATP
GTP
Recyklace purinových nukleotidů •
Při obměně nukleových kyselin se uvolňují báze adenin, guanin a hypoxanthin a ty jsou recyklovány cestou odlišnou od biosyntézy.
• •
U savců jsou puriny recyklovány dvěma enzymy: Adeninfosforibosyltransferasa (APRT) katalyzující reakci: Adenin + PRPP ↔ AMP + PPi
•
Hypoxanthin-guaninfosforibosyltransferasa (HGPRT) katalyzující reakci: Hypoxanthin + PRPP ↔ IMP + PPi Guanin + PRPP ↔ GMP + PPi
•
30
Lesch-Nyhamův syndrom – deficit HGPRT, akumuluje se PRPP, u chlapců, vysoká hladina močové kyseliny v moči, spojeno s neurologickými potížemi, agresívní a destruktivní chování.
Biosyntéza pyrimidinových nukleotidů •
31
Biosyntéza pyrimidinů je podstatně jednodušší než purinů. Čtyři atomy pyrimidinu jsou z Asp, jeden C2 má původ v CO2 a dusíkový atom N3 je z amidu Gln. Produktem biosyntézy je uridinmonofosfát (UMP), který je prekurzorem cytidinmonofosfátu (CMP).
Aminoskupina glutaminu
N
HCO3-
C
C 5 6
4 1
N
3 2
C C
Aspartát
Biosyntéza uridinmonofosfátu (UMP) • •
• • •
32
Syntéza UMP je šestistupňová. Na rozdíl od biosyntézy purinů je pyrimidinový kruh syntetizován samostatně a poté připojen k ribosa-5fosfátu. 1. Syntéza karbamoylfosfátu. Cytosolární enzym karabmoylfosfátsynthetasa II. Karbamoylfosfát je syntetizován z HCO3a amidového dusíku Gln za spotřeby dvou ATP. Srovnej s močovinovým cyklem. 2. Syntéza karbamoylaspartátu. Kondenzace karbamoylfosfátu s Asp za katalýzy aspartáttranskarbamoylasy. Bez spotřeby ATP ! 3. Uzavření kruhu za tvorby dihydroorotátu. 4. Oxidace dihydroorotátu na orotát. Reakce je ireversibilní, enzym dihydroorotátdehydrogenasa. Enzym obsahuje FMN a nehemové Fe a je lokalizován na vnější straně vnitřní mitochondriální membrány, kde je reoxidován chinony. Ostatní enzymy jsou cytosolární. Inhibice dihydroorotátdehydrogenasy blokuje syntézu pyrimidinů v T lymfocytech a tak potlačuje autoimunitní onemocnění rheumatoidní arthritidu.
Biosyntéza uridinmonofosfátu •
5. Vstup ribosa-5-fosfátu. Orotát reaguje s PRPP za tvorby orotidin5´-monofosfátu (OMP). Reakce je poháněna hydrolýzou PPi. Enzym: orotátfosforibosyltransferasa se také podílí na recyklaci ostatních pyrimidinových bází jako jsou uracil a cytosin.
•
6. Dekarboxylace OMP za tvorby UMP. Enzym OMP dekarboxylasa (ODCasa) urychluje tvorbu UMP faktorem 2 x 1023 – jeden z nejúčinnějších enzymů vůbec !!
•
Poznámka: Biosyntéza pyrimidinů je cílem antiparasitických léčiv. Např. parazit Toxoplasma gondii (toxoplasmosa) způsobuje oslepnutí, neurologické dysfunkce a u lidí se sníženou imunitou i smrt. Místem zásahu je karbamoylfosfátsynthetasa II, enzym, který se strukturou i kineticky liší od savčího. Parazit není schopen využít pyrimidinové báze hostitele a proto je musí syntetizovat de novo.
33
1. Syntéza karbamoylfosfátu. Cytosolární enzym karabmoylfosfátsynthetasa II. Karbamoylfosfát je syntetizován z HCO3- a amidového dusíku Gln za spotřeby dvou ATP.
2 ATP + HCO3- + Glutamin + H2O 1
Karbamoylfosfátsynthetasa II
2 ADP + Glutamát + Pi
NH2 O
C O
2-
PO3
Karbamoylfosfát
34
2. Syntéza karbamoylaspartátu. Kondenzace karbamoylfosfátu s Asp za katalýzy aspartáttranskarbamoylasy. Bez spotřeby ATP ! NH2 O
C O
2-
PO 3
Karbamoylfosfát Aspartát 2 Aspartáttranskarbamoylasa (ATCasa) Pi O C HO NH2 O
35
C
N H
CH2 CH
COO
Karbamoylaspartát
-
3. Uzavření kruhu za tvorby dihydroorotátu. O C HO NH2 O
C
N H
CH2 CH
COO
-
Karbamoylaspartát 3
Dihydroorotasa
H 2O O HN O
C
C
N H
CH2 CH
COO
Dihydroorotát
36
-
4. Oxidace dihydroorotátu na orotát. Reakce je ireversibilní, enzym dihydroorotátdehydrogenasa. Enzym obsahuje FMN a nehemové Fe a je lokalizován na vnější straně vnitřní mitochondriální membrány, kde je reoxidován chinony. O HN O
C
C
N H
CH2 CH
COO
-
Dihydroorotát Chinon 4 Dihydroorotátdehydrogenasa Chinol O HN O
37
C
C
N H
CH C
Orotát
COO
-
5. Vstup ribosa-5-fosfátu. Orotát reaguje s PRPP za tvorby orotidin-5´monofosfátu (OMP). Reakce je poháněna hydrolýzou PPi. Enzym: orotátfosforibosyltransferasa se také podílí na recyklaci ostatních pyrimidinových bází jako jsou uracil a cytosin. O C
HN C
O
CH C
N H
COO
-
Orotát PPRP 5 Orotátfosforibosyltransferasa O
PPi HN
2-
O 3P O
C
O CH2
O H
H
N
CH C
β H
H OH
38
C
OH
Orotidin-5´-monofosfát (OMP)
COO
-
6. Dekarboxylace OMP za tvorby UMP. Enzym OMP dekarboxylasa (ODCasa) urychluje tvorbu UMP faktorem 2 x 1023 – jeden z nejúčinnějších O enzymů vůbec !! HN
2-
O 3P O
C
O CH2
C
N
O H
CH C
COO
-
β
H
H
H OH
OH
Orotidin-5´-monofosfát (OMP) 6
OMP dekarboxylasa
CO2
O HN
2-
O 3P O
C
O CH2
O H
H
CH
N
CH
β H
H OH
39
C
OH
Uridin-5´-monofosfát (UMP)
Syntéza uridintrifosfátu (UTP) a cytidintrifosfátu (CTP) •
Enzymy: nuklosidmonofosfátkinasa a nukleosiddifosfátkinasa analogie syntézy purinových nukleotidtrifosfátů. UMP + ATP ↔ UDP + ADP UDP + ATP ↔ UTP + ADP
•
CTP se tvoří aminací UTP CTP synthasou. U živočichů je donorem aminoskupiny Gln u baktérií přímo NH3. O H
O -
O
-
P O
40
O O
P O
-
O O
P
O
O
UTP
CH2
H
N
O
-
N O
H
H
H
H OH
NH2
OH
Glutamin + ATP + H2O
Glutamát + ADP + Pi
-
-
O O
-
P O
O
P O
O
-
O
O
O
P
N
O
O
CTP
CH2
N O
H
H
H
H OH
OH
Regulace biosyntézy pyrimidinových nukleotidů - inhibice zpětnou BIOSYNTÉZA PYRIMIDINŮ U BAKTERIÍvazbou. BIOSYNTÉZA PYRIMIDINŮ U ŽIVOČICHŮ (E. coli)
HCO3- + Glutamin + ATP
HCO3- + Glutamin + ATP
AKTIVACE Karbamoylfosfát
Karbamoylfosfát AKTIVACE
Karbamoylaspartát
Karbamoylaspartát
Dihydroorotát
Dihydroorotát
Orotát
Orotát PRPP
PRPP INHIBICE
INHIBICE
OMP
OMP
UMP
UMP
UDP
UDP
UTP
UTP
CTP
CTP
41
Biosyntéza deoxyribonukleotidů •
Deoxyribonukleotidy jsou syntetizovány z odpovídajících ribonukleotidů redukcí pozice 2´. Katalyzují allosterické enzymy ribonukleotidreduktasy (RNR). Substrátem je nukleotiddifosfát, reakce je radikálová a RNR je udržována v redukovaném stavu thioredoxinem. Po redukci je dNDP fosforylovcán ATP na dNTP. -
-
O
-
P O
O
P O
O H
H
H
H OH
OH
-
-
P O
Báze
O
O O
O
NDP
42
-
Báze
O
O
O
P O
O
O H
H
H
dNDP
H OH
H
Biosyntéza deoxythymidinmonofosfátu. •
Deoxythymidinmonofosfát (dTMP), součást DNA, je syntetizován methylací dUMP. dUMP je generován hydrolýzou dUTP: dUTP + H2O → dUMP + PPi
•
Vytvořený dTMP je ihned fosforylován na dTTP ! Tyto dvě reakce spotřebovávající energii jsou nutné jako prevence vstupu dUTP do DNA. Enzymový systém katalyzující syntézu DNA z dNTP efektivně nerozlišuje mezi dUTP a dTTP.
•
Vlastní methylace dUMP: Enzym thymidylátsynthasa a nositel methylu N 5, N 10 –methylentetrahydrofolát (N 5, N 10 –methylen-THF).
•
Poznámka: Přenášená methylenová skupina, mající oxidační stav formaldehydu, je redukována na methyl (oxidační stav methanol) na úkor oxidace THF na dihydrofolát (DHF).
43
Schéma methylace dUMP na dTMP O
H
O
N C
C
6C 5
N
C
+ H
H
H N
N
H2N
H
8
N
5
O
N C
N
C C
+ H
H
H N
N
H2N
CH3
N
CH2
N
CH2 NH
O
dTMP
R
Dihydrofolát O
44
N R
dRibosa-5-fosfát
R =
10
H2C
O C
9 CH2
N 5,N 10-Methylentetrahydrofolát
dUMP
H
H
6
N O
dRibosa-5-fosfát
7 CH2
C
H N
COO CH
-
O CH2
CH2
C
-
O ; n = 1-6
n
Regenerace N 5, N
10
–methylentetrahydrofolátu
Dihydrofolátreduktasa (DHFR) (FdUMP = fluordeoxyuridinmonofosfát) dUMP
FdUMP
dTMP
Thymidylátsynthasa
N 5,N 10-Methylen-THF H3N
+
CH2
COO
NADPH + H+
-
Dihydrofolátreduktasa
Glycin
Serinhydroxymethyltransferasa
H3N
45
DHF
+
CH COO CH2OH
Serin
THF -
NADP+
Methotrexát Aminopterin Trimethoprim
Inhibice thymidylátsynthasy nebo dihydrofolátreduktasy – terapie rakoviny. •
Tvorba dTTP je kritický proces pro rychle proliferující buńky jako jsou rakovinné. Přerušení syntézy dTTP vede k jejich zániku. Normální buňky, kromě buněk kostní dřeně, imunitního systému, kartáčového lemu střev a vlasových uzlíků, jsou na tyto zásahy méně citlivé.
O H
-
O -
O
•
46
5-Fluordeoxyuridylát (FdUMP) je ireversibilní inhibitor thymidylátsynthasy. FdUMP se váže na thymidylátsynthasu jako dUMP. Při vlastní methylaci nelze odštěpit F (F+) stejně jako H+ a enzym je tak svázán v inaktivním kovalentním ternárním komplexu enzym-FdUMP-THF. Takové inhibitory nazýváme mechanism-based inhibitors nebo také suicide substrates (sebevražedné substráty).
P O
N C
O O
C
N
O H
H OH
H OH
H
5-Fluorodeoxyuridylát (FdUMP)
C C
F
H
Inhibice dihydrofolátreduktasy. Blokuje se regenerace THF. Antifoláty, DHF analoga, se váží na DHFR 1 000 x pevněji než DHF. H2N
H
N N
H N
CH2
N
O CH2
NH2
C
N
H N
COO CH
R
R = H
Aminopterin
R = CH3
Methotrexát (amethopterin) OCH3
H2N
N
OCH3
N
CH2 NH2
47
Trimethoprim
OCH3
-
CH2
CH2
COO
-
Odbourávání (katabolismus) nukleotidů •
Většina potravy obsahuje nukleové kyseliny. Nukleové kyseliny jsou intaktní ke kyselému prostředí žaludku a jsou odbourávány až v tenkém střevě pankreatickými nukleasami a střevními fosfodiesterasami. Iontová povaha nukleotidů jim nedovoluje procházet přes buněčné membrány a proto jsou hydrolyzovány na nukleosidy. Nukleosidy jsou ve střevní stěně hydrolyzovány nukleosidasami a nukleosidfosforylasami: Nukleosidasa: Nukleosid + H2O → báze + ribosa Nukleosidfosforylasa: Nukleosid + Pi → báze + ribosa-5-fosfát
• • •
48
Recyklováno je jen velmi malé množství bází nukleových kyselin z potravy – musí probíhat biosyntéza de novo. Ribosa-1-fosfát jako produkt purinnukleosidfosforylasy (PNP) je prekurzorem PRPP. Adenosin a deoxyadenosin nejsou štěpeny savčí PNP. Jsou deaminovány adenosindeaminasou (ADA) a AMP deaminasou na odpovídající deriváty ionosinu, které jsou dále degradovány.
Schéma katabolismu purinových nukleotidů 1. část
NH2
O N
N
AMP deaminasa
N
N
H2O
H
O
N
NH4+
N
Ribosa-5-fosfát
N
O
H2O
Nukleotidasa
H
N
N
H2N
H
Ribosa-5-fosfát
Adenosindeaminasa NH4+
Nukleotidasa
Inosin Pi
Ribosa-1-P
H2O
N
N H
Ribosa-5-fosfát
Xanthinoxidasa
GMP
Nukleotidasa
H2O
Nukleotidasa
Pi
Pi
Xanthosin
Guanosin
Pi Purinnukleosidfosforylasa (PNP) Ribosa-1-P
Hypoxanthin
N
N
XMP
Pi
H2O
49
N
N
IMP
Pi
Adenosin
H
Ribosa-5-fosfát
AMP H2O
N
O
Pi Purinnukleosidfosforylasa (PNP) Ribosa-1-P
Xanthin
Guanindeaminasa
Purinnukleosidfosforylasa (PNP)
Guanin
Schéma katabolismu purinových nukleotidů 2. část
Hypoxanthin
Xanthinoxidasa
Guanindeaminasa
Xanthin
NH4+
O2 + H2O H2O2 O2 + H2O
Xanthinoxidasa
H2O2 O H
O
H N
N
O N H
N H
Močová kyselina
50
H2O
Guanin
Cyklus purinových nukleotidů •
Cyklus hraje důležitou roli v kosterním svalstvu. Zvyšuje se svalová aktivita zvyšováním aktivity citrátového cyklu. Svaly nemají dostatečné množství enzymů, které by doplňovaly meziprodukty citrátového cyklu – anaplerotické reakce. Cyklus purinových nukleotidů je dodavatelem fumarátu pro svalový citrátový cyklus !!! H2O
NH4+ AMP deaminasa
AMP
IMP
Fumarát
Aspartát + GTP
Adenylosukcinátlyasa
Adenylosukcinátsynthetasa
Adenylosukcinát GDP + Pi
51
H2O + Aspartát + GTP
NH4+ + GDP + Pi + Fumarát
Xanthinoxidasa (XO) Převádí hypoxanthin (báze IMP) na xanthin a močovou kyselinu. •
U savců je XO v játrech a v lemu tenkého střeva. XO je homodimer obsahující FAD a Mo komplex cyklující mezi Mo6+ a Mo4+. Koncovým akceptorem elektronů je O2 přecházející na H2O2 což je nebezpečná oxidační sloučenina ihned štěpena katalasou na H2O a O2. O
O N
HN N
N H
Hypoxanthin
N
HN O
O
N H
N H
O N
HN
7 9
O
Xanthin
N H
8
O
N H
O
Močová kyselina (enol forma)
O
O
N
52
-
O N H
N H
Ureát
O N H
N H
Močová kyselina (keto forma)
pK = 5.4
HN
N
HN
H
H
+
H+
Osud močové kyseliny •
Konečným produktem degradace purinů u člověka a primátů je močová kyselina vylučovaná močí.
•
Totéž platí pro ptáky, suchozemské plazy a většinu hmyzu. Smyslem je zadržovat vodu, protože močová kyselina je jen omezeně rozpustná ve vodě a proto její vylučování ve formě krystalů nebo pasty šetří pro organismus vodu.
• •
U všech dalších organismů je močová kyselina dále degradována. Savci, vyjma primátů, oxidují močovou kyselinu na ve vodě dobře rozpustný allantoin. Kostnaté ryby štěpí allantoin dále na allantoovou kyselinu. Chrupavčité ryby a obojživelníci degradují allantoovou kyselinu na močovinu a tu vyměšují. Mořští bezobratlovci rozkládají močovinu na amoniak a amonné ionty.
• • •
53
Schéma další degradace močové kyseliny O
N
HN O
VYLUČOVANO:
H
O N
N H
H
Primáti Ptáci Plazi Hmyz
Močová kyselina 2 H2O + O2
Urátoxidasa
CO2 + H2O2
H
O
N
N H
N
NH2 O
O
Další savci
H
Allantoin H2O
COOH NH2
NH2 O
Allantoinasa
N H
N H
Kostnaté ryby
O
Allantoová kyselina H2O
Allantoikasa
CHO-COOH Glyoxylová kyselina O 2 H2N
C
NH2
Močovina
2 H2O
54
Chrupavčité ryby Obojživelníci
Ureasa
2 CO2 4 NH4+
Mořští bezobratlí
Dna je onemocnění provázené zvýšenou hladinou močové kyseliny v tělesných tekutinách. •
Jednou z nejvýznamnějších příčin dny je narušené vylučování močové kyseliny. Jedním z důvodů je nedostatečnost HGPRT (Lesch-Nyhamův syndrom) vedoucí k nadměrné produkci z důvodů akumulace PRPP.
•
Dna se léčí podáním inhibitoru xanthinoxidasy allopurinolu, což je strukturní analog hypoxanthinu. XO allopurinol hydroxyluje na alloxanthin, který se pevně naváže na redukovanou formu enzymu a tím ho ireversibilně inhibuje. Příklad „suicide inhibitor“ nebo mechanismbased substrate. O HN
7
N
55
O
8
N H
Allopurinol
N
O N
HN N
N H
Hypoxanthin
HN O
N N H
N H
Alloxanthin
Odbourávání (katabolismus) pyrimidinových nukleotidů •
Živočišné buňky degradují pyrimidinové nukleotidy na jejich báze. Reakce probíhají přes defosforylace, deaminace a štěpení glykosidových vazeb. Vznikající uracil a thymin jsou dále štěpeny v játrech redukčně, na rozdíl od purinových bází.
•
Konečnými produkty jsou β-alanin a β-aminoisobutyrát.
•
Obě sloučeniny jsou dále převáděny transaminací a aktivací na malonylCoA a methylmalonyl CoA.
•
Malonyl CoA je prekurzor biosyntézy mastných kyselin a methylmalonyl CoA je převeden na meziprodukt citrátového cyklu sukcinyl CoA.
•
Závěr: Produkty degradace pyrimidinových k energetickému metabolismu buňky.
56
nukleotidů
přispívají
Degradace pyrimidinových nukleotidů I. část NH2 N N
O
O H
H
H
O
N
CMP
UMP (dTMP) H2O
Nukleotidasa
Pi
Cytidin
H
Ribosa-5-fosfát
Ribosa-5-fosfát
H2O
CH3
N
Nukleotidasa
Pi Cytidindeaminasa H2O
NH4+
Uridin (Deoxythymidin) Pi
O H
Uridinfofsforylasa
(d)Ribosa-1-P
57
O
Dihydrouracildehydrogenasa Uracil (Thymin) NADPH + H+
NADP+
CH3
N
H H N H
H
Dihydrouracil (Dihydrothymin)
Degradace pyrimidinových nukleotidů II. část O H
CH3
N
O
H H N H
H
Dihydrouracil (Dihydrothymin) H2O
Hydropyrimidinhydratasa -
O O
C
H2N O
58
N H
CH
-
OOC
CH3
CH2
β-Ureidopropionát (β-Ureidoisobutyrát)
β-Ureidopropionasa H2O
NH4+ + CO2
H2N
CH
CH3
CH2
β-Alanin (β-Aminoisobutyrát)
Transaminace a aktivace β-alaninu a β-aminoisobutyrátu -
OOC
H2N
CH CH2
COO
CH3
Aminotransferasa
2-Oxoglutarát β-Alanin (β-Aminoisobutyrát)
Glutamát
-
HC
CH3
HC
O
Malonát semialdehyd (Methylmalonát semialdehyd) CoA + NAD+ NADH + H+ COO HC
59
-
CH3
C
O
S
CoA
Malonyl-CoA (Methylmalonyl-CoA)
