MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ Zahradnická fakulta v Lednici
Resveratrol a jeho význam Bakalářská práce
Vedoucí bakalářské práce
Vypracoval
Ing. Petra Bábíková, DiS
Mgr. Miroslav Čapka
Lednice 2012
Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Resveratrol a jeho význam vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Zahradnické fakulty Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Lednici dne 25.dubna 2012 Podpis:
3
Děkuji vedoucí mojí bakalářské práce Ing. Petře Bábíkové, DiS za odborné vedení, za věnovaný čas při posuzování postupně zpracovaných částí práce, za doporučení při výběru studijního materiálu, za poskytnutí mnoha cenných rad a za zodpovězené otázky týkající se dané problematiky. Rovněž děkuji své manželce Ivetě za trpělivost, kterou se mnou měla po dobu studia. V Lednici dne 25.dubna 2012
Mgr. Miroslav Čapka
4
Obsah Strana
1. Úvod
6
2. Cíl
8
3. Současný stav řešené problematiky
9
3.1 Fenolické látky
9
3.2 Stanovení fenolických látek
11
3.3 Resveratrol
12
3.3.1 Výskyt v přírodě
13
3.3.2 Chemická struktura
15
3.3.3 Funkce v rostlině
15
3.3.4 Obsah resveratrolu v zelenině a ovoci
16
3.3.5 Resveratrol a kvercetin – stanovení obsahu
17
3.3.6 Vyhodnocení
18
3.3.7 Biosyntéza resveratrolu
21
3.3.8 Praktické využití resveratrolu v současnosti
23
3.4 Francouzský paradox
24
3.5 Antioxidanty
25
3.5.1 Mechanismus účinku antioxidantů
25
3.5.2 Výskyt antioxidantů a faktory působící na jejich obsah
26
3.5.3 Využití antioxidantů
27
3.5.4 Doporučená denní dávka antioxidantů
28
3.5.5 Nové výzkumy vlivu antioxidantů na rychlost stárnutí
29
3.5.6 Antioxidanty ve víně
29
3.6 Volné radikály
30
3.6.1 Vznik volných radikálů
30
3.6.2 Funkce volných radikálů
31
3.6.3 Nemoci způsobené oxidací volnými radikály
31
3.7 Historie léčitelství vínem
33
3.8 Falšování vědeckých experimentů
36
4. Závěr
37
5. Abstrakt
39
6. Abstract
39
7. Seznam použité literatury
40
5
1. Úvod Mnohé medicínské výzkumy ukazují, že mírné pití alkoholických nápojů, obzvláště vína, může mít příznivý vliv na délku a kvalitu života. Podle dokládaných studií je u lidí, kteří užívají v pravidelných a mírných dávkách víno, je menší pravděpodobnost, že budou postiženi srdeční nebo mozkovou příhodu. Význam zdravotních účinků vína se začal skloňovat v mnoha pádech, poté co byla zveřejněna americká studie, která porovnávala úmrtnost na infarkt v 18 průmyslových zemích. Výsledkem studie byl jev nazvaný „Francouzský paradox“. Málo se také ví o tom, že víno se až do konce 19. století užívalo jako oficiálně schválený lék. Konkrétně ve Francii a Německu se využívalo více než 150 druhů vína, v Čechách a na Moravě pak asi 10 odrůd. Není rovněž dodnes zcela známo, kdy a kde se začalo víno vyrábět, má se za to, že to bylo přibližně 10 000 let př. n. l. někde v oblastech současné Gruzie a Arménie. Konzumace vína a jeho příznivé účinky jsou zmiňovány již na papyrusových záznamech a egyptských piktogramech z období kolem roku 4000 před naším letopočtem. Důvodem pro pití alkoholu, respektive vína, nebyla primárně chuť se opíjet, hlavním důvodem byla zdravotní prevence, neboť voda obsahovala plno bakterií, které byly nebezpečné pro život člověka. Předpokládá se, že právě v Egyptě dostávali dělníci, pracující na výstavbě pyramid, víno jako předcházení infekčním nemocím a také proto, že víno mělo a má značnou výživnou hodnotu. Známý lékař Hippokrates z Kosu (460 370 př. n. l.) zmiňoval, že: „Víno je věc podivuhodně vyhovující člověku jak zdravému, tak nemocnému, budiž však podáváno ve správné míře podle tělesné stavby jednotlivce.“ Pití vína se jako prevence proti uplatňovalo tehdy, kdy byly zdroje pitné vody znečištěné a obsahovaly nebezpečné bakterie infekčních chorob jako úplavice, tyfus a cholera. Nápoje připravené kvašením se tak stávaly bezpečnými nápoji. Kromě toho mělo víno, jak je již zmíněno výše, značnou výživnou hodnotou. Víno se také používalo k vymývání ran a je známo, že v lékařství byl alkohol do 20. století jediným tišícím prostředkem proti bolesti a používal se tedy jako anestetikum. Rovněž se víno používalo k rozpouštění podávaných léků a usnadnění vstřebávání. Je ovšem zásadní si uvědomit, že stejně jako u všech léků, tak i u vína je nutné se držet určitých pravidel. Pod tímto si můžeme představit vhodné dávkování a pravidelnost. 6
Lidé, kteří jednou týdně vypijí láhev vína v průběhu večera, tato pravidla zřejmě nedodržují a příznivý účinek nelze předpokládat. Mezi lékaři je obecně známa skutečnost, že je vhodné konzumovat sklenku vína denně. V případě žen je tomu skutečně tak, denně by měly vypít asi dvě deci vína. Muž si naproti tomu může dovolit deci čtyři. Za pravidelností se tedy skrývá denní příjem. Pokud denně vypijeme uvedenou skleničku, nebo dvě, je prokázáno, že lékaři doporučovaný postup dodržujeme. Jestliže si některý den víno nedáme, pak se nic nestane a rozhodně to nezanechá negativní vliv na našem zdraví. Nedoporučuje se zmíněný deficit dohánět sklenkou vína další den. Pokud se ve své práci i dál budu zabývat příznivými účinky střídmého pití vína a vlivu resveratrolu na zdraví člověka, považuji za nutné zmínit i další okolnost, která má bezesporu vliv na sníženou úmrtnost. Nesmíme rozhodně podceňovat pokroky lékařské vědy při léčení nemocí, a kromě omezení vlivu některých rizikových faktorů se jistě podílí na snížení nemocnosti a úmrtnosti na srdeční infarkt zlepšená péče o pacienty. Dále se výrazně rozšířilo spektrum léků užívaných při srdečním onemocnění, vysokém krevním tlaku i cukrovce a zlepšila se účinnost. Stejně tak nemůžeme podceňovat změnu stravovacích návyků, složení, dostupnost a kvalitu stravy.
7
2. Cíl Cílem této bakalářské práce je prostudovat dostupné zdroje týkajících se fenolických látek ve víně, a zejména pak resveratrolu, jeho významu v lidské výživě a možného příznivého účinku na zdraví. Vypracovat literární přehled k danému tématu.
8
3. SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY
3.1 Fenolické látky Fenolické látky mají význam pro vinohradnictví, vinařství a marketink vín. V jejich složení a obsahu v hroznech a vínech existuje výrazný rozdíl mezi odrůdami určenými pro výrobu bílých a červených vín. Fenolické látky odpovídají za mnoho důležitých charakteristik vína, především barvu, hořký a tříslovitý chuťový projev a za antioxidační vlastnosti. Fenolické látky vykazují výraznou proměnlivost ve struktuře a rozdělují se na flavonoidy a neflavonoidy. Hydroxyskořicové kyseliny jsou hlavními fenolickými sloučeninami bílých odrůd. Jedná se o bezbarvé látky, které snadno podléhají oxidaci a následně žloutnou nebo hnědnou. U bílých moštů a vín mohou způsobovat hnědnutí, u červených bývají důležité pro „kopigmentaci“. V bobulích se vyskytují jako estery kyseliny vinné ve vakuolách buněk ve slupce a dužnině. Hydroxybenzoové kyseliny se vyskytují ve víně minoritně. V hroznech se nacházejí hlavně ve formě glykosidů a esterů. Kyselina gallová je nejvýznamnější a jediná hydroxybenzoová kyselina, která se nalézá přímo v hroznech, a to v pevných částech bobule. Stilbeny se zařazují mezi fytoalexiny, tj. nízkomolekulární látky, které mají antimikrobiální vlastnosti a vznikají na základě vzájemného působení mezi rostlinou a mikroorganismem. Vyznačují se taképozitivními zdravotními účinky. Flavonoidy zastupují nejvýznamnější skupinu fenolických látek u révy vinné. V hroznech a víně lze najít tři hlavní skupiny flavonoidů – antokyany, flavonoly a flavanoly. Mezi významné flavonoly vína se řadí kaempferol, kvercetin, myricetin a isorhamnetin. V bobulích révy vinné se vyskytují v podobě glukosidů a glukoronidů. Flavonoly mají schopnost působit jako ochrana před UV zářením (Pavloušek, 2011). Antokyanová barviva se nalézají zejména u modrých odrůd – u většiny ve vakuolách buněk ve slupce, u odrůd zvaných barvířky je možné najít zbarvenou také dužninu. Struktura antokyanů v hroznech a víně byla popsána v roce 1959 a malvidin-3-glukosid byl objeven jako hlavní antokyanové barvivo (Ribéreau-Gayon, 1959).
9
Antokyany se vytvářejí v průběhu zrání hroznů a jejich obsah v bobulích bývá ovlivněn ročníkem, pěstitelskými podmínkami a extrakcí během výroby vína (Kennedy, Saucier a Glories, 2006). Taniny (třísloviny) se ve víně rozdělují na dvě skupiny – hydrolyzovatelné a kondenzované. První z nich pochází zpravidla ze dřeva sudů a nemají původ v hroznech. Pro pěstitele révy vinné jsou důležitější kondenzované taniny, které se nachází ve slupkách bobulí, semenech a třapinách. Pro kvalitu vína bývají podstatné zejména senzorické vlastnosti taninů. Hořké tóny bývají spojeny s flavan-3-oly ze semen a tříslovité s flavan-3-oly ze slupek (Kennedy, Saucier a Glories, 2006). Fenolické látky patří do široké skupiny antioxidantů, tedy látek, jejichž molekuly omezují aktivitu kyslíkových radikálů. Záměrně se proto přidávají do potravin, kde svým oxidačním působením prodlužují jejich stálost. Hlavní význam fenolických látek spočívá v tom, že působí jako prevence proti koronárním chorobám, snižují riziko rakovinových onemocnění a působí proti virům (Slanina a Táborská, 2004). Fenolické látky jsou přírodními antioxidanty a můžeme je proto najít v přírodě. Nachází se v různých částech rostlin, např. kořeny, listy, plody. Podle struktury rozdělujeme fenolické látky do několika skupin (Škeříková a kol., 2004). První skupinu tvoří flavonoly odvozené
od
heterocyklického
flavanu
a
další
skupinu
tvoří
aromatické
hydroxykyseliny (Velíšek, 2002). Jedná se o skupinu sloučenin, které společně tvoří až 85 % flavoidních látek – kvercetin, katechin, také antokyany, zbytek jsou látky neflavoidní. Obsah fenolických látek je vyšší u červených vín (800 – 4000 mg.l-1), u bílých vín je obsah významně nižší (200 – 500 mg.l-1). Kvercetin má silné antioxidační účinky. Množství kvercetinu v hroznech révy vinné je závislé na intenzitě slunečního svitu. Má schopnost rozpouštět krevní sraženiny a také má protizánětlivé vlastnosti. Katechin stejně jako epikatechin má rovněž silné antioxidační účinky. Z celkového množství fenolických látek se vyskytuje v největším poměru. Fenolické látky jsou obsaženy i v jiných potravinách, ale řada z nich není rozpustná ve vodě a organismus jej získává složitým procesem, navíc mohou být znehodnoceny nevhodným způsobem skladování a také při přípravě pokrmů. Ve víně jsou látky rozpuštěny v alkoholu a chráněny ostatními přítomnými látkami (www.vinoazdravi.cz, látkové složení vína).
10
Fenolické látky, které mají rozličné chemické složení. Je jich ve víně celá řada. Asi nejzajímavější je resveratrol, který se objevuje v izomerech trans-, cis- a transcis(www.vinoazdravi.cz, látkové složení vína).
3.2 Stanovení fenolických látek
Pro stanovení fenolických látek se v posledních letech začalo využívat vysokoúčinné kapalinové chromatografie ve spojení s coulometrickým detektorem. Coulometrická detekce s elektrodovým polem je velmi citlivý způsob detekce, ve které je využita série 4-16 průtočných coulometrických cel, ve kterých dochází k elektrochemické přeměně analytu. Na každou celu je vložen jiný, ale konstantní potenciál a každá látka se oxiduje, nebo redukuje, při jiném potenciálu, ten je pak nazýván tzv. dominantním potenciálem (Marcaníková a Beňová, 2010). CoulArray detektor, používaný v této práci, je coulometrický multielektrodový detektor, který byl zkonstruován pro použití v HPLC a který se používá pro detekci elektroaktivních látek. Umožňuje charakterizaci látek na základě poměru odezvy signálu velkého počtu kanálů (Marcaníková a Beňová, 2010).
11
3.3 Resveratrol
Resveratrol jako přirozená ochrana proti plísňovým chorobám révy. Kromě fungicidní funkce slouží rostlině i jako ochrana před UV zářením a jako antioxidant. Resveratrol patří do skupiny fenolických látek, které vznikají ve slupkách bobulí jako ochranná látka proti plísním. Množstvím resveratrolu čelí stresovým situacím, jako je například napadení plísní Botrytis cinerea, proti škodlivému účinku ultrafialového záření, vlivu chladnějšího počasí a také chrání rostlinu proti škodlivému vlivu aktivních forem kyslíku. Jeho obsah ve víně je ovlivněn zvolenou technologií výroby a školením vína. Pohybuje se v rozmezí 0,1 – 8 mg.l-1. V procentuálním vyjádření obsahují slupky modrých odrůd více resveratrolu a fenolických látek než odrůdy bílé. Roli v obsahu fenolických látek hrají půdní podmínky, délka slunečního svitu a vliv stresových podmínek. Nesmíme však zapomenout vzít do úvahy ani odrůdu, dobu sklizně hroznů a další faktory, které obsah resveratrolu ve víně ovlivňují (Kyseláková a kol.,2003). V červených vínech je střední koncentrace resveratrolu 2 – 6 mg.l-1, v bílých pak je koncentrace nižší, a to od 0,2 do 0,8 mg.l-1. Ve výsledku to znamená, že 1 mg resveratrolu je obsažen v 0,17 – 0,50 l červeného vína (Šmidrkal, 2001). Z tohoto pohledu je možné považovat červené víno za významný zdroj polyfenolických sloučenin v lidské výživě. 0,2 l červeného vína obsahují asi 0,6 mg resveratrolu. Kyseláková a kol. porovnávali sedm modrých odrůd ve čtyřech vinařských oblastech (Velké Pavlovice, Strážnice, Znojmo, Brno) ve třech ročnících 1999 – 2001. Obsah resveratrolu v moravských červených vínech se pohyboval v některých ročnících a oblastech v rozmezí mezi 2 – 3 mg.l-1 a je nejen srovnatelný, ale v některých případech vyšší
než
uvádějí
zahraniční
prameny.
Tento
výzkum
jasně
dokumentuje
nezanedbatelný význam moravských vín jako možného zdroje prospěšných látek (Kyseláková a kol., 2003) Důvodem, proč je v červeném víně více antioxidantů, je skutečnost, že se při výrobě červeného vína nechává slupka hroznu po určitou dobu fermentovat a je to právě vinná slupka, která je zdrojem flavonoidů. Bílé víno nezůstává při fermentaci na slupkách, a proto v něm flavonoidy scházejí. Množství flavonoidů ovšem nezávisí pouze na barvě vína a technologii zpracování hroznů, je rovněž ovlivněno půdou a na dalších faktorech jako je např. filtrace vína. Filtrací vína se může odstranit 50 – 70 % flavonoidů. Je 12
prokázáno, že suchá vína obsahují více flavonoidů, než vína ostatní. Resveratrol je jedním z mnoha bioaktivních polyfenolů. K dalším patří kvercetin, který disponuje kromě antioxidačních, také protizánětlivými a protisrážlivými účinky, katechin, genistein, apigenin, luteolin a další mnohdy neprozkoumané látky (Pavloušek, 2011). Resveratrol patří k látkám s antioxidačním účinkem, potlačuje LDL cholesterol a zvyšuje podíl HDL cholesterolu, má protinádorové účinky (www.vinoazdravi.cz). Komplexnější poznatky o resveratrolu byly získány v osmdesátých letech minulého století, kdy přístrojové vybavení (zejména HPLC) umožnilo sledování jeho výskytu a koncentrace ve vinné révě, Vitis vinifera L. (Vitaceae).
Následně byly zkoumány
biologické vlastnosti resveratrolu. Obecně platí, že rostlinné polyfenoly jako sloučeniny s antioxidačními vlastnostmi inhibují zhoubné nádorové bujení. Kromě toho je resveratrol patrně jednou z hlavních složek rostlinných extraktů, které jsou využívány v orientální medicíně k léčení srdečních a nádorových onemocnění (Šmidrkal a kol., 2001).
Obr. I. strukturní vzorec resveratrolu
3.3.1 Výskyt v přírodě
Resveratrol byl poprvé izolován z podzemní části Kýchavice velkokvěté, Veratrum grandiflorum. Resveratrol byl dále nalezen ve více než 72 rostlinných druzích, které patří systematicky do 31 rodů a 12 čeledí. Postupným zdokonalováním analytických metod a získaných poznatků se počet rostlinných druhů, které obsahují resveratrol, zvyšuje. Mnoho z těchto rostlin je běžnou součástí lidské potravy, např. vinné hrozny a víno, mnoho druhů zeleniny a ořechy (např. arašídy). Poměrně bohatým a rozšířeným zdrojem resveratrolu jsou právě hrozny révy vinné. 13
Koncentrace resveratrolu v běžně konzumovaných potravinách v České republice, v roce 2000, je uvedena v tabulce II., z tabulky je patrné, že množství 1 mg resveratrolu je obsaženo v 0,4 – 2,5 kg uvedených zelenin. Z hlediska obsahu resveratrolu je vhodné pro konzumaci zejména červené zelí, brokolice nebo červená řepa. Červená vína obsahují 2 – 6 mg.l-1resveratrolu, tedy 1 mg resveratrolu je obsažen v 0,17 – 0,50 l červeného vína. Optimální je patrně kombinace zeleniny a vína, což odpovídá výše uvedeným stravovacím zvykům Francouzů (Šmidrkal a kol., 2001). Rostlina
Latinské jméno
Resveratrol mg.kgsuš.-1
Sušina %
Zelí čínské Kapusta hlávková Kapusta růžičková Zelí červené Zelí bílé Brokolice Čekanka Petržel naťová
Brassica oleracea Brassica oleracea
9 7
5 14
Resveratrol Množství mg.kg-1 kg obsah 1 mg resveratrolu 0,5 2,2 1,0 1,0
Brassica oleracea
15
17
2,6
0,4
Brassica oleracea Brassica oleracea Brassica oleracea Cichorium intybus Petroselinum hortense Mrkev karotka Daucus carota
15 8 15 20 5
16 7 12 5 19
2,4 0,6 1,8 1,0 1,0
0,4 1,8 0,6 1,0 1,1
4
10
0,4
2,5
Červená řepa Česnek Cibule žlutá Cibule červená Podzemnice olejná Čajovník čínský
Beta vulgaris Allium sativum Allium cepa Allium cepa Arachis hypogaea
8 2 17 12 2
22 29 9 9 94
1,8 0,6 1,5 1,1 1,9
0,6 1,7 0,7 0,9 0,5
Thea sinensis
1
94
0,9
1,1
Tab. II. Koncentrace resveratrolu u běžných potravin (Šmidrkal a kol., 2001)
14
3.3.2 Chemická struktura
Resveratrol je svou strukturou 3,4,5 – trihydroxystilben (I). Z jeho struktury je zřejmé, že mohou existovat dva geometrické isomery, trans- a cis-. V rostlinném materiálu se obvykle vyskytuje směs obou isomerů, většinou převažuje trans.
Resveratrol se
vyskytuje rovněž ve formě glukosidů1, β- glukosyloxy skupina je vázána buď v poloze 3 nebo v poloze4, od obou typů je znám trans – i cis – isomer. Kromě toho jsou v rostlinném materiálu přítomny oligomery resveratrolu, tzv. konstitutivní stilbeny, dimer resveratrolu ε-viniferin a trimer α-viniferin. Uvedené oligomery resveratrolu nejsou jediné, v poslední době byla popsána čínskými autory řada analogických oligomerů resveratrolu, amurensiny H a G z podzemní části révy amurské, Vitis amurensis Rupr. (Vitaceae). Amuresin byl připraven H oxidací resveratrolu chloridem železitým. Je možné, že analogicky při izolaci těchto sloučenin z rostlin, kde jsou obvykle přítomny v katalytickém množství železité ionty, dochází k oxidaci resveratrolu na některé z výše uvedených dimerů a trimerů (Šmidrkal a kol., 2001). Výše uvedené dimery a trimery jsou tedy oxidační produkty resveratrolu. Otázkou však je, zda vznikají oxidací resveratrolu v rostlině, jestli jsou obsahovou látkou rostliny, nebo zda některé z nich vznikly až oxidací resveratrolu během zpracování rostlinného materiálu, a jsou tedy artefakty.
3.3.3 Funkce v rostlině Resveratrol lze zařadit mezi fytoalexiny, což jsou sekundární metabolity rostlin, které se začnou tvořit nebo ve zvýšené míře jsou reakcí na stres (mechanické poškození, UV záření, ozon) nebo po napadení rostliny nepatogenními nebo avirulentními bakteriemi, viry či houbami. Některé fytoalexiny mají antibakteriální nebo antifungální účinnost, jiné jsou pro danou infekci neúčinné; nejsou tedy ekvivalentní protilátkám, které vyšší organismy tvoří po infekci (Barlass a kol., 1987). Fyziologická funkce resveratrolu v rostlinách není stále zcela jasná. Tvorba fytoalexinů (trans-resveratrolu a ε-viniferinu) je jedním z mechanismů rezistence buňky. Při 15
napadení révy vinné plísněmi (např. Botrytis cinerea či Plasmospara viticola) nebo po expozici UV zářením se začnou rychle tvořit a akumulovat fytoalexiny, maximální koncentrace trans-resveratrolu je dosaženo po 24 – 96 hodinách od expozice, poté jeho koncentrace klesá a po cca 16 dnech se ustálí na původním stavu. Při napadení hroznu révy vinné plísní Botrytis cinerea lze pozorovat, jak rostlina vytváří bariéru okolo napadeného místa. V místě napadení je koncentrace resveratrolu nízká, je možné, že plíseň rozkládá fytoalexin, jehož působení je vystavena. Maximální koncentrace resveratrolu (cca 4x vyšší než v napadeném místě) je v sousední zóně se zvyšující se vzdáleností od centra napadení pak koncentrace zvolna klesá. Podobná bariéra se rovněž vytváří kolem napadeného místa listu révy vinné (Langcake a McCarthy, 1979). Je pravděpodobné, že ve zralých hroznech je syntéza trans-resveratrolu nebo jeho glykosidu nějakým způsobem iniciována. Kromě výše uvedených faktorů i mechanické poškození slupky bobulí indikuje i u neinfikovaných hroznů syntézu fytoalexinů, zřejmě jako preventivní ochranu před napadením plísněni. Předpokládá se, že zdrojem transresveratrolu ve víně (jako nápoji) jsou polyfenolické sloučeniny (konstitutivní stilbeny, tedy viniferiny), extrahované ze slupek bobulí, zbytků třapin a stonků, ze kterých vzniká trans-resveratrol během dalších procesů (Šmidrkal a kol., 2001).
3.3.4 Obsah resveratrolu v zelenině a ovoci
Velká část literatury se zabývá stanovením resveratrolu a vybraných antioxidantů ve vínech, hroznech, případně ve slupkách nebo semenech hroznů a jen malá část se zabývá jejich obsahem v ostatních zdrojích např. v brusinkách a v pohance. Mezi rostliny pozitivně testované na resveratrol můžeme řadit i ovoce a zeleninu (cibule, listová zelenina), čaj, moruši apod. Resveratrol byl prokázán také v kořeni arašídů (Arachis hypogaea), v arašídech samotných a v arašídových produktech. Pražené arašídy obsahovaly nižší množství resveratrolu a vyšší obsah byl ve vařených arašídech. Skupina vědců Vysoké školy chemicko-technologické, pod vedením Ireny Kolouchové, si v roce 2004 zadala cíl stanovit obsah resveratrolu a dalších vybraných fenolových látek v zelenině, arašídech a ovoci běžně dostupném v České republice. 16
Součástí
projektu bylo stanovení obsahu celkových polyfenolických látek a polyfenolů typu pyrokatecholu, resorcinolu a fluroglucinu. Resveratrol a kvercetin byly stanoveny HPLC s elektrochemickou detekcí (Kolouchová a kol., 2005). trans-Resveratrol v krystalické podobě (v čistotě větší než 99 %) byl připraven totální syntézou. Standardní roztok trans-resveratrolu (10 mg.l-1) v 40% v/v vodném ethanolu byl uchován v temnu, při 4 °C. cis-Resveratrol byl získán 10 h expozicí roztoku transresveratrolu ve vodném ethanolu rozptýlenému dennímu světlu. Za těchto podmínek 80 % trans-resveratrolu isomerovalo na cis-isomer. Standardní roztok kvercetinu (Sigma, USA) o koncentraci 25 mg.l-1 v/v vodném ethanolu byl uchován při 4 °C.
3.3.5 Resveratrol a kvercetin – stanovení obsahu
Trans- a cis-resveratrol a kvercetin byly stanovovány pomocí přístroje pro HPLC (3500, TSP, USA) s použitím elektrochemického detektoru HP 1049 s pracovní elektrodou ze skelného uhlíku (Hewlett-Packard, USA) při potenciálu 0,75 V. Extrakty byly filtrovány přes mikrofiltr (0,2 µm, Millipore, USA) a permeát (20 µl) byl nastřikován na kolonu Nucleosil (Supelco, USA) 120-5-C18 (250 x 4 mm, 5 µm) s předkolonou (10 x 4 mm) se stejnou stacionární fází. Byla použita isokratická eluce (mobilní fáze obsahovala: 25 % acetonitrilu, 0,1 % H3PO4 a NaCl (c=5 mmol.l-1) s průtokem 1,0 ml.min-1. Identifikace a kvantifikace resveratrolu byla prováděna metodou standardního přídavku. Byly analyzovány vzorky zeleniny, arašídů a ovoce běžně dostupné na trhu v ČR. Šlo o vzorky čínského zelí, bílého a červeného zelí, květáku, růžičkové kapusty, kapusty, brokolice, česneku, žluté a červené cibule, čekanky, hlávkového a ledového salátu, salátu Lollo Rosso, špenátu, mrkve petržele, červené řepy, podzemnice olejné, višně obecné, maliníku, ostružiníku, aronie černé, jeřábu moravského, borůvky, černého a červeného rybízu a angreštu (Kolouchová a kol., 2005).
17
3.3.6 Vyhodnocení
Výtěžnost a reprodukovatelnost stanovení za optimálních podmínek byla provedena vyhodnocením přesnosti a správnosti metody. Správnost metod byla ověřena Studentovým t-testem. Výsledky ukázaly, že na hladině významnosti 95 % poskytují metody správné výsledky. Výtěžnost stanovení trans-resveratrolu a kvercetinu ve vzorcích zeleniny, zeleného čaje, chmele a ořechů za optimálních podmínek byla stanovena metodou standardního přídavku (n=5). Relativní standardní odchylka (RSD) ve všech reálných vzorcích u trans-resveratrolu i kvercetinu při n=5 byla v rozmezí 1,1 – 2,1 % (Kolouchová a kol., 2005). Ve všech analyzovaných vzorcích zeleniny byla zaznamenána alespoň stopová množství resveratrolu (Tab.III). Větší množství obsahovaly červená řepa a červená cibule a nejvyšší koncentrace byla stanovena u špenátu. Stanovené hodnoty se pohybovaly v rozmezí 0,005 až 0,02 mg.g-1. Stanovené koncentrace kvercetinu se pohybovaly od stopových množství do 0,76 mg.g-1, tato maximální koncentrace byla zjištěna u vzorku hlávkové kapusty. Většina hodnot se pohybovala od 0,02 až 0,14 mg.g-1. Nejmenší obsah analyzovaných látek byl kromě vzorku ledového salátu zjištěn také u česneku, u nich stanovené koncentrace resveratrolu i kvercetinu byly podprůměrné. Bylo zjištěno, že z hlediska obsahů celkových polyfenolů se hodnoty pohybují v rozmezí 5 mg.g-1(mrkev) a 30 mg.g-1(červené zelí), u látek typu pyrokatecholu, resorcinolu a fluroglucinu (CRP) v rozmezí 0,02 (mrkev) až 0,08 mg.g-1 (červená řepa a petržel). U burských oříšků bylo zjištěno, že koncentrace resveratrolu v analyzovaných vzorcích ořechů byla celkově nižší (Tab. IV.). Nalezené hodnoty se pohybovaly mezi 0,002 a 0,0015 mg.g-1. Větší množství resveratrolu bylo sice nalezeno v červenohnědých slupkách, ale ani tato koncentrace nepotvrdila očekávané hodnoty. Nejvyšší obsah resveratrolu
byl
obsažen
v dřevitých
skořápkách
ořechů,
což
bylo
naopak
předpokládáno. Při srovnání nalezených hodnot kvercetinu byl zvýšený obsah nalezen v dřevitých skořápkách (6 mg.g-1). Největší množství TP bylo v červenohnědých slupkách arašídů (3 mg.g-1). Při srovnání jednotlivých částí z hlediska obsahu látek typu CRP byl největší obsah potvrzen ve vnitřních slupkách (~6 mg.g-1).
18
K problematice obsahu resveratrolu v ovoci nebyl v době zkoumání nalezen žádný odpovídající materiál, a proto výsledky skupiny vědců nebylo možné porovnat. Byly prováděny analýzy resveratrolu v bobulovém ovoci a v některých peckovinách (Tab. V.). Většina analyzovaného ovoce obsahovala stopové množství resveratrolu a pouze černý jeřáb (aronie) a černý rybíz měly významnější množství resveratrolu (0,032 mg.g-1 a 0,016 mg.g-1). Z peckovin byla nejvyšší koncentrace zjištěna u višní (0,006 mg.g-1), u ostatních peckovin byla nalezena stopová množství pod mezí detekce. S ohledem na to, že studie nemohla být porovnávána se zkoumáním podobného charakteru, lze tedy uvést, že je svým způsobem jedinečná. Porovnáním těchto látek, které se uvádějí jako významné pro lidské zdraví a prevenci chorob, se žádná z publikací nezabývala. A také předložené výsledky vyvracejí některé dávné mýty např. o obsahu polyfenolových látek v česneku, kdy se námi naměřené hodnoty jeví jako podprůměrné. Naopak ve srovnání s ostatními druhy zeleniny bylo značné množství těchto látek zjištěno např. v zelí a naťové petrželi. Nejvyšší množství resveratrolu bylo stanoveno v červeném zelí a špenátu (Kolouchová a kol., 2005).
19
Zelenina
Resveratrol
Kvercetin
trans-
cis-
celkem
Čínské zelí
0,0092
stopya
0,0092
0,073
Bílé zelí
0,0076
Stopya
0,0076
0,12
Červené zelí
0,011
0,0041
0,015
0,14
Květák
stopya
stopya
stopya
0,031
Růžičková
0,015
stopya
0,015
0,10
Kapusta
0,0035
0,0035
0,0070
0,76
Brokolice
0,010
0,0046
0,015
0,040
Česnek
0,0021
0,0016
0,0040
0,023
Žlutá cibule
stopya
stopya
stopya
0,040
Červená cibule
0,0038
0,0034
0,0072
0,034
Čekanka
0,012
stopya
0,012
stopya
Salát hlávkový
stopya
stopya
stopya
stopya
Ledový salát
stopya
stopya
stopya
stopya
Salát Lollo Rosso
0,0068
stopya
0,0070
0,043
Špenát
0,010
0,0061
0,016
0,038
Mrkev
0,0038
stopya
0,0040
0,030
Petržel
stopya
0,0047
0,0047
0,064
Červená řepa
0,0075
stopya
0,0075
0,017
kapusta
a
hodnota pod mezí stanovitelnosti
Tab. III. Nalezený obsah resveratrolu a kvercetinu ve vzorcích zeleniny (mg.g-1) (Kolouchová a kol., 2005)
20
Část
Resveratrol
Kvercetin
trans-
cis-
celkem
Jádro
0,0004
0,0020
0,0024
0,023
Vnější slupka
0,0079
0,0014
0,0092
0,11
Skořápka
0,012
0,0028
0,015
5,9
Tab. IV. Nalezený obsah resveratrolu a kvercetinu ve vzorcích burských oříšků (Kolouchová a kol.,2005)
Ovoce
Resveratrol trans-
cis-
Kvercetin celkem
a
Višeň obecná
0,0060
stopy
0,0060
0,0065
Maliník obecný
stopya
stopya
stopya
0,0044
Ostružiník
0,0008
stopya
0,0008
0,022
Aronie černá
0,031
0,0011
0,032
0,035
Jeřáb moravský
0,0009
stopya
0,0009
0,011
Borůvka černá
stopya
stopya
stopya
0,0096
Černý rybíz
0,015
0,0009
0,0016
0,012
Červený rybíz
0,0012
stopya
0,0012
0,0082
Angrešt
stopya
stopya
stopya
0,0035
a
– Hodnota pod mezí stanovitelnosti
Tab. V. Nalezený obsah resveratrolu a kvercetinu v ovoci (mg.g-1). (Kolouchová a kol., 2005)
3.3.7 Biosyntéza resveratrolu
Jak je uvedeno výše, koncentrace resveratrolu ve víně jako nápoji je cca 2 mg.l-1, tj. 2 g.m-3. I když jeho koncentrace je ve slupkách bobulí, zbytcích třapin a stoncích vyšší, jeho získání jako chemicky čistého individua je poměrně obtížné, neboť je doprovázen řadou dalších sloučenin obdobné struktury. Čistý resveratrol byl pro experimentální 21
účely získáván izolací z rostlinného materiálu, často z rdesna kadeřavého, Polygonum cuspidatum nebo z peruánského Cassia quinquangulata, kde z 1 kg drogy bylo získáno 30 mg resveratrolu. V současnosti se pro experimenty spíše používá resveratrolu získaného synteticky. Resveratrol jako antioxidant je citlivý na působení vzdušného kyslíku, takže izolace z přírodního materiálu je dosti pracná. Ostatně zásadní otázkou zůstává, proč resveratrol jako potravní doplněk z rostlinného materiálu izolovat, když je možno hrozny révy vinné nebo zeleninu konzumovat jako takové v čerstvém stavu nebo pít víno jako nápoj (Šmidrkal a kol., 2005) Fytoalexiny se obvykle studují tam, kde roste réva vinná a je následně rozvinuta výroba vína jako nápoje. Je tedy pochopitelné, že prvé novější syntetické studie pocházejí od španělských autorů z Barcelony, neboť Španělsko je země vína, stejně jako Francie a Itálie (Moreno-Maňas a Pleixats, 1985). HPLC (high performance liquid chromatography) je separační metoda, která slouží k rychlé separaci zpravidla nízkomolekulárních látek a nové přístupy umožňují využívat HPLC i k separaci malých proteinů. Z hlediska uspořádání se HPLC nejčastěji dělí na normální a reverzní fázi. Při využití normální fáze je jako stacionární fáze použita polární látka nejčastěji různé silikáty a jako mobilní fáze se uplatňuje nepolární rozpouštědlo, například hexan. Naproti tomu u reverzní fáze jsou ve stacionární fázi vázány nepolární alifatické zbytky (podle délky se potom označují jako C8, C18, atd.) jako mobilní fáze se využívají polární rozpouštědla. Pro zcela specifické účely se při HPLC požívají i iontoměničové kolony, kdy jako mobilní fáze slouží roztoky solí například NaCl. Volba uspořádaní záleží na typech sloučenin, které hodláme separovat. Při studiu rostlinného metabolismu využíváme dění pomocí normální fáze například pro stanovení MDA (malonyldialdehydu), což je ukazatel poškození buněk vyvolaného například aktivními formami kyslíku. Naproti tomu pro stanovení sekundárních metabolitů u rostlin, například fytoalexinů, je nejčastěji využívána reverzní fáze. Navíc při molekulárně-biologických experimentech se pro stanovení délkových fragmentů DNA používá iontoměničová HPLC (http://orion.sci.muni.cz). Lze říci, že totální syntéza resveratrolu není složitá, spíše je pracná a zdlouhavá a některé výchozí sloučeniny jsou obtížněji dostupné. To je také důvod proč cena komerčně nabízeného resveratrolu je velmi vysoká. 22
3.3.8 Praktické využití resveratrolu v současnosti
V současné době je nabídka preparátů obsahujících buď čistý resveratrol, nebo směs polyfenolů z vinných hroznů, velmi široká. Zpravidla jsou přípravky deklarovány jako potravinové fortifikační doplňky. Přípravky obsahují extrakt z jader hroznů, koncentrát bioflavonoidů a extrakt z červeného vína, který je uvedený jako resveratrol, ovšem bez uvedení skutečného obsahu této látky. Obecně jsou u přípravků uváděny antioxidační, antimutagenní a protizánětlivé účinky. Některé z nich jsou deklarovány jako antioxidanty s obsahem čistého resveratrolu. V každém případě je cena nabízených produktů nesrovnatelně vyšší v poměru s lahví kvalitního červeného vína, které má stejný obsah alkoholu a rovněž tak obsahuje účinnou látku - resveratrol. Vitamíny, po poznání jejich významu pro výživu, byly nejprve podávány v lékové formě jako doplňky k výživě a následně pak byly aplikovány v kosmetice. Stejně tak je tomu s resveratrolem. Jak je uvedeno výše, preparáty pro výživu s resveratrolem se prodávají v dostatečné míře (Pazourek a kol., 2001)
23
3.4 Francouzský paradox
Francouzským paradoxem označujeme skutečnost, že lidé žijící ve Francii trpí relativně nízkým výskytem akutních srdečních příhod a to navzdory nezdravému způsobu života. Tento fenomén poprvé odborně popsal irský lékař Samuel Black v roce 1819. V roce 1991 vystoupil profesor Serge Renaud v oblíbeném americkém televizním pořadu „Šedesát minut“, kde hovořil o zdravotních účincích v souvislosti s konzumací alkoholu, zejména však červeného vína. Mimo jiné uváděl, že mírná konzumace alkoholu snižuje výskyt srdečně cévních onemocnění až o 50 %. Zvýšenou pozornost tomuto sdělení pak dodal dopisovatel Morley Safer, který upozornil na skutečnost, že Francouzi snědí o 30 % tuku více než Američané, více kouří a méně cvičí, přesto trpí menším výskytem infarktů. Řekl: „Jestliže tedy jste průměrným Američanem středního věku, je u vás třikrát větší pravděpodobnost úmrtí na infarkt, než jakou má stejně starý Francouz. A tak je zřejmé, že Francouzi dělají něco správného, co Američané a jiné národy nedělají“. (Jones, 1998) Ve stejném roce pronesl na kongresu v australském Sydney osmaosmdesátiletý emeritní profesor Oxfordské univerzity Sir Richard Doll tato slova: „Soudím, že muži i ženy, kteří pravidelně pijí malé množství alkoholu, jsou méně náchylní k nemocím a mají menší úmrtnost na srdeční onemocnění a vůbec menší úmrtnost ze všech příčin než ti, kdo trvale abstinují.“ Jeho slova si netroufal nikdo zpochybnit, neboť právě tento muž, je váženou autoritou v oboru medicíny a mimo jiné nezvratně prokázal souvislost kouření a rakoviny plic (Šmidrkal a kol., 2001). Dosud ovšem neexistuje mezi lékaři shoda o tom, zda mírná spotřeba piva, vína, anebo destilátů má silnější vazbu k dlouhověkosti. Mnoho výzkumníků stále věří, že nejdůležitější přísadou je alkohol sám o sobě. Významnou příčinou úmrtí v USA jsou srdeční onemocnění a většina výzkumů udává, že mírná spotřeba alkoholu snižuje jejich zhoubnost o 40 až 60%. Výzkumem se zjistilo, že alkohol zlepšuje profil krevních lipidů, snižuje se výskyt trombózy, snižuje krevní tlak, zvyšuje proudění krve ve věnčitých tepnách a redukuje hladinu krevního inzulinu. Nicméně, příčiny francouzského paradoxu z lékařského hlediska nejsou ještě zcela jasné a stále existují pochybnosti.
24
3.5 Antioxidanty
Vědecké výzkumy a studie se intenzívně snaží zjistit, čím je alkohol, resp. víno, tak zvláštní, že vykazuje příznivé zdravotní účinky. Jaká látka ve víně způsobuje, že má víno žádoucí účinky pro předcházení kardiovaskulárním chorobám. Vědecké bádání v posledních několika letech prokázalo, že mnoho lidských nemocí, mezi něž patří rakovina nebo i samotný proces stárnutí, způsobují nebo podporují chemické látky, které nazýváme „volné radikály“. Částice volných radikálů napadají stěny zdravých buněk, čímž dochází k oxidaci. Ke zpomalení či potlačení nežádoucího oxidačního děje dochází za přítomnosti antioxidačních látek, antioxidantů. Oxidace je chemická reakce, při které dochází k přenosu elektronů z látky na oxidační činidlo. Ačkoliv tato reakce je velmi důležitá pro život, vytváří se při ní veškerá energie potřebná pro naše tělo, mohou se při ní produkovat volné radikály, které odstartují řetězové reakce poškozující buňky (Sies, 1997). K nežádoucí oxidaci dochází v organismu vlivem znečištěného vzduchu, vody, potravin, kouření, bifenylů a dalších karcinogenních látek, kterých je kolem nás mnoho. Proto je nutné látky s antioxidačními účinky přijímat stravou v přirozené formě, případně jejich obsah doplňovat potravinovými doplňky (Youngson, 1995).
3.5.1 Mechanismus účinku antioxidantů Mechanismus účinku antioxidantů spočívá přednostně v tom, že poskytují atomový vodík k reakci s peroxidovými nebo jinými radikály, které vznikají jako meziprodukty řady oxidačních procesů znehodnocující potraviny (Jordán V., 2001). Volný radikál antioxidantu je poměrně málo reaktivní a není schopen vyvolat další řetězovou reakci. Místo toho se deaktivuje buď spojením s dalším radikálem, nebo se disproporcuje na původní antioxidant a odpovídající chinon (Vodrážka, 2002). Je však třeba si uvědomit, že ne každý antioxidant dokáže odstranit každý volný radikál.
25
Rozeznáváme tři základní skupiny antioxidantů (Šípek, 2000): 1. Enzymové antioxidanty – superoxiddismutáza, glutationperoxidáza, kataláza atd. Superoxiddismutáza katalyzuje přeměnu superoxidu. Ten je přeměněn na peroxid vodíku a na následné odstranění je v těle více mechanismů, např. glutathionperoxidáza, která jej zredukuje. 2. Hydrofilní antioxidanty - vitamin C, kyselina močová, selen, bioflavonoidy atd. Tyto antioxidanty rozpustné ve vodě účinkují zejména v extracelulární tekutině. 3. Hydrofobní antioxidanty – vitamin E, ubichinon (koenzym Q 10), b-karoten. V tuku rozpustné antioxidanty pronikají buněčnou membránou a mohou tedy účinkovat intracelulárně. Nízké hladiny antioxidantů nebo inhibice antioxidačních enzymů mohou způsobit oxidační stres a mohou být příčinou poškození nebo smrti buňky. Oxidační stres, neboli převaha volných radikálů nad antioxidanty, hraje důležitou roli u mnoha lidských nemocí, použití antioxidantů ve farmakologii je proto intenzivně studováno (Sies, 1997). 3.5.2 Výskyt antioxidantů a faktory působící na jejich obsah
Antioxidační účinek byl prokázán například u tokoferolů, kyseliny L-askorbové, flavonoidních barviv derivátů kávové kyseliny, thiaminu, katalasy, pektinů a mnoho dalších (Hoza a Kramářová, 2006).
26
Antioxidant
Potravina
Vitamín A - karotenoidy
mrkev, dýně, brokolice, sladké brambory, rajčata, kapusta, broskve, meruňky citrusy (pomeranče a limetka), zelené papriky, brokolice, listová zelenina, jahody a rajčata ořechy a semena, celozrnné potraviny, listová zelenina ryby, červené maso, vejce, česnek, celozrnné potraviny sója, hroznové víno, granátová jablka, brusinky rajčata a výrobky z rajčat kapusta, brokolice, kiwi, špenát
Vitamín C
Vitamín E Selen Flavonoidy Lykopen Lutein Lignan
lněná semínka, ovesné vločky, ječmen, žito Tab. VI. Antioxidanty a jejich výskyt v potravinách (www.agronavigator.cz). Antioxidanty jsou obsaženy v potravinách v různých množstvích. Některé antioxidanty mohou být však zničeny dlouhodobým skladováním nebo varem, jako například lykopen (Šípek, 2000). Rovněž při zpracování a skladování karotenoidů dochází ke ztrátám, hlavní příčinou je oxidace nenasycených vazeb. Polyfenolické antioxidanty jsou naopak velmi stabilní, jsou obsaženy například v obilí a čaji a je jim přisuzován významný vliv na zdraví člověka. Fenolické kyseliny obsažené v cereáliích mají vysokou antioxidační aktivitu a to již v koncentracích, které získáme běžnou konzumací obilovin, a pravidelná konzumace čaje vede k významnému zvýšení antioxidační kapacity krve, která vypovídá o schopnosti bránit se působení volných radikálů (Odstrčil, 2006). 3.5.3 Využití antioxidantů Antioxidanty jsou hojně využívány jako doplňky stravy při prevenci takových nemocí jako rakovina a srdeční onemocnění. Kromě použití antioxidantů v lékařství mají tyto sloučeniny i řadu průmyslových využití. V potravinářském průmyslu se nejčastěji používají k ochraně tuků a jiných lipidů nebo látek povahy terpenů před autooxidací 27
(Odstrčil, 2006). Část potravin je na přírodní antioxidanty natolik bohatá, že je jimi nejen chráněna, ale může dokonce chránit ve směsích i potraviny, které vlastní antioxidanty postrádají. V řadě případů je však třeba obsah antioxidantů v potravinách zvyšovat jejich přídavkem. Antioxidanty izolované z přírodních materiálů však většinou nemají konstantní složení, jsou obvykle málo účinné a dosti drahé. Proto se potraviny častěji stabilizují antioxidanty syntetickými, z nichž se používají téměř výhradně fenoly (Vodrážka, 2002). Antioxidanty své uplatnění nacházejí také v kosmetickém průmyslu pro jejich schopnost zabránit předčasnému stárnutí, dále jako stabilizátory v palivech a mazadlech a jako látky zabraňující degradaci polymerů jako například gumy, plastů apod. (Youngson, 1995). 3.5.4 Doporučená denní dávka antioxidantů Lidský organismus je vybaven ochrannými antioxidačními systémy, které mohou reaktivní radikály pohlcovat nebo jejich tvorbu brzdit. Mezi tyto systémy patří antioxidační enzymy, pro jejichž tvorbu a funkci je zapotřebí dostatečné množství některých vitaminů, minerálů, stopových prvků a dalších látek s antioxidačními účinky, které systémy podporují. Tělo si vytváří vlastní antioxidanty, ale vitaminy, minerály a sloučeniny známé jako fotochemické látky (např. flavonoidy), které přijímáme potravou, jich poskytují víc. Velmi důležité je podávání antioxidantů jedincům oslabeným po nemoci, případně starším nebo nezdravě a jednostranně se stravujícím lidem, protože jejich organismus produkuje těchto látek méně. Podávání antioxidantů má své opodstatnění i v případě obyvatel velkoměst, sportovců a osob náchylných k nádorovému onemocnění. Dávkování jednotlivých antioxidantů je individuální a konzultace s lékařem je nezbytná. Dávkování preventivní je nižší, dávkování při nemoci nebo při nesprávné stravě je vyšší. Antioxidanty užívané dlouhodobě preventivně zabraňují dalšímu progresivnímu rozvoji aterosklerózy (Jordán, 2001).
28
3.5.5 Nové výzkumy vlivu antioxidantů na rychlost stárnutí Podstatou stárnutí je neschopnost bránit se oxidačnímu poškození a obnovovat pro život důležité makromolekuly neomezeně dlouho. Lidské tělo je schopné z vhodných prekurzorů vytvořit nebo opravit jakoukoliv svoji strukturu. Kdyby systémy antioxidační ochrany, odbourávání nepotřebných proteinů a opravy DNA byly zcela perfektní, byli bychom nesmrtelní. Tyto systémy však v sobě mají zakódovánu maximální (potenciální) délku našeho života (Pazourek J., 2001). V roce 1956 byla zveřejněna studie, která dokazovala vliv velkého množství volných radikálů v těle na stárnutí organismu. Proto byly antioxidanty začleněny do nejrůznějších krémů a přípravků, stejně jako do dietních pilulek a doplňků stravy. V posledních letech byly provedeny nové výzkumy, které zpochybňují tuto studii o volných radikálech. Například v Institutu Healthy Ageing na University College London (UCL) se prováděly pokusy na háďátku obecném (Caenorhabditis elegans). Jedná se o červa z kmene hlístic. Háďátko žije v půdě po celém světě a je významným modelovým organismem a nástrojem molekulární a vývojové biologie. Hlístice dostaly velké množství volných radikálů, což podle starší teorie mělo zkrátit jejich život. Místo toho však žily stejně dlouho jako běžné hlístice. To dovedlo vědce k závěru, že působení volných radikálů nemusí být hlavní příčinou stárnutí (www.agronavigator.cz). 3.5.6 Antioxidanty ve víně Zájem o sledování výskytu antioxidantů ve víně byl podmíněn právě existencí tzv. „francouzského paradoxu“. Konzumace vína byla totiž jedním z faktorů, kterým bylo možno vysvětlit nízkou úmrtnost na onemocnění kardiovaskulárními chorobami. Tato skutečnost vedla k domněnce, že požívání vína může působit proti účinkům diety s vysokým obsahem tuků, a omezit tak možnost vzniku a rozsah onemocnění věnčitých tepen a zároveň preventivně působit proti stárnutí.
29
3.6 Volné radikály
V organismu běžně vzniká řada reaktivních forem kyslíku a reaktivních forem dusíku. Tyto látky mají značný fyziologický i patogenní význam, proto se staly předmětem intenzivního lékařského výzkumu a vědomosti o nich se postupně uplatňují v lékařské praxi. Jedná se o látky, které mohou být produkovány s cílem zabezpečit určité biologické funkce, jako je například funkce mikrobicidní ve fagocytech, jsou významnými prostředníky přenosu energie a signálními molekulami buněčné regulace, za určitých okolností však působí jako toxické látky, které jsou schopné organismus poškodit (Šípek, 2000). Nejdůležitější reaktivní formy kyslíku a dusíku jsou uvedeny v tabulce 1. Pouze některé z níže popsaných reaktivních forem kyslíku nebo dusíku patří mezi volné radikály, tedy látky s nepárovým elektronem (Youngson, 1995).
3.6.1 Vznik volných radikálů Volné radikály vznikají z molekul trojím způsobem: 1. homolytickým štěpením kovalentní (dvouelektronové) chemické vazby, kdy každý fragment získá jeden nepárový elektron. K homolytickému štěpení je zapotřebí velké množství energie, získané například vysokou teplotou, ultrafialovým nebo ionizujícím zářením. 2. redukcí - přidáním jednoho elektronu k molekule. 3. oxidací - naopak ztrátou jednoho elektronu. V biologických systémech volné radikály vznikají energeticky snadnějším způsobem – odejmutím nebo přijetím elektronu. Radikály mohou být neutrální částice nebo záporně či kladně nabité ionty. To záleží na tom, zda počet protonů v atomových jádrech radikálu odpovídá počtu elektronů v orbitalech, či nikoli. Vzorce, příp. symboly radikálů se vždy označují tečkou, indikující nepárový elektron, a jsou-li popisované částice zároveň ionty, je vzorec doplněn podle počtu a typu náboje symboly plus nebo minus (Šípek, 2000).
30
3.6.2 Funkce volných radikálů Volné radikály plní v našem organismu řadu důležitých fyziologických funkcí. Bez radikálových reakcí by se dnešní formy života nevyvinuly, neboť tak velké množství energie, jaké je třeba k jejich výstavbě a funkcím, lze za daných podmínek uvolnit pouze přenosem elektronů ze živin na kyslík. Reaktivní formy kyslíku jsou rovněž součástí enzymových mechanismů a některé z nich jsou významnými signálními molekulami v buněčném informačním systému (Šípek, 2000). Volné radikály jsou tedy běžné produkty aerobního metabolismu, ale vlivem patofyziologických podmínek mohou být tvořeny ve zvýšené míře (Sies, 1997). Tvoří-li se v nadměrném množství nebo nejsou-li dostatečně rychle likvidovány, stávají se pro svou reaktivitu nebezpečné, narušují buněčné membrány a mohou být příčinou rozvoje závažných patologických projevů (Youngson, 1995; Jordán, 2001). Dochází tak k urychlení procesu degenerace a stárnutí buněk, narušení přirozené obranyschopnosti organismu, případně poškození genetického vybavení buňky, a tím k poruchám mnohdy vedoucím k nastartování velmi složitého a doposud intenzivně vědecky zkoumaného procesu nádorového zvratu v buňce. Rozmnoží-li se takto změněné buňky v důsledku nemoci, stárnutí nebo nadměrného působení slunečního záření, způsobí velké škody na funkci orgánů a zdraví organismu (Jordán, 2001). 3.6.3 Nemoci způsobené oxidací volnými radikály Oxidační stres byl implikován v patogenezi valné většiny, ne-li všech lidských chorob. I když se přidržíme mírné skepse doporučované vedoucími autoritami na poli biologie a medicíny kyslíkových radikálů, stále to znamená, že reaktivní formy kyslíku hrají významnou úlohu v rozvoji tak závažných a rozšířených onemocnění, jako je ateroskleróza, diabetes mellitus, hypertenze, chronické střevní záněty, některé typy rakoviny, ischemicko-reperfuzní poškození srdce a jiných orgánů, mozkové trauma/ischemie, Parkinsonova nemoc, Alzheimerova nemoc atd. I podstatou fyziologického stárnutí zřejmě není nic jiného než akumulace malých chyb systémů antioxidační ochrany a údržby tělesných struktur (www.solen.cz).
31
Oxidace cholesterolových částic v krvi může způsobit ukládání oxidovaných tukových látek ve stěnách tepen, což může postupně vést k srdečnímu infarktu a cévní mozkové příhodě. Jestliže volné radikály oxidují DNA v buněčném jádru, vyvolávají buněčné mutace, které mohou být počátkem rakoviny (Jordán, 2001).
32
3.7 HISTORIE LÉČITELSTVÍ VÍNEM
Léčivá a nutriční hodnota révy vinné byla známa už před tisíciletími. Egypťané konzumovali révu vinnou už před šesti tisíci lety, před více než třemi tisíci lety znali víno a staré egyptské recepty dokazují, že ho používali k léčení. Souběžně s egyptskou kulturou vína se vyvíjela kultura Sumerů a Babylóňanů. O Sýrii je známo, že se v zemi pilo více vína než vody. Mnoho starověkých řeckých filozofů velebilo léčivou sílu vína. Na řeckém ostrově Kos vznikla první lékařská škola, kde se doporučovala léčba vínem. Homér doporučoval víno používat k dezinfekci ran, Hippokrates nabízel některé druhy vín jako diuretikum a na snížení tělesné teploty. Odkazy o léčivých účincích a duševním opojení z vína lze dohledat v Bibli. Réva vinná a víno je zde zmiňováno častěji než jiné kulturní plodiny. Víno představovalo v dávné historii životní mízu přírody a symbolické spojení mezi vínem a krví přetrvává v křesťanství dodnes. Naši předkové se mírnou konzumací vína chránili před střevními onemocněními, víno užívali při nachlazení, na tišení bolesti, také jako dezinfekční prostředek na vnější rány. Víno pro osvěžení ředili vodou, k léčebným účinkům do něj přidávali byliny, koření, živočišné výměšky, med a jiné příměsi. Evropští lidoví léčitelé vyvíjeli z hroznové šťávy mastičky na odstraňování kožních nemocí. Listy révy vinné se užívaly k zástavě krvácení, na kožní záněty a bolesti vyvolané hemeroidy. Nezralé hrozny byly používány k léčení bolesti v krku a sušené hrozny, známé jako hrozinky, na vyléčení nechutenství a proti zácpě. Sladká vína se používala k léčení řady nemocí jako neštovice, cholera, rakovina, oční infekce, nemoci jater a ledvin. První lékařská kniha o víně napsaná francouzským lékařem pochází z počátku patnáctého století. Do konce osmnáctého století bylo víno díky obsahu kyselin a alkoholu, které potlačují a ničí škodlivé bakterie v těle, doporučováno jako bezpečnější nápoj než voda. Víno hrálo v léčitelství důležitou roli až do konce devatenáctého století a bylo oficiálně užíváno jako lék. Vývojem syntetických léčiv a negativními účinky vyšších dávek alkoholu, které vedou až k rozpadu osobnosti, se víno v medicíně přestalo používat (www.vinoazdravi.cz). Vědecké studie z roku 1940 prokázaly, že víno obsahuje vitamíny B komplexu a C, také řadu minerálních látek potřebných pro lidský život. O více než třicet let později se objevily první hypotézy o vlivu vína na kardiovaskulární systém. V roce 1978 dr. A. 33
Selwyn St. Leger, pracující v epidemiologické stanici Výzkumné lékařské rady, dovedl ke zdárnému konci hledání příčin ischemické choroby srdeční. Jak už to u významných objevů bývá, pomohla k výsledku i náhoda. St. Leger a jeho dva kolegové porovnávali úmrtnost na ischemickou chorobu srdeční v 18 zemích světa, a to včetně Kanady, USA, Irska, Francie, Itálie a Austrálie. Porovnávali různé statistické údaje, jako např. množství nasycených tuků v potravě až po dostupnost lékařské péče. Zpočátku rozsáhlá práce nevedla k zjištění příčin statistických rozdílů úmrtnosti. Dostupnost lékařské péče, celková konzumace nasycených tuků, kouření ani další faktory se nevymykaly předpokladům. Dokonce i konzumace alkoholu, která patřila mezi hlavní ochranné prvky proti zmíněným nemocem, prokázala již tehdy známý fakt, že mírní konzumenti alkoholu jsou lépe ochráněni před ischemickou chorobou srdeční. Nakonec pomohla náhoda. „Prostě se to povedlo,“ říká St. Leger. „Čistě náhodou jsme měli možnost získat informace o konzumaci alkoholu v jednotlivých zemích, dokonce rozdělené na konzumaci piva, vína a destilátů. Kolektiv vedený tímto mladým vědcem s překvapením zjistil, že víno má zdaleka nejlepší účinky. Bylo zjištěno, že v zemích kde je naprosto obvyklá konzumace vína, dosahovala úmrtnost na ischemickou chorobu srdeční, podstatně nižších hodnot, než v zemích kde víno takovou tradici nemělo. Mezi tyto země se zařadily Francie, Itálie, Španělsko, Rakousko a také západní část Německa. Tento poznatek, zveřejněný v roce 1979, byl nejzajímavějším výsledkem, který v souvislosti s konzumací alkoholu stál za zmínku. Po zveřejnění výsledku St. Leger prohlásil: „Jestliže má víno ochranné účinky proti úmrtí na koronární nemoci, pak na základě výsledků našeho výzkumu vyplývá, že pravděpodobně tyto účinky bude způsobovat jiná složka než alkohol. Víno je bohaté na aromatické přísady a další stopové látky, které je odlišují od ostatních alkoholických nápojů. Proto bychom své zkoumání měli napříště zaměřit na tyto látky, jestliže se chceme dopátrat původu léčivých vlastností vína“ ( Jones, 1998). V osmdesátých letech byla tato domněnka potvrzena testy na králících, které provedli vědci Wistarova ústavu anatomie a biologie ve Filadelfii, David Klurfeld a David Kritchevsky. Smyslem jejich práce bylo porovnat účinky vína, piva a tvrdého alkoholu při ochraně před aterosklerózou. V průběhu tříměsíčního výzkumu krmili králíky stravou s vysokým podílem tuků a přídavkem cholesterolových tablet. Králíci o celkovém počtu 48 byli rozděleni do šesti skupin. První – kontrolní skupina - dostávala k pití pouze vodu, dalším skupinám pak byl přidělován čistý líh, červené víno, bílé víno,
34
pivo a poslední skupina králíků dostávala whisky. Po třech měsících byla u králíků provedena pitva a zjištěno, že králíci v kontrolní skupině, a ti kteří dostávali pít pivo měli v srdečních cévách stejné tukové léze, králíci pijící whisky dosáhli stejného výsledku z 83 %, u králíků, kteří dostávali čistý líh, byla ateroskleróza ze 75 %, u bílého vína byla hodnota 67 % a u červeného vína pouze 40 %. Výsledek, tedy že u červeného vína se nejméně vyskytovala ateroskleróza, tak potvrdil předchozí výzkum. Krátce poté byla celému světu předložena studie Světovou zdravotnickou organizací (WHO) o pozitivním vlivu vína na vznik koronárních onemocnění. Za vším stála desetiletá studie, která měla za cíl odstranit pochybnosti, které vyvstávaly ohledně mezinárodního srovnávání v boji se srdečně cévními onemocněními. Tato studie se jmenovala Monika. Do studie bylo zapojeno 41 měst či regionů celého světa, většinou z Evropy. Od počátku roku 1985 se v nich pečlivě evidovaly smrtelné a přežité infarkty. Statistiky byly vedeny srovnatelným způsobem, aby mohlo být dosaženo validního porovnání. Ve studii figurovala města jako: Halifax v Kanadě, Stanford v Kalifornii, Glasgow a Belfast z Velké Británie, Newcastle a Perth z Austrálie, Auckland z Nového Zélandu a konečně Lille, Štrasburk a Toulouse z Francie. Když po skončení studie představil výzkumný tým vedený dr. Hughem TunstallPedoem z univerzity v Dundee, rozdíly byly ohromující. Například ženy z Glasgowa byly více než osmkrát ohroženy smrtí na infarkt než ženy ze Španělského Katalánska. S největší netrpělivostí se ovšem očekávali výsledky francouzských měst. Ve srovnání jednotlivých životních stylů a stravovacích návyků se totiž předpokládalo, že země jako Itálie nebo Španělsko, známe svou nízkotučnou středomořskou stravou, obstojí velmi dobře a Francie se svými paštičkami, tučnými sýry a omáčkami, neměla mít příliš velkou naději. Výsledky však prokázaly, že v Lille a Štrasburku činil u mužů počet infarktů 314, ve druhém případě 336 infarktů na 100 000 obyvatel. Toulouse mělo výsledky ještě lepší, pouhých 240 infarktů. Katalánsko evidovalo 187 případů, severoitalské Friuli 270, švýcarský Fribourg měl výskyt 253 infarktů. Pokud tedy bylo dosaženo těchto výsledků v souvislosti s konzumací vína, pak byly překonány i nedostatky francouzské kuchyně a životního stylu tamějších obyvatel. Monika splnila své poslání, francouzský paradox byl prokázán. Teď stál před vědci další významný úkol, přijít na to co přesně způsobuje, že lidé ve středomoří, a obzvláště v jižní části Francie, mají takovou výhodu před ostatními, jsou zdravější a dožívají se vyššího věku. ( Jones, 1998) 35
3.8 Falšování vědeckých experimentů
V souvislosti s výzkumy příznivých účinků vína resp. látek v něm obsažených se objevil i případ falšování vědeckých experimentů, který staví význam antioxidantů a resveratrolu zvlášť do nepříznivého světla. Jde o to, že profesor Connecticutské univerzity Dipak K. Das, ředitel Střediska kardiovaskulárního výzkumu, zfalšoval výsledky 145 experimentů, které byly zveřejněny v 11 renomovaných vědeckých časopisech. Tuto zprávu vydala v lednu 2012 Connecticutská univerzita. Profesor Das se zabýval především výzkumem vlivu resveratrolu, obsaženého v červeném víně, na srdeční choroby. V jeho záznamech byla nalezena celá řada nesrovnalostí a chyb. Má se za to, že účelem takto úmyslně falšovaných dat bylo oklamání odborné veřejnosti a podpora některých konkrétních firem produkujících resveratrol a jiné antioxidativní prostředky. Za celou dobu zkoumání resveratrolu bylo provedeno mnoho studií, které hodnotí antioxidanty a mezi nimi zvláště resveratrol, jako látky prospěšné zdraví, že není možné je zpochybnit tím, že malá část výzkumu neproběhla regulérně (Novák, 2012).
36
4. ZÁVĚR
Výzkum biologických účinků resveratrolu a dalších antioxidantů jsou předmětem studií a výzkumu zejména po tom co se objevil jev zvaný Francouzský paradox. O tomto paradoxu se začalo hovořit především v souvislosti s relativně nízkým počtem srdečních infarktů u obyvatel Francie. Tedy těch obyvatel, kteří obývají oblasti s významnou spotřebou červeného vína. Paradoxní je ta skutečnost, že tato část obyvatel není jinak vzorem pro svou životosprávu. Jedí jídla s vysokým podílem tuků, kouří, příliš nesportují a vůbec i z jiných ohledů nic nenasvědčuje tomu, že by měli být výjimkou, co se srdečních chorob týká. Vědci zkoumající zmíněný jev se postupně utvrdili v tom, že jedním z rozdílů od obyvatel jiných zemí je konzumace vína, tedy spíše červeného vína. Další výzkumy tedy byly zaměřeny do oblasti vína a jeho látkového složení. Výsledkem bylo objevení resveratrolu. Zázračné působení resveratrolu má být založeno na jeho antioxidačních vlastnostech, tedy na zamezování účinku tzv. volných radikálů, jež poškozují buňky. Má spouštět procesy, které chrání genetickou informaci buněk. Konzumace potravin obsahujících resveratrol (tedy ovoce a zeleniny) je zcela jistě zdraví prospěšná, jako ostatně byla i předtím, než bylo zjištěno, že obsahuje resveratrol. Určitým pokrokem nepochybně je, že na základě výsledků řady studií se ukázalo pití vína v rozumném množství spíše zdravé než škodlivé. Méně se už mezi běžnými konzumenty vína ví, že resveratrol je přírodně se vyskytující fytoalexin produkovaný některými rostlinami klasifikovanými jako spermatofyty je odpověď na biotický a abiotický stres, např. napadení rostliny patogeny, UV záření, expozice ozónem nebo mechanické poškození. Přípravky obsahující resveratrol byly využívány odedávna v japonské lidové medicíně k léčbě opařenin a spálenin, zánětlivých onemocnění, poruch metabolismu tuků a pro celou řadu dalších terapeutických zákroků. Je prokázáno, že jedním z nejbohatších zdrojů je plevelná rostlina Polygonum cuspidatum, která běžně roste na území Asie, a právě extrakty kořenů této rostliny jsou podstatnou složkou pro orientální medicínu. Resveratrol
má
rovněž
chemopreventivní
účinky,
které
souvisí
s inhibicí
hydroperoxidasy a cyklooxygenasy, jejichž aktivita je spojována s inicializací nádorového bujení a také se snižováním hladiny cholesterolu v krvi.
37
Resveratrol hraje velmi významnou roli jako prevence mnoha lidských chorob a lze předpokládat, že zdravotní účinky této látky budou i nadále v hledáčku odborníků celého světa. Resveratrol jistě neřekl poslední slovo ke svému vlivu na lidské zdraví a zpomalení stárnutí buněk.
38
5. ABSTRAKT Bakalářská práce se zabývá významem nejznámější fenolické látky resveratrolu jako biologicky aktivní látky v rostlině, která rovněž pohlcuje volné radikály a má výrazné antioxidační účinky. Resveratrol je zmiňován v souvislosti s příznivými účinky na lidské zdraví. V bakalářské práci je popsán výskyt, význam a využití antioxidantů. Část bakalářské práce popisuje jev známý jako Francouzský paradox, který se stal základem pro zkoumání příčin sníženého počtu kardiovaskulárních chorob. Dále je zde zmíněna historie léčitelství vínem a také pokus o falšování výzkumů, které měly prokázat pozitivní zdravotní účinky obzvláště u červených vín. Klíčová slova: Fenolické látky, resveratrol, antioxidanty, volné radikály,
6. ABSTRACT This bachelor thesis deals with the importance of resveratrol, a natural phenolic compound which acts as a biologically active substance in plants, and at the same time absorbs free radicals. In addition, it also has strong antioxidant effects. Resveratrol is discussed in connection with its beneficial impact on human health. The aim of this thesis is to describes the occurrence, importance and use of antioxidants. Part of the bachelor thesis describe the occurance, signifikance and use of antioxidants. One part of the thesis focuses on a phenomenon known as The French paradox, which serves as the basis for research into the causes of reduced number of cardiovascular diseases. The thesis also give an account of The History of wine treatment as new as of an attempted falsification of research data which were supposed to prove the positive health effects of red wines in particular. Keywords: Phenolic compounds, resveratrol, antioxidants, free radicals
39
7. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
1.
Amaya, R.: Food carotenoids: analysis, composition and alterations during storage and processing of fous, p. 35-37, 2003
2.
Barlass, M., Miller, R. M., Douglas, T. J.: Development of methods for screening grapevines for resistence to infection by Downy mildew. II. Resveratrol production. Am. J. Enol. Viticult, p. 65-68, 1987
3.
Beňová, B., Marcaníková, K.: Využití coulometrického detektoru pro analýzu fenolických látek. Chem. Listy 104, s. 27-30, 2010
4.
Hoza, I., Kramářová, D.: Potravinářská biochemie II., 1. vyd. Zlín: UTB, 2006, ISBN 80-7318-395-1
5.
Johnson, H.: Pocket Wine Guide. Mitchel Beazley, London 1997
6.
Jones, F.: Víno Každý den sklenku vína pro zdraví, Knižní klub v Praze 1998, 240 s. ISBN 80-7176-756-5
7.
Jordán,V., Hemzalová, M.: Antioxidanty zázračné zbraně, 1 vyd. Brno, nakladatelství Jota, 2001, 153 s. ISBN 80-7217-156-9
8.
Kennedy, J. A., Saucier,C., Glories, Y.: Grape and Wine phenolics: History and perspective. American Journal of Enology and Viticulture, 57: p. 239-248, 2006.
9.
Kolouchová, I., Melzoch, K., Šmidrkal, J., Filip, V.: Laboratorní přístroje a postupy. Obsah resveratrolu v zelenině a ovoci. Chem. Listy 99, s. 492-495, 2005.
10. Kraus, V., Kuttelvašer, Z., Vurm, B.: Encyklopedie českého a moravského vína, Praha, Melantrich 1997, ISBN 80-7023-250-1 11. Moreno-Maňas, M., Pleixats, R.: An. Quim, Ser. C 81, 1991 12. Novák, J. A.: Trpká chuť zázračného vína. Magazín Víkend příloha Hospodářských novin, č.7/17.února 2012. Praha, Europrint a.s. Dostupné na: http://life.ihned.cz/c1-54762800-trpka-chut-zazracneho-vina 13. Odstrčil, J., Odstrčilová, M.: Chemie potravin, 1. vyd., Brno: Mikadapress s.r.o, 2006, 164 s. ISBN 80-7013-435-6 14. Pavloušek, P.: Pěstování révy vinné. Moderní vinohradnictví. Vyd. V Praze: Grada Publishing, a.s., 2011, 336 s. ISBN 978-80-247-3314-2 15. Pláteník, J.: Volné radikály, antioxidanty a stárnutí, Interní Med. 2009; 11(1): s. 30-33. Dostupné na: http://www.solen.cz/pdfs/int/2009/01/06.pdf 40
16. RIBÉREAU-GAYON, P.: Recherses sur les antocyannes des vegetaux. Application au genre vitis. Libraire general de l ´enseignement. Paris, 1959. 17. Robinson, J.: Vines, grapes and Wines, London 1994 18. Sies, H.:Oxidative stress: Oxidants and antioxidants, p. 291 – 295, 1997 19. Slanina, J., Táborská E.: Příjem, biologická dostupnost a metabolismus rostlinných polyfenolů u člověka. Chem. Listy 1998, s. 239-245, 2004. Dostupné na: http://www.chemicke-listy.cz/docs/full/2004_05_02.pdf 20. Soleas, G. J., Diamandis, E. P., Goldberg, D. M.: Clin. Biochem. 30, 1997 21. Šamánek, M., Urbanová, Z.: Víno na zdraví, Agentura Lucie, spol. s r.o., 2010, 169 s., ISBN 978-80-87138-17-5 22. Šípek, S. a kol.: Antioxidanty a volné radikály ve zdraví a v nemoci, 1 vyd. Praha 7: Grada Publishing, spol. s.r.o., 2000. 320 s. ISBN 80-7169-704-4 23. Škeříková, V., Grynová, L., Jandera, P.: Využití coulometrického detektoru Coularray pro analýzu přírodních antioxidantů. Chem. Listy 98, 343 -348, 2004. Dostupné na : http://www.chemicke-listy.cz/docs/full/2004_06_05.pdf 24. Šmidrkal, J., Filip, V., Melzoch, K., Hanzlíková, I., Buckiová, D., Křísa, B.: Resveratrol. Chem. Listy 95, 602-609, 2001 25. Velíšek, J.: Chemie potravin 3.,Ossis, Tábor 2002, 331 s., ISBN 80-86659-17-8 26. Víno a zdraví, historie léčitelství vínem. 2003 – 2004 [cit. 2011-11-25]. Dostupné na: http://www.vinoazdravi.cz/index.php?soubor=historie 27. Víno a zdraví, látkové složení vína. 2003–2004 [cit. 2011-11-25]. Dostupné na: http:// www.vinoazdravi.cz/index.php?soubor=latkove_slozeni_vina
28. Vodrážka, Z.: Biochemie. 2 vyd. Praha 2: Academia, 2002. 191 s. SBN 80-2000600-1 29. Využití HPLC při stanovení rostlinných metabolitů, pdf dokument [cit. 2011-1023]. Dostupné na: http://orion.sci.muni.cz/virtuallab/dokumenty/pdf/HPLC.pdf 30. Youngson, R. M.: Antioxidanty cesta ke zdraví,1. vyd. Brno, nakladatelství JOTA, 1995. 144 s. ISBN 80-85617-56-0
41
ERRATA: Čapka Miroslav - Resveratrol a jeho význam 4. MATERIÁL A METODY 4.1 Popis vzorků Byla provedena analýza 4 vzorků, jednalo se o vína – červená (Zweigeltrebe a Cabernet Moravia) a bílá (Malverina, Hibernal), ročník 2010. Vzorky pocházely z Lednice.
Zweigeltrebe: modrá moštová odrůda rakouského původu, vyšlechtěná v Klosterneuburgu. V současnosti je v Rakousku jednou z nejrozšířenějších modrých odrůd. Byla vyšlechtěna z křížení odrůd Svatovavřinecké a Frankovka. Poskytuje pravidelné a vysoké úrody i v druhořadé trati, při nižším zatížení keřů a ve špičkové poloze může dosahovat vysokých vyzrálostí. Středně temně červené víno granátové barvy je podobné oběma rodičovským odrůdám, v prvním roce je hrubší a drsné, zraje pomaleji, vyzrálé je ovšem velmi jemné, harmonicky pevné, odrůdově typické. Výborně se hodí ke scelování s ostatními červenými víny. Do Státní odrůdové knihy byla odrůda zapsána v roce 1980. Cabernet Moravia: modrá moštová odrůda kabernetového typu, odrůdu vyšlechtil Lubomír Glos v Moravské Nové Vsi křížením odrůd Cabernet Blanc a Zweigeltrebe. Odrůda má bujný růst, velké listy tmavé barvy a střední až velké, středně husté hrozny. Bobule je středně velká, kulatá, má pevnou a plísni šedé odolávající, modročernou slupku. Bobule mají kabernetovou vůni a velmi příjemnou chuť. Zrání je velmi pozdní. Plodnost je výborná a pravidelná. Patří do nejteplejších poloh a oblastí. K výrobě vysoce kvalitních vín je nutné regulovat sklizně. Vína mají tmavě granátovou barvu, jemně kabernetové tóny ve vůni i v chuti. Po odbourání kyseliny jablečné je víno velmi plné, hebké a s dobře strukturovanými tříslovinami a s dlouhou perzistencí. Je-li technologie výroby dobře zvládnutá, patří Cabernet Moravia ke špičkovým moravským červeným vínům. Odrůda byla zapsána do Státní odrůdové knihy v roce 2011. Hibernal: bílá moštová interspecifická odrůda,vzniklá mezidruhovým křížením odrůd Seibel 7053 a Ryzlink rýnský. Vyšlechtěna v Geisenheimu (SRN) prof. Helmutem Beckerem. Sklizňové zralosti dosahuje cca. 1 – 2 týdny před Ryzlinkem rýnským v první polovině října. Hrozen je středně velký, středně dlouhá stopka, bobule menší až střední, kulaté. Víno je charakteru Ryzlinku rýnského, jemné sauvignonové tóny, příjemné kyseliny. Odrůda vhodná pro výrobu biovín a k barikování. Charakterové chuťové vlastnosti – zralá broskev, kořenité tóny. Do Státní odrůdové knihy byla zapsaná v r. 2004. Malverina: bílá moštová interspecifická odrůda pochází z moravského křížení odrůd Rakiš (Villard blanc a Veltlínské červené rané) a Merlan (Merlot a Seibel 13 666). Vyšlechtěna ve Vinselektu Perná M. Michlovským, F. Mádlem, V. Krausem, L. Glosem a V. Peřinou. Patří k prvním a nejrozšířenějším interspecifickým odrůdám, tedy 42
takovým, které mají zvýšenou toleranci k houbovým chorobám. Díky tomu bývá hojně využívaná v bioprodukci. Odrůda prospívá v dobrých polohách a na hlinité výživné půdě. Poskytuje vysoké a pravidelné výnosy s pěknými cukernatostmi. Víno je lehké, mírně aromatické, v chuti se projevuje plné a harmonické, s typickými tóny kouřovinky, skořice či chlebové kůrky. Do Státní odrůdové knihy byla zapsána v roce 2001.
4.2 Použité metody
HPLC – Vysoceúčinná kapalinová chromatografie Pro stanovení fenolických látek bylo použito metody kapalinové chromatografie, bylo postupováno podle níže uvedeného postupu. Vzorky byly měřeny v laboratoři Ústavu vinohradnictví a vinařství na Zahradnické fakultě Mendelovy univerzity. Koncentrace jednotlivých fenolických látek byla stanovena metodou s přímým nástřikem vzorku. Vína byla odstředěna (3000 x g; 6 min). Bílá vína byla 2x zředěna 50 mM HClO4, červená vína byla 4x zředěna 30 mM HClO4. Instrumentace: Binární vysokotlaký systém Shimadzu LC-10A Systém controler: SCL-10Avp 2 pumpy: LC-10ADvp Kolonový termostat s manuálním nástřikovým ventilem Rheodyne: CTO-10ACvp DAD detektor: SPD-M10Avp Software: LCsolution
Podmínky separace: Kolona: Alltech Alltima C18 3 μm; 3 x 150mm + předkolona 3 x 7.5mm Teplota separace: 60°C Objem nástřiku vzorku: 20ul Průtok mobilní fáze: 0.6 ml/min Mobilní fáze A: 15 mM HClO4 Mobilní fáze B: 15 mM HClO4, 10 % MeOH, 50 % ACN
43
Gradientový program: 0,00 min
2%B
20,00 min
26% B
30,00 min
45% B
35,00 min
70% B
37,00 min
100% B
38,00 min
100% B
38,01 min
0% B
39,99 min
0% B
40,00 min
2% B
45,00 min
2% B
Celková doba mezi dvěma vzorky 45 minut. Data v rozmezí 200-520 nm byla zaznamenávána 41 minut. Stanovení jednotlivých složek na základě kalibračních křivek standardů: 200nm : katechin; epikatechin 260nm : kys. vanilová; kys. protokatechuová; kys. 4-hydroxybenzoová 280nm: kys. gallová; kys. syringová; cis-piceid; cis-resveratrol 310nm: kys. p-kumarová a její deriváty; trans-piceid; trans-resveratrol 325nm: kys. kávová a její deriváty; kys. ferulová a její deriváty; piceatannol 360nm: rutin; myricetin; quercetin; kaemferol; isorhamnetin 520nm: anthokyany Deriváty hydroxyskořicové kyseliny byly kalibrovány jako základní kyseliny, od kterých jsou odvozeny. Anthokyany byly kalibrovány na malvidin-3,5-diglukosid.
44
5. VÝSLEDKY V srpnu roku 2011 proběhlo analytické stanovení vybraných látek metodou kapalinové chromatografie. Získané hodnoty jsou uvedeny v tabulce č.VII
Tab. VII. Hodnoty obsahu stilbenů ve vzorcích červených a bílých vín Stilbeny mg.l-1 Odrůda
Ročník
trans-resveratrol
cis-resveratrol
trans-piceid
cis-piceid
ZW
2010
1,05
1,92
0,04
0,28
CM
2010
1,82
2,98
0,12
0,52
HIB
2010
1,24
1,39
0,29
1,83
MAL
2010
0,26
0,41
0,19
1,36
Nejvyšší obsah trans-resveratrolu byl naměřen u modré odrůdy Cabernet Moravia, celkově modré odrůdy vykazovaly vyšší obsah trans a cis-resveratrolu oproti odrůdám bílým. Naopak obsah piceidů byl vyšší u odrůd bílých.
Stilbeny mg.1-1 3,5 3 2,5 ZW
2
CM 1,5
HIB
1
MAL
0,5 0 trans-resveratrol
cis-resveratrol
trans-piecid
Graf č.1 Obsah hlavních stilbenů v analyzovaných vzorcích
45
cis-piecid
Při grafickém porovnání zjištěných hodnot obsahu resveratrolu u vybraných červených a bílých vín vykazuje Cabernet Moravia (CM) výrazně vyšší hodnoty jak transresveratrolu, tak i cis-resveratrolu. Je zajímavé, že při porovnání odrůd Zweigeltrebe (ZW) a Hibernal (HIB) je hodnota trans-resveratrolu srovnatelná a bílé víno má dokonce o 19 mg.l-1 vyšší obsah této látky, naopak u cis-resveratrolu jsou hodnoty vyšší ve prospěch červeného vína a ZW má o 0,53 mg.l-1 vyšší hodnotu. Vyhodnocením trans-piecidů zjišťujeme, že u obou bílých vín jsou hodnoty vyšší a stejně tak i cispiecidů vychází bílé odrůdy podstatně lépe.
DISKUSE Výsledné hodnoty stilbenů v bílých odrůdách se shodují s prací Křivdové (2009), která analyzovala fenolické látky u vzorků ekologické a konvenční produkce. Práce se zabývala odrůdami Hibernal, Malverina a Laurot rovněž z oblasti Lednice. Naměřené výsledky se ztotožňují s výzkumem Pervaiz (2003), který nalezl resveratrol v bílých, červených i rosé vínech, ale nejvyšší množství resveratrolu bylo naměřeno ve vínech červených. Alonso (2002) upozorňuje na fakt, že hodnoty resveratrolu ve vínech mohou být ovlivněny jak použitou technologií zpracování, tak i zdravotním stavem použitých hroznů. Bohužel, vína analyzovaná v této práci nelze po této stránce korektně zhodnotit, neboť není známa přesná technologie ani zdravotní stav hroznů. Ze studie Stervbo et al, (2007) vyplývá, že průměrný obsah trans-resveratrolu v červených vínech je 1,9± 1,7 mg.l-1. Podobných hodnot při svém výzkumu dosáhl i Plocr (2010). Červená vína analyzovaná v této práci obsahují hodnoty trans-resveratrolu ztotožňující se s výše uvedeným rozpětím hodnot. Alonso, A.,M., Dominguez C., Guillen, D.A. Barroso, C.G: Determination of antioxidant power of red and white wines by a new electrochemical method and its correlation with polyphenolic content. Journal of agricultural and Food Chemistry, 50 (11), 2002, pg 3112-3115. Křivdová K. Vliv chemické ochrany interspecifických odrůd révy vinné na obsah zdraví prospěšných látek. Diplomová práce, Zahradnická fakulta Mendelovy univerzity, Lednice, 2009. Vedoucí práce. Ing. Michal Kumšta. Pervaiz S.: Resveratrol: from grapevines to mammalian biology. FASEB Journal, 17(14) 2003, pg. 1975-1985 Plocr T.: Vliv technologií na obsah fenolických látek v červených vínech. Diplomová práce. Zahradnická fakulta Mendelovy univerzity, Lednice, 2010. Vedoucí práce Doc. Marie Kyseláková, CSc. Stervbo, U., Vang, O., Bonnesen, Ch.: A review of the content of the putative chemoptotective phytoalexin resvertarol in red wine. Food Chemistry 101, 2007, pg. 449-457
46
Opravy textu BP Strana: 8 Původně uvedeno: 2. Cíl Cílem této bakalářské práce je prostudovat dostupné zdroje týkajících se fenolických látek ve víně, a zejména pak resveratrolu, jeho významu v lidské výživě a možného příznivého účinku na zdraví. Vypracovat literární přehled k danému tématu. Nahradit textem: 2. Cíl Cílem této bakalářské práce je prostudovat literaturu týkající se fenolických látek ve víně, zejména resveratrolu a jeho zdravotního významu. Vypracovat literární přehled této problematiky. Dále pak navrhnout metody, jimiž lze tyto látky ve víně stanovit. Stanovit množství trans-resveratrolu v několika komerčně dostupných vínech. Následně výsledky vyhodnotit vhodnými grafickými metodami. Strana: 24 Na konci textu druhého odstavce je uveden autor (Jones, 1995). Správně má být uvedeno (Jones, 1998).
47
