MATERI DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian lapang dilakukan untuk mengumpulkan data sifat kuantitatif dan koleksi sampel darah sapi pesisir dengan lokasi di Kabupaten Pesisir Selatan dan Kabupaten Padang Pariaman, Sumatera Barat. Selain itu sebagai pembanding kelompok bangsa sapi luar (out group) juga dikoleksi data sifat kuantitatif dan sampel darah sapi bali di Pusat Penelitian dan Pengembangan Sapi Bali (P3 Bali) di Pulau Bali, sapi limousin, dan sapi simmental di Balai Inseminasi Buatan (BIB) Singosari-Malang, Jawa Timur (Gambar 10). Penelitian
laboratorium
dilaksanakan
di
Laboratorium
Biologi
Molekuler, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), LPPM IPB untuk
isolasi dan purifikasi DNA, analisis Polymerase Chain
Reaction (PCR) serta analisis penciri Polymerase Chain Reaction-Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP). Analisis sekuensing DNA dilaksanakan di Bagian Bioteknologi R&D, PT Charoen Pokphand Jakarta. Analisis DNA di laboratorium berlangsung sejak September 2004 s/d Juli 2006. Bahan dan Alat Materi penelitian yang digunakan untuk analisis data kuantitatif dan analisis DNA adalah sampel sapi pesisir, sapi bali, sapi limousin, dan sapi simmental. Jumlah setiap sampel ternak sapi disajikan pada Tabel 4. Tabel 4 Jumlah ternak sapi pesisir, sapi bali, sapi limousin, dan sapi simmental yang digunakan dalam penelitian Jenis Kelamin No. Bangsa Sapi Jumlah Asal Jantan Betina ------------(ekor)---------1.
Pesisir
22
76
98
Kab. Pesisir Selatan
1
34
35
Kab. Padang Pariaman
2.
Bali
47
-
47
P3 Bali Pulau Bali
3.
Limousin
22
-
22
BIB Singosari Malang
4.
Simmental
18
-
18
BIB Singosari Malang
110
110
220
Total
27
Kecamatan Ulakan Tapakis, Kabupaten Padang Pariaman, Sumatera Barat
Kecamatan Ranah Pesisir Kabupaten Pesisir Selatan, Sumatera Barat
Gambar 10.a Lokasi pengambilan sampel sapi pesisir di Kabupaten Padang Pariaman dan Kabupaten Pesisir Selatan, Sumatera Barat.
28
BIB Singosari, Malang, Jawa Timur
P3 Bali, Pekutatan Kecamatan Pangianan Kabupaten Negara, Bali
Gambar 10.b Lokasi pengambilan sampel sapi simmental dan limousin di BIB Singosari Malang, Jawa Timur, serta sapi bali di P3 Bali, Pulau Bali.
29 Bahan dan Alat Pengambilan Sampel Darah Pengambilan sampel darah sapi menggunakan bahan pengawet darah berupa etanol absolut (PA), alkohol 70%, dan kapas, sedangkan alat yang digunakan venoject multi , tube holder, vacutainer, spuit dispossible, dan alat-alat tulis, serta alat penyimpan darah. Bahan dan Alat Isolasi DNA Isolasi DNA menggunakan beberapa bahan atau pelarut seperti TrisEDTA konsentrasi rendah (low TE), lysis buffer, digestion buffer, rinse buffer, larutan phenol chloroform, larutan chloroform isoamyl alcohol (CIAA), etanol absolut, etanol 70%, dan larutan pengencer DNA (tris-EDTA) 1x. Bahan-bahan pereaksi atau larutan tersebut disajikan pada Lampiran 2. Peralatan yang digunakan untuk isolasi DNA adalah pipet tip Axygen TR222Y dan T1000B, mikro pipet 200 P, 1000 P Gilson, microtube eppendorf ukuran 1,5 ml, mikrosentrifuge merek Eppendorf tipe 5415C, waterbath/inkubator (Grand Incubator), vortex (Maxi Mix Thermolyne 37600 Mixer), dan vacum drayer (Centri Vap Consentration, Labconco). Bahan dan Alat Analisis PCR Beberapa bahan yang digunakan untuk PCR (Polymerase Chain Reaction) dalah deionized water, templet DNA, primer forward dan reverse fragmen gen hormon pertumbuhan MspI dan AluI (oligo) Cybergene, dan beberapa pereaksi PCR (PCR Core System I - Promega USA) yang terdiri atas enzim Tag DNA polymerase 5 unit/μl, bufer thermophilic DNA polymerase 10X reaksi bebas MgCl2, larutan MgCl2 25 mM dan campuran nukleotida 40 mM (masing-masing 10 mM dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP). Peralatan yang digunakan dalam analisis PCR adalah pipet tip Axygen, mikro pipet 10 P, 20 P, dan 200 P Gilson, mikro tube eppendorf Axygen ukuran 0,2 ml, plate pendingin sampel, mikrosentrifuge merek Eppendorf tipe 5415C, dan mesin PCR (Gene Amp PCR System 2400, Perkin Elmer) serta stabilizer (Voltage Stabilizer Ferro Resonant 1500 ICA). \
30 Bahan dan Alat Analisis PCR-RFLP Bahan yang digunakan dalam analisis PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Fragment Length Polymorphism) adalah produk PCR fragmen gen hormon pertumbuhan MspI dan AluI, deionized water, buffer enzim pemotong /restriksi dan enzim pemotong MspI dan AluI 10 unit/μl. Peralatan yang digunakan dalam analisis PCR-RFLP adalah pipet tip Axygen, mikro pipet 10 P, 20 P dan 200 P Gilson,
mikro tube eppendorf Axygen ukuran 0,2 ml, dan
o
inkubator suhu 37 C (Hereues Instruments-Germany). Bahan dan Alat Elektroforesis Bahan yang digunakan untuk elektroforesis adalah agarose (no.cat. 50013R), loading dye, ladder 100 bp, TBE 1X (1 M Tris, 0,9 M Asam Borat, 0,01 M EDTA pH 8,0), dan ethidium bromide.
Peralatan yang digunakan untuk
elektroforesis adalah pipet tip Axygen, mikro pipet 20 P Gilson, gelas ukur, electronic balance (AD HX 100), magnetic strirrer (MG 78), piranti Submarine Electrophoresis (Hoeffer USA), power supply electrophoresis, dan alat foto UVi (gelombang 200-400 nm) serta disket. Bahan dan Alat Analisis Sekuensing Bahan yang digunakan untuk analisis sekuensing adalah produk PCR fragmen gen hormon pertumbuhan MspI dan AluI, primer Forward fragmen gen hormon pertumbuhan MspI dan AluI, bahan purifikasi sampel DNA (QIA-Quick PCR Purification Kit-Qiagen), 125mM EDTA, etanol 100%, etanol 70%, dan HiDi Formamide. Peralatan yang digunakan untuk analisis sekuensing adalah mesin sekuenser
(ABI
Prims
3100-Avant
Genetic
Analyzer),
centrifuge,
spektrofotometer (UV-Vis Spectrofotometer-Shimadzu), dan mesin PCR (Applied Biosystems, USA).
31 Metode Penelitian Penarikan Sampel Data Penelitian Metode penarikan sampel data penelitian berdasarkan metode penarikan otoritas (Steel dan Torrie, 1995). Metode ini dilakukan berdasarkan kriteria bangsa dan lokasi penarikan sampel, yaitu bangsa sapi pesisir di Kabupaten Pesisir Selatan dan Kabupaten Padang Pariaman, sapi bali di P3 Bali, sapi simmental dan sapi limousin di BIB Singosari, Malang. Sapi pesisir di Kabupaten Pesisir Selatan dan Kabupaten Padang Pariaman terbagi dalam tiga kelompok umur, yaitu kelompok sapi anak (<1,5 tahun), muda (≥1,5-<3,0 tahun), dan dewasa (≥3,0 tahun) berdasarkan pertukaran gigi serinya dengan jenis kelamin jantan dan betina. Sapi bali yang berasal di P3 Bali hanya memiliki satu kelompok umur, yaitu umur dua tahun dan berjenis kelamin jantan. Hal itu karena sapi bali di P3 Bali sebagian besar berumur dua tahun pada waktu pengambilan data dan semua berjenis kelamin jantan karena akan dipergunakan sebagai calon bibit (pejantan). Pada kelompok umur sapi limousin dan sapi simmental hanya umur dewasa (3-9 tahun) dengan jenis kelamin jantan. Kondisi tersebut juga terjadi karena pejantan yang terdapat di BIB Singosari sebagian besar merupakan sapi impor dari Australia yang sudah lama dan dipergunakan untuk diambil semennya sebagai pejantan unggul. Pengambilan Data Sifat Kuantitatif Pengambilan data sifat kuantitatif pada sapi pesisir menggunakan data sekunder yang berasal dari pengambilan data yang dilakukan oleh Sarbaini (2004). Hal yang sama juga dilakukan pada data sifat kuantitatif pada sapi bali, sapi limousin, dan sapi simmental berasal dari data sekunder yang terdapat di P3 Bali, Pulau Bali dan BIB Singosari Malang, Jawa Timur. Data sifat kuantitatif yang diambil sebagai data sekunder meliputi bobot badan, tinggi pundak, panjang badan, dan lingkar dada. Berdasarkan informasi yang diperoleh dari Sarbaini (2004), penimbangan bobot badan dan pengukuran ukuran tubuh pada sapi pesisir menggunakan timbangan kapasitas 400 kg (GHL Produc - England), tongkat ukur, dan pita ukur (satuan inci) yang dilakukan pada pagi s/d siang hari. Penimbangan bobot badan dan pengukuran ukuran tubuh pada sapi bali, sapi limousin dan sapi
32 simmental dari informasi yang diperoleh di P3 Bali Pulau Bali dan BIB Singosari, Malang, Jawa Timur menggunakan timbangan elektrik kapasitas 1500 kg, tongkat ukur, dan kaliper. Pengambilan Sampel Darah Sampel darah sapi pesisir yang berasal dari Kabupaten Pesisir Selatan dan Kabupaten Padang Pariaman diambil melalui vena jugularis dengan tabung venoject vakum tanpa heparin. Sampel darah tersebut kemudian diawetkan dengan etanol absolut. Hal yang sama juga dilakukan pada sampel darah sapi bali di P3 Bali Pulau Bali, sapi limousin, dan sapi simmental di BIB Singosari, Malang, Jawa Timur diambil melalui vena jugularis dengan venoject vacum tanpa heparin. Setelah itu, sampel darah tersebut ditambahkan etanol absolut dengan perbandingan 1:1 dan disimpan pada suhu ruang. Isolasi DNA Total Sebelum dilakukan isolasi DNA, darah yang telah diawetkan dengan etanol absolut dicuci dengan Tris-EDTA konsentrasi rendah (low TE). Pada setiap pencucian (setelah penambahan low TE) disentrifugasi 3000 rpm selama dua menit kemudian diulang sebanyak 5 kali dengan tujuan untuk menghilangkan kandungan etanol absolut yang terdapat di dalam sampel darah sapi yang telah diawetkan dengan etanol absolut (Duryadi 1993). Isolasi DNA total dilakukan dengan menggunakan metode fenol (Sambrook et al. 1989) yang dimodifikasi (Duryadi 1993). Sebanyak 300 μl darah yang telah dicuci low TE ditempatkan di dalam tabung eppendorf 1,5 ml ditambahkan lysis buffer (0,32 M sukrosa, 1% v/v triton X-100, 5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl pH 7,4) sama dengan volume sampel darah dan digerus sampai halus menggunakan pengaduk kaca, kemudian disentrifugasi 6500 rpm selama satu menit dan supernatan dibuang. Larutan rinse buffer (75 mM NaCl, 50 mM Titriplex III (EDTA) pH 8,0) ditambahkan sebanyak 200 μl, kemudian divortex sampai homogen lalu ditambahkan kembali digestion buffer (SDS 1% v/v, 0,5 mM EDTA pH 8,0, 1M NaCl. 0,5 mM Tris-HCl pH 9,0 dan ditambah 0,1 mg/ml RNase serta 0,5 mg/ml Protease K) sebanyak 500 μl. Campuran larutan tersebut
33 dikocok sampai homogen, setelah itu diinkubasi dalam water bath pada suhu 55oC selama semalam (± 16 jam). Ekstraksi dilakukan dengan menambahankan phenol sebanyak 500 μl dan kocok sampai homogen selama 20 menit, lalu disentrifugasi 13.000 rpm selama tiga menit. Supernatan dipindahkan ke eppendorf baru dan ditambahkan klorofom : isoamil-alkohol (24:1) sebanyak 500 μl dan dikocok selama 20 menit, kemudian disentrifugasi 13.000 rpm selama tiga menit. Supernatan dipindahkan kembali ke tabung eppendorf baru dan ditambahkan kembali etanol absolut dua kali volume sampel dan dibiarkan sebentar, kemudian disentrifugsi 13.000 rpm selama lima menit dan supernatan dibuang, diganti dengan etanol 70%, lalu disentrifugasi kembali 13.000 pm selama
lima menit.
Larutan etanol 70%
dibuang dan pelet (DNA) dikeringkan. Setelah kering pelet (DNA) ditambah larutan TE (1 mM EDTA pH 8,0, 10 mM Tris-HCl pH 8,0) sebanyak 100 μl dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 15 menit. Sampel DNA disimpan di freezer (-20oC) sampai siap digunakan. Amplifikasi Gen GH menggunakan mesin PCR Amplifikasi fragmen gen GH MspI dan AluI dilakukan dengan menggunakan dua set primer (Tabel 5) dengan mesin PCR. Menurut beberapa peneliti (Mitra et al. 1995; Reis et al. 2001) diketahui bahwa kedua primer tersebut memiliki polimorfisme pada fragmen gen GH. Tabel 5 No.
Sekuens primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen GH pada sapi pesisir, sapi bali, sapi limousin, dan sapi simmental Sekuens Primer
Acuan
1.
F 5’-CCC ACG GGC AAG AAT GAG GC-3’ R 5’-TGA GGA ACT GCA GGG GCC CA-3’
Mitra et al. (1995)
2.
F 5’-GCT GCT CCT GAG GGC CTT C-3’ R 5’-CAT GAC CCT CAG GTA CGT CTC CG-3’
Reis et al. (2001)
Keterangan : F = Forward, R = Reverse.
Kondisi mesin PCR yang digunakan untuk mengamplifikasi fragmen gen GH MspI dan AluI dilakukan dengan tiga tahap, yaitu denaturasi, annealing, dan eskstensi sesuai dengan suhu yang ditentukan (Tabel 6).
34 Tabel 6 Kondisi mesin PCR yang dijalankan untuk mengamplifikasi gen GH pada sapi pesisir, sapi bali, sapi limousin, dan sapi simmental Tipe Penciri
Denaturasi
Annealing
Ekstensi
Jumlah Siklus
o
-----------------( C/menit)---------------
(kali)
PCR-RFLP MspI
94/0,30
53/0,45
72/1,0
35
PCR-RFLP AluI
94/0,30
55/0,45
72/1,0
35
Fragmen gen GH MspI memiliki satu situs pemotong enzim MspI dengan panjang produk PCR 329 bp terdapat pada posisi inton 3 parsial dan exon 4 parsial (Gambar 11). Adapun fragmen GH AluI juga memiliki satu situs pemotong enzim AluI dengan panjang produk PCR 211 bp terdapat pada posisi intron 4 parsial dan exon 5 parsial (Gambar 12).
1441 1501 1561 1621 1681 1741
cccacggg gcaggggacc cttctccccg ggcaggaggt ccgaccaccc gtcgtggctt
caagaatgag tccttcatcc aggtggcgga cctcgggcag acctgccagc gggcccctgc
gcccagcaga taagtaggct ggttgttgga aggccgacct aggacttgga agttcctca
aatcagtgag gccccagctc tggcagtgga tgcagggctg gctgcttcgc
tggcaacctc ccgcaCCGGc ggatgatggt ccccagaccc atctcactgc
ggaccgagga ctggggcggc gggcggtggt gcggcaccca tcctcatcca
Keterangan: huruf besar situs pemotong enzim MspI (CCGG)
Gambar 11 Fragmen gen GH MspI didasarkan pada sekuens gen GH di GenBank (Gordon et al. 1983).
2041 2101 2161 2221 2281
ggcccttcgg ggctgggcag cgcgctgctc gacgtacctg
gc cctctctgtc tctccctccc ttggcaggAG CTggaagatg atcctcaagc agacctatga caaatttgac acaaacatgc aagaactacg gtctgctctc ctgcttccgg aaggacctgc agggtcatg
tgctcctgag gcaccccccg gcagtgacga ataagacgga
Keterangan: huruf besar situs pemotong enzim AluI (AGCT)
Gambar 12 Fragmen gen GH AluI didasarkan pada sekuens gen GH di GenBank (Gordon et al. 1983). Bahan pereaksi yang digunakan untuk PCR adalah templet DNA, buffer 10x, 10 mM dNTP, 50 mM MgCl2, primer Forward dan Reverse masing-masing 30 pmol, dan 2,5 unit Tag DNA Polymerase (Promega PCR Core System USA) dengan total volume reaksi 50 μl. Adapun komposisi bahan untuk volume reaksi
35 50 μl adalah 5 μl buffer PCR 10x bebas MgCl2, 2 μl MgCl2, 1 μl dNTP, 1,5 μl masing-masing primer Forward dan Riverse, 1,5 μl sampel DNA, dan 0,25 μl enzim Tag DNA Polymerase dan sisanya deionized water 37,25 μl. Sebelum bahan-bahan tersebut dimasukkan ke dalam mesin PCR, terlebih dahulu diputar sebentar (spin down) dengan mikro sentrifuge.
Analisis Penciri PCR-RFLP Produk PCR yang diperoleh dari hasil amplifikasi penciri PCR-RFLP fragmen gen GH MspI dan fragmen gen GH AluI masing-masing dipotong dengan menggunakan enzim pemotong MspI (C*CGG) dan AluI (AG*CT). Volume dan bahan pereaksi yang digunakan untuk memotong produk PCR fragmen gen GH MspI dan AluI masing-masing untuk setiap enzim pemotong adalah 5,0 μl deionized water, 2,5 μl buffer enzim pemotong, 2,5 sampel produk PCR, dan 0,5 μl enzim pemotong. Campuran sampel produk PCR baik fragmen gen GH MspI maupun AluI dan bahan pereaksi diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 37oC selama lebih kurang 16 jam (over night). Elektroforesis DNA Total, Produk PCR, dan Produk PCR-RFLP Elektroforesis dilakukan terhadap DNA total, produk PCR, dan produk pemotongan (digested) atau PCR-RFLP dengan menggunakan gel agarose dengan konsentrasi
yang
berbeda.
Konsentrasi
agarose
1%
digunakan
untuk
elektroforesis DNA total (0,5 g/50 ml TBE 1X), produk PCR 1,2% (0,6 g/50 ml TBE 1X, dan produk pemotongan 2% (1 g/50 ml TBE 1X). Gel agarose dibuat sesuai dengan konsentrasi yang dibutuhkan, kemudian dipanaskan di hot plate stirrer sampai mendidih (larutan terlihat bening), lalu ditambahkan ethidium bromide sebanyak 2,5 μl (10 mg/ml), dan dibiarkan sebentar agar dingin. Sebelum membeku gel agarose 1% dituangkan ke cetakan yang telah disiapkan, kemudian diletakkan sisir untuk 12 sampel dan biarkan sampai membeku. Sebelum menjalankan piranti elektroforesis, sampel dimasukkan ke setiap sumur sampel, larutan atau buffer TBE 1X (1 M Tris, 0,9 M asam borat, 0,01 M EDTA pH 8,0) volumenya sudah cukup dan sampel siap dijalankan. Elektroforesis menggunakan Submarine Electrophoresis (Hoeffer USA) yang
36 dijalankan atau dimigrasikan dari kutub negatif (katoda) ke positif (anoda) dengan arus 85 volt, 200 mA selama 30 menit s/d 45 menit. Hasil elektroforesis diamati dengan bantuan sinar UV (gelombang 200-400 nm) dan hasilnya difoto dengan Gel DOC (UVi) dan hasil foto disimpan di disket atau dicetak. Ada tidaknya pita (band) yang tergambar dalam hasil elektroforesis memberikan hasil ada tidaknya DNA total, berhasil tidaknya amplifikasi PCR atau ada tidaknya variasi atau polimorfisme fragmen gen GH MspI dan AluI. Sekuens Fragmen Gen GH MspI dan AluI Sekuensing fragmen gen GH MspI dan AluI dilakukan pada individu yang bergenotipe homozigot (mutasi dan tidak mutasi) dengan jumlah 12 sampel, masing-masing enam sampel untuk fragmen gen GH MspI dan enam sampel untuk fragmen gen GH AluI. Setiap bangsa sapi terdiri atas tiga sampel sapi pesisir, satu sampel sapi bali, satu sampel sapi simmental, dan satu sampel sapi limousin. Primer yang digunakan untuk merunut fragmen gen GH MspI dan AluI hanya menggunakan primer forward. Langkah-langkah yang dilakukan untuk sekuensing fragmen gen GH MspI dan AluI sebagai berikut : 1. Purifikasi Sampel DNA sampel (produk PCR) dipurifikasi menggunakan Kit Qia-Quick PCR (Qiagen) sesuai dengan prosedur. 2. Pengukuran Konsentrasi Sampel Sampel produk PCR yang telah dipurifikasi diukur konsentrasinya menggunakan spektrofotometer (UV-VIS Spectrofotometer-Shimizu) pada gelombang λ=260 nm. 3. Siklus Sekuensing DNA templet dengan jumlah yang cukup diamplifikasi dengan BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) menggunakan mesin PCR. Program PCR dijalankan sesuai dengan program dan siklus PCR normal yang dimodifikasi pada suhu ekstensi 60oC menggantikan suhu 72oC. Primer yang digunakan untuk siklus sekuensing adalah sama dengan primer PCR normal.
37 4. Purifikasi Produk Siklus Sekuensing Primer dan pereaksi
BigDye Terminator yang berlebih dihilangkan dari
produk siklus sekuensing (mengacu pada panduan penggunaan ABI Prism 3100-Avant Genetic Analyzer) dengan tahapan sebagai berikut : sebanyak 20 μl produk ditambahkan 5 μl EDTA 125 mM dan 60 μl etanol 100%, kemudian digoyang dengan membalik tube beberapa kali. Inkubasi pada suhu ruang selama 15 menit. Sentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm suhu 4oC selama 30 menit. Supernatan dibuang, lalu ditambahkan 60 μl etanol 70%. Sentrifugasi kembali dengan kecepatan 4500 rpm suhu 4oC selama 15 menit. Supernatan dibuang dan diulang kembali dengan menambahkan etanol 70% kemudian disentrifugasi dengan kondisi yang sama seperti di atas. Tube dikeringkan di dalam evaporator selama 2 menit, kemudian ditambahkan 10 μl Hi-Di Formamide. Denaturasi dilakukan dengan pemanasan pada suhu 95oC selama 4 menit, setelah itu diletakkan di atas boks yang berisi bunga es selama 5 menit. 5. Analisis Sekuensing DNA Produk PCR yang telah dipurifikasi dan didenaturasi dimasukkan sebanyak 10 μl ke dalam 96 sumur plate. Catatan plate sampel di tulis di software program sekuensing. Mesin sekuenser ABI Prims 3100-Avant Genetic Analyzer dijalankan sampai electropherogram telah memperlihatkan bahwa semua fragmen DNA mengalir melalui capillary array dan dideteksi oleh detektor laser. Hasil elektroferogram selanjutnya dianalisis. Peubah yang Diamati Beberapa peubah yang diamati terkait dengan analisis DNA pada fragmen gen GH MspI dan AluI, yaitu (1) frekuensi gen, (2) keseimbangan gen dalam populasi, (3) heterozigositas, (4) nilai Polymorphic Informative Content (PIC), (5) ada tidaknya mutasi, (6) kesamaan sekuens gen GH (homology), dan (7) keterkaitan genotipe gen GH dengan sifat kuantitatif. Peubah yang diamati untuk sifat kuantitatif : (1) bobot badan (kg), (2) tinggi pundak (cm), (3) panjang badan(cm), dan (4) lingkar dada (cm).
38 Analisis Data Frekuensi alel gen GH yang diperoleh dari analisis penciri PCR-RFLP MspI dan AluI dihitung menggunakan rumus (Nei 1987) : ⎛ ⎞ ⎜ 2 n ii + ∑ n ij ⎟ ⎟ ⎜ j≠ i ⎠ ⎝ xi = 2n
Keterangan : xi = frekuensi alel ke-i, = jumlah individu bergenotipe AiAi, nii nij = jumlah individu bergenotipe AiAj, n = jumlah total sampel. Keseimbangan Hardy-Weinberg diuji dengan Chi-square (χ2) (Hartl dan Clark 1997) :
χ
2
=
( obs − exp) ∑ exp
2
Keterangan : χ2 = uji Chi-square, Obs = jumlah pengamatan genotipe ke-i, Exp = jumlah harapan genotipe ke-i. Keragaman genetik (genetic varibability) dilakukan melalui estimasi frekuensi heterozigositas pengamatan (Ho), heterozigositas harapan (He) dan standar eror heterozigositas harapan (Weir 1996; Nei 1987) :
Ho = ∑
N 1ij N
i≠ j
Keterangan : Ho = frekuensi heterozigositas pengamatan, N1ij = jumlah individu heterozigot pada lokus ke-1, N = jumlah individu yang dianalisis. n
H e = 1 − ∑ p1i 1=1
Keterangan : He = heterozigositas harapan, p1i = frekuensi alel ke-i pada lokus 1, n = jumlah alel pada lokus ke-1.
2
39 V s1 ( H e ) =
{
(
2 3 2(2 n − 2 ) ∑ xi − 2 n (2 n − 1)
(∑ x ) )+ ∑ x − (∑ x ) } 2 2
i
2 2
2
i
i
Keterangan : Vsl (He) = ragam heterozigositas harapan, = frekuensi gen ke-1. xi Standar eror (SE) heterozigositas harapan diperoleh dari = Vsl (H e ) . Tingkat informatif suatu alel dihitung dengan menggunakan pendekatan nilai Polymorphic Informative Content (PIC) (Botstein et al. 1980) : n
n −1
PIC = 1 − ∑ pi − ∑ 2
i =1
n
∑2p
i =1 j = i +1
2 i
p 2j
Keterangan : pi n
= frekuensi alel ke-i, = jumlah alel per penciri (marker) Hasil sekuens fragmen gen GH MspI dan AluI sapi pesisir, sapi bali, sapi
limousin, dan simmental dianalisis kesamaannya (homology) dengan sekuens yang terdapat di GenBank menggunakan perangkat lunak (software) komputer program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altchul et al. 1997) [www.ncbi .nhl.nih.gov./BLAST] yang bertujuan untuk memastikan bahwa sekuens yang dianalisis adalah fragmen gen GH. Selain mendapatkan kesamaan sekuens antar-bangsa, juga dapat diduga posisi ada tidaknya mutasi yang terjadi pada gen GH dan sekuens basa nukleotida spesifik yang dianalisis. Kesamaan suatu sekuens tinggi apabila score yang didapat >200 bits. Hasil sekuens fragmen gen GH MspI dan AluI pada sapi pesisir, sapi bali, sapi limousin, dan sapi simmental yang diperoleh dibuat pohon kekerabatannya (phylogenetic trees) dengan menggunakan software komputer program Molecular Evolutionary
Genetic Analysis (MEGA4) dengan metode Neighbor-Joining berdasarkan bootstrap 1000 pengulangan (Kumar dan Tamura 2006). Perbedaan bobot badan dan ukuran tubuh antar-genotipe fragmen gen GH
MspI dan AluI dianalisis dengan menggunakan uji t (Mendenhall 1987) :
40
t
x −x
=
1
s
1
+
2
1
n n 1
2
∑ (x i − x 1) + ∑ (x i − x 2) n +n −2 n
s
=
n
2
i =1
2
i =1
1
2
Keterangan : = rataan sifat produksi genotipe 1 dan 2 x1 dan x2 = jumlah individu genotipe 1 dan 2 n1 dan n2 Sebelum dilakukan uji t, data sifat kuantitatif terlebih dahulu dikoreksi dengan pendekatan perhitungan sebagai berikut :
x
i − terkoreksi
=
x x
standar
x xpengamatan
ke −i
pengamatan
Keterangan :
x x x x
i − terkoreksi
= data yang telah dikoreksi
standar
= rataan data yang dijadikan standar
pengamat an
= rataan data yang akan dikoreksi
pengamatanke −i
= data yang akan dikoreksi ke-i
Adapun prosedur tahapan data terkoreksi untuk sapi pesisir (xi): (1) koreksi pertama dilakukan terhadap umur 2,0-2,5 tahun, semua data umur < 2,0 tahun atau > 2,5 tahun dikoreksi menurut rataan umur 2,0-2,5 tahun pada setiap jenis kelamin dan lokasi berbeda, (2) koreksi kedua dilanjutkan terhadap jenis kalamin betina, semua data jenis kelamin jantan dikoreksi terhadap jenis kelamin betina pada setiap lokasi berbeda, dan (3) koreksi ketiga dilakukan terhadap lokasi di Kabupaten Pesisir Selatan, maka semua data di Kabupaten Padang Pariaman dikoreksi terhadap lokasi di Kabupaten Pesisir Selatan. Koreksi data juga dilakukan pada bangsa sapi bali, sapi limousin, dan sapi simmental dengan prosedur yang sama akan tetapi tidak dilakukan koreksi terhadap jenis kelamin dan lokasi. Data dianalisis menggunakan perangkat lunak komputer program microsoft Excel 2003.
