Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta
Brno 2007
Ondřej Novotný
1
Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity Katedra Fyziky
Využití bariérových výbojů pro sterilizaci
Ondřej Novotný Lékařská fyzika
2007
2
Děkuji Mgr.Pavlu Sťahelovi za odborné vedení mé bakalářské práce a čas, který mi věnoval, děkuji Ing. Jitce Vrajové
za přípravu a vyhodnocení vzorků, za zařízení
elektronové mikroskopie, za soboty ve škole, za vřelou spolupráci i za užitečné rady. Dále děkuji Mgr. Janu Čechovi za měření a výsledky emisní spektroskopie, Hložkovi a Ing.Drahomíře Janové za obrázky z elektronové mikroskopie.
3
Mgr. Martinu
Tímto prohlašuji, že veškeré uvedené naměřené hodnoty jsou pravdivé, stejně jako uvedená použitá literatura.
Datum:
Podpis:
4
Anotace Plazmový výboj dokáže za jistých podmínek ničit biologický materiál. V této práci byla použita plíseň Aspergillus niger. Všechny materiály obsahující celulózu nebo uhlík, jako např. papír, kmeny stromů, potravinářské produkty, ale i živé stuktury, člověka nevyjímaje, mohou obsahovat tuto plíseň. Viditelnou část této mikroskopické houby, hyfu, lze zničit poměrně snadno, např. teplem. Ovšem spóry jsou obzvláště odolné vůči vnějšímu prostředí. Je potřeba najít správné podmínky pro likvidaci plísně, včetně výtrusů. Rovněž bude studován vliv plazmatu na barevné i mechanické vlastnosti papíru. Za tímto účelem byl vyroben malý plazmový reaktor. Tento reaktor využívá Dielektrický Bariérový Výboj, buzený za atmosférickéo tlaku. Plazma je možné vytvořit v několika pracovních plynech, jako argon, helium, dusík atd.
Anotation Plasma discharge performed at special conditions can destroy biologic materials. In this work the mould Aspergillus niger was used. All materials containing celulose or carbon for example paper, food products, but also life structrures, human including can contain this kind of mould. The visible part (microscopic fungus, called hyfa) can be destroyed easily for example by heat, however spores are more resistant against external conditions. To inactivate mould including spores it is necessary to find special conditions. We will also study plasma effects on color changes and on mechanical characteristics of paper. The small plasma reactor was constructed for this purpose. This reactor is based on Dielectric Barrier Discharge working at atmospheric pressure. Plasma is possible create in different working gases as argon, helium, nitrogen etc.
5
Obsah Kapitola 1 – Úvod ..................................................................
8
1.1
Úvod a cíl práce ...........................................................................
9
Kapitola 2 – Teoretická část..........................................
10
2.1
Plazma .........................................................................................
11
2.1.1 Definice a rozdělení plazmatu ............................................
11
2.1.2 Buzení plazmatu .................................................................
12
2.1.3 Druhy dielektrických bariérových výbojů ..........................
12
Metody sterilizace .......................................................................
13
2.2.1 Různé sterilizační techniky ................................................
13
2.2.2 Sterilizace v prostředích o různých tlacích ........................
15
2.3
Faktory sterilizace v plazmatu ....................................................
15
2.4
Plísně ...........................................................................................
16
2.4.1 Aspergillus niger ................................................................
17
2.4.2 Stanovení počtu spór a vyhodnocení sterilizace ................
18
2.5
Rastrovací elektronová mikroskopie............................................
19
2.6
Kolorimetrie ................................................................................
19
2.7
Optická emisní spektroskopie .....................................................
19
Kapitola 3 – Experimentální část.............................
21
3.1
Přístroje použité při experimentu ................................................
22
3.2
Materiál použitý při experimentu ...............................................
22
3.3
Příprava vzorků ...........................................................................
22
3.3.1
Příprava očkovací suspenze ....................................................
22
3.3.2
Příprava vzorků papíru ...........................................................
23
3.4
Vyhodnocování vzorků ..............................................................
24
3.5
Opracování vzorků .....................................................................
25
3.5.1
Experimentální uspořádání .....................................................
25
3.5.2
Opracování vzorků s plísní ....................................................
27
3.5.2.1
Sterilizace vzorků v argonovém plazmatu .....................
27
3.5.2.2
Sterilizace vzorků v heliovém plazmatu ......................
28
3.5.2.3
Sterilizace vzorků v dusíkovém plazmatu ...................
29
2.2
6
Srovnání výsledků sterilizace pro různé pracovní plyny .
30
Opracování vzorků papíru – vliv na kolorimetircké vlastnosti
31
3.5.3.1
Opracování papíru v argonovém plazmatu ....................
31
3.5.3.2
Opracování papíru v heliovém plazmatu .......................
32
3.5.3.3
Opracování papíru v dusíkovém plazmatu ....................
34
3.5.3.4
Srovnání vlivu na barevné změny pro různé prac. plyny..
35
Opracování vzorků papíru – vliv na strukturu papíru ..............
36
3.5.4.1
Vliv plazmatu na strukutu papíru - Ar ..........................
37
3.5.4.2
Vliv plazmatu na struktutu papíru - He .........................
38
3.5.4.3
Vliv plazmatu na strukturu papíru...........
....................
40
Výsledky emisni spektroskopie ...................................................
41
3.6.1
Spektrum výboje v argonu .......................................................
42
3.6.2
Spektrum výboje v heliu ..........................................................
43
3.6.3
Spektrum výboje v dusíku .......................................................
44
Kapitola 4 – Závěr..................................................................
45
4.1
46
3.5.3.3
3.5.3
3.5.4
3.6
Závěr ...........................................................................................
Použité zdroje a literatura ........................................................................ 47
7
KAPITOLA 1 Úvod a cíl práce
8
1.1 Úvod a cíl práce Sterilizace je proces, při němž dochází k přímému zničení mikroorganismů v daném prostředí (ve vymezeném prostoru). Inaktivace je pak proces, kdy dochází k potlačení aktivity mikoorganismů ve vzorku. Úkolem sterilizačních procesů je tedy zničit jakoukoliv živou formu, která může znamenat nebezpečí při použití daného objektu. Efektivita sterilizace nezávisí pouze na samotném sterilizačním procesu, ale také na úpravách sterilizovaného objektu. Je také důležité znát typ, původ a velikost kontaminace pro její efektivní odstranění. Například, spóry plísní jsou vysoce rezistivní vůči přírodnímu prostředí, dají se jen těžko ničit a proto jsou využívány jako biologické indikátory k určení stupně sterilizace [1]. Různé limity sterilizačních metod zapříčinily vývoj alternativních technik. Ideální sterilizátor by měl dnes splňovat toto [1]: 1.
Sterilizační čas by měl být mnohem ktratší než čas, který je aktuálně vyžadován u tepelných metod (kolem 30 min)
2.
Podobná nebo nižší pracovní teplota, která je běžná u EtO (55°C nebo méně)
3.
Možnost práce s širokým spektrem materiálů a objektů
4.
Bezpečná operativnost pro pracovníky, pacienty nebo objekty
Cílem této práce je studovat sterilizační schopnosti objemového bariérového výboje v různých pracovních plynech, při měnících se výkonech a časech opracování. Dále je potřeba zjistit změnu na vlastnostech papíru, jako je žlutost či bělost, po jeho vystavení účinkům plazmatu.
9
KAPITOLA 2 Teoretická část
10
2.1 Plazma 2.1.1
Rozdělení a definice plazmatu
Plazma je kvasineutrální plyn s vysokou koncentrací nabitých částic, jako jsou například elektrony nebo kladné a záporné ionty, které vznikly ionizací atomů a molekul plynu. Ideální plazma musí splňovat toto [2]: ●
počet elektronů v kouli s Debyeovým poloměrem hD =
1 0 kT e , e ne
kde e je elementární náboj, ɛ₀ je permitivita vakua, k je Boltzmannova konstanta, T℮ je teplota elektronů a ne jejich koncentrace, musí být výrazně vyšší než jedna.
●
plazmová frekvence elektronů =c
ne , 0 m
kde m je hmotnost eletronu, musí být větší než frekvence srážek neutrálními
částicemi.
Plazma je možné rozdělit podle [3]:
–
stupně ionizace – běžně od 10⁻⁶% do 100%
–
teploty plazmatu
–
–
vysokoteplotní (T > 10⁶ K)
–
nízkoteplotní (T < 10⁶ K), které můžeme dělit na: –
studené plazma - T < 1000 K
–
horké plazma - T > 1000 K
hlediska termodynamické rovnováhy
11
elektronů s
–
thermal equilibrum – kdy všechny částice obsažené v plazmatu mají stejnou teplotu
–
non-equilibrum – kdy jsou teploty rychlých elektronů vyšší než pomalé ionty
–
tlaku – zde rozdělujeme plazma na –
nízkotlaké - kdy je střední volná dráha částic dlouhá z důvodu malé hustoty částic
–
vysokotlaké - s velkou hustotou částic, a tedy i s vysokou srážkovou frekvencí a krátkými volnými drahami částic (např. dielektrický bariérový výboj)
2.1.2
Buzení plazmatu
Plazma tedy vzniká ionizací částic plynu a to zejména díky jejich vzájemných srážkám či interakci se zářením. Atomy nebo molekuly mohou být ionizovány jen tehdy, pokud je jim předaná energie vyšší nebo rovna ionizační energii (tab.1.1).
Atom
Ionizační energie [eV]
Molekula
Ionizační energie [eV]
He Ar
24,6 15,8
OH O₂ N₂
13,0 12,1 15,6
Tabulka 1.1: Ionizační energie vybraných atomů a molekul
Možností, jak docílit toho, aby ionizační a excitační srážky mohly probíhat v dostatečné četnosti, je urychlovat částice vnějším elektrickým polem a dodat jim tak potřebnou kinetickou energii k excitaci nebo přímo k ionizaci atomů či molekul.
12
2.1.3
Druhy dielektrických bariérových výbojů
Dielektrický bariérový výboj, dále jen DBD (dielektric barrier discharge), je výboj používaný jak při nízkých tlacích, tak například při atmosférickém tlaku. Výboj je buzen přes dielektrikum (většinou křemenné) mezi elektrodami, které tvoří sériově zapojený kondenzátor s výbojovým prostorem. Jeho náboj limituje napětí přiložené na plyn a brání tak přechodu výboje do oblouku. Na vlastnostech výboje se podílejí geometrické konfigurace výbojového prostoru a elektrod, dále pak vlastnosti dielektrické vrstvy, pracovní plyn, velikost a frekvence budícího napětí a.j. [4] Podle vzájemné polohy rozdělujeme DBD na:
●
koplanární výboj – elektrody jsou umístěny přímo v dielektrické vrstvě vedle sebe
●
povrchový výboj – vhodným umístěním spodní a horní elektrody lze vytvořit oblast, kde potenciál elektrického pole klesá ve směru povrchu dielektrika
●
objemový výboj – je vybuzen mezi protilehlými elektrodami, v jejich vhodně přizpůsobených vzdálenostech
Dále se budu zabývat jen objemovým DBD výbojem. Nejdříve však uvedu přehled různých sterilizačních technik.
2.2 Metody sterilizace 2.2.1
Různé sterilizační techniky
Používání polymerických prostředků v medicíně stimulovalo vývoj nových sterilizačních metod. Zde je přehled a stručný popis nejběžnějších metod sterilizace [5]:
13
●
Sterilizace plyny - patří sem například sterilizace Ethylen oxidem (EtO) . Nemá žádný vliv na prostorovou charakteristiku materiálu. První verze ale obsahovaly chlorofluorokarbony (CFC) a proto musely být změněny, jenomže v nových verzích mohou mít zbytky EtO adsorbované na zařízeních po sterilizaci rovněž karcinogenní vlastnosti. Po samotném sterilizačním procesu, je nezbytné reaktor kompletně odsát a vyčistit, což může trvat delší dobu než samotné opracování. Bezpečnost pracovníků je také velmi důležitý faktor této techniky. Mimo EtO, jsou nebezpečné i látky, jako tekutý formaldehyd a glutaraldehyd, které jsou běžně využívány v mnoha sterilizačních instalacích, zejména pro sterilizaci materiálů, které jsou citlivé na teplo. Dalším plynem, který je možné použít k těmto účelům je ozón, určený zejména ke sterilizaci vody a k ochraně jídla před zkažením.
●
Sterilizace elektromagnetickými paprsky ■
Tepelná (EM) sterilizace - většinou je aplikována infračervenými paprsky, keré zahřejí povrch cíle na teplotu kolem 120 °C. Expoziční doby kolem 20 min vedou ke kompletní sterilizaci. Tepelná sterilizace je však použitelná pouze v tom případě, pokud ji dovoluje ozařovaný materiál.
■
Sterilizace vlnami o vyšších frekvencích - jako jsou mikrovlny, ultrafialové záření, přímo ovlivňují DNA struktury buněk a to díky fyzikálnímu i biochemickému účinku. Tyto metody se používají ke sterilizaci lekářských nástrojů, textilních tkanin, i při konzervaci potravin.
■
Ozařování Gamma paprsky -
je dobře známá, nízkoteplotní sterilizační
technika. Je finančně náročná nejen kvůli nutnému vybavení, ale i pro striktní bezpečnostní opatření. Mimoto, relativně vysoké ozařovací intenzity neovlivňují pouze povrch opracovávaného vzorku či přímo vybavení, ale také mohou v případě polymerických objektů degradovat samotné řetězce. To může mít za následek zkrácení životnosti a znehodnocení funkčnosti vybavení.
●
Sterilizace částečnou radiací - elektrony a protony se účastní této metody. Působení elektronů je využíváno v mnoha různých dekontaminačních procesech.
●
Sterilizace v plazmatu - sterilizační techniky, využívající plasmatu
netrpí výše
popsanými problémy. Použití plazmatu je elegantní alternativou výše zmíněných sterilizačních metod. Adekvátní procesy jsou rychlé a efektivní, zatěžují jen málo 14
vlastnosti
materiálů
a
nezatěžují
životní
prostředí
toxickými
produkty.
Mikroorganismy jsou vystaveny reaktivním složkám, které jsou produkovány elektromagnetickým polem v použitém plynu. Volba plynu
je dána počátečními
předpoklady pro jednotlivé druhy opracování. Podle tlaku pracovního prostředí rozlišujeme sterilizace v nízkotlakém a vysokotlakém výboji [5].
Podívejme se na již zmíněné druhy plazmatu (odstavec 2.1.1) z hlediska
sterilizace. Jak již bylo uvedeno, zabývat se budu dále jen DBD.
2.2.2 ●
Sterilizace v prostředích o různých tlacích sterilizace v DBD za nízkého tlaku - relativně silná nízkoteplotní plazmata jsou tradičně vytvářena za sníženého tlaku. Pro praktickou sterilizaci je takto vyvíjené plazma velice nevýhodné, ať z finanční stránky či pro jeho náročnost z důvodu čerpacího systému. Při použití nízkotlakých výbojů vzrůstá náročnost celé procedury na těsnost reaktoru, dále je náročné, nebo spíše nepraktické pro sterilizaci v praxi vůbec nízký tlak vytvářet. Nizkotlaké výboje mají dále nevýhodu v malé koncentraci aktivních částic, čímž vzrůstají experimentální doby o několik řádů. Také proto byly vytvořeny metody ke generování velmi silného plazmatu blízko nebo přímo
za
atmosferického tlaku.
●
sterilizace v DBD výboji za vysokého tlaku - byl to Siemens, kdo v roce 1857 použil atmosferický výboj k vytvoření ozónu a tím i ke sterilizaci vody. Později, Menaschi použil koronální výboj ke sterilizaci povrchů materiálů. V polovině 90. let použil Laroussi DBD k dekontaminaci biologického materiálu. Další experimenty následovaly za použití různých konfigurací k ničení těžších i lehčích bakterií, virů a jiných mikroorganismů [5]. Typické elektronové hustoty DBD se pohybují mezi 10⁹ - 10¹¹ cm¯³. Hustota výkonu
se pohybuje většinou mezi 10 -300 mW/cm³ a teploty zpravidla pod 80 °C. Takto vytvořené plasma je zdrojem UV, viditelného, infračerveného záření a volných radikálů jako např. O₂ , N2 , NO, OH skupin, dále elektronů, které hrají významnou roli při destrukci mikroorganismů [5].
15
2.3
Faktory sterilizace v plazmatu Samotný koncept destrukce mikroorganismů není jen jeden, ale liší se v malých
detailech, podle druhu ozařovaných materiálů
a samozřejmě i druhu mikroorganismů.
Obecně existuje několik mechanismů, které jsou zodpovědné za sterilizaci opracovaného objektu a tedy i za inaktivaci buněk[5]:
●
UV efekt - M.Laroussi došel porovnáním výsledků z nízkotlakých a atmosférických výbojů k závěru, že UV záření za atmosférického tlaku nemá smrtící účinky na ozařované mikroorganismy, protože neprojde dostatečně hluboko do ozařovaného objektu. UV fotony jsou totiž více reabsorbovány plynem za atmosferického tlaku, než za nižšího.
●
Efekt reaktivních složek - je známo, že reaktivní složky, které jsou generovány vysokotlakým výbojem(jedná se o dopady elektronů, excitaci a inaktivaci živé hmoty od atomu k atomu), hrají důležitou roli v ničících účincích. Bylo prokázáno, že pokud plyn obsahoval kyslík, hodnota přeživších se zmenšovala, a to právě kvůli reaktivním složkám jako jsou samotné atomy kyslíku a ozónu. Ostatní radikály, jako např. OH, NO skupiny, elektrony aj. se také podílejí na inaktivaci a to zejménna za vysokého tlaku, s vysokou hustotou těchto částic..
●
Efekty nabitých částí - předpokládá se, že lokálně nabité části hrají významnou roli při destrukci vnější membrány buněk. Ukazuje se, že elektrostatická síla, způsobená akumulací výboje na vnějším povrchu buněčné membrány může převýšit přitažlivé síly membrány a způsobit její otevření.
2.4 Plísně Plísně jsou mikroskopické vláknité houby. Jejich tělo je vláknitý útvar nazývaný hyfa. Hyfa se větví v
podhoubí (mycelium). Z něho pak vyrůstají rozmnožovací útvary
(konidiofory) a na nich se tvoří spóry (výtrusy), [obr.1]
16
obr.1 – konidiofor A.Niger [7]
2.4.1
Aspergillus Niger
Aspergillus niger [obr.2] je jeden z nejrozšířenějších druhů z rodu Aspergillus, skupiny Trichocomaceae. Spóry jsou chráněny černým barvivem pro ochranu před slunečním zářením [2]. Může způsobit nemoc, zvanou Černá plíseň na většině ovoce a zeleniny a je celkem běžnou součástí jídel. A.niger může být navíc zdrojem mykotoxinů, konkrétně ochratoxinů, které jsou pro člověka karcinogenní [2].
Aspergillus není vyloženě nebezpečný pro lidský organismus v případě lehkého kontaktu, ale pokud člověk vdechne veliké množství spór, může dojít např. k Aspergillóze, což je vážné onemocnění plic. Může dojít také k onemocnění Otomykózou, tedy ušní infekcí, která může vést až k poškození tympanické membrány nebo k zánětu pobřišnice [2]. Různé typy A.niger jsou ale používány např. pro přípravu kyseliny citrónové (E330), která je součástí mnoha potravin. Dále Aspergillus niger produkuje různé enzymy, mezi něž patří produkování amyláz, lipáz a pektináz [5] A.niger se velmi daří všude, kde je uhlík a také vlhko. Napadá tedy i kmeny stromů, zejména javorů. Není překvapením, že ji najdeme i v knižních archivech a na samotných knihách [2]. 17
obr.2 Aspergillus niger [8]
obr. 3 – konidiofor (vpravo) se spórami (SEM)
2.4.2
Stanovení počtu spór a vyhodnocení sterilizace
Pro vyhodnocení vzorků je využívána tzv. Desková metoda. Tato metoda vychází z předpokladu, že z jedné životaschopné buňky vyroste jedna kolonie. Základním postupem
18
deskové metody je pipetování určitého objemu připravené suspenze na Petriho misku a její přelití rozehřátou živnou půdou nebo roztírání suspenze po povrchu ztuhlé půdy a zjišťování počtu kolonií po inkubaci při optimální teplotě. Proto se výsledek udává jako počet kolonietvorných jednotek (c.f.u.=colony forming unit) [11]. Ke stanoven í počt u spó r může p osloužit sčítá ní po mocí Burkerovy ko můrky pod optickým mikroskopem. Využívá se metody, kdy se započítávají všechny spóry ve velkých čtvercích, přičemž se započítávají spóry, které leží nebo se dotýkají horní a pravé strany čtverce. Počet spór v 1cm3 je stanoven pomocí vzorce: N…počet mikroorganismů v ml roztoku
N=
c…celkový počet spór ve všech počítaných políčkách z…číslo ředění roztoku P…počet políček Bürkerovy komůrky
c⋅z⋅250⋅1000 P
Účinnost sterilizace může být dána růstovým faktorem, který vypočítáme ze vzorce: N 0 ... původní počet spór
Rf =[log N0 −log Nd ]
N d ... počet nevyrostlých kolonií
2.5 Rastrovací elektronová mikroskopie Princip tvorby SEM snímků je založen na interakci svazku primárních elektronů ( 1 – 30 keV) s povrchem vzorku. Vysokoenergetické elektrony pronikají pod povrch a jsou látkou buď rozptýleny pružně (nebo nepružně) nebo je látka absorbuje. Vlivem pružných (nepružných) srážek jsou z povrchu emitovány zpětně odražené (nebo sekundární elektrony), které jsou zachycovány detektorem a dávají tak vzniknout výslednému obrazu. Pro popis topografie a jemné struktury povrchu se většinou používají sekundární elektrony. Ty vznikají při nepužných srážkách primárních elektronů s částicemi látky. Odražené primární elektrony poskytují informace o kompozici a topografii povrchu objektu, neposkytují však takové rozlišení, jako sekundární elektrony [12].
2.6 Kolorimetrie Kolorimetrie je metoda, používaná k popisu barevných změn objektů. Je možné měřit srovnávat změny na různých barevných prostorech. V této práci se měřily změny v prostoru Lab, a to parametry whitness – bělost, yelowness – žlutost, protože se jedná o nejdůležitější faktory barevných změn u papíru. 19
2.5 Optická emisní spektroskopie Optická emisní spektroskopie je metoda založená na sledování intenzity emise elektromagnetického záření, které je produkováno ionizovanými atomy a molekulami prvku. Optické metody mohou fungovat jak v aktivní podobě, kdy plazma z vnějšku ozařujeme optickým pásmem a pozorujeme interakce, tak v pasivní formě, která spočívá v analýze a vyhodnocení spektra detekovaného z plazmatu. Šířka optického pásma zasahuje od blízkých UV až po blízké IR oblasti [13]. Mezi hlavní optické metody patří metoda optické emisní spektroskopie, která je založená na detekci a analýze záření emitovaného excitovanými částicemi v plazmatu. Příkladem jejího užití je určování vibračních a rotačních teplot na základě změřené intenzity emitovaného záření. Základní rovnicí optické emisní spektroskopie je vztah mezi intenzitou emitovaného záření a koncentrací částic v excitovaném stavu [13]. Jak víme, u molekul existují kromě elektronových kvantových stavů také stavy vibrační a rotační, které rovněž mohou být excitovány. S obsazením excitovaných hladin je (za určitých předpokladů) jako parametr spjata vibrační resp. rotační teplota. Rotační teplota má navíc velký význam proto, že se její hodnotou aproximuje hodnota teploty neutrálních částic, která má zásadní vliv na procesy probíhající v plazmatu. Optické metody obecně patří k hlavním diagnostickým metodám pro doutnavý výboj. Jejich předností je to, že takřka neovlivňují zkoumané plazma a že jejich použitím lze získat více parametrů výboje [13] .
20
KAPITOLA 3 Experimentální část
21
3.1 Přístroje, použité při experimentu Při přípravě a vyhodnocování vzorků byly použity tyto přístroje: ●
třepačka Heidolph (Fisher Scientific, Germany)
●
centrifuga Ultracentrifuga Eppendorf centrifuge 5417R
●
rastrovací elektronový mikroskop Philips XL 30
Při studiu změn kolorimetrických vlastností byly použit přístroj: ●
přenosný kolorimetr X-Rite 918
Pro získání spekter výbojů v různých plynech byl použit přístroj: ●
spektrograf Jobin-Yvon Triax 550 s mřížkou 1200 rypů/mm s CCD detektorem SpectrumOne 2000x800 pixelů chlazeným tekutým dusíkem.
3.2 Materiál, použitý při experimentu Pro kultivaci i pro opracování papíru byl použit filtrační papír Whatman no.1. Tento papír má neutrální pH, je vyroben ze 100% bavlněných vláken a nejsou v něm žádná aditiva [11]. Je vhodný pro tento typ měření, protože můžeme sledovat skutečný vliv plazmatu na kvalitní papír.
3.3
Příprava vzorků Přípravu vzorků prováděla Ing. Jitka Vrajová. Pro experimenty byla použita plíseň
Aspergillus niger F8189. Kultura byla získána z České sbírky mikroorganismů z Masarykovy University v Brně, Přírodovědecké fakulty. Kultivační médium, sladina, bylo získáno z Pivovaru Starobrno a.s. Sladina byla zředěna vodou na 7 hmotnostních procent extraktu, pH bylo upraveno na 6,2 nasyceným roztokem NaHCO3. Následně byly přidány 2 hmotnostní procenta agaru. Takto upravená sladina byla sterilizována.
3.3.1 Příprava očkovací suspenze Ve zkumavce bylo vysterilizováno 5ml destilované vody s přídavkem Tweenu 80 při 22
koncentraci 0,1ml na 100ml média. Povrchově aktivní látka byla přidávána pro zvýšení smáčivosti hydrofobních konidií a vzniku homogenní suspenze. Sterilizace byla provedena v tlakovém hrnci po dobu 30 minut. Destilovaná voda byla nalita do zkumavky se šikmým agarem kultivované plísně a spóry plísně byly do vody uvolněny očkovací kličkou. Očkovací suspenze byla nalita do uzavíratelných sterilních mikrozkumavek o objemu 2ml. Suspenze byla 3x centrifugována při 8000 ot./min, 4°C a v čase 5 min. Suspenze byla promyta 2 ml sterilní destilované vody. Po třech promytích byla odstředěná kapalina čirá a na dně zkumavek byly usazeny spóry plísně Aspergillus niger. Tímto postupem byl odstraněn veškerý zbytkový sladinový agar, na kterém by mohlo dojít k nežádoucímu růstu plísně. Počet spór v 1 cm3 byl stanovován pomocí Bürkerovy komůrky. Bylo provedeno ředění na počet ± 2,0.106 spór v 1ml očkovací suspenze.
3.3.2 Příprava vzorků papíru Do sterilních Petriho misek bylo nalito 10 ml sladinového agaru. Na ztuhlé kultivační médium byl za sterilních podmínek vložen vzorek papíru Whatman no. 1, sterilizovaný v tlakovém hrnci po 30 minut, ve tvaru disku o průměru 3 cm. Na jedné misce byly umístěny čtyři vzorky papíru viz. obr.4. Na připravené vzorky papíru v Petriho miskách bylo napipetováno 100 μl očkovací suspenze. Kultivace vzorků probíhala 7 dní při teplotě 25 °C. Vzroky po vyjmutí z agaru byly vysušeny při teplotě 25 °C po dobu 24 hodin. Takto připravené vzorky byly navíc vložené do mezi dva listy papíru, aby nedošlo k jejich pokroucení vlivem vysychání a byly tak vhodné pro použití v reaktoru.
obr.4 – vzorky papíru na Petriho misce
23
3.4 Vyhodnocování vzorků Opracované vzorky byly za sterilních podmínek vloženy do Erlenmayerovy baňky s 10 ml destilované vody s přídavkem fyziologického roztoku Tweenu 80 při koncentraci 0,1ml na 100ml destilované vody. Baňky s opracovanými vzorky papíru byly umístěny na třepačku po dobu přibližně 1 hodiny, kde díky intenzivnímu protřepávání došlo k uvolnění většiny spór do vodného roztoku. Suspenze spór byla dále přelita do centrifugačních mikrozkumavek o objemu 2 ml a pročištěna s využitím centrifugy a následným promytím destilovanou vodou stejně jako u přípravy očkovací suspenze. Pomocí Bürkerovy komůrky byla stanovena koncentrace spór, suspenze byla dále zředěna, tak aby se výsledná koncentrace spór pohybovala v rozmezí 20 – 200 spór/0,1ml. Do sterilních Petriho misek bylo naočkováno 100 μl připravené suspenze spór. Každá miska byla přelita 10 ml rozehřátého agarového média, vytemperovaného na přibližně 45 °C a dobře promíchána krouživými pohyby Petriho misky.
Takto připravené vzorky byly
kultivovány 7 dní při teplotě 25 °C. Po třech dnech byl odečten počet vyrostlých kolonií (cfu – colony forming units). Z neopracovaného vzorku by mělo teoreticky vrůst stejný počet kolonií, jako byl na počátku počet spór. Z referenčních vzorků bylo přesto spočítáno přibližně 40% z možných vyrostlých kolonií. Tak se stalo z toho důvodu, že při velikém množství kolonie srůstaly a nebylo je již možné odlišit, dále pak proto, že každá spóra ve skutečnosti nemusí být schopná založit novou kolonii. Na obr. 5 jsou vidět kolonie, vyrostlé po 3-4 dnech při teplotě 25 °C.
obr.5 – vyrostlé kolonie
24
3.5 Opracování vzorků 3.5.1 Experimentální uspořádání Pro sterilizaci bylo použito plazmového reaktoru zobazeného na obr.6. Zařízení se skládalo ze zdroje střídavého proudu (regulačního transformátoru), stejnosměrného proudu, vysokofrekvenčního zdroje, ampérmetru, voltmetru, vysokonapěťového autotransformátoru (účinnost 0,2) a samotného DBD reaktoru se dvěmi elektrodami vzdálenými 0,4 cm (u He 1cm), tak aby mohl vzniknout objemový výboj. Elektrody byly složené z kovové části a z korundových desek, jako dielektrikuum. Schéma obvodu je na obr.7 schéma reaktoru na obr.8.
obr.6 - 1. AC zdroj, 2. AC/DC měnič, 3. voltmetr, 4 ampermetr, 5. HF zdroj, 6.VN autotransformátor, 7.DBD reaktor
obr.7- schéma obvodu
25
obr. 8 – DBD reaktor pro objemový výboj 1. vstup napětí, 2. kovová elektroda, 3. korundová destička, 4. přívod plynu, 5. plastová držátka k uchycení vzorku a ptostor výboje, 6. odvod plynu
Snaha byla dosáhnout co nejhomogenějšího výboje. Bylo použito několik výkonů, podle optimalizace hořícího výboje v argonu, dusíku a heliu. Vzorky byly umístěny mezi elektrody a jemně uchyceny za okraje pod plastové proužky, aby nebylo narušeno proudění plynu mezi elektrodami. Dále byla studována časová závislost pro jednotlivé výkony a doby opracování v plazmatu. Opracování probíhalo v digestoři z důvodu zamezení rozšíření spór do okolí. Reaktor (obr. 9) musel být průběžně čištěn ethanolem,
stejně tak byla opalována pinzeta pro
manipulaci se vzorky (obr. 10). Opracované vzorky byly převezeny do laboratoře ke kultivaci a vyhodnocení.
Z neopracovaných vzorků byly vykultivovány kolonie, které posloužili
k vypočtení referenční hodnoty růstového faktoru: Rϝ₀ = 0.364 . To byla nejvyšší hodnota, kterou jsme průměrně získali z neopracovaných vzorků.
obr.9 – malý plazmoový reaktor
26
obr.10 – vzorek připravený k opracování
3.5.2 Opracování vzorků s plísní 3.5.2.1 Sterilizace vzorků v argonovém plazmatu Pro práci v Argonu jsme použili tři výkony při frekvenci 30 kHz. Čas opracování se měnil od 0 - 240 s. Průtok plynu byl 3.2 l/min. Objem výboje (pro vzdálenost elektrod 0.4 cm, pro plochu horní elekrody 19.62 cm² a pro plochu dolní elektrody 16.81 cm²) byl 7,2 cm³.
graf 1. - závislost růstového faktoru na čase pro tři výkony
27
Již po 20 s opracování vzorku ve výboji v argonu došlo k výraznému snížení růstového faktoru. Pro nejvyšší výkon jeho hodnota klesla po 2 minutách na nulu. Při nižších výkonech klesal růstový faktor pomaleji. Výboj při opracování byl jen jemně filamentní. V průběhu experimentu došlo u několika málo měření k poklesu množství plynu mezi elektrodami, když se i vlivem malé teploty vzorek náhle zkroutil z důvodu nedokonalého vysušení před experimentem. Tabulka použitých hustot výkonů: P[W]
P [mW /cm³ ]
0.6
83.33
1.3
180.6
2.2
305.6 tab 1.
3.5.2.2
Sterilizace v heliovém plazmatu
Pro sterilizaci v heliu jsme použili také tři druhy výkonů. Vzdálenost elektrod byla zvětšena na 1 cm.
Objem výboje mezi elektrodami byl tedy 18 cm³. Frekvence byla
optimalizována na 50 kHz. Průtok plynu byl 2.0 l/min. Výboj byl homogenní.
graf 2. - závislost růstového faktoru na čase pro tři výkony
28
Po opracování v heliovém plazmatu došlo rovněž k rychlému zmenšení hodnoty růstového faktoru. Nejlépe znovu vyšla křivka pro nejvyšší výkon, kdy po 2 minutách nevyrostly žádné klonie v Petriho miskách po kultivaci. Při výkonu 5.7 W došlo mírnějšímu pádu hodnoty růstového faktoru. Kolem 130 s však již byl na úrovni nejnižšího výkonu a po 180 s i u něho došlo ke 100% účinku. Výboj hořel nejvíce homogenně, na vzorku v průběhu a zejména po opracování však byly patrné lokálně vypálené dírky. Tabulka použitých výkonů:
P[W]
P [mW /cm³ ]
1.6
88.89
5.7
316.7
9.3
516.7 tab 2.
3.5.2.3
Sterilizace v dusíkovém plazmatu
Pro Dusík byl použit jeden výkon, při frekvenci 30 kHz. Vzdálenost elektrod byla 0.4 cm, průtok plynu 3.6 l/min. Objem výboje byl 7.2 cm³. Čas byl tentokrát měřen v intervalu 0 – 180 s.
graf 3. -závislot růstového faktoru pro použitý výkon
29
Opět můžeme vyčíst vysokou účinnost dusíkového plazmatu. Vzorky opracované při 150 s a 180s byly kompletně sterilizované. Výboj hořel nejvíce filamentně ze všech tří plynů.
Použitá hustota výkonu: P[W]
P [mW /cm³ ]
7.8
1083 tab 3.
3.5.2.4
Srovnání výsledků sterilizace pro různé pracovní plyny
graf 4. - srovnání výsledků pro pracovní plyny a nejvyšší použité výkony
V graf.4 jsou vyneseny růstové faktory pro nejvyšší výkony pro tři plyny. Při použití všech plynů docházelo k významnému úbytku vyrostlých kolonií. U Argonu je zajímavý až čtyřikrát nižší výkon, než u helia a dusíku, se srovnatelnými výsledky s těmito plyny. Už po 20 s opracování klesl růstový faktor na 13.7% původní hodnoty. Při expozičních dobách vyšších než 150 s nevyrostly na vzorcích, opracovaných ve všech plazmatech, v Petriho miskách žádné kolonie.
30
3.5.3
Opracování vzorků papíru - Vliv na kolorimetrické vlastnosti
Podmínky při ozařování papíru jsme zvolili stejné, jako při práci s plísněmi. Použili jsme také stejný papír, na jakém byly kultivovány plísně, tedy Whatman no.1.
Byly
proměřeny závislosti změn bělosti a žlutosti papíru na výkonech a časech opracování. Každá hodnota bělosti i žlutosti odpovídala průměru z pěti měření v různých místech papíru, protože díky určité nehomogenitě ve výbojích mohlo dojít k lokálnímu neozáření vzorku. V grafech jsou uvedeny reálné hodnoty bělosti a žlutosti, u srovnání vlivů na vlastnosti papíru pro různé plyny jsou vyneseny odchylky od referenčních hodnot.
3.5.3.1 Opracování papíru v argonovém plazmatu Průtok plynu byl zvolen na 3.2 l/min, frekvence 30 kHz.
graf 5. - Závislost bělosti papíru na době opracování při použitých výkonech
31
graf 6. - Závislost žlutosti papíru na době opracování při použitých výkonech
V následující tabulce jsou uvedeny změny obou parametrů po 240 s opracování:
P[W]
∆WHT[W]
∆YEL[Yd]
∆%WHT
∆%YEL
0.6
-3.87
+1.85
-4.36
+250
1.3
-4.53
+2.03
-5.10
+274
2.2
-7.24
+2.34
-8.15
+316 tab 4.
Nejvíce se tedy zmenšila bělost o -8.15 % a zvětšila žlutost o +316 % při nejvyšším výkonu 2.2 W. Rychlost snížení bělosti a zvýšení žlutosti roste s použitým výkonem a dobou opracování.
3.5.3.2
Opracování papíru v heliovém plazmatu
Průtok plynu byl zvolen na 2 l/min, frekvence 50 kHz. V grafech 7. a 8. jsou vyneseny závislosti bělosti a žlutosti na použitém výkonu při různých výkonech. Po 240 s opracování se zmenšila bělost o -4.90 % a žlutost se zvětšila o +61.0 % při
32
nejvyšším výkonu 9.3 W. Křivky klesají (resp. stoupají) podobně jako v argonovém plazmatu.
graf. 7 – Závislost bělosti papíru na době opracování při použitých výkonech
graf 8. - Závislost žlutosti papíru na době opracování při použitých výkonech
Změny kolorimetrických hodnot jsou uvedeny v tab.5 :
P[W]
∆WHT[W]
∆YEL[Yd]
∆%WHT
∆%YEL
1.9
-1.06
+0.66
-1.13
+42.9
4.0
-2.13
+0.88
-2.26
+57.1
9.3
-4.61
+0.93
-4.90
+61.0 tab. 5
33
3.5.3.3
Opracování papíru v dusíkovém plazmatu
Průtok plynu byl zvolen 3.6 l/min, frekvence 30 kHz.
graf 9. - Závislost bělosti papíru na době opracování při použitém výkonu
graf 10. - Závislost žlutosti papíru na době opracování při použitém výkonu
Změny kolorimetrických hodnot jsou uvedeny v tab.6 :
P[W]
∆WHT[W]
∆YEL[Yd]
∆%WHT
∆%YEL
7.8
-4.41
+2.27
-4.73
+268 tab 6.
Hodnota změny bělosti je nízká (-4.73%), žlutost papíru se zvýšila po 240 s o +268 %.
34
3.5.3.4
Srovnání výsledků vlivu na kolorimetrické změny papíru pro různé pracovní plyny
graf 11. - Změna bělosti papíru pro všechny pracovní plyny (odečteno od referenční hodnoty) a pro nejvyšší hodnoty výkonu
graf 12. - Změna bělosti papíru pro všechny pracovní plyny (odečteno od referenční hodnoty) a pro nejvyšší hodnoty výkonu
35
Změny kolorimetrických hodnot jsou uvedeny v tab.7 :
Plyn
P[W]
%∆WHT
%∆YEL
Argon
2.2
-4.73
316.0
Helium
9.3
-4.90
61.1
Dusík
7.8
-8.15
268.0 tab 7.
Změna bělosti u všech plynů byla zanedbatelná, změna žlutosti však byla výrazná vzhledem k počátečním hodnotám, největší při použití argonu – zvětšila se o 316 %, u dusíku o 268 % a u helia došlo k navýšení o 61.1 %. Druh plynu, doba opracování a hodnota výkonu měla vliv na barevné změny papíru.
3.5.4
Opracování vzorků papíru – vliv na strukturu papíru
Papír Whatman neobsahuje žádná aditiva, proto můžeme studovat přímý vliv plazmatu na vlastnosti papíru, jako vzhled nebo drsnost, které mohou být způsobeny např. účinky tzv. leptání nebo tzv. rozprašování z povrchu vzorku [13] Snímky pořídili Mgr. M. Hlozek (technicke muzeum brno), Ing. D. Janova (VUT v Brne -FSI).
Na obr.11 ze SEM můžeme vidět neopracovaný referenční vzorek papíru
Whatman no.1 :
obr. 11 – struktura vláken neopracovaného vzorku papíru je neporušená, póry jsou původní.
36
3.5.4.1
Vliv plazmatu na strukturu papíru – Ar
Všechny snímky byly pořízeny ze stejných vzorků papíru Whatman, u jakých byly studovány kolorimetrické vlastnosti. Zvětšení mikroskopu je uvedeno v obrázkách ve stavové liště.
obr.12 – Argon, doba opracování: 60s, výkon: 2.2W
obr.13 – Argon, doba opracování: 240s, výkon: 2.2W
Slabší vlákna jsou rozbombardována a roztrhána radikály. Makroskopická změna povrchu papíru nebyla patrná. 37
3.5.4.2
Vliv plazmatu na strukturu papíru - He
Na obrázcích ze SEM lze vidět účinky na filtrační papír, při daném výkonu. Při opracování v objemovém výboji může dojít k poškození substrátu z důvodu kolmého hoření streamerů a vysokého výkonu. Takto se například vytvořilo děrování při expozici vzorků v heliovém plazmatu:
obr. 14 – Helium, doba opracování: 240 s, výkon: 9.3 W – Patrné jsou vypálené díry o průměru přibližně 100 μm
obr. 15 – Přiblížená vypálená díra- Helium, doba opracování 240 s, výkon 9.3 W
38
obr. 16 – Vypálený okraj díry, doba opracování 240 s, výkon 9.3 W
obr. 17 – Přiblížený okraj díry, doba opracování 240 s, výkon 9.3W
Heliové plazma výrazně ovlivňovalo strukturu papíru. Na obrázcích lze vidět dírky o průměru přibližně 100 μm. Okraje jsou vypálené výbojem po celém obvodu. Povrch vláken je naleptán. Makroskopická změna byla patrná z důvodu přítomnosti děr, zvýšení drsnosti se neprojevilo. 39
3.5.4.3
Vliv plazmatu na strukturu papíru - N2
Dusíkové plazma bylo ke vzorkům nejšetrnější co se týká vlivu na strukturu papíru. Na SEM snímkách je patrné naleptání povrchu vláken, vlákna samotná jsou méně potrhaná než po opracování v předchozích plazmatech. Makroskopická změna nebyla patrná. Streamery tentokrát nepropálily papír.
obr. 18 - Dusík, doba opracování:100 s,, výkon: 7,8 W -Struktura vláken
obr. 19 – Dusík, doba opracování:240 s, výkon: 7,8 W – Naleptaný povrch vláken
40
3.6
Výsledky emisní spektroskopie K optické emisní spektroskopii byl použit Vyhodnocení, měření a popis spekter
provedl Mgr. Jan Čech. Spektrum bylo snímáno přes Pyrexovou skleněnou destičku (stěnu reaktoru) silnou 1mm křemenným optickým vláknem ze vzdálenosti cca 10 cm od osy výboje. Vzhledem k vstupnímu úhlu vlákna +-4,5° bylo optické emisní spektrum snímáno přes celou šířku štěrbiny z oblasti cca 1,5 cm kolem osy výboje. Poloha vlákna byla najustována na maximální intenzitu čáry Ar 763.5 nm. Byla sejmuta přehledová spektra výboje hořícího ve výbojových atmosférách: argon, dusík, helium; v rozsahu vlnových délek 200 – 960 nm. Použitá Pyrexová přepážka způsobuje značný útlum intenzity světla výboje v oblastech pod 300 nm, což znemožňuje diagnostiku výboje v této oblasti. Pro vyhodnocení sejmutých spekter byl použit program Spectrum Analyzer 1.6. Dle identifikovaných spektrálních čar a pásů byla provedena korekce vlnových délek měřeného spektra na skutečnou hodnotu, poté byla použita korekce intenzity získaného spektra na citlivost soustavy optické vlákno-monochromátor-CCD detektor (která byla pro použitou soustavu již dříve experimentálně stanovena). Použitý program umožňoval nejen identifikaci jednotlivých čar a pásů spektra, ale též výpočet rotační teploty z pásu Q1 molekuly OH (čáry 307.84 nm, 308.00 nm, 308.33 nm, 308.52 nm a 308.73 nm) a vibrační teploty z pásu C 3Πu – B3Πg druhého pozitivního systému molekuly N2 (hlavy 0-2 380.49 nm, 1-3 375.54 nm a 2-4 371.05 nm). Získané rotační a vibrační teploty v tab .11: plyn/výkon
Trot [K]
Tvibr [K]
N2 7W
cca 400+-100
2218+-17
He 2,6W
340+-12
X
Ar 0,6W
309+-9
1745+-227
Ar 1,4W
309+-9
2156+-409
Ar 2,1W
322+-9
2258+-417 tab. 8
Rotační teploty jsou relativně nízké a odpovídají těžkým částicím, obsažených v hořícím výboji. 41
3.6.1
Spektrum výboje v argonu
Srovnání spekter plazmatu při výkonech 0,6 W a 2,1 W:
obr. 20 – Emisní spektrum výboje v argonu
Spektrum na obr. 20
je tvořeno výraznými čarami argonu v červené a blízké
infračervené oblasti spektra. Dále pak ze spekter hlavních příměsí - druhého pozitivního systému molekuly dusíku, rotačním spektrem molekuly OH a čarami atomárního kyslíku. Při zvýšení výkonu se charakter spektra zásadním způsobem nezměnil. Došlo k nárustu intenzity příměsových spekter a nárůstu intenzity argonových čar. Nové čáry ani pásy nebyly při zvýšení výkonu pozorovány.
42
3.6.2
Spektrum výboje v heliu
Spektrum výboje při výkonu 4,8 W:
obr. 21 - Emisní spektrum výboje v heliu
Spektrum na obr. 21 je tvořeno výraznými molekulárními pásy ionizované molekuly dusíku a druhého pozitivního systému molekuly dusíku jakožto dominantních nečistot ve výboji, dále pak rotačním spektrem molekuly OH, čarami atomárního kyslíku a slabými čarami Helia.
43
3.6.3 Spektrum výboje v dusíku
Následuje spektrum výboje při výkonu 7 W:
obr 22. - Emisní spektrum výboje v dusíku
Spektrum na obr. 22
je tvořeno molekulárními pásy druhého pozitivního systému
molekuly dusíku. Spektrum v oblasti nad 450 nm bylo již velmi slabé a tvořeno artefakty druhého spektrálního řádu. Přítomnost pásů molekuly NO nebylo možno ověřit, neboť spektrum v oblasti pod 300 nm je utlumeno použitou Pyrexovou přepážkou.
44
KAPITOLA 4
Závěr
45
4.1 Závěr Výsledky sterilizace vzorků s plísněmi dopadly velmi uspokojivě. Určit, zda mohlo být UV záření příčinou inaktivace spór nemůžeme, vzhledem k výsledkům s emisní spektroskopie, kde bylo snímání vlnových délek pod 300 nm
znemožněno použitou
Pyrexovou překážkou. Rotační teploty přibližně odpovídají těžším částicím. Bylo prokázáno, že velikost faktoru přežití je závislá na použitém plynu, výkonu a době opracování. Rychlost sterilizace byla srovnatelná pro všechny tři plyny. Po 150 sekundách a při nejvyšších výkonech nevyrostla ani jedna kolonie po opracování ve všech třech druzích plynu. Při opracování vzorků papíru nedocházelo k výrazným
změnám bělosti. Žlutost
naopak stoupala výrazněji (vzhledem k počátečním hodnotám) pro argon a dusík. Bělost i žlutost závisela také na výkonu, druhu plynu a době opracování. Při opracování v heliovém plazmatu docházelo k propalování
děr o průměru přibližně 100 μm vlivem streamerů,
hořících kolmo k substrátu. Tento jev byl patrný pouhým pohledem na opracovanný papír. U dalších dvou plynů tento jev nenastal. Všechny druhy výbojů měly vliv na mikroskopickou strukturu papíru. Makroskopická změna drsnosti nebyla patrná. Emisní spektra výbojů, buzených v různých plynech, byla použita pro stanovení parametrů plynů. Výsledky tedy ukazují, že atmosférický DBD lze použít pro sterilizaci.
46
Použité zdroje a publikace [1]
M. Laroussi, IEEE Trans. Plasma Sci. 24 (1996) 1188, zdroj http://sciencedirect.com .
[2]
Jan Čech, Využití objemového bariérového výboje pro depozici tenkých ochranných vrstev, Bakalářská práce, KFYZ PřF MU v Brně (2004) .
[3]
J. Buchta: Dielektrické bariérové výboje za atmosférického tlaku a jejich využití v praxi, Disertační práce, KFE PřF MU v Brně (2002), 5-27.
[4]
M. Jaššo: Vliv plazmy na vlastnosti výstružných materiálov používaných pri konstrukcii
plášťov, Projekt disertačnej práce, KpaK FCHPT STU v Bratislavě
(2004), 20-32. [5]
M. Laroussi, M. Laroussi, Bull. Amer. Phys. Soc. Div. Plasma Phys. 40 (1995) 1685. zdroj http://sciencedirect.com .
[6]
M. Laroussi, Low-temperature sterilization using gas plasmas: a review of the experiments and an analysis of the inactivation mechanisms, International Journal of Pharmaceutics 226 (2001) 1–21, zdroj http://sciencedirect.com .
[7]
Upraveno z Görner, F.,Valík, L.:Aplikovaná mikrobiológia poživatín. Malé centrum, Bratislava, 2004, s.528, ISBN 80-967064-9-7.
[8]
Aspergillus niger, dostupné z http://en.wikipedia.org/wiki/Aspergillus
.
[9]
Demnerová, K., a kol.: Laboratorní cvičení z mikrobiologie 3. vyd., Vysoká škola Chemicko - Technologická v Praze, Praha, 2001, s.87-91, ISBN 80-7080-415-7.
[10]
Vlastnosti papíru Whatman,dostupné z http://www.handprint.com.
[11]
J.Janča, L. and A., Plasma Chemistry and Plasma Processing, Vol. 13, No. 3, 1993.
[12]
Jitka Vrajová, Úpravy papíru v plazmatu, Diplomová práce, VUT v Brně, Fakulta Chemická (2005) 47
[13]
Optická emisní spektroskopie, dostupné z http://atrey.karlin.mff.cuni.cz.
48
