MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE
VLIV STRUKTURY MUTANTNÍCH PROTEINŮ P53 NA ONKOGENNÍ CHOVÁNÍ IN VIVO Bakalářská práce
Alena Polášková
Vedoucí práce: Mgr. Marie Brázdová PhD.
Brno 2012
Bibliografický záznam Autor:
Název práce:
Alena Polášková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Ústav biochemie Vliv struktury mutantních proteinů p53 na onkogenní chování in vivo
Studijní program:
Biochemie
Studijní obor:
Biochemie
Vedoucí práce:
Mgr. Marie Brázdová PhD.
Akademický rok:
2011/2012
Počet stran:
46
Klíčová slova:
standardní p53; mutantní p53; struktura; konformace; zisk funkce; TP53;
Bibliographic Entry Author
Title of Thesis:
Alena Polášková Faculty of Science, Masaryk University, Department of biochemistry Influence of mutant p53 conformation on oncogenic function in vivo
Degree programme:
Biochemistry
Field of Study:
Biochemistry
Supervisor:
Mgr. Marie Brázdová PhD.
Academic Year:
2011/2012
Number of Pages:
46
Keyword:
wild-type p53; mutant p53; structure; conformation; gain of function; TP53;
Abstrakt Protein p53 je nádorový supresor, účastnící se regulace buněčného cyklu a prevence nádorového bujení. U více než 50 % lidských maligních nádorů dochází k mutaci genu TP53. Onkologicky významné mutanty p53 nejen, že ztrácejí funkce standardního proteinu p53, ale navíc získávají nové onkogenní vlastnosti. Exprese mutantní p53 obvyklá u lidských nádorů je například spojena se zvýšenou rezistencí k chemoa radioterapii. Pro strukturu a funkci tohoto proteinu je nezbytný atom zinku, který pomáhá stabilizovat strukturu standardního proteinu tedy konformace schopnou vazby na DNA. Mutantní proteiny se obecně dělí na dvě skupiny na konformační proteiny, které mají výrazně změněnou standardní konformaci na mutantní a kontaktní, kde mutace odpovídá aminokyselině, která se přímo účastní vazby na DNA. V nedávné době bylo ukázáno u několika nádorových linií, že zinek může výrazným způsobem podporovat reaktivaci mutantní p53. V této bakalářské práci se věnujeme vlivu mutace TP53 u zinečnatých iontů na konformaci proteinu, transaktivaci a onkogenní chování u glioblastomových linií. Jako modelový systém nám právě sloužili tyto linie s různou mutací v genu pro p53. Standardní a mutantní konformace je zkoumána pomocí imunoprecipitačních metod. Vliv změny konformace na onkogenní chování je zkoumán in vivo pomocí technik buněčného přežívání a schopnosti tvořit kolonie v měkkém agaru.
Abstract Protein p53 is tumor suppressor, which takes part in regulation cell cycle and prevention of tumor proliferation. Mutation in gene TP53 occurs in more than 50 % human malignant tumors. Significant cancer p53 mutants not only have lost of function wild – type p53, but also some of them have gained new oncogenic properties. Expression of mutant p53 common in human cancer is associated with e.g. increased resistance to chemo- and radiotherapy. For the structure and function of this protein is required zinc atom that helps stabilize the structure of wild – type protein capable of binding to DNA. Mutant proteins are commonly divided into two categories on the structural proteins, which have markedly changed the conformation form wild – type to mutant and the contact proteins, which correspond to amino acid mutation, which is directly involved in DNA binding. Recently has been shown in several tumor lines that zinc can significantly support the reactivation of mutant p53. In this thesis we focus on the influence of p53 mutation and zinc ion on protein conformation, p53 transactivation function and oncogenic behaviour in glioblastoma cell lines with different mutations in the gene for p53. Wild – type and mutant conformation are investigated with immunoprecipitation methods. Effect of conformational changes on oncogenic behaviour is studied in vivo using methods of cell survival and capability to form colonies in soft agar.
Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat svojí vedoucí Mgr. Marii Brázdové PhD. za vedení, podporu, ochotu a trpělivost při vypracování experimentální části a celému laboratornímu kolektivu za občasnou pomoc. Tato práce byla podpořena z projektu r.č. P301/10/2370 "Úloha strukturně selektivní vazby proteinu p53 k DNA u nádorů mozku" Grantové agentury ČR.
Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.
Brno 7. května 2012
……………………………… Alena Polášková
Obsah 1
Úvod ........................................................................................................................... 3 1.1
1.1.1
N-koncová část .............................................................................................. 6
1.1.2
Centrální část ................................................................................................. 6
1.1.3
C-koncová část............................................................................................... 7
1.2
3
Struktura mutp53 ................................................................................................. 8
1.2.1
Mutanti v centrální oblasti ............................................................................. 8
1.2.2
Mutanti v C-koncové oblasti ......................................................................... 9
1.3
2
Standardní p53 ..................................................................................................... 3
Konformace p53 .................................................................................................. 9
1.3.1
Standardní konformace p53 ......................................................................... 10
1.3.2
Mutantní konformace ................................................................................... 11
1.4
Vliv konformace p53 na onkogenní chování ..................................................... 12
1.5
Cíle bakalářské práce ......................................................................................... 14
Materiál ................................................................................................................... 15 2.1
Použité přístroje ................................................................................................. 15
2.2
Použité chemikálie ............................................................................................. 15
2.3
Složení používaných roztoků............................................................................. 16
2.4
Použité linie p53 ................................................................................................ 17
Metody ..................................................................................................................... 18 3.1
Spektrofotometrické stanovení koncentrace proteinů v UV oblasti .................. 18
3.2
Stanovení koncentrace proteinů dle Bradfordové ............................................. 18
3.3
Sklízení buněk ................................................................................................... 18
3.4
Lýze buněk ........................................................................................................ 18
3.5
Imunoprecipitace ............................................................................................... 18
3.6
Separace proteinů na SDS-PAGE...................................................................... 19
3.7
Western-blott přenos.......................................................................................... 19
3.8
Imunodetekce a vizualizace na LAS 3000 ........................................................ 20
3.9
Tvorba kolonií v měkkém agaru ........................................................................ 20
3.10 Transfekce buněk ............................................................................................... 20 3.11 Měření Luciferázy ............................................................................................. 21 4
Výsledky .................................................................................................................. 22 4.1
Detekce konformace mutp53 v glioblastomových liniích ................................. 22 1
4.2
Vliv exprese mutantního proteinu p53 na tvorbu kolonií v měkkém agaru ...... 24
4.3
Vliv mutace a konformace proteinu p53 na transaktivaci promotoru p21 pomocí luciferázového reporterového systému .............................................................. 25
4.4
Vliv konformace p53 na buněčné přežívání ...................................................... 27
5
Diskuse ..................................................................................................................... 31
6
Závěr ........................................................................................................................ 33
7
Použitá literatura .................................................................................................... 34
8
Seznam zkratek....................................................................................................... 39
2
1 Úvod TP53 je jeden z nejčastěji mutovaných genů u rakoviny, na http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ můžeme najít přes 60 000 článků a díky tomu je to taky jeden z nejlépe prostudovaných genů v historii rakovinného výzkumu. Protein p53 byl objeven v roce 1979 [1] a klasifikován jako onkogen, kvůli jeho vlastnosti imortalizovat buňky a plně transformovat buňky po přidání onkogenu Ras [2]. Na druhou stranu tomuto oponovaly výsledky jiného týmu, kde p53 vykazoval opačné vlastnosti – nádorově supresorové. Vysvětlení bylo v podstatě jednoduché. Ve dvou různých laboratořích se pracovalo se dvěma různými genomovými klony cDNA p53. V laboratoři Dr. Levina se pracovalo s klonem cDNA wtp53 a Dr. Orenova laboratoř pracovala s genomovým klonem cDNA mutp53. Dále bylo zjištěno, že tyto dva genomové klony cDNA se liší mutací odpovídající kodonu 135 (záměna valinu za alanin). Díky usilovné práci mnoha laboratoří byl protein p53 překlasifikován na nádorový supresor v roce 1989 [3].
1.1 Standardní p53 Nádorový supresorový protein p53 (wild – type wtp53) je transkripční faktor, jehož hladina v buňce je udržována na velmi nízké úrovni, díky neustálé syntéze a degradaci. Podléhá přísné regulaci, jak je patrné také z velmi krátkého poločasu – okolo 6 až 30 minut (záleží na typu tkáně). Rozmanité stresové signály (jako např. poškození DNA, hypoxie, aktivace onkogenem, nedostatek nukleotidů, ionizující a UV ozáření) aktivují protein p53, což v důsledku vede k zastavení buněčného cyklu, opravě DNA, uvedení buňky do stavu senescence (trvalé převedení do fáze G0) a nebo apoptóze (obr. č. 1) [4]. Tato aktivace je realizována pomocí modifikace proteinu – fosforylací, defosforylací, ubikvitinací, acetylací, methylací, sumoylyzací, nedylací, glykosylací a ribosylací [5], [6]. Modifikace přispívá ke stabilizaci p53 a translokaci do jádra. Při stresu následujícím po poškození DNA, se aktivují specifické kinázy jako ATM, ATR, Chk1 a Chk2 a právě ty fosforylují cílová místa na p53 jako jsou Ser15, Thr18 a Ser20, čímž dojde k odtrhnutí p53 z komplexu MDM2 – p53. Protein p53 se funkčně váže jako tetramer na sekvenčně specifickou sekvenci DNA a transaktivuje cílové geny (např. p21, MDM2, bax, puma atd.) [7], [8]. Tento protein p53 bývá označován jako strážce genomu [9] a to nejenom díky funkci transkripčního faktoru. p53 totiž aktivuje jak závislé, tak i nezávislé dráhy apoptózy, dále se může nespecificky vázat C-koncem na DNA a účastnit se tak zachování integrity a stability DNA.
3
Obrázek č. 1: Síť aktivace a působení proteinu p53. Převzato a upraveno dle výukových přednášek MU prof. J. Šmardové, 2010
Jak už bylo zmíněno výše, za fyziologických podmínek je koncentrace p53 v buňkách velmi malá, protože se na transaktivační doménu (TAD) tohoto protein váže MDM2 [10], čímž inhibuje jeho transaktivační funkci blokováním získávání nutných transaktivačních komponent. MDM2 je E3 ubikvitin ligáza, která přenáší ubikvitin na p53 a takto označený protein je degradován v proteazomu (obr. č. 2) [11]. V odpovědi na stresové signály je inaktivní p53 v komplexu s MDM2 mobilizován prostřednictvím několika mechanismů: stresově indukovanými post-translačními modifikacemi obou proteinů [12] (znemožněna interakce MDM2 – p53); dále onkogenem indukované zablokování MDM2 nádorovým supresorem ARF [13] a v neposlední řadě jaderným stresem. Ten vyvolá ribosomální protein, který váže a inhibuje MDM2 – zprostředkovanou ubikvitinylaci p53 [14]. P53 sám také kontroluje funkci MDM2, aktivací transkripce genu MDM2, tvořící tak negativní zpětnovazebnou smyčku [15]. Podobnou funkci jako MDM2 má jeho blízký homolog MDM4, který také reguluje funkci p53 vazbou na jeho TAD doménu, ale na rozdíl od MDM2 nemůže ubikvitinovat p53 přímo [16]. Regulace p53 se účastní ještě několik dalších molekul jako je Pirh2, Parc a p14ARF. Například Pirh2 se váže na DNA vazebnou doménu a podporuje degradaci p53, zatímco Parc fixuje p53 v cytoplazmě, bránící mu tak ve vstupu do jádra, čímž potlačuje jeho transkripční aktivitu [17]. 4
Obrázek č. 2: p53 – MDM2 autoregulační smyčka. Protein MDM2 váže p53 a inaktivuje ho přinejmenším dvěma odlišnými mechanismy: fyzickou blokací transkripční aktivity p53 a podporou ubikvitinace p53 a následnou proteazomální degradací. Obdobně, p53 se může vázat na p53 vazebná místa uvnitř promotoru mdm2 genu a pozitivně regulovat expresi MDM2. Upraveno dle Moshe Oren, 2003.
Gen TP53 je lokalizován na chromozomu 17, přesněji řečeno na krátkém raménku tohoto chromozomu 17p13 [18] a kóduje 393 aminokyselin. Jedná se o DNA vazebný protein, který bývá nejčastěji rozdělován do 3 hlavních částí. První je N-koncová část dále centrální část a nakonec C-koncová část (obr. č. 3).
Obrázek č.3: Struktura proteinu p53. 53 kDa jaderný fosfoprotein p53, skládající se z 393 aminokyselin, zahrnuje několik domén včetně kyselé N-koncové oblasti obsahující transaktivační doménu, centrální část obsahující sekvenčně specifickou DNA vazebnou doménu a C-konec (tetramerizační a bazická DNA vazebná doména). Upraveno dle Anzola a Burgos, 2003. 5
1.1.1 N-koncová část N-koncová část zahrnuje dvě transaktivační domény TAD1 a TAD2, které můžeme najít mezi aminokyselinami 20 – 40 [19] a 40 – 60 [20] (obr. č. 3). Dále tato N-koncová část zahrnuje doménu bohatou na prolin – aminokyseliny 62 – 90, o které bylo původně předpokládáno, že se účastní protein – proteinových interakcí na základě přítomnosti SH3 vazebného motivu (PxxP). Tato doména se účastní regulace apoptózy zprostředkované proteinem p53 [21]. Aminokyselinové zbytky 80 – 93 v oblasti bohaté na prolin zahrnují negativní autoregulační doménu. Odstranění této domény zvyšuje schopnost p53 vázat se sekvenčně specificky k DNA proteinem p53 [22]. N-konec je vysoce post-translačně modifikován [23], zejména fosforylace této oblasti je důležitá pro stabilitu proteinu i výběr transkripce cílových genů [24]. Jak bylo zmíněno již dříve v souvislosti s aktivací p53 (kapitola 1.1).
1.1.2 Centrální část Centrální doména (CD), nebo také DNA - vazebná doména (DBD) obsahuje aminokyselinové zbytky 100 – 300 (obr. č. 3), která je zodpovědná za sekvenčně specifickou vazbu p53 k cílovým místům (responsivní elementy, p53CON). K této doméně je koordinován dvojmocný atom zinku pomocí tří cysteinů (Cys176, Cys238 a Cys242) a jednoho histidinu His179 [25] (obr. č. 4), nutný pro správnou konformaci i funkci proteinu. Většina mutací TP53 spojených s rakovinou jsou bodové mutace měnící smysl kodonu (,,missence― mutace) právě v této doméně. Tyto mutace tím poukazují na důležitost vazby p53 na DNA při nádorové supresi. Krystalová struktura této oblasti nám ukazuje, že centrální doména se skládá z β – sendvičového lešení a DNA vazebného povrchu zahrnující smyčka – list – šroubovice (LSH) motiv a dvě smyčky (L2 a L3) svázané atomem zinku [26] (obr. č. 4).
6
Obrázek č. 4: Znázornění centrální domény p53, sekundární struktura elementů p53. β-řetězce (S), α-helixy (H), tři smyčky (L) a atom zinku (Zn) jsou vyznačeny barevně. Tři cysteiny a histidin podílející se na vazbě Zn jsou zvýrazněny. Oblast dvou β-listů, které tvoří β-sendvič jsou na pozadí šedě. Konzervované oblasti v centrální doméně jsou vybarveny žlutě (II), modře (III), červeně (IV) a růžově (V), (shodné jako v obr. č. 5). Převzato a upraveno dle Monique, van Oijen a Slootweg; 2000.
1.1.3 C-koncová část Tato část zahrnuje dvě domény, tetramerizační a bazickou doménu (obr. č. 3). Tetramerizační nebo také oligomerizační doména se nachází mezi aminokyselinami 323 – 358. Doména je zodpovědná za převážně tetramerní uspořádání proteinu p53 při vazbě na DNA. Struktura tetramerizační domény je tvořena dimerem dimerů, které se vážou stejným způsobem, čímž tvoří konečný tetramer. Na C-konci je sekvence označována jako jaderný exportní signál (NES) mezi aminokyselinovými zbytky 340 – 351 a ten může vyžadovat ubikvitinaci pro plné své využití [27]. Navíc dominantní jaderný lokalizační signál (NLSI), aminokyseliny 316 – 325, překrývá tetramerizační doménu [28]. Pro vytvoření tetrameru p53 je nutná přítomnost většího hydrofobního postranního řetězce spíše na zbytku 341 než 344; převrácením tohoto poměru vznikají mutanti, kteří jsou schopni tvořit pouze dimery. Vysoce bazická doména (bohatá na lysin) lokalizovaná mezi zbytky 363 – 393 je sama schopna interagovat s DNA sekvenčně nespecifickým způsobem [29]. V této doméně se nachází dva menší jaderné lokalizační signály (NLSs) [30], které obsahují 7
hodně ubikvitinovaných míst [31]. Nachází se zde také místa pro stresem indukované modifikace, zahrnujících fosforylaci, acetylaci a glykosylaci [23].
1.2 Struktura mutp53 První mutace genu TP53 spojené s rakovinou byly poprvé zmíněny v roce 1989 [32]. Vzhledem k funkci standardního p53 při poškození DNA (spuštění reparačních mechanismů, navození apoptózy) je logické, že funkce tohoto proteinu je nejvíce ohrožena v nádorových buňkách, které samozřejmě chtějí zlikvidovat nádorový supresor p53. Somatické mutace TP53 se vyskytují u přibližně poloviny typů lidských rakovin a tvoří základní kámen tumorigeneze [33]. Výskyt TP53 mutací se značně liší mezi jednotlivými druhy nádorů, v rozmezí od 10% u hematopoetických nádorů [34], od 50 – 70% u kolorektálního karcinomu [35], rakoviny vaječníků [36], hlavy a krku [37]. Zatímco somatické mutace TP53 přispívají k výskytu ojedinělých nádorů, mutace v zárodečné linii TP53 způsobují predispozice k vzácnému typu rakoviny známému jako Li – Fraumeni Syndrom (LFS) [38] (vzácné autosomálně dominantní dědičné onemocnění, při kterém v relativně nízkém věku dochází k výskytu různých druhů tumorů). Nádory obsahující mutantní proteiny p53 bývají agresivní a velmi často rezistentní vůči ozařování a chemoterapii. Toho se využívá při vývoji nových léčiv, které jsou konstruovány tak, aby dokázaly obnovit funkci standardní p53. Mutantní p53 tak představuje jedno z nejdůležitějších cílových míst pro protinádorová léčiva.
1.2.1 Mutanti v centrální oblasti Ze všech mutací se jich 97% nachází v exonech v oblasti odpovídající centrální části proteinu v DNA vazebné doméně [39]. Navíc 75% z těchto mutací se vyskytuje jako jednotlivé bodové mutace měnící smysl kodonu (,,missence― mutace) častěji než delece, inzerce nebo porucha čtecího rámce. To znamená, že mutantní protein p53 je převážně protein o plné délce se záměnou jedné aminokyseliny v centrální části proteinu. Mutace, které se tu vyskytují, mohou ale i nemusí narušovat stabilitu proteinu či znemožňovat vazbu k DNA. Místa, kde se mutace vyskytují s nejvyšší frekvencí, jsou mutovaná místa TP53 odpovídající kodonům 175, 245, 248, 249, 273 a 282 (obr. č. 5), ty jsou označovány jako „hot spot― [33]. Tyto mutantní proteiny mohou být rozděleny na dvě skupiny, podle vlivu na termodynamickou stabilitu proteinu p53 [26], na takzvané kontaktní mutanty (R248 a R273) a strukturní mutanty (R175, G245, R249 a R282). První skupina zahrnuje mutace aminokyselin přímo zasahujících do vazby DNA, druhá skupina mutací způsobuje buď lokální (R249, G245) nebo globální (R175, R282) konformační deformace [33]. Většina TP53 mutací pozorovaných u lidských typů rakovin ruší sekvenčně specifickou DNA vazebnou aktivitu k p53 responsivním elementům [40]. 8
Obrázek č. 5: Frekvence a rozmístění mutací p53. p53 je protein o velikosti 393 aminokyselinových zbytků, který obsahuje N-koncovou TAD, SH3 doménu bohatou na prolin, DBD, tetramerizační doménu a C-koncovou regulační doménu. Pět míst značených římskými číslicemi znázorňuje oblasti s nejvíce konzervovanou sekvencí, z nichž se čtyři nachází v centrální doméně. Histogram ,,missence― mutací proteinu p53 ukazuje, že 95% mutací se vyskytuje v centrální doméně; šest vyznačených zbytků jsou ,,hot spot― mutace. Převzato a upraveno dle Bullock a Ferhst; 2001.
1.2.2 Mutanti v C-koncové oblasti Mutace v této oblasti nejsou příliš časté u nádorů, možná proto, že nejdříve byly sekvenovány pouze exony odpovídající centrální doméně nebo spíše proto, že nejsou pro nádor dostatečně výhodné, jako právě mutace v DBD. Podíváme-li se na mutace v tetramerizační doméně, mohou způsobit tetramerní nestabilitu [41], nebo mohou vést až k celkové ztrátě tetramerního uspořádání [42]. Mutace R337H je spojena s adrenokortikálním karcinomem u dětí na jihu Brazílie [43] a způsobuje náchylnost k různému spektru nádorů [44]. Dále rozrušuje vnitřní solný můstek mezi aminokyselinami 333 a 349, což ve výsledku znamená narušení tetramerního uspořádání. Přibližně 20 % ze všech zárodečných mutací genu TP53, má mutaci v kodonu 337, zatímco frekvence somatických nádorových mutací v této oblasti je velmi nízká [45].
1.3 Konformace p53 Rozlišujeme mezi standardním a mutantním proteinem p53, a dále hovoříme o dvou různých typech konformace. Za prvé je to standardní konformace, kterou reprezentuje wtp53, a za druhé se jedná o mutantní konformaci. Tyto různé konformace lze od sebe
9
odlišit pomocí dvou protilátek – PAb1620 a PAb240 (obr. č. 6), respektive i PAb246. Protilátka DO1 zachycuje všechny typy proteinu p53 na N – konci.
Obrázek č. 6: Model pro konformaci p53: N a C-konec proteinu p53 jsou velmi dostupné a zobrazují se na povrchu proteinu. Obsahují imunodominantní oblasti. Centrální část je spíše celistvá a dovoluje vytvoření epitopu pro PAb1620, ale epitop pro PAb240 je skrytý. Přítomnost specifické mutace nebo částečná denaturace proteinu p53 zničí epitop pro PAb1620, ale na druhou stranu se odkryje epitop pro PAb240 v centrální části proteinu. Převzato a upraveno dle http://p53.free.fr/our_work/structure.html [46]
1.3.1 Standardní konformace p53 Jak už bylo zmíněno, tato konformace je rozeznávána pomocí několika protilátek, např. pomocí PAb1620 (váže i lidský p53) a PAb246 (váže pouze myší p53), které jsou specifické pouze pro tuto konformaci [47] a neváží se na denaturovaný protein, tj. protein s mutantní konformací (obr. č. 7). Kromě toho, že tuto konformaci zaujímá wtp53, se tato konformace dá nalézt u tzv. kontaktních mutantů R273H a R248W (obr. č. 8). U těchto mutantů jsou vyměněny aminokyseliny účastnící se kontaktu s DNA, které ale nijak nepřispívají ke konformaci a tím pádem výměna jedné aminokyseliny za druhou (např. R H) neovlivní konformaci, ale pouze vazbu na DNA, ke které potom nedochází.
10
1.3.2 Mutantní konformace Tato konformace je rozeznávána pomocí protilátky PAb240, která rozeznává denaturovanou (obr. č. 6) nebo-li mutantní konformaci p53 [48]. Epitop pro tuto protilátku se nachází na řetězci S7 (obr. č. 7), který je při nativní konformaci skryt. Tuto konformaci zaujímají tzv. strukturní mutanti R175H, R282W, R248Q, R249S a G245S (obr. č. 8), kteří opět znemožňují vazbu DNA a navíc destabilizují DBD p53, čímž dojde k jeho denaturaci [49]. Mutanti G245S a R249S se nachází ve smyčce L3 (obr. č. 4). R249S se vyskytuje převážně u hepatocelulárního karcinomu ve východní Asii a subsaharské Africe (tumorigeneze má spojitost s expozicí aflatoxinu B1, kterým je v těchto regionech běžně kontaminována potrava). R175H je nejběžnější mutace ve smyčce L2. Zdá se, že hlavní efekt této mutace spočívá v tom, že zavedením objemnějšího histidinového zbytku dojde ke strukturním deformacím a také může přímo interferovat s iontem zinku. R282W (nachází se ve šroubovici H2, obr. č. 4) způsobuje různé strukturní odchylky ve vazebném motivu smyčka - list - šroubovice, ale celkově to nemá příliš dopad na CD. Shrnuto v [50].
Obrázek č. 7: 3D umístění epitopů. Epitopy pro protilátky PAb1620, PAb246 a PAb240 jsou označeny modře, červeně a fialově; C a N-konec centrální domény (aminokyselinové zbytky 97 a 289) jsou zeleně a světle modře; DNA je světle šedě a zinek je tmavě šedá koule. Převzato a upraveno dle Wang et al., 2001.
11
Obrázek č. 8: Konformační model p53. Standardní p53 má velmi celistvou konformaci, která je rozpoznávána PAb1620. Přítomnost mutací indukovaného rozvolnění této struktury, která inaktivuje epitop pro PAb1620, poskytne zpřístupnění epitopu pro PAb240. Upraveno dle http://p53.free.fr/our_work/structure.html [46]
1.4 Vliv konformace p53 na onkogenní chování Je závažným faktem, že nádory s mutací v genu TP53 bývají rezistentní k apoptóze a cytostatikům. Navíc tyto mutace jsou obvykle následovány ztrátou heterozygozity (LOH) během nádorového vývoje, což znamená, že dojde selektivně k inaktivaci zbývající standardní alely [33]. K tomu dochází pomocí heterooligomerizace mutantního proteinu se standardním typem p53 [51–53]. Na vznik a propagaci nádoru má vliv inaktivace nádorového supresoru (obr. č. 9, zelená část), především na proliferaci a angiogenezi. V současné době je největší důraz kladen na zisk nových onkogenních vlastností (GOF). Jedním z mechanismů GOF je transaktivace/represe genů, jejichž exprese není za normálních okolností regulována wtp53 (BFGF, EGFR, HSP70), ale i těch, u kterých wtp53 má naprosto opačný efekt (např. C-Myc – wtp53 ho potlačuje, naopak mtp53 ho aktivuje) [33], [54]. Dalším mechanismem je ovlivnění strukturně specifické vazby na DNA (obr. č. 9, tmavě modrá část). V neposlední řadě je to schopnost běžných mutp53 vázat a inaktivovat členy rodiny p53: p63 a p73 (obr. č. 9, žlutá oblast) [55], [56], jejichž transaktivační izoformy inhibují tvorbu metastáz a zvyšují senzitivitu pro radiochemoterapii [57], [58]. Analýza genomové DNA vazby ukazuje, že například mutant G245S interaguje s ne-B-DNA konformacemi (DNA triplexy, kvadruplexy, křížové struktury [59]). 12
Buněčná lokalizace mutp53 je dalším parametrem určujícím jeho onkogenní vlastnosti. Ve většině případů se mutp53 obvykle akumuluje v jádře rakovinných buněk, v některých případech se nachází v cytoplazmě. Závisí to na typu mutantu, buněčném kontextu a rozmanitosti stresových signálů, které určují lokalizaci p53 [33].
Obrázek č. 9: Vybrané onkogenní vlastnosti mutantní p53 a jejich základní mechanismy. Vnitřní kruh (vybarven světle modře) reprezentuje onkogenní fenotypy spojené s činností mutantních proteinů p53. Vnější kruh znázorňuje mechanické vlastnosti mutantních p53, které jsou základem fenotypového seznamu ve vnitřním kruhu. Každý fenotypový efekt může být přisouzen k téměř jakékoliv mechanické vlastnosti; tudíž vnitřní modrý kruh může volně rotovat. Upraveno dle Brosh, Rotter, 2009.
13
1.5 Cíle bakalářské práce 1. Určení konformace mutp53 v glioblastomových buňkách pomocí imunoprecipitace 2. Vliv exprese mutantního proteinu p53 na tvorbu kolonií v měkkém agaru 3. Vliv mutace a konformace proteinu p53 a zinečnatých iontů na transaktivaci promotoru p21 a MDM2 pomocí luciferázového reporterového systému 4. Vliv konformace p53 na buněčné přežívání
14
2 Materiál 2.1 Použité přístroje Cytometr – TALITM Image-Based Cytometer (Invitrogen) Chemiluminátor – LAS 3000 (Fujifilm) Luminometr–Luminometer - LM-01T (Immunotech) MicroliteTM 2+ 1x12 Strips, flatbottom (Thermo Electron Corporation) Mikrovlnná trouba – Le Cygne electronic Minicentrifuga – miniSpin plus (Eppendorf) SDS – PAGE/ western blot aparatura – Mini-protean Tetrasystem (BIORAD) Spektrofotometr – Libra S22 (Biochrom) Spektrofotometr – NanoDrop ND-1000 Termoblok – Thermomixer comfort (Eppendorf) Třepačka – Orbital shaker OS – 10 (Biosan) Váhy – Sartorius TE 412 Vortex – IKA VORTEX GENIUS 3 Vortex Genie 2 (Scientific Industries) Zdroje napětí pro elektroforézu a western blot – BIORAD PowerPac basic
2.2 Použité chemikálie 40% akrylamid – AA, Serva 1% agar, Difco Agar Noble, Sigma APS, Sigma Bradfordovo činidlo, BIORAD BSA – hovězí sérový albumin, frakce V, Sigma Butanol, Sigma Blotovací membrána BioTrace NT (Pall) Cis platina (5,5 mM), Sigma DMEM: médium s highglucose 4,5 g/l s L – glutaminem a s pyruvátem sodným, PAA EDTA, Sigma
15
ECL Western Blotting Detection Reagents – detekční kit na chemiluminiscenci, GE Healthcare Ethanol, Merck 5 – Fluorouracil (500 mM), Sigma Glutamin: L-glutamin (100x), 200 mM, GIBCO, 100 ml Krystalová violeť (0,005 %), Merck Monoclonal Anti – β - Actin, SIGMA, protilátka produkovaná v myši, klon AC 1 -15 (laskavě věnováno RNDr. Bořivojem Vojtěškem DrSc., MOU) Monoklonální myší protilátka DO – 1 (laskavě věnováno RNDr. Bořivojem Vojtěškem DrSc., MOU) NaCl (5M), Lachema NaF, Sigma odtučněné sušené mléko, Laktino PI (propidiumjodid), Sigma PMSF – fenylmethylsulfurylfluorid, Sigma Pyruvát: sodium pyruvate solution, 100 ml, PAA Penicilin/streptomycin (100x), 100 ml, PAA Polyklonální protilátka ANTI – RABBIT IgG (SIGMA) peroxidázový konjugát, protilátka vyvinuta v koze, protilátka se vstřebaným lidským IgG (laskavě poskytnuto RNDr. Bořivojem Vojtěškem DrSc., MOU) Polyklonální protilátka CM1 králičí, (laskavě věnováno RNDr. Bořivojem Vojtěškem DrSc., MOU) TEMED, Sigma Tween 20, Fluka ZnCl2 (100mM), Sigma ZnSO4 (100 mM), Sigma 1kb DNA Ladder N0468G (BioLabs)
2.3 Složení používaných roztoků Složení gelů na SDS PAGE: 12,5 % separační gel: 12,5 % akrylamid (AA), 350 mM Tris (pH 8,8), 0,1 % SDS Na přípravu jednoho gelu se smíchá 10 ml 12,5 % SDS-PAGE, 50 µl 10 % APS a 25 µl Temed 5 % koncentrační gel: 5 % akrylamid (AA), 125 mM Tris (pH 6,8), 0,1 % SDS Na přípravu jednoho gelu se smíchá 2,5 ml 5 % SDS-PAGE, 25 µl 10% APS a 12,5 µl Temed
16
Složení zásobních roztoků: 1x CSB: 0,0625 mM Tris (pH 6,8), 2 % SDS, 10 % glycerol, 0,1 M 2-merkaptoethanol, zbytek dolít destilovanou vodou 10x BB (Blotting buffer): 0,48 M Tris, 0,39 M glycin, 0,37 % SDS, dolít destilovanou vodou 10x RB (Running buffer): 0,025 M Tris, 0,192 M glycin, 0,1% SDS, upravit pH na 8,3 1x BB: 1/10 objemu 10x BB, 1/10 objemu methanolu, dolít destilovanou vodou PBST: 0,05 % Tween v 1x PBS 10x PBS: 1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 43 mM Na2HPO4, 14 mM K2HPO4, dolít vodou do 1l a upravit pH na 7,4 5% odtučněné mléko v 1x PBS: 5 % váhy odtučněného sušeného mléka v 1x PBS LP (lyzační pufr): 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 50 mM Tris (pH 8,0), 50 mM NaF, 5 mM EDTA (pH 8,0), před použitím přidat PMSF v poměru 1:50
2.4 Použité linie p53 Onda 10 – obsahuje mutaci G245S (245 Gly/Ser) [60] Onda 11 – obsahuje mutaci R273C (273 Arg/Cys) [60] Osi 10 – potlačení exprese p53 pomocí shRNA [59] U 251 – obsahuje mutaci R273H (273 Arg/His) [61] U 87 – linie exprimující wtp53 [61] Usi 12 – potlačení exprese p53 pomocí shRNA [59] Usi 16 – linie s nepotlačenou expresí p53 [59] H 1299 – linie odvozená z nemalobuněčného nádoru plic [59]
17
3 Metody 3.1 Spektrofotometrické stanovení koncentrace proteinů v UV oblasti Koncentrace proteinů byla měřena při vlnové délce 280 nm, vzorky byly měřeny proti vodě a jako blank byl použit lyzační pufr.
3.2 Stanovení koncentrace proteinů dle Bradfordové Byla nachystána koncentrační řada proteinu BSA o koncentracích 0,5; 1; 2; 5 a 10 µg a objem se doplnil vodou do celkem 800 µl. Od každého proteinu se odebraly 2 µl a přidalo se 798 µl vody. Jako blank bylo použito 800 µl vody. Ke všem vzorkům se přidalo 200 µl Bradfordova činidla a nechalo se to inkubovat 5 – 10 minut při pokojové teplotě. Poté se v plastových kyvetách naměřila absorbance při vlnové délce 595 nm. Měření bylo prováděno proti vodě.
3.3 Sklízení buněk Nejprve se z misek odlilo médium a pak byly buňky přichycené na dně misky 2x promyty roztokem 1x PBS, který byl chlazený na ledu. Za použití gumové stěrky byly buňky seškrabány a pipetou přeneseny do čisté mikrozkumavky s kulatým dnem. Gumová stěrka byla před použitím namočena v 80 % ethanolu, pak v roztoku 1x PBS a po použití opět v 80 % ethanolu. Buňky byly dále stočeny na 151 g při 4°C 5 minut. Poté byl odsát supernatant a suchý pelet byl zamrazen v tekutém dusíku na - 80°C.
3.4 Lýze buněk K zamrazenému sedimentu buněk byl přidán lyzační pufr (500 µl) a 30 minut byly mikrozkumavky ponechány na ledu, přičemž každých 10 minut se zvortexovaly. Následně proběhla centrufigace při 12 100 g při 4°C 30 minut. Supernatant byl přenesen do čisté mikrozkumavky se špičatým dnem a sediment byl uschován.
3.5 Imunoprecipitace Před použitím byly magnetické kuličky Dynabeads Protein G zvortexovány, pak se odebralo 500 µl do čisté mikrozkumavky, která byla dána do paramagnetického stojanu. Následovalo 3x promytí lyzačním pufrem. Při promývání byly magnetické kuličky přichycené na stěně mikrozkumavky, takže byl odsán pouze pufr, po přidání čistého 18
lyzačního pufru (500 µl) se mikrozkumavka umístila na třepačku a následně byla opět přemístěna do paramagnetického stojanu až do úplného promytí. Pak byl přidán čistý lyzační pufr a kuličky byly připravené k použití. K supernatantu získanému při lýzi buněk (450 µl) bylo přidáno 50 µl magnetických kuliček s proteinem G, a nechalo se to inkubovat 30 minut při 4°C na třepačce. Poté se to zcentrifugovalo při 12 100 g/2 min/4°C a supernatant byl přenesen do čisté mikrozkumavky, ze které byl následně rozdělen do 3 nových mikrozkumavek po 150 µl. K těm byla přidána příslušná protilátka (DO1, PAb1620, PAb240) tak, aby supernatant obsahoval 1 µg dané protilátky. Celé se to nechalo inkubovat 2 hodiny při 4°C na třepačce. Následně bylo přidáno ke každému vzorku 20 µl magnetických kuliček s proteinem G a nechalo se to opět inkubovat 40 min při 4°C na třepačce. Pak se to zcentrifugovalo při 67 g/2 min/4°C, supernatant byl odsán, k sedimentu bylo přidáno 500 µl lyzačního pufru, 5 min se to nechalo inkubovat a 2x se to zopakovalo. Nezachycené proteiny byly ještě před promytím lyzačním pufrem odebrány (50 µl), přidalo se k nim 4x CSB a zamrazilo se to na - 20°C. Pokračovalo se centrifugací 67 g/5 min/4°C a odsátím supernatantu. Ke každému vzorku bylo přidáno 20 µl 1x CSB, bylo to zvortexováno, 3 min povařeno a lehce zchlazeno na ledu. Následovala poslední centrifugace při 67 g/6 min/4°C, supernatant byl přenesen do nových mikrozkumavek a zamrazen na - 20°C.
3.6 Separace proteinů na SDS-PAGE Vzorky byly denaturované v 1x CSB při 99°C po dobu asi 10 minut a pak krátce zcentrifugovány. Po nanesení do jamek se vzorky zakoncentrovaly v 5 % koncentračním gelu a pak separovány v 12,5 % separačním gelu. Byl použit 1x RB pufr (připravený ze zásobního 10x RB pufru) a separace probíhala 15 min/50 V, 15 min/100 V a 60 min/150 V. Detekce proteinů se prováděla buď barvením gelu pomocí Coomasie Brilliant Blue, nebo se provedl přenos proteinů na nitrocelulózovou membránu při western blotu.
3.7 Western-blott přenos Tato metoda se obvykle se provádí po SDS-PAGE a dochází při ní k přenosu proteinů z gelu na nitrocelulózovou membránu, na které se dají identifikovat proteiny pomocí protilátek. K přenosu se využívalo elektrického pole (elektroblot), 1x BB pufr a ledu kvůli chlazení. U gelu se nejprve odřízl koncentrační gel a podle následujícího pořadí: hubka, 2x whatman papír, oříznutý gel, nitrocelulózová membrána, 2x whatman papír a hubka se seskládala část aparatury. Přenos se prováděl 90 min/120 V (program 9).
19
3.8 Imunodetekce a vizualizace na LAS 3000 Membrána s přenesenými proteiny byla nejprve třepána 30 min v 5 % odtučněném mléce v roztoku 1x PBS kvůli vysycení volných vazebných míst mléčnými bílkovinami. Poté byly přenesené proteiny detekovány pomocí primárních monoklonálních protilátek DO1 a anti - β – aktinu, ředěných v 5 % mléce v 1x PBS v poměru 1:10 000 buď hodinu při pokojové teplotě, nebo přes noc při 4°C na třepačce. Následovalo promytí membrány 3x roztokem 1x PBST vždy po 5 min. Dále byla přidána králičí sekundární protilátka polyklonální CM1 (peroxidázový konjugát) v 5 % mléce v 1x PBS a nechalo se to inkubovat 1 hodinu na třepačce. Opět následovalo 3x promytí roztokem 1x PBST po 5 min. K vizualizaci proteinu došlo pomocí sekundární protilátky značené peroxidázou a použitím chemiluminiscenčního kitu ECL (Amersham), sekundární protilátka byla navázána v místě přítomnosti proteinu na membráně. K chemiluminiscenci došlo po smíchání dvou reagencií v poměru 1:1 díky obsaženému luminolu, který byl oxidován peroxidázou. Reagencie se nechaly působit 1 min a pak se membrána přikryla folií, tak aby naprosto přilnula k membráně a nedošlo k vytvoření bublin. Chemiluminiscence byla detekována pomocí přístroje LAS 3000 a doba expozice se pohybovala od 30 sekund až po 30 minut, podle množství přeneseného proteinu.
3.9 Tvorba kolonií v měkkém agaru Na spodní vrstvu byla použita 0,5 % agaróza 30ml, 10 ml séra, 25 ml média DMEM (s 20% FCS), 1 ml glutaminu, 1 ml pyruvátu a 1 ml penicilinu/streptomycinu. Na jednu misku byly nality 3 ml směsi. Na horní vrstvu se použilo 35ml 0,4% agarózy, 10 ml séra, 30 ml média a po 1 ml od glutaminu, pyruvátu a penicilinu/streptomycinu. Na jednu misku bylo naléváno 1,6 ml. Směs byla udržována při teplotě 55°C ve vodní lázni. Buňky byly splitovány v 700 µl média a k tomu se přidalo 300 µl séra. Následovala 3 týdenní inkubace ve vlhké atmosféře obsahující 5% CO2 při 37°C, obarvení 0,005% krystalovou violetí po dobru 30 min a vyfocení na přístroji LAS 3000.
3.10 Transfekce buněk Buněčná linie H1299 (s potlačenou p53) byla kultivována v médiu DMEM s 5 % FBS a penicilinem/streptomycinem. Kultura byla inkubována při 37ºC s 5 % CO2. 10 ng plazmidu pRL-SV40 (kódující Renillu reniformis luciferázu) bylo použito jako kontrola účinnosti transfekce v luciferázovém reporterovém testu. Dále bylo použito 200 ng reporterového plazmidu pGL3-p21 (kóduje luciferázu) [62]. Pro luciferázový test byly buňky H1299 vysety na 24 jamkové destičky 24 h před samotnou transfekcí. Buňky byly transfekovány pomocí Effektinu podle instrukcí v návodu při 80 % konfluenci. 50 – 100 ng p53 expresního vektoru (pCDNA3.1 laskavě postkytnutému díky R. W. deVere White) nebo prázdného vektoru pCDNA3.1 bylo ko-transfekováno s 200 ng
20
reporterového konstruktu. 15 – 20 h po transfekci byl extrakt připraven použitím Dual Luciferase Assay System (podle návodu).
3.11 Měření Luciferázy Měření bylo prováděno ve dvanácti jamkové destičce, kdy na jednu stranu jamky bylo napipetováno 40 µl buněčného lyzátu a na druhou stranu 100 µl substrátu pro luciferázu. Před samotným měřením se destičkou lehce zatřáslo kvůli promíchání proteinu se substrátem a provedlo se měření. V případě dual systému následovalo kontrolní měření renily po přidání stop reagencie.
21
4 Výsledky 4.1 Detekce konformace mutp53 v glioblastomových liniích Pelety buněčných linií U251, Onda10 a Onda11 byly zlyzovány pomocí PLB. Purifikovaný protein wtp53 sloužil jako kontrola. Při následné imunoprecipitaci se k lyzátu rozdělenému na tři části přidaly primární protilátky DO1, PAb1620 a PAb240 tak, aby výsledné množství bylo 1 µg protilátky na 40 µg celkového proteinu. Dále byla provedena imunoprecipitace za použití magnetických kuliček Dynabeads Protein G. Získané proteiny byly analyzovány na 12,5 % SDS – PAGE a přeneseny pomocí western blotu na nitrocelulózovou membránu (BioTrace). Membrána byla vyvolávána s polyklonální protilátkou CM1 detekující všechny formy p53 a na přístroji LAS 3000 se změřila chemiluminiscence pomocí ECL (Amersham). Dle obrázku č. 10 si můžeme všimnout, že všechny linie exprimovaly protein p53, detekováno imunoprecipitací s protilátkou DO1 (protilátka, která se váže na N-konec p53), (starty č. 2). Srovnáme-li dále signál konformačně specifických protilátek PAb1620 a PAb240 u všech tří testovaných linií a u kontroly wtp53, docházíme k těmto výsledkům. U wtp53 lze vidět vyšší signál PAb1620, graf č. 1, z toho vyplývá, že tato metoda fungovala, z velikosti signálu PAb240 plyne, že ale by bylo lepší použít nižší vstupní množství purifikovaného proteinu. U linie U251 vidíme jasný signál PAb1620, což potvrzuje standardní konformaci R273H a stejný výsledek lze pozorovat i u buněk Onda11, který obsahuje mutanta R273C, u které se taky předpokládá standardní konformace. Jedině linie Onda10 vykazovala signál PAb240 (demonstruje mutantní konformaci), ale dále i signál PAb1620, graf č. 2. Z tohoto důvodu by se při imunoprecipitaci měla použít vyšší koncentrace PAb240 a nižší množství PAb1620 v celém experimentu.
22
A) wtp53 1 2
C) Onda11 1 2
4
B) U251 1 2
3
4
3
4
D) Onda10 1 2
3
4
3
Input
+
-
-
-
+
-
-
-
DO1
-
+
-
-
-
+
-
-
PAb1620
-
-
+
-
-
-
+
-
PAb240
-
-
-
+
-
-
-
+
Obrázek č. 10: Membrány po imunodetekci. A) wtp53, B) U251, C) Onda11, D) Onda10.
Procentální vyjádření PAb1620 a PAb240 ku D O 1 140
PAb1620 % DO1
120
PAb240 % DO1
100 80 60 40 20 0 wtp53
U251
Onda10
Onda11
Graf č. 1: Procentuální vyjádření protilátek PAb1620 a PAb240 vzhledem k DO1.
23
Poměr 1620/240 50 1620/240
45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 U251
Onda10
Onda11
Graf č. 2: Poměr protilátek PAb1620 a PAb240 u kontrolní linie wtp53 a linií U251, Onda10 a Onda11.
4.2 Vliv exprese mutantního proteinu p53 na tvorbu kolonií v měkkém agaru Normální zdravé buňky potřebují pro svůj růst a diferenciaci adhezi k pevnému podkladu. Zároveň se u nich vyskytuje inhibice dotykem, tzn., že buňky nemohou růst jedna přes druhou. U nádorových buněk však mutacemi dochází k potlačení různých vlastností a mezi jinými je to právě i adheze k pevnému podkladu a inhibice dotykem. Měkký agar je speciální agar, kde se dají simulovat podmínky právě pro růst transformovaných buněk. Při tomto experimentu byly použity dvě linie exprimující mutp53 U251a Onda11, jedna linie exprimující wtp53 U87 a dvě linie Osi10 a Usi12 s potlačenou expresí p53 (pomocí shRNA). Použila jsem šesti jamkové misky. Buňky byly vysety na 0,4/0,5 % agar s médiem (s 20 % FCS), sérem, penicilenem/streptomycinem, glutaminem a pyruvátem. Po třech týdnech inkubace byly misky promyty a obarveny krystalovou violetí a vyfotografovány na přístroji LAS 300. Na obrázku č. 11 můžeme vidět, že linie s mutp53 U251, Onda11 i s wtp53 kolonie tvoří, takže se jedná o transformované buňky. Linie Usi12 a Osi10 s potlačenou expresí p53 kolonie netvořily Podobně byl testován vliv zinečnatých iontů na linie U251 a Onda11, ale experiment nebyl bohužel úspěšný.
24
Obrázek č. 11: Linie U251, Onda11 exprimují mutp53, U87 exprimuje wtp53 a tvoří kolonie v měkkém agaru, linie Osi10 a Usi12 mají potlačenou expresi p53 a kolonie netvoří, jako kontrola sloužilo samotné médium.
4.3 Vliv mutace a konformace proteinu p53 na transaktivaci promotoru p21 pomocí luciferázového reporterového systému Buňky H1299 neexprimující p53 byly transfekovány vektorem obsahující gen pro luciferázu za regulační oblastí promotoru p21 a dále jedním z expresním vektorů: pCDNA3.1 (kontrola), pCDNAwtp53, pCDNA-R175H, pCDNA-G245S, pCDNAR248W a pCDNA-R273H. Na grafu č. 3 můžeme vidět, že wtp53 aktivoval promotor p21. Konformační mutanti G245S a R175H si zachovali reziduální transaktivační schopnost částečně a pozorovali jsme, že přidaný ZnCl2 ji ještě částečně aktivuje. Naopak kontaktní mutanti R248W a R273H potlačují promotor p21, pozorováno vůči kontrolnímu vektoru, graf č. 4. Zatímco přídavek ZnCl2 o koncentraci 50 µM měl pozitivní vliv na tuto aktivitu [63].
25
Transaktivace promotoru p21 2500000 bez iontu 2000000
50uM ZnSO4
RLU
1500000
1000000
500000
0 vektor
wtp53
175
245
248
273
Graf č. 3: Transaktivace promotoru p21.
Transaktivace promotoru p21 vzhledem ke kontrolmínu vektoru 25
bez iontu 50uM ZnSO4
20
NOR. RLU
15
10
5
0 bez iontu 50uM ZnSO4
wtp53
175
245
248
273
4,15
0,72
1,50
0,51
0,51
20,22
2,36
2,85
1,09
1,04
Graf č. 4: Transaktivace promotoru p21 vzhledem ke kontrolnímu vektoru pCNDA3.1.
26
4.4 Vliv konformace p53 na buněčné přežívání V tomto experimentu jsme zkoumali vliv ZnCl2 na účinek cytostatik na buněčných liniích U251, Onda10, Onda11 a U87. Buněčné linie byly 3 dny inkubovány s ZnCl2 (100 µM) a 3 dny s daným cytostatikem. Jednalo se o cisplatinu (5,5 µM), nebo o 5fluorouracil (500 µM). Buňky byly po vystavení těchto činidel vyfotografovány v inverzním mikroskopu. Vyfotografované linie byly promyty 1x PBS, pak se k nim přidal trypsin. Tím se buňky odlepily ode dna, byly znovu promyty a pipetou přeneseny do mikrozkumavky. Následně byly stočeny, supernatant se odsál a buňky byly opět promyty 1x PBS, zvortexovány a stočeny. Supernatant se opět odsál a přidalo se 1x PBS a propidiumjodid a 5 minut se to inkubovalo ve tmě. Pak se pomocí cytometru TALITM (Invitrogen), který využil fluorescenci propidiumjodidu (barví pouze mrtvé buňky), se změřilo množství živých a mrtvých buněk. Bohužel díky technických problémům prezentuji výsledky pouze fotograficky a jen u linie U87 mohu dodat i grafické znázornění vlivu ZnCl2 na účinek cisplatiny, graf č. 5 a fluorescenci propidiumjodidu, obrázek č. 14. Na obrázku č. 12 můžeme jasně vidět rozdíly v přežití buněk u linie Onda10. Po použití samotného ZnCl2 (B), lze vidět určitý úbytek buněk, nejmasivněji to však lze pozorovat u použití cisplatiny a ZnCl2 současně (C). Použití 5-fluorouracilu naopak nevykazuje téměř žádný rozdíl oproti kontrole (E). To samé lze pozorovat i na obrázku č. 13 u linie Onda11. Opět nejmarkantnější rozdíl je vidět při použití současně ZnCl2 a cisplatiny (C). Z těchto pouze předběžných výsledků můžeme pouze hypotetizovat, že v případě cisplatiny stimuloval ZnCl2 její účinek bez ohledu na konformaci proteinu.
27
A) Onda10 kontrola
B) Onda10 + ZnCl2
C) Onda10 + cispl
D) Onda10 + ZnCl2 + cispl
E) Onda10 + 5FU
F) Onda10 + ZnCl2 + 5FU
Obrázek č. 12: Vliv působení Zn/cytostatik na linii buněk Onda10. A) Kontrolní linie Onda10, B) Onda10 + ZnCl2 (100 µM), C) Onda10 + cispl (5,5 µM), D) Onda10 + ZnCl2 (100 µM) + cispl (5,5 µM), E) Onda10 + 5FU (500 µM), F) Onda10 + ZnCl2 (100 µM) + 5FU (500 µM).
28
A) Onda11 kontrola
B) Onda11 + ZnCl2
C) Onda11 + cispl
D) Onda11 + ZnCl2 + cispl
E) Onda11 + 5FU
F) Onda11 + ZnCl2 + 5FU
Obrázek č. 13: Vliv působení Zn/cytostatik na linii buněk Onda11. A) Kontrolní linie Onda11, B) Onda11 + ZnCl2 (100 µM), C) Onda11 + cispl (5,5 µM), D) Onda11 + ZnCl2 (100 µM) + cispl (5,5 µM), E) Onda11 + 5FU (500 µM), F) Onda11 + ZnCl2 (100 µM) + 5FU (500 µM).
29
Graf č. 5: Vliv ZnCl2 na účinek cisplatiny na buněčné linie U87.
Obrázek č. 14: Graf fluorescence propidiumjodidu. PI fluoreskuje červeně a barví pouze mrtvé buňky
30
5 Diskuse Pro analýzu vlivu struktury mutantních p53 na onkogenní chování in vivo jsme si vybrali glioblastomové linie s různým statusem p53: U251 (R273H), Onda11 (R273C), Onda10 (G245S) a U87 (wtp53). Cílem první experimentální části práce bylo zjištění konformace mtp53 u vybraných linií obsahujících mtp53 a porovnání dosažených výsledků s již publikovanými u jiných linií obsahující stejnou mutaci. U mutantního proteinu R273H byla popsána standardní i mutantní konformace v závislosti na tom jestli autoři pracovali s proteiny in vitro či in vivo [62, 64]. Nám se podařilo u linie U251 detekovat standardní konformaci, jak odpovídá představě kontaktního typu mutantního proteinu [33] se standardní konformací. V případě druhého nejčastěji vyskytujícího se mutantního proteinu u glioblastomových buněk R273C jsme v případě linie Onda11 pozorovali shodný výsledek, což znamená, že i tento mutant vykazoval přednostně PAb1620+ konformaci. Rozdílný výsledek byl dosažen s linií Onda10 osahující mutantní protein G245S, i v této linii bylo sice detekováno významné množství PAb1620+, ale také významná frakce PAb240+, odpovídající mutantní konformaci. Experiment neměl bohužel úplně ideální podmínky na imunoprecipitaci (koncentrace obou protilátek by bylo vhodnější upravit), ale i tak splnil naše očekávání a můžeme předpokládat, že tento konformační mutant G245S v glioblastomových buňkách upřednostňuje PAb240+ konformaci. Uvědomujeme si však nutnost optimalizace této metody pro konečné hodnocení. Z literatury je známo, že linie obsahující tyto mutace R273H, R273C a G245S, mohou tvořit kolonie v měkkém agaru ale i nemusí [62]. Pro analýzu linií Onda11, Onda10 a U251 jsme tyto informace v literatuře nenašli. V práci Dr. R. Puca a kolegů [62] popisují jinou glioblastomovou linii U373MG, obsahující mutaci R273H, která tvořila kolonie v měkkém agaru. Pro zmíněnou analýzu tumorigenního potenciálu in vitro jsme použili linie exprimující mutantní p53 (U251, Onda11, Onda10), klony vytvořené z těchto linií s potlačenou expresí p53 pomocí shRNA (Osi10, Usi12), linii U87 obsahující wtp53 a jako kontrolu čistý agar. Dle dosažených výsledků můžeme zcela jasně říci, že všechny glioblastomové linie s mutantní p53, ale i s wtp53 vykazovali schopnost tvořit kolonie v měkkém agaru. U linií s potlačenou p53 - Osi10 a Usi12 jsme nárůst kolonií nepozorovali. Z toho plyne, že tímto zásahem, vyřazením mtp53 pomocí shRNA došlo k potlačení onkogenního chování v případě těchto linií. Z toho můžeme soudit, že tyto linie jsou tedy vhodné jako model pro studium onkogenního chování závislého na mutantní p53. Další část práce se věnuje vlivu mutace a konformace proteinu p53 na transkripční regulace promotoru cílových genů. V případě transkripční regulace promotoru genu p21 bylo alespoň u několika vzorových linií popsáno, že tyto promotory jsou některými mutanty reprimovány, zatímco wtp53 aktivovány. Zajímal nás tento efekt i v souvislosti s konformací mutantních proteinů. Buněčná linie H1299 byla transformována reporterovým vektorem pGl3-p21 a expresními vektory pro zmíněné mutantní proteiny R273H, G245S a dále pro R248W a 31
R175H, wtp53 a kontrolní vektor (pCDNA3.1). Potvrdili jsme chování wtp53, výrazně aktivuje promotor p21. Dále nás zajímalo, jestli zinečnaté ionty mohou tuto transaktivaci ovlivnit, jak popsala R. Puca [62] v případě mutanta R175H, že luciferázovou aktivitu je schopen ZnCl2 v kombinaci s cisplatinou zvyšovat. Ale v její práci není uveden vliv samotného ZnCl2 na luciferázovou aktivitu. My jsme se zaměřili hlavně na vliv zinečnatých iontů (koncentrace 50 µM). A pozorovali jsme, že zatímco samotný vektor je ovlivňován ionty minimálně, aktivita standardního p53 vzrostla až 5x oproti původní hodnotě. Podobný výsledek jsme pozorovali i u kontaktních a strukturních mutantů s tím rozdílem, že aktivace zinečnatými ionty byla pouze 2x vyšší. Mutanti R175H, R248W a R273H reprimovali promotor p21, jak je popsáno v literatuře [63], ale na druhou stranu jej díky vlivu zinku aktivovali. Pouze mutant G245S promotor aktivoval reziduálně i bez přídavku zinečnatých iontů. Avšak i v literatuře je tento mutant popisován s částečně zachovalou wtp53 aktivitou. Podobný efekt zatím nebyl pozorován a tak se mu budeme nadále věnovat. Pouze hypotetizujeme, čím mohl být způsoben, jestli např. aktuálním nedostatkem zinku v buňkách tvořící velké množství p53. V neposlední řadě jsme se pokoušeli zjistit vliv konformace a mutace p53 na buněčné přežívání v důsledku působení cytostatik. Výsledková část reprezentuje pouze vybrané experimenty. Podařilo se nám potvrdit již publikované výsledky s mutantem R273H u glioblastomové linie U373MG, kde bylo ukázáno, že zinečnaté ionty zesilují účinek cisplatiny [62]. V této práci jsme zkoumali linie U251, Onda10, Onda11 a U87, které byly vystaveny účinku cisplatiny nebo 5-FU po několikadenním působení iontů zinku. Z předběžných výsledků usuzujeme, že zinek podporuje smrt buněk vyvolanou konkrétně cisplatinou v buňkách exprimujích wtp53 i mtp53. Naše práce potvrzuje, že mutace i konformace proteinu mají výrazný vliv na onkogenní chování glioblastomových buněk.
32
6 Závěr Smyslem této práce bylo shrnout informace o nádorovém supresoru wtp53, jehož primární funkcí je ochránit stabilitu genomu a zabránit přenosu poškození DNA do dalších generací. Byla zde zdůrazněna důležitost struktury p53 pro pochopení jeho fungování a obzvláště role atomu zinku, jenž významným způsobem zasahuje do konformace proteinu. V oblasti onkogenního chování buněk obsahující mutantní p53 byla největší pozornost věnována opět vlivu konformace a typu mutace s ohledem na strukturu proteinu. Pro studium byly zvoleny glioblastomové linie exprimující mutantní proteiny R273H, R273C a G245S a linie s wtp53. Zabývali jsme se detekcí konformace pomocí protilátek PAb1620/PAb240, nejenom vlivem mutace na zachování transaktivační funkce pomocí luciferázového reporterového systému, ale i vlivem zinečnatých iontů v daném systému. Tumorigenní potenciál in vitro byl studován pomocí tvorby kolonií v měkkém agaru a v neposlední řadě jsme pozorovali pozitivní vliv zinečnatých iontů na působení cisplatiny. Studie poukazuje na významný vliv nejen mutace p53, ale i konformace proteinu na onkogenní chování glioblastomových linií.
33
7 Použitá literatura [1] D. P. Lane a L. V. Crawford, „T antigen is bound to a host protein in SY40transformed cells―, , Published online: 15 March 1979; | doi:10.1038/278261a0, roč. 278, čís. 5701, s. 261–263, bře. 1979. [2] D. Eliyahu, A. Raz, P. Gruss, D. Givol, a M. Oren, „Participation of p53 cellular tumour antigen in transformation of normal embryonic cells―, Nature, roč. 312, čís. 5995, s. 646–649, pro. 1984. [3] S. J. Baker, E. R. Fearon, J. M. Nigro, S. R. Hamilton, A. C. Preisinger, a et al, „Chromosome 17 Deletions an P53 Gene Mutations in Colorectal Carcinomas―, Science, roč. 244, čís. 4901, s. 217, dub. 1989. [4] K. H. Vousden a D. P. Lane, „p53 in health and disease―, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., roč. 8, čís. 4, s. 275–283, dub. 2007. [5] C. Dai a W. Gu, „p53 post-translational modification: deregulated in tumorigenesis―, Trends in Molecular Medicine, roč. 16, čís. 11, s. 528–536, lis. 2010. [6] H. F. Horn a K. H. Vousden, „Coping with stress: multiple ways to activate p53―, Oncogene, roč. 26, čís. 9, s. 1306–1316, úno. 2007. [7] S. Lain a D. Lane, „Improving cancer therapy by non-genotoxic activation of p53―, European Journal of Cancer, roč. 39, čís. 8, s. 1053–1060, kvě. 2003. [8] F. Toledo a G. M. Wahl, „Regulating the p53 pathway: in vitro hypotheses, in vivo veritas―, Nature Reviews Cancer, roč. 6, čís. 12, s. 909–923, pro. 2006. [9] D. P. Lane, „p53, guardian of the genome―, , Published online: 02 July 1992; | doi:10.1038/358015a0, roč. 358, čís. 6381, s. 15–16, čvc. 1992. [10] J. D. Oliner, J. A. Pietenpol, S. Thiagalingam, J. Gyuris, K. W. Kinzler, a B. Vogelstein, „Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumour suppressor p53―, , Published online: 29 April 1993; | doi:10.1038/362857a0, roč. 362, čís. 6423, s. 857–860, dub. 1993. [11] R. Honda, H. Tanaka, a H. Yasuda, „Oncoprotein MDM2 is a ubiquitin ligase E3 for tumor suppressor p53―, FEBS Letters, roč. 420, čís. 1, s. 25–27, pro. 1997. [12] C. Prives, „Signaling to p53: Breaking the MDM2–p53 Circuit―, Cell, roč. 95, čís. 1, s. 5–8, jen 1998. [13] C. J. Sherr, „Divorcing ARF and p53: an unsettled case―, Nature Reviews Cancer, roč. 6, čís. 9, s. 663–673, srp. 2006. [14] Y. Zhang a H. Lu, „Signaling to p53: Ribosomal Proteins Find Their Way―, Cancer Cell, roč. 16, čís. 5, s. 369–377, lis. 2009. [15] X. Wu, J. H. Bayle, D. Olson, a A. J. Levine, „The P53-Mdm-2 Autoregulatory Feedback Loop.―, Genes Dev., roč. 7, čís. 7a, s. 1126–1132, led. 1993. [16] A. Mandinova a S. W. Lee, „The P53 Pathway as a Target in Cancer Therapeutics: Obstacles and Promise―, Sci Transl Med, roč. 3, čís. 64, s. 64rv1–64rv1, kvě. 2011. [17] W. Wang, F. Rastinejad, a W. S. El-Deiry, „Restoring p53-Dependent Tumor Suppression―, Cancer Biology & Therapy, roč. 2, čís. 0, s. 0–8, čvc. 2003. 34
[18] O. W. McBride, D. Merry, a D. Givol, „The gene for human p53 cellular tumor antigen is located on chromosome 17 short arm (17p13).―, Proc Natl Acad Sci U S A, roč. 83, čís. 1, s. 130–134, led. 1986. [19] T. Unger, J. A. Mietz, M. Scheffner, C. L. Yee, a P. M. Howley, „Functional domains of wild-type and mutant p53 proteins involved in transcriptional regulation, transdominant inhibition, and transformation suppression―, Molecular and Cellular Biology, roč. 13, čís. 9, s. 5186–5194, 1993. [20] „Two tandem and independent sub-activation domains in the amino terminus of p53 require the adaptor complex for activity―, , Published online: 13 August 1997; | doi:10.1038/sj.onc.1201244, roč. 15, čís. 7, srp. 1997. [21] „The proline-rich domain of p53 is required for cooperation with anti-neoplastic agents to promote apoptosis of tumor cells―, , Published online: 04 January 2002; | doi:10.1038/sj.onc.1205015, roč. 21, čís. 1, led. 2002. [22] B. F. Müller-Tiemann, T. D. Halazonetis, a J. J. Elting, „Identification of an Additional Negative Regulatory Region for P53 Sequence-Specific DNA Binding―, PNAS, roč. 95, čís. 11, s. 6079–6084, kvě. 1998. [23] E. Apella, C. W. Anderson ,,Postr-translational modifications and activation of p53 by genotoxic stresses―, European Journal of Biochemistry, roč. 268, čís. 10, s. 2764–2772, kvě. 2001. [24] C. Chao, M. Hergenhahn, M. D. Kaeser, Z. Wu, S. Saito, R. Iggo, M. Hollstein, E. Appella, a Y. Xu, „Cell Type- and Promoter-Specific Roles of Ser18 Phosphorylation in Regulating P53 Responses―, J. Biol. Chem., roč. 278, čís. 42, s. 41028–41033, říj. 2003. [25] Y. Cho, S. Gorina, P. D. Jeffrey, a N. P. Pavletich, „Crystal Structure of a P53 Tumor Suppressor-DNA Complex: Understanding Tumorigenic Mutations―, Science, roč. 265, čís. 5170, s. 346–355, čvc. 1994. [26] A. N. Bullock a A. R. Fersht, „Rescuing the function of mutant p53―, Nature Reviews Cancer, roč. 1, čís. 1, s. 68–76, říj. 2001. [27] J. M. Stommel, N. D. Marchenko, G. S. Jimenez, U. M. Moll, T. J. Hope, a G. M. Wahl, „A leucine-rich nuclear export signal in the p53 tetramerization domain: regulation of subcellular localization and p53 activity by NES masking―, The EMBO Journal, roč. 18, čís. 6, s. 1660–1672, bře. 1999. [28] G. Shaulsky, N. Goldfinger, A. Ben-Ze’ev, a V. Rotter, „Nuclear Accumulation of P53 Protein Is Mediated by Several Nuclear Localization Signals and Plays a Role in Tumorigenesis.―, Mol. Cell. Biol., roč. 10, čís. 12, s. 6565–6577, led. 1990. [29] O. S. Foord, P. Bhattacharya, Z. Reich, a V. Rotter, „A DNA Binding Domain Is Contained in the C-Terminus of Wild Type P53 Protein―, Nucl. Acids Res., roč. 19, čís. 19, s. 5191–5198, lis. 1991. [30] C. V. Dang a W. M. F. Lee, „Nuclear and nucleolar targeting sequences of c-erb-A, c-myc, N-myc, p53, HSP70, and HIV tat proteins―, Journal of Biological Chemistry, roč. 264, čís. 30, s. 18019–18023, 1989. [31] D. Michael a M. Oren, „The p53–Mdm2 module and the ubiquitin system―, Seminars in Cancer Biology, roč. 13, čís. 1, s. 49–58, nor 2003. [32] J. M. Nigro, S. J. Baker, A. C. Preisinger, J. M. Jessup, R. Hosteller, K. Cleary, S. 35
H. Signer, N. Davidson, S. Baylin, P. Devilee, T. Glover, F. S. Collins, A. Weslon, R. Modali, C. C. Harris, a B. Vogelstein, „Mutations in the p53 gene occur in diverse human tumour types―, , Published online: 07 December 1989; | doi:10.1038/342705a0, roč. 342, čís. 6250, s. 705–708, pro. 1989. [33] R. Brosh a V. Rotter, „When mutants gain new powers: news from the mutant p53 field―, Nature Reviews Cancer, roč. 9, čís. 10, s. 701–713, jen 2009. [34] S. Peller a V. Rotter, „TP53 in hematological cancer: Low incidence of mutations with significant clinical relevance―, Human Mutation, roč. 21, čís. 3, s. 277–284, úno. 2003. [35] B. Iacopetta, „TP53 mutation in colorectal cancer―, Human Mutation, roč. 21, čís. 3, s. 271–276, úno. 2003. [36] M. Schuijer a E. M. J. . Berns, „TP53 and ovarian cancer―, Human Mutation, roč. 21, čís. 3, s. 285–291, úno. 2003. [37] H. Blons a P. Laurent-Puig, ,,TP53 and head and neck neoplasm―, zHuman Mutation, roč. 21, čís. 3, s. 252–257, úno. 2003. [38] D. Malkin, F. P. Li, L. C. Strong, J. F. Fraumeni, C. E. Nelson, D. H. Kim, J. Kassel, M. A. Gryka, F. Z. Bischoff, M. A. Tainsky, a A. Et, „Germ Line P53 Mutations in a Familial Syndrome of Breast Cancer, Sarcomas, and Other Neoplasms―, Science, roč. 250, čís. 4985, s. 1233–1238, lis. 1990. [39] M. Olivier, R. Eeles, M. Hollstein, M. A. Khan, C. C. Harris, a P. Hainaut, „The IARC TP53 database: New online mutation analysis and recommendations to users―, Human Mutation, roč. 19, čís. 6, s. 607–614, kvě. 2002. [40] S. Kato, S.-Y. Han, W. Liu, K. Otsuka, H. Shibata, R. Kanamaru, a C. Ishioka, „Understanding the Function–structure and Function–mutation Relationships of P53 Tumor Suppressor Protein by High-Resolution Missense Mutation Analysis―, PNAS, roč. 100, čís. 14, s. 8424–8429, srp. 2003. [41] T. Z. Lwin, J. J. Durant, a D. Bashford, „A Fluid Salt-bridging Cluster and the Stabilization of p53―, Journal of Molecular Biology, roč. 373, čís. 5, s. 1334–1347, lis. 2007. [42] M. G. Mateu a A. R. Fersht, „Nine hydrophobic side chains are key determinants of the thermodynamic stability and oligomerization status of tumour suppressor p53 tetramerization domain―, The EMBO Journal, roč. 17, čís. 10, s. 2748–2758, kvě. 1998. [43] E. L. DiGiammarino, A. S. Lee, C. Cadwell, W. Zhang, B. Bothner, R. C. Ribeiro, G. Zambetti, a R. W. Kriwacki, „A novel mechanism of tumorigenesis involving pH-dependent destabilization of a mutant p53 tetramer―, Nature Structural & Molecular Biology, roč. 9, čís. 1, s. 12–16, lis. 2001. [44] M. I. W. Achatz, M. Olivier, F. L. Calvez, G. Martel-Planche, A. Lopes, B. M. Rossi, P. Ashton-Prolla, R. Giugliani, E. I. Palmero, F. R. Vargas, J. C. C. D. Rocha, A. L. Vettore, a P. Hainaut, „The TP53 mutation, R337H, is associated with Li-Fraumeni and Li-Fraumeni-like syndromes in Brazilian families―, Cancer Letters, roč. 245, čís. 1–2, s. 96–102, led. 2007. [45] A. Petitjean, E. Mathe, S. Kato, C. Ishioka, S. V. Tavtigian, P. Hainaut, a M. Olivier, „Impact of mutant p53 functional properties on TP53 mutation patterns and 36
tumor phenotype: lessons from recent developments in the IARC TP53 database―, Human Mutation, roč. 28, čís. 6, s. 622–629, čer. 2007. [46] http://p53.free.fr/our_work/structure.html, [47] A. Cook a J. Milner, „Evidence for allosteric variants of wild-type p53, a tumour suppressor protein.―, Br J Cancer, roč. 61, čís. 4, s. 548–552, dub. 1990. [48] J. V. Gannon, R. Greaves, R. Iggo, a D. P. Lane, „Activating mutations in p53 produce a common conformational effect. A monoclonal antibody specific for the mutant form.―, EMBO J, roč. 9, čís. 5, s. 1595–1602, kvě. 1990. [49] H. C. Ang, A. C. Joerger, S. Mayer, a A. R. Fersht, „Effects of Common Cancer Mutations on Stability and DNA Binding of Full-Length P53 Compared with Isolated Core Domains―, J. Biol. Chem., roč. 281, čís. 31, s. 21934–21941, dub. 2006. [50] A. C. Joerger a A. R. Fersht, „Structure - function - rescue: the diverse nature of common p53 cancer mutants―, Oncogene, roč. 26, čís. 15, s. 2226–2242, dub. 2007. [51] J. Milner, E. A. Medcalf, a A. C. Cook, „Tumor Suppressor P53: Analysis of WildType and Mutant P53 Complexes.―, Mol. Cell. Biol., roč. 11, čís. 1, s. 12–19, led. 1991. [52] J. Milner a E. A. Medcalf, „Cotranslation of activated mutant p53 with wild type drives the wild-type p53 protein into the mutant conformation―, Cell, roč. 65, čís. 5, s. 765–774, kvě. 1991. [53] A. Sigal a V. Rotter, „Oncogenic Mutations of the P53 Tumor Suppressor: The Demons of the Guardian of the Genome―, Cancer Res, roč. 60, čís. 24, s. 6788– 6793, pro. 2000. [54] H. Song a Y. Xu, „Gain of Function of p53 Cancer Mutants in Disrupting Critical DNA Damage Response Pathways―, Cell Cycle, roč. 6, čís. 13, s. 1570–1573, čvc. 2007. [55] C. Gaiddon, M. Lokshin, J. Ahn, T. Zhang, a C. Prives, „A Subset of TumorDerived Mutant Forms of P53 Down-Regulate P63 and P73 Through a Direct Interaction with the P53 Core Domain―, Mol. Cell. Biol., roč. 21, čís. 5, s. 1874– 1887, led. 2001. [56] C. J. Di Como, C. Gaiddon, a C. Prives, „P73 Function Is Inhibited by TumorDerived P53 Mutants in Mammalian Cells―, Mol. Cell. Biol., roč. 19, čís. 2, s. 1438– 1449, led. 1999. [57] C.-O. Leong, N. Vidnovic, M. P. DeYoung, D. Sgroi, a L. W. Ellisen, „The p63/p73 network mediates chemosensitivity to cisplatin in a biologically defined subset of primary breast cancers―, J Clin Invest, roč. 117, čís. 5, s. 1370–1380, kvě. 2007. [58] X. Su, D. Chakravarti, M. S. Cho, L. Liu, Y. J. Gi, Y.-L. Lin, M. L. Leung, A. ElNaggar, C. J. Creighton, M. B. Suraokar, I. Wistuba, a E. R. Flores, „TAp63 suppresses metastasis through coordinate regulation of Dicer and miRNAs―, Nature, roč. 467, čís. 7318, s. 986–990, říj. 2010. [59] M. Brázdová, T. Quante, L. Tögel, K. Walter, C. Loscher, V. Tichý, L. Činčárová, W. Deppert, a G. V. Tolstonog, „Modulation of gene expression in U251 glioblastoma cells by binding of mutant p53 R273H to intronic and intergenic 37
sequences―, Nucleic Acids Res, roč. 37, čís. 5, s. 1486–1500, dub. 2009. [60] H. Koga, S. Zhang, K. Washiyama, T. Ichikawa, K. Onda, a T. Kumanishi, „Analysis of p53 gene mutations in human glioma cell lines―, Noshuyo Byori, roč. 13, čís. 1, s. 1–10, dub. 1996. [61] E. G. Van Meir, T. Kikuchi, M. Tada, H. Li, A.-C. Diserens, B. E. Wojcik, H.-J. S. Huang, T. Friedmann, N. De Tribolet, a W. K. Cavenee, „Analysis of the P53 Gene and Its Expression in Human Glioblastoma Cells―, Cancer Res, roč. 54, čís. 3, s. 649–652, 1994. [62] R. Puca, L. Nardinocchi, M. Porru, A. J. Simon, G. Rechavi, C. Leonetti, D. Givol, a G. D’Orazi, „Restoring p53 active conformation by zinc increases the response of mutant p53 tumor cells to anticancer drugs―, Cell Cycle, roč. 10, čís. 10, s. 1679– 1689, kvě. 2011. [63] F. Vikhanskaya, M. K. Lee, M. Mazzoletti, M. Broggini, a K. Sabapathy, „CancerDerived P53 Mutants Suppress P53-Target Gene Expression—Potential Mechanism for Gain of Function of Mutant P53―, Nucl. Acids Res., roč. 35, čís. 6, s. 2093–2104, led. 2007. [64] Natalia Issaeva, Assaf Friedler, Przemyslaw Bozko, Klas G. Wiman, Alan R. Fersht, a Galina Selivanova, „Rescue of Mutants of the Tumor Suppressor P53 in Cancer Cells by a Designed Peptide―, PNAS, roč. 100, čís. 23, s. 13303–13307, lis. 2003.
38
8 Seznam zkratek wtp53 – standardní protein p53 mtp53 – mutantní protein p53 LF – Li-Fraumeni syndrome LOH – ztráta heterozygozity (loss of heterozygosity) GOF – získání funkce (gain of function) NES – nuclear export signal NLSs – nuclear localization signals NLSI – dominant nuclear localization signal DO1 – protilátka zachytávající protein p53 na N-konci PAb1620 – protilátka rozpoznávající nativní konformaci PAb240 – protilátka rozpoznávající denaturovanou konformaci TAD – transaktivační doména CD – centrální doména DBD – DNA vazebná doména (DNA binding domain) PI – propidiumjodid 5FU – 5 – fluorouracil MDM2 – (murine double minute 2), E3 ubikvitin ligáza, součást regulace p53 MDM4 – (murine double minute 4), strukturní homolog MDM2, účastní se regulace p53 TP53 – gen kódující protein p53 p53CON – (consensus) jedná se o specifickou sekvenci pro p53
39
