Karlova Univerzita v Praze Přírodovědecká fakulta
Katedra parazitologie
bakalářská práce MECHANISMY REZISTENCE K METRONIDAZOLU U BAKTERIÍ A ANAEROBNÍCH EUKARYOT Kateřina Pilařová Školitel: RNDr. Ivan Hrdý PhD.
2009
Ráda bych na tomto místě poděkovala především Ivanovi Hrdému za profesionální a kritický přístup k mé práci. Také bych chtěla poděkovat Tamaře Smutné za pomoc a podporu v mém snaţení. Dále mé poděkování patří Janu Machovi za pomoc s literaturou. A v neposlední řadě bych na tomto místě chtěla z celého srdce poděkovat mým rodičům za neskonalou trpělivost a podporu ve studiu.
Prohlašuji, ţe jsem tuto práci zpracovala samostatně pod vedením RNDr. Ivana Hrdého PhD. a ţe cituji všechny pouţité zdroje. ……………………… Kateřina Pilařová
V Praze, dne 30.7.2009 2
OBSAH ABSTRAKT
4
ABSTRACT
5
1. Úvod
6
2. Metronidazol a jiné nitroimidazolové deriváty
7
2.1 Struktura nitroimidazolů
7
2.2 Pouţití nitroimidazolů
7
2.3 Aktivace nitroimidazolů
8
2.4. Poškození buňky způsobebé nitroimidazoly
10
2.5. Rezistence k nitroimidazolům
13
3. Mechanismy reistence u bakterií
14
3.1 Bacteroides
14
3.2 Helicobacter
15
3.3 Clostridium
17
4. Mechanismy rezistence u anaerobních eukaryot
19
4.1 Trichomonas vaginalis
19
4.2 Tritrichomonas foetus
26
4.3 Giardia intestinalis
27
4.4 Entamoeba histolytica
28
5. Závěr
31
6. Seznam pouţité literatury
32
3
ABSTRAKT Tato práce se snaţí popsat mechanismy rezistence k metronidazolu u různých skupin organismů, na jejichţ léčbu se metronidazol pouţívá. Jsou to jak bakterie (rody Bacteroides, Helicobacter, Clostridium), tak anaerobní eukaryota (rody Trichomonas, Tritrichomonas, Entamoeba, Giardia). Důleţité je to, ţe metronidazol působí selektivně pouze na buňky ţijící v anaerobním nebo mikroaerofilním prostředí. Do buňky se metronidazol dostává pasivní difuzí a je poté redukován na cytotoxický meziprodukt, který poškozuje buňku na různých úrovních. U buněk s aerobním metabolismem sice dojde k průniku léčiva do buňky, můţe dojít i k redukci metronidazolu, eventuální radikál je pak ale v tzv. jalovém cyklu díky přítomnosti kyslíku přeměněn zpět na metronidazol. Z kyslíku pak vzniká superoxid, O2-. U anaerobů či mikroaerofilů k takto kyslíkem podmíněné detoxifikaci nitroradikálu nedochází a tak vyvinuli jiné způsoby, jak buňku ochránit před jeho škodlivými ůčinky. Vnímavost těchto patogenů k metronidazolu koreluje se změnami v jejich enzymatickém sloţení. Asi nejzákladnější mechanismus, jak patogeni bojují proti metronidazolu, je zamezení redukce metronidazolu. To, jakým způsobem organismy zamezují redukci, se druh od druhu liší. Je tu vzájemný vztah mezi rezistencí k metronidazolu a neefektivní aktivací antibiotika, coţ naznačuje, ţe rezistence je výsledkem modifikace proteinů spojených s aktivací antibiotika. Další mechanismus, který některé rezistentní organismy pouţívají, je přeměna reaktivního nitroradikálu na neaktivní amin či zpět na metronidazol. Mechanismy rezistence u jednotlivých modelových druhů organismů budou probrány v následujících kapitolách této práce. Klíčová slova: rezistence, metronidazol, bakterie, anaerobní eukaryota, hydrogenozom
4
ABSTRACT This bachelor thesis tries to describe mechanisms of resistance in different groups of organisms, where metronidazole is used for treatment. These organisms are bacteria (genus Bacteroides, Helicobacter, Clostridium) as well as anaerobic eukaryota (genus Trichomonas, Tritrichomonas, Entamoeba, Giardia). It is important, that metronidazole acts selectively only on cells living in anaerobic or microaerophilic environments. Metronidazole enters the cell by passive diffusion and is subsequently reduced to cytotoxic intermediate which damages the cell at different levels. Metronidazole can also enter the cell with aerobic metabolism, also the reduction can occur, but the eventual radical is then thanks to oxygen transformed back to metronidazole in the process called futile cycling. Oxygen then forms superoxide, O2 -. Organisms with aerobic or microaerophilic metabolism cannot detoxify nitroradical with oxygen, so they developed other ways how they protect themselves against the harmful effects of nitroradicals. Sensitivity of these patogens to metronidazole correlates with the changes of their enzymatic constitution. Perhaps the most basic mechanism how the patogens combat metronidazole is the prevention of reduction of the drug. The way how the organisms prevent reduction differs between species. There is a correlation between rezistance to metronidazole and inefficient activation of the drug. That indicates that rezistance is the result of modification of proteins involved in drug activation. Another mechanism, which is used by some organisms, is the transformation of reactive nitroradical to inactive amine or back to metronidazole. Mechanisms of rezistance of inividual model organisms will be discussed in the following chapters of this thesis. Key words: resistance, metronidazole, bacteria, anaerobic eukaryots, hydrogenosome
5
1. Úvod Objasnění a pochopení mechanismu rezistence jakéhokoliv patogena k léčivu nebo spektru léčiv pomáhá v boji proti patogennímu organismu a k potlačení infekce, k vývoji jiných léčiv, či dokonce k eradikaci patogena. Proto je velmi důleţité se na tyto procesy zaměřit a důkladněji je zkoumat a popsat. Cílem této práce je tedy shrnout poznatky o rezistenci bakterií a anaerobních eukaryot k metronidazolu, mnohdy jedinému antibiotiku uţívanému v boji proti patogenům z této skupiny organismů. Zároveň bych se touto prací chtěla přiblíţit k mému tématu diplomové práce, která je zaměřena na ţelezosirné flavoproteiny u anaerobního parazitického prvoka Trichomonas vaginalis. Tyto proteiny pravděpodobně plní roli elektrontransportérů podílejících se na anaerobním metabolismu hydrogenozomu T. vaginalis. Současně ale zatím nelze vyloučit, ţe by se mohly podílet i na mechanismu rezistence trichomonády k metronidazolu. Rezistence k metronidazolu u trichomonády je nyní diskutované téma, jelikoţ se ukázalo, ţe k aktivaci metronidazolu pravděpodobně nedochází jen v hydrogenozomu trichomonády ale asi i v cytoplazmě a mechanismus účinku metronidazolu u trichomonády se tím opět stává otevřenou otázkou.
6
2. Metronidazol a jiné nitroimidazolové deriváty 2.1
Struktura nitroimidazolů Nitroimidazoly jsou nitroheterocyklické sloučeniny, tj. sloučeniny s pětičetným
kruhem se dvěma dusíky a s nitroskupinou (NO2-) na druhém, čtvrtém či pátém atomu kruhu. K léčbě se pouţívají jejich různé deriváty. Nitroimidazolových derivátů je velká škála. Pro biologickou aktivitu nitroimidazolů je důleţitá právě nitroskupina navázaná buď na druhém, čtvrtém nebo pátém atomu imidazolového kruhu. 5-nitroimidazoly, z nichţ nejznámější je metronidazol (1-(2-hydroxyetyl)-2-metyl-5-nitroimidazol), jsou dále substituovány buď na prvním nebo druhém atomu imidazolového kruhu (Rossignol et al., 1984). 4-nitroimidazoly nejsou zdaleka tak účinné jako metronidazol (Edwards et al., 1973), a toxicita 2nitroimidazolů je zpravidla větší neţ u 5-nitroimidazolů (Rossignol et al., 1984) (Obr. 1.).
Obr. 1. Imidazol, 5-nitroimidazol a 1-(2-hydroxyetyl)-2-metyl-5-nitroimidazol (metronidazol)
2.2
Použití nitroimidazolů Nitroimidazoly jsou látky se širokým spektrem vyuţití. Pouţívají se proti Gram-
pozitivním a Gram-negativním bakteriím, proti protozoím jako například Entamoeba histolytica, Giardia intestinalis, Trichomonas vaginalis, Tritrichomonas foetus, Balantidium sp., příleţitostně proti helmintům a dokonce proti hypoxickým nádorům. Běţně se vyuţívají k prevenci pooperační sepse, většinou zahrnující Bacteroides sp. a k léčbě gastroduodenálních vředů, které podmiňuje Helicobacter pylori. Benznidazol (2-nitroimidazol) se běţně pouţívá k léčbě
infekce
způsobené
Trypanosoma
cruzi,
Chagasovy choroby,
a
společně
s misonidazolem (další 2-nitroimidazol) a nimorazolem se pouţívá k experimentální léčbě hypoxických nádorů rezistentních vůči záření (Edwards, 1993a). Nitroimidazoly se uţívají jiţ přes třicet let. Jako první byl do klinické praxe roku 1960 zaveden metronidazol, který se pouţívá dodnes. I přes jejich dlouhodobé uţívání je výskyt rezistence k nim u anaerobů relativně nízký. Ţádná jiná skupina léků nemá tak široké vyuţití jako právě nitroimidazoly. Aplikují se jak u člověka, tak ve veterinární medicíně 7
(Edwards, 1993a). První zmínka o rezistenci se objevila u Trichomonas vaginalis dva roky poté, co se k její léčbě začal pouţívat metronidazol. A osmnáct let po první aplikaci metronidazolu se objevila rezistence u Bacteroides fragilis u pacienta s dlouhodobou léčbou Crohnovy choroby (Edwards, 1993b).
2.3
Aktivace nitroimidazolů Všechny nitroimidazolové deriváty pouţívané jako chemoterapeutika jsou
v neredukovaném stavu netoxické a vyţadují nejprve redukci nitroskupiny na cytotoxický reakční produkt. Všeobecně přijímaný názor je, ţe hlavním cytotoxickým agens je nestabilní produkt redukce, nejspíše jednoelektronový nitroradikálový aniont, jenţ oxiduje DNA, coţ způsobuje zlomy na vláknech DNA a následně buněčnou smrt (Edwards, 1993a). Aby mohla být molekula nitroimidazolu zredukována, musí nejdříve vstoupit do buňky. To se děje pasivní difuzí. Tento děj je zároveň podpořený tím, ţe uvnitř buňky dochází k redukci nitroimidazolu, čímţ se udrţuje koncentrační gradient léčiva (Edwards, 1993a). Míra redukce nitroskupiny je závislá na počtu elektronů zapojených v tomto procesu a na tom, jaký je redoxní potenciál léčiva. Teoreticky, u typické nitroaromatické sloučeniny, je zapotřebí šesti elektronů, aby byla nitroskupina (-NO2) kompletně zredukována na aminoskupinu (-NH2). Tato klasická redukce probíhá přes nitrózové (2e-) a hydroxylaminové (4e-) intermediáty podle reakce: R-NO2 (+ 1e-) = R-NO2- (+ 1e-) = R-NO (+ 2e-) = R-NHOH (+2e-) = R-NH2 Redukce probíhá u různých organismů na různé úrovni. Výše uvedená reakce však ale neprobíhá aţ k produktu R-NH2 a nebo probíhá velmi zřídka. Důvody pro to jsou následující: zaprvé, energie potřebná k redukci hydroxylaminu na amin je velmi vysoká, a zadruhé, redukce nitroimidazolu vede k vytvoření jednoelektronového nitroradikálu, který podstupuje rychlý rozpad a vzniká z něj nitritový iont, NO2-, a imidazolový radikál. Redukce jedním elektronem pak tudíţ znemoţňuje další průběh redukce (Edwards, 1993a): R-NO2- =R• + NO2 Obecně se tedy předpokládalo, ţe dochází především k tvorbě jednoelektronového nitroradikálu, který následně poškozuje buňku. Ví se ale, ţe například bakterie rodu 8
Bacteroides citlivé k metronidazolu sice aktivují antibiotikum jedním elektronem za vzniku radikálu, ale mají nim geny, které kódují nitroreduktázy redukující nitroimidazoly dvěma elektrony. Tím předcházejí kumulaci cytotoxického nitroradikálu a sniţují tak poškození buňky (Sóki et al., 2006). U T. vaginalis a E. histolytica se podle nově navrţeného schématu aktivace a rezistence k metronidazolu (Leitsch et al., 2007; Leitsch et al., 2009) předpokládá, ţe redukce nitroimidazolu jedním elektronem, kdy vzniká nitroradikál, je pouze předstupněm další redukce na nitrózové a hydroxylaminové intermediáty, které se následně váţí na proteiny, cysteiny a DNA. 5-nitroimidazoly mají vliv převáţně na organismy s anaerobním metabolismem. Z hlediska redukce nitroimidazolu je důleţité to, ţe redoxní páry v anaerobní buňce mají více negativní (niţší) redoxní potenciál neţ u aerobů (Edwards and Mathison, 1970). U typických anaerobů dochází k redukci díky pyruvát:ferredoxin oxidoreduktáze, kde tento enzym katalyzuje reakci přeměny pyruvátu na acetyl-CoA a CO2 a elektrony získané v této reakci předává na ferredoxin, který následně redukuje nitroimidazol. Ferredoxin by za normálních podmínek předal elektrony na vodíkové ionty za vzniku vodíku v reakci katalyzované hydrogenázou (Edwards et al., 1973). Toto přerušení normálního toku elektronů však není pro buňku letální. Za povšimnutí stojí, ţe míra aktivity pyruvát:ferredoxin oxidoreduktázy u obligátně anaerobních organismů koreluje se stupněm citlivosti organismu a mnoţstvím importovaného nitroimidazolu do buňky. Navíc, ferredoxin není jediný protein, který je donorem elektronů 5-nitroimidazolům. Také enzym hydrogenáza je schopný redukovat nitroskupinu 5-nitroimidazolů a 2-nitroimidazolů (Edwards, 1993a). Kaţdá redoxní reakce v buňce, která má redoxní potenciál negativnější (niţší) neţ reakce páru nitroimidazol-ferredoxin, uskuteční přednostně přenos elektronů na nitroimidazol. Typičtí anaerobové mají redoxní mechanismy zaloţené na hodnotách od -430 do -460 mV, coţ je hodnota charakteristická pro určité typy ferredoxinů. Nitroskupina metronidazolu má redoxní potenciál -415 mV. Metronidazol je tudíţ více účinným akceptorem elektronů. To znamená, ţe kaţdá reakce s vyšším potenciálem je více výkonný akceptor elektronů – je více elektronafinitní – neţ nitroimidazol. U aerobů jsou fyziologicky nejvýznamnějšími donory elektronů redoxní páry NAD/NADH (-320 mV) a NADP/NADPH (-324 mV). Jejich redoxpotenciály jsou pozitivnější, neţ má nitroimidazol. Díky tomu se nitroimidazoly u aerobů redukují jen velmi málo a jsou tudíţ v podstatě neúčinné. Kdyţ uţ dojde k redukci, tak díky přítomnosti kyslíku je poškození buňky limitováno, nebo k němu vůbec nedojde, protoţe kyslík je nejlepší známý biologický akceptor elektronů a velmi rychle odnímá elektrony 9
z nitroradikálu a vzniká tak opět původní nitroimidazol a superoxid, O 2 -. Toto je proces známý jako jalový cyklus (Edwards, 1993a): R-NO2 + e- = R-NO2R-NO2- + O2 = R-NO2 + O2-
2.4
Poškození buňky způsobené nitroimidazoly Nitroimidazoly narušují či inhibují elektronový tok v buňce a poškozují DNA.
Nedávno se však objevily práce, dokládající, ţe účinky nitroimidazolů mohou zahrnovat i jiné fyziologické mechanismy poškozující buňku. První práce na toto téma se zabývá vysvětlením pozorování, ţe za vysokých koncentrací antibiotika je smrt typické anaerobní buňky rychlejší, neţ jak bylo vypočítáno jen pro samotné poškození DNA. Jedním vysvětlením je velmi rychlá lýze bakteriálních buněk (Clostridium pasteurianum). Tuto teorii potvrzuje detekce proteinů v supernatantu bakteriálních kultur v době, kdy v kontrolní kultuře neproběhly ţádné změny. K lýzi by mohlo dojít v důsledku energetické krize buňky, kdy náhlé poškození DNA by vedlo k rychlé syntéze enzymů opravného systému DNA. Tím, ţe má SOS opravný systém okolo patnácti enzymů a je známo, ţe všechny nitroimidazoly indukují tuto opravnou odpověď (Edwards, 1993a), by po expozici k nitroimidazolu nastal náhlý a značný energetický výdej nejen na syntézu opravných enzymů, ale také na jejich aktivitu. Tyto procesy vyţadují jednak přenos velkého mnoţství elektronů a také velké mnoţství energie. Hlavní cestou k produkci ATP je u studovaných bakterií aktivita pyruvát:ferredoxin oxidoreduktázy. Pokud buňka není schopna zastat všechny tyto procesy a chemoterapeutikum jakýmkoliv způsobem interaguje se sloţkami elektrontransportního řetězce (Lloyd and Kristensen, 1985), můţe to vést k tomu, ţe se naruší homeostáze energetického metabolismu buňky a v důsledku toho můţe být narušena integrita membrány, vedoucí k rychlému a ireverzibilnímu zhroucení systému, projevujícímu se jako lýze (Edwards, 1993a). Druhá studie naznačuje, ţe metronidazol má vliv na povrchové vlastnosti buněk (v tomto případě u Bacteroides fragilis), čímţ zvyšuje šanci buňky na pohlcení makrofágem fagocytózou. Tato zajímavá hypotéza je zaloţená na pozorování, ţe jak povrchový náboj, tak hydrofobicita organismu jsou zvýšené vlivem metronidazolu za klinicky významných koncentrací. (Tyto dva parametry jsou důleţité ve vztahu mezi buňkami hostitele a patogenem díky tomu, ţe umoţňují bakterii přiblíţit se k negativně nabitému povrchu buňky.) To vede celkově ke zvýšené míře fagocytózy, umocněné přítomností antibiotika (Edwards, 1993a). 10
Je všeobecně známé, ţe nitroimidazolové radikály poškozují DNA. Stupeň poškození závisí na sloţení bází v DNA. Nitroimidazoly poškozují více DNA s relativně vyšším obsahem AT párů neţ s vyšším obsahem GC párů. Předpokládá se, ţe tato léčiva indukují zlomy na DNA specificky na A nebo T bázích. T se zdá být pravděpodobnějším cílem, protoţe jak 2- tak 5-nitroimidazoly uvolňují z DNA směs tyminu a tymidin fosfátu, ale ne jiných bází. Například T. vaginalis, E. histolytica a klostridie mají obyčejně obsah A a T bází převyšující 70% a pro tyto organismy je minimální letální koncentrace (MLC) nitroimidazolů v rozmezí od 0,1 do 1,0 mg/l, narozdíl od Rhodopseudomonas acidophila, pro kterou je MLC 25 mg/l a jejíţ obsah A a T je 35% (Edwards, 1993a). Poškození DNA probíhá na úrovni zlomů na dvoušroubovici DNA a destabilizace helikální struktury. Ukázalo se, ţe se redukované nitroimidazoly váţí na G báze DNA. Navázání redukovaného nitroimidazolu koreluje s procentuálním zastoupením G a C párů v DNA (Declerck et al., 1983). Nicméně vazba na G báze nekoreluje s mírou poškození DNA, které v kaţdém případě souvisí s procentuelním obsahem A a T párů (Edwards, 1993a). Předpokládá se, ţe u anaerobních eukaryot platí, ţe čím více pozitivní redoxní potenciál léčivo má, tím větší poškození způsobuje buňce – je více cytotoxické. Se stovkami nitro-heterocyklických sloučenin byly provedeny testy závislosti poukazující na vztah mezi mírou redukce, hodnotou redoxního potenciálu a mírou cytotoxicity. Tento vztah lze vyjádřit také tak, ţe pro kaţdý pozitivní posun v redoxním potenciálu o 100 mV vzroste cytotoxicita sloučeniny dvakrát. U bakterií je to naopak. Cytotoxicita se zdvojnásobí s kaţdým sníţením o 110 mV. Navíc, poškození je výraznější při kyselém pH, coţ znamená, ţe škodlivý činitel je protonován. Tato informace spolu s tím, ţe se poškození objevuje pouze za přítomnosti DNA a ne jen kdyţ je DNA přidána několik sekund po redukci antibiotika vede k domněnce, ţe původce poškození by mohl být jednoelektronový nitroradikál. Ačkoliv volné radikály jsou velmi reaktivní, ukazuje se, ţe za fyziologického pH je jejich doba ţivotnosti dlouhá natolik, aby mohly difundovat z místa vzniku aţ k DNA a tam vyvolat její poškození (Edwards, 1993a). Tyto předpoklady umoţňují sestavit model mechanismu účinku nitroimidazolů (Obr. 2), který zahrnuje známé vlastnosti, charakteristiky a chování antibiotik (Edwards, 1993b).
11
Obr. 2. Původní model mechanismus působení metronidazolu u trichomonád (Edwards, 1993a). (a) Mnoţství glukózy, které vstupuje do buňky, závisí na míře fosforylace glukózy na glukóza-6-fosfát. Tento proces odráţí hladinu ADP / ATP a tím i energetický stav buňky. (b) Mnoţství nitroimidazolů vstupujících do buňky je závislé na koncentraci léčiva a na míře redukce nitroskupiny reakcí (c) nebo jinou nitroreduktázou. (c) Tato reakce je u anaerobů klíčová a vyţaduje elektrontransportní proteiny s nízkým redoxním potenciálem, většinou nějaký Fe-S protein. Inhibice nebo sníţená hladina přeměny pyruvátu na acetyl-CoA sniţuje hladinu redukce chemoterapeutika a tím i míru poškození DNA. Sníţená míra poškození DNA umoţňuje opravnému systému (h) lépe se s poškozením vypořádat. (d, e) Inhibice (c) vede k přeměně pyruvátu na laktát (d, T. vaginalis) eventuelně na etanol (e, T. foetus). Rezistence
tak
odklonem
metabolismu
vede
k mléčnému
(etanolovému)
kvašení
doprovázeného sníţenou redukcí chemoterapeutika tím, ţe se blokuje přeměna pyruvátu na acetyl-CoA a CO2, a následkem toho nedochází k redukci metronidazolu ferredoxinem. (f) Zjednodušené schéma substrátové fosforylace. Kdyţ je tato dráha blokována nebo omezena u rezistentních organismů, je produkce energie sníţena a je hledána alternativní dráha produkce ATP. (g) Popisuje redukci nitroimidazolu. (h) Poničená DNA je většinou velmi dobře opravena. Efektivnost oprav závisí na rozeznání povahy poruchy a efektivnosti opravných procesů. Efektivnost oprav je kombinací času, který je potřebný k rozeznání poškození DNA, účinností oprav a přesností těchto oprav. 12
2.5
Rezistence k nitroimidazolům Přirozeně se veškeré organismy snaţí bránit proti poškození způsobenému
chemoterapeutiky, která se pouţívají k jejich léčbě. A není tomu jinak ani u anaerobů (mikroaerofilů) a obraně proti poškození nitroimidazoly. Jiţ v úvodních odstavcích této kapitoly jsem zmínila, ţe jako první nitroimidazol se začal pouţívat metronidazol – u T. vaginalis (1960) (Edwards, 1993a) a rezistence k němu byla pozorována dva roky poté, co byl zaveden do klinické praxe právě u T. vaginalis (Robinson, 1962). Molekulární podstata rezistence k metronidazolu je zkoumána jak u anaerobních bakterií, jako je Bacteroides, Clostridium a Helicobacter, tak také u parazitických protist – Giardia, Entamoeba a u trichomonád. Vnímavost těchto patogenů k metronidazolu koreluje se změnami v jejich enzymatickém sloţení. Rezistentní buňky typicky nedostatečně aktivují metronidazol. Objevuje se tu vzájemný vztah mezi rezistencí k metronidazolu a neefektivní aktivací antibiotika, coţ naznačuje, ţe rezistence je výsledkem modifikace proteinů spojených s aktivací antibiotika. To je pravděpodobně způsob, jakým dochází k vývoji rezistence (Land and Johnson, 1999). Další podrobnější popis aktivace metronidazolu a mechanismů rezistence k němu u různých organismů bude probrán v následujících kapitolách této práce.
13
3. Mechanismy rezistence u bakterií Metronidazol se jiţ dlouho vyuţívá jako účinné antibiotikum proti mnoha typům anaerobních bakteriálních patogenů, zahrnujícím např. rody Clostridium a Bacteroides. V posledních letech bylo pozorováno, ţe je toto antibiotikum také účinné proti různým mikroaerofilním bakteriím jako je Helicobacter pylori a Campylobacter sp. S nárůstem jeho pouţívání proti mikroaerofilním organismům se objevily rezistentní izoláty různých bakterií (Land and Johnson, 1999).
3.1
Bacteroides Bacteroides fragilis a Bacteroides thetaiotaomicron jsou součástí normální
gastrointestinální mikroflóry a jsou důleţitými oportunními patogeny, kteří jsou schopni způsobit ţivot ohroţující infekce, jako například zánět pobřišnice, váţné gynekologické sepse, absces měkkých tkání nebo mozku. Tyto infekce se léčí metronidazolem (Wexler, 2007). Rezistence k metronidazolu u B. fragilis byla poprvé popsána v roce 1977 (Edwards, 1993b). Předpokládá se, ţe k aktivaci metronidazolu dochází redukcí ferredoxinem a ţe rezistence k metronodazolu je zaloţena na podobných mechanismech jako u T. vaginalis (Diniz et al., 2004). Následně byl díky in vitro studiím popsán i sníţený import metronidazolu do buňky (Edwards, 1993b). Zároveň se ví, ţe Bacteroides sp. je schopný vyvinout si rezistenci k metronidozu aktivací nim genů („nitroimidazole rezistence genes“), které jsou kódované na mobilních genetických elementech a chromozomech (u bakterií rodu Bacteroides se vyskytuje sedm skupin nim genů – nim A-G). Kódují reduktázy, které přeměňují nitroskupinu metronidazolu na amin díky přenosu dvou elektronů a znemoţňují tak jeho aktivaci (Leiros et al., 2004; Patel et al., 2009). Studie na B. fragilis naznačují, ţe rezistentní izoláty mají sníţený příjem metronidazolu díky sníţené aktivitě pyruvát:ferredoxin oxidoreduktázy, protoţe je tím sníţena míra redukce nitroimidazolu. Nedochází tak ke vstupu metronidazolu do buňky díky koncentračnímu gradientu. Zároveň s tím se zjistilo, ţe sníţená hladina redoxních dějů v buňce způsobuje změny v koncových produktech metabolismu glukózy, coţ vede ke zvýšení hladiny laktátu u rezistentních buněk. Zvýšená hladina laktátu koreluje se zvýšením aktivity laktát
dehydrogenázy.
Ta spotřebovává pyruvát
místo
pyruvát:ferredoxin
oxidoreduktázy, jejíţ aktivita je sníţena. Tyto změny jsou podobné změnám u T. vaginalis a jejímu přizpůsobení metabolismu (Obr. 2.) (Edwards, 1993b). 14
Je známo, ţe zvýšená exprese membránových transportérů, tzv. pump, odčerpávajících různé cizorodé látky, hraje roli v rezistenci Bacteroides sp. k velkému mnoţství antibiotik (Wexler, 2007). Ačkoliv by se tento mechanismus mohl podílet na k metronidazolu, inhibitory pump neobnovují citlivost na metronidazol u multirezistentních B. fragilis, i kdyţ postrádají nim geny (Pumbwe et al., 2007). Studie rezistence k metronidazolu u B. thetaiotaomicron naznačuje, ţe zvýšená exprese genu rhaR (kódující protein regulující katabolismus rhamnosy) vyvolává u tohoto rodu rezistenci. Výsledky potvrzují vztah mezi zvýšenou hladinou proteinu RhaR a pozorovanou rezistencí k metronidazolu (Patel et al., 2009). Lepší růst a rezistence k metronidazolu pozorované u B. thetaiotaomicron se zvýšenou expresí genu rhaR pěstovaného za přítomnosti rhamnosy by mohly být způsobeny zvýšenou hladinou proteinu RhaR, ovlivňujícího enzymy zodpovědné za aktivaci metronidazolu. Výsledky ukazují, ţe aktivita laktát dehydrogenázy u B. thetaiotaomicron, který má zvýšenou expresi rhaR genu a je pěstovaný v médiu s rhamnosou, byla čtyřikrát aţ pětkrát vyšší neţ u původního kmene, zatímco aktivita pyruvát:ferredoxin oxidoreduktázy u těchto rezistentních kmenů byla sedmkrát aţ desetkrát niţší v porovnání s původním kmenem. Je tedy moţné, ţe při růstu v médiu obohaceném rhamnosou by mohla být rezistence k metronidazolu přisuzována nedostatečné aktivaci metroniadzolu díky pozměněnému elektronovému toku, který je způsoben zvýšenou mírou katabolismu rhamnosy. Je téţ moţné, ţe jakákoliv mutace, která zvýší katabolismus v buňce, spojený s poklesem aktivity pyruvát:ferredoxin oxidoreduktázy, generuje rezistenci k metronidazolu u Bacteriodes sp. Rezistence k metronidazolu u tohoto kmene byla ovšem pozorována i při růstu za přítomnosti glukózy, kde produkty katabolismu rhamnosy nemohly nic ovlivnit. Zatímco výsledky pozorování za přítomnosti rhamnosy naznačovaly, ţe rezistence byla pravděpodobně způsobena sníţením aktivace metronidazolu, fakt, ţe rezistence byla téţ pozorována za přítomnosti glukózy, toto tvrzení zpochybňuje. Je tudíţ pravděpodobné, ţe protein RhaR kódovaný genem rhaR má moţná další, dosud neidentifikovanou regulační funkci, která by mohla ovlivňovat buněčnou odpověď na metronidazol (Patel et al., 2009).
3.2
Helicobacter Helicobacter pylori je spirální Gram-negativní mikroaerofilní bakterie, která
selektivně kolonizuje mukózní vrstvu lidského ţaludku a duodena. Způsobuje chronickou gastritidu, ţaludeční vředy, duodenální vředy, ţaludeční lymfom a ţaludeční adenokarcinom 15
(Lembo et al., 2009). Byla poprvé izolována v roce 1982 ze ţaludeční sliznice pacienta postiţeného gastritidou a peptickým vředem. Od té doby je tu stále silnější předpoklad, ţe H. pylori hraje důleţitou roli u duodenálních vředů (Land and Johnson, 1999). Metronidazol
byl
pouţíván
při četných
antimikrobiálních
terapeutických
strategiích k vymýcení H. pylori. O rezistenci H. pylori se vědci začali zajímat více aţ se vznikem rezistence v rozvojových zemích a také s narůstajícími případy rezistence v USA a Evropě (Dunn et al., 1997). Nynější léčba chorob, způsobených H. pylori, vyţaduje kombinaci mnoha antibiotik a inhibitorů protonových pump (proton pump inhibitor, PPI) podávaných po dobu sedmi aţ čtrnácni dnů. K léčbě se vyuţívá metronidazol v kombinaci s PPI, tetracyklinem a bizmutem, nebo clarithromycin v kombinaci s PPI a amoxicillinem. Tato kombinace antibiotik je sice účinná, ale je ale často spojena s neţádoucími vedlejšími účinky. Míra eradikace se pohybuje mezi 72% a 95% (Lembo et al., 2009). Předpokládané mechanismy rezistence k metronidazolu u H. pylori byly následující: (1) sníţený import léčiva do buňky nebo aktivní odčerpávání; (2) chybný mechanismus aktivace nebo modifikace metronidazolu; (3) zvýšená reparační schopnost DNA nebo v prostředí přítomný kyslík chránící buňku před neţádoucími účinky metronidazolu (Hoffman et al., 1996). Studie rezistence ale ukázaly, ţe ani sníţený import, ani zvýšené odčerpávání roli v rezistenci k metronidazolu nehrají (Mendz and Megraud, 2002). Prvotní
biochemické
na metabolické enzymy H.
studie
pylori,
na
rezistentních
izolátech
byly
konktétně na pyruvát:ferredoxin /
zaměřené flavodoxin
oxidoreduktázu (PFOR) a α-ketoglutarát oxidoreduktázu (KOR) (Hoffman et al., 1996). Předpoklad této práce byl zaloţen na studiích u anaerobních protist, které ukazovaly, ţe aktivita PFOR byla sníţena u rezistentních kmenů. Studie Hoffmana a jeho kolegů ukázala, ţe aktivity PFOR a KOR u rezistentních kmenů H. pylori byly potlačené u buněk rostoucích za přítomnosti metronidazolu, ale ne za jeho nepřítomnosti. Z tohoto zjištění autoři usuzovali, ţe by bakterie reistentní k metronidazolu mohly regulovat aktivitu metabolických enzymů PFOR a KOR u H. pylori. Za přítomnosti metronidazolu by sniţovaly aktivitu enzymů a naopak, jeho za jeho nepřítomnosti by aktivitu enzymů zvyšovaly. Zdali byl tento regulační efekt primárním důvodem rezistence k metronidazolu, nebo jestli to byl sekundární projev jiné mutace, se neprokázalo (Land and Johnson, 1999) Při pokusech s rezistencí byl z kmene rezistentního k metronidazolu vyizolován gen recA, gen potřebný k opravám DNA a k rekombinaci, a zaklonován do E. coli. Zdá se, ţe 16
exprese genu recA zvyšuje hladinu rezistence u E. coli (Chang et al., 1997). A při inaktivaci genu recA u H. pylori se zvýšila citlivost H. pylori k metronidazolu (Land and Johnson, 1999). Nicméně, gen recA z buněk citlivých na metronidazol byl nalezen i u rezistentních buněk, coţ nasvědčuje, ţe rezistence nezávisí na mutaci v tomto genu (Marais et al., 2003). Bylo zjištěno, ţe u této bakterie je přirozená rezistence silně spjata s mutací, přesněji s delecí v rdxA, chromozomálního genu, kódujícího na kyslík necitlivou NADPH nitroreduktázu, a v mutaci ve frxA, chromozomálního genu, kódujícího NAD(P)H:flavin oxidoreduktázu. Rezistence se můţe objevit buď s inaktivací genu pro rdxA, nebo s inaktivací obou, jak rdxA, tak frxA, nebo jen s inaktivací frxA (to ale pouze zřídka). Mutace ve frxA spíše pouze zvyšuje míru rezistence k metronidazolu, způsobenou mutací v rdxA (Mendz and Megraud,
2002).
Tím
dochází k inhibici
redukce
metronidazolu.
Ale
rezistence
k metronidazolu se můţe objevit i bez mutace v rdxA a frxA, coţ naznačuje, ţe jsou v mechanismu rezsitence k metronidazolu zahrnuty ještě i jiné genetické elementy (Kim et al., 2009). Například se zjistilo, ţe u kmenů reistentních k metronidazolu dochází ke zvýšení hladiny β-podjednotky riboflavin syntetázy, která je zapojená do tvorby riboflavinu, který je hlavní součástí FAD a FMN. FAD je substrátem pro FrxA a zvýšená hladina FAD by tak kompetovala s metronidazolem a vedla by tak k inhibici redukce metronidazolu. Dále u rezistentních kmenů dochází ke sniţování hladin PFOR a také γ-podjednotky ferredoxin oxidoreduktázy. Oba tyto proteiny jsou schopné redukovat ferredoxin, který následně redukuje metronidazol. Tudíţ sníţení hladin těchto proteinů by sniţovalo míru redukce metronidazolu. A neméně důleţitou roli hraje i zvýšení hladin proteinů zapojených do oxidoredukčních dějů, které napomáhají buňce vyrovnat se s oxidativním stresem způsobeným aktivací metronidazolu (Kaakoush et al., 2009).
3.3
Clostridium Clostridium difficile je anaerobní, Gram-pozitivní bakterie. Přenáší se fekálně-
orální cestou a je nejběţnější infekční příčinou průjmových onemocnění v rozvojových zemích (Poutanen and Simor, 2004; Leffler and Lamont, 2009). Studie rezistence k metronidazolu u rodu Clostridium ukázaly, ţe hydrogenáza 1 u C. pasteuranium hraje důleţitou enzymatickou roli v redukci metronidazolu pomocí mechanismu spřaţeného s ferredoxinem. Geny kontrolující aktivaci metronidazolu u rodu C. acetobutylicum byly téţ identifikovány. Mezi geny, které se ukazují být zodpovědné za senzitivitu k metronidazolu, byly také ty, které kódují flavodoxin a hydrogenázu. Tyto 17
proteiny by mohly slouţit jako donory elektronů pro aktivaci metronidazolu. A zároveň i flavodoxiny z klostridie se ukázaly být schopné nahradit ferredoxiny jako donory elektronů (Land and Johnson, 1999).
18
4. Mechanismy rezistence u anaerobních eukaryot Metronidazol se pouţívá nejen k léčbě bakteriálních patogenů, ale také k léčbě infekcí způsobených anaerobními
protozoálními parazity jako
jsou
Trichomonas,
Tritrichomonas, Giardia a Entamoeba (Land and Johnson, 1999).
4.1
Trichomonas vaginalis Trichomonas vaginalis je bičíkatý prvok, který infikuje urogenitální trakt člověka.
Je to organismus způsobující zánět pochvy a uretritidu, coţ jsou nejčastější nevirové sexuálně přenosné nemoci na světě (Leitsch et al., 2009). Je to jeden z organismů, který nemá klasickou mitochondrii a spolu s dalšími trichomonádami patří do skupiny parazitických jednobuněčných eukaryot, u kterých byl poprvé objeven hydrogenozom (Lindmark and Muller, 1973; Lindmark et al., 1975). Hydrogenozom je organela mitochondriálního typu charakteristická svou funkcí. Za anaerobních podmínek produkuje molekulární vodík oxidací pyruvátu nebo malátu. Organely s velmi podobnými biochemickými procesy byly nalezeny u protist, které se vyskytují v prostředích chudých na kyslík nebo v anoxických prostředích (Müller, 1993). Nalezeny byly taktéţ u nálevníků z (Snyers et al., 1982) a chytridiomycét (Müller, 1993). Hydrogenozomy nebyly nalezeny u mnohobuněčných ţivočichů nebso rostlin (Müller, 1993). Metabolismus hydrogenozomu je nejlépe prostudován u trichomonád (Hrdý, 2007) (Obr. 3.).
19
Obr. 3. Navrţená metabolická mapa hydrogenozomu T. vaginalis (Hrdý, 2007). Oranţové obdélníky představují enzymy, o kterých se ví, ţe jsou zapojené do energetického metabolismu.
Ţlutými ovály je
znázorněn ferredoxin,
který poskytuje elektrony
hydrogenázám, které následně produkují vodík. Růţově je znázorněn metronidazol, kterému ferredoxin předává elektrony, které získal oxidativní dekarboxylací malátu nebo pyruvátu. To vede k aktivaci metronidazolu. Předpokládané funkce proteinů jsou barevně znázorněny následovně: růţově, skládání ţelezosirných klastrů a hydrogenázy; modře, detoxifikace kyslíku; ţlutě, metabolismus aminokyselin; a zeleně, translokace a maturace proteinů. Prázdná kolečka v membráně naznačují neidentifikované transportéry, které pravděpodobně umoţňují transport substrátů a metabolitů. Zkratky: AK, adenylát kináza; Fdx, ferredoxin; GDC, komplex glycin dekarboxylázy; Hy, hydrogenáza; PFOR, pyruvát:ferredoxin oxidoreduktáza; SOD, superoxid dismutáza; STK, sukcinát thiokináza (sukcinát CoA ligáza, sukcinyl-CoA syntetáza); SHMT, serin hydroxymetyl transferáza; Trx, thioredoxin; TrxP, thioredoxin peroxidáza; TrxR, thioredoxin reduktáza; THF-CH2, N5, N10 – metylen tetrahydrofolát; ASCT, sukcinyl-CoA:acetát CoA transferáza; oxidase?, tuto reakci pravděpodobně katalyzuje „flavodiiron protein A“; HydG, HydF a HydE, maturázy Fe hydrogenázy; IscS, cystein desulfuráza; IscU, „FeS scaffold protein“; IscA a Nfu, alternativní „FeS scaffold protein“; Hsp70, Hsp60, Hsp10, proteiny tepelného šoku („heat shock protein“); Jac1 a Mdj1, J – doména obsahující kochaperony; Mge, „nucleotide exchange factor“; HPP, hydrogenozomální procesovací peptidáza; Hmp35, hydrogenozomální integrální membránový protein; Tom?, předpokládaná translokáza vnější membrány; Tim23?, základní translokáza vnitřní membrány; Sam50, základní sloţka „sorting and assembly machinery“; Pam18, „J-domain containing protein of the presequence translocase associated motor komplex“; MCF, „mitochondrial carrier family protein“ (Hmp31, ATP/ADP přenašeč). Přerušovaná čára představuje předpokládané reakce. Hydrogenozomy
postrádají
mnoţství
biochemických
procesů
a
sloţek
charakteristických pro mitochondrii. Ty by mohly chybět v důsledku sekundárních ztrát, které proběhly jako adaptace na anaerobní metabolismus. Tyto organely však ale také obsahují nejméně dva enzymy klíčové pro jejich metabolismus, které nenalezneme v typické mitochondrii. Jsou jimi pyruvát:ferredoxin oxidoreduktáza a hydrogenáza. Některé enzymy a další sloţky se zase nacházejí u obou, mitochondrií i hydrogenozomů. Těmi jsou ferredoxin, sukcinát thiokináza a adenylát kináza (Müller, 1993). 20
Do nedávné doby se předpokládalo, ţe hydrogenozom je jediným místem aktivace antibiotik, pouţívaných proti anaerobním bakteriím a protistům – metronidazolu a jiných 5nitroimidazolů. Podle původního modelu aktivace metronidazolu u trichomonád vznikají elektrony pro redukci metronidazolu oxidací pyruvátu pomocí pyruvát:ferredoxin oxidoreduktázy a jsou přeneseny ferredoxinem na nitroskupinu léčiva (Müller, 1993) (Obr. 4.).
A)
B)
Obr. 4. Schéma aktivace metronidazolu u trichomonád: přes metabolismus pyruvátu (A) nebo malátu (B) (Kulda, 2007). (A) V přítomnosti metronidazolu jsou elektrony produkované pyruvát:ferredoxin
oxidoreduktázou
(PFOR)
transportovány
ferredoxinem
(Fd)
na
ox
neaktivovaný metronidazol (MTZ ) a ne na jejich přirozený akceptor hydrogenázu (HY). Cytotoxické volné radikály R-NO2- jsou produkované jako intermediáty během redukce metronidazolu (MTZred). (B) Druhé schéma popisuje alternativní aktivaci metronidazolu v hydrogenozómu. Elektrony generované hydrogenozomálním jablečným enzymem (ME) redukují NAD+ na NADH, NADH dehydrogenáza (NDH) recykluje NADH a přenáší elektrony na ferredoxin (Fd), který je nakonec donorem elektronů pro redukci metronidazolu. U trichomonád byly popsány dva typy rezistence, aerobní a anaerobní, podle podmínek, za kterých vznikají. Jsou výsledkem mnoha po sobě jdoucích procesů, které postupně sniţují aktivity hydrogenozomálních enzymů, zapojených do drah aktivujících metronidazol. Aerobní rezistence se projeví pouze za přítomnosti kyslíku a je to jediný typ rezistence pozorovaný u klinických izolátů. Anaerobní rezistence se naopak projeví za nepřítomnosti kyslíku. A je charakterizována rozsáhlými změnami metabolismu uhlovodíků jak v hydrogenozomu, tak v cytoplasmě. Byla navozena in vitro a pozorována nejen u T. vaginalis, ale téţ u T. foetus. Kmeny s anaerobní rezistencí jsou schopné odolávat vysokým koncentracím metronidazolu (Kulda, 1999). 21
Bylo zjištěno, ţe aerobní rezistence je téţ předstupněm získání anaerobní rezistence in vitro. Aerobně rezistentní buňky vykazují sníţení aktivit hydrogenozomálních enzymů jako PFOR, NADH:ferredoxin oxidoreduktázy a NAD+-dependentního jablečného enzymu. Nedochází však sníţení aktivity hydrogenázy. Nejvíce se sniţuje aktivita PFOR. U raně rezistentního stádia anaerobní rezistence jiţ aktivita PFOR klesá na nulu a zároveň s tím klesá i aktivita hydrogenázy. Aktivity jablečného enzymu a NADH:ferredoxin oxidoreduktázy klesají oproti stádiu aerobní rezistence pouze nepatrně. V dalších stádiích anaerobní rezistence aktivita hydroganázy postupně klesá aţ k nule. Aktivity jablečného enzymu a NADH:ferredoxin oxidoreduktázy téţ klesají na nulu ale aţ v plně anaerobně rezistentním stádiu. Z toho je jasné, ţe samotná inhibice PFOR ke vzniku rezistence nestačí, ţe je tu ještě další mechanismus přenosu elektronu na metronidazol a musí dojít k inhibici i dalších hydrogenozomálních komponent (Kulda, 1999; Rasoloson et al., 2002). Zároveň s vývojem rezistence a poklesem aktivit hydrogenozomálních enzymů dochází ke zvyšování aktivit cytosolických enzymů, laktát dehydrogenázy, pyruvát kinázy a NADP+-dependentního jablečného enzymu. Samozřejmě, ţe s těmito změnami jsou spjaté i změny v konečných produktech metabolismu. Se zvyšující se mírou rezistence roste produkce laktátu a sniţuje se produkce vodíku a acetátu (Kulda, 1999; Rasoloson et al., 2002). Zjistilo se, ţe sníţená či nulová aktivita enzymů je spjata s poklesem hladiny patřičných
proteinů.
Zároveň
na
vyšším
stupni
rezistence
klesá
i
mnoţství
hydrogenozomálního ferredoxinu. K poklesu hladiny ferredoxinu však nedochází u aerobní rezistence, čemuţ nasvědčuje i fakt, ţe u těchto organismů probíhá hydrogenozomální metabolismus pyruvátu a dochází k přeměně pyruvátu na acetát (Rasoloson et al., 2002). Některé studie na klinických izolátech však ukazují, ţe i u organismů s aerobní rezistencí dochází k částečnému sníţení hladiny ferredoxinu a to díky sníţeným hladinám mRNA (Quon et al., 1992). Se zvyšující se mírou rezistence a poklesem hladiny proteinů klesá i mnoţství mRNA pro PFOR a jablečný enzym. K poklesu PFOR dochází díky sníţení genové transkripce, zatímco hladina jablečného enzymu bude pravděpodobně regulována stabilitou mRNA (Rasoloson et al., 2002). V minulosti se také uvaţovalo, zda příčinou v rezistenci nemůţe být například zvýšená exprese P-glykoproteinu jako je tomu u jiných antibiotik (emetin), kdy by docházelo k transportu antibiotika ven z buňky. Nebyla tu ale nalezena ţádná korelace mezi hladinou exprese transportéru a mírou rezistence k metronidazolu (Callahan and Beverley, 1991; Barnes et al., 1992). 22
V tomto roce (2009) vyšla publikace, která zpochybňuje dosavadní pohled na vznik rezistence k metronidazolu u T. vaginalis a nastiňuje i jinou moţnost aktivace léčiva neţ pomocí v hydrogenozomu redukovaného ferredoxinu. Práce vychází z toho, ţe u jiných organismů neţ je T. vaginalis byla popsána cesta aktivace metronidazolu bez zapojení ferredoxinu, a sice redukcí pomocí thioredoxin reduktázy u E. histolytica (Leitsch et al., 2007), jejíţ homolog se téţ vyskytuje u T. vaginalis (Coombs et al., 2004). Kromě toho u H. pylori byla redukce k metronidazolu přičítána nitroreduktázám RdxA a FrxA (Goodwin et al., 1998; Kwon et al., 2000) a také byla popsána neenzymatická redukce metronidazolu dvojmocným ţelezem, thioly a flaviny (Leitsch et al., 2009). Další otázkou, kterou se tato práce zabývá, je poškození, které způsobuje metronidazol. Jestli jeho nitroradikál nebo dále redukované metabolity jsou opravdu tím hlavním toxickým agens. V mnoha in vitro studiích bylo pozorováno, ţe elektrochemicky generovaný nitroradikál způsobuje jedno a / nebo dvouvláknové zlomy DNA (Edwards, 1993a). Nicméně chemická redukce metronidazolu dithioničitanem (Larusso et al., 1977) nevedla k dvouvláknovým zlomům ale spíše ke kovalentní vazbě reaktivních metronidazolových intermediátů na DNA (Lindmark and Muller, 1976) a proteiny (Leitsch et al., 2009). A skutečně se zdá, ţe navázání metabolitů metronidazolu k proteinům a DNA je mechanismem působení metronidazolu u T. vaginalis, ale specifické cíle se u T. vaginalis ani u ostatních mikroaerofilních parazitů nehledaly. Předpoklad byl, ţe reaktivita metronidazolových metabolitů je náhodná (Leitsch et al., 2009). Leitsch et al. (Leitsch et al., 2009) se ve své studii zaměřili na hledání podpory své hypotézy, ve které tvrdí, ţe v buňce nitroimidazoly netvoří náhodné kovalentní sloučeniny s proteiny, ale spíše se specificky váţí na proteiny, které jsou zapojené v redoxním systému zprostředkovaném thioredoxiny. Dále předpokládají, ţe thioredoxin reduktáza u T. vaginalis je jak klíčovým enzymem v aktivaci metronidazolu, tak cílem nitroimidazolových látek. A také, ţe nitroimidazoly rozvracejí buněčnou redoxní rovnováhu sníţením aktivity thioredoxin reduktázy a vnitrobuněčné hladiny thiolů. Předkládají téţ důkaz toho, ţe vznik kovalentních sloučenin s proteiny a neproteinovými thioly by mohl značně přispívat k toxicitě nitroimidazolů u T. vaginalis. Ve svých pokusech našli deset proteinů, které se váţí k aktivovanému metronidazolu, z nichţ sedm bylo identifikováno: thioredoxin reduktáza, thioredoxin peroxidáza, velká podjednotka ribonukleotid reduktázy, cytosolická malát dehydrogenáza, enoláza a glukóza-6-fosfát izomeráza. Za povšimnutí stojí, ţe ţádný z těchto proteinů není hydrogenozomální. Byly zkontrolovány i hydrogenozomální frakce buněk ošetřovaných 23
metronidazolem, které neukázaly ţádné změny v proteinovém profilu oproti kontrolním buňkám (Leitsch et al., 2009). S výjimkou glukóza-6-fosfát izomerázy bylo u zbylých identifikovaných proteinů zaznamenáno, nebo se o nich alespoň předpokládá, ţe jsou zapojené do redoxní regulace zprostředkované thioredoxinem.
Thioredoxin
reduktáza musí evidentně
interagovat
s thioredoxinem, aby mohly být obnovené dvě reaktivní thiolové skupiny thioredoxinu (Coombs et al., 2004). A ribonukleotid reduktáza je právě jedním z enzymů, který je závislý na redukci thioredoxinem (Leitsch et al., 2009). Thioredoxin peroxidáza a thiol peroxidáza vyţadují redukci thioredoxinem na jejich aktivním místě, aby mohly degradovat peroxid vodíku (Coombs et al., 2004; Camier et al., 2007), zatímco enoláza a malát dehydrogenáza byly identifikovány jako partneři pro thioredoxin u rostlin (Anderson et al., 1998; Wong et al., 2003; Hara et al., 2006). U buněk pěstovaných s nitroimidazolem projevovala thioredoxin reduktáza značně sníţenou schopnost redukovat thioredoxin, pravděpodobně kvůli vytváření kovalentních aduktů s nitroimidazolovými intermediáty. Sníţená aktivita thioredoxin reduktázy následně vede ke sníţené aktivitě těch enzymů, jejichţ funkce jsou závislé na thioredoxinu. Ve své studii Leitsch et al. (Leitsch et al., 2009) ukázali, ţe rozklad peroxidu vodíku peroxidázami je zpomalený shodně s poklesem aktivity thioredoxin reduktázy. Zároveň sníţená aktivita thioredoxin reduktázy by byla rozhodující nevýhodou pro T. vaginalis při střetu s hostitelským obranným systémem, který zahrnuje tvorbu molekul zodpovědných za oxidativní stres. Navíc nejen antioxidativní obrana, ale i některé další fyziologické procesy potřebují thioredoxin. Jsou to napřiklad procesy, jejichţ součástí je syntéza dNTP ribonukleotid reduktázou, redukce sulfátu a redoxní kontrola chaperonů. Je samozřejmě moţné, ţe i tvorba kovalentních vazeb s DNA hraje roli v toxicitě metronidazolu. Nicméně, T. vaginalis vystavené metronidazolu se přestaly pohybovat a zemřely velmi rychle. To je ovšem těţké přisuzovat poškození DNA, jehoţ následky jsou méně kritické a spíše vedou buď k apoptóze ve vícebuněčném organismu nebo k inhibici růstu u jednobuněčného organismu. To, co by tedy mohlo být zodpovědné za rychlou smrt buňky je náhlá energetická krize v důsledku aktivace opravného systému buňky, jak jiţ bylo popsáno v úvodní kapitole této práce. Ten má okolo patnácti enzymů a ví se, ţe nitroimidazoly tuto opravnou odpověď indukují. Dochází tak k velkému energetickému výdeji jak na syntézu, tak na aktivitu těchto enzymů. Produkci ATP zastává především pyruvát:ferredoxin oxidoreduktázá, která se zdá být dalším cílem nitroimidazolů. Navíc není 24
vyloučené, ţe nitroimidazoly interagují i se sloţkami elektrontransportního řetězce (ferredoxin). Tyto všechny okolnosti mohou vést k narušení homeostáze energetického metabolismu buňky, následkem toho k narušení integrity membrány a zhroucení systému, coţ se projevuje jako lýze (Chapman et al., 1985; Edwards, 1993a; Leitsch et al., 2009). V aktivaci a tudíţ i v rezistenci k metronidazolu budou pravděpodobně zapojeny nejen flavinový enzym thioredoxin reduktáza ale i volné redukované flaviny. Předpokládá se, ţe thioredoxin reduktáza hraje roli v aktivaci metronidazolu, protoţe je to dost silně exprimovaný protein a ve vysoce rezistentních buňkách k metronidazolu je z velké části inaktivní. Je pravděpodobné, ţe ztráta aktivity thioredoxin reduktázy v buňkách rezistentních k metronidazolu nastává díky nedostatku kofaktoru FAD. Při velkém sníţení aktivity thioredoxinu se zdá, ţe nedochází k ţádné redukci FAD, FMN a riboflavinů u buněk rezistentních k metronidazolu, zatímco buňky citlivé na metronidazol ochotně tyto flaviny redukují. Tento objev nasvědčuje, ţe hladiny redukovaných flavinů u buněk rezistentních k metronidazolu by měly být velmi nízké. Dále lze předpokládat, ţe ztráta aktivity flavin reduktázy v rezistentních T. vaginalis narušuje metabolismus ţeleza. Vyčerpání intracelulární hladiny ţeleza by mohlo ovlivnit expresi mnoha proteinů, včetně superoxid dismutázy. Tím, ţe T. vaginalis má pouze ţelezné superoxid dismutázy, mohla by buňka zvyšovat jejich expresi, kdyţ je ţeleza nedostatek, a tím zachovat alespoň částečně jejich aktivitu. Zvýšená aktivita superoxid dismutázy (tj. zvýšená produkce peroxidu vodíku) by mohla postupně vést ke zvýšené expresi peroxiredoxinu, jak jiţ bylo ukázáno u E. histolytica (Wassmann et al., 1999). Navíc, je známo ţe exprese ţelezosirných proteinů a dalších proteinů, které buď přímo a nebo nepřímo na nich závisí, je ovlivňována nízkými hladinami ţeleza (Imlay, 2006). Toto propojení bylo pozorováno v širokém spektru organismů včetně E. coli (McHugh et al., 2003), Saccharomyces cerevisiae a T. foetus (Leitsch et al., 2009). Také T. vaginalis s vyčerpanými zásobami ţeleza ostře sniţuje expresi PFOR a hydrogenozomální malát dehydrogenázy (dekarboxylující). Přesto T. foetus a T. vaginalis (Leitsch et al., 2009) i za nedostatku ţeleza zůstávají plně citlivé na metronidazol, coţ v podstatě popírá dosavadní model aktivace nitroimidazolu v trichomonádách. Autoři se podle svých dosavadních pozorování domnívají, ţe ztráta ţelezosirných enzymů a dalších hydrogenozomálních drah u T. vaginalis rezistentních k metronidazolu není důvodem, ale pravděpodobně důsledkem rezistence k metroniadzolu, a tou je těţké narušení buněčného metabolismu flavinů.
25
4.2
Tritrichomonas foetus Tritrichomonas foetus je protozoální parazit skotu. I zde je trichomonóza sexuálně
přenosná pohlavní choroba, která se na rozdíl od T. vaginalis projevuje jako zánět děloţní sliznice, můţe napadat i plod, můţe se manifestovat v placentě, plicích plodu, střevě a lymfatických uzlinách, a je známo, ţe můţe způsobit i potrat a sterilitu (Kulda, 1999). I proti této trichomonádě se pouţívá metronidazol a je u ní popsána rezistence. Stejně jako u T. vaginalis je rezistence u T. foetus důsledkem několika následných změn v metbolismu a postupným vývojem rezistence (Kulda, 1999). Metabolismus T. foetus se poněkud liší od metabolismu T. vaginalis. T. foetus má cytosolickou metabolickou dráhu, vedoucí k produkci malátu, prodlouţenou přes fumarát k sukcinátu za přítomnosti fumarázy a fumarát reduktázy. T. foetus neprodukuje oproti T. vaginalis laktát. Navíc má T. foetus metabolickou dráhu, produkující etanol z acetaldehydu, vyţadující přítomnost pyruvát dekarboxylázy a alkohol dehydrogenázy. Aktivita pyruvát kinázy je velmi slabá a k produkci pyruvátu tak pravděpodobně dochází především přes malát. (Obr. 5.) Podle stávajícího mechanismu je rozhodujícím jevem pro získání anaerobní rezistence u T. foetus postupné sniţování a eventuelní ztráta aktivity pyruvát:ferredoxin oxidoreduktázy podobně jako u původního modelu rezistence u T. vaginalis. Postupně se sniţuje i aktivita hydrogenázy, sniţuje se míra exprese ferredoxinu a tím jeho mnoţství v buňce. Mění se i cytosolický metabolismus. Rezistentní organismy musí kompenzovat ztátu hydrogenozomálního metabolismu, přeorganizovat katabolismus pyruvátu do drah, které neprodukují elektrony pro aktivaci metronidazolu a upravit redoxní rovnováhu přebudované dráhy. Rezistentní kmeny zvyšují hladinu glykolýzy. T. foetus aktivuje dráhu produkce etanolu, která je u nerezistentních kmenů zanedbatelná, a 95% glukózy je přeměněno na etanol (Obr. 5.). Zvýšená produkce etanolu je doprovázena výrazným zvýšením aktivity pyruvát dekarboxylázy. Tím, ţe T.foetus postrádá aktivitu pyruvát kinázy a pyruvát se tvoří výhradně odbočkou přes malát, je exprese a aktivita cytosolického jablečného enzymu zvýšena. Aktivita tohoto NADP závislého enzymu také vyrovnává zvýšené poţadavky alkohol dehydrogenázy na NADPH na produkci etanolu. Protoţe chybí aktivita fumarázy a fumarát reduktázy a produkce sukcinátu zaniká, všechen vyprodukovaný malát je k dipozici na produkci pyruvátu. Rovněţ produkce glycerolu je zastavena (Kulda, 1999).
26
Obr. 5. Schématický diagram změn v katabolismu glukózy spojených s plným vývojem rezistence (Kulda, 1999). Rezistence k metronidazolu u T. foetus je spojena s aktivací dráhy produkce etanolu, která je u původního kmenu zanedbatelná. Přes 95% glukózy je přeměněno na etanol. Zvýšení produkce etanolu je doprovázeno značným zvýšením aktivity pyruvát dekarboxylázy. Ve srovnání s T. vaginalis u rezistentní T. foetus není aktivní pyruvát kináza. Pyruvát je tvořen výhradně odbočkou přes malát. Tím, ţe jsou fumaráza a fumarát reduktáza neaktivní a produkce sukcinátu je tak zastavena, můţe být všechen malát vyuţit na produkci pyruvátu. Také produkce glycerolu u rezistentní T. foetus je pozastavena. Zkratky: PEP, fosfoenolpyruvát; OAA, oxalacetát; Fd, ferredoxin; Pyr, pyruvát.
4.3
Giardia intestinalis Giardia intestinalis (Diplomonadida) je nejběţněji vyskytující se bičíkatý prvok
ve střevním traktu (Upcroft and Upcroft, 2001). Byla poprvé popsána v 17. století (Escobedo and Cimerman, 2007). Hlavním zdrojem infekce je cysta, která se do člověka dostává fekálněorální cestou, vodou, jídlem a z člověka na člověka, a to obzvláště v zemích, kde je teplé podnebí, špatně vyvinutá kanalizační síť a špatné zásobení vodou (Ortega and Adam, 1997). Giardie je nejčastější příčinou chronických průjmových onemocnění u cestovatelů (Upcroft and Upcroft, 2001). Metronidazol se na giardiózu pouţívá od roku 1961 (Escobedo and Cimerman, 2007). Působí na stádium trofozoita a podle stávajícího modelu se předpokládá jeho
27
reduktivní aktivace přes pyruvát:ferredoxin oxidoreduktázu (PFOR) a ferredoxin během dekarboxylace pyruvátu (Horner et al., 1999). Byly dokumentovány případy pacientů s přetrvávající giardiózou (Upcroft et al., 1990). Izoláty rezistentních kmenů z těchto pacientů byly zkoumány na biochemické úrovni a zdá se, ţe mají sníţenou aktivitu pyruvát:ferredoxin oxidoreduktázy (PFOR). Prvky elektrontransportní dráhy zapojené do aktivace metronidazolu ještě nebyly u tohoto parazita kompletně definovány. Byly izolovány dvě z rozhodujících sloţek, PFOR a ferredoxin (Fd) (Townson et al., 1994). PFOR giardie, jedna ze dvou hlavních cytosolických oxidoreduktáz αketokyselin, přenáší elektrony na ferredoxin (Fd 1) a ten následně redukuje metronidazol (Land and Johnson, 1999). In vitro studie ukázaly, ţe PFOR a ferredoxin z giardie jsou schopny aktivovat metronidazol (Townson et al., 1994). U rezistentních kmenů je hladina PFOR aţ pětkrát sníţená. To koreluje se sníţenou aktivací antibiotika na nitrózový radikál (Upcroft and Upcroft, 2001). I hladina ferredoxinu 1 je sníţena a to aţ sedmkrát (Liu et al., 2000).
4.4
Entamoeba histolytica E. histolytica se vyskytuje ve střevním lumen, střevní stěně a tkáních, zahrnujících
i játra (WHO 1969). Amébióza je druhá po malárii z hlediska úmrtnosti na parazitické prvoky (WHO 1997). Člověk se nakazí pozřením jídla nebo pití kontaminovaného cystami E. histolytica. K přenosu můţe také dojít z člověka na člověka a to orálním a análním sexem, popřípadě kontaminovaným nástrojem na zavedení klystýru. Léky proti amébióze se liší podle toho, na kterém místě nákazy působí. Dělí se obvykle na dvě skupiny: působící na invazi v lumen (sloučeniny arsenu, deriváty hydroxychinolinu, deriváty benzylaminu, atp.) a na invazi ve tkáni (emetin a jeho deriváty, chlorochinin, nitroimidazoly) (Gonzales et al., 2009). Metronidazol je antibiotikem číslo jedna při léčbě amébiázy a to jak u dospělých, tak u dětí. Na léčbu entaméby se pouţívá jiţ od roku 1966 (Tazreiter et al., 2008). Není ale dostačující k eliminaci parazitárních cyst ve střevě. E. histolytica způsobuje zánět tlustého sřeva a mimostřevní abscesy (Gonzales et al., 2009). Rezistence k metronidazolu E. histolytica byla popsána, ale molekulární podstata rezistence není jasná a dosud nebyla rozsáhle studována. Výzkumy rezistence na antibiotikum u E. histolytica byly primárně zaměřeny na studium rezistence k emetinu, coţ je léčivo nepříbuzné nitroimidazolům
(Ghosh
et
al.,
1996).
U
metronidazolu
předpokládalo, ţe působení na buňku je nespecifické (Leitsch et al., 2009). 28
se
původně
Stejně jako u všech ostatních organismů musí dojít k aktivaci metronidazolu redukcí ferredoxinem nebo flavodoxinem. Dalo by se předpokládat, ţe k vývoji rezistence dochází podobným mechanismem jako u ostatních anaerobních eukaryot, tj. sníţením hladiny a aktivity PFOR a hydrogenázy. U E. histolytica ale nedochází ke sníţení aktivity PFOR, ale ke značnému zvýšení hladiny ţelezoobsahující superoxid dismutázy (Fe-SOD). Vedle FeSOD, která katalyzuje dismutaci superoxidového radikálu na kyslík a peroxid vodíku, byly u E. histolytica identifikovány ještě další dva enzymy, zapojené do antioxidativního mechanismu. Jsou to NADPH:flavin oxidoreduktáza a peroxiredoxin. NADPH:flavin oxidoreduktáza funguje jako disulfid reduktáza a je ale zároveň schopna redukovat kyslík na peroxid
vodíku.
Peroxiredoxin
tak
odnímá
peroxid
vodíku
z dismutázové
nebo
oxidoreduktázou reakce. Tím, ţe dochází ke zvýšení hladiny Fe-SOD a tak i k větší tvorbě peroxidu vodíku, předpokládá se zapojení všech těchto tří enzymů do mechanismů rezistence entamoeby. Zároveň bylo zjistěno, ţe dochází ke sníţené expresi specifických RNA pro ferredoxin 1 (hladina ferredoxinu 2 se u rezistentních buněk nelišila od buněk citlivých k metronidazolu, coţ naznačuje, ţe kaţdý ferredoxin zastává v buňce odlišnou funkci). Zůstává otázkou, zda by Fe-SOD nemohla kromě dismutace superoxidového radikálu detoxifikovat téţ nitroradikály vzniklé redukcí metronidazolu, nebo zdali nedochází k detoxifikaci metronidazolu jednoduše díky reoxidaci nitroradikálu tím, ţe je E.histolytica kultivována za mikroaerofilních podmínek. Za přítomnosti kyslíku by se nitroradikál reoxidoval zpět na metronidazol spolu s vytvořením superoxidového radikálu, který by byl následně ostraněn dimutací pomocí Fe-SOD. Vytvořil by se peroxid vodíku, který by byl detoxifikován peroxiredoxinem. Tento proces by vyţadoval zvýšené hladiny Fe-SOD a peroxiredoxinu, coţ se shoduje s předchozími poznatky (Wassmann et al., 1999). Z poslední studie je však patrné, ţe k aktivaci metronidazolu pravděpodobně dochází pomocí thioredoxin reduktázy a nikoliv ferredoxinem (aktivovaná nitroskupina podstupuje další redukci a tvoří se nitrózoimidazol, který můţe reagovat se sulfhydrylovými skupinami a DNA a můţe být dále redukován na amin přes hydroxylamin). Aktivovaný metronidazol se pak kovalentně váţe specificky na určité malé mnoţství proteinů – na thioredoxin reduktázu, superoxid dismutázu, purin nukleosid fosforylázu a taktéţ na thioredoxin. Dokonce se ukázalo, ţe se aktivovaný metronidazol váţe téţ na cystein. Cílové proteiny jsou modifikovány nejpravděpodobněji na thiolových skupinách. Tyto proteiny, které jsou modifikovány (superoxid dismutáza, peroxiredoxin, thioredoxin reduktáza a thioredoxin) patří k faktorům určeným k ochraně améby před oxidativním stresem (Leitsch et al., 2007). 29
Za přítomnosti kyslíku mohou nitroradikály také vytvářet oxidativní stres reakcí s kyslíkem, čímţ tvoří superoxidový radikál. Ten ale můţe být amébou odstraněn pomocí superoxid dismutázy v kombinaci s peroxiredoxinem, jak jiţ bylo zníměno výše. Proto by zvýšení exprese těchto genů bylo vítanou reakcí. Při pomalé adaptaci na metronidazol améba opravdu zvyšuje expresi obou enzymů. Dochází téţ k mírnému zvýšení exprese thioredoxin reduktázy. Thioredoxin reduktáza spolu s thiredoxinem a peroxiredoxinem detoxifikuje peroxid vodíku, který vzniká ze superoxidového aniontu superoxid dismutázou. Na druhé straně je thioredoxin reduktáza schopna redukovat a aktivovat metronidazol a tudíţ by zvýšení exprese bylo kontraproduktivní. Ve skutečnosti bylo zjištěno, ţe u améb adaptovaných na metronidazol dochází ke sníţení exprese thioredoxin reduktázy a ferredoxinu 1 (Wassmann et al., 1999).
30
5. Závěr V této bakalářské práci jsem se pokusila shrnout poznatky o mechanismech rezistence k metronidazolu u různých modelových organismů, zahrnující jak bakterie (rody Bacteroides, Helicobacter, Clostridium), tak anaerobní eukaryota (rody Trichomonas, Tritrichomonas, Giardia, Entamoeba). Vytvoření rezistence k metronidazolu je pro všechny organismy velmi komplexní děj, který vyţaduje mnoho změn v enzymatickém sloţení a metabolismu buňky. Kaţdý druh se snaţí s působením metronidazolu vyrovnat svým způsobem, avšak klíčovou roli v rezistenci hraje pravděpodobně sniţování aktivit enzymů, redukujících a aktivujících metronidazol, popřípadě zvyšování enzymatických aktivit jiných enzymů, získávání a exprese genů kódujících detoxifikační enzymy, a není téţ vyloučené, ţe u některých organismů by mohlo docházet i k odčerpávání antibiotika. Mechanismy rezistence k metronidazolu a k němu příbuzným antibiotikům nejsou zdaleka plně charakterizované. Ukazuje se, ţe jsou to velmi sloţité děje probíhající na buněčné úrovni, a je nutné tyto procesy nadále zkoumat a popsat je.
31
6. Seznam použité literatury Anderson, L. E., Li, A. D., and Stevens, F. J. (1998). The enolases of ice plant and Arabidopsis contain a potential disulphide and are redox sensitive. Phytochemistry 47, 707713. Barnes, D. A., Foote, S. J., Galatis, D., Kemp, D. J., and Cowman, A. F. (1992). Selection for High-Level Chloroquine Resistance Results in Deamplification of the Pfmdr1 Gene and Increased Sensitivity to Mefloquine in Plasmodium Falciparum. Embo Journal 11, 30673075. Callahan, H. L. and Beverley, S. M. (1991). Heavy-Metal Resistance - A New Role for PGlycoproteins in Leishmania. Journal of Biological Chemistry 266, 18427-18430. Camier, S., Ma, E., Leroy, C., Pruvost, A., Toledano, M., and Marsolier-Kergoat, M. C. (2007). Visualization of ribonucleotide reductase catalytic oxidation establishes thioredoxins as its major reductants in yeast. Free Radical Biology and Medicine 42, 1008-1016. Chang, K. C., Ho, S. W., Yang, J. C., and Wang, J. T. (1997). Isolation of a genetic locus associated with metronidazole resistance in Helicobacter pylori. Biochemical and Biophysical Research Communications 236, 785-788. Chapman, A., Hann, A. C., Linstead, D., and Lloyd, D. (1985). Energy-Dispersive X-RayMicroanalysis of Membrane-Associated Inclusions in Hydrogenosomes Isolated from Trichomonas Vaginalis. Journal of General Microbiology 131, 2933-2939. Coombs, G. H., Westrop, G. D., Suchan, P., Puzova, G., Hirt, R. P., Embley, T. M., Mottram, J. C., and Müller, S. (2004). The amitochondriate eukaryote Trichomonas vaginalis contains a divergent thioredoxin-linked peroxiredoxin antioxidant system. Journal of Biological Chemistry 279, 5249-5256. Declerck, P. J., Deranter, C. J., and Volckaert, G. (1983). Base Specific Interaction of Reductively Activated Nitroimidazoles with Dna. Febs Letters 164, 145-148. Diniz, C. G., Farias, L. M., Carvalho, M. A. R., Rocha, E. R., and Smith, C. J. (2004). Differential gene expression in a Bacteroides fragilis metronidazole-resistant mutant. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 54, 100-108. 32
Dunn, B. E., Cohen, H., and Blaser, M. J. (1997). Helicobacter pylori. Clinical Microbiology Reviews 10, 720-&. Edwards, D. I. (1993a). Nitroimidazole Drugs - Action and Resistance Mechanisms .1. Mechanisms of Action. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 31, 9-20. Edwards, D. I. (1993b). Nitroimidazole Drugs - Action and Resistance Mechanisms .2. Mechanisms of Resistance. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 31, 201-210. Edwards, D. I., Dye, M., and Carne, H. (1973). Selective Toxicity of Antimicrobial Nitroheterocyclic Drugs. Journal of General Microbiology 76, 135-145. Edwards, D. I. and Mathison, G. E. (1970). Mode of Action of Metronidazole Against Trichomonas Vaginalis. Journal of General Microbiology 63, 297-&. Escobedo, A. A. and Cimerman, S. (2007). Giardiasis: a pharmacotherapy review. Expert Opinion on Pharmacotherapy 8, 1885-1902. Ghosh, S. K., Lohia, A., Kumar, A., and Samuelson, J. (1996). Overexpression of Pglycoprotein gene 1 by transfected Entamoeba histolytica confers emetine-resistance. Molecular and Biochemical Parasitology 82, 257-260. Gonzales, M. L. M., Dans, L. F., and Martinez, E. G. (2009). Antiamoebic drugs for treating amoebic colitis. Cochrane Database of Systematic Reviews. Goodwin, A., Kersulyte, D., Sisson, G., van Zanten, S. J. O. V., Berg, D. E., and Hoffman, P. S. (1998). Metronidazole resistance in Helicobacter pylori is due to null mutations in a gene (rdxA) that encodes an oxygen-insensitive NADPH nitroreductase. Molecular Microbiology 28, 383-393. Hara, S., Motohashi, K., Arisaka, F., Romano, P. G. N., Hosoya-Matsuda, N., Kikuchi, N., Fusada, N., and Hisabori, T. (2006). Thioredoxin-h1 reduces and reactivates the oxidized cytosolic malate dehydrogenase dimer in higher plants. Journal of Biological Chemistry 281, 32065-32071. Hoffman, P. S., Goodwin, A., Johnsen, J., Magee, K., Veldhuyzen, S. J. O., and van Zanten, S. J. O. V. (1996). Metabolic activities of metronidazole-sensitive and -resistant strains of 33
Helicobacter pylori: Repression of pyruvate oxidoreductase and expression of isocitrate lyase activity correlate with resistance. Journal of Bacteriology 178, 4822-4829. Horner, D. S., Hirt, R. P., and Embley, T. M. (1999). A single eubacterial origin of eukaryotic pyruvate:ferredoxin oxidoreductase genes: Implications for the evolution of anaerobic eukaryotes. Molecular Biology and Evolution 16, 1280-1291. Hrdý, J., Tachezy, J. and Müller, M. (2007). Metabolism of Trichomonad Hydrogenosomes. Microbiology Monographs, Springer - Verlag Berlin Heidelberg. Imlay, J. A. (2006). Iron-sulphur clusters and the problem with oxygen. Molecular Microbiology 59, 1073-1082. Kaakoush, N. O., Asencio, C., Megraud, F., and Mendz, G. L. (2009). A Redox Basis for Metronidazole Resistance in Helicobacter pylori. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 53, 1884-1891. Kim, S. Y., Joo, Y. M., Lee, H. S., Chung, I. S., Yoo, Y. J., Merrell, D. S., and Cha, J. H. (2009). Genetic analysis of Helicobacter pylori clinical isolates suggests resistance to metronidazole can occur without the loss of functional rdxA. Journal of Antibiotics 62, 43-50. Kulda, J. (1999). Trichomonads, hydrogenosomes and drug resistance. International Journal for Parasitology 29, 199-212. Kulda, J. and Hrdý, J. (2007). Hydrogenosome: The Site of 5-Nitroimidazole Activation and Rezistance. Hydrogenosomes and Mitosomes: Mitochondria of Anaerobic Eukaryotes. Microbiology Monographs, Springer - Verlag Berlin Heidelberg. Kwon, D. H., Kato, M., El-Zaatari, F. A. K., Osato, M. S., and Graham, D. Y. (2000). Frameshift mutations in NAD(P)H:flavin oxidoreductase encoding gene (frxA) from metronidazole resistant Helicobacter pylori ATCC43504 and its involvement in metronidazole resistance. Fems Microbiology Letters 188, 197-202. Land, K. M. and Johnson, P. J. (1999). Molecular basis of metronidazole resistance in pathogenic bacteria and protozoa. Drug Resistance Updates 2, 289-294.
34
Larusso, N. F., Tomasz, M., Müller, M., and Lipman, R. (1977). Interaction of Metronidazole with Nucleic-Acids Invitro. Molecular Pharmacology 13, 872-882. Leffler, D. A. and Lamont, J. T. (2009). Treatment of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology 136, 1899-1912. Leiros, H. K. S., Kozielski-Stuhrmann, S., Kapp, U., Terradot, L., Leonard, G. A., and McSweeney, S. M. (2004). Structural basis of 5-nitroimidazole antibiotic resistance - The crystal structure of NimA from Deinococcus radiodurans. Journal of Biological Chemistry 279, 55840-55849. Leitsch, D., Kolarich, D., Binder, M., Stadlmann, J., Altmann, F., and Duchene, M. (2009). Trichomonas vaginalis: metronidazole and other nitroimidazole drugs are reduced by the flavin enzyme thioredoxin reductase and disrupt the cellular redox system. Implications for nitroimidazole toxicity and resistance. Molecular Microbiology 72, 518-536. Leitsch, D., Kolarich, D., Wilson, I. B. H., Altmann, F., and Duchene, M. (2007). Nitroimidazole action in Entamoeba histolytica: A central role for thioredoxin reductase. Plos Biology 5, 1820-1834. Lembo, A. J. et al. (2009). Treatment of Helicobacter pylori Infection With Intra-Gastric Violet Light Phototherapy: A Pilot Clinical Trial. Lasers in Surgery and Medicine 41, 337344. Lindmark, D. G. and Müller, M. (1973). Hydrogenosome, A Cytoplasmic Organelle of Anaerobic Flagellate Tritrichomonas Foetus, and Its Role in Pyruvate Metabolism. Journal of Biological Chemistry 248, 7724-7728. Lindmark, D. G. and Müller, M. (1976). Anti-Trichomonad Action, Mutagenicity, and Reduction of Metronidazole and Other Nitroimidazoles. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 10, 476-482. Lindmark, D. G., Müller, M., and Shio, H. (1975). Hydrogenosomes in Trichomonas Vaginalis. Journal of Parasitology 61, 552-554.
35
Liu, S. M., Brown, D. M., O'Donoghue, P., Upcroft, P., and Upcroft, J. A. (2000). Ferredoxin involvement in metronidazole resistance of Giardia duodenalis. Molecular and Biochemical Parasitology 108, 137-140. Lloyd, D. and Kristensen, B. (1985). Metronidazole Inhibition of Hydrogen-Production Invivo in Drug-Sensitive and Resistant Strains of Trichomonas Vaginalis. Journal of General Microbiology 131, 849-853. Marais, A., Bilardi, C., Cantet, F., Mendz, G. L., and Megraud, F. (2003). Characterization of the genes rdxA and frxA involved in metronidazole resistance in Helicobacter pylori. Research in Microbiology 154, 137-144. Mchugh, J. P., Rodriguez-Quinones, F., bdul-Tehrani, H., Svistunenko, D. A., Poole, R. K., Cooper, C. E., and Andrews, S. C. (2003). Global iron-dependent gene regulation in Escherichia coli - A new mechanism for iron homeostasis. Journal of Biological Chemistry 278, 29478-29486. Mendz, G. L. and Megraud, F. (2002). Is the molecular basis of metronidazole resistance in microaerophilic organisms understood? Trends in Microbiology 10, 370-375. Müller, M. (1993). The Hydrogenosome. Journal of General Microbiology 139, 2879-2889. Ortega, Y. R. and Adam, R. D. (1997). Giardia: Overview and update. Clinical Infectious Diseases 25, 545-549. Patel, E. H., Paul, L. V., Casanueva, A. I., Patrick, S., and Abratt, V. R. (2009). Overexpression of the rhamnose catabolism regulatory protein, RhaR: a novel mechanism for metronidazole resistance in Bacteroides thetaiotaomicron. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 64, 267-273. Poutanen, S. M. and Simor, A. E. (2004). Clostridium difficile-associated diarrhea in adults. Canadian Medical Association Journal 171, 51-58. Pumbwe, L., Wareham, D. W., duse-Opoku, J., Brazier, J. S., and Wexler, H. M. (2007). Genetic analysis of mechanisms of multidrug resistance in a clinical isolate of Bacteroides fragilis. Clinical Microbiology and Infection 13, 183-189. 36
Quon, D. V. K., Doliveira, C. E., and Johnson, P. J. (1992). Reduced Transcription of the Ferredoxin Gene in Metronidazole-Resistant Trichomonas Vaginalis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89, 4402-4406. Rasoloson, D., Vaňáčová, S., Tomková, E., Razga, J., Hrdý, I., Tachezy, J., and Kulda, J. (2002). Mechanisms of in vitro development of resistance to metronidazole in Trichomonas vaginalis. Microbiology-Sgm 148, 2467-2477. Robinson, S. C. (1962). Trichomonal Vaginitis Resistant to Metranidazole. Canadian Medical Association Journal 86, 665-&. Rossignol, J. F., Maisonneuve, H., and Cho, Y. W. (1984). Nitroimidazoles in the Treatment of Trichomoniasis, Giardiasis, and Amebiasis. International Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics 22, 63-72. Snyers, L., Hellings, P., Bovykesler, C., and Thinessempoux, D. (1982). Occurrence of Hydrogenosomes in the Rumen Ciliates Ophryoscolecidae. Febs Letters 137, 35-39. Sóki, J., Gal, M., Brazier, J. S., Rotimi, V. O., Urban, E., Nagy, E., and Duerden, B. I. (2006). Molecular investigation of genetic elements contributing to metronidazole resistance in Bacteroides strains. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 57, 212-220. Tazreiter, M., Leitsch, D., Hatzenbichler, E., Mair-Scorpio, G. E., Steinborn, R., Schreiber, M., and Duchene, M. (2008). Entamoeba histolytica: Response of the parasite to metronidazole challenge on the levels of mRNA and protein expression. Experimental Parasitology 120, 403-410. Townson, S. M., Boreham, P. F. L., Upcroft, P., and Upcroft, J. A. (1994). Resistance to the Nitroheterocyclic Drugs. Acta Tropica 56, 173-194. Upcroft, J. A., Upcroft, P., and Boreham, P. F. L. (1990). Drug-Resistance in Giardia Intestinalis. International Journal for Parasitology 20, 489-496. Upcroft, P. and Upcroft, J. A. (2001). Drug targets and mechanisms of resistance in the anaerobic protozoa. Clinical Microbiology Reviews 14, 150-+.
37
Wassmann, C., Hellberg, A., Tannich, E., and Bruchhaus, I. (1999). Metronidazole resistance in the protozoan parasite Entamoeba histolytica is associated with increased expression of iron-containing superoxide dismutase and peroxiredoxin and decreased expression of ferredoxin 1 and flavin reductase. Journal of Biological Chemistry 274, 26051-26056. Wexler, H. M. (2007). Bacteroides: the good, the bad, and the nitty-gritty. Clinical Microbiology Reviews 20, 593-+. Wong, J. H., Balmer, Y., Cai, N., Tanaka, C. K., Vensel, W. H., Hurkman, W. J., and Buchanan, B. B. (2003). Unraveling thioredoxin-linked metabolic processes of cereal starchy endosperm using proteomics. Febs Letters 547, 151-156.
38
