JITV Vol. 15 No. 4 Th. 2010: 286-296
Pemanfaatan Famili Gen Hormon Pertumbuhan (GH, GHR, GHRH dan PIT-1) untuk Mendeteksi Keragaman Genetik Kerbau di Kabupaten Pandeglang dan Lebak Provinsi Banten CECE SUMANTRI1, .R. DIYONO1, A. FARAJALLAH2, A. ANGGRAENI3 dan E. ANDREAS1 1
Fakultas Peternakan –Institut Pertanian Bogor 2 Fakultas MIPA –Institut Pertanian Bogor 3 Balai Penelitian Ternak, Bogor. (Diterima dewan redaksi 15 Oktober 2010)
ABSTRACT SUMANTRI, C., R. DIYONO, A. FARAJALLAH, A. ANGGRAENI and E. ANDREAS. 2010. Aplication of growth hormone genes familly (GH, GHR, GHRH and Pit-1) for detecting genetic variation of buffaloes in Pandeglang and Lebak districts in Banten Province. JITV 15(4): 286-296. Selection using genetic markers are commonly performed to improve livestock productivity in the livestock industry. The objectives of this study were to identify growth hormone genes family (GH|MspI, GH|AluI, GHR|AluI, GHRH|HaeIII and Pit1|HinfI) polymorphisms of Banten buffalo population consisted of Pandeglang and Lebak subpopulations. A total number of 209 blood samples were collected from 15 districts. Genomic DNAs were extracted by a standard phenol-chloroform protocol and amplified by a polymerase chain reaction (PCR) techniques, then PCR products of GH, GHR, GHRH and Pit-1 Genes were digested with MspI, AluI, HaeIII and HinfI enzyme restriction. Fragments of GH|MspI, GH|AluI, GHR|AluI, GHRH|HaeIII and Pit-1|HinfI were detected by EtBr method. The results showed that GH|MspI and GHRH|HaeIII loci were polymorphic, GH|AluI, GHR|AluI and Pit-1|HinfI, loci were monomorphic. GH allele (-) at locus GH|MspI was only found in Cisata (0.03) and Menes (0.11). Allele B at locus GHRH|HaeIII only found in Cibadak (0.42), Cisata (0.30) and Menes (0.11). In the total population of Banten locus GH|MspI have low diversity (He = 0.02) and polymorphic information content (Pic = 0.02), whereas GHRH|HaeIII locus has a higher diversity (He = 0.23) and Pic (0.22). Key Words: Polymorphism, Growth Hormone Genes, Buffalo ABSTRAK SUMANTRI, C., R. DIYONO, A. FARAJALLAH, A. ANGGRAENI dan E. ANDREAS. 2010. Pemanfaatan famili gen hormon pertumbuhan (GH, GHR, GHRH dan PIT-1) untuk mendeteksi keragaman genetik kerbau di Kabupaten Pandeglang dan Lebak Provinsi Banten. JITV 15(4): 286-296. Seleksi dengan menggunakan marker genetik sudah umum dilakukan untuk meningkatkan produktivitas ternak di industri peternakan. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman gen GH, GHR, GHRH dan Pit-1 pada lokus (GH|MspI, GH|AluI, GHR|AluI, GHRH|HaeIII dan Pit-1|HinfI) pada populasi kerbau Banten (Pandeglang dan Lebak) dengan metode polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms (PCR-RFLP) Sebanyak 209 sampel darah dikoleksi dari 15 kecamatan. Genom DNA diekstrak menggunakan phenol-chloroform protocol dan diamplifikasi dengan teknik polymerase chain reaction (PCR), kemudian PCR produk dipotong dengan enzim restriksi. Potongan fragmen dari gen GH|MspI, GH|AluI, GHR|AluI, GHRH|HaeIII dan Pit-1|HinfI dideteksi dengan metoda EtBr. Analisis polimorfisme meliputi frekuensi alel dan genotipe, heterosigositas pengamatan (Ho), heterosigositas harapan (He) dan keseimbangan Hardy-Weinberg. Lokus GH|MspI dan GHRH|HaeIII bersifat polimorfik, sedangkan lokus GH|AluI, GHR|AluI dan Pit-1|HinfI bersifat monomorfik. Alel GH(-) pada lokus GH|MspI hanya ditemukan di kecamatan Cibarani (0,03) dan Kecamatan Menes (0,11). Alel B pada lokus GHRH|HaeIII hanya ditemukan di kecamatan Cibadak (0,42), Cibarani (0,30) dan Menes (0,11) Pada populasi total Banten lokus GH|MspI mempunyai keragaman yang rendah (He = 0,02) dan polymorphic information content (Pic = 0,02), sedangkan lokus GHRH|HaeIII mempunyai keragaman lebih tinggi (He = 0,23) dan Pic (0,22) Kata Kunci: Keragaman, Gen Hormon Pertumbuhan, Kerbau
PENDAHULUAN Informasi keragaman gen sebagai MAS (marker assisted selection) yang berkaitan dengan sejumlah sifat ekonomis penting, sangat dibutuhkan untuk perbaikan
286
mutu genetik dan pengembangan kerbau lokal. Kandidat gen yang dapat digunakan yaitu gen yang tergabung dalam grup hormon pertumbuhan diantaranya gen growth hormone (GH), growth hormone releasing hormone (GHRH), dan pituitary
SUMANTRI et al. Pemanfaatan famili gen hormon pertumbuhan (GH, GHR, GHRH dan PIT-1) untuk mendeteksi keragaman genetik kerbau
transcription factor (Pit-1). Menurut COHEN et al. (1997), gen Pit-1 yang juga dikenal dengan nama growth hormone factor 1 (GHF1) merupakan faktor transkripsi spesifik pituitari yang berperan untuk perkembangan pituitari dan ekspresi hormon pada mamalia. Hormon pertumbuhan (GH), reseptor hormon pertumbuhan (GHR) serta Insulin-like growth factorI (IGF-I) merupakan faktor kritis untuk regulasi pertumbuhan dan perkembangan tubuh dan reproduksi ternak (HINES et al., 1998). LECHNIAK et al. (1999) melaporkan genotipe LL pada GH|Alu1 mempunyai kecenderungan menghasilkan volume ejakulasi yang rendah bila dibandingkan dengan genotipe VV pada GH|Alu1. GROCHOWSKA et al. (2001) mendapatkan genotipe bGH LV memproduksi susu dan persentase protein lebih tinggi dibandingkan dengan genotipe LL dan VV, tetapi genotip VV mempunyai kadar lemak lebih tinggi. Hubungan polimorfisme gen GHRH/HaeIII dengan produksi susu telah diteliti oleh MAREK et al. (2007) pada populasi sapi perah di Polandia ini menghasilkan tiga genotipe yaitu AA, AB dan BB dengan frekuensi masing-masing 0,10; 0,37 dan 0,53, dan frekuensi alel A dan B masing-masing 0,28 dan 0,72. Sapi dengan genotipe AA mempunyai produksi susu lebih tinggi dibandingkan dengan kedua genotipe lainya. Gen-gen ini telah banyak dilaporkan pada beberapa spesies termasuk Bos taurus dan Bos indicus (GE et al., 2003; BEAUCHEMIN et al., 2006). DI STASIO et al. (2005) melaporkan hormon pertumbuhan GH sangat berpengaruh terhadap pertumbuhan dan metabolisme melalui interaksi dengan spesifik receptor (GHR) pada permukaan sel target. Oleh karena itu GHR menjadi gen kandidat yang berpengaruh terhadap produksi daging pada sapi. CHEONG et al. (2006) melaporkan keterkaitan antara polimorfisme gen GHRH dengan kualitas karkas pada sapi Korea. Pada sapi Zebu dan silangannya, CURI et al. (2006) mengidentifikasi gen GH1|Alu1 dan POU1F1|Hinf1 nyata berpengaruh terhadap pertumbuhan dan kualitas karkas, genotipe GH1|Alu1 LL mempunyai pertambahan bobot tubuh harian dan bobot karkas lebih tinggi daripada genotipe GH1|Alu1 LV. THOMAS et al. (2007) melaporkan genotipe GH dan Pit-1 berpengaruh terhadap sifat pertumbuhan dan karkas pada sapi Brangus. Genotipe Pit-1 GG mempunyai persentase lemak intramuscular lebih tinggi dari pada AA atau AG, dan Genotipe GH CG mempunyai pertambahan bobot tubuh lebih cepat dari pada genotipe CC dan GG. SHERMAN et al. (2007) melaporkan gen pengontrol metabolisme dan distribusi energi mempunyai dampak ekonomi yang sangat penting pada dunia peternakan. Gen-gen tersebut diantaranya growth hormone receptor (GHR), IGF2, dan GH. Genotipe AG pada GHR berpengaruh terhadap Bobot tubuh dan efisiency pakan IGF2 sangat berpengaruh terhadap marbling, ketebalan lemak
punggung, pertambahan bobot tubuh harian dan efisiensi pakan.. Penelitian genetika molekuler tentang identifikasi keragaman gen Pit-1 pada kerbau di Indonesia dan sapi FH Friesian Holstein telah di laporkan (MISRIANTI et al., 2010), identifikasi keragaman gen GH|Alu1 dan GHR|Alu1 pada kerbau di Indonesia (ANDREAS et al., 2010). DIYONO et al. (2010) telah melakukan penelitian pendahuluan tentang keragaman gen GH, GHRH dan Pit-1 dengan data populasi terbatas (44 ekor Kabupaten Pandeglang dan 33 ekor Kabupaten Lebak) di Banten, hasil penelitian menunjukkan keragaman yang sangat rendah pada lokus Pit-1|Hinf1 dengan He=0,00, lokus GH|Msp1 dengan He =0,0469 dan lokus GHRH|HaeIII dengan He=0,4908. Rendahnya keragaman kemungkinan disebabkan oleh keterbatasan sampel yang diambil, oleh karena itu perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan mengunakan gen GH, GHR, GHRH dan Pit-1 pada lokus (GH|MspI, GH|AluI, GHR|AluI, GHRH|HaeIII dan Pit-1|HinfI) pada populasi kerbau yang lebih banyak dan menyebar terutama di Kabupaten Pandeglang Banten. MATERI DAN METODE Pengambilan sampel darah Sebanyak 209 ekor ternak kerbau yang berasal dari 13 kecamatan di Kabupaten Pandeglang dan dua kecamatan di Kabupaten Lebak Provinsi Banten. Pengambilan sampel darah dilakukan melalui vena jugularis menggunakan jarum Vacutainer sebanyak 2 ml dan dimasukkan ke dalam tabung vakum berantikoagulan dan disimpan dengan etanol 95% sebagai pengawet. Ekstrasi DNA DNA diisolasi menggunakan metode fenol kloroform (SAMBROOK et al., 1989). Sampel darah total yang disimpan dalam etanol 95% disentrifugasi 3500 rpm selama 5 menit. Endapan sel-sel darah yang diperoleh dicuci dengan buffer TE sebanyak 2 kali. Sekitar 100 µl sel-sel darah yang telah bebas dari etanol disuspensikan dengan 1xSTE sampai volume mencapai 350 µl. Sel-sel darah kemudian dilisis dengan 20 µl proteinase K (10 mg/ml) dan 40 µl 10% SDS. Campuran ini dikocok pelan-pelan selama 2 jam pada suhu 55oC. Pemurnian DNA dilakukan dengan metode fenolkloroform, yaitu dengan menambahkan 1/10 volume 5 M NaCl, 1 x volume larutan fenol, dan 1 x volume kloroform iso amil alkohol (24:1), kemudian dikocok pelan-pelan pada suhu ruang selama 2 jam. Fase DNA dipisahkan dari fase fenol dengan sentrifugasi pada kecepatan 7000 rpm selama 5 menit. Molekul DNA 287
JITV Vol. 15 No. 4 Th. 2010: 286-296
diendapkan dengan menambahkan 1/10 x volume 5 M NaCl dan 2 x volume etanol absolut. Endapan DNA dicuci dengan etanol 70% kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 7000 rpm selama 5 menit. Sisa etanol dibuang dan diuapkan dengan menggunakan pompa vakum. DNA selanjutnya dilarutkan dengan 80 µl buffer TE 80%. Identifikasi keragaman gen GH|MspI, GH|AluI, GHR|AluI, GHRH|HaeIII dan Pit-1|HinfI Amplifikasi DNA dilakukan pada total volume 25 µl terdiri dari 2 µl (10-100 ng) DNA, 15,75 µl air bebas ion steril; 2,5 µl 10× buffer tanpa Mg2+; 2 µl MgCl2; 0,5 µl 10mM dNTP; 0,25 µl Taq polimerase; 2 µl (25 pmol) primer. Tahap 1 dilakukan dengan 1 x siklus, meliputi proses denaturasi awal pada suhu 94 ºC selama 4 menit. Tahap II dilakukan dengan 30 x siklus, meliputi denaturasi pada suhu 94ºC selama 10 detik, penempelan primer (annealing) pada suhu 60 ºC masing-masing untuk perimer GH|AluI GHRH|HaeIII dan Pit1|HinfI dan pada suhu 62oC untuk primer GH|MspI dan GHR|AluI selama 1 menit, pemanjangan molekul DNA pada suhu 72ºC selama 2 menit. Tahap III dilakukan dengan 1 x siklus, meliputi pemanjangan akhir molekul DNA pada suhu 72ºC selama 7 menit. Inkubasi pada 4°C hingga digunakan untuk analisis lebih lanjut. Informasi primer yang digunakan pada penelitian ini ditunjukkan pada Tabel 1. Produk PCR selanjutnya dipotong dengan enzim restriksi yang spesifik dengan gen tersebut. Enzim restriksi yang digunakan untuk gen GH, GHR, GHRH dan Pit-1 secara berurutan yaitu MspI, AluI, HaeIII dan HinfI. Enzim restriksi MspI mengenali situs restriksi
C*CGG, enzim AluI mengenali situs restriksi AG*CT, sedangkan enzim restriksi HaeIII dan HinfI masingmasing mengenali situs GG*CC dan G*ANTC. Sebanyak 2 µl produk PCR dicampur dengan 1 sampai 2 unit enzim restriksi dalam 1xBufer (New England Biolabs) dan selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama minimal 4 jam. Visualisasi pola pita hasil RFLP menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid 6% dilanjutkan dengan metode pewarnaan perak (TEGELSTROM, 1992) dan agarose 2% w/v dalam 0,5 x TBE dan diwarnai dengan Etidium Bromida. Analisis statistik Analisis data molekuler lokus GH|MspI, GH|AluI, GHR|AluI, GHRH|HaeIII dan Pit-1|HinfI. pada populasi kerbau Banten meliputi frekuensi alel, keseimbangan Hardy-Weinberg, nilai heterosigositas meliputi heterosigositas pengamatan (Ho) dan heterosigositas harapan (He). Frekuensi alel Frekuensi alel untuk setiap lokus dihitung menurut NEI dan KUMAR (2000) dengan formula sebagai berikut:
x1 =
(2 N11 + N12 ) 2N
Keterangan: x1 N11 N12
= frekuensi alel ke-1 = jumlah genotipe A1A1 = jumlah genotipe A1A2
Tabel 1. Informasi sekuen primer yang digunakan dalam penelitian Lokus
Sekuen Primer
GH|MspI
F: 5’-CCCACGGGCAAGAATGAGGC-3’
Pustaka
Annealing
MITRA et al., 1995
62oC
BALOGH et al., 2008
60oC
ANDREAS et al., 2010
62oC
MOODY et al. 1995
60oC
WOLLARD et al. 1994
60oC
R: 5’-TGAGGAACTGCAGGGGCCCA-3’ GH|AluI
F: 5’-CGGACCGTGTCTATGAGAAGCTGAAG-3’ R: 5’-GTTCTTGAGCAGCGCGTCGTCA-3’
GHR|AluI
F: 5’-CGCTTACTTCTGCGAGGTAGACGC-3’ R: 5’-GTCTGTGCTCACATAGCCAC-3’
GHRH|HaeIII
F: 5’-TGAAGGATGCTGCTCTGGGT-3’ R: 5’-TGCCTGTTCATGATATCCTGGA-3’
Pit1|HinfI
F: 5’-AAACCATCATCTCCCTTCTTCTT-3’ R: 5’-AATGTACAATGTGCCTTCTTCTG-3’
288
SUMANTRI et al. Pemanfaatan famili gen hormon pertumbuhan (GH, GHR, GHRH dan PIT-1) untuk mendeteksi keragaman genetik kerbau
Keseimbangan Hardy-Weinberg Keseimbangan Hardy-Weinberg diuji dengan chisquare (χ2) menurut HARTL (1988), sebagai berikut: (O − E ) 2 χ2 = ∑ E χ2 O E
= nilai chi-square uji = jumlah pengamatan genotipe ke-i = jumlah harapan genotipe ke-i
Nilai Heterozigositas Pengamatan (Ho) Nilai heterosigositas teramati (Ho) dan heterosigositas harapan (He) dapat digunakan untuk menduga nilai koefisien inbreeding pada suatu kelompok ternak. Perhitungan nilai Ho dan He dilakukan menurut HARTL (1988) dengan formula sebagai berikut: Σ
Ho =
i#j
Keterangan: Ho = N1ij = N
=
N1ij N
heterosigositas pengamatan jumlah individu heterosigot pada lokus ke-1 jumlah individu yang diamati
Nilai Heterozigositas Harapan (He) n
2 He = 1 - Σ P1i i=1
Keterangan: He = heterosigositas harapan P1i = frekuensi alel ke-i pada lokus ke-1 = jumlah alel pada lokus-1 n
Polymorphic Information Content (PIC) was calculated by following formula (BOTSTEIN et al., 1980):
PIC = 1 −
n
∑
i −1
P 2i −
n −1
n
∑ ∑ 2P
2
i
P2j
i −1 j = i + 1
Keterangan: PIC Pi n
= polymophic information content = frekuensi alel ke-i = jumlah alel
HASIL DAN PEMBAHASAN Frekuensi Alel lokus GH|MspI, GH|AluI, GHR|AluI, GHRH|HaeIII dan Pit-1|HinfI Frekuensi alel, frekuensi genotipe dan keseimbangan Hardy-Weinberg (χ2) untuk lokus GH/MspI, GHRH/HaeIII dan Pit-1/HinfI pada subpopulasi kerbau Pandeglang dan Lebak disajikan pada Tabel 2. Lokus GH|MspI Hasil visualisasi PCR-RFLP lokus GH|MspI sepanjang 327 panjang basa (pb) menghasilkan dua alel yaitu GH(+) dan GH(-). Mutasi yang terjadi terletak pada basa ke-104 yaitu mutasi titk C-T pada intron 3. Gen GH dengan genotipe GH(+/+) ditunjukkan dengan potongan sempurna dengan dua fragmen yaitu 104 dan 223 pb, genotipe GH(+/-) dengan tiga fragmen yaitu 104, 223 dan 327 pb dan genotipe GH(-/-) ditunjukkan dengan tidak terpotongnya produk PCR sepanjang 327 pb (Gambar 1.)
400 pb 300 pb
327 pb
200 pb
223 pb
100 pb
104 pb
Gambar 1. Pola pita pemotongan lokus GH|MspI pada gel poliakrilamid 6%
289
JITV Vol. 15 No. 4 Th. 2010: 286-296
Secara umum lokus GH|MspI bersifat monomorfik dengan alel GH (+) sebesar 1,0 kecuali di Kecamatan Menes dan Cisata Kabupaten Pandeglang dengan frekuensi alel GH (+) masing-masing 0,89 dan 0,97. Tingginya frekuensi alel GH(+) ini juga ditemukan pada beberapa populasi ternak sapi (FALAKI et al.,1996; LAGZIEL et al., 2000). Oleh beberapa peneliti, keragaman pada lokus GH|MspI ini digunakan untuk mengetahui pola distribusi alel antara bangsa sapi tidak berpunuk (Bos taurus) dan bangsa sapi berpunuk (Bos Indicus). Pada bangsa sapi Bos indicus, dijumpai frekuensi alel GH(-) yang lebih tinggi dibandingkan dengan frekuensi alel GH(+) (LAGZIEL et al., 2000). Lokus GH|AluI Hasil amplifikasi PCR-RFLP lokus GH|AluI sepanjang 432 pb sesuai dengan pustaka genom (Genbank Nomor Akses J00008; BALOGH et al., 2009). Berdasarkan sekuen DNA ruas gen GH yang diamplifikasi terdapat tiga situs pemotongan AluI, alel leucine (L) ditunjukkan dengan panjang fragmen 20, 51, 96, dan 265 bp, dan alel valine (V) ditunjukkan dengan fragmen 20, 147, dan 265 bp. Hal ini disebabkan adanya perubahan basa pada posisi ke 1758, yaitu dari C menjadi G. (BALOGH et al., 2009). Gambar 2 menunjukkan semua genotipe adalah LL. lokus GH|AluI secara umum bersifat monomorfik dengan frekuensi alel (L) sebesar 1,0.
PEREIRA et al. (2005) melaporkan genotipe GH|AluI berpengaruh nyata terhadap bobot sapi Canchim (5/8 Charolais + 3/8 Zebu) umur satu tahun, sedangkan pada sapi Japanese Black berpengaruh terhadap sifat karkas dan komposisi asam lemak (ARDIYANTI et al., 2009). Lokus GHR|AluI Hasil amplifikasi PCR-RFLP lokus GHR|AluI sepanjang 298 pb pada ekson 10 sesuai dengan pustaka genom (Genbank Nomor Akses AY053546). Alel A ditunjukkan dengan panjang fragmen 81 dan 217 pb, sedangkan alel G ditunjukkan panjang fragmen 298 pb. Hal ini disebabkan adanya mutasi basa pada posisi ke 256, yaitu dari A menjadi G. Perubahan tersebut menyebabkan situs pemotong tidak dikenali oleh enzim AluI (GE et al., 2000; dan DI STASIO et al., 2005). Gambar 3 menunjukkan semua kebau bergenotipe AA. Tabel 2. menunjukkan lokus GHR|AluI bersifat monomorfik karena semua populasi mempunyai alel A (1,0). Keragaman gen GHR pada sapi yang telah dilaporkan diantaranya terdapat pada daerah promotor dan ekson 10 (GE et al., 2000). Analisis PCR-RFLP menggunakan NsiI pada daerah regulator GHR sapi berpengaruh terhadap tingkat serum IGF-1 (GE et al., 2000). Keragaman pada GHR sapi ekson 10 berpengaruh terhadap kualitas daging (DI STASIO et al., 2005).
500 pb 400 pb 300 pb 200 pb
265 pb 96 pb
100 pb
LL LL LL LL
LL LL LL
LL LL LL
LL LL LL LL
LL LL
Gambar 2. Pola pita pemotongan lokus GH|AluI bergenotipe LL pada gel agarosa 2%
500 pb 400 pb 300 pb 200 pb
217 pb 81 pb
100 pb
AA
AA AA
AA
AA AA
AA AA AA AA AA AA
Gambar 3. Pola pita pemotongan lokus GHR|AluI bergenotipe AA pada gel agarosa 2%
290
SUMANTRI et al. Pemanfaatan famili gen hormon pertumbuhan (GH, GHR, GHRH dan PIT-1) untuk mendeteksi keragaman genetik kerbau
500 pb 400 pb 300 pb
312 pb
200 pb
194 pb 118 pb 94 pb
100 pb
45 pb
BB
AB
AB
AB
AB
AB
BB
AA
AB
AB
Gambar 4. Pola pita pemotongan lokus GHRH|HaeIII pada gel agarosa 2%
500 pb 400 pb
367 pb
300 pb 243 pb 200 pb
100 pb
BB BB BB BB BB BB BB Gambar 5. Pola pita pemotongan lokus Pit-1|HinfI pada gel poliakrilamid 6%
Lokus GHRH|HaeIII Hasil amplifikasi PCR-RFLP lokus GHRH|HaeIII sepanjang 451 pb sesuai dengan pustaka genom (GenBank: AF242855). Alel A dengan panjang fragmen 312, 94 dan 45 pb, sedangkan alel B dengan 4 fragmen panjangnya adalah 118, 194, 94 dan 45 pb. Mutasi terjadi pada intron 2 basa ke 312. Genotipe AA ditunjukkan dengan 3 fragmen 312, 94 dan 45, genotipe BB ditunjukkan dengan adanya empat fragmen yaitu 194, 118, 94 dan 45 pb, dan genotipe AB ditunjukkan dengan adanya lima fragmen 312, 194, 118, 94 dan 45 pb. Lokus GHRH|HaeIII bersifat polimorfik hanya pada populasi Menes dan Cisata di Kabupaten Pandeglang dan Cibadak Kabupaten Lebak dengan frekuensi alel A masing-masing 0,89; 0,70 dan 0,58 (Tabel 2). Penelitian tentang keragaman gen GHRH belum banyak dilakukan pada populasi kerbau rawa. Pada populasi kerbau perah Murrah yang termasuk dalam kelompok kerbau sungai (riverine buffalo), lokus GHRH|HaeIII bersifat monomorfik dengan tidak ditemukanya alel A
(RAJAMURUGAN et al., 2007). Beberapa penelitian mengenai keragaman gen GHRH telah dilakukan pada ternak sapi. KMIEC et al. (2007) melaporkan keragaman lokus GHRH/HaeIII pada sapi perah Polish Red and White dengan frekuensi alel A dan B masing-masing 0.28 dan 0.72, serta frekuensi genotipe AA, AB dan BB masing-masing 0.09, 0.38 dan 0.53. Lokus Pit-1|HinfI Hasil amplifikasi PCR-RFLP lokus Pit-1|HinfI sepanjang 611 pb sesuai dengan pustaka genom (gene bank Y 15995 dan AM 490263) JAVANMARD et al. (2005), alel A ditunjukkan dengan satu pita 611 pb sedangkan alel B ditunjukkan dengan dua fragmen 367 dan 244 pb. Perbedaan ini diakibatkan adanya mutasi titik G ke A pada ekson 6 tepatnya pada basa ke-357 yang dikenali dengan enzim restriksi HinfI pada situs restriksi G*ANTC. Mutasi ini tidak mengakibatkan terjadinya perubahan asam amino (silent mutation) (DIERKES et al., 1998). Lokus Pit-1|HinfI bersifat monomorfik pada populasi kerbau Banten dan semua 291
JITV Vol. 15 No. 4 Th. 2010: 286-296
bergenotipe BB. Pada penelitian ini gen Pit-1 pada populasi kerbau di Kabupaten Pandeglang dan Lebak Banten, bersifat monomorfik. Berbeda dengan yang dilaporkan oleh JAVANMARD et al. (2005), bahwa pada populasi kerbau di Iran yang merupakan kerbau sungai (tipe perah), frekuensi alel A dan B dilaporkan sebesar 0.15 dan 0.85 serta frekuensi genotipe AA, AB dan BB masing-masing secara berurutan 0.10; 0.10 dan 0.80. Pada bangsa sapi Bos taurus, laporan mengenai keragaman gen Pit-1 dilaporkan oleh WOLLARD et al. (1994). Frekuensi alel A gen Pit-1 pada sapi bervariasi mulai dari 0.25 (DI STASIO et al., 2002), 0.45 (MOODY et al., 1995), dan 0.53 (RENAVILLE et al., 1997). Keseimbangan Hardy-Weinberg Suatu populasi dikatakan dalam kesembangan Hardy-Weinberg yaitu jika frekuensi genotipe dan frekuensi alel selalu konstan dari generasi ke generasi berikutnya. Hal ini terjadi sebagai penggabungan gamet secara acak dalam populasi yang besar (VASCONCELLOUS et al., 2003). Keseimbangan gen dalam populasi terjadi jika tidak ada seleksi, mutasi, migrasi dan genetic drift (FALCONER dan MACKAY (1996). Pada penelitian ini (Tabel 2), menunjukkan bahwa frekuensi alel lokus GH|MspI, GHRH|HaeIII di populasi Menes Kabupaten Pandeglang menyimpang dari keseimbangan Hardy-Weinberg (P < 0,05). Populasi Cisata Kabupaten Pandeglang tidak menyimpang dari keseimbangan Hardy-Weinberg, sedangkan populasi lainnya tidak dianalisis karena monomorfik. Heterosigositas pengamatan (Ho), harapan (He) dan polymorphic information conten (PIC) Nilai heterosigositas pengamatan (Ho) dan heterosigositas harapan (He) digunakan untuk menduga keragaman genetik. Heterosigositas harapan (He) merupakan penduga keragaman genetik yang tepat pada populasi hewan ternak karena perhitungannya langsung berdasarkan pada frekuensi alel (MOIOLI et al., 2004). Nilai heterosigositas pengamatan (Ho), heterosigositas harapan (He) ditunjukkan pada Tabel 3. Nilai Ho dan He untuk lokus GH|Msp1 dan GHRH|Hae III hanya ditemukan pada populasi Menes masing-masing sebesar (0,00 dan 0,29; 0,00 dan 0,20) dan Cisata masingmasing sebesar (0,07 dan 0,07; 0,45 dan 0,42). Perbedaan nilai Ho dan He pada lokus GH|Msp1 dan GHRH|HaeIII pada populasi Menes, mengindikasikan adanya ketidakseimbangan Hardy-Winberg (Tabel 2) pada populasi yang diamati (TOMBASCO et al., 2003). Nilai Ho dan He untuk lokus GHRH|Hae III pada populasi Cibadak sebesar (0,48 dan 0,49). Secara keseluruhan nilai heterosigositas pengamatan (Ho) dan nilai heterosigositas harapan (He) pada populasi kerbau
292
di Banten untuk lokus GH|Msp1 dan GHRH|Hae III masing-masing sebesar (0,01 dan 0,02) dan (0,17 dan 0,23). Hasil penelitian ini jauh lebih rendah dari penelitian DIYONO et al. (2010) yang melaporkan He untuk lokus GH|Msp1 sebesar 0,0469 dan untuk lokus GHRH|HaeIII sebesar 0,4908. Hal ini disebabkan perbedaan pengambilan jumlah dan lokasi sampel yang lebih menyebar. Nilai Ho dan He untuk lokus GH|AluI, GHR|AluI, dan Pit-1|HinfI pada semua populasi bernilai 0,00 karena bersifat monomorfik. Nilai polymorphic information conten (Pic) hanya ditemukan pada populasi Menes dan Cisata untuk lokus GH|Msp1 dan GHRH|Hae III masing-masing sebesar (0,19 dan 0,19) dan (0,06 dan 0,37). Populasi Cibadak untuk lokus GHRH|Hae III mempunyai Pic sebesar 0,43. Secara keseluruhan nilai Pic pada populasi Banten untuk lokus GH|Msp1 dan GHRH|Hae III masing-masing sebesar 0,02 dan 0,22. Perbedaan keragaman bisa juga disebabkan oleh metode analisis seperti melalui PCR-SSCP (polymerase chain reactionsingle strand conformation polymorphism) pada kerbau India ditemukan adanya keragaman pada gen GH (MUHAGHEGH dan GOSWAM, 2006). Deteksi keragaman genetik dengan menggunakan 13 mikrosatelit pada kerbau di Italia, Yunani dan Mesir dengan rataan heterosigositas observasi masing-masing sebesar 0,135, 0,151 and 0,158 untuk kerbau Italia, Yunani dan Mesir. telah dilaporkan oleh (MOIOLI et al 2001). Dengan metode yang sama yaitu dengan menggunakan mikrosatelit VAN HOOFT et al. (2000) melaporkan keragaman genetik pada kerbau liar Afrika cukup tinggi dengan nilai Ho sebesar 0,729 dan He sebesar 0,759. Hasil penelitian menunjukkan terdapat keragaman yang sangat rendah pada gen grup hormon pertumbuhan (GH|Alu1, GH|Msp1, GHR|Alu1, GHRH|HaeIII dan Pit-1|Hinf1) pada populasi kerbau di Kabupaten Pandeglang dan kabupaten Lebak. Keragaman genetik perlu ditingkatkan melalui (1) kebijakan manajemen perkawinan terutama dalam penyediaan dan perguliran pejantan dari luar populasi. (2) Melakukan seleksi pejantan melalui uji performa dan perguliran pejantan perlu dilakukan untuk menghindari silang dalam Hal ini menguatkan penelitian sebelumnya (SAROJI et al., 2010) terdapat kecenderungan penurunan performa bobot tubuh dan ukuran tubuh dari pejantan lebih kecil dari betinanya. KESIMPULAN Lokus GH|MspI dan GHRH|HaeIII bersifat polimorfik, sedangkan lokus GH|AluI, GHR|AluI dan Pit-1|HinfI bersifat monomorfik. Pada lokus GH|AluI hanya ditemukan alel V, GHR|AluI hanya alel A dan pada lokus Pit-1|HinfI hanya ditemukan alel B dengan
SUMANTRI et al. Pemanfaatan famili gen hormon pertumbuhan (GH, GHR, GHRH dan PIT-1) untuk mendeteksi keragaman genetik kerbau
Tabel 2. Frekuensi alel dan uji keseimbangan Hardy-Weinberg (χ2) pada kerbau di Banten GH|MspI Kabupaten (n)
Pandeglang (174)
Lebak (35)
Kecamatan (n)
Frek Alel
GH|AluI χ2
Frek Alel
GHR|AluI χ2
Frek Alel A
G
td
1,00
0,00
0,00
td
1,00
1,00
0,00
td
td
1,00
0,00
1,00
td
1,00
0,11
0,89
9,00*
Pagelaran (19)
0,00
1,00
Cisata (44)
0,03
Panimbang (2)
GHRH|HaeIII χ2
Frek Alel A
B
td
1,00
0,00
0,00
td
1,00
1,00
0,00
td
td
1,00
0,00
0,00
td
1,00
1,00
0,00
td
td
1,00
0,00
0,97
0,05
1,00
0,00
1,00
td
Saketi (8)
0,00
1,00
Sumur (1)
0,00
Cibadak (33)
Pit-1|HinfI χ2
Frek Alel
χ2
A
B
td
0,00
1,00
td
0,00
td
0,00
1,00
td
1,00
0,00
td
0,00
1,00
td
td
1,00
0,00
td
0,00
1,00
td
0,00
td
1,00
0,00
td
0,00
1,00
td
1,00
0,00
td
0,89
0,11
9,00*
0,00
1,00
td
td
1,00
0,00
td
1,00
0,00
td
0,00
1,00
td
0,00
td
1,00
0,00
td
0,70
0,30
0,37
0,00
1,00
td
1,00
0,00
td
1,00
0,00
td
1,00
0,00
td
0,00
1,00
td
td
1,00
0,00
td
1,00
0,00
td
1,00
0,00
td
0,00
1,00
td
1,00
td
1,00
0,00
td
1,00
0,00
td
1,00
0,00
td
0,00
1,00
td
0,00
1,00
td
1,00
0,00
td
1,00
0,00
td
0,58
0,42
0,00
0,00
1,00
td
Warung Gunung (2)
0,00
1,00
td
1,00
0,00
td
1,00
0,00
td
1,00
0,00
td
0,00
1,00
td
Total (209)
0,01
0,99
32,24
1,00
0,00
td
1,00
0,00
td
0,87
0,13
13,88
0,00
1,00
td
-
+
L
V
Bojong (4)
0,00
1,00
td
1,00
0,00
Carita (7)
0,00
1,00
td
1,00
Cibaliung (71)
0,00
1,00
td
Kadupandak (1)
0,00
1,00
Labuan (8)
0,00
Menes (9)
Keterangan: χ20,05 = 5,99 td = tidak dianalisis
293
JITV Vol. 15 No. 4 Th. 2010: 286-296
Tabel 3. Nilai heterosigositas pengamatan (Ho) dan heterosigositas harapan (He) Kabupaten (n)
Kecamatan (n)
Pandeglang (174)
Lebak (35)
294
GH|MspI
GH|AluI
GHR|AluI
GHRH|HaeIII
Pit1|HinfI
Ho
He
PIC
Ho
He
PIC
Ho
He
PIC
Ho
He
PIC
Ho
He
PIC
Bojong (4)
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
Carita (7)
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
Cibaliung (71)
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
Picung (1)
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
Labuan (8)
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
Menes (9)
0,00
0,20
0,19
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,20
0,19
0,00
0,00
0,00
Pagelaran (19)
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
Cisata (44)
0,07
0,07
0,06
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,45
0,42
0,37
0,00
0,00
0,00
Panimbang (2)
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
Saketi (8)
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
Sumur (1)
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
Cibadak (33)
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,48
0,49
0,43
0,00
0,00
0,00
Warung Gunung (2)
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
Total (209)
0,01
0,02
0,02
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,17
0,23
0,22
0,00
0,00
0,00
SUMANTRI et al. Pemanfaatan famili gen hormon pertumbuhan (GH, GHR, GHRH dan PIT-1) untuk mendeteksi keragaman genetik kerbau
frekuensi alel masing-masing (1,0). Alel GH(-) pada lokus GH|MspI hanya ditemukan di kecamatan Cibarani (0,03) dan Kecamatan Menes (0.11). Alel B pada lokus GHRH|HaeIII hanya ditemukan di kecamatan Cibadak (0,42), Cibarani (0,30) dan Menes (0,11) Pada populasi total Banten lokus GH|MspI mempunyai keragaman yang rendah (He = 0.02) dan polymorphic information content (Pic = 0,02), sedangkan lokus GHRH|HaeIII mempunyai keragaman lebih tinggi (He = 0, 23) dan Pic (0,22) UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terima kasih kami sampaikan kepada Kementerian Pertanian RI yang telah mendanai sebagian kegiatan penelitian ini melalui Program KKP3T dgn No. 707/LB.620/I.1/3/2008. Ucapan terima kasih juga kami sampaikan kepada Dinas Peternakan Provinsi Banten yang telah mengijinkan dan membantu dalam pengambilan sampel darah kerbau di kabupaten Lebak dan Pandeglang. DAFTAR PUSTAKA ANDREAS, E., C. SUMANTRI, H. NURAINI, A. FARAJALLAH and A. ANGGRAENI. 2010. Identification of GH|Alu1 and GHR|Alu1 genes polymorphism in Indonesian Buffalo. J. Indon. Trop. Anim. Agric. 35: 215-221.. ARDIYANTI, A., Y. OKI, Y. SUDA, K SUZUKI, K. CHIKUNI, Y. OBARA and K. KATOH. 2009. Effects of GH gene polymorphism and sex on carcass traits and fatty acid compositions in Japanese Black cattle. Anim. Sci. J. 80: 62–69. BALOGH, O., K. KOVACS, M. KULCSAR, A. GASPARDY, H. FEBEL, A. ZSOLNAI, L. FESUS, C. DELAVAUD, Y. CHILLIARD, R.O. GILBERT and G.Y. HUSZENICZA. 2009. Interrelationship of growth hormone AluI polymorphism and hyperketonemia with plasma hormones and metabolites in the beginning of lactation in dairy cows. Livest. Sci. 123: 180-186. BEAUCHEMIN, V.R., M.G. THOMAS, D.E. FRANKE and G.A SILVER. 2006. Evaluation of DNA polymorphisms involving growth hormone relative to growth and carcass characteristics in Brahman steers. Genet. Mol. Res. 5:438-447. BOTSTEIN, D., R.L. WHITE, M. SKOLNICK and R.W. DAVIS. 1980. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331. CHEONG, H.S., D.K. YOON, L.Y. KIM, B.Y. PARK, Y.H. CHOI, E.R. CHUNG, Y.M. CHO, E.W. PARK, I.C. CHEONG, S.J. OH, S.G. YI, T. PARK and H.D. SHIN. 2006. Growth hormone-releasing hormone (GHRH) polymorphisms associated with carcass traits of meat in Korean cattle. BMC Genet. 7:35-41.
COHEN, L.E., F.E. WONDISFORD and S. RADOVICK. 1997. Role of Pit-1 in the gene expression of growth hormone, prolactin, and thyrotropin. Endocr. Metab. Clin. North Am. 25: 523-540. CURI, R.A., D.A. PALMIERI, L. SUGUISAWA, H.N. DE OLIVEIRA, A.C. SILVEIRA and C.R. LOPES. 2006. Growth and carcass traits associated with GH1/Alu 1 and POU1F1/Hinf1 gene polymorphisms in Zebu and crossbred beef cattle. Genet. Mol. Biol. 29: 56-61. DIERKES, B., KRIEGESMANN, B.G. BAUMGARTNER and B. BRENIG. 1998. Partial genomic structure of the bovine Pit1 gene and characterization of a HinfI transition polymorphism in exon 6. Anim. Genet. 29: 405-412. DIYONO, R., C. SUMANTRI dan A. FARAJALLAH. 2010. Polymorfisme gen GH, GHRH dan Pit1 pada populasi kerbau di Banten. Prosiding Seminar dan Lokakarya Nasional Kerbau. Lebak-Banten, 2-4 November 2010. Puslitbang Peternakan. Bogor. (Abstrak). hlm. 26. DI STASIO, L., A. BRUGIAPAGLIA, G. DESTEFANIS, A. ALBERA and S. SARTORE. 2002. GH1 as candidate gene for variability of meat production traits in Piedmontese cattle. J. Anim. Breed. Genet. 120:358-361. DI STASIO, L., G. DESTEFANIS, A. BRUGIAPAGLIA, A. ALBERA and A. ROLANDO. 2005. Polymorphism of the GHR gene in cattle and relationships with meat production and quality. Anim. Genet. 36: 138-140. FALAKI, M., N. GENGLER, M. SNEYERS, A. PRANDI, S. MASSARTA. FORMIGONI, A. BURNYD, PORTETELLE and R. RENAVILLE. 1996. Relationships of polymorphism for growth hormone and growth hormone receptor genes with milk production traits for Italian HolsteinFriesian bulls. J. Dairy Sci. 79: 1446–1453. FALCONER, D.S. and T.F.C. MACKAY. 1996. Introduction to Quantitative Genetic. 4th Ed. Essex, England: Longman Group Ltd. GE, W., M.E. DAVIS, H.C. HINES and K.M. IRVIN. 2000. Single nucleotide polymorphisma detected in exon 10 of the bovine growth hormone receptor gene. J. Anim. Sci. 78: 2229-2230. GROCHOWSKA, R., P. SØRENSEN, L. ZWIERZCHOWSKI, M. SNOCHOWSKI and P. LØVENDAHL. 2001. Genetic variation in stimulated GH release and in IGF-I of young dairy cattle and their associations with the leucine/valine polymorphism in the GH gene. J. Anim. Sci. 79: 470-476. HARTL, D.L. 1988. Principle of Population Genetic. Sunderland: Sinauer Associates, Inc. Publisher. HINES, H.C., W. GE, Q. ZHAO and M.E. DAVIS. 1998. Association of genetic markers in growth hormone and insulin-like growth factor I loci with lactation traits in Holstein. Anim. Genet. 29: 69-74. JAVANMARD, A., N. ASADZADEH, M. HOSSEIN, BANABAZI and J. TAVAKOLIAN. 2005. The allele and genotype frequencies of bovine pituitary specific transcription factor and leptin genes in Iranian cattle and buffalo
295
JITV Vol. 15 No. 4 Th. 2010: 286-296
populations using PCR-RFLP. Iran J. Biotechnol. 3: 104-108.
growth hormone releasing hormone (GHRH) partial gene in buffalo. Ind. J. Anim. Sci. 77: 749-751.
KMIEC, M., I.K. LUCZAK, H. KULIG and A. TERMAN. 2007. Association between GHRH/HaeIII restriction polymorphism and milk production traits in a herd of dairy cattle. J. Anim. Vet. Adv. 6: 1298-1303.
RENAVILLE, R., N. GENGLER, E. VRECH, A. PRANDI, S. MASSART, C. CORRADINI, C. BERTOZZI, F. MORTIAUX, A. BURNY and D. PORTETELLE. 1997. PIT-1 gene polymorphism milk yield and conformation traits for Italian Holstein-Friesian bulls. J. Dairy Sci. 80: 34313438.
LAGZIEL, A., S. DENISE, O. HANOTTE, S. DHARA, V. GLAZKO, A. BROADHEAD, R. DAVOLI, V. RUSSO and M. SOLLER. 2000. Geographic and breed distribution of an MspI PCR-RFLP in the bovine growth hormone (bGH) gene. Anim. Genet. 31: 210-213. LECHNIAK, D., G. MACHNIK, M. SZYDLOWSKI and M. SWITONSKI. 1999. Growth hormone gene polymorphism and reproductive performance of AI bulls. Theriogenology 52: 1145-1152. MAREK, K., I.K. LUCZAK, H. KULIG, A. TERMAN, H. WIERZBICK and A. LEPERZYNSKI, 2007. Associations between GHRH/HaeIII restriction polymorphism and milk production traits in a herd of dairy cattle. J. Anim. Vet. Adv. 6: 1298-1303. MISRIANTI, R., C. SUMANTRI and A. FARAJALLAH. 2010. Identification polymorphism of pituitary-specific positive transcription factor1 (Pit1) gene in Indonesian local buffalo (Bubalus bubalis) and Holstein-Friesian cows. Media Petern. 33: 131-136. MITRA, A., P, SCHELE, C.R. BALAKRISNAN and F. PIRCHNER. 1995. Polymorphisms at growth hormone and prolactin loci in Indian cattle and buffalo. J. Anim. Breed. Genet. 112: 71-74. MOIOLI, B., A. GEORGOUDIS, F. NAPOLITANO, G. CATILLO, E. GIUBILEI, C.H. LIGDA and M. HASSANANE. 2001 Genetic diversity between Italian, Greek and Egyptian buffalo populations. Livest. Prod.. Sci. 70: 203-211. MOIOLI, B., F. NAPOLITANO and G. CATILLO. 2004. Genetic diversty between Peidmontese, Maremmana and Podolica cattle breeds. J. Hered. 95: 250-256.
SAMBROOK, J.E.F. FRITSCH and T. MANIATIS. 1989. Molecular Cloning. a Laboratory Manual . Ed ke-2. Cold Spring Harbor Laboratory Press. SAROJI, R.E. SITOMPUL, JAKARIA dan C. SUMANTRI. 2010. Karakteristik ukuran tubuh kerbau rawa di kabupaten Lebak dan Pandeglang propinsi Banten. Prosiding Seminar dan Lokakarya Nasional Kerbau. LebakBanten, 2-4 November 2010. Puslitbang Peternakan. Bogor. (Abstrak). hlm. 18. SHERMAN, EL, J.D. NKRUMAH, B.M. MURDOCH, C. LI , Z. WANG, A. FU and S.S. MOORE. 2007. Polymorphisms and haplotypes in the bovine neuropeptide Y, growth hormone receptor, ghrelin, insulin-like growth factor 2, and uncoupling proteins 2 and 3 genes and their associations with measures of growth, performance, feed efficiency, and carcass merit in beef cattle. J. Anim. Sci. 86: 1-16. TAMBASCO, D.D., C.C.P. PAZ, M. TAMBASCO-STUDART, A.P. PEREIRA1, M.M. ALENCAR, A.R. FREITAS, L.L. COUTINHO, I.U. PACKER and L.C.A. REGITANO. 2003. Candidate gene for growth traits in beef cattle crosses Bos taurus x Bos indicus. J. Anim. Breed. Genet. 120: 51–56. TEGELSTROM, H. 1986. Mitochondrial DNA in nature population: An improved routine for screening of genetic variation based on sensitive silver staining. Electrophoresis 7: 226-229.
MOODY, D.E., D. POMP and W. BARENDSE. 1995. Restriction fragment lenght polymorphisms in amplification product in the bovine growth hormone releasing hormone gene. J. Anim. Sci. 73: 3789-3793.
THOMAS, M.G., R.M. ENNS, K.L. SHIRLEY, M.D. GARCIA, A.J. GARRETT and G.A. SILVER. 2007. Associations of DNA polymorphisms in growth hormone and its transcriptional regulators with growth and carcass traits in two populations of Brangus bulls. Genet. Mol. Res. 6: 222-237.
MUHAGHEGH, M.D. and S.L. GOSWAMI, 2006. Single strand conformation polymorphism (SSCP) in 3’ region of growth hormone gene in five breeds of Indian buffalo. Anim. Sci. Papers Rep. 24: 159-162.
VAN HOOFT, W.F., A.F. GROEN and H.H.T. PRINS. 2000. Microsatellite analysis of genetic diversity in Africanbuffalo (Syncerus caffer) populations throughout Africa. Mol. Ecol. 9: 2017–2025.
NEI, M. and S. KUMAR. 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics. New York: Oxford University Press.
VASCONCELLOS, L.P.M.K., D.T. TALHARI, A.P. PEREIRA, L.L. COUTINHO and L.C.A. REGINATO. 2003. Genetic characterization of Aberden Angus cattle using molecular. Genet. Mol. Biol. 26: 133-137.
PEREIRA, A.P., M.M. DE ALENCAR, H.N. DE OLIVEIRA and L.C. DE REGITANO. 2005. Association of GH and IGF-1 polymorphisms with growth traits in a synthetic beef cattle breed. Gen. Mol. Biol. 28: 230–236. RAJAMURUGAN, J., S. KUMAR, O.P. PANDEY, S.M. DEB, A. MITRA and A. SHARMA. 2007. Characterization of
296
WOOLLARD, J., C.B. SCHIMTZ, A.E. FREEMAN and C.K. TUGGLE. 1994. Rapid communication: HinfI polimorphisms at the bovine Pit-1 lokcus. J. Anim. Sci. 72: 1911-1916.
