ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN TAKSONOMI MIKROBA

ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN TAKSONOMI MIKROBA

ISOLASI MIKROBA

Medium dan Biakan

Habitat alami

Medium di Lab.

•Medium: Nutrien yang digunakan organisme untuk tumbuh di luar habitat alaminya •Biakan: Perbanyakan mikroorganisme menggunakan berbagai media

Komponen Media Makronutrien (C, N, P, K)  Mikronutrien (Fe, Mg, Ca, Na)  Vitamin 

Macam Media Mikrobiologis  Media

Kimia Tertentu (defined)

 Komposisi

kimia penyusun media diketahui dengan pasti

 Media

Kompleks (undefined)

 Komposisi

kimia penyusun media tidak diketahui dengan pasti  Sering tersusun dari ekstrak tanaman atau hewan seperti ekstrak kedelai, ekstrak kecambah, protein susu, dll.

Macam Media Mikrobiologis 

Media Padat  Media



yang tersusun dari bahan padat

Media Cair  Media

yang bahan-bahan penyusunnya dilarutkan dalam air



Media Semipadat  Media

yang telah diberi bahan pembuat gel

Agar (paling sering digunakan)  Gelatin  Silika gel (digunakan bila membutuhkan pembuat gel non-organik) 

Tujuan Penggunaan Media  Umum Nutrien

 Selektif

Broth/Agar, Luria Bertani

& Pembeda

Medium

bebas N

 Pengayaan Medium

plus senyawa tertentu

 Pengujian Pati

agar, medium nitrat

Media Seletif & Pembeda 

Media Selektif  Mengandung

bahan yang menghambat pertumbuhan mikroba tertentu tetapi tidak yang lain  Seringkali digunakan untuk mengisolasi mikroorganisme tertentu dari populasi mikroorganisme lainnya



Media Pembeda  Mengandung

indikator yang menghasilkan reaksi berbeda antar mikroorganisme (contoh, warna koloni berbeda)  Digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme

Media Pertumbuhan Selektif 







Dimaksudkan untuk memacu pertumbuhan mikrobia yang dikehendaki dan menghambat mikrobia yang tidak dikehendaki Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol (DRBC): antibiotik yang menghambat pertumbuhan bakteri. Cocok untuk isolasi Fungi Brilliant Green Agar: Senyawa kimia cat Green menghambat bakteri Gram (+). Cocok untuk isolasi bakteri Gram (-) Bismut Sulfite Agar: Cocok untuk isolasi Salmonella typhi, menghambat bakteri lain

Differential Media 

Coliform pada media Lauryl Tryptone Broth pada suhu 30oC mampu menghasilkan gas, sedangkan non-Coliform tidak tumbuh atau tumbuh tapi tidak menghasilkan gas



Baird Parker Agar: untuk membedakan Staphylococcus aureus



Egg Yolk: S. aureus mampu memecah egg yolk dan menberikan zona bening sekitar koloni



Media Padat (Agar)



Media Cair (Broth)

Media Pengayaan 

Memungkinkan pertumbuhan mikroba yang diinginkan  Contoh:

Di dalam tanah hanya terdapat sejumlah kecil mikroba pendegradasi fenol di antara berjutajuta mikroba lainnya 





Medium yang mengandung fenol diinokulasi tanah tersebut dan diinkubasi Biakan yang mulai tumbuh dipindahkan/reinokulasi ke medium baru (diulang beberapa kali) Hanya mikroba yang mampu memetabolisme fenol yang tumbuh dalam medium tersebut

Pengayaan Azotobacter

Inokulasi media mengandung agar untuk memperoleh koloni tunggal

Biakan campuran

Biakan tunggal

Goresan di permukaan media yang mengandung agar

IDENTIFIKASI MIKROBA YANG TELAH DIISOLASI

Taksonomi Konvensional vs. Molekular 

Karakter Fenotipik  Termasuk

di dalamnya karakter fisik dan

biokimia  Dua mikroba yang tak berhubungan bisa memiliki fenotipe yang sama 

Filogeni  70%

DNA terhibridisasi?  97% kesamaan pada 16S rRNA?  Mikroba dengan fenotipe berbeda dapat memiliki 16S rRNA yang identik

Karakter Fenotipik yang Digunakan dalam Taksonomi Konventional Morfologi, reaksi pengecatan Gram, dinding sel, lipida, organela inklusi dan penyimpan produk, pigment, penggunaan sumber karbon, penggunaan sumber nitrogen, penggunaan sumber sulfur, produk fermentasi, kebutuhan gas, kisaran suhu, kisaran pH, patogenisitas, hubungan simbiotik, habitat.

Pengecatan Gram

Prosentasi G+C 



“Komposisi basa DNA merupakan salah satu karakter yang perlu diketahui untuk melakukan deskripsi minimal dari suatu genera dan spesies” (Lévy-Frébault & Portaels, 1992; Goodfellow& O’Donnell,1993). Seringkali, nisbah GC juga digunakan.  Jika

dua mikroba yang diduga berkerabat dekat berdasarkan kriteria fenotipiknya tidak memiliki kemiripan nilai GC, maka pada kenyataannya mereka tidaklah berkerabat dekat.

Kandungan GC  Struktur duplek DNA : G-C dan A-T  Kandungan G+C (mol% GC) beragam dalam mikroorganisme  Titik denaturasi oleh panas meningkat  OD260 meningkat.

Kesimpulan:

1. Beda kandungan G+C<5%  dalam spesies yang sama 2. Perbedaan %GC  hubungan kekerabatan jauh 3. Komposisi basa DNA  bermanfaat untuk melihat/mengukur keberagaman genetik

Peranan 16S rRNA

23S rRNA 5S rRNA 34 protein 50S subunit

70S ribosom

16S rRNA 30S subunit

21 protein

Operon Ribosomal RNA (rRNA) 16S-23S ITS

23S-5S ITS

16S rDNA

23S rDNA

1500 bp

3000 bp

5S

Inti

120 bp

Pemrosesan

Sitoplasma 16S rRNA

23S rRNA

5S rRNA

Filogenetik dalam Mikrobiologi 1.

Memahami hubungan evolusioner (= filogenik) antar organisme 

2.

Cukup berbeda daripada yang semula dipahami

Ekologi Mikroba 

Kemampuan untuk membuktikan struktur komunitas tanpa memerlukan pembiakan

Skema Penentuan Urutan Basa (sequencing) Gen 16S rRNA DNA extraction

16S rRNA gene PCR

DNA Cloning or single-strand prep

Database search

Sequencing Vector + 16S rRNA

Phylogenetic tree

Amplifikasi Gen 16S rRNA menggunakan PCR DNA Genom atau lisat sel elektroforesis Primer PCR dNTP Taq DNA polymerase

95 C, 1 min 60 C, 1 min 35 daur 72 C, 2 mins 1636 bp

Primer 9F (5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)

16S rRNA gene

Primer 1542R (5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’)

Gambar hasil elektroforesis pada gel agarosa dari gen 16S rRNA yang diamplifikasi menggunakan PCR

Urutan basa (sequence) gen 16S rRNA dari galur Chj707T 1 gtttgatcct ggctcaggat gaacgctagc ggnaggccta acacatgcaa gccgagcggt 61 atggatagct tgctatccag agagcggcgt acgggtgcgt aacacgtgtg caacctgcct 121 ttatctgggg gatagccttt cgaaaggaag attaataccc cataatatgg tgtccggcat 181 cggtcgcatt gaaagcctcg gcggatagag atgggcacgc gcaagattag atagttggcg 241 gggtaacggc ccaccaagtc gatgatcttt aggggtcctg agagggagat cccccacact 301 ggtactgaga cacggaccag actcctacgg gaggcagcag tgaggaatat tggacaatgg 361 gtggaagcct gatccagcca tcccgcgtga aggatgacgg tcctatggat tgtaaacttc 421 ttttgtacag ggataaacct gccctcgtga gggcagctga aggtactgta cgaataagca 481 ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggaggg tgcgagcgtt atccggattt 541 attgggttta aagggtccgt aggcgggcct gtaagtcagt ggtgaaatct catagcttaa 601 ctatgaaact gccattgata ctgcaggcct tgagtaaatt tgaagtggct ggaataagta 661 gtgtagcggt gaaatgcata gatattactt agaacaccga ttgcgaaggc aggtcactaa 721 gatttaactg acgctgatgg acgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta 781 gtccacgccg taaacgatgc taactcgttt ttggacttcg ggttcagaga ccaagcgaaa 841 gtgataagtt agccacctgg ggagtacgtc cgcaaggatg aaactcaaag gaattgacgg 901 gggcccgcac aagcggtgga ttatgtggtt taattcgatg atacgcgagg aaccttacca 961 agacttaaat gggaattgac agatttagaa atagatcctc cttcgggcaa ttttcaaggt 1021 gctgcatggt tgtcgtcagc tcgtgccgtg aggtgttagg ttaagtcctg caacgagcgc 1081 aacccctgcc aacagttgcc atcattcagt tggggactct gttgggactg cctacgcaag 1141 tagagaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcacggccc ttacgtcttg ggccacacac 1201 gtaatacaat ggccggtaca gagggcagct acctggtgac aggatgcgaa tctcgaaagc 1261 cggtctcagt tcggattgga gtctgcaact cgactctatg aagctggaat cgctagtaat 1321 cgcgcatcag ccatggcgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaag 1381 ccatggaagt ctggggtacc tgaagtcggt gaccgtaata ggagctgcct agggtaaaac 1441 aggtaactag ggctaagtcg taacaagggg gg

Panjang Total: 1472bp

Hasil Pembandingan terhadap Database NCBI menggunakan program BLAST

Hasil Pembandingan terhadap Database NCBI menggunakan program BLAST

100

59

Chryseobacterium gleum ATCC35910T (M58772) 98 Chryseobacterium indologenes ATCC29897T (M58773) 46 Chryseobacterium joostei LMG18212 (AJ271010) 27 Chryseobacterium proteolyticum 9670 (AB039830) 59 Chryseobacterium defluvii B2T (AJ309324) Chryseobacterium indoltheticum ATCC27950T (M58774) Chryseobacterium balustinum ATCC33487T (M58771) 98 75 95 Chryseobacterium scophthalmum LMG13028T (AJ271009) Chj707T 89 Ko2 100 Ko10 Bergeyella zoohelcum ATCC43767T (M93153) Riemerella anatipestifer ATCC11845T (U10877) 75 62 Riemerella columbina LMG11607T (AF181448) Chryseobacterium meningosepticum ATCC13253T (M58776) Empedobacter brevis ATCC14234T (M59052) 100 Weeksella virosa ATCC43766T (M93152) Ornithobacterium rhinotracheal LMG9086T (U87101) Coenonia anatina LMG14382T (Y17612) Cellulophaga lytica ATCC23178T (M62796) 100 82 Flavobacterium aquatile ATCC11947T (M62797) 98

Pohon filogenetik (cabang ChryseobacteriumBergeyellaRiemerella)

0.02

Resolusi Taksonomik (yang saat ini digunakan)

PEMONITORAN DAN PENGHITUNGAN

Pengukuran Pertumbuhan Mikroba menggunakan Pembiakan 

Plate Counts: Dengan membuat pengenceran berseri dari cuplikan

Plate Count/ Pour Plate Media agar dalam cawan Petri diinokulasi (dicampurkan dengan agar pada pour plate atau diratakan di permukaan agar pada plate count) dengan pengenceran berseri

Plate Count/ Pour Plate 

Setelah masa inkubasi, jumlah koloni yang muncul di media agar dihitung. Hanya berlaku untuk agar yang memiliki 30-300 koloni (CFUs)

Metoda Most Probable Number (MPN) Menggunakan banyak tabung  Yang dihitung adalah tabung yang menunjukkan positif dan dibandingkan dengan tabel statistik MPN 

Pengukuran Pertumbuhan Mikroba

Senyawa Organik (CH2O) + O2

CO2 + H2O + senyawa antara metabolisme + materi sel + energi (ATP)

Pengukuran Pertumbuhan Mikroba dengan Pembiakan CO2 + 2 NaOH

Na2CO3 + H2O

Pengukuran Pertumbuhan Mikroba tanpa Pembiakan ATP + D-lusiferin + O2

lusiferase

oksilusiferin + AMP + pirofosfat + CO2 + sinar (562 nm)

DETEKSI MIKROBA TANPA PEMBIAKAN

Metoda Molekular untuk Mendeteksi Mikroba Komponen dinding sel, Protein, Lipopolisakarida

Asam Nukleat

RNA LMW RNA

DNA Teknik menggunakan PCR

LMW (Low Molecular Weight) RNA Molekul RNA yang berberat molekul rendah, memiliki nilai yang tinggi untuk mempelajari keragaman dalam populasi karena karakter khususnya.

Karakter LMW RNA 

Stabil selama masa pertumbuhan sel, dan tidak tergantung komposisi media pertumbuhan.



Dimiliki oleh semua jenis sel hidup: prokaryot maupun eukaryot.



Memiliki fungsi yang sama di semua sel hidup: Untuk sintesis protein.



Diduga ada sejak awal evolusi.

LMW RNA Molekul yang mana saja?    

5S rRNA 5.8S rRNA tRNA class 1 tRNA class 2

LMW RNA PROFILING: Elektroforesis menggunakan polyacrylamide gels

PROFIL LMW RNA Kenapa bisa disebut sidik jari molekular mikroba?  Spesies prokaryot dari genus yang sama menunjukkan 5S rRNA yang identik.

 Spesies eukaryot dari genus yang sama menunjukkan kombinasi zona 5S-5.8S rRNA yang identik.

 Galur-galur dari spesies prokaryot maupun

eukaryot

menunjukkan identik

profil

yang tRNA

sama yang

METODA ANALISIS DNA Ukuran dan struktur suatu molekul DNA

DNA Plasmid

DNA Kromosom

Derajat kekerabatan antar molekul menggunakan prosedur hibridisasi Kelemahan: i. Kurang stabil di beberapa galur ii. Beberapa galur tak memiliki plasmid iii. Dapat terjadi transfer plasmid antar galur

Teknik terkait PCR

 Penentuan urutan basa DNA (sequencing) suatu gen  Profiling dari produk PCR yang dielektroforesis

Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba PROFILING DNA PLASMID  Plasmid adalah molekul asam nukleat

yang paling mudah diuji.  Molekul-molekul tersebut berperan penting

karena

membedakan

kemampuan galur mikroba.  Kemampuan galur mikroba untuk menjadi

simbion

ditentukan

oleh

atau

patogen

plasmid

yang

dimilikinya.  DNA plasmid mudah diekstrak dan dielektroforesis

menggunakan

agarosa sederhana.

gel

Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba PROFILING DNA KROMOSOM

Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Thermal Gradient Gel Electrophoresis (TGGE)

Prinsip: Berdasarkan amplifikasi zona GC berkeragaman tinggi (hypervariable) dari 16S rDNA, dan pemisahan fragmen DNA yang dihasilkannya menggunakan elektroforesis gel poliakrilamida dengan keberadaan senyawa denaturan atau suhu bergradien linier

Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Thermal Gradient Gel Electrophoresis (TGGE)

Keunggulan: dapat dipercaya, reproducible, cepat dan relatif murah Pembatas: Baru dimanfaatkan untuk prokaryot. Sidik jari tidak terkait langsung dengan informasi taksonomi Analisis perbandingan urutan DNA dengan database 16S rDNA Analisis pola hibridisasi dengan probe oligonukleotida spesifik taxon terhadap 16SrRNA

Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)

Prinsip: Berdasarkan pembentukan struktur melipat dari benang DNA untai tunggal yang tergantung urutan DNA penyusunnya. Biasanya terdapat di daerah berkeragaman tinggi dari gen 16S rRNA.

Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)

Keunggulan: Cepat dan dapat membedakan di tingkat spesies Pembatas: Sidik jari tidak dapat digunakan untuk analisis filogenetik

Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Metoda terkait PCR

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

Prinsip: Berdasarkan pola pemotongan menggunakan enzim endonuklease restriksi terhadap produk PCR. Produk PCR dihasilkan menggunakan oligonukleotida primer yang didesain untuk menempel di urutan basa DNA konsensus di berbagai gen (yang paling sering digunakan adalah gen 16S rRNA)


Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

Keunggulan: Telah digunakan baik pada prokaryot maupun eukaryot. Pembatas: Kadang-kadang tidak diperoleh pembedaan pada tingkatan taksonomik, tergantung pada zona diterapkannnya enzim endonuklease restriksi.


Length heterogeneity-PCR (LH-PCR)

Prinsip: Berdasarkan keragaman alami dari panjang gen 16SrRNA (atau gen lain). Oligonukleotida berfluoresen digunakan sebagai primer forward, bersama primer reverse yang tidak Pembatas: Tingkat berlabel, untuk mengamplifikasi pembedaan lebih rendah daerah berkeragaman tinggi dari daripada teknik T-RFLP, gen 16 rRNA. Fragmen yang karena kelompok dihasilkan dideteksi berdasarkan taksonomi yang berbeda fluoresensi yang diinduksi laser dapat menghasilkan produk dengan panjang dengan deteksi menggunakan yang sama sequencer otomatis.

Operon Ribosomal RNA (rRNA) 16S-23S ITS

23S-5S ITS

16S rDNA

23S rDNA

1500 bp

3000 bp

5S

Inti

120 bp

Pemrosesan

Sitoplasma 16S rRNA

23S rRNA

5S rRNA


Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA)

Prinsip: Berdasarkan kespesifikan DNA ribosom pada spesies bakteri. Fragmen yang teramplifikasi pada PCR kemudian dielektroforesis. Pola yang diperoleh dianalisis secara matematis.

Tingkat pembedaan pada aras spesies berguna untuk dimanfaatkan pada studi filogenetik dan ekologis


rDNA Internal Spacer Analysis (RISA)

Prinsip: Berdasarkan perbedaan panjang daerah antara (spacer) gen 16S dan 23S rRNA yang teramplifikasi. Spacer ini sangat beragam dalam ukuran dan urutan basanya. Keunggulan: Teknik yang sangat baik untuk mempelajari keragaman populasi, dan dapat membedakan hingga aras spesies. Dapat digunakan untuk karakterisasi galur karena ada perbedaan sangat besar antar galur


Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

Prinsip: Berdasarkan pola yang terbentuk dari elektroforesis langsung hasil PCR menggunakan satu primer pendek dan suhu annealing rendah, yang menghasilkan amplifikasi acak.


Two-primers RAPD (TP-RAPD)

Prinsip: Berdasarkan hasil amplifikasi 16S rDNA menggunakan dua primer universal pada konsentrasi tinggi (10 kali) dengan suhu annealing 50-55ºC

Teknik ini sangat bermanfaat untuk mempelajari taksonomi dan keragaman dengan pembedaan hingga aras spesies pada bakteri dan jamur


Repetitive element sequence-based PCR (rep-PCR)

Prinsip: Berdasarkan pola elektroforesisi langsung hasil PCR menggunakan primer untuk mengamplifikasi urutan DNA pendek berulang (short repetitive sequence) yang banyak ditemukan di jasad prokaryot. Keunggulan: These techniques show intraspecific variations among microorganisms, and have resolution at species level, so their usefulness is very similar to that of RAPD

DNA Fingerprinting of Microorganism Populations PCR-based methods

Repetitive element sequence-based PCR

Principle: Depending on the number of primers used, there are different techniques based on repetitive sequences: 1 primer:

BOX-PCR

2 primers:

REP-PCR

ERIC-PCR

ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN TAKSONOMI MIKROBA

Recommend Documents