ISOLASI DAN UJI RESISTENSI MERKURI (Hg) PADA BAKTERI DARI PANTAI LOSARI MAKASSAR Isolation and Testing of Mercury (Hg) Resistance of Bacteria from The Beach of Losari in Makassar Heriadi 1), Fahruddin 2), Nur Haedar 3) 1) Mahasiswa Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, Makassar. 2, 3) Dosen Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Hasanuddin, Makassar. E-mail :
[email protected] ABSTRAK Telah dilakukan penelitian “Isolasi Dan Uji Resistensi Merkuri (Hg) Pada Bakteri Dari Pantai Losari Makassar”. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi bakteri resisten merkuri, mengetahui kemampuan resistensinya dan karakteristik bakteri resisten merkuri yang berasal dari pantai Losari Makassar. Uji resistensi isolat bakteri terhadap beberapa konsentrasi merkuri dilakukan dengan metode difusi agar. Hasil isolasi diperoleh 5 isolat bakteri resisten merkuri. Uji resistensi isolat bakteri terhadap beberapa konsentrasi merkuri menunjukkan, 2 isolat termasuk bakteri resisten pada konsentrasi 150 ppm yaitu IRm2 dan IRm5 dengan diameter hambatan tidak melebihi ambang batas resistensi yaitu ≤ 1 mm, sedangkan 3 isolat termasuk bakteri yang sensitif pada konsentrasi 150 ppm yaitu IRm1, IRm3, dan IRm4 dengan diameter hambatan > 1 mm. Hasil karakterisasi menunjukkan 4 isolat tergolong genus Bacillus yaitu IRm1, IRm2, IRm3, dan IRm4 dan 1 isolat tergolong genus Pseudomonas yaitu IRm5. Kata kunci : Merkuri, Bakteri resisten, Uji Resistensi, Gen Mer, Pantai Losari ABSTRACT A study about “Isolation and Testing of Mercury (Hg) Resistance of Bacteria from The Beach of Losari in Makassar” has been done. The principal aim of this study was to isolate mercury resistant bacteria, knowing the resistance of the bacteria itself, and also character of mercury resistant bacteria from the Beach of Losari in Makassar. The resistance testing of the bacterial isolates to some variant concentrations of mercury was conducted by agar diffusion method. The result of isolates derived 5 isolates of mercury resistant bacteria. The testing of resistance of the isolates to some concentrations of mercury showed that 2 isolates belonged to resistant bacteria at concentration 150 ppm, they are IRm2 and IRm5 with the diameter of resistance was under the standard of resistance ≤ 1 mm, whilst 3 isolates were appertained to the bacteria which were sensitive to concentration 150 ppm these bacterias are IRm1, IRm3, and IRm 4 and their diameter of resistance were > 1mm. The result of characterization conducted that 4 isolates were grouped into Bacillus genus they were IRm1, IRm2, IRm3, and IRm4 while 1 isolate were categorized as Pseudomonas genus which was IRm5. Keywords : Mercury, Resistant Bacteria, Testing Resistance, Gen Mer, Losari Beach PENDAHULUAN Perkembangan industri di daerah Makassar dan sekitarnya saat ini cukup pesat. Peningkatan jumlah industri ini akan selalu diikuti oleh pertambahan jumlah limbah, baik berupa limbah padat, cair, maupun gas. Limbah tersebut mengandung bahan kimia yang beracun dan berbahaya (B3) dan masuk ke Pantai Losari melalui aliran sungai yang bermuara ke perairan ini dan menyebabkan terjadinya pencemaran lingkungan. Pencemaran lingkungan merupakan masalah yang sangat serius dan harus segera mungkin ditangani. Salah satu yang menjadi pusat perhatian masyarakat luas saat ini adalah
pencemaran yang diakibatkan oleh logam berat, karena dapat menimbulkan bahaya bagi kesehatan, baik pada manusia, hewan, tanaman maupun lingkungan (Widowati, et al., 2008). Merkuri (Hg) merupakan salah satu unsur logam berat yang paling berbahaya dan beracun yang dapat membahayakan bagi kehidupan baik itu bagi manusia maupun mahluk hidup lainnya. Dampak yang timbul dari akibat kontaminasi merkuri bisa menyebabkan kematian (Lasut, 2011). Sumber pencemaran merkuri dapat disebabkan oleh proses geologi dan biologi. Senyawa merkuri yang terdapat pada batu dan
Page 1
tanah dikikis oleh hujan dan angin. Meskipun demikian, hal ini tidak sebanding dengan pencemaran merkuri yang disebabkan oleh aktivitas manusia, seperti pembakaran batubara, beberapa jenis produk minyak bumi, penggunaan fungisida merkuri, katalisator merkuri dan penambangan emas yang menggunakan merkuri untuk ekstraksi partikel emas (Nofiani dan Gusrizal, 2004). Di Sulawesi Selatan khususnya kota Makassar, penggunaan merkuri oleh para pengrajin emas di kawasan Pantai Losari sebagai salah satu sumber meningkatnya pencemaran merkuri. Penggunaan merkuri pada emas, terutama pada saat dimasak untuk memudahkan proses pembentukan emas. Kemudian limbah merkuri hasil pengolahan emas tersebut langsung dibuang melalui goronggorong, dan mengalir ke Pantai Losari, sehingga kadar merkuri bercampur dengan air laut. Jejeran toko emas saat ini berlokasi bersebelahan dengan Pantai Losari sudah memasuki tahap yang mengkhawatirkan, khususnya warga yang berdomisili di sekitar pantai dan mengkomsumsi ikan yang ditangkap (Republika, 2008). Pelepasan logam berat ke lingkungan dapat membahayakan ekosistem dan menyebabkan bahaya serius pada kesehatan manusia. Merkuri merupakan salah satu logam berat yang paling berbahaya dan berada di lingkungan dalam berbagai bentuk. Senyawa merkuri dalam bentuk Hg(II) dapat terikat pada residu sistein protein manusia sehingga protein akan kehilangan aktivitasnya. Selain Hg(II), senyawa merkuri yang paling berbahaya bagi kesehatan manusia adalah senyawa merkuri organik, khususnya metil merkuri dan fenil merkuri. Senyawa ini sangat reaktif dan mempunyai mobilitas tinggi dibandingkan Hg(0) dan Hg(II), juga dapat menyerang saraf manusia melalui peredaran darah (Rasmussen et al., 2008). Pada dasarnya logam berat seperti merkuri dapat disisihkan dengan berbagai metode, yaitu fisika, kimia, dan biologi. Metode penyisihan yang paling banyak diaplikasikan selama ini adalah metode kimia dan fisika, namun seiring dengan perkembangan bioteknologi pengolahan limbah, pencemaran logam berat dapat diatasi dengan cara biologi dengan memanfaatkan jasad hidup, terutama mikroorganisme (Fahruddin, 2010). Salah satu usaha untuk detoksifikasi merkuri dapat menggunakan mikroorgansime resisten merkuri, misalnya bakteri resisten merkuri. Detoksifikasi merkuri oleh bakteri ini terjadi karena memiliki gen mer operon untuk bertahan pada lingkungan yang mengandung merkuri (Silver and Phung 1998). Bakteri ini dapat mengubah Hg2+ menjadi Hg0 inert dan volatile, dan dapat ditemukan pada bakteri gram positif maupun gram negatif (Fahruddin, 2010). Beberapa penelitian telah mengungkap bahwa mikroorganisme pada daerah tercemar
merkuri berperan utama dalam detoksifikasi merkuri dan merupakan sumber isolat bakteri resisten merkuri. Oleh karena itu maka perlu dilakukan penelitian untuk mendapat isolat bakteri resisten merkuri yang berasal dari pantai Losari Makassar. METODE PENELITIAN Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan petri (Pyrex), Erlenmeyer (Pyrex), tabung reaksi (Pyrex), gelas ukur, gelas kimia, batang pengaduk, gelas objek, pinset, sendok tanduk, penjepit tabung, rak tabung, spoit, mikroskop (Nikon), neraca (OHAUS), inkubator (Heraeus), oven (Heraeus), autoklaf (American), Hot plate, Vortex, LAF (Laminar Air Flow), ose lurus, ose bulat, bunsen, stirrer magnetic dan jangka sorong. Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel tanah yang terkontaminasi limbah merkuri, aquades steril, alkohol 70 %, Metil Merkuri (CH3Hg), medium NA (Nutrient Agar) (Difco), medium NB (Nutrient Broth) (Difco), medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar) (MERCK), medium SIM (Sulfid Indol Motility) (MERCK), medium Simmon’s Citrate Agar (Difco), medium MR-VP (Methyl Red-Voges Proskauer) (Peptone, Glukosa, Buffer fosfat), medium Urea (Metode Christensen) (Peptone, Phenol Red, NaCl, Agaragar, KH2PO4), medium Nitrat Agar (Agar-agar, Peptone, Beef Extract, KNO3 ) methyl-red, KOH 40%, α-naftol, reagen kovac (pereaksi indol), reagen H2O2 (Hidrogen feroksida), reagen asam sulfanilat, α-naphtylamine, pewarnaan gram (kristal violet, iodine mordant, alkohol asam, safranin), pewarnaan endospora (Malachite Green dan Safranin), Paper Disc, aluminium foil, kapas, kertas label, dan cling wrap. Pengambilan Sampel Sampel yang diambil adalah sedimen pada saluran pembuangan di daerah pantai Losari, dengan pertimbangan bahwa sedimen tersebut memiliki kandungan merkuri yang tinggi akibat limbah merkuri dari pengrajin emas yang letaknya dekat dari pantai losari. Sampel yang diambil dimasukkan ke dalam botol yang telah disterilkan, kemudian dimasukkan ke dalam coolbox dan selanjutnya dibawa ke laboratorium untuk dilakukan pengujian. Isolasi Bakteri Resisten Merkuri Bakteri diisolasi melalui teknik kultur diperkaya, dimana sampel ditimbang sebanyak 1 gr dan diencerkan dengan aquades steril dari 10 -1 – 10-6 kemudian sampel pengenceran diambil 1 mL selanjutnya ditumbuhkan pada media Nutrient
Page 2
Broth (NB) yang ditambah 10 ppm metil merkuri (CH3Hg) dan diinkubasi di atas shaker selama 72 jam. Setelah terjadi pertumbuhan pada media kultur, selanjutnya bakteri diisolasi kembali dengan teknik pengenceran bertingkat dengan cara kultur bakteri diencerkan menggunakan aquades steril dari 10-1 – 10-3 kemudian kultur hasil pengenceran diambil sebanyak 1 mL dan diinokulasikan ke dalam cawan petri, kemudian media Nutrient Agar (NA) yang telah ditambah dengan CH3Hg 10 ppm dituang ke dalam cawan petri yang berisi kultur bakteri. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 72 jam. Koloni bakteri yang tumbuh merupakan bakteri yang resisten terhadap merkuri. Tahap Pemurnian Bakteri Tahap pemurnian dimulai dengan memilih koloni-koloni yang berbeda dengan menggunakan jarum ose bulat, kemudian diinokulasikan pada permukaan medium NA (Nutrient Agar) yang ditambah dengan 10 ppm CH3Hg dengan metode gores. Kemudian diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 37 °C selama ± 72 jam. Tahapan pemurnian dapat dilakukan 2-3 kali, untuk lebih meyakinkan bahwa koloni yang terbentuk benarbenar murni. Selanjutnya setiap koloni yang terbentuk setelah pemurnian, kemudian diinokulasi pada medium NA miring yang ditambah dengan 10 ppm CH3Hg untuk persiapan pengujian selanjutnya. Uji Resistensi Isolat Bakteri Pada Beberapa Konsentrasi Merkuri 1. Pembuatan Larutan Uji Sebanyak 0,006 gr CH3Hg ditimbang dan dilarutkan dalam 100 mL aquades, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 60 ppm. Selanjutnya dibuat larutan uji dengan konsentrasi 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 dan 150 ppm. 2.
Penyiapan Suspensi Bakteri Pembuatan suspensi bakteri dilakukan dengan cara mengambil 3-4 ose isolat bakteri dari stok kemudian ditumbuhkan pada medium NB (Nutrient Broth) yang ditambah 10 ppm CH3Hg kemudian diinkubasi di atas shaker selama 72 jam. 3.
Pengujian Resistensi Isolat Bakteri Pada Beberapa Konsentrasi Merkuri Pengujian resistensi isolat bakteri pada beberapa konsentrasi merkuri dilakukan dengan metode difusi agar, dengan cara mengambil sebanyak 0,5 mL suspensi bakteri dan diinokulasikan pada media Nutrient Agar lalu dihomogenkan supaya suspensi bakteri dan media tercampur secara merata, kemudian dituang ke dalam cawan petri dan didiamkan sampai memadat. Selanjutnya paper disc direndam selama 15 menit dalam larutan uji yang telah dibuat dengan konsentrasi yang berbeda, kemudian diletakkan di
atas media menggunakan pinset dengan jarak 2 cm antara paper disc. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam. Selanjutnya dilakukan pengukuran diameter hambatan yang terbentuk di sekitar paper disc dengan menggunakan jangka sorong (Dutka da Bitton, 1989). Zona hambat yang diukur adalah jarak dari tepi zona hingga tepi zona lainnya. Apabila ukuran zona hambat yang terbentuk > 1 mm maka bakteri tersebut tergolong bakteri sensitif, sebaliknya bila ukuran zona hambat ≤ 1 mm tergolong bakteri yang resisten (Burnley, 2000). Pengamatan Morfologi Pada pengamatan morfologi setiap koloni tunggal yang terbentuk setelah pemurnian kemudian diamati. Pengamatan yang dilakukan meliputi bentuk koloni, warna koloni, tepi koloni, permukaan koloni, serta morfologi sel dan sifat gram bakteri serta adanya endospora yang dilakukan untuk mengelompokkan isolat yang diperoleh. Pengecatan Gram Pengamatan morfologi sel dilakukan dengan teknik pewarnaan gram. Pertama-tama ulasan bakteri dibuat pada gelas objek dan dilakukan fiksasi. Sebanyak 2-3 tetes cat A (Kristal violet) diteteskan pada koloni bakteri, diamkan selama 60 detik. Kemudian preparat dicuci menggunakan air mengalir lalu dikeringanginkan. Selanjutnya sebanyak 2-3 tetes cat B (iodine mordant) diteteskan di atas preparat dan dibiarkan selama 60 detik. Preparat dicuci dengan air mengalir lalu dikeringanginkan. Preparat kemudian ditetesi 2-3 tetes larutan cat C (alkohol asam) dan dibiarkan selama 30 detik lalu dicuci kembali dan dikeringanginkan. Selanjutnya preparat ditetesi dengan larutan cat D (safranin) sebanyak 2-3 tetes dan didiamkan selama 60 detik, lalu dicuci dan dikeringanginkan. Setelah itu diamati dibawah mikroskop. Pengecatan Endospora Pengecatan endospora digunakan untuk membedakan antara endospora dengan sel vegetatif pada bakteri. Pertama-tama bakteri dari biakan murni diambil sebanyak satu ose (ose bulat) kemudian diratakan pada kaca prepatat steril, selanjutnya ditetesi dengan malachite green 5% dan diletakkan pada water bath yang sudah dipanaskan hingga 60-70 ºC, selama 10 menit. Setelah 10 menit, bilas preparat dengan air mengalir. Selanjutnya preparat ditetesi dengan safranin dan diamkan selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air mengalir. Kaca obyek ditiriskan dan sisa air diserap dengan kertas serap, kemudian diamati di bawah mikroskop. Warna spora adalah hijau atau tampak refraktil.
Page 3
Uji Biokimia Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar) Isolat bakteri diambil sebanyak 1 ose (ose lurus) dari masing-masing stok kultur kemudian diinokulasikan dengan cara ditusukkan pada bagian butt medium TSIA dan digores pada bagian slant. Selanjutnya diinkubasi selama 2-3x24 jam pada suhu 37 °C. Perubahan yang diamati setelah inkubasi adalah warna medium menjadi kuning menandakan asam, warna merah menandakan medium menjadi basa, warna menjadi hitam menandakan terbentuknya H2S dan bila medium terangkat menandakan bahwa mikroba tersebut mampu untuk memproduksi gas. Uji MR (Methyl Red) Sebanyak 1 ose (ose bulat) isolat bakteri diambil dari stok kultur dan diinokulasikan pada medium MR-VP cair dalam tabung reaksi. Selanjutnya diinkubasi selama 5x24 jam pada suhu 37 °C. Setelah selesai diinkubasi sebanyak 5 tetes methyl-red ditambahkan pada medium lalu dikocok selama 30 detik. Hasil positif apabila terbentuk kompleks warna merah yang menandakan bahwa mikroba tersebut menghasilkan asam. Uji VP (Voges Proskauer) Sebanyak 1 ose (ose bulat) isolat bakteri diambil dari stok kultur dan diinokulasikan pada medium MR-VP cair dalam tabung reaksi. Selanjutnya diinkubasi selama 3x24 jam pada suhu 37 °C. Setelah selesai diinkubasi medium ditambahkan 0,2 mL KOH 40 % dan 0,6 mL alfanaftol lalu dikocok selama 30 detik. Hasil positif apabila medium berubah warna lembayung. Uji Motilitas dan Produksi Senyawa Indol Sebanyak 1 ose (ose lurus) isolat dari stok kultur lalu diinokulasikan dengan cara ditusuk pada medium SIM tegak, lalu diinkubasi pada suhu 37OC selama 2x 24 jam. Hasil positif (motil) apabila terdapat rambatan-rambatan di sekitar bekas tusukan jarum pada medium dan hasil negatif (non motil) bila tidak terdapat rambatanrambatan disekitan bekas tusukan jarum ose pada medium. Ke dalam masing-masing isolat ditambahkan beberapa tetes senyawa kovacks, untuk melihatproduksi senyawa indol. Hasil positif ditandai dengan perubahan warna menjadi merah (cincin merah). Uji Katalase Sebanyak 1 ose (ose bulat) isolat bakteri diambil dari stok kultur kemudian disuspensikan pada larutan H2O2. Hasil positif apabila terbentuk gelembung gas, dan hasil negatif apabila tidak terbentuk gelembung gas.
Uji Urease Sebanyak 1 ose (ose bulat) isolat bakteri diambil dari stok kultur dan diinokulasikan dengan cara digores pada medium Christensens Urea miring, lalu diinkubasi pada suhu 37 °C selama 45x24 jam. Warna merah berarti reaksi positif. Uji Sitrat Sebanyak 1 ose (ose bulat) isolat bakteri diambil dari stok kultur dan diinokulasikan dengan cara digores pada medium Simmon’s Citrat Agar dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 2x24 jam. Warna biru menunjukkan reaksi positif dan warna hijau menunjukkan reaksi negatif. Uji Nitrat Sebanyak 1 ose (ose lurus) isolat bakteri diambil dari stok kultur dan diinokulasikan dengan cara ditusuk pada medium Nitrate Agar tegak, kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 1x24 jam. Hasil positif bakteri mereduksi nitrit ditandai dengan perubahan warna menjadi merah atau pink setelah penambahan beberapa tetes reagen asam sulfanilat dan α-naphtylamine. HASIL DAN PEMBAHASAN Bakteri resisten merkuri diisolasi dari sampel tanah yang terkontaminasi limbah merkuri di kawasan pantai losari. Isolasi bakteri dilakukan melalui teknik kultur diperkaya dengan menggunakan media Nutrient Broth (NB) yang ditambah 10 ppm metil merkuri (CH3Hg) dan diinkubasi selama 72 jam. Setelah terjadi pertumbuhan pada media kultur, selanjutnya bakteri diisolasi kembali dengan teknik pengenceran bertingkat dari 10-1 – 10-3 dengan metode tuang menggunakan media Nutrient Agar (NA) yang ditambahkan 10 ppm metil merkuri dan diinkubasi selama 72 jam. Setelah diinkubasi diperoleh koloni bakteri yang tumbuh pada media Nutrient Agar (NA) seperti yang terlihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Pertumbuhan koloni bakteri resisten merkuri pada media NA yang ditambah CH3Hg
Page 4
Isolat bakteri yang berhasil diisolasi dan dimurnikan selanjutnya diamati morfologi koloninya dengan berdasarkan pada bentuk koloni, warna, tepi dan elevasinya. Tabel 1. Karakteristik morfologi koloni isolat bakteri resisten merkuri
Bakteri yang diperoleh dari kultur murni selanjurnya dilakukan pengamatan mikroskopis melalui pengecatan gram dengan melihat bentuk sel vegetatif, sifat gram, serta melihat ada tidaknya endospora. Tabel 2. Karakteristik isolat berdasarkan pengecatan gram dan pengecatan endospora
Pengecatan gram termasuk pengecatan differensial (untuk membedakan) bakteri yang bersifat gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif pada pengamatan mikroskopis sel-sel bakteri ini tampak berwarna biru ungu (violet). Uji Resistensi Isolat Bakteri Pada Beberapa Konsentrasi Merkuri Untuk mengetahui kemampuan resistensi isolat bakteri terhadap logam berat merkuri, maka dilakukan uji resistensi isolat bakteri pada beberapa konsentrasi merkuri yaitu 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, dan 150 ppm. Uji resistensi ini dilakukan dengan metode difusi agar.
Sedangkan bakteri gram negatif, pada pengamatan mikroskopis sel-sel bakteri ini tampak berwarna merah (Dwyana dan Gobel, 2012). Berdasarkan hasil pengamatan mikroskopis yang dilakukan dengan pengecatan gram, 4 isolat bakteri memiliki bentuk batang (Basil) dengan sifat Gram positif, yaitu IRm1, IRm2, IRm3, dan IRm4 sedangkan isolat IRm5 juga memiliki bentuk batang (Basil) akan tetapi dengan sifat Gram negatif.
Gambar 2. Pengecatan Gram A. Isolat (IRm1) bersifat Gram Positif B. Isolat (IRm5) bersifat Gram Negatif Hasil pengecatan gram pada Tabel 2, kelima isolat bakteri yang didapatkan yaitu berbentuk basil (batang), oleh karena itu dilakukan pewarnaan spora. Pewarnaan spora dilakukan untuk melihat adanya endospora pada bakteri. Endospora hanya terbentuk dalam lingkungan yang tidak menguntungkan, seperti kekurangan nutrisi. Berdasarkan hasil pewarnaan spora pada Tabel 2, ada 4 isolat yang memiliki endospora setelah diamati di bawah mikroskop yaitu IRm1, IRm2, IRm3, dan IRm4, yang ditandai dengan warna spora adalah hijau atau tampak refraktil, sedangkan isolat IRm5 tidak nampak adanya endospora.
Gambar 3. Pengecatan Endospora
Tingkat resistensi isolat bakteri terhadap merkuri diperoleh dengan mengukur diameter hambatan di sekitar paper disc yang mengandung merkuri. Hasil pengukuran diameter hambatan dapat dilihat pada Tabel 3.
Page 5
Tabel 3. Pengukuran Diameter Hambatan (mm) Beberapa Konsentrasi Merkuri pada Uji Resistensi Isolat Bakteri Resisten Merkuri Kode Isolat IRm1 IRm2 IRm3 IRm4 IRm5
60 0 0 0 0 0
70 0 0 0 0 0
Konsentrasi Metil Merkuri (CH3Hg) (ppm) 80 90 100 110 120 130 0 0 0 0 0.3 0.5 0 0 0 0.3 0.5 0.5 0 0 0.2 0.6 0.8 1.2 0 0.1 0.4 0.7 0.9 1.1 0 0 0 0.1 0.1 0.3
Hasil pengukuran diameter hambatan beberapa konsentrasi merkuri pada uji resistensi isolat bakteri menunjukkan isolat IRm1 dapat tumbuh sampai konsentrasi 110 ppm yang ditandai dengan tidak adanya diameter hambatan disekitar paper disc. Namun pada konsentrasi 120 sampai 150 ppm pertumbuhan bakteri mulai terhambat dengan adanya diameter hambatan disekitar Paper disc, dan pada konsentrasi 150 ppm luas diameter hambatan yang terbentuk telah melewati ambang batas resistensi yaitu ≤ 1 mm. Uji resistensi untuk isolat IRm2 dan IRm5, menunjukkan bakteri dapat tumbuh sampai konsentrasi 100 ppm, karena pada konsentrasi 110 sampai 150 ppm pertumbuhan bakteri mulai terhambat, akan tetapi luas diameter hambatan yang dibentuk oleh setiap konsentrasi merkuri pada kedua isolat ini tidak melewati ambang batas resistensi. Untuk uji resistensi isolat IRm3 menunjukkan bakteri dapat tumbuh sampai konsentrasi 90 ppm, karena pada konsentrasi 100 sampai 150 ppm pertumbuhan bakteri mulai terhambat, dan pada konsentrasi 130 ppm luas diameter hambatan yang terbentuk telah melewati ambang batas resistensi. Sedangkan untuk uji resistensi isolat IRm4 menunjukkan pertumbuhan bakteri hanya sampai pada konsentrasi 80 ppm, pada konsentrasi 90 sampai 150 ppm pertumbuhan bakteri mulai terhambat, dan diameter hambatannya telah melewati ambang resistensi pada konsentrasi 130 ppm. Hasil uji resistensi isolat IRm4 dengan metode difusi agar dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4. Uji resistensi isolat IRm4 pada beberapa konsentrasi merkuri Berdasarkan hasil uji resistensi untuk kelima isolat dengan melihat hasil pengukuran diameter hambatan dari setiap konsentrasi merkuri (Tabel 3), maka dapat dikatakan bahwa isolat IRm2 dan IRm5 termasuk bakteri yang resisten, karena
140 0.9 0.6 1.4 1.4 0.4
150 1.2 0.9 1.4 1.6 0.7
pada konsentrasi 150 ppm luas diameter hambatan yang terbentuk tidak melebihi nilai ambang resistensi yaitu ≤ 1 mm, sementara 3 isolat yang lainnya yaitu IRm1, IRm3, dan IRm4 termasuk bakteri yang sensitif karena pada konsentrasi 150 ppm luas diameter hambatan yang terbentuk > 1 mm. Menurut Burnley (2000), suatu bakteri dikatakan resisten terhadap logam berat khususnya merkuri jika diuji resistensinya dengan metode difusi agar dan terbentuk zona hambatan sebesar ≤ 1 mm, maka bakteri tersebut dapat digolongkan bakteri resisten merkuri (BRM). Hasil pengukuran diameter hambatan dari setiap konsentrasi merkuri pada kelima isolat bakteri memiliki luas yang berbeda, semakin tinggi konsentrasi merkuri maka semakin luas diameter hambatan yang akan terbentuk, hal ini dikarenakan setiap bakteri memiliki mekanisme respon yang berbeda terhadap logam berat merkuri. Menurut Smith et al., (1998), ada tiga mekanisme respon bakteri tehadap stres merkuri. Pertama, menghambat metabolisme sel sehingga pertumbuhan sel akan terhambat atau mati. Kedua, menginduksi sistem operon resisten merkuri untuk bekerja sehingga sel tetap hidup akan tetapi dalam kondisi stress. Ketiga, adanya plasmid yang mengandung gen resisten merkuri yang masuk ke dalam sel. Bakteri yang resisten terhadap merkuri mempunyai suatu mekanisme untuk mengatasi cekaman merkuri dengan adanya gen resisten merkuri yang disebut gen mer-operon yang terdiri dari gen metaregulator (merR), gen transpor merkuri (merT, merP, merC), gen merkuri reduktase (merA) dan gen organomerkuri liase (merB) (Chien, et al., 2010). Gen merB akan mengkatalisis pemutusan ikatan Me-Hg menghasilkan senyawa organik dan ion Hg2+, ion Hg2+ akan terikat pada merC atau merT. Sedangkan Hg2+ di luar lingkungan bakteri akan masuk ke periplasma dengan pasangan residu sistein merP. Kemudian merP mentransfer Hg2+ ke residu sistein merT atau merC. Selanjutnya ion Hg2+ menyeberang membran sitoplasma melalui proses reaksi pertukaran ligan menuju NADPH yang bergantung pada merkuri reduktase (gen merA). Merkuri reduktase memberikan 2 elektronnya kepada NADPH sehingga Hg2+ berubah menjadi Hg0 yang bersifat volatil tanpa menghasilkan energi
Page 6
untuk bakteri tersebut, selanjutnya Hg0 dikeluarkan dari sel (Brown, et al., 2002). Selain dengan adanya gen mer-Operon, kemampuan bakteri untuk mereduksi logam berat juga dipengaruhi oleh jenis bakteri. Bakteri gram negatif mengikat kurang lebih sepersepuluh dari jumlah logam berat yang terikat pada bakteri gram positif (Hughes dan Poole, 1989). Bakteri Gram
negatif menunjukkan toleransi terhadap logam yang lebih besar dibandingkan Gram positif karena memiliki struktur dinding sel yang lebih kompleks yang mampu mengikat dan mengimobilisasi ion logam termasuk Hg2+. Ahmad et al., (2005), mengemukakan bahwa kemampuan bakteri menghasilkan polisakarida ekstraseluler dapat melindungi sel dari pengaruh toksik logam berat.
Karakterisasi Bakteri dengan Uji Biokimia Tabel 4. Karakteristik isolat hasil uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar), MR-VP (Methyl Red- Voges Proskauer), motilitas, indol, katalase, urea, sitrat,dan nitrat Kode Isolat IRm1 IRm2 IRm3 IRm4 IRm5
Slant Merah Merah Merah Merah Merah
Uji TSIA Butt Gas Kuning Kuning Kuning Kuning Kuning -
H2S -
Untuk mengetahui kemampuan isolat dalam memfermentasi karbohidrat dilakukan uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang merupakan uji biokimiawi untuk mengetahui kemampuan mikroba dalam memfermentasi 3 macam gula (glukosa, sukrosa, dan laktosa), indikator merah, dan ferosulfat yang terkandung dalam medium (Lay, 1994), serta produksi gas dari glukosa, dan produksi hidrogen sulfida (H2S). Berdasarkan uji TSIA didapatkan hasil positif untuk ke-5 isolat. Sebagaimana yang terlihat pada tabel 4, semua isolat mampu memfermentasi glukosa yang terdapat pada medium TSIA sehingga tampak pada bagian butt media berubah warna menjadi kuning. Akan tetapi semua isolat tidak dapat memfermentasi sukrosa dan laktosa sehingga media TSIA pada bagian slantnya masih berwarna merah. Menurut Cappucino dan Sherman (2001), medium TSIA juga mengandung substrat untuk produksi gas dan H2S. Berdasarkan hasil pengamatan dari uji TSIA tidak ditemukan medium yang terangkat atau pecah dan tidak ada isolat yang dapat menghasilkan gas H2S yang ditandai dengan tidak terbentuknya warna hitam pada dasar medium. Uji MR (Methyl Red) digunakan untuk menentukan adanya produk asam campuran dari fermentasi glukosa melalui jalur fermentasi asam campuran berupa asam laktat, asam asetat, asam format, dan asam suksinat, yang menurut Hadioetomo (1990), akumulasi dari asam-asam ini akan menurunkan pH menjadi 5 atau kurang, maka ketika ditambahkan indikator metil red pada medium biakan diakhir pengamatan, maka medium akan berubah menjadi merah yang menandakan bahwa mikroorganisme tersebut memproduksi asam campuran.
M R + + + -
V P + + + -
Mot
Indol
Kat
Urea
Sit
Nit
-
-
+ + + + +
-
+ + +
+ + + +
Berdasarkan hasil uji MR (Methyl Red), menunjukkan 3 isolat yang positif yaitu IRm1, IRm2, dan IRm4 ditandai dengan perubahan warna media menjadi kemerah-merahan. Sedangkan 2 isolat hasilnya negatif yaitu IRm3 dan IRm5 ditandai dengan perubahan warna medium yang menjadi kuning setelah penambahan reagen methyl red. Uji VP (Voges Proskauer) merupakan uji tidak langsung untuk mengetahui adanya 2,3butanadiol karena dalam uji ini yang terdeteksi adalah pembentukan asetoin. Namun karena asetoin merupakan senyawa awal dalam pembentukan 2,3-butanadiol dan selalu diperoleh secara serentak, sehingga uji VP dapat digunakan untuk menentukan adanya 2,3-butanadiol (Lay, 1994). Berdasarkan hasil uji VP (Voges Proskauer), menunjukkan 3 isolat yang positif yaitu IRm1, IRm2, dan IRm4 ditandai dengan perubahan warna media menjadi kemerah-merahan yang berarti bakteri dapat menfermentasi karbohidrat menjadi 2,3-butanadiol sebagai produk utama. Sedangkan 2 isolat hasilnya negatif yaitu IRm3 dan IRm5 ditandai dengan perubahan warna medium yang menjadi kuning setelah penambahan α-naftol dan KOH 40%. Uji motilitas digunakan untuk mengetahui bakteri bersifat motil atau non motil. Menurut Singleton (1992), bahwa motilitas bakteri disebabakan oleh perpindahan (taksis) karena adanya rangsangan dari fartor lingkungan tertentu. Pada gerak kemotaksis, bakteri bereaksi dengan adanya senyawa kimia tertentu sehingga bakteri akan mendekati sumber rangsangan. Hasil uji motilitas dari ke-5 isolat yaitu bersifat nonmotil. Hal ini ditandai dengan tidak
Page 7
terlihatnya rambatan yang menyebar disekitar tusukan (inokulasi) pada medium. Uji indol merupakan uji untuk melihat kemampuan bakteri menggunakan asam amino triptofan dalam memproduksi indol. Mikroba yang menggunakan asam amino triptofan sebagai sumber energi, apabila dihiidrolisis oleh enzim triptofamase akan menghasilkan indol. Berdasarkan hasil pengamatan pada uji indol, tidak ditemukan isolat bakteri yang dapat menghasilkan indol. Hal ini terlihat saat penambahan reagen Kovach tidak terbentuk cincin warna merah. Uji katalase merupakan uji untuk mengidentifikasi mikroba yang mampu menghasilkan enzim katalase, yang akan digunakan untuk memecah hidrogen peroksida yang terbentuk dari proses respirasi aerob dan bersifat toksik terhadap bakteri, menjadi dihidrogen oksida (H2O) dan oksigen (O2). Hasil uji katalase terhadap ke-5 isolat menunjukkan hasil positif untuk semua isolat, yang ditandai dengan adanya gelembung gas pada reagen H2O2 yang telah disuspensikan dengan isolat bakteri. Uji urease digunakan untuk melihat bakteri yang mampu memproduksi enzim urease. Beberapa mikroorganisme mampu menghasilkan enzim urease yang menguraikan mikromolekul urea ((NH2)2CO2) menjadi karbondioksida (CO2) dan ammonia (NH3). Amonia yang dihasilkan akan meningkatkan pH media sehingga akan berada pada suasana basa diikuti dengan terjadi perubahan media dari orange menjadi merah. Hasil uji urease menunjukkan bahwa ke-5 isolat bersifat negatif, ditandai dengan media yang tetap berwarna kuning. Uji sitrat digunakan untuk mengetahui kemampuan bakteri menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon (Duncan, 2005). Hasil positif ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan bakteri dan terjadinya perubahan warna media dari hijau menjadi biru yang disebabkan oleh peningkatan pH media di atas 7,6 karena adanya ammonia yang dihasilkan yang berasal dari monoammonium phosphate yang terdapat pada media. Berdasarkan hasil uji sitrat, menunjukkan 3 isolat yang bersifat positif yaitu IRm2, IRm3, dan IRm5 yang ditandai dengan perubahan warna media yang berwarna hijau menjadi biru. Sedangkan 2 isolat hasilnya negatif yaitu IRm1 dan IRm4 yang ditandai dengan media tetap berwarna hijau. Uji reduksi nitrat bertujuan untuk mengetahui kemampuan organisme dalam mereduksi nitrat, dimana kemampuan mereduksi nitrat menurut Lay (1994), dapat digunakan sebagai ciri identifikasi bakteri. Banyak bakteri anaerob fakultatif dapat menggunakan nitrit sebagai hasil
reduksi nitrat, yang disebabkan adanya enzim nitratase. Berdasarkan hasil uji nitrat terdapat 1 isolat yaitu IRm3 yang bersifat negatif yang berarti tidak mampu mereduksi nitrat menjadi nitrit. Sedangkan 4 isolat yang lain yaitu IRm1, IRm2, IRm4, dan IRm5, bersifat positif yang berarti memiliki kemampuan mereduksi nitrat menjadi nitrit ditandai dengan terjadinya perubahan warna menjadi merah. Pengelompokan Isolat Bakteri Resisten Merkuri Berdasarkan hasil isolasi bakteri resisten merkuri didapatkan 5 isolat yang kemudian diidentifikasi dengan melihat karakteristiknya secara makroskopik, mikroskopik, dan uji biokimia dengan mengacu pada Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology 7th. Hasil pengujian dari beberapa karakter bakteri tersebut dapat digunakan sebagai dasar untuk menentukan genus dari isolat bakteri yang diperoleh. Berdasarkan hasil identifikasi 4 isolat memiliki kecenderungan tergolong genus Bacillus (IRm1, IRm2, IRm3, dan IRm4) dan 1 isolat memiliki kecenderungan tergolong genus Pseudomonas. KESIMPULAN 1. Hasil isolasi bakteri resisten merkuri dari kawasan pantai Losari Makassar diperoleh lima isolat dan diberi kode IRm1, IRm2, IRm3, IRm4, dan IRm5. 2. Hasil uji resistensi isolat bakteri pada beberapa konsentrasi merkuri memperlihatkan kemampuan resistensi yang berbeda, dua isolat termasuk bakteri resisten pada konsentrasi 150 ppm yaitu IRm2 dan IRm5 dengan diameter hambatan tidak melebihi ambang batas resistensi yaitu ≤ 1 mm, sedangkan tiga isolat termasuk bakteri yang sensitif pada konsentrasi 150 ppm yaitu IRm1, IRm3, dan IRm4 dengan diameter hambatan > 1 mm. 3. Hasil uji karakterisasi isolat bakteri resisten merkuri, terkait morfologi koloni, morfologi sel, dan fisiologisnya, maka empat isolat bakteri memiliki kecenderungan tergolong genus Bacillus yaitu IRm1, IRm2, IRm3, dan IRm4, dan satu isolat memiliki kecenderungan genus Pseudomonas yaitu IRm5. DAFTAR PUSTAKA Ahmad, I., Hayat S., Ahmad A., Inam A., and Samiullah, 2005. Effect of Heavy Metal on Survival of Certain Groups of Indigenous Soil Microbial Population. J Appl Sci Environ Mgt 9:115-121. Brown, N., Y. Shih, C. Leang, K. Glendinning, J. Hobman, and J. Wilson, 2002. Mercury Transport and Resistance. Biometals, International Biometals Symposium.
Page 8
Burnley, L. E., 2000. Heavy Metal Resistance in the Genus Gluconobacter. Thesis, Master of Science in Biology, Faculty of Cappuccino, J. G., and N. Sherman, 2001. Microbiology : A Laboratory Manual, 6th Edition. Pearson Education Inc. San Fransisco, USA. Chein, M. F., K. H. Lin, Matsui, C. C. Huang, and G. Endol, 2010. Organomercurials Removal by Heterogeneous merB Genes Harboring Bacterial Strains. Jurnal Of Bioscience and Bioengineering, Vol. xx No. xx: xxx – xxx. Duncan, F., 2005. MCB 1000L Applied Microbiology Laboratory Manual 4th Ed. New York: The McGraw-Hill Companies. Dutka, B. J., and G. Bitton, 1989. Toxicity Testing Using Microorganisms. Vol. II. CRC Press., Inc. Boca Raton, Florida. Dwyana, Z., dan R. B. Gobel, 2012. Mikrobiologi Umum. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Hasanuddin, Makassar. Fahruddin, 2010. Bioteknologi Lingkungan. Alfabeta, Bandung. Hadioetomo, R. S., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek : Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta Hughes, M. N., and R. K. Poole, 1989. Metals and Microorganism. Chapman and Hall, New York: 253-339. Lasut, M., 2011. Penurunan Kualitas Lingkungan Akibat Aktivitas Tambang. Aksara Karunia. Jakarta. Lay, B. W., 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Erlangga, Jakarta. Nofiani, R., dan Gusrizal., 2004. Bakteri Resisten Merkuri Spektrum Sempit dari Daerah Bekas Penambangan Emas Tanpa Izin (PETI) Mandor, Kalimantan Barat.
Virginia Tech, Blacksburg, VA, USA. 81 pp. Jurnal Natur Indonesia. 6(2): 67-74. Jurusan Kimia, FMIPA (Persiapan), Universitas Tanjungpura, Pontianak. Rasmussen, L. D., C. Zawadsky, S. J. Binnerup, G. Oregaard, S. J. Sorensen, and N. Kroer, 2008. Cultivation of Hard-To-Culture Subsurface Mercury-Resistant Bacteria and Discovery of New merA Gene Sequences. Department of Environmental Chemistry and Microbiology, National Environmental Research Institute, University of Aarhus, Frederiksborgvej 399, 4000 Roskilde, Denmark, Institute of Biology, University of Copenhagen, Solvgade 83H, 1307 Copenhagen K, Denmark. App. Environ. Microbiol. p.3795-3803, vol. 74, No.12. Republika, 2008. Pantai Losari Makassar Tercemar Merkuri. http://www.republika.co.id, Diakses pada tanggal 19 Desember 2014. Silver, and Phung, 1998. Bacterial Heavy Metal Resistance : New Suprises. Rev Microbiol. Singleton, P., 1992. Introduktion to Bacteria. Comstock Publishing Association. Cornel University Press, London. Smith, E., Wolters, A. and Elsas, J. D. V. 1998. Self-transmissible mercury esistance plamids with gene mobilizing capacity in soil bacterial populations: influence of wheat roots and mercury addition. Appl. Environ. Microbiol. 64: 1210 1219. Widowati, W., A. Sastiono, dan R. Jusuf. R., 2008. Efek toksik logam “Pencegahan dan penanggulangan pencemaran”. Penerbit Andi, Yogyakarta.
Page 9
