BERIAJAYA et al. : Isolasi dan Identifrkasi Kapang Nematofagus
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI KAPANG NEMATOFAGUS BERIMAYA, AHMAD R.Z ., dam E. KUSUMANINGTYAS Balai Penelitian Veteriner Jalan R. E. Martadinata 30, P. O. Box 151, Bogor 16114, Indonesia
ABSTRAK BERImAYA, AHMAD RZ, dan E. KUSUMANINGTYAS. 1999/2000. Isolasi dan identifikasi kapang nematofagus.
Proyek nkayasa Teknologi Peternakan ARMP-H : 358-363.
Laporan Bagian
Infeksi cacing nematoda merupakan kendala bagi ternak domba dan kambing dan salah satu cacing yang cukup mempunyai dampak ekonomi adalah cacing Haemonchus contortus. Penanggulangan yang sering dilakukan adalah dengan pemberian obat cacing (antelmintik). Mengingat sistim betemak dengan cara digembalakan, maka pemberian antelmintik harus dilakukan secara berkala setiap bulan. Sebagai akibat dari pemberian antelmintik secara terus menerus akan menimbulkan galur cacing yang tahan terhadap antelmintik dan menimbulkan residu obat dalam jaringan tubuh hewan. Kapang nematofagus adalah salah satu jenis kapang yang mempunyai kemampuan membunuh cacing nematoda dengan cara membuat perangkap (trapping), endoparasitik, parasit pada telur dan mengeluarkan metabolit yang toksik terhadap nematoda . Beberapa jenis kapang yang diketahui mempunyai sifat nematofagus dan kemungkinan merupakan pilihan terbaik yang dapat digunakan untuk penanggulangan haemonchosis adalah Arthrobotrys oligospora dan Duddingtonia flagrans . Jenis kapang tersebut diisolasi dari daerah Sumatra Utara dan Jawa Tengah dan selanjutnya diidentifikasi berdasarkan morfologi . Isolat kapang ini yang berhasil diisolasi adalah Arthrobotrys oligospora . Sedangkan isolat Duddingtoniaflagrans tidak ditemukan dari sampel tersebut. Kata kunci :
Arthrobotrys oligospora, Duddingtonia flagrans, Haemonchus contortus,
domba, kambing
s
ABSTRACT BERIMAYA, AHMAD R.Z., and E. KUSUMANINGTYAS . 1999/200 0. Isolation and identification of nematophagus fungi .
Bagian Proyek Rekayasa Teknologi Peternakan ARMP-II : 358-363.
Laporan
Nematode infections is a constraint to sheep and goats farms and one of nematode worms which have major Haemonchus contortus. The present control is by drenching with anthelmintic. Since all animals
economic impact is
are grazed, anthelmintic should be given regularly each month. Side effect of that, anthelmintic resistance and tissue
residue might be developed. Nematpphagous fungi is one group of fungi having the ability to destroy larvae of nematodes with trap, endoparasitic;.: egg parasitic and excrete toxic metabolites. Arthrobotrys oligospora and Duddingtonia flagrans are the species of fungi which might be selected for control of nematodes. Results of this study showed that
flagrans . Key
Arthrobotrys oligospora
are isolated from North Sumatra and Central Java, but not with
Duddingtonia
words: Arthrobotrys oligospora, Duddingtoniaflagrans, Haemonchus contortus, sheep, goats PENDAHULUAN Haemonchosis merupakan penyakit yang disebabkan oleh cacing
Haemonchus contortus
dan biasanya
menyerang temak ruminansia terutama domba dan kambing. Cacing ini mempunyai kepentingan ekonomik karena
infeksi oleh cacing ini menyebabkan timbulnya kendala dalam peningkatan produktivitas temak berupa hambatan pertumbuhan dan timbulnya kematian terutama pada ternak muda (BERIAJAYA dan STEVENSON, 1985). Mengingat populasi domba dan kambing yang cukup besar (ANON, 1995) maka kerugian ekonomik akibat haemonchosis ditaksir 16,6 juta dolar US per tahun (PARSON dan VERE, 1984), sedangkan khusus pada domba ditaksir sebesar 4,7
juta US dolar (RONOHARDJO terinfeksi
oleh
cacing
ini
et al.,
akan
1985). Cacing ini merupakan cacing penghisap darah sehingga hewan yang kehilangan darah, yang ditandai dengan anaemia. Pada saat ini
banyak
penanggulangan haemonchosis. banyak dilakukan dengan memakai antelmintik, yang mana bila antelmintik ini
digunakan secara terus-menerus akan menyebabkan timbulnya galur cacing yang tahan terhadap antelmintik (WALLER, 1994) dan menimbulkan residu obat dalam jaringan tubuh hewan. Metoda penanggulangan yang lain seperti seleksi ras temak yang resisten terhadap infeksi cacing, pembuatan vaksin dan kontrol biologi dengan
358
Laporan Bagian Proyek Rekayasa Teknologi Peternakan ARMP-11 Th. 199912000
menggunakan kapang nematofagus masih dalam taraf penelitian dan cara-cara ini harus merupakan cara yang terpadu (WALLER, 1997). Penelitian kontrol biologi terhadap cacing gastrointestinal nematoda dengan menggunakan kapang nematofagus sudah dirintis orang sejak 1977 (BARRON, 1977 ; LARSEN et al., 1991 ; GRONVOLD et al., 1989 ; GRONVOLD et al., 1993). Penelitian ini diarahkan kepada isolasi dan efikasi jenis kapang tersebut baik secara in vitro maupun secara in vivo terhadap berbagai jenis nematoda gastrointestinal yang nantinya diperkirakan dapat diaplikasikan sebagai salah satu altematif penanggulangan haemonchosis atau cacing nematoda gastrointestinal yang lain (LARSEN et al., 1992 ; WALLER dan FAEDO, 1993 ; WALLER et al., 1994). Dengan berbagai pertimbangan dan penelitian yang banyak dilakukan di luar negeri maka beberapa jenis kapang yang mempunyai sifat nematofagus dengan cara membuat jerat dan merupakan pilihan yang terbaik adalah Arthrobotrys oligospora dan Duddingtonia flagrans ( GRONVOLD et al., 1996 ; WALLER dan LARSEN, 1996). Indonesia memiliki kekayaan plasma nuftah yang banyak (KARDIN et al., 1995) dan kapang nematofagus termasuk di dalamnya . Dengan memanfaatkan sumber plasma nuftah di atas diharapkan jenis kapang tersebut dapat digunakan untuk menanggulangi infeksi cacing nematoda khususnya haemonchosis . Dari penelitian terdahulu yang dilakukan di Balitvet pada tahun 1997/1998, telah didapat beberapa isolat kapang nematofagus dan hasil uji secara in vitro menunjukkan hasil yang baik (AHMAD, 1998). Tujuan dari kegiatan penelitian ini adalah untuk mengisolasi jenis kapang Duddingtonia flagrans dan Arthrobotrys oligospora dari daerah pengembangan bibit domba dan kambing di Indonesia .
TINJAUAN PUSTAKA Kapang nematofagus adalah salah satu jenis kapang tanah yang mempunyai kemampuan membunuh larva cacing nematoda . Kapang ini hidup kosmopolitan dan ditemukan pada berbagai lingkungan mulai dari daerah tropis sampai hutan tundra di kutub utara terutama pada tanah pertanian yang subur (KERRY, 1984 ). Pertama kali dikenal kurang lebih satu abad yang lalu (Descazeux and Cappelle dalam AHMAD, 1998) dan sampai saat ini oleh beberapa peneliti di luar negeri berhasil diisolasi sebanyak kurang lebih 200 spesies dari kelas Deutromycetes. Cara kerja kapang nematofagus untuk membunuh larva cacing nematoda antara lain dengan membentuk perangkap cincin untuk menangkap larva cacing, endoparasit dan menghasilkan toksin yang akan membunuh larva (BARRON and THORN, 1984 ; GRONVOLD et al., 1989 : HASHMI and CONNAN, 1989 ; MENDOzA DE GIVES et al., 1992). Kelas Deutroomycetes atau fungi imperfecti mewakili kelompok kapang pemangsa (predator), pembuat perangkap, endozoit parasit dan parasit telur nematoda (WALLER and FAEDO, 1993). Dalam kelas ini termasuk cendawan renik heterogen yang ditandai. dengan kemampuannya menangkap dan mengeksploitasi nematoda baik sebagai sumber makanan maupun tambahan keberadaaan saprofitik . Berdasarkan bentuk dan fungsinya yang khusus untuk menangkap nematoda, BARRON (1977) membagi kapang ini dalam 2 kelompok ekologis yaitu kapang predator yang menghasilkan struktur perangkap untuk nematoda seperti bonggol perekat, jaring atau bentuk cincin dari miselium; dan kapang endoparasit yang menginvasi nematoda dengan cara penetrasi dari spora perekat yang menempel pada kutikula atau penelanan spora yang masuk ke dalam saluran pencernaan . Satu kelompok lain yang diajukan oleh NoRDBRING-HERTz (1989) adalah kelompok kapang parasitik pada telur yang mempunyai kemampuan menyerang stadium telur, terutama kelompok nematoda yang stadium perkembangan telurnya sangat lama (KUNERT, 1992 ; LYSEK and KRAJCI, 1987). Kapang-kapang kelompok nematofagus cukup sukar diisolasi dari lapangan tempat temak digembalakan dan menderita cacingan, karena di dalam proses pengisolasian, kapang nematofagus harus bersaing hidup dengan kapang-kapang tanah dan kapang kontaminan lainnya. Untuk memperbanyak isolat kapang, digunakan berbagai pilihan medium diantaranya Potato Dextrose Agar (PDA), Malt Agar (MA), Yeast Malt Agar (YMA), Sabouraud Glucose Agar (SGA) atau Sabouraud Dextrose Agar (SDA) dan Corn Meal Agar (CMA). Untuk mengisolasi kapang ini digunakan media yang miskin nutrisi dan kandungan gula dan larva oacing nematoda digunakan sebagai makanannya . Semua larva nematoda akan terperangkap dan terbunuh dalam beberapa jam (NANSEN et al., 1986). Bila dalam sampel tanah atau tinja terdapat kapang nematofagus, maka kapang ini akan tumbuh dan memakan larva cacing tersebut dalam medium pembiakan. Genus dari kapang nematofagus yang dilaporkan sangat aktif untuk membunuh larva cacing nematoda adalah Arthrobotrys, Geniculifera dan Monacrosporium, dan dari genus ini 2 spesies Arthrobotrys, 2 spesies Geniculifera dan 2 spesies Monacrosporium cukup aktif dibanding dengan studi yang ekstensif dari spesies Arthrobotrys oligospora (WALLER dan FAEDO, 1993). Selanjutnya WALLER et al . ( 1994) juga melaporkan bahwa
35 9
BERJAJAYA et al. : lsolasi dan /dentifikasi Kapang Nematofagus
Arthrobotrys oligospora, Arthrobotrys oviformis dan Geniculifera eudermata cukup mempunyai daya tahan hidup, dalam abomasum .
MATERI DAN METODE Koleksi spesimen Spesimen yang terdiri dari tinja dan tanah dikumpulkan dari peternakan domba dan kambing di daerah Jawa Tengah ,dan Sumatra Utara. Kedua daerah ini dipilih karena merupakan daerah pengembangan bibit ternak kambing dan domba. Sampel tinja diisolasi menurut LARSEN et al. (1994) . Satu gram tinja disebar pada cawan petri yang berisi 0.02% Tetrasiklin Agar Cair. Pada saat yang sama ditambah 2000-4000 larva infektif Haemonchus contortus, kemudian diperiksa setiap minggu selama 3 minggu untuk melihat pertumbuhan kapang. Untuk menjaga kelembaban ditambah air secukupnya, tetapi hal ini tidak dilakukan karena sudah cukup lembab . Setelah kapang yang diinginkan ditemukan, kemudian dimurnikan dengan cara membiakan lagi pada media 0,02% Tetrasiklin Agar Cair spora atau konidia kapang yang diinginkan dan kemudian dimurnikan dengan cara cell single spore culture untuk memisahkan dari kapang jenis lain . Sampel tanah diisolasi menurut LARSEN et al. (1991) . Sepuluh gram sampel tanah berasal dari kandang atau tempat pangonan dan kemungkinan banyak mengandung tanah liat dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 100 ml berisi 15 ml 0.01% sodium-hexametaphosphate, kemudian digoyang-goyang selama 10 menit pada suhu kamar, dan selanjutnya dibiarkan selama 5 menit. Setelah itu diambil 5 contoh supernatan (0 .5 ml/petri), kemudian disebar dengan pola bintang pada cawan petri (diameter 8 cm) yang berisi media Tetrasiklin Chlorida Agar Cair (TCCWA). Pada saat yang sama cawan petri tersebut diberi 1000 - 2000 larva Haemonchus contortus dan kemudian diinkubasi pada suhu kamar untuk memastikan adanya aktivitas kapang nematophagus . Cawan petri diperiksa 2 kali setiap minggu selama 2 bulan. Selain itu sampel tanah sebanyak kurang lebih 1 gram dibiakan seperti sampel tinja. Identifikasi Kapang yang ditemukan diidentifikasi berdasarkan morfologi bentuk jeratan dan konidia (GILMAN, 1957;
BARNET, 1969 ; DOMSCH dan GAMS, 1972 ; VAN OORSCHOT, 1985).
HASIL DAN PEMBAHASAN Isolasi kapang nematofagus Untuk mengisolasi kapang nematofagus, maka sampel tanah diambil dari daerah sekitar kandang atau tempat pangonan domba dan kambing. Sampel ini diproses di laboratorium Mikologi, Balai Penelitian Veteriner. Sampel tanah dibiakan dalam media Water Agar Tetra Cycline Chloride (WA-TCC) dan ditambah larva cacing H. contortus . Setelah 2-3 minggu , jenis kapang yang tumbuh diisolasi dan dibiakan kembali dalam media yang baru tetapi sama seperti diatas yaitu mdia Tetracycline Chlorida Water Agar. Jenis kapang ini diidentifikasi dan hasil identifikasi dapat dilihat pada Tabel 1 . Kapang Arthrobotrys oligospora di dapat dari Sungai Putih, Medan. Jenis kapang ini seharusnya banyak terdapat di daerah Bogor, seperti yang pernah diisolasi tetapi tidak dapat dipelihara di laboratorium. Jenis kapang Duddingtonia flagrans tidak ditemukan dari sampel tanah yang diperiksa, tetapi jenis kapang lain seperti Fusarium spp. Trichoderma sp ., Cephalosporium sp . dan Paccilomyces sp. banyak terdapat pada semua sampel yang diperiksa . Kapang tersebut merupakan kapang nematofagus karena kapang ini berkembang pada media miskin nutrisi (WATCC) dan larva cacing Haemonchus contortus dipakai sebagai umpan untuk makanannya . Jenis kapang tersebut belum tentu dapat dipakai karena harus dilihat dahulu apakah kapang ini mempunyai efek samping yang negatif terhadap hewan dan apakah daya tahan hidup kapang ini dalam saluran pencemaAn cukup baik, artinya tahan terhadap enzimenzim pencernaan . Uji in vitro tidak dilakukan untuk jenis kapang Duddingtonia flograns karena tidak didapatkan isolat ini dari sampel tinja dan tanah yang diperiksa, sedangkan jenis Arthrobotrys oligospora pemah dilakukan dengan hasil yang 360
Laporan Bagian Proyek Rekayasa Teknologi Peternakan ARMP-I1 Th. 199912000
baik bila diberikan lebih dari 1000 konidia setiap gram tinja yang mengandung telur cacing dengan jumlah telur 3000 per gram tinja. Tabel 1.
Hasil pemeriksaan sampel tinja dan tanah yang dikoleksi dari berbagai tempat di Jawa Tengah dan Sumatera Utara
Waktu
Kegiatan
Koleksi sampel
Juli 1999
Sampel tinja dan tanah dari Kaligesing, Purworejo, Jawa Tengah
Agustus 1999
Sampel tinja dan tanah dari UPT Pembibitan Kambing di Kendal, Jawa Tengah
Agustus 1999
Jumlah 226
Isolat
Hasil isolasi
Jumlah
Fusarium spp. Trichoderma sp. Paccilomyces sp . Cephalosporium sp .
143 12 41 13
18
Fusarium spp. Trichoderma sp. Paccilomyces sp.
18 10 2
Sampel tinja dan tanah dari Sungai Putih, Medan, Sumatera Utara
63
Fusarium spp. Trichoderma sp . Cephalosporium sp . Paccilomyces sp. Arthrobotrys oligosora
47 8 9 7 2
Januari 2000
Sampel tinja dan tanah dari Kabupaten Semarang, Magelang dan Batang
136
Fusarium spp. Trichoderma sp . Paccilomyces sp . Cephalosporium sp.
78 6 22 7
Maret 2000
Sampel tanah dari daerah sekitar Sungai Putih, Medan
30
Fusarium spp. Trichoderma sp. Cephalosporium sp. Paccilomyces sp .
28 4 2 6
Maret 2000
Sampel tanah dari Bogor
15
Fusarium spp. Trichoderma sp .
.
15 15
KESIMPULAN DAN SARAN Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa dari jenis kapang nematofagus yang berhasil diisolasi adalah kapang Arthrobotrys oligospora, sedangkan jenis kapang Duddingtonia flagrans belum berhasil diisolasi dari sampel yang diambil. Jenis kapang nematofagus lain yang juga berhasil diisolasi adalah Fusarium spp., Trichoderma sp ., Paccilomyces sp . dan Cephalosporium sp ., tetapi masih harus diteliti apakah jenis tersebut dapat digunakan untuk menanggulangi infeksi cacing. Penelitian ini perlu dilanjutkan terutama untuk mengisolasi kapang Duddingtonia flagrans baik dari sample tinja maupun tanah karena kapang jenis ini lebih baik efeknya dibanding dengan Arthrobotrys oligospora dan uji in vivo kapang jenis ini pada ternak domba dan kambing yang teriinfeksi cacing nematoda serta cara-cara pemberian kapang tersebut pada hewan baik melalui pakan konsentrat maupim mineral blok . Penelitian ini mempunyai dampak yang jelas untuk menanggulangi masalah infeksi cacing nematoda pada domba dan kambing. Aplikasi di lapangan dapat dilakukan dengan mencampur jenis kapang ini dalam pakan tambahan seperti konsentrat, urea molasses block atau bahan-bahan yang tersedia di lapangan .
36 1
BERIAJAYA
et al. : Isolasi dan Identifrkasi Kapang Nematofagus
DAFTAR PUSTAKA AHMAD, R.Z. 1998 . Isolasi dan pengembangan kapang nematofagus . Laporan APBN tahun 1997/1998 . Balitvet . Bogor . ANONIMUS . 1995 . Buku Statistik Petemakan 1994 . Direktorat Jenderal Petemakan, Jakarta. BARNET, H .L. 1969. Illustrated Genera of Imperfect Fungi . 2rd ed . Burgess Publishing Company . Minneapolis . BARRON, G.I. 1977 . The nematoda destroying fungi . In Topics in Mycology No.] . Canadian Biological Publication Ltd . Guelph, Ontario. Canada BARRON, G .L. and R .G . THORN . 1984 . Carnivorous mushroom . Science 224 : 76-78 . BERIAJAVA and P . STEVENSON . 1985 . The effect of anthelmintic treatment on the weight gain of village sheep . Proc . the 3`d AAAP Animal Science Congress, Seoul, May 6 -10, 1985 ; Vol . l : 519-521 . DOMSCH, K .H. and W . GAMS . 1972 . Fungi in Agricultural Soils . Longman, Edingburgh . GILMAN, J .C . 1957 . A Manual of Soil Fungi . 2nd Ed . The Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA . GRONVOLD, J ., P . NANSEN, S .A . HENRIKSEN, M, LARSEN, J . WOLSTRUP, J . BRESCIANI, H . RAWAT and L .F . FRIBERT . 1996 . Introductio n of traps by Ostertagia ostertagi larvae, chlamydospore production and growth rate in nematode-trapping fungus Duddingionia fagrans. J. Helminthol . 70 : 291-297 . GRONVOLD, J ., S .A . HENRIKSEN, P . NANSEN, J. WOLSTRUP and J . THYLIN . 1989 . Attempts of control infection with Ostertagia ostertagi (Trichostrongylidae) in grazing calves by adding mycelium of the nematode-trapping fungus Arthrobotrys oligospora (Hypomycetales) to cow pats . J. Helminthol . 63 : 115-126. GRONVOLD, J ., J. WOLSTRUP, P . NANSEN and S .A . HENRIKSEN . 1993 . Nematode trapping fungi againts parasitic cattle nematodes . Parasitol. Today 9 (4) : 137-140 . HASHMI, H.A . and R .M . CONNAN . 1989 . Biological control of ruminant trichostrongylids by Arthrobotrys oligospora, a perdacious fungus. Parasitol. Today 5(1) : 28-30 . KARDIN, M .K ., S . HASTIONO, D . SUDARMADJI dan S . BROTONEGORO . 1995 . Status plasma nuftah mikroba pertanian . Puslitbang Tanaman Pangan, Badan Litbang Pertanian, Bogor . KERRY, B .R . 1984 . Nematophagous fungi and the regulation of nematode populations in soil . Helminthological Abstracts Series B 53 : 1-14 . KUNERT, J. 1992 . On the mechanism of penetration of ovicidal fungi through eggshells of parasitic nematodes. Decomposition of chitinous and ascarocide layers . Folia Parasitologica 39 : 61-66 . LARSEN, M., J . WOLSTRUP . S .A . HENRIKSEN, C . DACKMAN, J. GRONVOLD and P . NANSEN . 1991 . In vitro stress selection of nematophagous fungi for biocontrol of parasitic nematodes in ruminants . J"Helminthol . 65 : 193-200 . LARSEN, M ., J . WOLSTRUP, S .A . HENRIKSEN, J . GRONVOLD and P . NANSEN . 1992 . In vivo passage through calves of nematophagous fungi selected for biocontrol of parasitic nematodes . J. Helminthol. 66 :137-141 . LARSEN, M., M . FAEDO, P.J . WALLER . 1994 . The potential of nematophagous fungi to control the free-living stages of nematode parasites of sheep . Survey for the presence of fungi in fresh faeces of grazing livestock in Australia . Vet. Parasitol. 53 :273-281 . LYSEK, H . and KRAJCI . 1987 . Penetration of ovicidal fungus Verticillium chlamydosporium through the Ascaris lumbricoides egg-shells . Folia Parasitologica 34 : 57-60 . MENDOZA-DE GIVES, P ., E. ZAVALETA-MEDIA, H . QUIROZ-ROMERO, D. HERRERA-RODRIGUEz and F . PERDOMO-ROLDAN . 1992 . Interaction between the nematode-destroying fungus Arthrobotrys robusta (Hyphomycetales) and Haemonchus contortus infectioe larvae in vitro. Vet. Parasitol. 41 :101-107 . NANSEN, P., J . GRONVOLD, SV .Aa. HENRIKSEN and J . WOLSTRUP . 1986 . Predacious activity of the nematode-destroying fungus, Arthrobotrys oligospora, on preparasitic larvae of Cooperia oncophbra and on soil nematodes . Proc. of the Helminthol. Soc. of Washington 53 :237-243 . NORDBRINO-HERTZ, B . 1988 . Nematophagous fungi : strategies for nematode exploitation and for survival . Microbiological Sciences 5 : 108-116 . PARSON, s .a . and D .T. VERE . 1984 . A benefit-cost analysis of the Bakitwan Project, Bogor, Indonesia . A report to the Australian Development Assistance Bureau. New South Wales . Department of Agriculture, Australia . RONOHARJO, P ., A .J. WILSON and R.G. HIRSTS . 1985 . Current livestock disease status in Indonesia. Penyakit Hewan 17(29) : 317-326.
362
Loporan Bagian Proyek Rekayasa Teknologi Petemakan ARMP-11 Th. 199912000 VAN OORSCHOT, C .A.N . 1985 . Taxonomy of the Dactylaria complex, V. A review of Arthrobotrys and allied genera . Studies in Mycol. 26 : 61-96 . WALLER, P . 1994 . The development of anthelmintic resistance in ruminant livestock. Acta Tropical 56 :233-243 .
WALLER, P . and M. FAEDO . 1993 . The potential of nematophagous fungi to control the free-living stages of nematode parasites of sheep: Screening studies. Vet. Parasitol . 49 : 285-297 . WALLER, P. and M . LARSEN . 1996 . Workshop summary: Biological control of nematode parasites of livestock. Vet. Parasitol. 64 : 135-137 WALLER, P.J ., M. LARSEN, M. FAEDO and D.R . HENNESSY . 1994 . The potential of nematophagous fungi to control the free-living stages of nematode parasites of sheep: In vitro and in vivo studies. Vet. Parasitol. 51 : 289- 299 . WALLER, P.J . 1997 . Sustainable helminth control of ruminants in developing countries. Yet. Parasitol. 71 : 195-207 .
