Tenru Teknis Fungsional non Penelid 2000
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI PATOGEN PENYEBAB KEMATIAN TERNAK SAPI Supariono
Balai Peneftian Veteriner, .TL RE. Martadinata, 30, Bogor 16114
RINGKASAN Pemeliharaan ternak yang tidak didukung oleh pengetahuan kesehatan hewan sering mengakibatkan kerugian ekonomi seperti kematian akibat penyakit menular, salah satu penyakit menular yang banyak ditemukan pada ternak sapi adalah penyakit ngorok yang disebabkan infeksi bakteri patogen yang dikenal dengan Pasteurella multocida. Untuk membuktikan penyebab kematian sapi yang didiagnosis penyakit ngorok, maka pengupan laboratonum perlu dilakukan terhadap spesimen atau organ yang diambil dan hewan mati. Pengambilan sampel biasanya dilakukan segera setelah hewan dibedah/autopsi dalam keadaan segar di laboratonum . Organ yang akan dipenksa digerus hingga lembut untuk mendapatkan suspensi organ dan selanjutnya dibiakkan pada media agar darah dan MacConkey agar. Isolasi dan identifikasi agen penyebab kematian dimulai dari pengamatan morfologi koloni dan mikroskopis. Pengujian untuk idennfikasi dimulai dan genus hingga pengujian gula-gula untuk pengamatan aktivitas biokimia sebagai data pendukung untuk mengetahui spesies dari bakteri yang diisolasi. Semua perubahan uji kimiawi dicatat dan dicocokkan dengan daftar atau tabel standar, Pengujian dilakukan secara teliti dan bila perlu dilakukan pengulangan hingga menghasilkan data yang akurat. Uji biologis dengan menggunakan hewan percobaan dilakukan untuk mengetahui patogenitas bakteri yang diisolasi dan identifikasi benar-benar membunuh hewan percobaan. Kata kunci : Isolasi, Bakter palogen, kemtian sapi.
PENDAHULUAN Isolasi dan identifikasi merupakan salah satu teknik untuk mengetahui penyebab kematian pada ternak akibat infeksi bakten patogen. Kedua kegiatan tersebut dilakukan di laboratonum diagnosik untuk mengetahui penyebaran, pencegahan dan bahkan pengobatan penyakit . Ketepatan diagnosis dipengaruhi oleh berbagai faktor antara lain ketepatan pemilihan spesimen diagnosis dan pengiriman ke laboratonum. Pengetahuan dan keterampilan dalam penguasaan teknik diagnosis twut mendukung keberhasilan diagnosis ini serta pembuatan media pertumbuhan dan peralatan yang memenuhi persyaratan. Pada saat ini banyak metoda untuk identifikasi sejalan dengan berkembangnya ilmu pengetahuan dan teknologi, namun metoda diagnosis tersebut membutuhkan peralatan dan biaya yang cukup tinggi . Dilain pihak teknik konvensional yang 65
Temu Telrnis Fungsional non Pemba 2000
dilakukan secra bertahap di dalam pengujian (BERGEYS, 1984) masih memberikan hasil yang dapat diandalkan. Cara lain dengan menggunakan Kit (Microbact Mb 24 Miscelaneus) cukup praktis dan sederhana dengan hasil yang cepat tetapi tidak semua mikroba dapat terdeteksi. Cara lain yaitu gabungan antara manual dan reaksi dimlai dalam bentuk point atau angka yang diolah dengan Komputer. Tekmk benkutnya adalah penggunaan kartu masterldischotomous keys dimana kuman yang sudah diketahui genus dan spesiesnya pada kartu dibuat tabel dan reaksi dibentuk lubanglubang dan dicocoKkan dengan hasil yang kits dapatkan. Dalam hal ini penulis hanya membahas salah satu teknik identifikasi secara manual satu persatu dilakukan pengujian hingga dapat dihasdkan mulai dari genus suatu kuman serta didukung reaksi biokimiawi sampai diketahui spesies dan "man hasil isolasi .
BAHAN DAN METODA Bahan 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Media agar dash (darah domba 5-6%) Media MacConkey agar Media cair BI-H, Nutrien, serum broth Media uji karbohidrat Media uji gala-gala (untuk Biokimia) Buku/lembar daftar uji
Metoda Spesimen atau organ yang dikoleksi dari lapangan atau yang dikirim ke laboratorium seperti limpa, hati, jantung, diambil sebagian suspensinya dengan menggunakan pipet Pasteur, atau digerus terlebih dahulu hingga lemb t kemudian dibiakkan pada medium kaldu cair (Nutrien broth, BHI, serum broth) atau langsung dibiakkan pada media agar darah dan MacConkey agar. Selanjutnya suspensi yang diperoleh dinkubasi pada suhu 37° C atau suhu lain dengan sifat-sifat dari bakteri yang memerlukan suhu lebih tinggi pada 42-45° C seperti bakten thermophilie. Identifikasi dimulai dan pengamatan morfologi koloni setelah dunkubasi selama 24 atau 48 jam. Bila biakan belum memperlihatkan pertumbuhan maksimal, maka dilakukan pengamatan nukroskopis untuk mempelajan bentuk (shape) kolom dengan bantuan pengecatan zat warns menurut metode Gram (COWAN & STEEL, 1974). Hasil dari pengecatan dapat dilihat dari pembentukan warns biru untuk bakten gram positif dan merah untuk bakten gram negatif Selanjutnya pengujian katalase dan oksidase, dalam hal ini sebagaian dan uji yang mengarah ke genus dan biakan kuman yang akan dican dapat dicocokkan pada tabel yang sudah standar. Setelah genus dapat diketahui kuman yang sudah dipilih dan dimurnikan lalu disubkultur pada media cair nutrien (Difco) atau BM diinkubasi hingga cukup
Tenm Tekrrta Flngsiond non Pemhg 2000
kekeruhannya dan dilakukan pengujian untuk mengetahui spesies kuman yang berkualitas. Prosedur Pembiakan Spesimen
Banyak jenis spesimm yang dildrim oleh petugas lapangan untuk pemeriksaan laboratorium serta banyak pula jems bakten yang akan diisolasi dan terjadi kesalaban pada pemilihan jenis spesimen sermg dudentifikasi, masih tepat sasaran Minimnya informasi yang disampaikan pada mengakibatkan tidak spesimen pada saat melakukan bedah hewan dapat mempenganilu . lembar penganter (label 1). keberhasilan tersebut Tabel. 1 Prosedur pemprosesan spesimen
jam.
prgaty asnW uioe, swab Feses, l feat swab Usus, lasmta Organ, isi, ums, feat swab
D fliskon Aaobic
Media Agar dwsh Moc, BliL medium semi solid
Read»n Aaobik
Suhu 37" C
Endwik baktai Micro Anseaob (clostridia)
Sekaith, SS agar, Mcc TSA, DSA selektif mod BA, RCMM, Thioglyeollate, BHI semi solid
Aerob& 10% Co &uodk Anaaobik
37,42° C 37" C 37° C
Carter (1973)
Urutan identifikasi menentukan Genus dari bakteri 1. Shape (bentuk) Dengan slat bantu mikroskop pembesaran 1000 x dapat dilihat bentuk mikroba yang diisolasi dan telah dimumikan. Pengamatan dilakukan berdasarkan bentuk kuman seperti bulat (Coccus/Sphere) dan jenisnya seperti bergerombol membentuk kumpulan atau menyambung satu sama lain membentuk mntai (Streptococcus sp). bentuk batang (R7-Rod) sama seperti di alas memilik bentuk batang yang bervariasi dalam ukurannya seperti kecil atau lembut (Corynebacterium sp), bentuk besar (Bacillus sp) dengan bantuan zat warm pengecatan kuman dengan metoda Gram bisa dilihat warm merah untuk bakteri bersifat gram negatif dan bakteri yang berwama biru untuk gram positif 2.
Motilitas atau pergerakan
Ada dua cars untuk melihat pergerakan dari aktivitas bakten. Penusukan pada agar semi solid medium, ose yang digunakan ose yang lurus, bidang tusukan dan alas hingga dasar tabung, reaksi memperlihatkan perubahan warm keruh dari tusukan menyebar ke segala arah. Reaksi negatif tidak terjadi perubahan tersebut. Cara penetesan pads glass slide atau preparat tetes gantung kuman yang akan diamati telah ditumbuhkan pada media cair 4 atau 24 jam. Pengamatan dengan cars meneteskan
67
Tom Tebds FLngsonal nonPenelth 2000
cairan pada cover glass yang diben bantalan cincin karet selebar glass slide lalu dibalikkan hmgga posisi cairan tergantung, dengan mikroskop pembesaran 400 x dilihat aktivitas pergerakan dengan dua katagon yaitu untuk pergerakan cepat sekali untuk positif realm, sedangkan pergerakan hanya disekitar kelompoknya: berarti negatif Pertumbuhan aerobik Kemampuan untuk bisa tumbuh pada kondisi aembik, dalam arti kkuman untuk tumbuhnya masih memerlukan oksigen perttimbiihan bisa pada temperaatur ruangan atau dunkubasi pads leman pengeram atau mkubator 37° C, untuk pembiakan tersebut bisa pada media cair (broth) atau pada agar petri pertumbuhan bisa dilihat pada jam ke empat hingga pertumbuhan menjadi berubah keruh bila pada media cair, sedangkan pads agar pada awal pertumbuhan hanya dapat dilihat bintik-bintik lembut hingga membesar pads pertumbuhan optimal sesuai kebutuhan nmasingmasing yang berbeda (Topley dan Wilson, 1975) . Pertumbuhan An erobik Kemampuan untuk bisa tumbuh pada kondisi tanpa udara atau oksigen, dalam hal ini kuman diinkubasikan dalam suatu bejana kapasitas 2,5 liter terbuat dari logam atau plasuk udara dikeluarkan dengan macam cara, satu diantaranya yaitu yang disebut Candle jar, pads bejana itu dimasukkan sepotong lilin yang menyala, selama persediaan udara masih ada dalam bejana itu lilin menyala dan apabila dalam waktu beberapa menit lampu itu akan segera pada menandakan bahwa udara dalam bejana itu telah habis. Cara yang kedua dengan nggunakan Gaspak (Gas generating kit) berupa amplop atau kantong kedap air yang apabila dimasukkan air sebanyak 10 cc akan memmbulkan reaksi berupa gas yang memenuhi ruang bejana tersebut sehingga kondisi pada mejana tersebut dalam keadaan tanpa udara, dan selanjutnya pada temperatur yang sesuai kebutuhan. Pengujian Katalase Dengan bantuan lamtan Hydrogen peroksida (H202) dilamtkan 3% dan disimpan atau diteteskan pada gelas preparat sebanyak dua atau tiga tetes, biakan kuman yang sudah tumbuh diambil menggunakan Pipet Pasteur yang dibengkokkan atau dengan kawat ose Wit disentuhkan ujung pipet yang mengandung biakan tersebut, dilihat perubahan yang ditimbulkan, dalam beberapa detik terlihat buih/gelembung berarti kuman bereaksi positif, untuk negatif sebahknya . Pengujinn Oksidase Biakan kuman yang sudah ditumbuhkan pada media agar darah diambil dengan kawat ose atau pipet Pasteur lalu ditempelkan pada kertas wring yang sudah
68
Tenor Tekms Fungsfonol non Penehd 2000
basah ditetesi larutan tetra methyl-p-phenylene diamine dichlonda reaksi dapat dilihat dalam hitungan detik yaitu terdapat warns biru atau violet untuk reaksi positif Pengujian karbohidrat untuk genus dan gula-gula untuk spesies bakteri Untuk mendukung pengujian genus tahap pertama yaitu katalase, oxidase dan selanjutnya dilanjutkan dengan pengujian seperti Simmon Citrate, Tsia-gelatin test dan yang lamnya. Pada prinsipnya media yang digunakan yaitu agar miring dalam slope (tabung) yang apabila dibiakkan kuman ke media penguji tersebut akan bereaksi perubahan warns Brom tymol blue atau phenol red. Perubahan bervariasi dari hari ke dua sampai hari ke tujuh. Setelah pengupan karbohidrat selesai dilanjutkan dengan uji gula-gula seperti arabinosa, lactosa, maetosa, manitol dll, media uji ini disimpan dalam botol isi 2,5 ml berwarna merah, apabila kuman yang akan diuji dengan cars me masukkan beberapa tetes kedalamnya akan terjadi peubahan warns, bila dalam 24 jam atau 48 jam berubah warns menjadi Joining menandakan kuman yang diuji positif dan untuk negatif tidak terjadi perubahan warns (masih merah) . Tabe12. Pengujian (Pasteurella) -Reaksi Gram -batang bipoler -Motitity -Catalase + -Arabinose -Lactose -Manitol -Rafinosa
d d + -
-Sorbitol -Sucrose -Trehalose -Xylose -Reaksi Nitrate -Indole -Gelatin -Urease -H2S
d + d d + + d -
Keterangan (d) = dubius 60-70% positif
69
r~ r tw Fungafasd mm Psesuri 2000 HASIL DAN PEMBAHASAN dan Setelah dilakukan pembiakan sampel/organ pada media selanjutnya dilakukan pembuktian, dimulai dengan pengamatan marphologi lain pengujian terhadap genus, species dari kuman yang berhasil dnsolasi sepanjang faktor pendukung lain diperhatikan. Peinbuatan media serta tepat tidaknya pemilihan organ darn spesimen yang dikirim ke laboratorium . Pengamatan mikroskopis sampan pengujian biokimiawi dilakukan dengan teliti, sehmgga diperoleh data pengujian darn test yang dilakukan dan selanjutnya dicocokkan dengan tabel yang sudah standar menunrt buku panduan yang sudah dibakukan.
KESIINIPULAN Pengujian dan bakten hasil isolasi dan hewan sapi yang terkena mfeksi PasteuwBa dengan cars manual masih depat digunakan, sepanjang pendukung dan spesimen, jenis spesimen dan pengolahan di laboratorium yang memenuhi persyaratan bank sarana dan slat hingga media pengujian d*at dengan cara benar. Berdasarkan hasil reaksi darn uji colour, uji terhadap genus, uji terhadap gula-gala untuk spesies dan dieocokkan pada Tabel yang sudah bake.
UCAPAN TERIMA KASIH Penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada Bapak Drs. Bhakti Puruvadikarta yang telah membantu pengusan makalah inn.
DAFI'AR PUSTAKA 1984. Manual of Systematic Bacteriology Vol.1, 1984. Williams & WillQns Baltimore, London. CARTER, G.R 1974 . Diagbnostics Procedure of Veterinary Microbiology, Sixth edition. COWAN , S.T. 1974. Manual of the Identification of Medical Bakteria. Second edition . Cambridge University Press, London. TOPLEY & WILSON. 1975. Principles of Bacteriology, Virology & Immunity. Sixth edition. Vol.l, 1975. Edwar Arnold Ltd, London .
BERGEY'S .
