ISOLASI BAKTERI ASAM LAKTAT DARI USUS IKAN LELE UNTUK PENGENDALIAN BAKTERI STREPTOCOCCUS PADA IKAN NILA

ISOLASI BAKTERI ASAM LAKTAT DARI USUS IKAN LELE UNTUK PENGENDALIAN BAKTERI STREPTOCOCCUS PADA IKAN NILA ISOLATION OF LACTIC ACID BACTERIA FROM THE CATFISH’S INTESTINE TO CONTROL STREPTOCOCCUS ON NILE TILAPIA

Rika Wulandari, Alexander Rantetondok, Hilal Anshary

Jurusan Ilmu Perikanan, Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan, Universitas Hasanuddin

Alamat Koresponden: Rika Wulandari Program Pascasarjana Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan Universitas Hasanuddin Makassar, 90245 HP: 085272994004 Email: [email protected]

ABSTRAK Streptococcosis kian marak menginfeksi ikan nila yang disebabkan infeksi bakteri Streptococcus agalactiae. Tujuan penelitian ini adalah menganalisis potensi daya hambat dan imunogenik bakteri asam laktat sebagai biokontrol pengendali Streptococcosis. Penelitian ini dilakukan secara in vitro dan in vivo dengan pengamatan dilakukan secara deskriptif. Metode penelitian terdiri dari isolasi bakteri, uji aktivitas antibakteri dengan metode difusi agar, karakterisasi dan identifikasi bakteri secara biokimia, uji lisozim, uji fagositosis, uji letupan respirasi dan sintasan. Hasil isolasi bakteri diperoleh 11 isolat dan isolat L22 terpilih untuk diuji lanjut karena mampu membentuk luasan zona hambat terbesar (11 mm). Hasil uji biokimia menunjukkan isolat L22 diduga jenis Bacillus sp. Aktivitas lisozim tertinggi pada darah ikan nila setelah pemberian probiotik ditunjukkan oleh perlakuan D (30 x 108 CFUml-1). Hasil uji NBT tertinggi diperlihatkan oleh perlakuan B (12 x 108 CFUml-1). Aktivitas fagositosis tertinggi ditunjukkan oleh perlakuan B (12 x 108 CFUml-1) dan D (30 x 108 CFUml-1), serta sintasan ikan uji tertinggi diperlihatkan oleh perlakuan B (12 x 108 CFUml-1) dan D (30 x 108 CFUml-1). Berdasarkan hasil serangkaian uji tersebut memperlihatkan bahwa ikan nila yang diberi perlakuan probiotik jenis Bacillus sp melalui pakan, menunjukkan hasil yang efektif meningkatkan laju aktivitas lisozim.

Kata kunci : bakteri asam laktat, ikan nila, Streptococcus agalactiae

ABSTRACT Streptococcosis increasingly infected nile tilapia caused by the bacterium Streptococcus agalactiae. The purpose of this study was to analyze the inhibitory and immunogenic potential of lactic acid bacteria as a biocontrol. This study was conducted in vitro and in vivo by descriptively observation. The research method consists of isolation of bacteria , antibacterial activity test with the agar diffusion method , characterization and biochemical identification of bacteria , lysozyme test , phagocytosis test , respiratory burst test and survival rate. The results of bacterial isolation was obtained 11 isolates and L22 was chosen to be tested further because it was able to form the largest area of inhibition zone ( 11 mm ) . The results of biochemical tests showed that L22 was Bacillus sp. The highest lysozyme activity in tilapia blood after probiotics treatments were shown by D ( 30 x 108 CFUml - 1 ). The highest NBT test results were shown by B ( 12 x 108 CFUml - 1 ) . The highest phagocytic activity were shown by B ( 12 x 108 CFUml - 1 ) and D ( 30 x 108 CFUml - 1 ) treatments, and the highest survival rate fish tests were shown by B ( 12 x 108 CFUml - 1 ) and D treatments ( 30 x 108 CFUml -1 ). Based on the results of the test series showed that tilapia treated with Bacillus sp. showed effective results to increase lysozyme activity of nile tilapia (Oreochromis niloticus).

Keywords : lactic acid bacteria, nile tilapia, Streptococcus agalactiae

PENDAHULUAN Salah satu komoditas perikanan budidaya air tawar populer saat ini ialah ikan nila (Oreochromis niloticus). Ikan nila disukai karena mudah dibudidayakan, laju pertumbuhan dan perkembang biakannya cepat, serta tahan terhadap gangguan hama dan penyakit (Sembiring, 2012). Selain dipelihara di kolam biasa seperti yang umum dilakukan, ikan nila juga dapat dibudidayakan di media lain seperti kolam air deras, keramba, sawah, dan tambak (air payau). Pada awalnya, ikan nila dianggap lebih tahan terhadap infeksi bakteri, parasit, jamur, dan virus dibandingkan dengan komoditas lainnya. Namun kini masalah penyakit kian marak menginfeksi ikan nila, terutama Streptococcosis dan Enterococcosis yang timbul akibat infeksi bakteri Streptococcus iniae, S. agalactiae dan Lactococcus garviae. Gejala yang ditimbulkan diantaranya mata menonjol (exopthalmia), septicemia, berenang lesu, hilang nafsu makan, berenang tidak normal dan berputar-putar dengan kepala menggantung (Evans dkk., 2002). Pengobatan penyakit yang diakibatkan oleh infeksi bakteri Streptococcus dapat diatasi dengan penggunaan antibiotik. Namun penggunaan antibiotik sering menimbulkan efek resistensi, meningkatkan virulensi bakteri, menimbulkan residu pada daging dan mencemari lingkungan (Widya, 2014). Untuk mengurangi ketergantungan penggunaan antibiotik, penggunaan probiotik sebagai imunomodulator dan antibakteri perlu dikembangkan. Probiotik pertama kali ditemukan oleh seorang peneliti Rusia bernama Metchnikoff. Ia mengemukakan bahwa bakteri akan masuk dan tinggal di usus, kemudian memberi pengaruh positif terhadap keseimbangan mikroflora usus dengan cara menurunkan efek racun dari bakteri yang merugikan di usus (Rusmiati dkk., 2008). Hal tersebut didukung oleh beberapa penelitian yang telah dilakukan, diantaranya oleh Camu dkk., (2007) yang mendapatkan hasil bahwa probiotik sebagai komponen nutrisi yang mengandung strain bakteri mampu memproduksi asam laktat dan asam asetat di usus sehingga dapat menekan pertumbuhan bakteri patogen. Selain itu, probiotik dapat menghalangi pertumbuhan dan aktifitas metabolik pelekatan sel bakteri enteropathogenic pada saluran pencernaan seperti Salmonella, Shigella, atau Vibrio cholerae, sehingga memiliki efek positif mencegah timbulnya penyakit (Soccoli dkk., 2010). Probiotik juga menghasilkan ion hidrogen yang akan menurunkan pH usus dengan memproduksi asam laktat sehingga menciptakan suasana yang tidak menguntungkan untuk pertumbuhan bakteri patogen (Leelavatcharamas dkk., 2011). Beberapa produk bakteri dengan sifat imunomodulator seperti lipopolisakarida (LPS), peptidoglikan dan lipoteichoic acid (LTA) dari Bifidobacteria dapat mengaktivasi makrofag

untuk membangkitkan respon imun (Sahalan dkk., 2013). Probiotik juga meningkatkan produksi sitokin antiinflamasi dan mengurangi produksi sitokin proinflamasi sehingga memperkuat barier mukosa usus (Rao dan Samak, 2013). Probiotik dapat diisolasi dari saluran pencernaan organisme, salah satunya ikan lele (Clarias batrachus). Menurut Naim dan Ahmed (2012), ikan lele merupakan organisme dengan komposisi mikroflora usus yang mampu meningkatkan respon imun inang dan mampu mengasimilasi karbon organik dari lingkungan sehingga ikan lele mampu hidup pada lingkungan ekstrim. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis potensi daya hambat dan imunogenik bakteri asam laktat sebagai biokontrol pengendali Streptococcosis. Hasil penelitian ini dapat digunakan sebagai bahan informasi pengembangan bakteri asam laktat sebagai probiotik. BAHAN DAN METODE Lokasi Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2013 hingga Maret 2014. Isolasi dan seleksi in vitro dilaksanakan di Laboratorium Parasit dan Penyakit Ikan. Pengujian secara invivo dilaksanakan di Laboratorium Hatcheri, Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan. Uji lisozim dilaksanakan di RS. Umum Pendidikan (RSUP) Universitas Hasanuddin. Uji respiratory burst dan fagositosis dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Hasanuddin. Alat dan Bahan Alat dan bahan yang digunakan pada penelitian ini yaitu: inkubator digunakan untuk menumbuhkan bakteri; spektrofotometer dan microplate reader digunakan untuk mengukur nilai absorban; aerator digunakan sebagai penyedia oksigen; akuarium digunakan sebagai wadah percobaan; spoit digunakan untuk mengambil darah ikan; ikan lele (Clarias batrachus) dan ikan nila (Oreochromis niloticus) sebagai sampel; de Mann Rogosa Sharpe Agar (MRSA), Glucose Yeast Peptone Agar (GYPA), Tryptic Soy Agar (TSA) dan Brain Heart Infussion (BHI) sebagai media tumbuh bakteri; paper disc digunakan sebagai parameter zona hambat; pakan breeder digunakan untuk makanan ikan, Buffer Peptone Water dan minyak ikan digunakan untuk campuran pakan.

Analisis Data Penelitian dilakukan secara eksperimen. Data isolasi, seleksi isolat melalui uji biokimia (pewarnaan Gram, Katalase, Oxidase, Motilitas, Indol, Ornitin, Produksi H2S, Lysine Iron Agar, Urease, Simons Citrat Agar, Arginine dihydrolisis, Methyl Red, Voges Proskauer, Fermentasi Karbohidrat, Ketahanan pH) dan aktivitas antimikroba dianalisis secara deskriptif, untuk menentukan kandidat probiotik. Aktivitas lisozim, letupan respirasi,

fagositosis dan sintasan dianalisis menggunakan One Way ANOVA dan diuji lanjut dengan uji LSD/Tukey untuk melihat pengaruh bakteri probiotik terhadap sistem kekebalan ikan.

HASIL Total bakteri asam laktat yang berhasil diisolasi adalah 11 isolat. Isolat L11, L12, L24, L32 dan L33 memiliki warna koloni putih susu dengan tepian bergerigi dan permukaan cembung. Isolat L21 dan L23 memiliki warna koloni kuning dengan tepian rata dan permukaan cembung. Isolat L14 dan L22 memiliki warna koloni kuning dengan tepian berombak dan permukaan cembung. Koloni isolat L31 berwarna kuning dengan tepian bergerigi dan permukaan cembung dan isolat L41 memiliki warna koloni putih susu dengan tepian berombak dan permukaan cembung. Aktivitas daya hambat tertinggi terhadap S.agalactiae ditunjukkan oleh isolat L22 dengan luas zona hambat 11 mm. Isolat yang diperoleh termasuk jenis bakteri Gram +, menghasilkan enzim katalase yang berfungsi mendegradasi bahan nutrisi menjadi bahan buangan, memiliki flagella untuk pergerakan sel, mampu menghidrolisis asam amino arginin yang memiliki kecenderungan basa yang cukup tinggi, mampu memfermentasi glukosa dan menghasilkan

berbagai produk yang

bersifat

asam sehingga mampu menurunkan pH

mencapai 5,00, menghasilkan asam-asam organik (seperti asam laktat, format, asetat), dengan tidak disertai pembentukan gas serta mampu bertahan pada pH 6. Berdasarkan hasil tersebut diduga bahwa isolat BAL yang diperoleh adalah Bacillus sp. Pemberian pakan probiotik mampu meningkatkan imunitas ikan nila dengan p<0,05. Aktivitas lisozim tertinggi terdapat pada perlakuan D (BAL 30 x 108 CFUmL-1) sebesar 239,29 EumL-1, kemudian perlakuan B (BAL 12 x 108 CFUmL-1) sebesar 234,52 EumL-1, perlakuan C (BAL 24 x 108 CFUmL-1) sebesar 223,02 EumL-1, dan terendah pada kontrol (A) sebesar 213,89 EumL-1 (Gambar 1). Aktivitas NBT pada pada perlakuan A (kontrol) sebesar 0,14 , perlakuan B sebesar 0,17, perlakuan C sebesar 0,16, dan perlakuan D sebesar 0,15. Hasil uji statistik menunjukkan pengaruh yang tidak berbeda nyata antar perlakuan dengan p>0,05. Aktivitas fagosit pada perlakuan A (kontrol) sebesar 12%, perlakuan B sebesar 14%, perlakuan C sebesar 13%, dan perlakuan D sebesar 14%. Hasil uji statistik menunjukkan pengaruh yang tidak berbeda nyata antar perlakuan dengan p>0,05. Data sintasan ikan nila yang diuji tantang dengan bakteri patogen Streptococcus agalactiae diperoleh sebesar 80% pada kontrol, 86,67% pada perlakuan B, serta 100% pada

perlakuan C dan D. Hasil uji statistik menunjukkan pengaruh yang tidak berbeda nyata antar perlakuan dengan p>0,05.

PEMBAHASAN

Penelitian ini mendapatkan isolat BAL yang diidentifikasi sebagai Bacillus sp. Bacillus ini berpotensi menghambat perkembangan bakteri Streptococcus agalactiae penyebab Streptococci dengan zona hambat sebesar 11 mm. Bacillus ini juga efektif meningkatkan respon imun non spesifik ikan nila yaitu kemampuan enzim lisozim dalam melisis dinding sel bakteri patogen dengan nilai aktivitas sebesar 239,29 EumL-1 Menurut Mahdhi dkk., (2011), Bacillus diketahui berpotensi sebagai probiotik karena mampu meningkatkan kemampuan imunogenik organisme dengan tetap hadir dalam saluran usus selama beberapa hari, aktif selama usus berkontraksi, berpartisipasi dalam proses pencernaan, menghambat perkembangan bakteri patogen, dan menciptakan lingkungan yang sehat. Jenis senyawa antibakteri yang dihasilkan Bacillus juga teridentifikasi sebagai bacitracin, gramicidin, polimiksin, dan tyrothricin, yang aktif menghambat berbagai bakteri gram positif maupun gram negatif. Karakteristik seleksi kandidat bakteri probiotik adalah melihat kemampuan bakteri dalam mensekresi senyawa metabolit sekunder. Senyawa tersebut berfungsi untuk menghambat perkembangan bakteri patogen. Menurut Jahja dkk., (2012), senyawa antibakteri bekerja dengan cara mengganggu komponen penyusun dinding sel, bereaksi dengan membran sel sehingga mengakibatkan peningkatan permeabilitas yang menyebabkan hilangnya komponen penyusun sel, menginaktifkan enzim esensial yang berakibat pada terhambatnya sintesis protein dan destruksi atau kerusakan fungsi material genetik. Parameter imunogenik yang diamati setelah pemberian bakteri asam laktat pada pakan ialah aktivitas lisozim, letupan respirasi, aktivitas fagositosis dan sintasan. Berdasarkan hasil penelitian, pemberian BAL efektif meningkatkan laju aktivitas lisozim. Besarnya nilai aktivitas lisozim menunjukkan bahwa terjadi peningkatan respon imun. Cara kerja enzim lisozim ialah melisis dinding sel bakteri seperti menghidrolisis jenis asam N-asetilglukosamin dan N-acetylmuramic pada peptidoglikan, sehingga dengan hilangnya dinding sel, bakteri akan mati (Paulsen dkk., 2003). Namun lisozim kurang aktif berperan pada bakteri Gram negatif karena kandungan peptidoglikan di dalam selnya kurang melimpah dibandingkan bakteri Gram positif (Ibrahim dkk., 2001). Besarnya nilai letupan respirasi menunjukkan kondisi ikan yang sedang terinfeksi bakteri. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ikan nila yang diberi perlakuan probiotik

dengan ikan yang tidak diberi perlakuan diperoleh hasil yang tidak berbeda nyata. Hal ini diduga karena neutrofil merupakan sel yang dominan berperan dalam aktivitas NBT. Cara kerja neutrofil yang cepat dan tidak tahan lama, bertolak belakang dengan aktivitas fagosit yang cenderung lambat namun dapat memfagosit berulang-ulang (Gopalakannan dan Arul, 2006). Oleh karena sampel darah tidak dapat diukur NBT-nya dalam waktu singkat maka kemungkinan neutrofil sudah menurun sehingga aktivitas NBT yang terukur tidak maksimal. Aktivitas fagosit merupakan aktivitas sel-sel fagosit untuk melakukan fagositosis dengan melibatkan sel mononuklear (monosit dan makrofag), granulosit (neutrofil) dan limfosit. Aktivitas fagosit pada ikan akan meningkat seiring dengan meningkatnya imunitas. Peningkatan imunitas dapat dipicu oleh pemberian imunomodulator yang tepat, salah satunya ialah probiotik. Hasil penelitian pemberian probiotik terhadap aktivitas fagosit ikan nila memberikan hasil yang tidak berbeda nyata. Hal ini disebabkan cara kerja BAL yang spesifik meningkatkan aktivitas imunogenik tertentu. Menurut Marzouk dkk., (2008), BAL mampu secara efektif meningkatkan aktivitas fagositosis jika satu jenis BAL dicampur dengan jenis lainnya. Hal ini ia buktikan dalam penelitiannya menggunakan probiotik mix antara Saccharomyces cervisae dan Bacillus Subtilis, dan mendapatkan hasil aktivitas fagositosis kontrol sebesar 1,9 % sedangkan perlakuan probiotik mix sebesar 73,9 %. Untuk meningkatkan sintasan, penggunaan imunostimulan merupakan metode potensial dalam meningkatkan respon bawaan/non spesifik dalam merespon patogen. Berdasarkan hasil penelitian, data sintasan ikan nila dengan pemberian imunostimulan BAL jenis Bacillus menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata. Hal ini diduga karena bakteri Bacillus bekerja spesifik meningkatkan respon imun. Walaupun penelitian menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata, gejala klinis Streptococci masih dapat diamati seperti timbulnya haemorrhage, perut cekung, opacity kornea, pembengkakan perut (dropsy) serta necrosis pada sirip caudal, anal, dan ekor. KESIMPULAN DAN SARAN

Berdasarkan hasil pembahasan diketahui bahwa jenis BAL yang didapatkan adalah Bacillus sp. dengan zona hambat terhadap Streptococcus agalactiae sebesar 11 mm, yang mampu meningkatkan laju aktivitas lisozim (p<0,05). Saran yang diberikan, pada penelitian lebih lanjut, diperlukan uji histopatologi untuk mendiagnosa fungsi dan kondisi jaringan yang terinfeksi bakteri Streptococcus.

DAFTAR PUSTAKA

Camu Nicholas., Tom De Winter., Kristof Verbrugghe., Ilse Cleenwerck., Peter Vandamme., Jemmy S. Takrama., dkk., (2010). Dynamics and biodiversity of populations of lactic acid bacteria and acetic acid bacteria involved in spontaneous heap fermentation of cocoa beans in ghana. Vrije Universiteit Brussel. Brussel. Appl. Environ. Microbiol, 73 (6) : 1809-1824 Evans J., Klesius P., Gilbert P., Shoemaker C., Al-Sarawi M., Landsberg J., dkk., (2002). Characterization of B-haemolytic Group B Streptococcus agalactiae in cultured seabream, Sparus auratus L., And Wild Mullet, Liza Klunzingeri. Kuwait. Journal of Fish Diseases, 25: 505–513. Gopalakannan A & V. Arul. (2006). Immunomodulatory effects of dietary intake of chitin, chitosan and levamisole on the immune system of Cyprinus carpio and control of Aeromonas hydrophila infection in ponds. Aquaculture, 255: 179–187. Ibrahim H.R., Matsuzaki T. & Aoki T. (2001). Genetic evidence that antibacterial activity of lysozyme is independent of its catalytic function. FEBS Lett. 506 : 27–32 Jahja Fadhilla., Hilal Anshary & Siti Aslamyah. (2012). Isolation and test inhibition of lactic acid bacteria from digestive tract of nile tilapia (Oreochromis niloticus) toward Streptococcus iniae. Universitas Hasanuddin. Makassar Leelavatcharamas V., Arbsuwan N., Apiraksakorn J., Laopaiboon P & Kishida M. (2011). Thermotolerant bacteriocin producing lactic acid bacteria isolated from thai local fermented foods and their bacteriocin productivity. National Institutes of Health. USA. Biocontrol Sci, 16 (1) : 33-40 Mahdhi Abdelkarim., Fathi Kamoun & Amina Bakhrouf. (2011). Inhibitory activity and adhesive ability of potential probiotic Bacillus species to confer protection for Artemia culture against pathogenic Vibrio spp. University of Monastir. Tunisia. Marzouk M.S., M.M. Moustafa & Nermeen M. Mohamed. (2008). Evaluation of immunomodulatory effects of some probiotics on cultured Oreochromis niloticus. Faculty Of Veterinary Medicine. 8th International Symposium On Tilapia In Aquaculture, p.1043 Naim Uddin & Ahmed H. Al Harbi. (2012). Bacterial flora of polycultured common carp (cyprinus carpio) and african catfish (Clarias gariepinus). Natural Resources and Environment Research Institute. Saudi Arabia. International Aquatic Research, 4:10. Paulsen S.M., Lunde H., Engstad RE. & Robertsen B. (2003). In vivo effects of β-glucan and LPS on regulation of lysozyme activity and MRNA expression in atlantic salmon (Salmo salar L.). Fish And Shellfish Immunology, 14 (1) : 39-54. Rao R. K. & G. Samak. (2013). Protection and restitution of gut barrier by probiotics nutritional and clinical implications. National Institutes Of Health. USA. Curr Nutr Food Sci, 9 (2) : 99–107. Rusmiati Dewi., Sulistiyaningsih., Tiana Milanda & Sri Agung Fitri Kusuma. (2008). Penyuluhan pentingnya konsumsi yoghurt dan metode pembuatannya dengan cara sederhana dalam rangka peningkatan derajat kesehatan dan ekonomi masyarakat di kelurahan sukaluyu kota Bandung. Universitas Padjajaran. Bandung Sahalan Ahmad Zorin., Abdul Hamid Abd. Aziz, Hing Hiang Lian & Mohamed Kamel Abd. Ghani. (2013). Divalent cations (Mg2+, Ca2+) protect bacterial outer membrane damage by polymyxin. Kebangsaan Malaysia University. Malaysia. Sains Malaysiana 42 (3) : 301–306 Sembiring Albert. (2012). Kemampuan bakteri antagonistik dalam menghambat infeksi Saprolegnia sp. pada ikan nila (Oreochromis niloticus). Universitas Sumatera Utara. Medan

Soccoli Carlos Ricardo., Luciana Porto de Souza Vandenberghe., Michele Rigon Spier., Adriane Bianchi Pedroni Medeiros., Caroline Tiemi Yamaguishi., Juliano De Dea Lindner., dkk., (2010). The potential of probiotics. State University of Santa Catarina. Brazil. ISSN 1330-9862 Widya D.R. (2014). Alternatif penggunaan obat alami dengan ekstrak biji teratai (Nymphaea pubescens L.). Universitas Sumatera Utara. Medan

Aktivitas lisozim (EU/mL)

Lampiran

250.0000 245.0000 240.0000 235.0000 230.0000 225.0000 220.0000 215.0000 210.0000 205.0000 200.0000 195.0000

239,29 ± 5,14 234,52 ± 2,57

b

223,02 ± 4,05 213,89 ± 6,83

A

b

a

a

B

C

D

Perlakuan (CFUmg-1/kg diet)

Gambar 1. Aktivitas lisozim ikan nila (Oreochromis niloticus) setelah pemberian BAL