Begeleidingsformulier aanvraag dierproef DEC- UM Herziene versie
Versie 2006
DEC datum goedkeuring^
Iypeaanvraag2
27-02-2012
Nieuw / Herz. versie / Pilot
Hoofdproject
[Deelproject
DECNR: 2011-162
CARJM
NUTRIM
| 1. 2. 3.
11. 2. 3. 4.
Ontvangen; 09-02-2012 VROM/GGONR3
Hersenen en
GROW
biomaterialen
LNV/CBDNR4
Ander UM
l Geen UM
1. 2. 3.
Financieel beheerder
Budgetnummer
30973626B
Titel van het onderzoek: Effecten van centrale toediening van een TrkB agonist op lange-termijn geheugen bij ratten
startdatum | December 2011 Naam
[ einddatum9 | December 2015~] Tel (+ Tel privé enkel VO, VVO en
E-mailadres
Cap. groep /afdeling
Art.9 Art.9
Art.9 Art 12 Art9 Art.9/12^ Anders6:
5.
* VhU-coderingen zie bijlage
mnd
Bevoegdheid5
l .Verantwoordelijk onderzoeker (VO) 2. Vervanger VO (WO) 3. Verantwoordelijk medewerker (VM) GGO7 4. overige uitvoerenden
Diergroep ctrl/exp/sham Diersoort Stam Construct / mutatie ? Herkomst (leverancier) * Aantal Geslacht Dieren immuuncompetent ? Leeftijd/gewicht Doel van de proef * Belang van de proef * Toxicologisch onderzoek * Bijzondere technieken * Anesthesie * Pijnbestrijding * Mate ongerief * Toestand dier einde exp*
Duur van de proef10:
1 Exp 02
.
.
Wistar
Nee 02 30 Man ja lOw 32 01 01 01 04 04 04 01
'
'
f/erantwoording Aanvraag dierproef DEC-UM
(kaders zijn licht flexibel, maar het geheel is max. 5 pag.
nov.'OS)
Titel: Effecten van perifere toediening van een TrkB agonist op lange-termijn geheugen bij ratten. 1. Doel van de proef. In het voorgestelde project willen we de effecten van een testsubstantie, 7,8-Dihydroxyflavone, onderzoeken in een object herkenning taak bij jong-volwassen ratten. BDNF en de belangrijkste receptor van BDNF, TrkB, worden tegenwoordig aanzien als een interessant target in de ontwikkeling van medicatie voor o.a. cognitieve dysfuncties zoals Alzheimers dementie. Bovendien zijn de cellulaire mechanismen die aan grondslag liggen van niet-pathologisch leren niet volledig doorgrond; de precieze rol en werking van BDNF zijn niet gekend. Wij willen de eerste selectieve TrkB agonist, 7,8-Dihydroxyflavone, toetsen in een geheugentaak in ratten, om de effecten ervan op geheugen te evalueren en zo een duidelijker beeld krijgen van het belang van BDNF in geheugenvorming. We willen bovendien meer te weten komen over welke moleculaire processen essentieel zijn in de effecten van BDNF-gemedieerde geheugenverbetering. Anderzijds zullen we met deze studie de mogelijke klinische relevantie van TrkB agonisten beter kunnen inschatten. 2. Maatschappelijke relevantie en/of wetenschappelijk belang Dit project heeft een wetenschappelijk karakter. Deze studie is waardevol voor het begrijpen van de cellulaire processen onderliggend aan geheugen. Deze informatie is van grote waarde zijn in het onderzoek naar de neurobiologische mechanismen die ten grondslag liggen aan leren en geheugen. Tevens is deze studie maatschappelijk relevant, aangezien het vergrootte inzicht in deze mechanismen mogelijk kan leiden tot de ontwikkeling van medicatie die de ouderdomsgerelateerde cognitieve dysfuncties en in het bijzonder dementie (bijvoorbeeld Alzheimers dementie) kan verbeteren of de achteruitgang van deze functies kan tegengaan.
3. Alternatieven De voorgestelde studie kan niet bij mensen worden uitgevoerd omdat deze technieken (in het bijzonder de herhaaldelijke hippocampale toediening van substanties) niet bij mensen kunnen worden toegepast. Verder zijn er tot op heden geen andere testmethoden voorhanden die op voorhand de mogelijke cognitieve werking van substanties kan voorspellen op grond van, bijvoorbeeld, in vitro technieken. Dit type onderzoek is vooralsnog de enige methode om de mogelijke werking van substanties op geheugenfuncties te onderzoeken. Er worden ratten gebruikt omdat dit een vergelijk mogelijk maakt met eerdere studies die uitgevoerd zijn met substanties met een vergelijkbaar werkingsmechanisme (op basis van eerdere studies).
4. Ethische afweging Gezien het grote maatschappelijke belang van het begrijpen van normale en pathologische geheugenvorming, en het gebrek mn alternatieven die ons vergelijkbare inzichten kunnen geven, zijn wij van mening dat het voorgestelde experiment opweegt tegen het gebruik van de dieren zoals beschreven in deze aanvraag.
2
M/etenschap
5. Wetenschappelijke onderbouwing Eén van de meest prominente aspecten van de ziekte van Alzheimer is de achteruitgang in cognitieve vaardigheden en in het bijzonder geheugenfuncties. Deze achteruitgang heeft grote negatieve consequenties voor de patiënt zelf maar zeker ook voor zijn/haar directe omgeving. Ondanks dat deze cognitieve problematiek slechts een onderdeel is van dit complex ziektebeeld, kan worden gesteld dat een verbetering van deze cognitieve functies bij Alzheimerpatiënten tot een betere levenskwaliteit zou leiden. Voor de behandeling van cognitieve stoornissen zijn op dit moment verschillende cholinesterase remmers (en recentelijk een partiële NMDA antagonist, memantine) op de markt verschenen (Bartus et al, 1982; Lleo, 2006; Hansen et al. 2008). Echter, deze behandeling heeft een relatief klein effect op geheugen in verhouding met de eerder ernstige bijwerkingen. Uit ander onderzoek blijkt bovendien dat het werkingsmechanisme van cholinesterase remmer, i.e. verhogen van beschikbare acetylcholine, niet de beste manier zou zijn om geheugenfuncties te verbeteren (Lleo, 2006). Momenteel wordt er dan ook veel onderzoek verricht naar het identificeren van neurotransmitters of andere stofjes die van belang zijn voor het opslaan van herinneringen. In vorige studies hebben we d.m.v. het toedienen van phosphodiesterase (PDE) remmers het belang van cAMP- en cGMP-gemedieerde cascades in de hippocampus voor de vorming van lange-termijn geheugen aangetoond (DEC 2007-112). Een belangrijk gevolg van deze moleculaire cascades is de aanmaak van nieuwe proteïnen, waaronder brain derived neurotrophic factor (BDNF). Als neuronale groeifactor is BDNF betrokken in neuronale overleving, groei en plasticiteit. Er zijn sterke indicaties dat BDNF en de binding van BDNF op de tyrosine receptor kinase B (TrkB), een belangrijke rol spelen in hippocampale consolidatie van het geheugen. Recent werd 7,8Dihydroxyflavone geïdentificeerd als eerste selectieve agonist van TrkB (Jang et al., 2010). Met deze stof kunnen we dus activiteit van BDNF simuleren. We hebben in een vorig experiment (DEC 2010-195) kunnen aantonen dat centrale toediening van 7,8-DHF leidt tot een verbeterde geheugenconsolidatie in vroege en late fases van het leerproces. Om te ontdekken welke de belangrijkste processen zijn die TrkB fosforylatie activeert om geheugenvorming te verbeteren en de effectiviteit van systemische 7,8-DHF behandeling te evalueren, willen we perifere toediening van 7,8-DHF combineren met remmers van mogelijke "downstream-targets". Specifiek zijn we geïnteresseerd in de rol van PKA en proteine synthese. De remmers voor deze processen kunnen enkel centraal toegediend worden, gezien er non-specifieke effecten zouden optreden en onze interesse bij het begrijpen van hippocampale geheugenprocessen ligt. We hopen dat deze studie enerzijds beter inzicht zal geven in de hippocampale processen die ten grondslag liggen aan geheugen en meer specificiek duidelijkheid zal verschaffen in de onderliggende werkingsmechanismen van BDNF in de hippocampus. Anderzijds is het aangetoond dat BDNF een positief effect heeft op Alzheimer pathologie (Nagahara et al., 2010). 7,8-DHF is in dat opzicht een mogelijke nieuwe behandelingsmogelijkheid, in het bijzonder gezien het gunstige farmacokinetische profiel dat systemische (orale) behandeling mogelijk zou maken. 6. Wetenschappelijke beoordeling Deze studie te een onderdeel van een PhD project. Dit protocol te wetenschappelijk beoordeeld en goedgekeurd door de PI.
3
firoefdier
7. Proefdier keuze 7a. Soort, stam / herkomst / eindbestemming In deze studie zal gebruik gemaakt worden van 3 maanden oude mannelijke Wistar ratten (Charles River). We kiezen voor de 3 maanden oude Wistar ratten omdat deze ook in onze voorgaande experimenten werden gebruikt. We willen dan ook de vergelijkbaarheid van deze studie en vorige experimenten met farmacologische substanties om het lange termijn geheugen te onderzoeken (DEC 2010-195), optimaal houden. We hebben eerder ervaring opgedaan met stamverschillen in de object herkenning taak (Lewis ratten doen dit bijvoorbeeld heel wisselvallig). 7b. Sexe We willen gebruik maken van mannelijke ratten aangezien we dit ook in de eerdere projecten hebben gedaan waardoor we weten welke condities gekozen dienen te worden voor het testen van het geheugen. De prestatie van vrouwtjes ratten is in de taak afhankelijk van de cyclus en daarom is deze taak minder geschikt om zowel mannelijke en vrouwelijke, of enkel vrouwelijke ratten te gebruiken. Bovendien kennen we de prestatie van deze dieren (4 maanden oude mannelijk Wistar ratten) in deze taak. Daarmee is een vergelijking met eerdere studies mogelijk. 7c. Aantallen We willen onderzoeken wat de het effect is van farmacologische manipulaties in de hippocampus in de ORT test. Daarom gebruiken we dieren die canules in de hippocampus krijgen. We veronderstellen een verschil in gemiddelde van 0.25 en een spreiding van 0.3 te vinden. Deze gegevens baseren we op data van vergelijkbare studies (dieren met canules in ORT). Het betreft een within design waarin alle dieren elke conditie ondergaan, De poweranalyse (power 80%) toont in dit geval het volgende: n = 15.7 * (0.3/0.25)2 = 23. We moeten daarenboven rekening houden met een aantal uitvalfactoren. Een eerste factor is het exploratie gedrag. In vorige studies bleek dat een klein aantal van de dieren onvoldoende exploratie vertoonden in de ORT en daardoor uit het experiment moesten genomen worden, in praktijk wil dit zeggen dat dieren die consequent minder dan 7 seconden exploreren in de ORT niet gebruikt kunnen worden. De plaatsing van canules is een andere risicofactor voor uitval gedurende het experiment. Canules kunnen verstopt of geïnfecteerd raken, en verkeerd geplaatst zijn (e.g. niet in de hippocampus), Ook deze dieren kunnen niet verder deelnemen aan het experiment. We trachten deze uitval te reduceren door de operaties zo accuraat en aseptisch mogelijk te verrichten. Het nJ0t meer kunnen injecteren van een dier omwille van een verstopping of pi|n rondom de canute (infectie) zutten ir» dft geval redenen zij n om het dier u it experiment ie halen Uit ervaring met vergeJIJkbare experimenten weten we dat we om een groep van 23 ratten te bekomen rekening moeten houden meteen uitval. Het Mate aantal ratten dat nodig te voor deze studie rekening houdend met de power-anaiyse én met de mogelijke uitval door exploratie of canuleplaatsing Is 30. We hebben nameWjk in het verleden ervaren dat ongeveer 4 dieren (± 12,5 %) ten gevolge van canute plaatsing, en ongeveer 3 dieren (± 10 %) door verminderde exploratie.
4 Dierproef 8. Experiment Praktische uitvoering van proef In de object herkenningstaak (ORT) worden de ratten 3 min in een cirkelvormige arena (doorsnede 83 cm en 40 cm hoog) gezet waarin twee identieke objecten staan. Een rat kan dan vrij exploreren en zal een gedeelte van de tijd aan de objecten snuffelen/exploreren. Het gedrag, i.e., de duur van contact aan de afzonderlijke voorwerpen, wordt door een geoefend persoon gescoord en opgeslagen op een PC. Als de dieren 1 uur later in dezelfde arena worden gezet met twee objecten waarvan 1 nieuw is en het andere hetzelfde object dat in de eerste 3 min ook aanwezig was, zal een rat meer tijd aan het nieuwe object snuffelen. Als echter 6 of 24 uur verstrijkt tussen de twee testfasen, zal een dier in de tweede testfase minder goed (na 6 uur) of niet (na 24 uur) discrimineren tussen het bekende en onbekende object. Het wordt aangenomen dat dit te maken heeft met het geheugen (object herkenning/geheugen): Na 24 uur is een rat vergeten welk object in de eerste testfase aanwezig was. Dit gedrag is vrij stabiel en kan herhaaldelijk getest worden. In dit experiment zullen we een interval van 24 uur aanhouden tussen de testfasen in de ORT, om de processen onderliggend aan lange-termijn geheugen te onderzoeken. Na twee weken van training in de ORT zal onder volledige narcose (volgens SOP, maar afwijkingen zijn mogelijk afgaande op de geobserveerde diepte van de anesthesie) met behulp van een stereotactische operatie de canules worden geïmplanteerd. Voor de praktische en algemene handelingen gedurende de stereotaktische procedure verwijzen we naar de bijgevoegde SOP-PSY01. Na minstens een week revalidatie zal 7,8-DHF worden toegediend in de hippocampus en de effecten op het geheugen worden onderzocht. De volgende condities zullen in eerste instantie onderzocht worden: Experimentele conditie
Controle conditie Vehicle (0,5% tylose; 4% tween)
moment injectie Oh na eerste testfase 3h 6h
moment injectie TrkB agonist Oh (7,8-DHF; 1 en 3 mg/kg) 3h 6h
Indien we geheugenverbetering observeren in één of meerdere van bovenvermelde experimentele condities, zullen we op dat tijdstip de behandeling in een suboptimale dosis combineren met een PKA remmer (Rp-8-Br-cAMPS 1 ug/hippocampus) en/of een proteine synthese remmer (anisomycin 80 ug/hippocampus). Ook de bijhorende vehicle condities (saline) zullen in dat geval worden getest. Doseringen van de toegediende stoffen zijn gebaseerd op eerdere studies binnen onze groep of op relevante en vergelijkbare rapporteringen in wetenschappelijke literatuur. Alle experimenten worden blind uitgevoerd, d.w.z. de gedragsonderzoeker zal blind zijn voor de te onderzoeken testcondities. Na het experiment zullen we de dieren perfunderen met PBS. Eén helft van het brein zal worden nagefixeerd om de morfogie te bestuderen. De andere helft van het brein wordt gebruikt voor biochemische bepalingen.
De onderstaande figuur geeft een indicatie van het tijdsverloop van het experiment in weken. Vanzelfsprekend geldt deze tijdslijn voor beide groepen dieren.
5
6
7 i a f» iioiiiii2H3ii4l|| Start experimentele condities
weken» l Perfusie
'Herstel Operaties Training ORT
9. Experimentele condities 9a. Anesthesie Anesthesie zal tijdens de stereotaktische operatie worden aangewend zoals in het bijgevoegde SOP beschreven is. 9b. Pijnbestrijding
Zoals Jn de bijgevoegde SOF beschreven is, zullen de dieren een half uur voor de operatie met Temgesic (0.05 mg/kg) worclen behandeld. De eerste twee dagen na de operatie zat het weteijn vin de dieren regelmatig ge-evalüeerd worden, en indien nodig zal de behandeling met Temgesic herhaaW worden (0.01-0.05 mg/kg om de 8-12 uur). 9c. Euthanasie en Humane eindpunten Euthanasie: De dieren worden aan het einde van de proef in een diepe narcose gebracht met pentobarbital (100 mg/kg, i.p.) en daarna perfundeerd met PBS. Humane eindpunten: In de vele eerdere experimenten die we gedaan hebben is nooit iets voorgevallen. Het kan dat dieren vanwege de operatie (infectie canule), de herhaalde injecties of andere redenen ziek worden. Gedurende het gehele experiment zal een ongerief dagboek bijgehouden worden. Als er buitengewoon zwaar of onverwacht ongerief optreedt, zal in samenspraak met de dierenarts (artikel 14) bepaald worden of additionele pijnbestrijding dan wel euthanasie gewenst is. Wanneer een dier niet meer kan worden getest in de ORT (bijvoorbeeld ten gevolge van de operatie of verstopping van de canule) zal het dier worden ge-euthanaseerd middels decapitatie.
Zorg 10a. Ongerief De operatie en het ondergaan van algehele narcose dient als matig/ernstig ongerief (code 4) te worden ingeschat. Dit zal vooral na de operatie zijn (1 a 2 dagen). De verdere handelingen (i. e. perifere injecties (oraal), centrale injecties en eenmalige i. p. injectie alvorens het doden van de dieren middels perfusie aan het einde van de proef), worden voor het dier als matig ongerief (code 3) beoordeeld. De toegediende stoffen hebben geen irriterende werking en hebben geen invloed op het welbevinden van het dier. Dit is ook niet wenselijk omdat anders de dieren niet getest kunnen worden in de gedragsopstelling. Het individueel huisvesten van dieren dient als matig/ernstig (code 4) ongerief ingeschat te worden aangezien ratten sociale dieren zijn. Voor beide groepen geldt dan ook: Individueel huisvesten Operatie onder narcose Injecties (centr/perifeer)
Sociale deprivatie Stress / pijn Fixatie / pijn
Ernst Matig/ernstig
Duur/ Frequentie Gedurende het volledige experment
Matig/ernstig Matig
Éénmalig, eerste dagen na operatie 2 x per week tijdens de training (enkel perifeer) en de experrnentele condities Eenmalige i.p. injectie voor perfusie
Totaal ongerief voor beide groepen = matig tot ernstig
lOb. Weizijnsevaluatie Dit soort studies zijn veelvuldig uitgevoerd en we hebben niet de indruk dat de dieren veel ongerief hebben tijdens het testen en het toedienen van de farmaca bij de dieren. Tijdens deze studie zal zoals altijd het welzijnsdagboek bijgehouden worden.
11. Verzorging en huisvesting Alle ratten zullen individueel gehuisvest worden totdat het experiment is afgerond. De ratten zullen op een omgekeerd dag/nacht cyclus gehouden worden. In een controle studie hebben we aangetoond dat sociaal gehuisde ratten slechter presteerden in de ORT dan individueel gehuisveste dieren (DEC 2006-138). Vandaar dat we zoals gebruikelijk bij deze studies opteren voor individuele huisvesting. We verkiezen de dieren normaal voer te geven, ondanks de variabele inhoud aan flavonoides. We hebben een vehicle conditie die controleert voor deze factor, en we willen zoveel mogelijk testomstandigheden standardiseren om de vergelijkbaarheid met vorige studies in onze groep optimaal te houden.
12. Deskundigheid Onze groep heeft veel ervaring met de procedures zoals beschreven in dit protocol.
13. Standard Operation Procedures (SOP) Zie bijgevoegde SOP voor anesthesie en stereotactische plaatsing van canules.
Relevante literatuur Bartus, R. T., Dean, R. L., Beer, B., & Lippa, A. S. (1982). The cholinergic hypothesis of geriatrie memory dysfunction. Science, 217, 408-417. Blokland, A. (1995). Acetylcholine: a neurotransmitter for learning and memory? Brain Research Reviews, 21, 285-300. Buccafusco, J. J., Letchworth, S. R., Bencherif, M., & Lippiello, P. M. (2005). Long-lasting cognitive improvement with nicotinic receptor agonists: mechanisms of pharmacokinetic-pharmacodynamic discordance. Trends in Pharmacological Science, 26, 352-360. Choi, D. C., Maguschak, K. A., Ye, K., Jang, S., Myers, K. M., and Ressler, K. J. (2010) Prelimbic cortical BDNF is required for memory of learned fear but not extinction or innate fear PNAS, 107, 2675-2680. Hagan, J. J., & Morris, R. G. M. (1988). The cholinergic hypothesis of memory: a review of animal experiments. In L. L Iversen, S. D. Iversen & S. H. Snyder (Eds.), Handbook of psychopharmacology (Vol. 20, pp. 237-305). New York: Plenum Press. Hansen, R.A., Gartlehner G., Webb, A. P., Morgan, L. C., Moore, C. G., and Jonas D. E. (2008) Efficacy and safety of donepezil, galantamine, and rivastigmine for the treatment of Alzheimer's disease: A systematic review and meta-analysis. Clin Interv Aging, 3(2): 211-225. Jang S., Liu, X., Yepes, M., Shepherd, K. R., Miller, G. W., Liu, Y., Wilson, D., Xiao, G., Blanchi, B.,
Sun, Y. E. and Ye, K. A selective TrkB agonist with potent neurotrophic activities by 7,8-dihydroxyflavone. PNAS, 107, 2687-2692. Lleo, A., Greenberg, S.M. and Growdon, J. H. (2006). Current pharmacotherapy for Alzheimer's disease. Ann Rev Med, 57, 513-533. Nagahara, A. H.,, Merrill D. A.,, Coppola, G., Tsukada, S., Schroeder, B. E., Shaked, G. M., Wang, L., Blesch, A., Kim, A., Conner, J. M., Rockenstein, E., Chao, M.V., Koo, E. H., Geschwind, D., Masliah, E., Chiba, A. A. and Tuszynski, M. H. (2009) Neuroprotective effects of brain-derived neurotrophic factor in rodent and primate models of Alzheimer's disease. Nature Medicine 15(3):331-7. Reneerkens, O., Rutten, K., Steinbusch, H., Blokland, A., Prickaerts, J. (2008) Selective phosphodiesterase inhibitors: a promising target for cognition enhancement. Psychopharmacology (Berl), DOI 10.1007/s00213-008-1273-x Rutten K, Prickaerts J, Hendrix M, van der Staay FJ, Sik A, Blokland A (2007) Time-dependent involvement of cAMP and cGMP in consolidation of object memory: Studies using selective phosphodiesterase type 2, 4 and 5 inhibitors. European Journal of Pharmacology 558: 107-112
Bijlage I: Standard Operation Procedures (SOP) Standard Operating Procedure: Stereotaktische operatie
Nummer: SOP-PSY01 Versie: 14 Datum: 15 november 2010 Auteur:
Inleiding Indien een onderzoeksvraagstelling verlangt dat een gedefinieerde kern in de muizenhersenen chemisch, biologisch (DNA plasmide) of farmacologisch wordt geprikkeld, of dat er een afleiding van hersenpotentialen wordt gemeten, kan dit worden gedaan met behulp van Stereotaktische procedures. De muishersenen zijn in kaart gebracht (e.g., Paxinos & Franklin, The mouse brain in stereotaxic coordinates, 1997). Nadat de kop van de muis/rat in de gewenste positie in de stereotakter is gebracht, biedt het coördinatenstelsel van de hersenatlas de mogelijkheid de exacte positie van de verschillende gebieden te bepalen. De positiebepaling van de hersengebieden kan gedaan worden vanuit drie referentiepunten, i.e., het bregma, het lambda, of de interauraal lijn. Deze referentiepunten kunnen alleen gebruikt worden indien de muis/rat tijdens de operatie gefixeerd is, en de positie van de manipulatorarm (met daaraan vastgemonteerd een, ijknaald, spuit, electrode, of canule) en het referentiepunt ten opzichte van elkaar hetzelfde blijft. De manipulatorarm is aan het fixatie gedeelte verbonden, en het totale apparaat wordt een stereotakter ('stereotactic frame') genoemd. Deze methode kan ook gebruikt worden voor het plaatsen van elektrodes, waarmee de hersenactiviteit gemeten kan worden. De mate van ongerief is 4.
Anaesthesie en analgesie bij operatie De verwachting is dat de proefdieren minimaal zullen lijden als gevolg van de Stereotaktische operatie. Om toch een mogelijke pijncomponent te bestrijden zullen de dieren voor de operatie, evenals 8 uur na de operatie, een injectie krijgen met Temgesic (muis 0.1 mg/kg, rat 0.05 mg/kg, s.c.). De Stereotaktische operatie wordt onder algehele narcose uitgevoerd. Om de muis/rat onder narcose te krijgen wordt ze in een inductie kastje gezet met een gasmengsel van lucht en isofluraan (4%). Als de muis/rat onder narcose is, wordt een narcose masker aangebracht om de narcose te onderhouden met het gasmengsel (2,5% isofluraan). Voordat de muis/rat in de stereotacter gefixeerd wordt, dient de reflex die optreedt na het knijpen in de tenen verdwenen te zijn. Narcose wordt ook in de stereotakter onderhouden via het narcose masker. De ogen zullen met oogzalf worden behandeld om zodanig uitdroging te voorkomen. Ook zal gekeken worden of de ademhaling diep en regelmatig is (ook na toediening van matige pijnprikkel. Aangezien het periost wordt verwijderd op de schedel, zal tevens locaal lidocaine op de wond worden toegediend. Vlak voor de operatie zullen de dieren een injectie
krijgen met Temgesic (muis: 0,1 mg/kg, rat: 0.05 mg/kg, s.c.). De behandeling met Temgesic wordt eventueel 's morgens herhaald indien mocht blijken dat een milis/rat nog tekenen van ongerief vertoont. Apparaat en procedures De haren op de hoofdhuid worden afgeschoren en verwijderd. Daarna wordt de muis/rat in de stereotakter gezet. Met behulp van twee stompe oorpennen, die in de gehoorgang van de muis/rat gebracht worden, en een bekklem voor de snijtanden, wordt de kop van de muis/rat gefixeerd. Na desinfectie van de hoofdhuid met betadine wordt de schedel vrijgemaakt door een incisie in de hoofdhuid. Alle operatie materialen (scalpels, wondklemmen, naalden etc.) worden voor gebruik gesteriliseerd. De huid wordt zodanig gefixeerd dat de schedel goed bereikbaar is. Daarna wordt de schedel schoon en droog gemaakt met steriele watjes. De schedel wordt in een horizontale positie gebracht door de referentiepunten bregma en lambda op dezelfde hoogte in te stellen. Vervolgens wordt de middellijn (i.e., lijn door lambda en bregma) bepaald. Nadat de muis/rat in het stereotaktische frame is gefixeerd ligt het referentiepunt voor de interauraal lijn vast. Om het referentiepunt bregma/lambda te bepalen moet de ijknaald naar het bregma/lambda gebracht worden en deze coördinaten opgeschreven worden. Deze coördinaten moeten aangepast worden aan de gewenste atlascoördinaten. Dan wordt op de laterale en de anterior/posterior coördinaten de schedel doorboord tot aan de dura (diameter van boorgat 0.8 mm). Nadat het gat in de schedel is geboord wordt de dura mater met een injectienaald doorgeprikt. Vervolgens kan men met de naald of canule naar de van te voren vastgestelde dorsoventrale coördinaat. Acute injectie van farmaca/DNA Plasmides Voor eenmalige injecties worden farmaca/DNA plasmides met een speciale spuit (Hamilton™) in de hersenen geïnjecteerd. De spuit wordt langzaam naar de injectieplaats gebracht. Als die positie bereikt is wordt begonnen met het injecteren. De snelheidsnelheid is afhankelijk van het volume dat geïnjecteerd wordt. Indien een groot volume (meer dan l ui) wordt geïnjecteerd zal langzamer geïnjecteerd dienen te worden (0.5 (il/min). Indien een kleiner volume geïnjecteerd wordt (minder dan l ui) kan een snellere snelheid worden toegepast. Dit heeft te maken met het feit dat een groter volume meer tijd dient te krijgen om te diffunderen in het weefsel zodat er geen aanzienlijke schade wordt veroorzaakt door volumedruk. Om deze injectiesnelheid precies te bepalen wordt gebruikt gemaakt van een microinfusiepomp. Nadat de substantie is ingespoten wordt l min gewacht alvorens de spuit langzaam wordt teruggetrokken. Electroporatie procedure DNA plasmides: Om efficiëntie van de intracellulaire opname van DNA plasmides te verhogen wordt gebruikt gemaakt van electorporatie. Tien minuten na de craniale incisie en stereotactisch injectie van plasmide DNA (2.5 jag/ul in saline) worden 2 naaldelektrodes geplaatst op l mm anterior en l mm posterior van de injectieplaats. Vervolgens worden 5 geblokte pulsen gegeven op l Hz. met een duur van 50 ms en 125 uA. Contralateraal kan deze procedure herhaald worden.
Plaatsen van canules Indien men meerdere malen een farmacon wil toedienen worden vaste canules geplaatst. Zodoende hoeft men de dieren niet telkens weer te narcotiseren. Eerst worden er twee verdere gaatjes in de schedel geboord. Hier worden schroefjes (Mlx2) in gedraaid die als verankering voor de canule dienen. De roestvrijstale canules hebben een buitendiameter van 0.65 mm en de binnendiameter van 0.30 mm. De canule wordt naar de van tevoren bepaalde coördinaten gebracht. Met behulp van cement (Paladur™) wordt de canule op de schedel aan de schroefjes verankerd. Men dient ervoor te zorgen dat tijdens het aanbrengen van de cement de schedel droog blijf.
Faculty of Health, Medicine and L\1e Sciences UniverSÏty MaaStHcht
Dierexperimenten Commissie
DEC
.„
, voorzitter
Aan:
p/a Secretariaat DEC-UM Postbus 616 NL-6200 MD Maastricht
Telefoon: C
Uwreferentie:
Onze referentie :
Maastricht, 19-12 2011
Geachte Onderzoeker, Uw projectaanvraag: "Effecten van perifere toediening van een TrkB agonist op lange termijn geheugen bij ratten", is op de DEC vergadering van 16 december 2011 besproken. De DEC heeft een aantal vragen en opmerkingen: 1) DEC vindt de ethische afweging erg algemeen beschreven bij punt 4. De DEC verzoekt dit toe te passen op de voorgestelde studie. 2) De DEC verzoekt de naam van de PI bij punt 6 te verwijderen en op het voorblad te vermelden. Het is niet de bedoeling dat verwezen wordt naar personen in de aanvraag, in verband met de Wet Openbaarheid van Bestuur. 3) De DEC verzoekt de nieuw toegevoegde literatuur bij punt 5, ook op te nemen in de literatuurlijst. 4) Bij punt 7c verzoekt de DEC de uitleesparameter te vermelden en de uitval in een percentage aan te geven. Gelieve tevens aan te geven/verduidelijken dat de vergelijkingen binnen een en hetzelfde dier plaatsvinden met betrekking tot de groepsgrootte van 30. Tevens verzoekt de DEC de laatste 2 zinnen vanaf "Dit is echter enzovoort", te verwijderen. Dit heeft als consequentie dat op het voorblad volstaan kan worden met de vermelding van één groep. 5) De DEC verzoekt de namen bij punt 8 te verwijderen. I let is niet de bedoeling dat verwezen wordt naar personen in de aanvraag, in verband met de Wet Openbaarheid van Bestuur. 6) De DEC verzoekt bij punt 9b aan te geven dat pijnstilling wordt gegeven de eerste 2 dagen na de operatie. Dosering post-operatief wel verlagen: 0.01-0.05 mg/kg LG elke 8-12 uur herhalen. 7) De DEC merkt op dat de SOP over muizen gaat en de proef over ratten. Gelieve eventuele vragen te beantwoorden in een briefen indien noodzakelijk Uw project .nar; •'••: nasscn ca duidelijk de aanpassingen grijs te markeren.
Pro j eet 2011-162
Uw project staal bij de DEC geregistreerd onder nummer 2011-162, gelieve dit nummer in verdere correspondentie te vermelden. De DEC-UAA wenst u en uw familie fijne feestdagen en een voorspoedig en vooral gezond 2012
Hoogachtend,
Voorzitter DEC-UM
Maastricht, 5 februari 2012
Tel:
Betreft: Begeleidende brief bij aanpassing van DEC 2011-162
Beste,
We hebben de vragen en opmerkingen van de DEC (onderaan bijgevoegd) in overweging genomen en hebben volgende stappen ondernomen om de DEC aanvraag te verbeteren. M.b.t. vraag l We hebben de ethische afweging aangepast tot: Gezien het grote maatschappelijke belang van het begrijpen van normale en pathologische geheugenvorming, en het gebrek aan alternatieven die ons vergelijkbare inzichten kunnen geven, zijn wij van mening dat het voorgestelde experiment opweegt tegen het gebruik van de dieren zoals beschreven in deze aanvraag. M.b.t. vraag 2 en 5 Op vraag van het DEC werden de namen van alle personen op de aanvraag verwijderd. M.b.t. vraag 3 Alle referenties werden opgenomen in de literatuurlijst. (V1.b.tvraag4 Uitlees parameters werden als volgt duidelijker gedefinieerd in de aanvraag: -In praktijk wil dit zeggen dat dieren die consequent minder dan 7 seconden exploreren in de ORT niet gebruikt kunnen worden.
- Het niet meer kunnen injecteren van een dier omwille van een verstopping of pijn rondom de canule (infectie) zullen in dit geval redenen zijn om het dier uit experiment te halen De gevraagde zin werd verwijderd en ook percentages en het within subject design werden duidelijker naar voren gebracht in volgend stuk: "Het betreft een within design waarin alle dieren elke conditie ondergaan." "Uit ervaring met vergelijkbare experimenten weten we dat we om een groep van 23 ratten te bekomen rekening moeten houden met een uitval. Het totale aantal ratten dat nodig is voor deze studie rekening houdend met de power-analyse én met de mogelijke uitval door exploratie of canuleplaatsing is 30. We hebben namelijk in het verleden ervaren dat ongeveer 4 dieren (± 12,5 %) ten gevolge van canule plaatsing, en ongeveer 3 dieren (± 10 %) door verminderde exploratie. Elk van de dieren ondergaat elke experimentele conditie." Ten slotte werd het voorblad aangepast. M.b.t. vraag 6 De gevraagde verandering in anesthesie richtlijnen (pijnstilling geven de eerste 2 dagen na de operatie. Dosering post-operatief: 0.01-0.05 mg/kg LG elke 8-12 uur herhalen.) werden doorgevoerd. M.b.t. vraag 7 De bijgevoegde SOP is inderdaad geschreven voor het geval van muizen. Desondanks zijn de procedures bij ratten m.u.v. pijnstilling doseringen vergelijkbaar. Daarom is in de SOP muis vervangen door muis/rat en werden de pijnbestrijding richtlijnen voor zowel muis als rat ingevoerd.
Ik hoop hiermee uw vragen te hebben beantwoord. U kan mij altijd contacteren voor meer informatie.
Vriendelijke groeten,
Geachte Onderzoeker,
Uw projectaanvraag: "Effecten van perifere toediening van een TrkB agonist op lange termijn geheugen bij ratten", is op de DEC vergadering van 16 december 2011 besproken.
De DEC heeft een aantal vragen en opmerkingen: 1) DEC vindt de ethische afweging erg algemeen beschreven bij punt 4. De DEC verzoekt dit toe te passen op de voorgestelde studie. 2) De DEC verzoekt de naam van de PI bij punt 6 te verwijderen en op het voorblad te vermelden. Het is niet de bedoeling dat verwezen wordt naar personen in de aanvraag, in verband met de Wet Openbaarheid van Bestuur. 3) De DEC verzoekt de nieuw toegevoegde literatuur bij punt 5, ook op te nemen in de literatuurlijst. 4) Bij punt 7c verzoekt de DEC de uitleesparameter te vermelden en de uitval in een percentage aan te geven. Gelieve tevens aan te geven/verduidelijken dat de vergelijkingen binnen een en hetzelfde dier plaatsvinden met betrekking tot de groepsgrootte van 30. Tevens verzoekt de DEC de laatste 2 zinnen vanaf "Dit is echter enzovoort", te verwijderen. Dit heeft als consequentie dat op het voorblad volstaan kan worden met de vermelding van één groep. 5) De DEC verzoekt de namen bij punt 8 te verwijderen. Het is niet de bedoeling dat verwezen wordt naar personen in de aanvraag, in verband met de Wet Openbaarheid van Bestuur. 6) De DEC verzoekt bij punt 9b aan te geven dat pijnstilling wordt gegeven de eerste 2 dagen na de operatie. Dosering post-operatief we! verlagen: 0.01-0.05 mg/kg LG elke 8-12 uur herhalen. 7) De DEC merkt op dat de SOP over muizen gaat en de proef over ratten.
Gelieve eventuele vragen te beantwoorden in een briefen indien noodzakelijk Uw project aan te passen en duidelijk de aanpassingen grijs te markeren.
Fccutty of Health, Medicina ene Ufe ïcientes
Aan:
kenmerk
Doorkiesnummer
Maastricht 05-03-2012
Project; Effecten van centrale toediening van een TrkB agonist op lange termijn geheugen bij ratten.
DEC-UM Voorzitter DEC-UM i p/a secretariaat DEC-UM
Verantwoordelijk onderzoeker (VO): Secretariaat DEC-UM
Namens de Vergunninghouder van de DEC-UM, delen wij u mede dat voornoemd project aan de ethische toetsingscriteria voor proefdiergebruik voldoet. De DEC maakt geen bezwaar tegen uitvoering van dit project zoals aangevraagd en geeft een positief advies.
Bezoekadres
Postadres Postbus 616
Projectnummert
2011-162
Diersoort: Aantal, dieren:
rat 30
Einddatum:
27-02-2016
6200 MD Maastricht
Uw project staat bij de DEC en GPV geregistreerd onder bovenstaand nummer. Gelieve dieren, die voor dit project bestemd zijn, ook onder dit nummer aan te vragen. Dr. R. Hoenderken
Dr. S. Heeneman
Voorzitter DEC-UM
Vicevoorfcitter
DEC-UM
