HANDHAVINGSACTIE ENTEROBACTER SAKAZAKII IN POEDERVORMIGE PRODUCTEN
A.E. Heuvelink H. Moes J.J.H.C. Tilburg E. de Boer
VOEDSEL EN WAREN AUTORITEIT/KEURINGSDIENST VAN WAREN OOST Postbus 202 7200 AE Zutphen tel. 0575 – 588 100 fax. 0575 – 588 200 email
[email protected] projectnummer: OT03H006 datum: juli 2004
Project OT 03H006
28 december 2004
pagina 1 van 15
INHOUDSOPGAVE SAMENVATTING……………………………………………………………………………………...3 SUMMARY………………………………………………………………………………………………3 TREFWOORDEN……………………………………………………………………………………….. 3 1 INLEIDING ........................................................................................................................... 4 2 MATERIAAL EN METHODEN ............................................................................................ 4 2.1 SURVEY POEDERVORMIGE PRODUCTEN ............................................................................ 4 2.1.1 Monsters............................................................................................................. 4 2.1.2 Microbiologisch onderzoek................................................................................. 4 2.1.2.1 Klassieke kweekmethode ............................................................................ 4 2.1.2.2 Real-time PCR............................................................................................. 5 2.1.2.2.1 Primers en probes................................................................................. 5 2.1.2.2.2 Bacteriestammen .................................................................................. 5 2.1.2.2.3 Extractie DNA ....................................................................................... 5 2.1.2.2.4 PCR condities ....................................................................................... 5 2.1.2.2.5 Poedervormige producten..................................................................... 6 2.2 MONITORING KINDERDAGVERBLIJVEN .............................................................................. 6 3 RESULTATEN ..................................................................................................................... 7 3.1 SURVEY POEDERVORMIGE PRODUCTEN ............................................................................ 7 3.1.1 Klassieke kweekmethode................................................................................... 7 3.1.2 Real-time PCR ................................................................................................... 7 3.2 MONITORING KINDERDAGVERBLIJVEN .............................................................................. 8 4 DISCUSSIE........................................................................................................................ 10 5 CONCLUSIE ...................................................................................................................... 14 6 LITERATUUR .................................................................................................................... 15 BIJLAGEN: 2
Project OT 03H006
28 december 2004
pagina 2 van 15
SAMENVATTING Enterobacter sakazakii is een zeldzame, maar bekende oorzaak van neonatale sepsis en een ernstig verlopende vorm van meningitis. Verschillende infecties zijn in verband gebracht met de consumptie van besmette zuigelingenvoeding. In dit rapport worden de resultaten beschreven van een handhavingsactie uitgevoerd in 2003, in opdracht van de veterinair account. In totaal werden 101 monsters zuigelingenvoeding, 87 monsters ijsmix en 12 monsters instant-puddingpoeder in onderzoek genomen. Voor het aantonen van E. sakazakii (50 g) werd gebruik gemaakt van zowel een klassieke kweekmethode als een door de afdeling Signalering Veterinaire Producten ontwikkelde real-time PCR. De monsters zuigelingenvoeding werden bovendien onderzocht op de aanwezigheid van Salmonella spp. (50 g) en Enterobacteriaceae (1 g). In géén van de monsters zuigelingenvoeding, noch in de monsters ijsmix en instant-puddingpoeder werden E. sakazakii en Salmonella spp. stammen aangetoond. Uit 6 monsters zuigelingenvoeding werden Enterobacteriaceae geïsoleerd. SUMMARY Enterobacter sakazakii is a rare but important cause of life-threatening neonatal sepsis and meningitis. In several cases infant formula has been suspected to be the source of infection. In this report we describe the results of a survey of the occurrence of this bacterium in different powdered foods: 101 samples of infant formula, 87 samples of ice-cream mix and 12 samples of instant-puddingpowder. To examine the presence of E. sakazakii (50 g) both a classical culture technique and a newly developed real-time PCR were used. Besides samples of powdered infant formula were examined for Salmonella spp. (50 g) and Enterobacteriaceae (1 g). In none of the 200 samples strains of E. sakazakii nor Salmonella spp. were detected. Enterobacteriaceae were isolated from 6 samples of infant formula.
TREFWOORDEN: Enterobacter sakazakii, zuigelingenvoeding, babyvoeding, ijsmix, puddingpoeder, real-time PCR, kinderdagverblijf
Project OT 03H006
28 december 2004
pagina 3 van 15
1
INLEIDING Enterobacter sakazakii is een zeldzame, maar bekende oorzaak van neonatale sepsis en een ernstig verlopende vorm van meningitis. Verschillende infecties zijn in verband gebracht met de consumptie van besmette zuigelingenvoeding. In 2001 is door de afdeling Signalering Veterinaire Producten (VP) van de Voedsel en Waren Autoriteit/Keuringsdienst van Waren (VWA/KvW) Oost een literatuurstudie verricht naar deze bacterie en zijn in totaal 211 melkpoeders onderzocht, waaronder 40 monsters zuigelingenvoeding (Heuvelink et al., 2002). Uit 8 monsters werden E. sakazakii stammen geïsoleerd: 1 monster zuigelingenvoeding en 7 monsters verzameld van stukgoederen en bulkverpakkingen. Naar aanleiding van deze resultaten is in opdracht van de veterinair account in 2002 een handhavingsactie op zuigelingenvoeding uitgevoerd (Heuvelink et al., 2003). In totaal werden 101 verschillende monsters zuigelingenvoeding in onderzoek genomen, verschillende charges van verschillende merken. Uit 2 (2%) monsters zuigelingenvoeding afkomstig van verschillende producenten werden E. sakazakii stammen geïsoleerd (<1 kve/g). Enterobacteriaceae werden in 4 monsters aangetoond. Salmonella spp. werden in géén van de monsters zuigelingenvoeding aangetoond. In dit rapport worden de resultaten beschreven van een handhavingsactie uitgevoerd in 2003. Naast monsters poedervormige zuigelingenvoeding werden monsters ijsmix en instant-puddingpoeder onderzocht. Voor het aantonen van E. sakazakii werd gebruik gemaakt van zowel een klassieke kweekmethode als een door de afdeling Signalering VP ontwikkelde real-time PCR. In het najaar van 2003 was door de werkgroep “Doelgericht Handhaven” een monitoring bij kinderdagverblijven gepland met als doel het vaststellen van het procesbeheersings- en hygiëneniveau van de voedselbereiding bij kinderdagverblijven. Om de potentiële risico’s van uitgroei van E. sakazakii te inventariseren werd de inspectielijst op ons verzoek aangevuld met een aantal vragen die specifiek betrekking hadden op de bereiding en bewaring van zuigelingenvoeding. De resultaten hiervan zijn tevens opgenomen in dit rapport. Tenslotte wordt in de discussie een update gegeven van recente internationale ontwikkelingen op het gebied van E. sakazakii.
2
MATERIAAL EN METHODEN
2.1
Survey poedervormige producten
2.1.1
Monsters In totaal werden 101 monsters zuigelingenvoeding, 87 monsters ijsmix en 12 monsters instant-puddingpoeder in onderzoek genomen (onaangebroken verpakkingen, verschillende charges van verschillende merken). De zuigelingenvoeding werd verzameld in de detailhandel (supermarkten en drogisten) (n=97) en bij enkele producenten (n=4), de monsters ijsmix in de detail- (n=60) en groothandel (n=27) en de puddingpoeders bij fabrikanten die het produceren en/of verwerken. De bemonsteringen werden verzorgd door (assistent)controleurs van Food en Veterinair Technologische teams van de regionale diensten Oost en Zuid-West.
2.1.2
Microbiologisch onderzoek
2.1.2.1
Klassieke kweekmethode De monsters zuigelingenvoeding werden onderzocht op de volgende bacteriën (zie ook Bijlage I): Enterobacteriaceae (aan-/afwezigheid in 1 g) SIG01-OT312 "Bepaling van de aanwezigheid van Enterobacteriaceae in waren en diervoerders d.m.v. ophopen" - CONCEPT. Salmonella spp. (aan-/afwezigheid in 50 g) MIC01-WV121 “Bepaling van de aanwezigheid van Salmonella in waren m.b.v. de MSRV-methode”.
Project OT 03H006
28 december 2004
pagina 4 van 15
Enterobacter sakazakii (aan-/afwezigheid in 50 g) SIG01-OT313 "Bepaling van de aanwezigheid van Enterobacter sakazakii in waren en diervoerders d.m.v. ophopen" - CONCEPT. Voor zowel het onderzoek op Salmonella spp. als E. sakazakii werd in afwijking van de hierboven gerefereerde voorschriften 50 g monstermateriaal in plaats van 25 g in onderzoek genomen. Redenen hiervoor zijn de in de Warenwetregeling Zuigelingenvoeding gestelde eis dat Salmonella spp. niet aantoonbaar mag zijn in 50 g zuigelingenvoeding in poedervorm en de door ons voorgestelde norm voor E. sakazakii “afwezig in 50 g poeder”. De monsters ijsmix en instant-puddingpoeder werden uitsluitend onderzocht op E. sakazakii. Het microbiologisch onderzoek werd verricht door het microbiologische handhavingsteam van de regio Oost. Bevestiging en typering van E. sakazakii isolaten werd uitgevoerd door het laboratorium van de afdeling Signalering VP. 2.1.2.2
Real-time PCR
2.1.2.2.1 Primers en probes Met behulp van Primer Express software (PE-Applied Biosystems) werden primers en een probe geselecteerd voor het specifiek aantonen van E. sakazakii DNA (Tabel 1). De probe werd gelabeld met FAM (6-carboxy-fluoresceïne) als reporter en TAMRA (6carboxytetramethyl-rhodamine) als quencher. Tabel 1. Overzicht primers en probe Primer & probe Sequentie (5’ → 3’) Entsa-Fa CCA AAG CTT CCG CAG TGA A Entsa-Rb CAA TAT CCC CTG AGG AAT TAG TAC AGA Entsa-probe CGT CAC GCG AAG AAA CTG GCT CG a
PositieC 119 - 137 209 – 183 139 – 161
F, forward primer R, reverse primer = De posities refereren aan het “E. sakazakii partial macromolecular synthesis (MMS) operon”; rpsU gen, 3’ eind en primase (dnaG) gen, 5’ eind (Catalogus nummer GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov): L01775).
b
C
2.1.2.2.2 Bacteriestammen Behalve middels een theoretische evaluatie werd de specificiteit van de primers/probe set empirisch vastgesteld. Hiertoe werden 164 E. sakazakii en 44 niet-E. sakazakii stammen getest. De stammen werden opgekweekt in Brain Heart Infusion bouillon (18-24 uur bij 37°C), waarna uit 1 ml cultuur DNA werd geëxtraheerd (zie paragraaf 2.1.2.2.3) en een realtime PCR werd ingezet (zie paragraaf 2.1.2.2.4). 2.1.2.2.3 Extractie DNA DNA werd geëxtraheerd volgens een eenvoudige methode gebaseerd op het gebruik van Chelex® 100 (BioRad). Chelex® 100 is een chelaatvormende hars met een hoge affiniteit voor polyvalente metaalionen en wordt gebruikt om eventueel in het monster aanwezige PCR remmers te binden. De methode bestaat uit de volgende stappen: (1) centrifugeren van 1 ml cultuur (5 min, 10.000 X g); (2) resuspenderen van het pellet in 300 µl 6% Chelex® 100; (3) 15-20 min incuberen bij 56°C; (4) 8 min incuberen bij 100°C en (5) centrifugeren 5 min, 14.000 X g. Het supernatant werd vóór gebruik in de PCR 1:5 verdund in Tris-EDTA pH 8,0. 2.1.2.2.4 PCR condities De real-time PCR testen werden uitgevoerd in een reactiemengsel (25 µl) van de volgende samenstelling: 12,5 µl TaqMan Universal PCR master mix (PE-Applied Biosystems), 0,5 µl forward primer (eindconcentratie 200 nM), 0,5 µl reverse primer (200 nM), 0,5 µl probe (100
Project OT 03H006
28 december 2004
pagina 5 van 15
nM), 2,5 µl TaqMan exogene interne amplificatie controle (IPC) mix (PE-Applied Biosystems), 0,5 µl TaqMan exogene IPC DNA (PE-Applied Biosystems), 5,5 µl milli-Q water en 2,5 µl monster. Tijdens iedere run werden de volgende controles meegenomen: een blanco (milli-Q water), negatieve controle (geen template DNA), positieve controle (template DNA) en een IPC block (negatieve controle IPC). De PCR condities waren 2 min 50°C, 10 min 95°C en 40 cycli van 15 sec 95°C en 1 min 60°C, het standaardprogramma van het ABI Prism 7000 sequentie detectie systeem (PE-Applied Biosystems). De resultaten werden automatisch opgeslagen in dit systeem en geanalyseerd volgens de instructies van de fabrikant. 2.1.2.2.5 Poedervormige producten Nadat vanuit de ophopingen gemaakt in gebufferd peptonwater (BPW) en Enterobacteriaceae verrijkingsbouillon (EE) een entoog (1 µl) was afgestreken op violet rood gal lactose (VRBL) agar (Bijlage I) werd uit 1 ml cultuur DNA geëxtraheerd (zie paragraaf 2.1.2.2.3) en een realtime PCR ingezet (zie paragraaf 2.1.2.2.4). De ophopingen werden in de koelkast (5°C) bewaard, tot de uitslag van de PCR bekend was. 2.2
Monitoring kinderdagverblijven In het kader van Doelgericht Handhaven waren in de periode oktober t/m december 2003, 150 inspecties gepland bij verschillende kinderdagverblijven in de regio’s Oost (n=75) en NoordWest (n=75). De inspecties werden uitgevoerd door assistent controleurs Food. In Tabel 2 zijn de vragen weergegeven die waren opgenomen in de inspectielijst met betrekking tot het inventariseren van mogelijke risico’s van uitgroei van E. sakazakii in zuigelingenvoeding op kinderdagverblijven. Tabel 1: Vragen inspectielijst KDV301 ZD03I500 Monitoring kinderdagverblijven betrekking hebbende op de bereiding van zuigelingenvoeding Vraag Waar wordt melk van water en poeder, als vervanging van moedermelk, voor baby's bereid?
Indien de melk op het kinderdagverblijf wordt bereid, hoe vaak gebeurt dit dan?
Antwoorden Thuis Kinderdagverblijf Beide nvt
Antwoord 1 Antwoord 2
Indien de melk in de koelkast wordt bewaard, wat is de temperatuur van de koelkast?
-
Indien melk wordt opgewarmd, hoe gebeurt dit dan?
Magnetron Flessenwarmer Anders
Wat wordt met restjes gedaan?
Bewaard Weggegooid
Hoe worden lege flessen en spenen gereinigd?
Antwoord 1 Antwoord 2
Project OT 03H006
28 december 2004
Toelichting De vragen betreffende melk op kinderdagverblijven zijn alleen van toepassing indien: er 1of meerdere baby’s jonger dan 1 jaar in de kinderdagverblijven worden opgevangen en melk is gemaakt van poeder en water als vervanging van moedermelk Indien dit niet het geval is, kunnen de vragen betreffende dit onderwerp worden beantwoord met niet van toepassing. Antwoord beide op de vraag indien voor sommige baby’s de melk thuis wordt bereid en voor sommige baby’s op het kinderdagverblijf. Ad 1: Eenmaal per dag. Meerdere porties worden bereid die over de hele dag verspreid aan de baby’s worden gegeven. Deze porties worden in de koelkast bewaard; Ad 2: Vlak voor elke keer dat een baby wordt gevoed. Temperatuurmeting uitvoeren en registreren met 1 decimaal en geen melding van graden etc. Voorbeeld: “7,0”. Indien niet van toepassing, dan ‘999’ invullen.
Ad 1: Omspoelen met water Ad 2; Afwassen met afwasmiddel
pagina 6 van 15
Hoe worden lege flessen en spenen na reiniging bewaard?
Antwoord 1 Antwoord 2 Antwoord 3
3
RESULTATEN
3.1
Survey poedervormige producten
3.1.1
Klassieke kweekmethode
Ad 1: Flessen en spenen bij kamertemperatuur Ad 2: Flessen en spenen in de koelkast Ad 3: Flessen of spenen in de koelkast
Uit géén van de monsters zuigelingenvoeding, noch uit de monsters ijsmix en instantpuddingpoeder werden E. sakazakii en Salmonella spp. stammen geïsoleerd. In 6 monsters zuigelingenvoeding werden Enterobacteriaceae aangetoond. 3.1.2
Real-time PCR Voor het empirisch vaststellen van de specificiteit van de real-time PCR primers/probe set werden 208 stammen getest. De resultaten hiervan zijn samengevat in Tabel 2. In Bijlage II zijn verschillende amplificatie plots weergegeven. De cyclus waarbij het fluorescentiesignaal voor het eerst significant afwijkt (hoger is) van de basislijn, de zogenaamde Ct (cycle threshold) waarde, varieerde voor de als positief beoordeelde reacties van 15 tot 25. Van de 164 E. sakazakii stammen gaven er 146 een positieve reactie (Ct waarden 1522): de 6 referentiestammen, alle 26 E. sakazakii isolaten afkomstig uit de collectie van de VWA/KvW Oost en 114 van de 132 isolaten opgestuurd vanuit Wageningen. De 18 isolaten uit Wageningen die een negatieve reactie gaven werden door ons op grond van verschillende biochemische testen niet als E. sakazakii geïdentificeerd. De overige teststammen gaven alle een negatief signaal, met uitzondering van Escherichia coli O157 NCTC12900 (Ct waarde 25). Het Klebsiella oxytoca isolaat van de VWA/kvW Oost en alle 5 Shigella stammen gaven aan het einde van het PCR programma een zwak fluorescentiesignaal (Ct waarden > 36). In overeenstemming met de kweekresultaten werden alle monsters zuigelingenvoeding, ijsmix en instant-puddingpoeder met de real-time PCR negatief bevonden voor E. sakazakii.
Tabel 2. Real-time PCR resultaten van 208 teststammen Stam
Resultaat real-time PCRa + + + + + +
Enterobacter sakazakii Enterobacter sakazakii Enterobacter sakazakii Enterobacter sakazakii Enterobacter sakazakii Enterobacter sakazakii
Herkomst NCTC8155 NCTC9238 NCTC9529 NCTC9844 NCTC9846 NCTC11467
Enterobacter sakazakii (n=26)
isolaten VWA/KvW Oost
+ (n=26)
Enterobacter sakazakii (n=132)
isolaten Wageningen Universiteit
+ (n=114) – (n=18)b
Aeromonas hydrophila Citrobacter Citrobacter freundii Citrobacter freundii Enterobacter amnigenus Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterobacter cloacae (n=5)
M800 PHLS 073-177 ATCC8090 NCTC6272 Isolaat VWA/KvW Oost Isolaat VWA/KvW Oost ATCC23355 Isolaat VWA/KvW Oost
Project OT 03H006
28 december 2004
- (n=5)
pagina 7 van 15
Enterococcus faecium Escherichia coli Escherichia coli O157 Hafnia alveii Klebsiella pneumoniae Klebsiella Klebsiella oxytoca Klebsiella oxytoca Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae Listeria innocua Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas putida Proteus mirabilis Proteus mirabilis Proteus vulgaris Salmonella Enteritidis Salmonella Typhimurium Salmonella Typhimurium Serratia marcescens Shigella flexneri Shigella flexneri Shigella sonnei Shigella sonnei Shigella sonnei Yersinia enterocolitica Yersinia enterocolitica O3 Yersinia enterocolitica O9 a b c
3.2
ATCC29212 ATCC25922 NCTC12900 NCTC8105 ATCC33495 Isolaat VWA/KvW Oost ATCC49131 Isolaat VWA/KvW Oost ATCC13883 Isolaat VWA/KvW Oost NCTC11288 SLCC2479 NCTC5348 ALM32 ATCC27853 NCTC10662 Isolaat VWA/KvW Oost ALM29 NCTC11938 ATCC13315 ALM36 ALM40 ATCC13311 ATCC13880 ALM60 Isolaat VWA/KvW Oost ATCC11060 Isolaat GG&GD Haarlem Isolaat VWA/KvW Oost ALM5 Isolaat UMC St. Radboud CCUG8239A
+c -
+, positief; -, negatief resultaat biochemische identificatie Signalering VP: géén E. sakazakii stammen Ct waarde 25
Monitoring kinderdagverblijven In totaal zijn 176 kinderdagverblijven geïnspecteerd: 89 in de regio Oost en 87 in de regio Noord-West. De antwoorden van de vragen die in de inspectielijst waren opgenomen met betrekking tot de bereiding van zuigelingenvoeding zijn samengevat in Tabel 3. Het verschil in antwoordpercentages tussen beide regio’s was over het algemeen kleiner dan 10% en maximaal 5% ten opzichte van het gemiddelde. Voor díe vragen waarbij het percentage tussen de regio’s meer dan 10% verschilde, zijn de betreffende percentages apart vermeld.
Tabel 3: Antwoorden vragen inspectielijst KDV301 ZD03I500 Monitoring kinderdagverblijven betrekking hebbende op de bereiding van zuigelingenvoeding Vraag
Antwoorden
Antwoordpercentagea
NW
OT
Waar wordt melk van water en poeder, als vervanging van moedermelk, voor baby's bereid?
Beoordeeld Thuis Kinderdagverblijf Beide nvt
176 maal (=100%) 21 48 27 4
87 (100%) 13 68 16 3
89 (100%) 29 29 38 4
Project OT 03H006
28 december 2004
pagina 8 van 15
Indien de melk op het kinderdagverblijf wordt bereid, hoe vaak gebeurt dit dan?
Beoordeeld Antw. 1 (1x per dag) Antw. 2 (verse voeding)
135 maal (=76%) 10 90
76 (87%) 3 97
59 (66%) 19 81
Indien de melk in de koelkast wordt Beoordeeld bewaard, wat is de temperatuur T < 7,0°C van de koelkast? 7,0°C < T < 11,0°C T > 11,0°C
144 maal (=82%) 52 38 10
59 (68%) 32 47 20
85 (95%) 65 31 3
Indien melk wordt opgewarmd, hoe Beoordeeld gebeurt dit dan? Magnetron Flessenwarmer Anders
171 maal (=97%) 47 23 30
-
-
Wat wordt met restjes gedaan?
Beoordeeld Bewaard Weggegooid
173 maal (=98%) 4 96
-
-
Hoe worden lege flessen en spenen gereinigd?
Beoordeeld Antw. 1 (omspoelen) Antw. 2 (afwassen)
168 maal (=95%) 61 39
-
-
Hoe worden lege flessen en spenen na reiniging bewaard?
Beoordeeld Antw. 1 (beide Tkamer) Antw. 2 (beide Tkoelkast) Antw. 3 (1 van beide
146 maal (=83%) 73 22 5
78 (89%) 79 21 0
68 (76%) 66 24 7
Tkoelkast) Uitsluitend indien het antwoordpercentage tussen de regio’s Noord-West (NW) en Oost (OT) meer dan 10% verschilde, zijn de betreffende percentages van de regio’s afzonderlijk vermeld. a
Project OT 03H006
28 december 2004
pagina 9 van 15
4
DISCUSSIE Handhavingsactie 2003 Terwijl in de 2 voorgaande jaren uit 2-3% van de monsters zuigelingenvoeding E. sakazakii werd geïsoleerd, werden alle 101 monsters onderzocht in de huidige studie negatief bevonden, met zowel de klassieke kweekmethode als de real-time PCR. Evenals tijdens de handhavingsactie uitgevoerd in 2002 werden geen Salmonella spp. geïsoleerd. Op grond van de in Bijlage I beschreven procedure voor het aantonen van Enterobacteriaceae voldeden 6 monsters niet aan de Warenwetregeling Zuigelingenvoeding (artikel 6, lid 2, onder b): in 1 g van het poeder werden Enterobacteriaceae aangetoond. Het is niet waarschijnlijk dat de geringe aantallen E. sakazakii in melkpoeder dat voor de voeding van zuigelingen wordt gebruikt, aangetoond in eerdere studies, een infectie kunnen veroorzaken. Belangrijk is dat bacteriële groei gedurende bereiding (en bewaring) van de voeding wordt voorkómen. Infecties beschreven in de literatuur deden zich (uitsluitend) voor in ziekenhuizen waar, door de aanwezigheid van een gering aantal E. sakazakii in poedervormige zuigelingenvoeding, in combinatie met onhygiënische bereiding en onjuiste bewaarcondities, uitgroei en besmetting kon optreden. Toch zijn ook in de private sfeer en op kinderdagverblijven risico’s niet uit te sluiten indien de bereidingsinstructies niet nauwkeurig worden opgevolgd. Uit de monitoring bij kinderdagverblijven bleek dat op 84% van de bezochte locaties in de regio Noord-West en op 67% in de regio Oost babyvoeding als vervanging van moedermelk werd bereid. In verreweg het merendeel van de gevallen betrof het verse bereiding, dat wil zeggen per fles (97% in NW en 81% in OT). Voor het opwarmen van de voeding werd bij 47% van de bezochte kinderdagverblijven gebruik gemaakt van een magnetron en bij 23% van een flessenwarmer (30% anders). Restanten van de voeding werden bij 4% van de kinderdagverblijven bewaard. Gebruikte flessen en spenen werden door 39% van de kinderdagverblijven afgewassen en door 61% van de kinderdagverblijven om-/afgespoeld. De flessen en/of spenen werden bij 27% van de kinderdagverblijven in de koelkast bewaard. Behalve een juist gebruik van een flessenwarmer verdient de koelkasttemperatuur op kinderdagverblijven aandacht. Flessenwarmers dienen uitsluitend te worden gebruikt om de melk op temperatuur te brengen en niet om de voeding op temperatuur te houden. Klaargemaakte voeding is immers een uitstekend groeimedium. Overigens heeft het gebruik van een magnetron voor het opwarmen van babyvoeding de voorkeur (dit geldt uiteraard niet voor moedermelk), vanwege het bacteriedodende effect (Kindle et al., 1996). Bij 67% van de kinderdagverblijven in de regio Noord-West en 34% in de regio Oost werd in de koelkast een producttemperatuur van meer dan de wettelijke norm van 7°C geconstateerd. Indien in de voeding aanwezig, is onder dergelijke omstandigheden uitgroei van E. sakazakii mogelijk. Een recente Nederlandse studie heeft aangetoond dat E. sakazakii algemeen voorkomt in fabrieken waar melkpoeder, graanproducten, chocolade, aardappelzetmeel en pasta’s worden geproduceerd (Kandhai et al., 2004a). Zuigelingenvoeding wordt tijdens de productie gepasteuriseerd om vegetatieve bacteriecellen af te doden. Eventueel in het poeder aanwezige E. sakazakii kiemen zullen een dergelijke hittebehandeling niet overleven. De aanwezigheid van E. sakazakii in het eindproduct is daarom hoogstwaarschijnlijk het gevolg van nabesmetting vanuit de omgeving (droog- en uitvulrruimten) óf door toevoeging van hitte-gevoelige micronutriënten die zijn besmet met deze bacterie. Gezien het wijd verspreid voorkomen van E. sakazakii is tijdens deze handhavingsactie ook gekeken naar het voorkomen van deze bacterie in samengestelde producten anders dan zuigelingenvoeding: monsters ijsmix en instant-puddingpoeder. Als gevolg van een gebrekkige hygiëne kunnen softijsmachines een bron van infecties vormen. Alhoewel geen ziektegevallen zijn beschreven gerelateerd aan ijs en er geen informatie beschikbaar is over het voorkomen van deze bacterie in ijs(mix) is het niet onmogelijk dat E. sakazakii infecties het gevolg zijn van de consumptie van besmet softijs. Ook aan zeer jonge kinderen wordt dikwijls (een hapje) softijs gegeven. De 87 monsters ijsmix die tijdens deze studie werden onderzocht werden echter alle negatief bevonden, evenals de 12 monsters instant-puddingpoeder.
Project OT 03H006
28 december 2004
pagina 10 van 15
Uit de resultaten verkregen met de 208 teststammen blijkt dat de real-time PCR die werd opgezet voor het specifiek aantonen van E. sakazakii DNA een geschikte aanvulling is op biochemische bevestigingsreacties. Escherichia coli O157 NCTC12900 gaf een positief signaal, maar kan eenvoudig worden onderscheiden van E. sakazakii stammen op grond van bijvoorbeeld pigmentvorming. Hetzelfde geldt voor het Klebsiella oxytoca isolaat en de 5 Shigella stammen die aan het einde van het PCR programma een zwak fluorescentiesignaal gaven. Om een uitspraak te kunnen doen over de geschiktheid van de real-time PCR procedure voor het snel screenen van producten op de aanwezigheid van E. sakazakii moeten behalve kunstmatig besmette monsters, voldoende van nature positieve monsters worden onderzocht. Alle 200 tijdens deze studie onderzochte poeders bleken zowel met de klassieke kweekmethode als de real-time PCR negatief. Wanneer tijdens een volgende studie voldoende monsters positief worden bevonden, zullen ook besmettingsproeven worden ingezet teneinde de evaluatie van de PCR te completeren. Recente internationale ontwikkelingen Sinds het verschijnen van het rapport over de handhavingsactie van 2002 zijn een tiental artikelen gepubliceerd over E. sakazakii. Allereerst een tweetal publicaties met betrekking tot het detecteren van de bacterie en de praktische toepassing van de ontwikkelde procedures. Kandhai et al. (2004b) beschreven een eenvoudige methode voor het aantonen van E. sakazakii in omgevingsmonsters verzameld in levensmiddelenproducerende bedrijven. De methode is gebaseerd op de vorming van geel-gepigmenteerde kolonies bij groei op trypton soja agar (TSA) en het bezit van α-glucosidase, waarvan de activiteit werd gedetecteerd met een 4-uurs colorimetrische test. Verdachte isolaten werden biochemisch geïdentificeerd met het API 20E systeem. Bovendien werden de isolaten onderworpen aan een ribotypering om hun identiteit te bevestigen op basis van het patroon van rRNA genen. Zowel de 4-uurs colorimetrische test als het identificeren van isolaten middels ribotypering was nog niet eerder beschreven voor E. sakazakii. Gebruikmakend van de nieuwe screeningsmethode werden uit 18 van 152 omgevingsmonsters verzameld in 3 verschillende melkpoederfabrieken E. sakazakii stammen geïsoleerd. De isolatiemethode is gelijk aan de klassieke methode die door de VWA/KvW wordt gebruikt (wanneer direct wordt afgeënt op VRBL vanuit BPW, zonder eerst nog een selectieve verrijking in EE-bouillon) en dus ook geschikt bevonden voor het aantonen van E. sakazakii in het eindproduct, zuigelingenvoeding. Als extra stap is in de VWA/KvW-methode echter nog een soort van voorscreening op α-glucosidase activiteit opgenomen door af te enten op TSA met als toevoeging 4-methylumbelliferyl-α-D-glucopyranoside (18-24 uur bij 37°C), waarna uitsluitend met positieve isolaten de 4-uurs colorimetrische test wordt ingezet. De tweede publicatie beschrijft een methode waarbij na een voorophoping in BPW en een selectieve verrijking in EE-bouillon wordt afgeënt op zowel violet rood gal glucose (VRBG) (24 uur bij 37°C) als nutriëntagar met 4-methylumbelliferyl-α-D-glucoside (NA+αMUG) (16 uur bij 25°C, gevolgd door 24 uur bij 18-20°C) (Leuschner et al., 2004). Verdachte kolonies op VRBG werden vervolgens ook afgestreken op NA+α-MUG (24 uur bij 37°C). De NA+α-MUG platen werden beoordeeld op kolonies met een geel pigment die bij instraling met UV licht fluoresceerden (gelijk de voorscreening bij de VWA/KvW-methode), waarna deze isolaten werden geïdentificeerd met het API 20E systeem en bovendien werden getest op Tween 80 esterase activiteit (3-8 dagen) om vals-positieve isolaten uit te sluiten. De specificiteit van de α-glucosidase activiteit van E. sakazakii blijkt namelijk uitsluitend te gelden wanneer deze activiteit wordt beoordeeld na 4 uur (Kandhai et al., 2004b; Muytjens et al., 1984). Na 24 uur is het verschil in activiteit tussen E. sakazakii stammen en verschillende andere coliformen minder duidelijk. De methode werd vervolgens gebruikt voor het onderzoek van 58 verschillende monsters zuigelingenvoeding, afkomstig uit 11 landen. De producten werden in hun geheel onderzocht; in totaal 1464 monsters van 25 g. Uit 8 (13,8%) producten werden E. sakazakii stammen geïsoleerd. In 127 (8,7%) van de 1464 monsters, ofwel 21 (36%) van de producten, werden Enterobacteriaceae aangetoond. Uit 10 van deze 127 monsters positief voor Enterobacteriaceae werden E. sakazakii stammen geïsoleerd, hetgeen betekent dat voor 2 producten in 2 submonsters E. sakazakii werd aangetroffen. Deze bevinding indiceert dat E. sakazakii in lage aantallen en heterogeen verspreid voorkomt in de poeders.
Project OT 03H006
28 december 2004
pagina 11 van 15
Op dit moment bestaat er geen internationale standaard (bijvoorbeeld ISO of IDF) voor het aantonen van E. sakazakii. Verschillende laboratoria gebruiken verschillende methoden. In februari 2004 was er een gezamelijke bijeenkomst van de FAO en WHO over E. sakazakii en andere micro-organismen in zuigelingenvoeding en één van de aanbevelingen na dit overleg luidde het ontwikkelen en implementeren van een gevalideerde methode voor E. sakazakii. Harmonisatie van analysemethoden voor E. sakazakii is niet alleen van belang voor het onderling kunnen vergelijken van resultaten, maar ook in verband met (toekomstige) wetgeving. In 2003 heeft de Stichting Centraal Orgaan voor Kwaliteitsaangelegenheden in de Zuivel (COKZ) het initiatief genomen tot een vergelijkend methodenonderzoek. Samen met een drietal producenten van zuigelingenvoeding en de afdeling Signalering VP werden de methoden die thans in gebruik zijn geïnventariseerd en de effectiviteit ervan geëvalueerd. De procedure ontwikkeld door het Nestlé Research Centre in Lausanne (CH) werd unaniem het meest geschikt bevonden als potentiële (inter)nationale standaard. Door elk van de 5 laboratoria zijn vervolgens circa 100 omgevingsmonsters verzameld in fabrieken van de deelnemende producenten onderzocht. Behalve met de Nestlé-methode werden de monsters onderzocht met de methode van de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) en eventueel een derde methode naar eigen keuze. De FDA-methode, waarvan de klassieke methode van de VWA/KvW is afgeleid, wordt beschouwd als een methode met een min of meer officiële status. Echter opnieuw kwam de Nestlé-methode als beste naar voren. De resultaten van deze vergelijkende studie zijn gepresenteerd tijdens de ISO vergadering van de werkgroepen SC5 en SC9 in Parma, 19-23 april 2004. Dit heeft geleid tot het besluit dat Nederland een technische specificatie (binnen ISO/TC34/SC5) opstelt voor het aantonen van E. sakazakii, met de Nestlé-methode als basis (projectleider: Dick van de Berg). Behalve aan detectiemethoden is recent veel onderzoek verricht aan de groei en overleving van E. sakazakii. Zoals in het begin van de discussie is beschreven komt E. sakazakii algemeen voor in verschillende levensmiddelenfabrieken en bestaat de kans op besmetting van eindproducten vanuit de omgeving, met name tijdens het drogen en uitvullen. Om E. sakazakii uiteindelijk uit deze ruimten proberen te elimineren is kennis vereist van de fysiologie en overlevingsstrategieën van de bacterie. Breeuwer et al. (2003) bestudeerden de resistentie van E. sakazakii tegen hitte, droogte en osmotische stress. Terwijl NazarowecWhite en Farber (1997) concludeerden dat E. sakazakii één van de meest thermotolerante Enterobacteriaceae species is (echter niet in staat standaard pasteurisatiecondities te overleven), kwamen deze onderzoekers tot een hitteresistentie van dezelfde orde van grootte als dat van andere Enterobacteriaceae; de D-waarde bij 58°C liep uiteen van 0,39 tot 0,60 min. Nazarowec-White en Farber (1997) rapporteerden een D-waarde van 4,2 min bij 58°C. In vergelijking met E. coli, Salmonella en andere Enterobacteriaceae stammen blijken E. sakazakii cellen die in de stationaire fase verkeren echter beter bestand tegen droogte en osmotische stress, hoogstwaarschijnlijk als gevolg van het ophopen van trehalose in de bacteriecellen. Door deze resistentie en het vermogen te groeien bij een temperatuur van 47°C heeft E. sakazakii in warme en droge omgevingen zoals in droog- en uitvulruimten, een competitief voordeel ten opzichte van andere Enterobacteriaceae. Ook Iversen et al. (2004) kwamen tot de conclusie dat E. sakazakii niet in het bijzonder hitteresistent is. Zij bestudeerden de D-waarde van cellen gesuspendeerd in klaargemaakte zuigelingenvoeding tussen 54 en 62°C en bepaalden hieruit een z-waarde van 5,7°C. Behalve de hitteresistentie bestudeerde deze groep de groei en biofilmformatie van E. sakazakii in klaargemaakte zuigelingenvoeding. De minimum groeitemperatuur was 6°C en de optimale groeitemperatuur 37-43°C. De verdubbelingstijd bij koelkasttemperatuur was circa 13 uur. Alhoewel de infectieuze dosis van E. sakazakii niet bekend is, achten zij het onwaarschijnlijk dat de bacterie bij lage temperaturen uit zal groeien tot een aantal voldoende om infectie te veroorzaken. Meer verontrust zijn zij over de biofilmvorming; E. sakazakii stammen blijken in staat te hechten aan en groeien op materialen gebruikt voor apparatuur en andere hulpmiddelen benodigd bij het bereiden van babyvoeding, zoals latex, polycarbonaat, siliconen en in mindere mate roestvrij staal, welke op deze wijze een reservoir van infectie kunnen vormen. Daarom is het van groot belang dat flessen, spenen en ander keukengerei zo snel mogelijk na gebruik grondig worden afgewassen om de vorming van biofilms te beletten. Zoals in onze vorige rapportages reeds besproken zijn verschillende neonatale E. sakazakii infecties beschreven gerelateerd aan kolonisatie van
Project OT 03H006
28 december 2004
pagina 12 van 15
keukengereedschap dat werd gebruikt voor het maken van de voeding (Bar-Oz et al., 2001; Block et al., 2002; Muytjens et al., 1983; Simmons et al., 1989). De D58-waarden in klaargemaakte voeding bepaald door Edelson-Mammel en Buchanan (2004) liepen uiteen van 30,5 tot 591,1 s, waarmee een aantal stammen aanmerkelijk hitteresistenter bleek dan de stammen getest door Nazarowec-White en Farber (1997). De stammen konden worden ingedeeld in 2 verschillende hitteresistente fenotypen. De z-waarde van de meest hitteresistente stam was 5,6°C. Als alternatief voor het verhitten van babyvoeding in de magnetron (in verband met het gevaar van kookvertraging) bevelen de onderzoekers aan de voeding te bereiden met water dat op een temperatuur van ≥70°C is gebracht. Tijdens experimenten met kunstmatig besmette zuigelingenvoeding werd hiermee een 4-D reductie van E. sakazakii bereikt, dat voldoende wordt geacht om te kunnen garanderen dat een portie voeding vrij is van deze bacterie. Alhoewel dit nog experimenteel moet worden bevestigd, verwachten de onderzoekers geen nadelig effect van deze handelswijze op de in de voeding aanwezige nutriënten gezien de korte duur en de relatief lage temperatuur. Recent verschenen studies met informatie over het vóórkomen van E. sakazakii in zuigelingenvoeding en omgevingsmonsters uit verschillende levensmiddelenproducerende fabrieken zijn eerder in deze discussie al aan de orde gekomen (Kandhai et al., 2004a; Kandhai et al., 2004b; Leuschner et al., 2004). Kandhai et al. (2004a) onderzochten behalve omgevingsmonsters verzameld in fabrieken ook omgevingsmonsters verzameld van 16 huishoudens, te weten 16 stofzuigerzakken. Uit 5 (31%) zakken werd E. sakazakii geïsoleerd, waaruit opnieuw het wijdverspreid vóórkomen van deze bacterie blijkt. Insecten lijken een belangrijke rol te spelen in de verspreiding van E. sakazakii. Hamilton et al. (2003) isoleerden E. sakazakii uit de maag van larven van de stalvlieg Stomoxys calcitrans, waarmee is aangetoond dat deze vlieg een omgevingsreservoir van E. sakazakii vormt. Omdat de vlieg algemeen voorkomt in melkveestallen, is volgens de onderzoekers op deze wijze besmetting van melk mogelijk. In een eerder verschenen studie werd E. sakazakii geïsoleerd uit de magen van Mexicaanse fruitvliegen, Anastrepha ludens (Kuzina et al., 2001). Verder wordt door Hamilton et al. (2003) gerefereerd aan een rapport waarin wordt vermeld dat de huisvlieg Musca domestica E. sakazakii bij zich kan dragen. Tenslotte is door Iversen en Forsythe (2003) een risicoprofiel van E. sakazakii opgesteld, dat een goed overzicht geeft van de E. sakazakii problematiek. Zonder hier nu verder inhoudelijk op hun reactie in te gaan, melden we dat Havelaar en Zwietering (2004) in een brief aan de editor van het betreffende tijdschrift een andere interpretatie geven van de data gebruikt voor de risk assessment en daarmee de conclusie van Iversen en Forsythe (2003) dat explosies het gevolg zijn van grove nalatigheid tijdens het bereiden en bewaren van de voeding niet ondersteunen. Eén van de 5 beheersmaatregelen die door Iversen en Forsythe (2003) van belang worden geacht is het opstellen van een microbiologische norm voor E. sakazakii in zuigelingenvoeding. In de Codex Alimentarius CAC/RCP 21-1979 “Code of hygienic practice for foods for infants and children” wordt als kwaliteitseis gesteld: minimaal 4 van 5 controle monsters <3 coli-achtigen/g en maximaal 1 van de 5 >3 coli-achtigen, maar ≤20 coliachtigen/g. Poeders waarin E. sakazakii werd aangetoond voldeden tot nu toe alle aan deze eis, inclusief de poeders die in verband zijn gebracht met ziektegevallen. Aanpassing van deze eis lijkt daarom gerechtvaardigd. De commissie zelf heeft onlangs ook een risicoprofiel van E. sakazakii in poedervormige zuigelingenvoeding opgesteld (Codex Committee on Food Hygiene, 2003) en heeft besloten de hygiënecode te zullen herzien, met name voor zuigelingenvoeding. Iversen en Forsythe (2003) stellen ter overweging een afwezigheidseis voor darmpathogenen in 25 g zuigelingenvoeding voor en trekken de vergelijking tussen E. sakazakii en Salmonella. Farber (2004) vraagt bij eventuele normstelling rekening te houden met de recente bevindingen dat E. sakazakii wijd verspreid in de omgeving voorkomt en is van mening dat aan een afwezigheidseis wellicht niet voldaan kan worden. Vorig jaar is ook door de VWA/KvW aanbevolen een norm voor E. sakazakii op te nemen in de Warenwetregeling Zuigelingenvoeding. Als norm werd voorgesteld “afwezig in 50 g”, conform de eis gesteld aan Salmonella spp. Het standpunt van de VWA/KvW is dat E. sakazakii een risicodragende pathogeen is en dat deze niet voor hoort te komen in volledige zuigelingenvoeding. De procesbeheersing/-bewaking dient zodanig te zijn ingericht dat de aanwezigheid van E. sakazakii wordt aangemerkt als kritisch controlepunt en afdoende
Project OT 03H006
28 december 2004
pagina 13 van 15
wordt beheerst. Het is zinnig dat de bedrijven in de branche, vooruitlopend op meer kwantitatieve risicovaststelling, een risicoschatting opstellen waarin de reeds bekende gegevens worden opgenomen en lacunes worden vastgesteld. Op termijn kan op basis van genoemde schatting een risicoanalyse worden gemaakt zodat met betrekking tot nut en noodzaak van (combinaties van) interventiemogelijkheden, meer duidelijkheid ontstaat en verantwoorde keuzes kunnen worden gemaakt. 5
CONCLUSIE Melkpoeder dat voor de voeding van zuigelingen wordt gebruikt kan besmet zijn met een gering aantal E. sakazakii. Deze bacterie kan, indien het in grotere hoeveelheid via de melkvoeding aan (premature) pasgeborenen wordt toegediend, leiden tot ziekteverschijnselen zoals gastro-enteritis, necrotiserende enterocolitis, sepsis en een ernstig verlopende vorm van meningitis. Terwijl tijdens de studies verricht in de 2 voorafgaande jaren in 2-3% van de monsters zuigelingenvoeding E. sakazakii werd aangetoond, werden alle 101 monsters onderzocht tijdens de handhavingsactie in 2003 negatief bevonden, met zowel een klassieke kweekmethode als een real-time PCR test. Ook in 87 monsters ijsmix en 12 monsters instant-puddingpoeder werden geen E. sakazakii stammen aangetoond. Ondanks deze negatieve bevindingen is het van belang een vinger aan de pols te houden. Daarom is voor 2004 opnieuw een handhavingsactie op zuigelingenvoeding gepland, waarbij de monsters zullen worden onderzocht met de voorgestelde ISO-methode. Tenslotte wordt wederom aandacht gevraagd voor het op korte termijn bewerkstelligen van een normstelling voor E. sakazakii in de Warenwetregeling Zuigelingenvoeding.
Project OT 03H006
28 december 2004
pagina 14 van 15
6
LITERATUUR Bar-Oz B, Preminger A, Peleg O, Block C, Arad I. Enterobacter sakazakii infection in the newborn. Acta Paediatr 2001;90:356-358. Block C, Peleg O, Minster N, Bar-Oz B, Simhon A, Arad I, Shapiro M. Cluster of neonatal infections in Jerusalem due to unusual biochemical variant of Enterobacter sakazakii. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2002;21:613-616. Breeuwer P, Lardeau A, Peterz M, Joosten HM. Desiccation and heat tolerance of Enterobacter sakazakii. J Appl Microbiol 2003;95:967-973. Codex Committee on Food Hygiene. 2003. Risk profile of Enterobacter sakazakii in powdered infant formula. Thirty-fifth session, Orlando, Florida, United States of America, 27 January–1 February 2003. Edelson-Mammel SG, Buchanan RL. Thermal inactivation of Enterobacter sakazakii in rehydrated infant formula. J Food Prot 2004;67:60-63. Farber JM. Enterobacter sakazakii--new foods for thought? Lancet 2004;363:5-6. Hamilton JV, Lehane MJ, Braig HR. Isolation of Enterobacter sakazakii from midgut of Stomoxys calcitrans. Emerg Infect Dis 2003;9:1355-1356. Havelaar AH, Zwietering M. On the risk of Enterobacter sakazakii in infant milk formula. Trends in Food Science & Technology 2004;15:99-100. Heuvelink AE, Ahmed M, Kodde FD, Zwartkruis-Nahuis JTM, Boer E de. Enterobacter sakazakii in melkpoeder. De Ware(n)-Chemicus 2002;1:17-29. Heuvelink AE, Zwartkruis-Nahuis JTM, A H van der, Wit B, Oosterom R van, Boer E de. Handhavingsactie Enterobacter sakazakii in zuigelingenvoeding. De Ware(n)-Chemicus 2003;4:207-213. Iversen C, Forsythe SJ. Risk profile of Enterobacter sakazakii, an emergent pathogen associated with infant milk formula. Trends in Food Science & Technology 2003;14:443454. Iversen C, Lane M, Forsythe SJ. The growth profile, thermotolerance and biofilm formation of Enterobacter sakazakii grown in infant formula milk. Lett Appl Microbiol 2004;38:378-382. Kandhai MC, Reij MW, Gorris LG, Guillaume-Gentil O, Schothorst M van. Occurrence of Enterobacter sakazakii in food production environments and households. Lancet 2004a;363:39-40. Kandhai MC, Reij MW, Puyvelde K van, Guillaume-Gentil O, Beumer RR, Schothorst M van. A new protocol for the detection of Enterobacter sakazakii applied to environmental samples. J Food Prot 2004b;67:1267-1270. Kindle G, Busse A, Kampa D, Meyer-Konig U, Daschner FD. Killing activity of microwaves in milk. J Hosp Infect 1996;33:273-278. Kuzina LV, Peloquin JJ, Vacek DC, Miller TA. Isolation and identification of bacteria associated with adult laboratory Mexican fruit flies, Anastrepha ludens (Diptera: Tephritidae). Curr Microbiol 2001;42:290-294. Leuschner RGK, Baird F, Donald B, Cox LJ. A medium for the presumptive detection of Enterobacter sakazakii in infant formula. Food Microbiology 2004;21:527-533. Muytjens HL, Ros-van de Repe J van der, Druten HAM van. Enzymatic profiles of Enterobacter sakazakii and related species with special reference to the α-D-glucosidase reaction and reproducibility of the test system. J Clin Microbiol 1984;20:684-686. Muytjens HL, Zanen HC, Sonderkamp HJ, Kollée LA, Wachsmuth IK, Farmer JJ 3rd. Analysis of eight cases of neonatal meningitis and sepsis due to Enterobacter sakazakii. J Clin Microbiol 1983;18:115-120. Nazarowec-White M, Farber JM. Thermal resistance of Enterobacter sakazakii in reconstituted dried-infant formula. Lett Appl Microbiol 1997;24:9-13. Simmons BP, Gelfand MS, Haas M, Metts L, Ferguson J. Enterobacter sakazakii infections in neonates associated with intrinsic contamination of a powdered infant formula. Infect Control Hosp Epidemiol 1989;10:398-401.
Project OT 03H006
28 december 2004
pagina 15 van 15
BIJLAGE I
PROTOCOL MICROBIOLOGISCH ONDERZOEK ZUIGELINGENVOEDING
Enterobacter sakazakii - SIG01-OT313 (CONCEPT) Positieve controle: NCTC11467 (ATCC 29544; Enterobacter sakazakii) Negatieve controle: NCTC8155 (Enterobacter cloacae) Resuscitatie Strooi 50 g van het poeder op 450 ml tot 45°C opgewarmd gebufferd peptonwater (BPW). Los het poeder op door langzaam zwenken; Laat de poeders 1 uur bij kamertemperatuur staan; Bebroed de poeders 18 tot 24 uur bij 37°C. Isolatie Meng goed en strijk een entoog (1 µl) af op violet rood gal lactose (VRBL) agar (zonder deklaag) én breng 10 ml over in 90 ml Enterobacteriaceae verrijkingsbouillon (EEbouillon); Strijk na 18 tot 24 uur bebroeden bij 37°C ook vanuit de ophoping in EE-bouillon een entoog (1 µl) af op VRBL agar; Bebroed de VRBL platen 18 tot 24 uur bij 37°C; Test typische kolonies (Enterobacteriaceae), zowel na direct afstrijken vanuit de BPWophopingen als na afstrijken vanuit de EE-ophopingen, op de vorming van een geel pigment en α-glucosidase activiteit. Ent hiertoe de kolonies (maximaal 5 typische, morfologisch verschillende kolonies van iedere VRBL plaat) over op respectievelijk trypton soja agar (TSA) en TSA (of nutriëntagar) met als toevoeging 4methylumbelliferyl-α-D-glucopyranoside (Sigma M9766, 250 mg) (TSA-MUG (of NAMUG)); Beoordeel de TSA platen na 48 ± 4 uur bij 25°C en de TSA-MUG agar platen na 18 tot 24 uur bij 37°C; Kolonies met een geel pigment die bij instraling met UV licht fluoresceren (als gevolg van de splitsing van MUG in α-D-glucose en 4-methylumbelliferon, dat fluoresceert als het bij 366 nm wordt geëxciteerd) worden nader bevestigd door Signalering VP. Opmerking: Verse isolaten kunnen bij een eerste reinstrijk 2 of meer morfologisch verschillende typen kolonies geven. Sommige kolonies zijn droog of slijmerig, gekarteld en bij aanraking met een öse vrij taai. Andere kolonies zijn mooi glad en kunnen gemakkelijk met een öse van de plaat worden verwijderd. Na verder overenten veranderen de taaie kolonies in mooi gladde kolonies.
Bevestiging De kolonies worden opnieuw getest op α-glucosidase activiteit, maar ditmaal met de PNP test. α-Glucosidase katalyseert de splitsing van het chromogene substraat 4paranitrofenyl-α-D-glucopyranoside in α-D-glucose en 4-paranitrofenol (PNP). Vanaf de TSA platen wordt koloniemateriaal gesuspendeerd in een buisje met 2 ml 0,85% NaCl, waarna 2 ml PNP-α-glucosidase oplossing (5 g/l, 1,15 M fosfaat buffer, pH 7,0) wordt toegevoegd. Na 4 uur incuberen bij 37°C wordt met behulp van een spectrofotometer (405 nm) de vorming van geelgekleurd PNP gemeten. Eenvoudiger en even doeltreffend is het visueel beoordelen van de buisjes op geelkleuring (t.o.v. positieve en negatieve controle); Isolaten waarvoor (≤4 uur) α-glucosidase activiteit wordt aangetoond, worden afgestreken op een sorbitol-MacConkey agar plaat (18 tot 24 uur bij 37°C) (99-100% van de stammen is sorbitol-negatief) en geïdentificeerd met behulp van het API 20E (18 tot 24 uur bij 37°C) systeem. Eventueel worden de isolaten bevestigd met de eerder genoemde PCR en gesubtypeerd met behulp van PFGE (Smeets e.a., 1998).
Salmonella spp. - MIC01-WV121
Project OT 03H006
28 december 2004
Bijlage I, pagina 1 van 2
Isolatie Salmonella spp. vanuit BPW-ophopingen volgens MIC01-WV121 “Bepaling van de aanwezigheid van Salmonella in waren mbv de MSRV-methode”. In afwijking van het protocol wordt niet 25 g, maar 50 g poeder in onderzoek genomen. Enterobacteriaceae (conform ISO 21528 deel I) – SIG01-OT312 (CONCEPT) Isolatie Pipetteer na 1 uur bij kamertemperatuur en goed mengen 10 ml van de 1:10 verdunning in BPW over in een steriele buis; Bebroed 18 tot 24 uur bij 37°C; Voeg de cultuur toe aan 90 ml EE-bouillon en bebroed het geheel 18 tot 24 uur bij 37°C; Strijk de EE-cultuur met een steriel entoog af op gedroogde VRBG platen, zodanig dat losliggende kolonies worden verkregen; Bebroed de VRBG platen gedurende 18 tot 24 uur bij 37°C; Beoordeel de platen op de aanwezigheid van karakteristieke kolonies (violetrode/donkerrode kolonies al dan niet met violetrood/donkerrood neerslaghof); Voer de bevestiging uit met minimaal 1 tot maximaal 5 (totdat een postief resultaat wordt verkregen) willekeurig gekozen, losliggende specifieke kolonies. Bevestiging Strijk de geselecteerde, specifieke kolonies eerst af op gedroogde TSA (of NA) platen, zodanig dat losliggende kolonies worden verkregen (reinstrijk); Bebroed de TSA (of NA) platen gedurende 18 tot 24 uur bij 37°C; Voer de volgende bevestigingstesten uit met het bacteriemateriaal van losliggende kolonies (zie MIC01-WV106): oxidasetest met oxidasereagens (Enterobacteriaceae geven een negatieve reactie) en fermentatie van glucose met glucose agar (Enterobacteriaceae geven een positieve reactie) (uitvoeren indien oxidasetest negatief is).
.
Project OT 03H006
28 december 2004
Bijlage I, pagina 2 van 2
BIJLAGE II
VOORBEELDEN AMPLIFICATIE PLOTS REAL-TIME PCR
Figuur 1. Amplificatie plot E. sakazakii stammen (referentiestammen en enkele isolaten VWA/KvW Oost) (Ct waarden 15-22).
Figuur 2. Amplificatie plot E. sakazakii NCTC 8155 (Ct waarde 15) en enkele niet-E. sakazakii stammen en monsters poedervormige producten (DNA extracten BPW- en EE-cultures) (Ct waarden >40)
Figuur 3. Amplificatie plot E. sakazakii NCTC8155 (Ct waarde 16), E. coli NCTC12900 (Ct waarde 25), een K. oxytoca isolaat (Ct waarde 36,5) en enkele Shigella isolaten (Ct waarden > 38).
Project OT 03H006
28 december 2004
Bijlage II, pagina 1 van 1