GLIKOLÍTIKUS ENZIMEK

Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet Általános Orvostudományi Kar Debreceni Egyetem

BIOKÉMIA GYAKORLAT

GLIKOLÍTIKUS ENZIMEK Dr. Köröskényi Krisztina 2015

A tananyag elkészítését "Az élettudományi- klinikai felsőoktatás gyakorlatorientált és hallgatóbarát korszerűsítése a vidéki képzőhelyek nemzetközi versenyképességének erősítésére" TÁMOP 4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 számú projekt támogatta. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósult meg.

1

TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

3

1. Elméleti háttér

4

1.1. Glikolízis

4

1.2. Glikolítikus enzimek

5

1.2.1. Aldolázok (ALDO)

6

1.2.2. Laktát dehidrogenáz (LDH)

7

1.3. A glikolítikus enzimek aktivitásának meghatározása

8

1.1.3.1 Aldoláz aktivitásának meghatározása kolorimetriásan

8

1.1.3.2 LDH aktivitás meghatározása Warburg-féle optikai teszttel

9

1.4. A glikolítikus enzimek meghatározásának klinikai szerepe

10

1.4.1. Aldoláz

10

1.4.2. LDH

11

IRODALOMJEGYZÉK

13

2

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

(NH4)2SO4

ammónium-szulfát

ADP

adenozin difoszfát

ALDO

aldoláz

ATP

adenozin trifoszfát

BPB

brómfenol kék

DHAP

dihidroxiaceton foszfát

DNPH

dinitrofenil hidrazin

F-1,6-BiP

fruktóz 1,6-bifoszfát

FDG

2-18F-2-deoxiglükóz

G3P

gliceraldehid 3-foszfát

GAPDH

gliceraldehid 3-foszfát dehidrogenáz

HCl

hidrogén klorid (sósav)

LDH

laktát dehidrogenáz

NAD+

nikotinamid adenin dinukleotid

NADH

redukált nikotinamid adenin dinukleotid

NADP

nikotinamid adenin dinukleotid foszfát

NADPH

redukált nikotinamid adenin dinukleotid foszfát

NaOH

nátrium-hidroxid

NBT

nitro-kék tetrazolium-klorid

PET

pozitron emissziós tomográfia

pI

izoelektromos pont

Pi

inorganikus foszfát

PMS

fenazin metoszulfát

TCA

triklórecetsav

U/L

unit/liter

UV

ultraibolya fény

3

GLIKOLÍTIKUS ENZIMEK 1. Elméleti háttér 1.1. Glikolízis A glikolízis a szénhidrát anyagcsere egyik előkészítő útvonala, mely során a sejtek által felvett glükóz (C6H12O6) tejsavvá (anaerob glikolízis) vagy piruváttá (aerob glikolízis) alakul. A glikolízis reakciói során felszabaduló energia nagy energiájú ATP és NADH molekulákban raktározódik el. A glikolízis különféle, egyes lépésekben eltérő formája csaknem minden élő szervezetben megtalálható, ősi útvonal. Aerob glikolízis során a glükózból történő piruvát termelés 2 molekulányi ATP befektetését igényel, a folyamat során viszont glükóz molekulánként 4 ATP és 2 NADH molekula keletkezik. Ezáltal az aerob glikolízis nettó nyeresége 2 ATP és 2 NADH molekula. Glükóz + 2 ADP + 2 NAD+ + 2 Pi

2 Piruvát + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+

A folyamatban keletkező NADH a mitokondriális oxidatív foszforiláció (ATP termelés) során hasznosítódik: a mitokondriális ingaútvonlak típusától (glicerin-foszfát vagy malát-aszpartát inga) függően NADH molekulánként 2 vagy 3 ATP keletkezik.

1. ábra: Az aerob glikolízis, a TCA ciklus és az oxidatív foszforiláció integrációja

4

Az aerob glikolízis során keletkező piruvát szénatomjai a TCA ciklusba lépve további 30 molekulányi ATP szintézisére fordítódnak. Összességében tehát a glükóz aerob körülmények között történő hasznosítása 36-38 mól ATP szintézisét eredményezik. Oxigénmentes

körülmények

között,

illetve mitokondriummal nem rendelkező sejtek (pl.: vörösvértest) esetében a glikolízis során keletkező piruvát funkcionáló TCA ciklus és oxidatív foszforiláció hiányában- tejsavvá alakul a laktát dehidrogenáz (LDH) által katalizált reakcióban.

2. ábra laktát dehidrogenáz (LDH) reakció

A piruvát tejsavvá történő átalakítása a glikolízis során keletkező NADH NAD+-dá történő oxidációját biztosító citoplazmatikus reakció is egyben. Glükóz + 2 ADP + 2 Pi

2 Laktát + 2 ATP + 2 H2O

A LDH reakcióban keletkező tejsav mitokondriumokkal rendelkező sejtekben felhalmozódhat és aerob körülmények között a LDH reakció megfordíthatósága miatt piruváttá visszaalakulva hasznosítódhat a szénhidrát anyagcserében, vagy a sejtekből kikerülve a Cori kör segítségével a glükoneogenezist táplálhatja a májban. A TCA ciklus és oxidatív foszforiláció hiánya miatt az anaerob glikolízis ATP termelő kapacitása a glikolítikus útvonal során keletkező 2 ATP molekulára szorítkozik. Intenzív munka során izomsejtekben a glikolízis intenzitása mintegy 100x meghaladja az oxidatív foszforiláció kapacitását, ezáltal ilyen körülmények között az anaerob glikolízis dominál.

1.2. Glikolítikus enzimek A glikolízis tíz egymást követő reakció sorozatából áll, melyek mindegyike citoplazmatikus lokalizációjú. Számos glikolítikus reakció esetében találkozhatunk úgynevezett izoenzimekkel. 5

Az izoenzimek egyazon kémiai reakciót katalizáló, egymáshoz nagymértékben hasonlító enzimek csoportja, melyek aminosav összetételükben, sejten belüli elhelyezkedésükben, sejt- vagy szövetspecifikus megjelenésükben, szabályozásukban és kinetikai paramétereikben (pl.: KM, Vmax) térnek el egymástól. Az izoenzimek az anyagcsere finom szabályozását és a sejtek/szövetek specifikus igényeinek kielégítését teszik lehetővé. Eltérő aminosav összetételükből adódóan az izoenzimek tömegük és töltésük alapján könnyen azonosíthatóak és elválaszthatóak egymástól. Diagnosztikai szempontból két fontos glikolítikus izoenzim családot kell megemlítenünk: az aldolázokat és a LDH izoenzimeket. 1.2.1. Aldolázok (ALDO) Az

aldolázok

a

fruktóz

1,6-biszfoszfát

(Fru-1,6-BiP)

két

3-szénatomos

molekulává

(dihidroxiacetát: DHAP és gliceraldehid-3-foszfát: G-3-P) történő hidrolízisét katalizáló enzimek. A reakció reverzibilitása folytán az aldolázok nem csupán a glikolízis, hanem a glikoneogenezis során is fontos szerepet játszanak. Három, eltérő génekről átíródó és eltérő expressziót mutató aldoláz izoforma ismert.

 aldoláz A (ALDOA): magas szinten fejeződik ki embrionális szövetekben, „felnőtt korban” pedig az izomban. Születést követően expressziója folyamatosan csökken a májban, vesében és enterális sejtekben, az idegszövetben pedig az aldoláz C-vel közel megegyező szintet mutat.  aldoláz B (ALDOB): magas expressziót mutat a májban, vesében és enterocitákban.  aldoláz C (ALDOC): nagy mennyiségben van jelen az idegszövetekben (főként a hippocampus és a Purkinje sejtek esetében). 3. ábra Aldoláz reakció Az aldoláz A és C izoformák főként a glikolízisben, míg a B izoenzim mind a glikolízisben, mind a glükoneogenezisben vesz részt.

6

1.2.2. Laktát dehidrogenáz (LDH) Az emlős sejtek kétféle, M (izom-típusú) és H (szív-típusú) LDH alegységet tartalmaznak, melyek egymással kombinálódva öt, eltérő jellegzetességgel rendelkező tetramer LDH izoenzimet alkotnak. A H típusú alegység aerob szövetekben (pl.: szívizom: H4 tetramer), míg a M típusú az anaerob sejtekben (pl.: vázizom: M4 tetramer) dominál. A H4 LDH izoforma alacsony KM értékkel rendelkezik piruvát esetében, valamint a nagy mennyiségben jelenlévő piruvát gátolja. Ezzel szemben a M4 izoforma magas KM értékkel jellemezhető piruváttal szemben és nem gátolható a szubsztráttal. A két tetramer eltérő tulajdonságai magyarázzák a H4 (laktátot oxidál piruváttá) és a M4 (piruvátot alakít át laktáttá) funkcionális különbségét.

4. ábra A LDH izoformák szöveti eloszlása vvt: vörösvértest; fvs: fehérvérsejt Az LDH-2 a szérumban található domináns izoforma.. Az LDH-1-nél magasabb LDH-2 szint (ún. „fordított mintázat”) gyakran jelenik meg miocardialis infarktus esetében (a károsodott szívizomból nagy mennyiségben szabadul fel LDH-1 a vérkeringésbe) és korábban diagnosztikai fontossággal bírt. Napjainkban azonban a Troponin I és T kiszorította a LDH-t a szívinfarktus diagnosztikájában. A LDH M és H alegységeit eltérő gének kódolják:  M alegység: LDHA gén (11 kromoszóma; 11p15.4)  H alegység: LDHB gén (12 kromoszóma; 12p12.2-p12.1)  LDHC (LDHX): valószínűleg a LDHA génduplikációjából származik, a fehérje kizárólag a herékben jelenik meg (11 kromoszóma; 11p15.5-p15.3) 7

1.3. A glikolítikus enzimek aktivitásának meghatározása A glikolítikus enzimeaktivitások meghatározására számos különféle módszer alkalmazható. A gyakorlat során ezek közül a kolorimetriás meghatározást alkalmazzuk az aldoláz, míg a Warburgféle optikai tesztet az LDH aktivitásnak meghatározására. 1.3.1. Aldoláz aktivitásának meghatározása kolorimetriásan Az enzimreakcióban az aldoláz hatására a F-1,6-BiP triózfoszfátok keletkeznek. A reakcióelegy hidrazint és monojódacetátot is tartalmaz. A hidrazin a triózfoszfátokkal hidrazont képez. A triózfoszfát-hidrazonok nem szubsztrátjai sem az aldoláznak, sem a szérumban mindig jelenlévő triózfoszfát-izomeráznak. A hidrazonképzéssel a vissza-, illetve egymásba való alakulásra nincs lehetőség, a reakció egyensúlya teljesen a bontás irányába tolódik el. A monojódacetát a GAPDH (G3P-dehidrogenáz) gátlása révén megakadályozza a triózfoszfátok továbbalakulását. Az enzimreakció leállítása után a reakcióelegy egy részét meglúgosítjuk. Lúgos közegben a triózfoszfát-hidrazonokról a foszfátcsoportok leválnak. A dinitrofenil-hidrazin-oldat hozzámérésével a közeg erősen savas lesz. A trióz-hidrazonok a dinitrofenil-hidrazinnal trióz-dinitrofenilhidrazonokat képeznek. Ezek a vegyületek lúgos közegben (amit híg NaOH hozzáadásával érünk el) vörösbarna színűek. A triózfoszfát-hidrazonokról a foszfátcsoportokat a lúgos kezeléssel azért célszerű lehasítani, mert az áthidrazonálás után kapott dinitrofenil-hidrazonok moláris abszorpciós koefficiense a foszfátcsoport nélkül lényegesen nagyobb. A lúgos kezeléssel a meghatározás érzékenyebbé válik.

5. ábra Hidrazin/hidrazon átalakulás

8

1.3.2. LDH aktivitás meghatározása Warburg-féle optikai teszttel Enzimatikus "optikai teszt" olyan módszert jelent, melyben egy enzim aktivitására (és nem koncentrációjára) a NADH vagy NADPH koncentrációjának változásából fotometriás úton következtethetünk. A mérés elvét Warburg 1936-ban írta le. Alapja a NAD+ (NADP+) és NADH (NADPH) eltérő abszorpciós tulajdonságaiból adódik.

6. ábra NAD+/NADH és fényelnyelésük a 240-425 nm hullámhossztartományban

A mérést a fény szemmel nem látható tartományában (340-366 nm) végezzük, ezért a módszert UV-tesztnek is mondják. A laktát-dehidrogenáz reakció úgynevezett egyszerű UV-teszttel követhető nyomon. Az egyszerű optikai tesztben a NADH (NAD+) közvetlen reakciótermék. Másodpercenként 1 mol NADH képződése (vagy felhasználása a reakcióban) 1 katal enzimaktivitást jelent. A hagyományos U enzimaktivitás percenként 1 µmol NADH képződését vagy felhasználását jelenti. Sok enzimreakció NADH-t képző (vagy felhasználó) reakcióval összekapcsolható: ez az összetett "optikai teszt" (pl.: GPT aktivitásának meghatározása). Hasonló elvek alapján, tehát a NAD+/NADH koncentráció változásának mérésével, számos enzimaktivitás folyamatosan mérhető (kinetikai módszer), valamint szubsztrátok mennyisége is meghatározható. 9

1.4. A glikolítikus enzimek meghatározásának klinikai szerepe Normális körülmények között a sejtek enzimei csak igen kis mennyiségek jutnak a véráramba normál szöveti turnover következtében. Kisebb sejtkárosodásnál, a sejtmembrán permeabilitásának megváltozására először a citoplazmából a kisebb molekulatömegű enzimek kerülnek a vérbe. Erős aktivitás-növekedések és mitokondriális enzimek megjelenése a szérumban súlyos károsodásra, a sejtek széthullására utal. Az enzimaktivitások értéke a károsodás mértékével és kiterjedésével arányos, illetve ezen túlmenően az enzimek sejtből való kijutásának sebességével, koncentrációgradiensükkel, molekulatömegükkel és intracelluláris elhelyezkedésükkel függ össze. A kizárólagosan intracellulárisan jelenlévő glikolítikus enzimek aktivitásának és/vagy mennyiségének meghatározása, azok változásának felismerése/követése, valamint az izoformák beazonosítása fontos szerepet játszik a klinikai differenciál diagnosztikában. 1.4.1. Aldoláz Normál tartomány: 1.0 - 7.5 U/L. Kisebb különbség tapasztalható nők és férfiak, valamint a meghatározást végző különböző laboratóriumok esetében. Megemelkedett aldoláz aktivitás oka lehet (többek között):  vázizom károsodása  szívroham  bizonyos tumorok (pl.: máj, hasnyálmirigy, prosztata)  izombetegségek (pl.: dermatomyositis, disztrófia, polymyositis)  májbetegségek (pl.: hepatitis)  mononukleozóis A aldoláz aktivitásának meghatározását korábban a progresszív izomsorvadás követésére (a betegség előrehaladtával egyre kiterjedtebb az izomsejtek elhalása, így az aldoláz felszabadulása is), az aldoláz B meghatározását pedig a hepatitis diagnosztizálására használták a klinikumban. Genetikai rendellenességek: az aldoláz A hiánya myopathia és hemolítikus anémia, míg a B izoforma defektusa örökletes fruktóz intolerancia kialakulásával jár.

10

1.4.2. LDH Az LDH meghatározása a leggyakrabban alkalmazott módszer a különféle szöveti károsodások diagnosztizálására. Normál tartomány: 105 - 333 U/L, mely a meghatározást végző laboratóriumok esetében kisebb mértékben eltérő lehet. Bizonyos gyógyszerek (pl.: érzéstelenítők, Aspirin, Clofibrate, kábítószer, alkohol stb.) alkalmazása megemelkedett LDH aktivitást okozhat. Megemelkedett LDH szint esetében az LDH izoenzimek mérése segít a szöveti károsodás pontos helyének meghatározásában (diferenciál diagnózis). Megemelkedett LDH aktivitás oka lehet (többek között):  vérkeringési problémák (ischemia)

 izomsérülés

 szívroham

 izomgyengeség és izomsorvadás (disztófia)

 hemolítikus anemia

 bizonyos tumorok (pl.: Lymphoma)

 fertőző mononukleózis

 hasnyálmirigy-gyulladás, vesebetegség

 májbetegségek (pl.: hepatitis)

 Stroke

 alacsony vérnyomás

 szövetelhalás (pl.: tüdő-, bélinfarktus)

Genetikai rendellenességek: Az LDH-deficienciák H- és M-alegység hiányra bonthatóak. A M alegység mutációi olyan ritka betegségekhez vezetnek, melyek erőkifejtéskor jelentkező myoglobinuriával járnak együtt. A H-alegység esetében is leírtak mutációkat, ezek azonban nem vezetnek betegségekhez. A LDH izoformák rendellenes elektroforetikus mintázata (abnormális méret, extra sávok) korrelációt mutat bizonyos tumortípusokkal emberben. Az onkológiában a Warburg effektus a legtöbb tumoros sejt esetében megfigyelhető fokozott glikolítikus aktivitást és tejsavtermelést írja le. A malignus, valamint a gyorsan osztódó „nemtumoros” sejteket mintegy 200x aktívabb glikolízis, viszont csökkent mitokondriális ATP termelés jellemzi még normális oxigénellátottság esetében is. Tumorsejtek esetében a glükóz anyagcsere áthangolása mögött onkogén aktiváció és génmutációk állnak. 11

7. ábra Warburg effektus A gyorsan osztódó és tumoros sejtek intenzív glükóz felvételre és anaerob glikolízisre hangolják át az anyagcseréjüket, a differenciált sejtek ezzel ellentétben főként oxidatív foszforiláció segítségével állítanak elő ATP-t. A Warburg effektus fontos orvosi alkalmazása az FDG-PET, mely során 2-18F-2-deoxiglükóz alkalmazásával – kihasználva a tumoros sejtek intenzív glükózfogyasztását- PET (pozitron emissziós tomográfia) módszerrel megjeleníthetőek a daganatok. Az FDG-PET nem csupán a diagnosztikában, hanem a terápiás hatékonyság, és a tumorok progressziójának követéses vizsgálataiban is fontos módszer.

12

IRODALOMJEGYZÉK [1] ACOSTA ML, FLETCHER EL, AZIZOGLU S, FOSTER LE, FARBER DB, KALLONIATIS M., Early markers of retinal degeneration in rd/rd mice. Mol Vis. 2005 Sep 6;11:717-28. [2] BRANCACCIO P, MAFFULLI N, BUONAURO R, LIMONGELLI FM. Serum enzyme monitoring in sports medicine. Clin Sports Med. 2008 Jan;27(1):1-18, vii. [3] BROOKS GA. Anaerobic threshold: review of the concept and directions for future research. Med Sci Sports Exerc. 1985 Feb;17(1):22-34. [4] David L. NELSON, Michael M. COX Lehninger Principles of Biochemistry Sixth Edition, W. H. Freeman. 2012. ISBN-10: 1-4292-3414-8 [5] IQBAL MA, GUPTA V, GOPINATH P, MAZUREK S, BAMEZAI RN. Pyruvate kinase M2 and cancer: an updated assessment. FEBS Lett. 2014 Aug 19;588(16):2685-92. [6] KIM Y, ROH S, LAWLER S, FRIEDMAN A., miR451 and AMPK mutual antagonism in glioma cell migration and proliferation: a mathematical model., PLoS One. 2011;6(12):e28293. [7] KISHI H, MUKAI T, HIRONO A, et al. (1988). Human aldolase A deficiency associated with a hemolytic anemia: thermolabile aldolase due to a single base mutation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (23): 8623–7. [8] PINCUS MR, ABRAHAM NZ Jr, CARTY RP, et al. Clinical enzymology. In: McPherson RA, Pincus MR, eds. Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 22nd ed. Philadelphia, PA: Elsevier Saunders; 2011:chap 20. [9] RASTRELLI M, TROPEA S, PIGOZZO J, BEZZON E, CAMPANA LG, STRAMARE R, ALAIBAC M, ROSSI CR. Melanoma m1: diagnosis and therapy. In Vivo. 2014 May-Jun;28(3):273-85. [10] ROMANO AH, CONWAY T. (1996) Evolution of carbohydrate metabolic pathways. Res Microbiol. 147(6– 7):448–55 [11] SCATENA R, BOTTONI P, PONTOGLIO A, MASTROTOTARO L, GIARDINA B. Glycolytic enzyme inhibitors in cancer treatment. Expert Opin Investig Drugs. 2008 Oct;17(10):1533-45. [12] Spriet LL, Howlett RA, Heigenhauser GJ. An enzymatic approach to lactate production in human skeletal muscle during exercise. Med Sci Sports Exerc 32 (4): 756–63. [13] TANAKA KR, ZEREZ CR. Red cell enzymopathies of the glycolytic pathway. Semin Hematol. 1990 Apr;27(2):165-85. [14] TESLAA T, TEITELL MA. Techniques to monitor glycolysis. Methods Enzymol. 2014;542:91-114. [15] U.S. National Library of Medicine 8600 Rockville Pike, Bethesda, MedlinePlus. Aldolase blood test. http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003566.htm [16] Tamás GYÖRKE, Nuclear medicine (Semmelweis University Department of Radiology and Oncotherapy, Budapest) http://oftankonyv.reak.bme.hu/tiki-index.php?page=Nuclear+medicine

13