Geometriai optika, mikroszkópia Transzmissziós mikroszkópia Fluoreszcenciás mikroszkópia Elektronmikroszkópia
SZÖLLŐSI JÁNOS
Tartalom Geometriai optika, Snellius-Decart törvény Egyszerű lencse képalkotása Lencse hibák Az összetett mikroszkóp képalkotása Transzmissziós mikroszkóp Fluoreszcens mikroszkóp Electronmikroszkóp
Melyik az igazi?
A GEOMETRIAI OPTIKA ALAPJAI
Snellius - Descartes
nab
sin i = sin r
Vékony gyűjtőlencsék képalkotása
1 1 1 = + f k t D (dioptria ) =
1 = ( n − 1) f
1 f
1 1 + R R 2 1
Vastag gyűjtőlencsék képalkotása
1 = ( n − 1) f
1 1 ( n − 1) 2 d + + R2 n R1 R2 R1
LENCSEHIBÁK • Monokromatikus Aberrációk 7
– – – – –
i3 i5 i i9 sin i = i − + − + − ... 3! 5! 7! 9! Gömbi eltérés (szférikus aberráció) Kóma (üstökös hiba) Asztigmatizmus Képmezőgörbület Torzítás
• Kromatikus Aberráció – Longitudinális kromatikus aberráció – Laterális kromatikus aberrációk
Gömbi eltérés
•Tengellyel párhuzamos fénysugarak •Minél távolabb van a sugár a tengelytől, annál közelebb esik a képe a lencséhez vgy 1997-2008
Kóma
•Az objektum távol van az optikai tengelytől •A sugárnyaláb nyílása nagy •A pont képe üstökös-csóvára hasonlít
Kóma
Asztigmatizmus
•A szimmetrikus objektum távol van az optikai tengelytől •A fénysugarak nyílásszöge kicsi •A tárgy képe – az ernyő helyétől függően – tangenciálisan vagy szagittálisan megnyúlik •Ha a gömbi lencse vertikális és függőleges fókusztávolsága nem azonos, az optikai tengellyel párhuzamos sugárnyaláb esetén is asztigmatizmus jön létre. Általános esete, mikor a legrövidebb és leghosszabb fókuszú tengely tetszőleges, de nem 0 fokos szöget zár be. vgy 1997-2008
Asztigmatizmus
Képmezőgörbület
•Az asztigmatizmussal összefüggő jelenség •Nagyobb méretű sík tárgy képe nem sík, hanem görbe felület mentén keletkezik •Minél távolabb van a tárgypont a tengelytől, annál távolabb esik a képe az ideális (Gauss-féle) képsíktól vgy 1997-2008
Torzítás
•Nem a kép élességére vonatkozó hiba •A nagyítás nem azonos a széleken és középen
vgy 1997-2008
Kromatikus aberráció
diszperzió
•A fénysugár elhajlik •A fénytörés hullámhossz függő •A vörös fény hajlik el legkevésbé, az ultraibolya a legjobban •A fehér fényt alkotó színek elválnak (diszperzió) vgy 1997-2008
Longitudinális kromatikus aberráció
Longitudinális színkép
Laterális kromatikus aberráció
Képalkotás a hagyományos fénymikroszkópban összetett mikroszkóp objektív és okulár nagyított, fordított, látszólagos kép F1
2F1
F2
2F1
Nagyítás: az egyes optikák nagyításának szorzata Ni= K / T = k / t Felbontás határa: d=0.61 λ / NA (NA=n sinφ) φ) – önálló fényforrás a pont d= λ / NAobj+NAcond – külső megvilágítás… d ≈ 0.5 λ / NA vgy 1997-2008
d: λ: n: α:
felbontóképesség a tárgyat megvilágító fény hullámhossza a tárgy és a lencse közötti közeg törésmutatója a tárgyról az objektív frontlencséjébe még éppen bejutó fénysugár és az optikai tengely által bezárt szög (nyílásszög fele)
Képalkotási módok I. Teljes látótér Megvilágítás: teljes látótér (Köhler optika) Detektálás: szemmel, fényképezőgéppel, elektronikus kamerával II. Pásztázó Megvilágítás: pontszerű (lézer fényforrás) Detektálás: nincs tekintettel a beérkező foton pontos lokalizációjára a detektor felszínén pl. Fotoelektron sokszorozó (PMT) lavina fotodióda (APD) Pásztázás: tárgyasztal lézer (mozgó tükör) vgy 1997-2008
Képrögzítés a hagyományos fénymikroszkópban
F1
2F1
F2
2F1
Film CCD kamera chip Variációk kontraszt fokozására: sötét látóteres fáziskontraszt polarizációs vgy 1997-2008
A fluoreszcencia alkalmazása a mikroszkópban kontrasztfokozó hatás •Sötét háttérrel szemben minden foton 100%-os intenzitásnövekedést jelent •A fluoreszcens jelzést tetszőleges megfigyelendő sejtalkotóhoz vagy molekulához kapcsolhatjuk •A legtöbb fluoreszcens jelzés a sejtek számára csekély károsodást jelent, a sejtműködéssel összeegyeztethető
vgy 1997-2008
Molekulák in situ detektálása fluoreszcenciával Jelölt antitest, Fab, ScFv (intracelluláris epitóp esetén permeabilizálás)
Jelölt molekula vagy antitest mikroinjektálása
GFP-fúziós fehérje
vgy 1997-2008
A fluoreszcenciás mikroszkóp felépítése
megfigyelő szemlencse (okulár) emissziós szűrő
gerjesztési szűrő lámpa
dikroikus tükör tárgylencse (objektív)
kondenzor lencse
minta
vgy 1997-2008
Optikai szűrők a mikroszkópban emittált fény Tipikus filter elrendezés mikroszkópban
gerjesztő fény
minta
Optikai szűrők I
LP
Típusok: Dikroikus Sáv (BP = bandpass) Hosszú áteresztő (LP=longpass) Rövid áteresztő (SP=shortpass)
BP
Optikai szűrők II
GAP JUNCTION KOMMUNIKÁCIÓ A172 GLIOBLASZTÓMÁBAN
Töltés: karcolás szikével Jelző anyag: 1 mg/ml Lucifer Yellow
vgy 1997-2008
A mitokondriális és F-aktin hálózat kapcsolódása
phallotoxin (phalloidin F-actin)
Mitokondrium-szelektív festék
zoom factor of 3.0 and sequential scanning with the 488-nanometer spectral line of an argon-ion laser, the 543-nanometer line from a green helium-neon laser, and the 633-nanometer line of a red helium-neon laser.
A mitózis első fázisa: profázis First stage of mitosis, prophase Látható a mitokondriális hálózat
DRAQ5 DNS festék
MitoTracker Orange CMTMRos
Felbontás határa d dmin =
0.61 λ n sin α
n = Törésmutató refractive index λ = hulllámhossz wavelength
note: resolving powerhatára independent of lens properties Megjegyzés: a felbontás független a lencse minőségétől, zöld : for green (500nm) light d min = c. 0.2 µm fény (500 nm) esetén:
Elektronmikroszkópia Az elektron hullámtulajdonságát használjuk fel Transzmissziós Elektronmikroszkópia (TEM) Pásztázó Elektronmikroszkópia (SEM)
Mozgó elektronok hullámhossza ( λ) of(λ) electrons determined AzWavelength elektron hullámhosszát a gyorsítóisfeszültség (V) by the accelerating voltage (V) on the filament from határozza meg which they are emitted
0.5 λ = 0.1*(150/V) (de Broglie, 1924) .Így . . thus very high voltages (up to 100 kV) are nagy gyorsító feszültségen (akár 100 used to produce small values of λ (<0.005 nm) kV) rövid hullámhosszat kapunk
Az elektronnyaláb kölcsönhatása a mintával
Transmissziós Elektronmikroszkóp TEM) Egy elektronmikroszkópban elektronnyalábot fókuszálunk “mágneses lencsével”. Az elektronmikroszkóp feloldóképessége mintegy 500,000-szer nagyobb mint az emberi szem feloldóképessége. Miután az elektronmikroszkóp vákuumban működik, a szövetmetszeteket speciálisan kell előkészíteni, ezért élő sejteket nem lehet vizsgálni.
Transmissziós Elektronmikroszkóp
Mitokondriumok
Pásztázó Elektronmikroszkóp • Egy elektronnyaláb pásztázza a minta felszínét. • Az elektronok visszaverődnek a felszínről, és ezeket speciális elektron detektorok gyűjtik össze. • Ezek alapján egy képet lehet alkotni a komputer képernyőjén, amely a vizsgált minta külső alakját mutatja be.
Pásztázó Elektronmikroszkóp
Emberi hajszál
Tartalom Geometriai optika, Snellius-Decart törvény Egyszerű lencse képalkotása Lencse hibák Az összetett mikroszkóp képalkotása Transzmissziós mikroszkóp Fluoreszcens mikroszkóp Electronmikroszkóp
