Fejlődéselmaradás diagnosztikája új generációs genetikai módszerekkel Komlósi Katalin1,3, Stefan Diederich1, Desiree Lucia Fend-Guella1, Oliver Bartsch1, Hao Hu2, Thomas F. Wienker2, H. Hilger Ropers2, Ulrich Zechner1, Susann Schweiger1 1 Humángenetika
Intézet, Johannes Gutenberg Egyetem Mainz 2Molekuláris Genetika Max Planck Intézet Berlin 3 Orvosi Genetikai Intézet, Pécsi Tudományegyetem
21. MPS Konferencia 2015. augusztus 21-23. Gödöllő-Máriabesnyő
Áttekintés • hagyományos diagnosztika és új generációs módszerek fejlődéselmaradásban • az új generációs panel-vizsgálatok • példák: fejlődéselmaradás genetikai háttere, anyagcsere-betegségek más megközelítésben • és ami még így is megfejtetlen marad: diagnosztikai stratégia a jövőben?
Diagnosztikai mélységek: fókuszálás kérdése
Kromoszómarendellenességek: -triszómiák: Down-szindróma -mozaik Patau-szindróma -kiegyensúlyozatlan kr. átrendeződések
A „genom scannelése”
-Kópiaszámbeteg DNS
Referencia DNS
vizsgálat -Örökítőanyag hiány (deléció) vagy többlet (duplikáció) észlelése -mikrodeléciós szindrómák
Célzott géndiagnosztika
Eredmény: -az örökítőanyag egy célzott szakasza vizsgálható -pl. egy teljes gén kódoló szakasza -pontmutáció detektálása -pl. MPSII, Rett-szindróma
Panel diagnosztika A hagyományos genetikai diagnosztika kibővítése: több gén párhuzamos elemzése • 1222 gén párhuzamos szekvenálása Ritka recesszív öröklődésű gyermekkori betegségek
Kognitiv zavarok/mentális retardáció Anyagcserebetegségek, recesszív neurodegeneratív betegségek, monogénes epilepszia szindrómák
Diagnózist nyújthat monogénes mentalis retardáció/fejlődéselmaradá s esetén
Példa a génpanel-diagnosztikára: Kingsmore (MPIMG1) - Teszt
Minta előkészítés
1222 gén
1 nap
vérminta
3 nap
DNS
Minta előkészítés
8 nap
TruSeq Custom Enrichment Kit (Illumina Inc.)
Elemzés: szekvenálás Új generációs szekvenálás – NGS: Illumina MiSeq készülék Technologia
Sequencing by Synthesis (SBS)
Olvasási hossz
2 x 300 bp
Teljesítmény
13,2-15 Gb (55 h)
Vizsgálati lehetőségek: • BRCA, HNPCC, FAP (2, 4, 2 gén, max. 30 beteg)
• Noonan, Neurofibromatosis, Malignus Hyperthermia, Rubinstein-Taybi szindróma, Spina Bifida ( 22 gén; 12 beteg)
• Kötőszöveti betegségek (32 gén; 12 beteg) • Halláskárosodás (150 gén; 12 beteg) • Kingsmore-Panel (1222 gén; 12 beteg)
Az adatok kiértékelése MERAPPipeline
Variánsok azonosítása:
SNVKereső
Alignment SOAP2.21
1 nap
IndelKereső
Utóértékelés:
Adatok megjelenítése:
3 nap
rejtett splicing helyek
Interpretáció:
Klinikai információ
Annotáció
Technikai információ
Rangsorolás
8 nap
szekve nálás
15 nap
kiérté kelés
20 nap
Interpretáció
100-300 közötti variáns öröklődés-modell→ pl. AR: csak homozigóta vagy összetett heterozigóta variánsok
alacsony lefedettségű és rossz minőségű futások kizárása
50-100 variáns SNPk kizárása: Exome Variant Server vagy 1000 genomes projectben nem található
10 homozigóta variáns HGMD adatbázis: mennyi a funkcionális génekben található eltérés?+ OMIM
5 filterezett variáns Klinikai adatok: melyik betegség illik?
1 vagy 2-3 eltérés
Adatok megjelenítése
c.4849_4851delAAG (www.hgmd.cf.ac.uk; CD042611) p.K1617del MYH7
Megerősítés • Sangerszekvenálással: -nem érintett szülő -érintett gyermek
• célzott mutációvizsgálat -családtagok
c.4849_4851delAAG
Utóvizsgálatok 1.
A lehetséges kóroki eltérések (variánsok) megerősítő vizsgálata hagyományos szekvenálással
2.
Szegregációanalízis: a talált eltérések vizsgálata a szülőkben, családtagokban
3.
Molekulárgenetikai lelet
1 nap
3 nap
8 nap
15 nap
20 nap
utóvizs gálatok
41 nap
Eddig vizsgált betegek (118) (Mutációkategória 4+5) Patienten Betegek
diagnostiziert Diagnosztizált
140
120 100
118 100%
80
66
60
56%
52
40
34
20
29%
44% 14 12%
20 17%
0 Patienten (S+NS)
Betegek
Szindrómás MR(S) Syndromale
Nem szindrómás(NS) MR Nicht-Syndromale
A pozitív esetek megoszlása öröklődésmód szerint (34 beteg)
X-recesszív; [ÉRTÉK]
X-domináns [ÉRTÉK]
autosomalis recessziv; 10
autosomalis domináns; ?, [ÉRTÉK]
autosomalis domináns, új mutáció; [ÉRTÉK] autosomalis domináns, familiáris; [ÉRTÉK]
autosomal domináns; 21
Terápiarezisztens epilepszia
•27 éves fiú és 17 éves lánytestvére •súlyos szellemi elmaradás •Myoclonus és absence-epilepszia
kicsi koruk óta (Lafora-betegség?) •súlyos beszédfejlődési zavar •a leánynál: • súlyos viselkedészavar • aszimmetrikus alsó végtagok
Évtizedekig diagnózis nélkül Észak-Portugália
Klinikai tünetek: •testi fejlődés rendben •Fejlődési rendellenesség nincs •H, T, FK normál Terápia: •Fiú: 2 antiepileptikum, még így is sok roham •Lány: 2 antiepileptikum és 3 gyógyszer viselkedészavarra
Kezelhető anyagcserezavar!!! Betegút:
•
Évek óta gyerekpszichiátriai centrumban
•
Gyermekklinika neurológia: anyagcserediagnosztika negatív
•
Gyanú: Lafora-Epilepszia
Diagnosztika: •
1222 gén NGS-Paneldiagnosztikája
•
GAMT gén: c.506 G>A, p.Cys169Tyr homozygota eltérés
•
„portugál“ mutáció (Caldeira Araújo et
al., 2005, Am J Med Genet 133A:122-127) •
Kreatinszintéziszavar: GAMT-Enzimhiány
•
25% ismétlődési kockázat
KREATINSZINTÉZIS-ZAVAROK
Kreatinszintézis zavarok • nagyon ritka, 1 : 1.000.000 szülés (Orphanet) • hipotonia, súlyos fejlődéselmaradás, súlyos beszédfejlődési zavar, nehezen kezelhető görcsök • progresszív mozgászavar, ataxia, myoclonusok • Van rá specifikus laborvizsgálat! MS/MS: szérum és vizelet: ↓↓ Kreatinin, ↑ GAA • MR-Spektroszkopia: kreatininhiány és felhalmozódott anyagcseretermék (GAA) a törzsdúcokban és a kéregben • KEZELHETŐ: napi 400-800 mg/kg KreatinMonohydrat és dietetikus kezelés
Joseph Clark and Kim. M. Cecil, Pediatric Research (2015) 77, 398–405
Két betegség egy családban
Családi anamnézis: -vérrokon család Pakisztánból -4 spontán abortus: hydrops foetalis -utolsó terhességben enzimmérések: MPS VII -2 komplikációmentes terhesség, kezdetben jól fejlődő leányok, majd súlyos leépülés
Két súlyos betegség egy családban Diagnosztika: Tünetek: - a két lány fejlődése a 3./5. életévig rendben zajlott -egyre rosszabbodó, bizonytalan járás, elmosódott beszéd, a beszédkifejezés zavara -rosszabbodó négyvégtagi fokozott izomtónus -nyelészavar, súlyos táplálási nehezítettség -ataxia -viezelet- és széklet-inkontinencia
• FA2H Gen: c.780C>A, p.H260Q (homozigóta) • Zsírsav-2-hidroxiláz enzim zavara • autoszómális recesszív vastárolási betegség ritka formája • súlyos, előrehaladó betegség
-MRT: fokozódó vaslerakódás a törzsdúcokban -eddigi terápia: Botoxinjekciók, ortézisek
25% ismétlődési kockázat
Prenatalis diagnosztika vagy Preimplantációs dg.?
FA2H asszociált vastárolási betegség • Jellegzetes tünetek:
• • • • • • •
járászavar, gyakori esések progresszív spaszticitás, ataxia elkenődött beszéd, beszédzavar nyelészavar látásélesség csökkenése előrehaladó kognitív zavar görcsök ritkák
Kruer et al. Ann Neurol. 2010 Nov;68(5):611-8.
Fejlődéselmaradás és viselkedészavar
17 éves fiú und 11 éves húga súlyos fejlődéselmaradással
Tünetek •fejlődéselmaradás a kezdetektől •mentalis retardáció •viselkedészavar: aggresszió •az első 12 hónapban normál FK, majd mikrocephalia •motoros elmaradás: járás 2 évesen •beszédfejlődési zavar: 17/11 évesen alig beszélnek •heves lázgörcsök, később epilepszia •alacsonynövés •szülők: egészségesek, nem vérrokonok
Klasszikus anyagcserebetegségek enyhe megjelenése NGS-Paneldiagnosztika: -ALG1 gén: c.1280T>G, p.F427C, homozygota • ALG1: beta-1,4-mannosyltranszferáz • CDG1k: Kongenitális glikolizációs zavar 1 k • CDG I k: súlyos betegség, korai halálhoz vezet • terápirezisztens görcsök, gyorsan romló mikrocephalia, alvadási zavar, MR: agyi atrófia • a klasszikus kép: disztrófia, hasmenés, hypoproteinémia, izomhipotonia, alvadési zavar, görcsök, hepatomegalia, veseelégtelenség
A glikoziláció első lépései
Egyszerű biokémia teszt: Transzferrin izoelektromos fókuszálás: CDG 1 mintázat Ingo Helbig: Rare Epilepsy Syndromes and the Congenital Disorders of Glycosylation
CDG1k
Jövő diagnosztika • panelvizsgálatok bővíthetők→teljes exomszekvenálás→teljes genomszekvenálás • Nijmegeni centrum: teljes genomszekvenálással a mentalis retardációs esetek 60%-ban születik oki diagnózis • adatok újraértékelése • funkcionális vizsgálatok jelentősége
Köszönetnyilvánítás • • • • • • •
Intézetek: Mainzi Humángenetika Intézet Mainzi Gyermekpszichiátriai Központ Max Planck Intézet Berlin Orvosi Genetikai Intézet, PTE Betegek és családjaik részvételéért Pályázatok: – Campus Hungary ösztöndíj – KAAD ösztöndíj – OTKA 103983 – „MTA Bolyai János Kutatási Ösztöndíj”
