Escherichia coli aminosav-transzporterek vizsgálata
DOKTORI ÉRTEKEZÉS
Szegedi Tudományegyetem Biológiai Doktori Iskola
Készítette: Szvetnik Attila Témavezetı: Dr. Kálmán Miklós
Bay Zoltán Alkalmazott Kutatási Közalapítvány Biotechnológiai Intézet Szeged, 2008
1
1. TARTALOMJEGYZÉK
1. TARTALOMJEGYZÉK
2
2. BEVEZETÉS
4
2.1. A membránfehérjék élettani szerepe és jelentısége
4
2.2. A membránfehérjék csoportosítása
5
2.3. A transzmembrán fehérjék jellemzıi és általános felépítése
7
2.4. A membránfehérjék vizsgálata
11
2.4.1. A topológia vizsgálata
12
2.4.1.1. A predikciós programok és korlátaik
14
2.4.1.2. A topológia meghatározására alkalmas kísérletes módszerek
15
2.4.1.2.1. Glikozilációs scanning
15
2.4.1.2.2. Cisztein-scanning
16
2.4.1.2.3. Proteázok és antitestek alkalmazása
16
2.4.1.2.4. Riporter fehérje fúziók
16
2.4.1.2.5. Biotiniláció
18
2.4.2. A térszerkezet vizsgálata
19
2.4.2.1. Mennyire elfogadható a kapott szerkezet? 2.5. Transzportfolyamatok Escherichia coliban
21 21
2.5.1. A metionin-transzport Escherichia coliban
23
2.5.2. A glutaminsav-transzport Escherichia coliban
24
2.5.2.1. A GltS
26
3. CÉLKITŐZÉS
28
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
29
4.1. Bakteriális törzsek és plazmidok
29
4.2. Vegyszerek
29
4.3. Táptalajok és tápoldatok
30
4.4. Plazmidtisztítás és transzformálás
31
4.5. A metD lókusz azonosításánál alkalmazott módszerek
31
4.5.1. A metD promóterének vizsgálatához szükséges plazmidok készítése
31
4.5.2. Kromoszómális deléciók létrehozása
32
4.5.3. Komplementáló plazmidok készítése
32
4.6. A topológia vizsgálatához felhasznált módszerek
2
33
4.6.1. A TnphoA
33
4.6.2. A λTnphoA szaporítása és titrálása
33
4.6.3. λTnphoA mutagenezis és screening
34
4.6.4. A pGE1 és pGL2 plazmidok készítése
35
4.6.5. Egyirányú deléciók kialakítása
35
4.6.6. Fúziók létrehozása polimeráz láncreakcióval
37
4.6.7. A fúziós pontok helyének vizsgálata
37
4.6.8. Western-blot
38
4.7. Enzimatikus mérések
38
4.7.1. Az alkalikus foszfatáz aktivitás meghatározása
38
4.7.2. A β-galaktozidáz aktivitás meghatározása
39
5. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK
40
5.1. A metionin-transzport vizsgálata
40
5.1.1. A metD lókusz azonosítása
40
5.1.1.1. A fenotípus tesztelése
41
5.1.1.2. Az abc promóterének vizsgálata
42
5.1.1.3. Az L-metionin transzport multiplicitásának kérdése
44
5.1.1.4. Kitekintés
46
5.1.2. A GltS topológiája
48
5.1.2.1. A GltS topológiájának predikciója
48
5.1.2.2. Kísérletes stratégia
48
5.1.2.3. Western-blot analízis
52
5.1.2.4. A GltS topológia modellje riporter fúziók alapján
53
5.1.2.5. A GltS topológiája
55
5.1.2.6. Összehasonlítás az emlıs glutaminsav transzporterekkel
58
5.1.2.7. Riporter fúziók vagy cisztein-hozzáférési kísérletek?
60
6. ÖSSZEFOGLALÁS
62
7. SUMMARY
65
8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
68
9. IRODALOMJEGYZÉK
69
10. FÜGGELÉK
78
3
2. Bevezetés
2.1 A membránfehérjék élettani szerepe és jelentısége
Az élılényekben a biológiai membránok egyrészt elhatárolják a különbözı összetételő kompartmenteket, másrészt a bennük elhelyezkedı membránfehérjék révén szelektív anyagés információáramlást képesek lebonyolítani közöttük. A membránproteinek segítik az életfolyamatokhoz szükséges anyagok szabályozott ki- és bejuttatását a sejtbe, felfogják és közvetítik a közegbıl származó jeleket (szignál transzdukció), enzimatikus aktivitással átalakíthatnak más molekulákat, és konkrét fizikai összeköttetést biztosítanak az egyes kompartmentek, például az extracelluláris tér és a citoplazma között (1. ábra).
1. ábra A membránfehérjék négy funkciója
A négy fı funkció révén a membránproteinek szinte az összes alapvetıen fontos biológiai folyamatban részt vesznek. Az anyag- és jelátvitel lebonyolítása révén biztosítják a sejtek közötti kommunikáció formáit, a külsı körülményekhez történı adaptáció lehetıségét. Ez a hormonális szabályzás, immunrendszer, ingerület-átvitel, energiatermelés, izommőködés, apoptózis, morfogenezis, sejtosztódás, a homeosztázis fenntartásának az alapja. Egyszerőbb szervezeteknél - mint például a baktériumoknál - az élettani folyamatok nagyrésze
a
plazmamembránhoz
kapcsolódik.
Itt
zajlik
az
anyagtranszport,
az
enregiatermelés, az energiatárolás protonmotoros erı formájában, a transzmembrán jelátvitel, kemotaxis, a sejt mozgatása a flagellumok révén, a sejtfal szintézis és a sejtosztódás irányítása.
4
A kompartmentalizáció miatt az eukarióták bonyolult belsı membránrendszere (sejtszervecskék) további funkciókat irányít: a sejtmag és a citoplazma közötti anyagtranszportot, a fehérjék módosítását és elosztását (endoplazmatikus retikulum, Golgikészülék), lebontó folyamatokat (lizoszóma, peroxiszóma), vezikuláris transzportot. A membránfehérjék módosult vagy hibás mőködése – a fentiekbıl következıen - rendkívül sok betegség okát képezi az emberi szervezetben is. A cisztikus fibrózis, Alzheimer-kór, szív-, vese- és emésztırendszeri betegségek, cukorbetegség, multidrog rezisztencia, idegrendszeri betegségek, magas vérnyomás kóroka egyértelmően membránproteinekhez kapcsolható. A betegségek kezelésekor a gyógyhatású anyagok felszívódását és kiürülését, illetve a kórokozó mikroorganizmusok elleni védekezés lehetıségeit szintén a membrán transzportfolyamatai
határozzák
meg.
Mindezek
alapján
nem
meglepı,
hogy
a
membránproteinek egyre növekvı figyelmet és érdeklıdést váltanak ki az alapkutatás, az alkalmazott kutatás, az orvostudomány és a gyógyszeripar részérıl egyaránt. Becslések szerint a jelenlegi gyógyszertargetek kb. 60 %-a membránprotein (receptorok és ioncsatornák) és a jövıben ez a hányad valószínőleg tovább fog emelkedni. A membránfehérjék gyakorisága és óriási jelentısége ellenére összességében keveset tudunk róluk. Vizsgálatuk nehezebb a szolubilis fehérjéknél, és az eddigi jelentıs erıfeszítések ellenére még mindig van néhány leküzdhetetlennek tőnı technikai akadály.
2.2 A membránfehérjék csoportosítása A fenti funkcionális felosztás (receptor, linker, enzim, transzporter) mellett számos egyéb sajátosság szerint is csoportosíthatjuk a membránfehérjéket. A legfontosabb szempontokat és a dolgozat további részében használt fogalmakat szeretném definiálni az alábbiakban. A membránfehérjék olyan proteinek, amelyek a biológiai membránokhoz gyengébbenszorosabban kapcsolódnak. A kötıdés erıssége alapján két csoportot lehet megkülönböztetni. Az integrális vagy intrinsic membránfehérjék a lipid kettısrétegbe süllyednek, olyan erıs kölcsönhatást kialakítva a membránnal, hogy csak annak károsításával, detergensekkel vagy apoláris oldószerekkel vonhatók ki. A perifériális vagy extrinsic membránproteinek lazábban kapcsolódnak
a
membránhoz,
emiatt
könnyebben
leválaszthatók
(pl.
magas
só
koncentrációval vagy a pH változtatásával). A perifériális membránproteinek többféleképpen,
5
parallel α-hélixszel, hidrofób hurok szekvenciával, kovalensen kötött lipid-ankorral (horgony) és ionos kölcsönhatással rögzíthetik magukat a membránhoz (2. ábra).
2. ábra A membránfehérjék típusai a membránhoz való kötıdés alapján A perifériális fehérjéknél a kötıdés formái sorrendben: bemerülı α-hélix, kapcsolódás integrális TMP-hez, bemerülı hidrofób hurok, ionos kölcsönhatás, lipid-ankor.
Lényeges, hogy egy membránprotein (MP) a membrán által elválasztott kompartmentekkel hogyan tart kapcsolatot. A monotopikus fehérjék kizárólag az egyik kompartmenttel érintkeznek (pl. perifériális MP-k). A bitopikus fehérjék egyetlen transzmembrán szegmens révén mindkét kompartmentbe benyúlnak. A kettı vagy több transzmembrán szegmenssel rendelkezı fehérjéket politópikusnak nevezik. Utóbbi két csoportot nevezzük transzmembrán fehérjéknek. A transzport energiaigénye szerint lehet aktív és passzív. A transzporterek közül a csatorna-fehérjéken (porinok és ioncsatornák) passzívan, facilitált diffúzióval jut keresztül a szubsztrát. Aktív transzport során ATP (elsıdleges aktív transzport), vagy a membrán két oldalán fenntartott ion koncentráció különbség szolgálhat energiaforrásként (másodlagos aktív transzport). Utóbbi csoportnál a szubsztrát transzportálásának az iránya lehet megegyezı (szimport), vagy ellentétes irányú (antiport) az ion-gradienssel. A „permeáz” kifejezéssel sokszor találkozhatunk a membránfehérjékkel kapcsolatosan, az egyik legrégibb és sokféle értelemben használt fogalom. Számos eltérı definíció írja le, a legtágabb értelmezés szerint (Merriam-Webster orvosi szótár) bármely molekula, ami egy másik molekula sejtmembránon keresztüli átjutását segíti. Leggyakrabban a transzporterek szinonímájaként használják.
6
2.3 A transzmembrán fehérjék jellemzıi és általános felépítése A membránfehérjékben a transzmembrán szegmens(ek) tulajdonságai a membránok általános felépítéséhez igazodnak. A biológiai membránok alapja egy 6-9 nm vastag lipid kettısréteg. Ebben a szendvics-szerkezetben a hidrofób karakterő belsı magot az amfipatikus lipidek feji része által kialakított hidrofil réteg borítja. A flexibilis membránban a lipidek viszonylag szabadon mozoghatnak többféle irányban is. A hımozgás eredményeképpen a hidrofil réteg nem homogén, sokkal inkább egy grádiens, interfázis alakul ki a teljesen hidrofób membrán-mag és a vizes fázis között (Andersen és Koeppe, 2007; 3. ábra). Az egyedi transzmembrán szegmensek teljesen követik a lipid kettısréteg hidrofobicitási karakterét.
3. ábra Transzmembrán α-hélix a membránban A feltüntetett aminosavak az átlagosnál gyakrabban fordulnak elı a jelölt rétegekben.
A politópikus membránproteineknél viszont az egész transzmembrán domén felülete együttesen alakítja ki a szükséges sávozottságot. A lipid kettısréteg és a belemerülı fehérjék hidrofobicitási karaktere nem mindig kompatibilis, hiszen a membránokat becslések szerint több mint ezer különbözı lipid alkothatja (van Meer, 2005). A specifikus összetétel egyben meghatározza a membrán (és a hidrofób mag) lokális vastagságát, fluiditását, esetleges görbületét. Az adott specifikus közeghez nem minden fehérje tud jól illeszkedni (hidrofób mismatch), emiatt a lipid kettısréteg önmagában is képes befolyásolni, szabályozni a belemerülı fehérje aktivitását (Andersen és Koeppe, 2007) és lokalizációját (McIntosh és Simon, 2006). Felépítésük alapján az integrális membránfehérjéket két családba lehet sorolni. A kisebbik csoportot alkotják a Gram (–) mikroorganizmusok külsı membránjában, archeákban, a
7
mitokondriumban és a kloroplasztban elıforduló porinok. Esetükben a membránt átszelı ún. transzmembrán szekvenciák (TMS-ek) β-redıs szerkezetőek, amelyek egy képzeletbeli henger palástját formázzák (β-hordó struktúra). A membránproteinek túlnyomó többségében viszont a transzmembrán szakaszok másodlagos szerkezete α-hélikális (4. ábra). Mivel utóbbi típus tekinthetı általánosnak, valamint az általam vizsgált transzporterek is ebbe a csoportba tartoznak, az alábbiakban ezt a fajta szervezıdést szeretném részletesebben tárgyalni.
4. ábra A membránfehérjék két családja Baloldalon a bakteriorodopszin (α-helikális), jobboldalon a mátrix porin (β-redıs) látható.
A membránt átérı α-hélixek tipikusan 20-30 aminosavból épülnek fel, és a membrán síkjára nagyjából merılegesen helyezkednek el. Az összes aminosav elıfordulhat TMS alkotóként, de a hidrofób karakterőek vannak többségben: leucin, izoleucin, valin, alanin, fenilalanin. In vitro kísérletekben a prolin és a glicin a hélix-szerkezet destabilizációját okozza, mégis viszonylag gyakran elıfordulnak a politópikus membránfehérjék TMS-eiben (a prolin kb. 5 %, Wallin és mtsai, 1997). Ahhoz, hogy egy fehérjeszekvencia be tudjon épülni a membránokba, gyakran elegendı egy megfelelı hosszúságú hidrofób szakasz. Ezt az egyszerősítı szemléletet módosítják az újabb kísérleti megfigyelések, miszerint megfelelı környezetben gyakorlatilag bármilyen szekvencia képezhet transzmembrán szegmenst (Ota és mtsai, 1999). Másodlagos szerkezetét tekintve a TMS belsı 12-13 aminosavnyi része a szekvenciától függetlenül helikális szerkezető (Nilsson és mtsai, 1998). A poláros aminosavak közül gyakori a kismérető, hélixek közötti interakciókban résztvevı szerin és treonin, viszont nagyon ritkák a nagyobb mérető, erısen poláros vagy töltéssel rendelkezı aminosavak. Az aromás aminosavak a foszfolipidek poláros feji részével tudnak
8
kölcsönhatást kialakítani, ennek megfelelıen gyakrabban fordulnak elı a hélixek végein. A politópikus fehérjék esetén a fehérje alsó és felsı felületén ún. aromás övet lehet megfigyelni (Reithmeier, 1995). Politópikus fehérjéknél a lipidekkel érintkezı TMS-eknél további amfipatikus karakter figyelhetı meg. Kialakul egy erısen hidrofób oldal, ami a lipid oldalláncokkal érintkezik, a hélix másik oldala pedig kevésbe hidrofób. Ennek a hidrofób momentumnak a nagysága és irányultsága predikciós jelentısséggel bír. A belsı TMS-eknél ez kevésbé, vagy egyáltalán nem figyelhetı meg, kisebb átlagos hidrofobicitásuknak és az összetettebb interakcióknak köszönhetıen. A kettınél több TMS-t tartalmazó proteinek esetében a hélixek nagyon kompakt, minimális térkitöltéső „kötegeket” alkotnak. A pakolódás mértéke a szolubilis fehérjékhez képest nagyobb (Eilers és mtsai, 2000). A szoros interakciót alapvetıen kétfajta kölcsönhatási típus, motívum biztosítja. Az elsıt a glikoforin A esetében figyelték meg elıször: a hélixek érintkezı oldalain kis oldalláncú aminosavak helyezkednek el, sima kapcsolódási felületet képezve. A GxxxG, illetve általánosan a ZxxxZ (ahol Z=kis oldalláncú aminosav; Gly, Ala, Ser, Thr) motívumot ezután sok más membránproteinben is megtalálták. Feltételezések szerint a kis oldalláncok miatt a Cα hidrogénjei részt tudnak venni hidrogénkötések kialakításában (Curran és Engelman, 2003), ezáltal a hélixek legszorosabb pakolódását és a fehérje egészének stabilizációját teszik lehetıvé (Walters és DeGrado, 2006; Eilers és mtsai, 2002). A másik kölcsönhatás a szolubilis proteineknél is nagy jelentısséggel bír (például a leucinzipzár fehérjék esetében). A szakirodalom a szemléletes „knobs-into-holes” kifejezést használja a Crick által bemutatott kölcsönhatásra (Crick, 1953). Az α-hélixek felülete egyenetlen, hepehupás, mert az aminosav oldalláncok térbeli kiemelkedéseket (knobs) és hiányuk bemélyedéseket (holes) alakít ki. Amennyiben a „göröngyök” jól illeszkednek egymáshoz és komplementer felületet alkotnak, akkor a szomszédos hélixek között erıs interakció alakul ki. Membránfehérjéknél az LxxLxxxLxx motívum a hélix-hélix kapcsolatok 42 %-ért felelıs, az oldallánc mérete miatt azonban kevésbé szoros kölcsönhatást biztosít a GxxxG-hez képest. A motívumban a leucint helyettesítheti alanin, izoleucin és valin is (Eilers és mtsai, 2002). A szabályos α-hélixben az oldalláncok redık és árkok vonulatait alakítják ki. A szabályos α-hélix tengelyéhez képest ezek 26 fokos szögben futnak. A szomszédos hélixek a
9
legszorosabban úgy tudnak elhelyezkedni, ha az egyik hélix redıje pontosan a másik árkába illeszkedik. Emiatt a TMS-ek leggyakrabban 0-40 fokos szöget zárnak be (Bowie, 2005). A transzmembrán hélixeket egyszerősítésképpen egyenes, henger-szerő struktúraként szoktuk ábrázolni és elképzelni. A bıvülı számú nagyfelbontású kristályszerkezetek szerint azonban túlnyomó többségben vannak a görbült, torzult szerkezető hélixek. Részben az eltérı torzulás lehetısége biztosítja a megegyezı alapstruktúrájú fehérjék sokféleségét és ezzel evolúciójuk alapját (Yohanna és mtsai, 2004). Érdemes példaként megemlíteni a G-protein kapcsolt receptorok családját vagy a Nagy Facilitátor Szupercsaládot (MSF). Mindkét esetben egy azonos alapváz-struktúra figyelhetı meg, az elsıdleges szekvenciák ugyanakkor csak kevéssé homológok (Bowie, 2005; Hirai és mtsai, 2003). A transzmembrán szegmenseket változatos hosszúságú, összetételő és szerkezető hurokszekvenciák kötik össze. Az erısen poláris, valamint a töltéshordozó aminosavakat tartalmazó szegmensek összetételük révén irányítják a politópikus fehérjék membránbeli lefutását. Egy TMS membránbeli irányultságát alapvetıen a hidrofób szekvencia két oldalán elhelyezkedı töltéssel rendelkezı aminosavak határozzák meg. Már ismert topológiájú membránproteinek összehasonlításakor észrevették, hogy a pozitív töltést hordozó aminosavak többsége a citoplazmatikus térben helyezkedik el (von Heijne, 1986; von Heijne és Gavel, 1988). Ez az ún. „pozitív belül”-szabály általánosságban is megfigyelhetı tendencia, bár kifejezettebb a prokarióta szervezetekben (Gafvelin és mtsai, 1997). A membránfehérjék szerkezetét tovább differenciálva, a többségben lévı poláros karakterő hurkok mellett elıfordulnak apolárisak is, amelyek a membránba merülve részt vesznek az αhélix-köteg kialakításában (ún. bemerülı hurkok). Az aquaporinok esetében a membrán mindkét oldaláról benyúlik egy-egy ilyen hurok. Az egymás felé nézı szekvenciák a membrán közepén találkoznak és a vízmolekulákat áteresztı pórust alakítják ki (Murata és mtsai, 2000; Fox és Lu, 2007). Hasonló struktúrát írtak le számos más transzporter fehérjében is (Gltph: Yernool és mtsai, 2004; KcsA: Roux és McKinnon, 1999; EEAT: Slotboom és mtsai, 1999, GlpF: Fu és mtsai, 2000) így ez a struktúra egyre inkább gyakorinak tőnik a transzporterek körében. Bioinformatikai predikciók alapján a politópikus MP-ek 10 %-ánál elıfordulnak (Viklund és mtsai, 2006). Összefoglalva elmondhatjuk, hogy a bıvülı térszerkezeti információk jelentısen összetettebb képet tárnak elénk a TMS-ek szerkezetérıl, mint ahogyan azt néhány évvel korábban elképzeltük.
10
2.4 A membránfehérjék vizsgálata Kísérletes szempontból a TMP-k vizsgálata jóval nehezebb, mint a szolubilis fehérjéké. Két évtizeddel korábban azonban még úgy tőnt, a bioinformatika képes lesz a technikai problémákat ellensúlyozni. A TMP-k szerkezetének elméleti predikciója, vizsgálata akkoriban könnyebbnek látszott, mint a szolubilis fehérjéké. A komoly elvárások alapja az volt, hogy az α-hélix köteg típusú TMP-k szervezıdése alapvetıen egyszerő. Elvileg csak a transzmembrán régiókat kell kijelölni, azután ezek membránbeli lefutását meghatározni, végül a TMS-ek összerendezıdését kitalálni. A bioinformatika könnyő és gyors kezdeti sikereket ért el a TMSek kijelölésében (Kyte és Doolitle, 1982), valamint a topológia predikciójában a „pozitív belül” szabály megfigyelésével (von Heijne, 1986). A hélixek pakolódásának a kérdése is megoldhatónak tőnt, mivel a szolubilis fehérjékhez képest jóval kevesebb térbeli pozícióval és mozgási lehetıséggel kell számolni. Az utóbbi kb. 10 év eredményei azonban ennél bonyolultabb szervezıdésre és finomabb kölcsönhatásokra engednek következtetni. Becslések szerint az élılényekben átlagosan a gének 20-30 %-a kódol membránfehérjét (Krogh és mtsai, 2001). Ehhez képest és óriási jelentısségükhöz viszonyítva a róluk rendelkezésre álló adatmennyiség kicsi, a szolubilis fehérjékkel összevetve pedig elenyészınek is mondhatnánk. A nagyfelbontású térszerkezetek száma bár gyarapodik, összesen csak 178 különbözı fehérje struktúrája ismert (MPDB, 2007. decemberi állapot). Ugyanakkor, ez a szám az összes membránproteint tartalmazza, tehát a perifériális fehérjék típusait is. Emiatt a jelenleg jellemzett 102 fehérjecsaládból mindössze csak 36 tartalmaz politópikus transzmembrán fehérjéket (MPDB; Raman és mtsai, 2006). Elenyészıen kevés az ismert térszerkezető eukarióta fehérjék száma, a humán membránproteineket az aquaporinok és a leukotrién C4 szintáz képviselik (l. Függelék). Kijelenthetjük, hogy a folyamatosan fejlıdı szoftverek és informatikai kapacitás ellenére a bioinformatika még napjainkban sem tudja pótolni a membránproteinekkel kapcsolatos ismeretek hiányát; a lényeges információkat a kísérletes módszerek szolgáltatják. Természetesen, az eredmények kiértékeléséhez nélkülözhetetlenek speciális szoftverek, de önmagukban még nem elegendıek. A TMP-k vizsgálatakor három szerkezeti szintet lehet megkülönböztetni (5. ábra). Elıször is, valamilyen módon meg kell ismerni a fehérje aminosavsorrendjét, azaz elsıdleges szerkezetét. Ehhez szükséges a fehérjét kódoló gén szekvenciája vagy a tisztított fehérje. Sok esetben ma már rendelkezésre áll a vizsgált organizmus teljes genomszekvenciája.
11
5. ábra Az integrális membránproteinek vizsgálati szintjei és módszerei (EM krisztallográfia-elektron mikroszkópiával kombinált elektron diffrakció).
Ez azonban még nem jelenti azt, hogy egy adott funkcióhoz nagyon könnyő lenne a kódoló géneket hozzárendelni. A világ legjellemzettebb élılényének, az Escherichia coli-nak a teljes genomszekvenciáját 1998 óta ismerjük. Ennek ellenére ismeretlen a gének kb. 24 %-ának a feladata és mindössze 66 %-ról vannak kísérletes adatok (Karp és mtsai, 2007; Riley és mtsai, 2006). Még roszabb a helyzet az eukarióták esetében: a Saccharomyces cerevisiae esetében 37 %, Arabidopsis thaliananál 5 %, Drosophila melanogasterben és egérben 4-4 % a kísérletesen igazolt funkciójú gének aránya. A szakirodalom, bioinformatikai eszközök és az Interneten elérhetı adatbázisok felhasználásával azonban sokszor sikerül a kódolt fehérjék funkcióira következtetni. Az aminosavsorrend birtokában mind kísérletes, mind elméleti módszerekkel megközelíthetıek a magasabb szerkezeti szintek: a topológia és a háromdimenziós dimenziós struktúra.
2.4.1. A topológia vizsgálata A membránfehérjék membránbeli lefutása, más szóval topológiája lényegében a kétdimenziós szerkezetet jelenti. Meghatározása sokféle biokémiai és molekuláris biológiai
12
technikával elvégezhetı, manapság már 400-nál is több TMP membránbeli lefutása ismert (Elofsson és von Heijne, 2007). Az élı szervezetekben a membránok különbözı fizikai és biokémiai jellemzıkkel leírható kompartmentek határát képezik. A biokémiai módszerek a membrán elhatároló funkcióját használják ki a topológia vizsgálatához. A membrán egyik oldalára olyan reagenseket vagy fehérje molekulákat juttatnak, amelyek számára csak az azonos oldalon megtalálható fehérje hurkok hozzáférhetıek. A riporter fúziós eljárás az elválasztott kompartmentekben uralkodó eltérı fiziológiai körülményeken alapul (Jennings, 1989; Traxler és mtsai, 1993). Mindkét stratégia közös jellemzıje, hogy a vizsgált fehérje megfelelıen módosított változatait kell elızıleg létrehozni (van Geest és Lolkema, 2000). A membránfehérjék módosítását az teszi lehetıvé, hogy meglepıen stabil a szerkezetük. Mutagenezis vizsgálatok során azt tapasztalták, hogy nagyon kevés olyan egyedi mutáció van, amely önmagában a fehérje inaktivációjához vagy a szerkezet felbomlásához vezet. Néhány bakteriális membránprotein esetében végeztek ún. scanning analízist, amely során az összes aminosavat egyenként cserélik valamilyen semleges karakterő, kismérető aminosavra, alaninra (alanin-scan) vagy ciszteinre (cisztein-scan). A laktóz permeáz esetében mindössze hat (401 aa-ból, Frillingos és mtsai, 1998), a tetraciklin rezisztencia fehérjében tizenhét (400 aa-ból, Tamura és mtsai, 2001) ilyen kulcsfontosságú aminosav volt. Az egyes fehérjerészek azonban eltérı érzékenységet mutatnak a különbözı módosításokkal szemben. A transzmembrán szekvenciák például sokkal érzékenyebbek a töltéssel rendelkezı aminosavak beépítésére, rövid deléciókra, ezzel szemben a hurkok (különösen a hosszabbak) jól tőrik az aminosav cseréket, deléciókat és inszerciókat is (Weinglans és Kaback, 2000). A membránfehérjék többsége még csonkolt formájában is megırzi a natív topológiáját. Emiatt lehetséges a riporter fúziós stratégia sikeres alkalmazása (lásd alább). Az integrális membránproteineknek általában egyetlen jól meghatározott membránbeli lefutása van. Feltételezések szerint azonban léteznek olyan proteinek is, amelyek módosítatlanul is kétféle „stabil” topológiát vehetnek fel (Rapp és mtsai, 2006). Ezeknél a pozitív töltést hordozó aminosavak azonos számban vannak jelen a membrán két oldalára kerülı hurkokban. A kettıs topológiájú (dual-topology) fehérjék 1:1 arányban, ellentétes orientációban vannak jelen. A csoport legjobban vizsgált tagja az EmrE, egy kismérető multidrogrezisztencia fehérje. A legújabb szerkezeti modell (Chen és mtsai, 2007; Pornillos és mtsai, 2005) és cisztein-hozzáférési vizsgálat (Nara és mtsai, 2007) szerint az aktív fehérje homodimer, amit két antiparallel helyzető monomer alkot. Egy másik kutatócsoport eredménye szerint a parallel kapcsolt tandem párok is aktívak (Steiner-Mordoch és mtsai, 13
2008; Schuldiner, 2007), ami egyféle topológiára enged következtetni. Az EmrE szerkezetén túlmutató, a vizsgálati módszerek megbízhatóságára is kiterjedı, több éve tartó vitában úgy tőnik az in vivo biokémiai eredmények tőnnek meggyızıbbnek, és a kristályszerkezet kerül elutasításra (McHaourab és mtsai, 2008). Ez egyben azt is jelenti, hogy a kettıs topológiájú membránfehérjék létezésére - bár kiváló elméleti hátteret biztosítanak a membránfehérjék evolúciójának magyarázatára (Rapp és mtsai, 2007.; Lolkema és mtsai, 2008) - jelenleg nincs egyértelmő kísérletes bizonyíték. A fehérje önálló tulajdonságai mellett a közeg, konkrétan a membrán lipidösszetétele is erısen befolyásolja a membránbeli lefutást (van Klompenburg és mtsai, 1997). Bogdanov és munkatársai (2002) egy genetikailag módosított, foszfatidil-etanolamin (PE) szintézis deficiens E. coli törzsben vizsgálták a laktóz permeáz (LacY) mőködését. A mutáns törzsben a LacY fehérje elsı fele ellentétes orientációt vett fel, míg második fele megtartotta a normál lefutását. Még érdekesebb azonban az az eredmény, hogy kívülrıl adagolt PE hatására a fehérje visszanyerte a natív topológiáját és aktivitását is. A csoport késıbbi munkája (Zhang és mtsai, 2003) szerint a fenil-alanin permeáz (PheP) és a γ-amino-vajsav transzporter (GabP; Zhang és mtsai, 2005) esetében is topológia változáshoz vezetett a PE-hiányos közeg, amely reverzibilisnek bizonyult PE adagolás hatására. Bár a PE-hiányos membrán nagyon eltér a fiziológiás állapottól - hiszen az E. coli membránlipidjeinek 75 %-a PE -, felmerül annak a lehetısége, hogy a membránfehérjék topológiája a membránba történı beépülés után is dinamikusan változhat, és ezt a membrán lipid összetétele szabályozhatja.
2.4.1.1 A predikciós programok és korlátaik A transzmembrán szegmensek kijelölését és a topológia elırejelzését sokféle, különbözı megközelítést alapul vevı szoftverrel elvégezhetjük. A legegyszerőbbek az egyes aminosavakhoz különbözı hidrofobicitási értékeket rendelnek hozzá, majd egy 16-30 aminosavas szegmens átlagát ábrázolják. A keletkezı grafikonon látható nagy hidrofobicitási csúcsok kijelölik a lehetséges TMS-eket. Sajnos, ez a nagyon egyszerő megközelítés nem képes megkülönböztetni a globuláris fehérjéket a membránfehérjéktıl, a szignálszekvenciákat a TMS-ektıl. A második generációs szoftverek már valódi topológia predikciót biztosítanak és összetett elméleti módszereket alkalmaznak: homológia-keresést, tanuló neuron-hálózatot,
14
Rejtett Markov-modellt, és ezek kombinációit. A szerzık a 90-es évek második felétıl sorra publikálták a pontosabbnál pontosabb szoftvereket, nemegyszer 85-95 % feletti találati arányt említve (pl. Rost és mtsai, 1995; Gromiha, 1999). A kevésbé fényes felhasználói tapasztalatok aztán a valós pontosság szisztematikus vizsgálatához vezettek (Möller és mtsai, 2001; Ikeda és mtsai, 2002; Chen és mtsai, 2002). Általánosságban a következı hiányosságokat tapasztalták: a legjobb módszerek is átlagosan kb. 70 %-os valószínőséggel dolgoznak, a TMS-ek eleje és vége nehezen meghatározható, az ötnél több TMS-sel rendelkezı fehérjéknél szignifikánsan rosszabb predikciós hatékonyságot lehet elérni (Chen és mtsai, 2002; Elofsson és von Heijne, 2007). A programok tehát feltétlenül hasznosak és segíthetik a kísérletes munkát,
de
nincs
tökéletes
szoftver.
A
bonyolultabb
szekvencia
környezetben
megbízhatatlanok; „a predikció az csak predikció” (Elofsson és von Heijne, 2007). Véleményem szerint, a lipid-környezet - és bizonyos belsı hélixek számára a fehérje közeg figyelembe vétele nélkül a lineáris szekvencia információ eleve nem elegendı a hatékony predikcióhoz.
2.4.1.2 A topológia meghatározására alkalmas kísérletes módszerek 2.4.1.2.1 Glikozilációs scanning
Eukarióta
membránproteinek
vizsgálatára
elterjedten
alkalmazott
megoldás.
Az
endoplazmatikus retikulum lumenében található az oligoszacharid transzferáz (OST) enzim, amely az Asn-X-Thr/Ser konszenzus szekvencia aszparaginjához egy oligoszacharid molekulát kapcsol (N-glikoziláció). Mivel a reakció kompartmentspecifikus módon játszódik le, alkalmas a topológia felderítésére. A glikolizációs scanning elsı lépése a vizsgált proteinben normálisan elıforduló glikolizációs helyek eliminálása. A módosított fehérje különbözı régióiban irányított mutagenezissel új konszenzus glikolizációs helyet hoznak létre. Az endoplazmatikus retikulum lumenébe kerülve a módosított régión bekövetkezhet az N-glikoziláció, míg a citoplazmában elmarad. Az egyetlen helyen glikozilált fehérje SDS poliakrilamid gélen megfuttatva hozzávetılegesen 2,5 kDa-nal nagyobb molekulatömegőnek látszik, mint a módosítatlan forma.
15
2.4.1.2.2 Cisztein-hozzáférés
Az eljárás alapja az, hogy a cisztein szulfhidril reagensekkel reakcióba lép, melynek eredményeképpen kovalensen módosított cisztein oldalláncot kapunk. Különbözı membránon átjutó és impermeábilis szulfhidril reagensek ismertek, amelyek lehetnek fluoreszcens sajátosságúak, tartalmazhatnak biotin csoportot vagy radioaktív jelölést. A detektálás ennek megfelelıen fluoreszcencia alapján, sztreptavidin kötıdése révén és autoradiográfiával történik. A cisztein-scanning mutagenezis során egyetlen ciszteint tartalmazó fehérje sorozatot kell létrehozni. A „nemkívánatos” ciszteineket általában szerinre cserélik. A cisztein viszonylag hidrofób, kismérető aminosav, ezért új helyekre való beépítését a fehérje általában tolerálja. A fentiekben felsorolt reagensek segítségével a ciszteinek lokalizációja meghatározható teljes sejtes rendszerekben, szferoplasztokban és vezikulákban is. A módszer nagy elınye, hogy a vizsgált fehérjében csak kisebb változtatásokat, pontmutációkat kell létrehozni, amelyek általában nem befolyásolják az aktivitást és a szerkezetet, így a topológiát sem.
2.4.1.2.3 Proteázok és antitestek alkalmazása
Nagymérető molekulák nem képesek átjutni a membránon, így számukra csak az azonos oldalon található membránfehérje-részek hozzáférhetıek. Ezek alapján proteázok és antitestek is használhatók a membránbeli lefutás meghatározására. Ilyenkor a membránprotein szekvenciájába specifikus proteáz felismerı helyet (pl. His-tag, Xa faktor), illetve epitópot (pl. Myc, FLAG, prolaktin) építenek.
2.4.1.2.4 Riporter fehérje fúziók
Az 1980-as évek közepétıl kezdıdıen egyre nagyobb teret hódít a génfúziós stratégia, elsısorban bakteriális proteinek analízisében. Alkalmazása nem csak topológiai információkat biztosít,
hanem
a
membránproteinek
összeszerelıdését,
ennek
szabályosságait
is
vizsgálhatóvá teszi. A módszer két alapvetı kísérleti eredményen alapul. Az elsı közülük az, hogy sikerült olyan ún. riporter fehérjéket találni, amelyek a bakteriális citoplazma membránnak csak az egyik oldalán mutatnak magas aktivitást. A másik fontos tapasztalat az, 16
hogy a transzmembrán szakaszok orientációját a közvetlenül elıttük és utánuk található szignálok határozzák meg elsısorban. Ezért, ha egy politópikus membránprotein végérıl néhány transzmembrán szakaszt eltávolítunk, akkor a rövidített fehérje lefutása legtöbbször ugyanolyan marad, mint a teljes fehérje megfelelı szakaszának lefutása. Az eljárás során a riporter fehérjék promóter és startkodon nélküli génjét a membránfehérje génjének különbözı pontjaihoz illesztik a megfelelı leolvasási keretben. A hibrid génrıl a baktérium sejtekben egy fúziós fehérje képzıdik, amely beépül a citoplazma membránba. A riporter fehérje vagy a citoplazmában marad, vagy kijut a periplazmatikus térbe attól függıen, hogy a membránprotein mely részéhez kapcsolódik. A riporter enzim aktivitása alapján ezután következtetni lehet a fúziós pont szekvenciakörnyezetének lokalizációjára (6. ábra).
6. ábra A riporter fúziós technika alapja Egy periplazmatikusan aktív riporter viselkedése (pl. alkalikus foszfatáz). A magas enzimaktivitás azt jelzi, hogy a riporter kijutott a periplazmatikus térbe. A citoplazmába kerülı riporter inaktiív marad.
Riporter fehérjeként elsıként az Escherichia coli alkalikus foszfatázát (PhoA) alkalmazták topológia meghatározására (Manoil és Beckwith, 1986). A PhoA a periplazmatikus térben mőködıképes, a citoplazmában inaktív. A sejten belüli körülmények között néhány eszenciális diszulfid-híd nem tud létrejönni, ezért az aktív konformáció sem alakulhat ki. A PhoA „komplementereként” kezdték használni késıbb az Escherichia coli β-galaktozidáz enzimét (LacZ), mint citoplazmatikusan aktív riportert. A periplazmatikus régiókhoz fúzionált β-galaktozidáz csak alacsony aktivitást mutat, mert a transzport során beszorul a membránba. Emiatt citoplazmatikus régiók azonosítására alkalmas. A PhoA és LacZ riporterek aktivitása kromogén szubsztrátok segítségével egyszerően nyomon követhetı és mennyiségileg mérhetı (Maniatis és mtsai, 1982; Brickman és Beckwith, 1975). A topológia vizsgálatára más fehérjék is alkalmasnak bizonyultak. Ilyenek például az intracellulárisan aktív kloramfenikolacetil-transzferáz és a GFP, valamint a periplazmában mőködı β-laktamáz.
17
Egy membránprotein lefutásának meghatározásához számos fúziós fehérjét kell kialakítani, amelyekben a fúziós pont különbözı régiókban van. Az egyik megoldás során a membránfehérje génjének 3’ végérıl irányított mutagenezissel egyre hosszabb szekvenciát távolítanak el, majd a megmaradó végekhez kapcsolják a riporter géneket. Végeredményben a fúziós pont az N-terminálishoz egyre közelebb kerül, és különbözı mérető C-terminális szekvencia részek teljesen hiányoznak a fúziós fehérjékbıl (C-terminális csonkolás). Ez a stratégia nagyon
célravezetı
és
sikeres,
ugyanakkor
a C-terminális
szekvenciák
eltávolításával elveszhetnek bizonyos topológiát befolyásoló szignálok is, ezért az eredmények értékelésekor körültekintıen kell eljárni. Az ún. szendvics fúziók kisebb mértékben zavarják a normális lefutást. Ez esetben a riporter gént - a leolvasási keretet figyelembe véve - beépítik a membránfehérje génjébe és nem mögé illesztik. Tehát a teljes vizsgált protein megmarad, és a riporter egy N-terminális és egy C-terminális szakasz közé ékelıdik (7. ábra).
7. ábra A szendvics-fúzió szerkezete
2.4.1.2.5 Biotiniláció
A biotin karboxilázok kovalensen kötött biotin segítségével katalizálják a karboxil-csoport átadását metabolitok között. A biotin csoport kötıdése a citoplazmában történik poszttranszlációsan. E kompartment-specifikus folyamatot a biotin ligáz katalizálja. E. coliban az acetil-CoA-karboxiláz az egyetlen biotinálódó fehérje. Az acetil-CoA-karboxiláz egy nyolcvan aminosavas fragmentje, a BAD domén szükséges a biotinilációhoz. A BAD domén szendvics fúziókban és C-terminális csonkolás során is használható lokalizációt jelzı markerként. A periplazmatikusan elhelyezkedı fehérje szekvenciához fúzionált BAD domén általában nem biotinilálódik. Abban az esetben viszont igen, ha a régió lassan transzportálódik. Ilyen módon a BAD fragment a membránproteinek összeépülésének
18
kinetikájáról is adhat információt. A biotin jelenlétét a biotin-avidin rendszerrel lehet detektálni.
2.4.2. A térszerkezet vizsgálata A háromdimenziós szerkezet meghatározását jelenleg (az alkalmazás gyakoriságának sorrendjében) röntgenkrisztallográfiával, mágneses magrezonancia spektroszkópiával (NMR), elektron mikroszkópiával kombinált elektron diffrakcióval (EM krisztallográfia) és elméleti számításokkal végzik. Szerkezeti információkat szolgáltat még ezeken kívül az atomi erı mikroszkópia (AFM) is, de kisebb felbontásából adódóan elsısorban nagyobb konformációs különbségek, valamint fehérje-fehérje kölcsönhatások, komplexek megfigyelésére alkalmas. Az összes kísérletes megoldáshoz nagy fehérje koncentráció szükséges, és a membránfehérjék esetében a problémák már ennél a kritériumnál elkezdıdnek (1. táblázat).
Módszer
Szükséges fehérje
Kristály
Felbontás (Å)
koncentráció (mg/ml) Röntgenkrisztallográfia
10
Szükséges (3D)
1,5-2,5
EM krisztallográfia (kis target)
1
Szükséges (2D)
1,9-4
EM krisztallográfia (nagy target)
0,1
Nem szükséges
10-20
NMR-spektroszkópia
10
Nem szükséges
Nem értelmezhetı
1. táblázat A kísérletes szerkezet-vizsgálati módszerek összehasonlítása (Lacapere és mtsai, 2007)
A membránfehérjék túltermeltetése mind az eukarióta, mind a prokarióta szervezetekben komoly kihívást jelent. Szerkezetvizsgálati szempontból azok a fehérjék jelentenek könnyebb feladatot, amik eleve nagy mennyiségben fordulnak elı (pl. rodopszin, citokrómok). A célfehérje azonban legtöbbször kis mennyiségben van jelen és mennyiségük megnövelése gyakran önmagában toxikus a gazdasejt számára. A prokarióta eredető fehérjéknél a legkedveltebb heterológ expressziós gazdaszervezet még napjainkban is az Escherichia coli. A MP-ek expressziójakor tapasztalható toxicitás egyik oka a szekréciós rendszer túlterhelése, aminek következményeként a légzési lánc, a citromsav ciklus és más fontos endogén proteinek mennyisége lecsökken (Wagner és mtsai,
19
2007). A toxicitás problémája mellett a topológia és a háromdimenziós szerkezet kialakításának a folyamata is eltér(het) az idegen környezetben. Még több faktor nehezíti az eukarióta eretedő fehérjék túltermeltetését prokarióta gazdaszervezetekben. A prokariótákban ugyanis jelentısen eltérı a lipid összetétel (pl. a membránból hiányzik a koleszterin), a dajka-fehérjék mennyisége, a fehérje szintézis sebessége, a folding sebessége, a szekréció mechanizmusa, kisebb a betölthetı membránfelület, inkomplett vagy hiányzik a poszttranszlációs modifikáció (pl. nincs glikoziláció) (Wagner és mtsai, 2006). Az általában jól mőködı „pozitív belül” szabály az eukarióta fehérjéknél kevésbé markáns. Mindezek ellenére vannak példák eukarióta MP-k funkcióképes formában történı heterológ expressziójára (pl.: humán CB2 receptor, emlıs SERT). A sikeres termeltetést követıen a target fehérjét ki kell tisztítani. Ennek megkönnyítése érdekében gyakran módosítják a célfehérje szekvenciáját (leggyakrabban His-taggel). A membránfehérjék helyes térszerkezetének kialakításához és megtartásához a lipid-közeg elengedhetetlenül szükséges. Amennyiben a túltermeltetés során a fehérje a gazdaszervezet membránjába képes beépülni, akkor a tisztítás lehetséges ún. detergens micellák létrehozásával. Különbözı detergensek kipróbálásával és a preparálás körülményeinek változtatásával szerencsés esetben megırizhetı a fehérje aktivitása. Ha a target fehérje zárvány testet (inclusion body) képez, akkor a tisztítás jóval bonyolultabb és nehezebb, hiszen a fehérje normál szerkezetét is vissza kell állítani. A tisztítás módszere nagyban függ a fehérje egyedi tulajdonságaitól, emiatt gyakorlatilag csak speciális megoldások léteznek, nincs általánosan alkalmazható technika. Egy lehetséges megoldás lehet a fenti problémákra a sejtextraktumokkal történı in vitro fehérjetermeltetés. Ez a sejtben történı expresszió számos problémáját megkerüli, és ezért komoly elırelépéssel kecsegtet a membránproteinek szerkezetvizsgálatában. A módszer elınye a könnyebb tisztíthatóság, a jó konverziós arány és az, hogy a termeltetés körülményei széles skálán változtathatók. A reakciót továbbá ki lehet egészíteni egyéb szükséges összetevıkkel,
mint
például
dajka-fehérjékkel,
diszulfid
izomerázzal,
glikozilációs
enzimekkel. A fehérjék könnyebb izotópos jelölése mellett, lehetséges speciális hidrofób közegek elıállítása is, akár membránba illesztés is. A kapott fehérjemennyiség eléri a szerkezetvizsgálathoz szükséges mg/ml-es koncentrációt (Junge és mtsai, 2008). A tisztított fehérje sorsa ezután a választott szerkezet-meghatározó módszertıl függ. Túlnyomó többségben a röntgenkrisztallográfiát és az NMR spektroszkópiát használják napjainkban. A két módszer alkalmazhatósága eltérı, emiatt más szerkezeti kérdések 20
megválaszolására használhatók. Kisebb mérető proteinek vagy peptidek vizsgálatára (<40 kDa) inkább az NMR spektroszkópia alkalmas. A módszer óriási elınye, hogy a minta oldatban, a fiziológiáshoz közelebbi körülmények között is analizálható, így lehetıvé teszi különbözı dinamikus folyamatok megfigyelését is (Tamm és Liang, 2006). Nagyobb
proteinek
röntgenkrisztallográfiával
vagy
elektronkrisztallográfiával
vizsgálhatók, amihez azonban már két- illetve háromdimenziós kristályokra van szükség. Az analizálható maximális fehérje méretet jelenleg a számítógépes kiértékelési kapacitás korlátozza.
2.4.2.1 Mennyire elfogadható a kapott szerkezet? A fentiekbıl már érzékelhetı, hogy a térszerkezet-vizsgálat bonyolult folyamatsorában több lépés is erısen befolyásol(hat)ja a célfehérje szerkezetét. A szerkezet konkrét meghatározása is a valós környezettıl nagyon eltérı közegben történik. In vivo körülmények között a TMP-k membránokba ágyazva, specifikus lipid-összetételő közegben vannak. A speciális környezet megváltozása önmagában a harmadlagos szerkezet változásához vezethet. A lipid-kettısréteg hiánya a háromdimenziós fehérje kristályokban olyan szerkezetet eredményezhet, amely messze áll a funkcionális formától. Az oldat-közegő NMR vizsgálatok sem mentesek a problémáktól, pédául gyakran figyelhetık meg instabil negyedleges szerkezet módosulások (Lacapere és mtsai, 2007). A szerkezet-vizsgálat emiatt speciális szakértelmet és összetett laboratóriumi hátteret igényel.
2.5 Transzportfolyamatok Escherichia coliban
A Gram-negatív baktériumok sajátossága, hogy a citoplazma membránon kívül, egy sajátos összetételő, a sejtfal részét képezı külsı membránnal (KM) is rendelkeznek (8. ábra). A külsı membrán szelektív határoló funkciót lát el, megvédi a baktérium sejtet a környezetében lévı káros anyagoktól. A belsı membrántól eltérıen a KM aszimmetrikus felépítéső: a belsı foszfolipid réteg mellett egy külsı lipopoliszacharid réteg alkotja. A membrán tömegének mintegy 50 %-át adják az itt található membránfehérjék (sejtenként kb. 100000 db), amelyek β-hordó típusú szerkezettel rendelkeznek. 21
A periplazmatikus térben nincs ATP és proton grádiens (Bos és mtsai, 2007), így közvetlen felhasználható energiaforrás hiányában a molekulák túlnyomórészt passzív transzporttal jutnak át a membránon.
8. ábra Az E. coli sejt keresztmetszeti képe (mővészi ábrázolás) Származás: http://mgl.scripps.edu/people/goodsell; David S. Godsell engedélyével.
A KM a belsı membránhoz képest nagyobb áteresztıképességő, viszont a speciális lipopoliszacharid külsı rétegnek köszönhetıen a hidrofób karakterő anyagok bejutását hatékonyan képes gátolni. A 600 Dalton-nál kisebb molekulasúlyú hidrofil karakterő anyagok könnyen átdiffundálnak a széles szubsztrátspecifitású porinokon keresztül a periplazmatikus térbe. A nagyobb molekulák transzportját specifikus csatornák végzik. Léteznek bonyolult aktív transzport folyamatok is a külsı membránban. Ilyen például a TonB rendszer, amely a belsı membrán protonmotoros erejének felhasználásával energetizálja a KM-ben zajló receptor-mediált felvételi folyamatokat (Wandersman és Delepelaire, 2004). A baktérium sejt térfogatának mintegy 10 %-át adó periplazmatikus térben a citoplazmához képest eltérı körülmények vannak. A jelenlévı nagy mennyiségő fehérje és poliszacharid miatt a fehérjék diffúziójának sebessége mintegy két nagységrenddel kisebb a citoplazmához képest (Foley és mtsai, 1989). A periplazma oxidatív közege lehetıvé teszi a diszulfid hidak kialakulását. A periplazmatikus térbıl a hidrofil metabolitok már aktív transzporttal jutnak tovább. E. coliban ez történhet csatorna-fehérjéken keresztül facilitált diffúzióval (pl. aquaporinok), valamint elsıdleges és másodlagos aktív transzporttal is. Az elsıdleges aktív transzportot ABC-fehérjék (ATP-binding cassette) végzik. Az E. coli 79 ABC-transzportert kódol, egy 22
részüknél ma sem ismert a pontos funkció. Alapszerkezetükre jellemzı, hogy két transzmembrán doménhez két ABC-domén kapcsolódik. A bakteriális ABC-transzporterek effluxot és influxot egyaránt katalizálhatnak. Influx esetén egy, a szubsztrát megkötését és szállítását végzı, periplazmatikus szubsztrát-kötı fehérje is segíti a hatékonyabb transzportot. A másodlagos aktív transzporterek elsısorban H+, ritkán Na+ vagy más oldott anyag koncentrációkülönbségét használják fel a szubsztrát mozgatásához. A transzport iránya alapján megkülönböztetünk antiportereket (ellentétes irányú; pl.: NhaA) és szimportereket (azonos irányú; pl.:PutP).
2.5.1 A metionin-transzport Escherichia coliban
A metionin transzportról kevés információ áll rendelkezésünkre. Az egyik legkorábbi vizsgálat bizonyította, hogy az L-metionin felvételét legalább két transzportrendszer végzi (Kadner és Watson, 1974). Különbözı mutációt hordozó törzsek fenotípusa alapján megkülönböztethetı volt egy nagy affinitású (metD; KD= 0,1 µM), valamint egy kisebb affinitású (metP; KD=40 µM) transzporter. A metionin felvétel kinetikáját már a 70-es évek második felében jellemezték, azonban a transzportban résztvevı fehérjéket és az azokat kódoló géneket még ma sem ismerjük teljesen (9. ábra).
9. ábra Metionin transzporterek E. coliban
A metionin az E. coli számára nem eszenciális aminosav, B12-vitamin-függı (MetH) és független (MetE) módon is képes megszintetizálni. A bioszintézisben résztvevı gének
23
inaktiválásával metionin auxotróf törzseket lehet izolálni, amelyek metionin igénye Dmetioninnal is biztosítható. A D-metionin kizárólagos transzportere a nagy affinitású rendszer, amely az L- és D-metionin mellett a sejt számára toxikus α-metil-metionint és egyéb metionin-analógokat is transzportál. A D-metionin transzportja ATP-függı, valamint ozmotikus sokk érzékeny. Ez utóbbi tulajdonság egy periplazmatikus kötı-fehérje jelenlétére utal, és együttesen e jellemzık a bakteriális ABC-transzporterek sajátosságai. A nagy és kis affinitású rendszert a citoplazma L-metionin koncentrációja szabályozza. A metD esetén bizonyos, hogy a MetJ represszor képes befolyásolni az expressziót (Kadner, 1977). Kapcsoltság alapján a metD lokalizációját egészen pontosan meg lehetett határozni: a lókusz az E. coli genom proS (4,7 perc) és rrnH (4,8 perc) között helyezkedik el (Bohman és Isaksson, 1980; Ellwood és Nomura, 1982; Berlyn, 1998). A lókusz konkrét azonosítása képezi a jelen dolgozat egy részét. A metP még a nagy affinitású rendszerhez képest is jóval kevésbé jellemzett, a kinetikai adatokon kívül szinte nincs is róla más információ, a felelıs géneket még nem azonosították. A kis affinitású rendszer jelenlétére Kadner és Watson mutagenezis kísérletekbıl (1974) következtetett. A nagy affinitású rendszer kiiktatása csak a D-metion felvételét akadályozza meg, viszont nem befolyásolja az E. coli L-metionin minimál tápoldatban való szaporodását. A mutagenezis során izoláltak olyan törzseket is, amelyek nem tudták a D-metionint transzportálni és az L-metionin transzportjuk is módosult volt. Alacsony külsı L-metionin koncentráció (10 µg/ml) esetén csak nagyon lassan osztódtak, míg 100 µg/ml L-metionin mellett nem tapasztaltak szaporodási különbséget a ∆metD vagy vad típusú törzsekkel összehasonlítva. Utóbbi tapasztalat arra utal, hogy valójában három transzporter végez Lmetionin felvételt Escherichia coliban, a harmadik rendszer lehet egy metionin-analóg transzportere, vagy egy kevésbé specifikus aminosav permeáz.
2.5.2 A glutaminsav-transzport Escherichia coliban
A glutaminsav egy központi jelentıségő aminosav, a glutaminnal együtt a legfontosabb amino-csoport donor és nitrogén-forrás (Reitzer, 2003). A legnagyobb mennyiségben elıforduló anion a citoplazmában, amely a fı ozmotikum K+ ellenionjaként van jelen. Hiperozmotikus sokk esetén idıleges védıfaktorként viselkedik és a K+-mal együtt
24
megnövekszik a glutamát koncentráció (Csonka, 1989), illetve szabályozó faktorként biztosítja a megfelelı adaptációhoz szükséges gének expressziójának aktiválását és gátlását (Lee és Gralla, 2004; Gralla és Vargas, 2006). Egy másik igen fontos glutaminsavhoz kapcsolódó folyamat az extrém savstresszel (pH=2-3) szembeni védekezés egyik formája. A citoplazmatikus
pH
gyors
csökkenésének
ellensúlyozására
a
glutaminsav-pool
dekarboxilezése zajlik le, amely során egy H+ beépülésével γ-amino-vajsav (és CO2) keletkezik, amit a GadC antiporter kijuttat a sejtbıl (Foster, 2004). A glutaminsav felvételére is jellemzı a multiplicitás, Escherichia coliban négy felvételi rendszer létezik, amelyek transzporttulajdonságaik alapján jól elkülöníthetıek (10. ábra).
10. ábra Glutamát transzporterek E. coliban
A GltP egy H+/aszpartát-glutamát transzporter, amely β-hidroxi-aszpartáttal és ciszteáttal gátolható, kötı-fehérje independens. (Rhodobacterben visszaállította a glutamát-specifikus kemotaxist.) A GltIJK egy aszpartát/glutamát specifikus ABC-transzporter rendszer, ozmotikus sokk érzékeny és ciszteáttal gátolható. A harmadik transzporter (GltS) az E. coliban található néhány Na+-szimporter egyike, kötı-fehérje független, kizárólag glutamátot és annak analógjait képes felvenni, aszpartáttal nem gátolható. A negyedik rendszer az extrém savstressz során mőködı GadC, egy glutamát/γ-amino-vajsav antiporter. A glutamát-transzport szabályozásáról keveset tudunk. A négy rendszer együttes kifejezıdése vad típusú E. coli törzsekben olyan alacsony, hogy azok glutaminsavat, mint egyedüli szén- és nitrogénforrást tartalmazó táptalajon nem képesek szaporodni (Halpern és Even-Shosahan, 1967). A fentieken kívül néhány egymástól független kísérlet szolgáltatott adatot a regulációról, szisztematikus vizsgálatot azonban még nem végeztek. A tapasztalat szerint szukcinát
25
minimál tápoldatban a GltI kötı-fehérje mennyisége 3-5-szörösére növekszik a glükóz minimálhoz tápoldathoz képest (Willis és Furlong, 1975). Aszpartát minimálon tápoldatban a glutamát felvétel kb. ötszörösére növekszik, amelyért feltehetıen a GltS mennyiségének növekedése felelıs (Kahane és mtsai, 1976). Zimmer és mtsai (2000) a gltIJKL expressziójának növekedését tapasztalták nitrogén-limitált közegben microarray-kísérletben.
A GltS E. coliban 40 mM NaCl jelenlétében a glutaminsav transzport nagy részét a Na+-függı glutaminsav szimporter (GltS) végzi (Schellenberg és Furlong, 1977). A GltS fehérje egy 401 aminosavból felépülı, erısen hidrofób természető permeáz. Az aminosavak 73%-a nem poláris, 63 közülük leucin. Az E. coli K-12 törzsben 42425, míg a B-ben 42455 dalton molekulatömegő (az utóbbiban a 378. aminosav glicin helyett szerin). A GltS elısegíti néhány toxikus L-glutaminsav analóg, az alfa-metil-glutaminsav, a homociszteinsav (Essenberg, 1984) és a sejtfal komponens D-glutaminsav felvételét is. Mőködése során egy glutaminsavval legalább kettı Na+-t transzportál a citoplazmatikus térbe (Tolner és mtsai, 1995). A GltS génje a baktérium kromoszómájának 82. percére térképezıdik (Marcus és Halpern, 1969). A gltS struktúrgén ATG startkodonjától 5’ irányban a konszenzushoz közeli -35-ös, 10-es és Shine-Dalgarno-szekvenciák találhatóak, terminációja feltehetıen rho-independens (Deguchi és mtsai, 1990; Kálmán és mtsai, 1991). A gltS gén túl magas szintő kifejezıdése mint általában a membránfehérjéké - gátolja a növekedést (Kálmán és mtsai, 1991). A GltS szekvenciáját, mőködését tekintve is jelentısen eltér a többi glutaminsav transzportertıl (Tolner és mtsai, 1995), emiatt a hozzá hasonló proteinekkel együttesen egy önálló családba sorolták (Saier, 2000). Ebbe az ún. ESS-családba (Glutamate:Na+ Symporter; TC #2.A.27) jelenleg több, mint 220 fehérje tartozik, legjellemzettebb tagja és modell fehérjéje az E. coli GltS. A nagyszámú homológ fehérje különbözı baktérium törzsekbıl származik, némelyik több GltS-ortológot is kódol (pl. Fusobacterium nucleatum). A GltS pontos élettani feladata még nem tisztázott, de a glutaminsav számos fontos szerepe alapján lehetséges a részvétele a hiperozmotikus stressz, az extrém savstressz és a nitrogén metabolizmus folyamataiban. A Na+-kotranszporterek esetében feltételezhetı, hogy funkciójuk a szimbiózissal vagy a patogenitással kapcsolatos (Hase és mtsai, 2001). Utóbbi
26
lehetıséget támasztja alá az a tény, hogy a GltS homológokat sok esetben patogén mikroorganizmusok kódolják. A kinetikai mérések alapján a GltS 10-15 mM-nál nagyobb Na+ koncentrációjú közegben biztosít hatékony transzportot (és esetlegesen evolúciós elınyt) a hordozó baktériumok számára. A GltS szerkezete nem ismert, a fehérje kétdimenziós struktúrájának vizsgálata a jelen dolgozat tárgyát képezi.
27
3. Célkitőzés 1. Szakirodalmi adatok alapján valószínősítettük, hogy az E. coli nagy affinitású metionin transzporterét (MetD) az abc-yaeE-yaeC klaszter kódolja. Célunk ennek a feltételezésnek a kísérletes bizonyítása volt.
2. A GltS glutamát permeáz szerkezete nem ismert. Célunk a GltS kétdimenziós membránbeli lefutásának meghatározása volt molekuláris biológiai eszközök felhasználásával.
28
4. Anyagok és módszerek 4.1 Bakteriális törzsek és plazmidok Klónozási célokra E. coli DH5α (F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZ∆M15 ∆(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK- mK+), λ–) törzset alkalmaztunk. A λTnphoA szaporítására az amber szupresszor LE392 [e14-(mcrA), hsdR514, supE44, supF58, D(lacIZY)6, galK2, galT22, metB1, trpR55] E. coli törzset használtuk. A λTnphoA mutagenezist, az egyirányú deléciókat és a mutánsok screeningjét az alkalikus foszfatáz-, βgalaktozidáz- és rekombináció-deficiens CC118 (Manoil és Beckwith, 1985) [araD139, D(ara,leu)7697, DlacX74, phoAD20, galE, galK, thi, rpsE, rpoB, argEam, recA1] E. coli törzsben végeztük. A metionin transzport vizsgálatakor a metionin auxotróf MTD23 (∆metE, ∆metH) és az MTD234 (∆metE, ∆metH, ∆mmuP) törzseket használtuk fel (Thanbichler és mtsai, 1999). Az abc promóterének vizsgálatát a JM109 (endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ ∆(lac-proAB) e14- [F' traD36 proAB+ lacIq lacZ∆M15] hsdR17(rK-mK+)) törzsben végeztük. A GltS topológia vizsgálatához a pCP1(−) direkt szelekciós vektorból (Gál és mtsai, 1999) indultunk ki. A gltS gén folyamatos, gyenge kifejezıdését az E. coli módosított lac promótere biztosítja. Ezek a plazmidok sejtenként kb. 40 kópiában vannak jelen. A metionin transzporttért felelıs gének expressziójához az arabinózzal indukálható pBADexpressziós vektorokat alkalmaztuk (Guzman és mtsai, 1995). A kromoszómális deletánsok létrehozásához a kanamicin rezisztencia kazetta a pUC4K plazmidból (Pharmacia) származik. A promóter teszteléséhez a pRS415 vektort használtuk (Simons és mtsai, 1987). A MetJ represszor génjét a pWMJ plazmidból hasítottuk ki (Nakamori és mtsai, 1999).
4.2 Vegyszerek A táptalajkomponenseket a Difco-tól, a Reanal-tól és a Molar Chemicals-tól szereztük be. Az 5-bróm-4-klór-3-indolil-foszfát (BCIP), az 5-bróm-4-klór-3-indolil-β-D-galaktozid (Xgal), a para-nitrofenil-foszfát (Sigma 104), az orto-nitrofenil-β-D-galaktopiranozid, az L- és D-
29
metionin, az α-metil-metionin, az arabinóz és az egyéb felhasznált vegyszerek a Sigma-tól származnak. A felhasznált restrikciós enzimeket a New England Biolabstıl és az MBI Fermentastól, az exonukleáz III-at, az S1 nukleázt, a T4 DNS polimerázt és a T4 DNS ligázt az MBI Fermentastól szereztük be. Pfu és Taq polimerázokat ugyancsak az MBI Fermentastól valamint a Zenon Kft-tıl szereztük be. Az enzimatikus reakciókat, valamint a polimeráz láncreakciókat a gyártók javaslatai szerint végeztük. A riporterek detektálásához szükséges tormaperoxidáz konjugált antitesteket (ab6646 és ab7319) az Abcam-tıl vásároltuk. A peroxidáz aktivitás detektálását kemilumineszcenciás módszerrel végeztük; ehhez a SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce) és a Lumi-light Western Blotting Substrate (Roche) oldatait használtuk.
4.3 Tápoldatok és táptalajok Minimál tápközegként M9-oldatot alkalmaztunk (0,2 % glükóz; Maniatis és mtsai, 1982), szükség szerint kiegészítve 3,3-100 µg/ml L- és 10 µg/ml D-metioninnal, 250 µg/ml α-metilmetioninnal. A pBAD18 és 33 vektorok alkalmazásakor a fehérjék expresszióját 0,05 % arabinózzal indukáltuk. A foszfatáz aktivitás méréséhez az alacsony foszfáttartalmú PAT tápoldatban növesztettük a baktériumokat. 10 g triptont, 5 g élesztı kivonatot és 2,5 g NaCl-t 200 ml desztillált vízben melegítéssel feloldottunk. 0ºC-ra való lehőtés után kevertetés mellett hozzáadtunk 2,28 ml 25% NH4OH-t és 30 ml 1 M MgCl2-t, majd 0ºC-on kevertettük 2 órán át. Az anorganikus foszfát MgNH4PO4 csapadék formájában kiválik. 0,22 mm pórusátmérıjő Millipore szőrın kétszer átszőrtük az oldatot. Ezután hozzáadtunk 10 g MOPS-t, és 1000 ml-re egészítettük ki a térfogatot. Végül az oldathoz 1 ml 1 M MgSO4-t és 1 ml 1 M CaCl2-t adtunk, a pH-t 7,0-re állítottuk (37% HCl oldattal), majd kuktázva sterilizáltuk. Minden más kísérletben LB tápközeget (Maniatis és mtsai, 1982) használtunk. A táptalajokat 1,7 % agarral szilárdítottuk. Az Xgal-t 50 µg/ml, a BCIP-et 40 µg/ml, a kanamicint 50 µg/ml, kloramfenikolt 35 µg/ml, ampicillint 100 µg/ml koncentrációban használtuk, kivéve a pCP1(−)::TnphoA dúsításakor, amikor 300 µg/ml kanamicint alkalmaztunk.
30
4.4 Plazmidtisztítás és transzformálás
A plazmid DNS-t hagyományos alkalikus lízises technikával (Maniatis és mtsai, 1982), illetve a Qiagen kitjeit használva tisztítottuk. A DNS transzformálását a CaCl2-módszerrel (Maniatis és mtsai, 1982), vagy elektroporációval (Invitrogen, The Electroporator II Manual) végeztük.
4.5 A metD lókusz azonosításánál alkalmazott módszerek 4.5.1 A metD promóterének vizsgálatához szükséges plazmidok készítése A promóter fragmentet a GJ37 (5’-AATTCTTGATTTAGACGTCTGGATGCCTTAACATCCATTTCATTG-3’) és GJ38 (5’-GATCCCAATGAAATGGATGTTAAGGCATCCAGACGTCTAAATCAAG-3’) primerek hibridizálásával állítottuk elı (11. ábra). A szekvenciát úgy terveztük, hogy EcoRI-BamHI kompatibilis ragadós végekkel rendelkezzen. A promótert ezután EcoRI-BamHI hasított pRS415 promóter-tesztelı vektorba (Simons és mtsai, 1987) ligáltuk (pROMET1). A szabályzás vizsgálatához szükségünk volt egy MetJ represszort túltermelı konstrukcióra is. A MetJ gént a pWMJ plazmidból XbaI-KpnI fragmentként átépítettük a pBAD33 expressziós vektorba (pMJ33).
11. ábra A metionin transzporter anzonosításához felhasznált primerek helyzete A sigma 70-es konszenzus promóterrel megegyezı nukleotidokat vastag betőkkel emeltem ki.
31
4.5.2 Kromoszómális deléciók létrehozása Delécióinkat ET-klónozással alakítottuk ki (Muyrers és mtsai, 1999). A céltörzsbe elıször betranszformáltuk a pBADαβγ plazmidot, ezután ebbıl készítettünk elektrokompetens sejteket. Éjszakán át növesztett starter kultúrát 100-szorosan visszahigítunk, majd 37 °C fokon inkubáltuk. Amikor a sejtdenzitás elérte az OD600 = 0,2 értéket, 0,1 % arabinózzal indukáltuk a sejtkultúrát, amit további 1 óra inkubálás után 0 °C fokra hőtöttünk. A sejteket centrifugálás után kétszer mostuk jéghideg desztillált vízzel, majd kétszer 10 %-os glicerinnel, végül 300-szorosan koncentrálva 10 %-os glicerinben vettük fel. Szétmérés után a csöveket folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, majd -80 °C fokon tároltuk. Az elıre elkészített kompetens sejtekbe 100-500 ng lineáris DNS-t elektroporáltunk, majd a sejteket kanamicin tartalmú LB lemezekre szélesztettük. A MetD kiiktatásához készítettünk egy deletáló konstrukciót, amelyben a metD körüli kromoszómális DNS szekevenciák közé egy kanamicin rezisztencia kazettát építettünk. A GJ28 (5’-ATGCATAGTTAGTCGTGGCATCTCGA -3’) és GJ29 (5’-AGAAGCGGCCATATCAATATG -3’) valamint a GJ35 (5’-GTCGACGCCTATTTGCTCGAACTG -3’) és GJ36
(5’-ATGCATTTTTAGGCTGTTTCCACAATT-3’)
primerek
felhasználásával
amplifikáltuk az upstream és downstream kromoszómális szekvencia-környezet, majd a fragmenteket XcmI emésztett T-vektorba ligáltuk (pMON38201). Az upstream határoló szekvenciát hordozó plazmidból (GJ35-36 termék) a kis NsiI-SalI fragmentet átépítettük az ugyanígy hasított másik kromoszómális szekvenciát hordozó vektorba. Ezek után az NsiI helyre építettük a kanamicin rezisztencia kazettát (PstI/pUC4K). A kész konstrukcióból BamHI-SalI emésztéssel kihasítottuk a deletáló konstrukciót, majd izolálás után elektroporáltuk a fenti módon ET-klónozáshoz elıkészített K-12 törzsbe. A kapott kanamicin rezisztens telepeket PCR-rel teszteltük a GJ29-35 primerekkel. A
fenotípus
teszteléséhez
metionin-auxotróf
(MTD23),
illetve
S-metil-metionin
transzporter (mmuP) deléciós E. coliba (MTD234) is átvittük a metD deléciót P1 fágtranszdukcióval.
4.5.3 Komplementáló plazmidok készítése Az abc, yaeE és yaeC géneket kolónia PCR-rel, Pfu polimerázzal felamplifikáltuk. A felhasznált
primerek
a
következık
voltak:
32
GJ48
(5’-TCACGGTACCGAGA-
TGCCACGACTAACTT-3’) és GJ49 (5’-CACATCTAGAGCTCAGACATAACCCAGTAC3’) az abc, GJ50 (5’-TCACGGTACCTGCCTGGCTGCAGGAACAC-3’) és GJ51 (5’TCACTCTAGATGTTGTGTTGAACGTTACTTG-3’) a yaeE, GJ52 (5’-TCACGGTACCACTCGCAAGTAACGTTCACC-3’) és GJ53 (5’-CACATCTAGATTACCAGCCTTTAACAGCTC-3’) a yaeC klónozásához. A fragmenteket XbaI-KpnI emésztés (és gélizolálás) után pBC SK (-) klónozó vektorba ligáltuk, végül restrikciós ellenırzés után szekvenáltattuk a géneket. A fenotípus teszteléséhez expressziós vektorokba (pBAD18 és 33) építettük át a géneket egyenként, illetve egy negyedik konstrukcióban az abc és yaeE géneket együttesen. A konstrukciók segítségével lehetıvé vált, hogy az összes variációban expresszáljuk a géneket.
4.6 A topológia vizsgálatához felhasznált módszerek 4.6.1 A TnphoA Fúziós fehérjék létrehozásának legegyszerőbb módja a transzpozonos mutagenezis. A TnphoA-t (12. ábra) úgy hozták létre, hogy a Tn5 baloldali inszerciós elemébe beillesztették az E. coli szignál szekvencia nélküli alkalikus foszfatáz génjét (Manoil és Beckwith, 1985). Emiatt a phoA’ egy 50 bázispár hosszúságú Tn5 eredető linkerrel kapcsolódik a fúziós partnerhez. Magas foszfatáz aktivitást akkor tapasztalunk, ha a TnphoA a megfelelı leolvasási keretben egy periplazmatikus fehérjerészt kódoló szekvenciába épül. A mutánsokat a transzpozon által biztosított kanamicin rezisztencia révén tudtuk elkülöníteni.
12. ábra. A TnphoA vázlatos szerkezete
4.6.2 A λTnphoA szaporítása és titrálása
A λTnphoA (Manoil és Beckwith, 1985) szaporítása, hígítása és titrálása során mindig 10 mM MgSO4-tartalmú közegben dolgoztunk. A λTnphoA szaporítását hagyományos protokoll alapján végeztük (Maniatis és mtsai, 1982). 100 µl, éjszakán át LB tápoldatban növesztett 33
LE392 kultúrához kb. 3×106 λTnphoA fágot adtunk, majd 37 °C-on 20 percig inkubáltuk rázatás nélkül. Ezután hozzáadtunk 4 ml LB-t, és 37 °C-on, feltisztulásáig intenzíven rázattuk a kultúrát. Ezután 100 µl kloroformot adtunk a szuszpenzióhoz, vortexszel kevertük, majd 4 °C-on tároltuk felhasználásig. A fág titrálásához elkészítettük a preparátumok 105-szeres és 107-szeres hígítását. 100 µl hígított fágot adtunk 200 µl, éjszakán át növesztett LE392 kultúrához, majd 4 ml megolvasztott, kb. 50 °C-os 0,7 % agar LB-vel keverve 1,5 % agarral szilárdított táptalajra terítettük. A preparátumok titerére az éjszakán át, 37 °C-on való inkubáció után kapott plakkok számából, visszaszámolással következtettünk. A preparátumok koncentrációja 2-3×1010 PFU/ml volt.
4.6.3 λTnphoA mutagenezis és screening
Éjszakán át növesztett, a pCP1(−) plazmidot hordozó CC118 törzset húszszorosan visszahígítottunk LB tápoldattal, kb. OD600 = 0.6-ig növesztettük, majd kb. tízszeres feleslegben λTnphoA fággal fertıztük. Ez a fág a genomjában nonsense mutációkat, ún. amber-mutációkat hordoz, emiatt csak speciális amber szupresszor törzsön, pl. az LE392 E. coli törzsön szaporítható. A CC118 nem amber szupresszor törzs, emiatt a λTnphoA ugyan bejuttatja genomját a sejtekbe, de nem képes azokban szaporodni. 20 percig inkubáltuk az elegyeket szobahımérsékleten, majd 37 °C-on rázattuk egy órán át. A mutagenezis hatékonyságának megállapítására az elegy egy részét szélesztettük BCIP/Km/Cm tartalmú táptalajra. Az elegyet 35-szörösre hígítottuk 30 µg/ml kloramfenikolt és 50 µg/ml kanamicint tartalmazó LB tápoldattal, majd másfél óráig rázattuk 37 °C-on. Ekkor a kanamicin koncentrációját 300 µg/ml-re növeltük azért, hogy a transzpozont a pCP1(-)-on hordozó sejtek növekedését segítsük elı. Ezután a sejtkultúrákat 37 °C-on egész éjszakán át tovább növesztettük. A felszaporodó sejteket BCIP/Km/Cm tartalmú táptalajon teszteltük. A kromogén BCIP-et az alkalikus foszfatáz kék színő termékké alakítja, így vizuálisan elkülöníthetıek az aktív GltS::PhoA fúziót termelı kolóniák.
34
4.6.4 A pGE1 és pGL2 plazmidok készítése Az egyirányú deléciók kivitelezéséhez olyan plazmidokat készítettünk, amelyek a gltS után megfelelı restrikciós hasítóhelyeket és a start kodon nélküli phoA (pGE1) és lacZ (pGL2) riporter géneket tartalmazták. A pGE1 esetében a pBC SK(−) poliklónozó helyét BssHII-BssHII fragmentként beklónoztuk a pCP1(−) MluI helyére. A megfelelı orientációt ClaI restrikciós enzimmel ellenıriztük. A pGE1 esetében a létrehozott pCP-NPX plazmidot PstI és XhoI restrikciós enzimekkel hasítottuk, majd beligáltuk a pPHO7-bıl a megegyezı enzimekkel kihasított, phoA’-ot tartalmazó fragmentet. A pGL2 konstrukciója során a pCP-NPX-bıl ApaLI és SphI restrikciós hasítással eltávolítottuk a nem expresszálódó lacZα fragmentet. A keletkezett pCPII-NPX-et PstI és NcoI restrikciós enzimekkel hasítottuk, majd beligáltuk a pNM482 PstI-NcoI fragmentjét, ami a start kodon nélküli lacZ struktúrgént hordozza. Az irányított lacZ fúziók kialakításához egy hosszabb linkert hordozó pGL2 származékot is készítettünk (pGL3). Ez esetben a pNM482 SmaI-NcoI nagy fragmentjét ligáltuk az ugyanezekkel az enzimekkel emésztett pCP-NPX-be.
4.6.5 Egyirányú deléciók kialakítása Az exonukleáz III a DNS szálainak 3’ végeit rövidíti. A folyamatos emésztés eredményeképpen 5’ egyes szálú túlnyúló végek keletkeznek. Ha a reakcióelegybe az enzimet feleslegben adjuk, akkor a molekulák többségében az emésztıdés ugyanakkora sebességgel történik. Megfigyelték, hogy a legalább négy nukleotidból álló túlnyúló 3’ végek megakadályozzák az exonukleáz III támadását (Henikoff, 1984). Egy megfelelıen kialakított DNS molekulát tehát exonukleáz III-as, majd S1 nukleázos kezeléssel lehetséges kontrollálható módon az egyik vége felıl megrövidíteni (13. ábra). A deléciókat NotI és PstI restrikciós enzimekkel hasított pGE1 és pGL2 vektorok felhasználásával végeztük. A riporter géneket a PstI restriciós enzim által kialakított 3’ túlnyúló véggel védelmeztük. A reakciót Henikoff (1987) leírása alapján végeztük. Kísérleteinkben elızetes méréseink szerint 35 °Con az exonukleáz III emésztés sebessége 300 nukleotid/perc volt. A reakciókat az exonukleáz
35
III hozzáadásával indítottuk el, majd 15 másodpercenként 2 µl reakcióelegyet átpipettáztunk az elıre elkészített, és jégen tárolt S1 nukleáz elegyekbe.
13. ábra Egyirányú deléciók készítése
Az S1 nukleázos reakciókat az összes minta kimérése után 30 percig szobahımérsékleten inkubáltuk, majd 0,3 M Trizma Base-t és 0,05 M EDTA-t tartalmazó oldattal leállítottuk. Hıinaktiválás és etanolos kicsapás után az esetleges egyes szálú részeket T4 DNS polimerázzal feltöltöttük, illetve leemésztettük, majd a mintákat T4 DNS ligázzal kezeltük. A reakció eredményeképpen a különbözı mélységig csonkolt gltS-hez kapcsolódnak a szignálszekvencia nélküli phoA és lacZ gének. A ligátumot CC118 kompetens sejtekbe
36
transzformáltuk. Az aktív fehérjét termelı vonalak BCIP/Cm, illetve Xgal/Cm tartalmú táptalajon kék színő telepeket adnak.
4.6.6 Fúziók létrehozása polimeráz láncreakcióval Az egyirányú deléciókkal néhány pozíció helyzetét nem sikerült egyértelmően azonosítani. A kérdéses helyekhez irányítottan építettük hozzá a riporter géneket. A gltS megfelelı mérető fragmentjeit Pfu polimerázzal és specifikus oligodukleotidokkal a pCP1(−) templátról amplifikáltuk. Reakcióinkban az egyik primer mindig az AT473 volt, ami a gltS promóteréhez hibridizál. A LacZ fúziókhoz a következı specifikus oligonukleotidokat használtuk fel: a V170-hez a GJ25-öt (5'-CCACCAGACCGAACGTTGCA-3'), a R92-höz a GJ30-at (5'-CACGCCCACCGGCACGCAA-3'), a R273-hoz a GJ31-et (5'-CACGCTCAAAGACG-CGGTA-3') és végül a D334-hez a GJ32-t (5'-CATCGTAGTTTTTGCCCATCA-3'). Az amplifikátumokat BcuI emésztés után a BcuI és SmaI hasított pGL3 plazmidba ligáltuk. Az AT473-GJ32 fargmentet a D334-es PhoA fúzió elkészítéséhez is felhasználtuk, BcuIgyel emésztettük és beépítettük BcuI és SmaI hasított pGE1 plazmidba. A R273 és R92 fúziókat a GJ33 (5'-GTCAGGTACCCCACGCCCACCGGCACGCAA-3') és a GJ34 (5'GTCAGG-TACCCCACGCTCAAAGACGCGGTA-3') primerek felhasználásával készítettük el. A BcuI és SmaI enzimekkel emésztett PCR termékeket a pGE2 plazmidba építettük, amit a D334-es PhoA fúziót hordozó plazmid KpnI helyet tartalmazó XhoI-SmaI fragmentjének deletálásával hoztunk létre.
4.6.7 A fúziós pontok helyének vizsgálata A gltS promóteréhez és a riporter gének elejéhez szintetizált oligonukleotidokkal PCR reakciót végeztünk. Az amplifikált fragmentek méretét 1,5 %-os agaróz gélen molekulasúly marker mellett, az UVP Gelbase program-csomagjának felhasználásával becsültük meg. A felhasznált primerek szekvenciája: AT473 5’-TTAATGTAAGTTAGCTCACTCAT-3’ (a gltS promóteréhez); GJ23 5'-CCTCTTCGCTATTACGCCAG-3' (a lacZ’ elejéhez); 37
GJ7 5’-GCAGTAATATCGCCCTGAGCAG-3’ (a phoA’ elejéhez) Az alkalmazott PCR-program: 94 °C 2,5 perc elızetes denaturáció, 30 ciklus (94 °C 1 perc; 53 °C 1 perc; 72 °C 1,5 perc), majd 72 °C 5 perc. A pontos beépülési helyeket szekvenálással határoztuk meg a GJ7 és GJ23 oligonukleotidok felhasználásával. A szekvenálást a Szegedi Biológiai Központ automata szekvenáló laboratóriumában végeztettük el.
4.6.8 Western-blot A LacZ és PhoA fúziós fehérjéket Western-blottal detektáltuk. A fúziós fehérjéket kódoló plazmidot hordozó CC118 sejtekbıl friss kultúrát növesztettünk. Megfelelı sejtdenzitás elérése után (OD600 = 0,45-0,8) a sejteket lecentrifugáltuk, majd szonikálással feltártuk. A teljes fehérjetartalom mérése után (Bradford, 1976) az azonos összfehérje mennyiségő lizátumokat 1 % SDS, 1 % β-merkaptoetanol, 25 mM Tris-HCl (pH 6,8), 10 % glicerol és 0,001 % brómfenolkék tartalmú oldatban 95 °C-on 5 percig denaturáltuk. A mintákat ezután 6 %-os poliakrilamid gélen választottuk el, majd PVDF membránra (Immobilon-P, Millipore) vittük át elektroforézissel. A fúziós fehérjéket LacZ és PhoA sepcifikus, tormaperoxidázkonjugált poliklonális antitestekkel jelöltük (ab6646, ab7319; Abcam), majd a peroxidáz aktivitást
kemilumineszcens
szubsztráttal
vizualizáltuk
(SuperSignal
West
Pico
Chemiluminescent Substrate (Pierce) vagy Lumi-light Western Blotting Substrate (Roche)). A jeleket Röntgen-filmen rögzítettük.
4.7 Enzimatikus mérések 4.7.1 Az alkalikus foszfatáz aktivitás meghatározása A mérendı törzseket éjszakán át növesztettük foszfát-szegény (PAT) tápoldatban, majd 30-szorosan visszahígítottuk, és OD600 = 0,3-0,5-ig növesztettük. 1 ml baktérium kultúrát lecentrifugáltunk, és a sejteket felszuszpendáltuk 1 ml 1 M Tris-Cl, pH = 8,0 pufferben. Vak próbaként a szuszpenziós puffert használtuk. A szuszpenziókhoz 100 µl 0,4 % para-nitrofenilfoszfátot tartalmazó szuszpenziós puffer oldatot adtunk, és az elegyeket 10-30 percig
38
inkubáltuk 37 °C-on, majd a reakciót 100 µl 1 M K2HPO4-tal állítottuk le. Az elegyeket lecentrifugáltuk, és a felülúszó optikai denzitását 420 nm-en mértük. A foszfatáz aktivitás számolásának képlete: UPhoA= OD420 × 1000 / OD600 × eltelt idı percben (Brickman és Beckwith, 1975).
4.7.2 A β-galaktozidáz aktivitás meghatározása Éjszakán át LB tápoldatban felnövesztett sejtkultúrából 50-szeres hígítást készítettünk, és felszaporítottuk a törzseket OD600 = 0,3-0,5 értékig. Minden kultúrából 800-800 µl-t lecentrifugáltunk és Z-pufferben (Maniatis és mtsai, 1982) felszuszpendáltunk. Újabb centrifugálás után 800 µl Z-pufferben vettük fel a baktériumokat. Minden csıhöz 20 µl kloroformot és 20 µl 0,1 %-os SDS-oldatot cseppentettünk, majd az elegyeket 10 másodpercig vortexeltük. 28 °C-os elıinkubálás után 160 µl 4 mg/ml koncentrációjú, ortonitrofenil-β-D-galaktopiranozid oldattal indítottuk a reakciókat. 10-20 perc inkubálás után a reakciókat 400 µl 1M Na2CO3-oldattal állítottuk le. Az elegyeket lecentrifugáltuk és mértük a felülúszó optikai denzitását 420 és 550 nm-en. A β-galaktozidáz aktivitást (ULacZ) a következı képlettel számoltuk: (OD420 - 1,75×OD550)× 1000 / OD600 × eltelt idı percben (Miller, 1972). Minden enzim aktivitásra vonatkozó adatunk legalább három párhuzamos mérés eredményének az átlaga.
39
5. Eredmények és értékelésük 5.1 A metionin-transzport vizsgálata 5.1.1 A metD lókusz azonosítása Az E. coli metionin transzportjával kapcsolatos elsı adatokat Kadner és munkatársai publikálták 1974-tıl kezdıdıen. Mivel a nagy affinitású rendszer a D-metionin kizárólagos transzportere, a metD fenotípusa könnyen követhetı. Emiatt az E. coli genetikai térképezésénél a metD-t markerként felhasználták, és már a genom-korszakot megelızıen is elég pontosan meghatározták a helyét. Azonosítása azonban az E. coli genomprogram eredményeinek publikálása (Blattner és mtsai, 1997) után sem történt meg. A lókusz azonosításához - a teljes E. coli genomszekvencia ismerete mellett - a következı szakirodalomban elérhetı információk álltak rendelkezésünkre. A géntérképezés eredményei alapján a keresett gén a fhuA és proA (még pontosabban a proS és rrsH) markerek között helyezkedik el (Kadner és Watson, 1974; Berlyn, 1998). A korai biokémiai eredmények alapján tudtuk, hogy egy ABC-transzportert kell keresni (Kadner és Winkler, 1975), amely a MetJ represszor szabályzása alatt áll (Kadner, 1975). A fhuA és proA között mindössze három lehetséges membránfehérje génje található, és ezek közül kettı homológiavizsgálat alapján más funkciót lát el. A harmadik gén viszont egy lehetséges ABC-transzporter, amit a genom bioinformatikai vizsgálatakor tılünk függetlenül is annotáltak (Paulsen és mtsai, 1998; Linton és Higgins, 1998). A talált abc-yaeE-yaeC géneket sorrendben ATPáz domén, transzmembrán domén és egy periplazmatikus kötı fehérje génjeként, tehát egy tipikus bakteriális ABCtranszporter rendszerként írták le, funkciót azonban nem párosítottak a lókuszhoz (14. ábra).
proS
yaeB rcsF yaeC
yaeE
abc
yaeD
rrsH
MET-box 14. ábra A proS-rrsH régió szerkezete az E. coli genomban
A fenti ismeretek birtokában egy neurális hálózat alapú promóter predikciós program segítségével megvizsgáltuk a régió szekvenciáját. Az abc elıtt megtaláltuk a metionin regulon
40
általános szabályzó fehérjéjének kötı-helyét (AGACGTCT; MET-box) két kópiában, 100 és 62,5 % azonossággal. Az abc nyitott leolvasási keretben az ATPázokra jellemzı Walker-A, linker peptid és Walker–B motívumokat találtunk. A szekvenciák további analízisével megállapítottuk, hogy az abc és yaeE nyitott leolvasási keretek nyolc nukleotidnyi szakaszon átfednek egymással. Emellett, a yaeE feltehetıen egy öt TMS-sel rendelkezı membránproteint kódol. A yaeC a yaeE STOP kodonja után kezdıdik 39 nukleotiddal, a kódolt proteinben azonosítható egy lehetséges szignál szekvencia és egy prokarióta lipoprotein kötıhely. Mindezen tapasztalatok alapján, de különösen a MET-boxok jelenlétével, megalapozottá vált az a feltételezés, hogy az L- és D-metionin felvételéért felelıs transzportert az abc-yaeE-yaeC klaszter kódolja.
5.1.1.1 A fenotípus tesztelése Mivel kizárólag a metD felelıs a D-metionin és a toxikus α-metil-metionin (αMM) felvételéért, metionin auxotróf törzsben a fenotípus nyomonkövetése könnyen kivitelezhetı. Egyszerő növesztési kísérletben, D-metioninnal kiegészített és anélküli glükóz minimál tápoldatban (M9) összehasonlítható az egyes törzsek szaporodási képessége.
Törzs
Genotípus, jellemzés
MTD23 MTD234 MK 1958 MK 1962 MK 2053
∆metE, ∆metH, ∆mmuP K-12 ∆metD MTD23 ∆metD MTD234 ∆metD
Növekedés Növekedés M9 + 10 µg/ml DM9 + 250 µg/ml metionin αMM M. Thanbichlertıl
∆metE, ∆metH
pBAD18-abc pBAD18-yaeE pBAD18-yaeC pBAD18-abc-yaeE pBAD18-abc + pBAD33-yaeE pBAD18-abc + pBAD33-yaeC pBAD18-yaeE + pBAD33-yaeC pBAD18-abc-yaeE + pBAD33-yaeC
+ − − −* −* −* −* −* −* −* +*
+
+♦ +♦ +♦ +♦ +♦ +♦ +♦ −♦
2. táblázat A fenotípus tesztelésekor felhasznált törzsek és növekedési képességük *- MK1962 törzsháttér; ♦-MK1958 törzsháttér.
A vizsgált lókusz kiiktatásához egy kanamicin rezisztencia kazettát építettünk az E. coli K12-es törzs abc-yaeE-yaeC génklaszterének helyére ET-rekombinációs módszerrel (Muyrers
41
és mtsai, 1999). Ezt a deléciót transzdukáltuk (P1 fággal) azután különbözı metionin auxotróf törzsekbe a fenotípus vizsgálatához (MTD23 és MTD234; 2. táblázat). A klaszter deléciójának hatását metionin auxotróf törzsháttéren (MK1962-nél) 10 µg/ml Dmetioninnal kiegészített, K-12 törzsháttéren (MK1958-nál) 250 µg/ml α-metil-metioninnal (αMM) kiegészített glükóz minimál (M9) táptalajon vizsgáltuk. Várakozásainknak megfelelıen elıbbi törzs képtelen volt az osztódásra, utóbbi viszont a toxikus szubsztrát mellett is képes volt szaporodni. Ezzel bizonyítást nyert, hogy a klaszter valóban a nagy affinitású metionin transzport rendszert kódolja. Ezek után a gének szerepének vizsgálatához komplementációs kísérleteket terveztünk. Az operon génjeit különbözı kombinációkban expressziós vektorokba (pBAD18 és 33) építettük, majd a fenti metD deficiens (MK1958 és 1962) törzsekbe transzformáltuk. A transzformánsokat párhuzamosan D-metioninnal, vagy a toxikus αMM-nal kiegészített M9minimál lemezekre szélesztettük. A kialakított törzsek közül csak azoknál tapasztaltuk a szaporodási képesség visszaállását D-metionint tartalmazó, és növekedési gátlás megjelenését αMM-t tartalmazó lemezeken (2. táblázat), amelyekben mindhárom gént expresszáltuk. Ezzel sikerült bizonyítani, hogy az abc-yaeE-yaeC klaszter által kódolt fehérjék mindegyike szükséges a D-metionin és az αMM felvételéhez.
5.1.1.2 Az abc promóterének vizsgálata A komplementációs kísérletekben a gének expressziója nem a saját promóterük irányítása alatt állt. Kíváncsiak voltunk tehát arra, hogy az abc gén elıtt azonosított promóter valóban mőködıképes-e. A MET-boxok jelenléte arra utalt, hogy a MetJ represszor szabályozza a klaszter kifejezıdését. A MetJ egy homodimer fehérje, amelynek kötıdéséhez általában kettıöt, egymás után elhelyezkedı MET-box szükséges (Marincs és mtsai, 2006). A kapcsolódó monomerek közötti kooperatív kölcsönhatás miatt a boxok száma és azok konszenzus szekvenciával való egyezése meghatározza a represszió mértékét (Old és mtsai, 1991). Kíváncsiak voltuk arra is, hogy az azonosított MET-boxok tudják-e biztosítani a MetJ megfelelı kapcsolódását a promóter régióhoz. A felmerülı kérdések megválaszolására a promóter szekvencia 37 bázispáros darabját beépítettük a pRS415 promóter tesztelı vektorba (pROMET1; 15. ábra), amely a β-galaktozidáz riporter kifejezıdését teszi lehetıvé.
42
15. ábra A promóter tesztelésére készített konstrukció vázlata
A pROMET1 plazmiddal transzformált E. coli (JM109) sejtekben magas β-galaktozidáz aktivitást tapasztaltunk, amely igazolja, hogy a hordozott DNS szekvencia képes valódi promóterként mőködni (16. ábra). Ha L-metioninnal kiegészített minimál tápoldatban növesztettük a sejteket, akkor közel harmadára csökkent a riporter aktivitása.
Plazmidok E. coli JM109-ben pROMET1, pBAD33 pROMET1, pMETJ pBAD33, pRS415 (K)
ULacZ (M9) 26643 13332 19
Szórás 753 400 4
ULacZ (M9 + 100 µg/ml L-metionin) 8476 2145 19
Szórás 190 38 2
LacZ aktivitás (U)
30000 25000 20000 15000 10000 5000 M9
0 pRS415 + pROMET1 + pBAD33 pROMET1 + pMetJ pBAD33
M9 + L-metionin
16. ábra Az L-metionin és a MetJ szabályozó hatása L-metionin koncentráció: 100 µg/ml.
Ezért a hatásért feltételezhetıen a kromoszómális metJ-rıl kifejezıdı MetJ a felelıs, de más szabályozó fehérje szerepét sem lehet kizárni. A MetJ reguláló hatásának konkrét bizonyításához a metJ gént (Hiroshi Takagi laborjából, Nakamori és mtsai, 1999) expressziós
43
vektorba (pBAD33) klónoztuk (pMETJ), majd vizsgáltuk a MetJ szabályozó képességét a pROMET1 riporter plazmid segítségével. A MetJ túlexpressziója mintegy felére csökkentette a riporter fehérje aktivitását, azaz represszálta a promóter mőködését. A megemelt MetJ koncentráció és a szintén gátló hatású L-metionin jelenlétében még további, ~12-szeres csökkenést tapasztaltunk a promóter aktivitásában. Ezzel igazoltuk, hogy a MetJ valóban képes kötıdni az abc promóteréhez. A fenotípus tesztje és a promóter viselkedése alapján egyértelmővé vált, hogy az abcyaeE-yaeC klaszter a metionin-regulon részét képezi, és a nagy affinitású metionin transzportert kódolja. Ennek megfelelıen a gének új, hivatalos elnevezése sorrendben metN, metI és metQ lett.
5.1.1.3 Az L-metionin transzport multiplicitásának kérdése Kadner és munkatársai legalább két különbözı L-metionin felvételi rendszert írtak le, amelyek közül az egyiket sikerült azonosítanunk. Az elkészített metD deléciós törzs lehetıséget ad a kis affinitású transzporter azonosítására is. A projekt sikeres folytatásának reményében vizsgáltuk a metD deléciós és metionin auxotróf (MTD23) törzs szaporodási képességét L-metioninnal kiegészített glükóz minimál tápoldatban. Kadner és Watson (1974) eredményének megfelelıen nem tapasztaltunk különbséget közöttük (17. ábra „A”). A metP azonosítására irányuló mutagenezis kísérlet elvégzése elıtt szakirodalmi kutatást végeztünk a lehetséges gének összegyőjtésére. A legvalószínőbb jelöltünk, egy metioninanalóg permeáz, az mmuP kódolta S-metil-metionin transzporter (Thanbichler és mtsai, 1999) volt. Az azonosság eldöntéséhez a metD deléciót a metioin auxotróf és S-metil-metionin permeáz gén deficiens MTD234-be transzdukáltuk át. Amennyiben az mmuP kódolja a kis affinitású transzportert, Kadner és Watson (1974) eredményei alapján a kettıs deléciós törzs (∆mmuP és ∆metD) lassabb szaporodásra képes alacsony (10µg/ml) L-metionin koncentráció jelenlétében, mint a ∆metD deficiens. A fenotípus tesztelését folyadékkultúrában (M9minimál) különbözı
L-metionin koncentrációk (3,3-6,7-10-33 µg/ml) mellett végeztük.
Sajnálatos módon a törzsek között nem tapasztaltunk számottevı különbséget az osztódás ütemében (17. ábra „A” és „B”) még alacsony L-metionin koncentráció mellett sem. Az eredmény arra utal, hogy az S-metil-metionin permeáz nem azonos a kis affinitású L-metionin transzporterrel. Késıbb Zhang és munkatársai (2003) megerısítették ezt a következtetést.
44
A)
B)
17. ábra Növekedési görbék különbözı L-metionin koncentrációjú tápoldatban A: kék-MTD23, narancs-MTD23 ∆metD. B: kék-MTD234, narancs-MTD234 ∆metD. A kísérlet 3,3-6,7-10-33 µg/ml L-metioninnal kiegészített M9 minimál tápoldatban történt.
Kadner és Watson eredményei alapján az izolált metD-metP kettıs mutáns törzsek magas, 100 µg/ml L-metionin koncentráció mellett ugyanúgy képesek növekedni, mint a kiindulási metionin auxotróf törzs. Ezek alapján tehát a MetD és MetP mellett legalább még egy, alacsony affinitású transzporter jelenlétére következtethetünk. Elképzelhetı az is, hogy az MmuP ez a harmadik transzporter, csak a funkcionális MetP jelenlétében nem tapasztalható fenotipikus különbség a metD deficiens és metD-mmuP kettıs mutáns törzsek között. Zhang és mtsai (2003) eredményei azonban ezt a feltételezést nem támogatják, így a metP és a harmadik transzporter identitása továbbra is kérdéses maradt.
5.1.1.4 Kitekintés Publikációnkkal gyakorlatilag egyidıben (Gál és mtsai, 2002) jelent meg Merlyn és munkatársainak (2002) cikke, amelyben ugyanazokra a következtetésekre jutottak, mint csoportunk. 2003-ban hasonló, ugyanakkor bıvebb publikációjukban Zhang és munkatársai szintén
megerısítették
eredményeinket.
Radioaktív
aminosav
felvételi
tesztekkel
egyértelmően bizonyították, hogy a MetD valóban képes az L- és D-metionin, valamint az Nformil-L-metionin felvételére is. A metD deficiens törzs L-metionin transzportja gátolható 45
volt L-metioninnal, és kisebb mértékben L-treonin, L-valin, L-alanin és L-leucin magas koncentrációjával. Filogenetikai analízisük szerint a metD széles körben elterjedt a Gram-pozitív és -negatív baktériumok között egyaránt. Megállapították továbbá, hogy a transzportrendszer egy új ABC-transzporter családot alkot, amelyet Methionine Uptake Transporter (MUT) családnak neveztek el (TC #3.A.1.23). Érdekes módon a MUT család filogenetikai szempontból közelebb áll a poláris aminosav transzporter családhoz (PAAT family, TC# 3.A.1.3), mint a hidrofób aminosav transzporter családhoz (HAAT, TC# 3.A.1.4). A három gént általában hasonló méretőnek találták, a transzmembrán domén öt lehetséges TMS-sel rendelkezik. Az E. colitól eltérıen, néhány baktérium genomjában (pl. Salmonella, Yersinia) két MUTcsaládba tartozó fehérje is jelen van. A MUT család számos tagja befolyásolja a hordozó baktérium patogenitását. A Salmonella typhimurium ismeretlen funkciójú sbfA génje eszenciális szerepet játszik egerek megfertızésében (Pattery és mtsai, 1999). A Haemophylus influenzae hlpA génjének mutációja nagymértékben csökkenti a baktérium terjedését patkányokban (Chanyangam és mtsai,
1991).
Egy
másik
MUT-transzporter
(AbcBCD)
a
Helicobacter
pylori
kolonizációjához eszenciális (Hendricks és Mobley, 1997). A Yersinia pestis külsı metionin forrást igényel a szaporodásához (Brubaker, 1972), így a metionin transzporter lehetséges gyógyszer target lehet ebben az organizmusban is. Szekvencia homológia alapján Bacillus subtilisban is sikerült azonosítani a nagy affinitású L-metionin transzportert (Hullo és mtsai, 2004). Hasonlóan az E. colihoz további transzporterek jelenlétét feltételezik, amelyeket azonban eddig még nem sikerült megtalálni. 2008-ban amerikai kutatóknak sikerült az E. coli MetNI (korábban Abc és YaeE) térszerkezetét röntgendiffrakciós módszerrel megfejteniük (Kadaba és mtsai, 2008). Az aktív transzporter négy egységbıl áll: két transzmmebrán (MetI) és két ATP-kötı (MetN) fehérjébıl. Utóbbiak C-terminálisán egy másik domén (C2) is megtalálható, amelynek a funkciója ismeretlen volt (18. ábra).
46
18. ábra A MetNI térszerkezete (befelé nyitott konformáció) TMD-transzmembrán domén, NBD-nukleotid-kötı domén. (Kadaba és mtsai, 2008).
A transzmembrán domének a predikcióknak megfelelıen 5-5 TMS-bıl állnak, az N- és Cterminális a membrán ellentétes oldalain helyezkedik el. Bizonyították, hogy a C2-domének képesek szabályozni a metionin transzportot. Az ATP-kötı hely ugyanis a két ATP-kötı domén összekapcsolódásával, az illeszkedı felületeken alakul ki. Az L-metionint kötı C2domének
távol
tartják
egymástól
az
ATPáz
alegységeket,
így
végeredményben
megakadályozzák a transzportot. Ezzel tehát sikerült megérteni azt a korai kísérleti megfigyelést is, hogy a citoplazmatikus metionin koncentráció képes közvetlenül szabályozni a metionin felvételét.
47
5.1.2 A GltS topológiája 5.1.2.1 A GltS topológiájának predikciója A membránfehérjék topológia vizsgálata lényegében a transzmembrán szegmenseket összekötı hurokszekvenciák helyzetének meghatározását jelenti. A kétdimenziós szerkezet jellemzéséhez minimálisan elegendı egy hurokról egy kísérleti adat (pl. proteáz hasítás, Cyshozzáférés, riporter aktivitás). Mivel azonban majdnem az összes kísérletes módszer valamilyen módosított formában vizsgálja a célfehérjét, a módosítások (költség)hatékony elhelyezéséhez elızetes információkra van szükség. Tudni kell, hogy hol találhatóak a hurkok, és a módosításokat oda érdemes tervezni. A vizsgálandó membránprotein elızetes jellemzésére TMS predikciós szoftvereket alkalmaznak. A világhálón sokféle ilyen számítógépes eszköz elérhetı, és segítségükkel gyorsan képet alkothatunk a lehetséges hurokés TM szekvenciák elhelyezkedésérıl. Munkánk kezdetén az összes elérhetı szoftverrel megvizsgáltuk a GltS szekvenciáját. A különbözı
predikciók
szerint
a
lehetséges
TMS-ek
száma
9-12
(3.
táblázat).
Munkahipotézisként a lehetı legtöbb, azaz 12 TMS jelenlétét feltételeztük.
Program/ algoritmus PredictProtein TOPPRED2 MEMSAT Kyte-Doolitle TMPRED DAS HMMTOP SOSUI TMHMM TMAP PHDhtm
TMS-ek száma 12 12 11 12 12 v.11 12 v. 9 11 11 11 v. 9 10 12
3. táblázat A GltS-ben prediktált TMS-ek száma
5.1.2.2 Kísérletes stratégia A topológia vizsgálatához a viszonylag egyszerő és széles körben sikerrel alkalmazott génfúziós stratégiát alkalmaztuk. A periplazmatikus hurkok kijelöléséhez az alkalikus foszfatázt (PhoA), citoplazmatikus riporterként pedig a β-galaktozidáz (LacZ) enzimet
48
választottuk. A C-terminális csonkolásos stratégiával GltS-riporter fúziókat hoztunk létre különbözı molekuláris biológiai technikákkal. Konstrukcióink többsége random fúziós pont kialakításával történt (transzpozonos mutagenezis, egyirányú deléciók), a kimaradó vagy bizonytalan helyzető régiókba irányított fúziókat terveztünk.
Fúzió 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 21 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 pCP1(–) pGE1
Módszer
Fúziós pont
PhoA aktivitás (U)
Szórás
T14 K22 G57 E59 S65 P69 G79 R92 V100 A110 S117 G120 W144 A161 V170 V230 K232 A242 R273 A290 M292 K295 A303 T314 A318 W326 D334 K391 I398 A400 – –
65 11 198 190 222 206 33 6 65 162 195 40 38 25 19 145 165 134 7 163 202 189 195 165 145 76 6 113 89 135 2 2
5 2 13 15 2 8 1 1 4 15 13 0 1 1 2 11 14 5 1 18 11 18 10 9 7 5 1 13 1 11 0 0
TnphoA TnphoA Egyirányú deléció TnphoA Egyirányú deléció Egyirányú deléció TnphoA PCR Egyirányú deléció Egyirányú deléció Egyirányú deléció TnphoA LacZ fúzióból átépítve LacZ fúzióból átépítve TnphoA Egyirányú deléció Egyirányú deléció Egyirányú deléció PCR Egyirányú deléció Egyirányú deléció Egyirányú deléció Egyirányú deléció Egyirányú deléció TnphoA Egyirányú deléció PCR Egyirányú deléció Egyirányú deléció Egyirányú deléció
4. táblázat A topológia meghatározásához felhasznált PhoA-fúziók jellemzıi
A riporter fúziók kialakításának a legegyszerőbb módja a transzpozonos mutagenezis, a GltS vizsgálatát ezzel kezdtük. A TnphoA (Manoil és Beckwith, 1986) egy promóter és szignál-szekvencia nélküli alkalikus foszfatáz gént kódol (’phoA), amely csak abban az
49
esetben tud átíródni, ha a transzpozon éppen a target gén leolvasási keretének megfelelıen integrálódik. Foszfatáz aktivitás pedig csak akkor tapasztalható, ha a riporter kijut a periplazmatikus térbe, mivel az enzim aktív konformációjához diszulfid-hidak kialakulása szükséges. A gltS-t plazmidon hordozó E. coli sejteket fertıztük a TnphoA-t kódoló λ-fággal (λTnphoA). A transzpozon által kódolt kanamicin rezisztencia alapján szelektálni tudtunk a plazmidba történı integrációra, majd a plazmidok izolálása és újratranszformálása után a foszfatáz aktivitást mutató telepeket vizsgáltuk. A beépülési helyeket PCR-es analízissel határoltuk be, a pontos helyet szekvenálással azonosítottuk.
Fúzió 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 pGL2 pGL3
Módszer Egyirányú deléció Egyirányú deléció Egyirányú deléció Egyirányú deléció Egyirányú deléció PCR Egyirányú deléció Egyirányú deléció Egyirányú deléció PCR Egyirányú deléció Egyirányú deléció Egyirányú deléció Egyirányú deléció Egyirányú deléció Egyirányú deléció Egyirányú deléció Egyirányú deléció PCR Egyirányú deléció Egyirányú deléció Egyirányú deléció PCR Egyirányú deléció Egyirányú deléció Egyirányú deléció Egyirányú deléció Egyirányú deléció Egyirányú deléció Egyirányú deléció
Fúziós pont
LacZ aktivitás (U)
Szórás
A12 Y33 V39 G42 A89 R92 G136 W144 A161 V170 S187 N191 D207 V208 G209 T213 A222 I257 R273 N280 S284 A303 D334 F345 T352 M357 R363 P375 A379 P397 – –
454 240 115 113 28 36 67 143 155 92 200 153 235 171 268 105 87 24 212 102 87 25 127 80 121 140 151 114 131 17 1 1
64 13 7 14 4 3 17 10 20 12 2 15 17 17 19 9 8 5 24 17 18 9 19 4 15 22 28 11 24 6 0 0
5. táblázat. A topológia meghatározásához felhasznált LacZ-fúziók jellemzıi
50
Harminckét
független
mutagenezis
kísérlet
során
mindössze
hét
olyan
klónt
azonosítottunk, amelyeknél a TnphoA különbözı pozíciókba integrálódott. Ráadásul a kapott beépülési helyek sem feleltek meg a várakozásainknak, csak két egyértelmően informatív, nagy PhoA aktivitású fúzió volt közöttük. Úgy tőnt, hogy a szükséges nagyszámú fúzió kialakítása a transzpozonnal lassú és kétséges végeredménnyel jár. Ezért kerestünk egy hatékonyabb és irányíthatóbb módszert, amellyel gyorsan, elegendıen sok konstrukció készíthetı. Választásunk az exonukleáz III és S1 nukleáz enzimek kombinált alkalmazásán alapuló egyirányú deléciós technikára esett, mivel ezzel a módszerrel egyetlen kísérletben nagyszámú fúzió alakítható ki kontrollálható módon. A transzpozonos próbálkozás arról azonban meggyızött minket, hogy a PhoA mellett szükség lesz - a citoplazmatikus hurkok egyértelmő azonosításához - egy kizárólag citoplazmatikusan aktív riporter alkalmazására is. Viszonylag egyszerően mérhetı aktivitása miatt a β-galaktozidázt választottuk, és LacZ-vel is készítettünk egy sorozat fúziós fehérjét. Az egyirányú deléciókkal kapott, több mint ötven különbözı fúziós fehérje és a hozzájuk tartozó riporter aktivitások már elég jó képet adtak a GltS kétdimenziós szerkezetérıl. Bizonyos pozíciók azonban továbbra is „lefedetlenek” maradtak. Ezek jellemzésére irányítottan, specifikus primerek és PCR segítségével alakítottunk ki fúziókat. Végül összesen 60 génfúziót használtunk fel a szerkezet jellemzésére (4-5. táblázat; 19. ábra), amelyekkel minden hurok szekvenciát legalább két enzimaktivitással tudtunk jellemezni.
19. ábra A fúziós pontok és a riporter aktivitások A szürke téglalapok a PHDhtm programmal prediktált TMS-eket szimbolizálják (Rost et al., 1996). N-N terminális; C-C terminus. ULacZ- β-galaktozidáz aktivitás-fekete függıleges vonalak; UPhoA, alkalikus foszfatáz aktivitás-szürke függıleges vonalak. A GltS-t szimbolizáló vízszintes téglalapban lévı kis vonalak 20 aminosavanként vannak elhelyezve. A jelölt aminosavak fúziós pontjainkat jelölik.
51
5.1.2.3 Western-blot analízis A riporter aktivitások önmagában nem elegendık a topológia korrekt megrajzolásához. Amikor egy adott pozícióban nagy riporteraktivitást tapasztalunk, annak két oka lehetséges. Az elsı, hogy a fúzió intakt és valóban a megfelelı kompartmentben található a fúziós pont. Az is elıfordul azonban, hogy valamilyen okból (például proteolitikus degradáció hatására) az aktív riporter leválik a partnerrıl, és szolubilis formában van jelen a sejtben. Az is elıfordulhat, hogy ugyanakkora mennyiségő membrán-kötött riporter sztérikus okok, vagy a korlátozottabb szubsztrát diffúzió miatt kisebb aktivitást produkál, mint a szabad forma. Az aktivitás önmagában tehát félrevezetı lehet, emiatt tartják szükségesnek a fúziók szekvenciaanalízise mellett maguknak a fúziós fehérjéknek a detektálását is. Többféle, a riporter fehérjékre specifikus antitest is hozzáférhetı a kereskedelmi forgalomban, így Western-blot analízissel vizsgálni lehet a fúziós proteineket. Az egyes fúziókat termelı törzseket exponenciális fázisban lecentrifugáltuk, majd szonikálást és centrifugálást követıen meghatároztuk a felülúszó összfehérje tartalmát (Bradford-reakcióval). A Western-blot során a poliakrilamid gélekre azonos összfehérjemennyiségő sejtlizátumot vittünk fel. A gélelktroforézis és transzfer után a fúziós fehérjéket alkalikus foszfatáz és β-galaktozidáz specifikus, tormaperoxidázzal konjugált poliklonális antitestek segítségével vizualizáltuk. A vizsgálat során nem várt nehézségekkel találtuk szembe magunkat. A legszembetőnıbb tapasztalat az volt, hogy a kétféle riporterrel kialakított fúziók másként viselkedtek, például eltérı mértékő degradációt mutattak (20. ábra).
20. ábra A fúziós fehérjék detektálása Western-blottal A: alkalikus foszfatáz fúziók, B: β-galaktozidáz fúziók; +: E. coli K-12 IPTG-vel indukálva. (PhoA-47 kDa, LacZ-117 kDa). A jelölt aminosavak fúziós pontjainkat jelölik.
52
A foszfatáz fúzióknál majdnem mindegyik intakt fúziós fehérjét tudtuk detektálni. Ugyanakkor megfigyelhetı, hogy a jelek intenzitása csökken és egyre nagyobb mértékő degradáció látható, ahogy a GltS-bıl egyre hosszabb darab van jelen a fúziós fehérjében. Elképzelhetı, a nagyobb hidrofób rész jelenléte miatt a transzfer rosszabb hatékonysággal zajlott. Összességében elmondhatjuk, hogy a PhoA esetén detektált jelek összeegyeztethetık a mért riporter aktivitásokkal. A nagyon kicsi aktivitású fúzióknál kevés vagy nem látható jelet kaptunk (pl. R92 és D334 PhoA fúziók), ami gyors degradációs folyamatokra utal. A LacZ-fúziók esetén még az elıbbinél is nagyobb akadályokkal kerültünk szembe. Sok kísérlet és antitest-csere után harmincból 18 esetben tudtuk detektálni a teljes fúziós protein halvány jelét. Viszont mindegyik mintában megjelent egy, a szabad β-galaktozidáz méretének megfelelı jel. Az R273-as fúziótól kezdıdıen egy erıs degradációs csík is látható. Ugyanakkor az enzimaktivitások nem függenek a szolubilis LacZ-nek tőnı jel intenzitásától (pl.: I257 és A303 LacZ fúziók), és összességében jól kiegészítik a megbízhatóbb alkalikus foszfatázos eredményeket. A szakirodalomban más laboratóriumok is beszámoltak hasonló detektálási nehézségekrıl a LacZ-vel kapcsolatban, emiatt úgy gondoljuk, az aktivitás értékeket - a detektálási problémák ellenére - érdemes figyelembe venni.
5.1.2.4 A GltS topológia modellje riporter fúziók alapján A GltS membránbeli lefutásának meghatározásához összesen hatvan riporterfúziót használtunk fel. Néhány alább részletezett példától eltekintve az enzimaktivitás értékek jól kiegészítik egymást, és a fehérje nagy részének a lefutása ezek alapján egyértelmő. A Cterminális csonkolás módszerének természetesen vannak hátrányai, hiszen a vizsgált protein erısen módosított formája van csak jelen. A rövidített forma általában megırzi a natív lefutását, de elıfordul(hat), hogy a C-terminális felıl elhelyezkedı topológiát meghatározó szignálok eltávolításával módosul a szerkezet. A szakirodalom részletesen bemutat néhány tipikus hibalehetıséget (van Geest és Lolkema, 2000), ezeket figyelembe vettük az eredmények értékelésénél. Az elsı két fúzió ellentmondó következtetésre vezet az elsı feltételezett TMS-t illetıen (19. ábra). A T14-es PhoA fúzió közepes aktivitást mutat, tehát a szekvenciarész gyenge szignálpeptidként bizonyos valószínőséggel ki tudja vezetni a riportert a periplazmatikus
53
térbe. A T14-ig tartó szegmens maradéka tehét elég hidrofób a membránba való beépüléshez. A K22-es pozíció viszont egyértelmően citoplazmatikus lokalizációra utal. A második TMS irányultsága teljesen egyértelmő a körülötte lévı aktivitások alapján. Elıtte egy nagy és két közepes LacZ, utána négy nagy PhoA aktivitású fúzió: az elsı hurok a membrán citoplazma felöli oldalán helyezkedik el. Ezt megerısíti a szegmens erıs nettó pozitív töltése is (egy Arg és három Lys). A képet csak az A12-es pozícióban tapasztalt nagy LacZ aktivitás zavarja meg.
21. ábra A GltS topológia modelljei a riporter aktivitások alapján A szürke, számozott téglalapok a lehetséges transzmembrán szekvenciákat szimbolizálják. A jelölt aminosav pozíciók a szövegben kiemelt fúziók fúziós pontjai. „A” a 6. és 11. prediktált TMS nem íveli át a membránt; „B” a hidrofób karakterő szekvenciák bemerülı hurkokat képeznek
Azoknál a fehérjéknél, ahol az N-terminális a periplazmába nyúlik megfigyelték (van Geest és Lolkema, 2000), hogy az elsı TMS-bıl megmaradó néhány aminosav gyakran nem
54
elegendı ahhoz, hogy a riportert a membránhoz rögzítse. Emiatt a fúziós fehérje szolubilizálódik és nagy aktivitást mutat. Az A12-es LacZ fúzió pontosan így viselkedik, aktivitása (454 U) közel kétszer akkora, mint a többi nagy aktivitású fúzióé (220-240 U). Összességében tehát az elsı hidrofób szegmens valódi TMS-nek tőnik, ami kívülrıl a citoplazma felé irányul. Egy másik magyarázatra szoruló terület a 3. és 4. TMS közötti rövid hurok. Várakozásunkkal ellentétben az itt található LacZ fúziók csak kis aktivitást mutattak. A kérdéses rövid szekvencia (RAGGR) ugyanakkor nagyon hasonlít a Nagy Facilitátor Szupercsalád
erısen
konzervált
„RXGRR” motívumához, amelyet
kulcsfontosságú
citoplazmatikus kihorgonyzó szekvenciaként jellemeztek (Jessen-Marshall és mtsai, 1995; Sato és Mueckler, 1999). A fehérje további részében az alternáló enzimaktivitások elég egyértelmően jelzik a membránbeli lefutást. A membrán periplazmatikus oldalán található a 4., a 7., a 9. hurok és a C-terminális. Az eredmények alapján felvázolható volt a GltS kétdimenziós szerkezeti modellje (21. „A” ábra). A GltS 10 transzmembrán szekvenciával rendelkezik, két további prediktált hidrofób szegmens pedig nem valódi transzmembrán szegmens. Utóbbiak feltételezésünk szerint hurkot képezve a membránba merülve helyezkednek el (ún. „reentrant loop”-ok; 21. „B” ábra).
5.1.2.5 A GltS topológiája Eredményeink publikálása elıtt nem sokkal jelent meg egy tanulmány, amelyben a GltS topológiáját cisztein-hozzáférési kísérletekkel vizsgálták (Dobrowolski és mtsai, 2007). A szerzık hidrofobicitási karakterisztikájuk alapján hasonlóságot találtak a GltS és a Klebsiella pneumoniae citrát transzportere (CitS) között. Az általuk korábban már alaposan jellemzett CitS 11 TMS-sel rendelkezik és az elsı TMS kivételével valóban megegyezı hidrofobicitási profilt mutat a GltS-sel. Klasszifikációs módszerük (Memgen) kísérletes bizonyításához kezdték vizsgálni a GltS lefutását. Az általuk leírt szerkezet jórészt megegyezik a mi riporter fúziókon alapuló struktúránkkal. Tíz TMS-t azonosítottak, az N- és C-terminális egyaránt a periplazmatikus térbe nyúlik. Lényeges eltérés van azonban az 5. és a 6. prediktált TMS elhelyezkedésében (22. ábra). Modelljükben a 6. hidrofób szekvencia valódi TMS, az 5. viszont nem az.
55
A Memgen-szerkezet komoly fejtörést okozott, az ellentmondás elsıre feloldhatatlannak tőnt. A riporter fúziós kísérletek eredményeit két további foszfatáz fúzióval kiegészítettük (W144 és A161), és újabb ellenırzések után továbbra is helyesnek találtuk. A probléma megoldását végül az eltérı módszerek alkalmazásában, konkrétan a C-terminális csonkolás technika „mellékhatásában” találtuk meg. A Dobrowolski és munkatársai által alkalmazott cisztein-hozzáférési módszer ugyanis a lehetı legkisebb módosítással jár, és a célfehérjét a valóshoz legközelebb álló állapotában vizsgálja. Ehhez aminosavcserékkel egy cisztein-mentes targetfehérje változatot kell létrehozni, majd a vizsgálandó helyeknek megfelelıen egy sorozat egyedi ciszteinnel rendelkezı mutánst. Megfelelı reagensekkel és fluoreszcens jelölı molekulával az egyedi cisztein lokalizációja meghatározható. Az általunk alkalmazott C-terminális csonkolás ehhez képest durva beavatkozás, a vitatott helyzető régióban található fúzióknál a GltS fele hiányzik. A nem elegendıen önálló struktúrájú szekvenciák, a C-terminális felıli topológia meghatározó tényezık hiányában más szerkezetet is felvehetnek. Emellett a nagymérető fúziós-partnerek is torzíthatják a natív szerkezetet. A CitS vizsgálatakor a vitatott helyzető szekvenciarészrıl (a GltS 5. hidrofób szegmense, CitS-ben az ún. „Vb” régió) bizonyították, hogy nem transzmembrán szekvencia. Feltételezések szerint a 22. ábrán látható módon egy bemerülı hurkot képez, de kísérletekkel ezt még nem támasztották alá.
22. ábra A GltS topológiája A riporter fúziók és a cisztein-hozzáférési kísérletek eredményeivel is összeegyeztethetı topológia-modell. A szürke, számozott téglalapok a lehetséges transzmembrán szekvenciákat szimbolizálják. A jelölt aminosavak a szövegben is kiemelt fúziók fúziós pontjai.
A régió hidrofobicitása, hossza és töltéseloszlása alapján megfelel a valódi TMS-ek jellemzıinek (23. ábra „A”). Néhány predikciós program valóban TMS-nek jelzi, ugyanakkor
56
a cisztein-hozzáférési eredmények szerint nem az. A W144, A161 és a V170-es fúzióinkban azonban egyértelmően valódi TMS-ként viselkedik, amely a riportereket a citoplazmatikus térbe vezeti (23. ábra „B” jobboldali része).
23. ábra A 5. prediktált TMS szekvencia és viselkedése A: a prediktált 5. TMS és szekvencia környezete. B: a régió lehetséges szerkezetei fúziós fehérjéinkben. A tapasztalt riporter enzimaktivitások a jobboldali struktúra kialakulására utalnak. A 122-es és 155-ös pozíciók a periplazma felıl hozzáférhetıek voltak Dobrowolski és mtsai (2007) cisztein-hozzáférési kíséleteiben. A többi jelölt aminosav riporter fúzióink helyét jelzik a régióban.
Az 5. hidrofób szegmens érzékeny és befolyásolható szerkezetére szakirodalmi adatokat is találtunk. A Vb régió TMS-ként való viselkedésére a Lolkema-labor munkája (van Geest és mtsai, 1999.) szolgáltatott bizonyítékot. A leader peptidáz (Lep) tesztrendszerben az individuálisan jelenlévı Vb régió képes volt az ER membránba inszertálódni, bár ennek hatékonyságát és stabilitását a szekvenciakörnyezet jelentısen befolyásolta. A szerkezeti modellek közötti látszólagos ellentmondás tehát feloldható azzal a feltételezéssel, hogy az 5. prediktált TMS egy szenzitív (vagy nem-meghatározott) struktúrájú régió, amelyet a natív szekvenciakörnyezet stabilizál. Amennyiben a C-terminális felıli topológia meghatározó tényezık hiányoznak, a szegmens helyzete megváltozik, és a Vb régió valódi TMS-ként viselkedik. A GltS-sel végzett cisztein-hozzáférési és riporter fúziós vizsgálatok tehát egyaránt helyesen írják le az adott módosított fehérjék struktúráit. A Vb régió sajátos szekvenciája miatt azonban a fúziós fehérjékben a megmaradó GltS topológiája nem azonos a natív fehérjéjével. Eredményeink összhangban vannak és alátámasztják a Dobrowolski és munkatársai által bemutatott szerkezetet (22. ábra). Sıt, a régióbeli fúzióink
57
viselkedése a „bemerülı hurok”-elképzelés elsı kísérletes bizonyítékát adják, egyben rámutatnak a 6. prediktált TMS szerkezet stabilizáló hatására is. A topológia modell szerint a GltS egy szimmetrikus felépítéső transzmembrán fehérje. Tíz membránt átérı szegmenst azonosítottunk, a fehérje N- és C-terminálisa a plazmamembrán periplazmatikus tér felöli oldalán helyezkedik el. A fehérje két nagyobb, öt-öt transzmembrán szegmenst tartalmazó, antiparallel helyzető egységbıl áll. Eredményeink megerısítik, hogy a 4-5. és 9-10. transzmembrán szegmensek közötti két hidrofób régió a membránba bemerülı hurkot alkot. A GltS membránbeli lefutásának ismerete további kutatások alapjául szolgálhat, amelyeknek két fı lehetséges iránya a következı. A topológia modell alapján elméleti módszerekkel is vizsgálhatóvá válik a GltS mőködése és háromdimenziós szerkezete. Emellett a szerkezet a kísérletes analízist is nagyban segíti, hiszen könnyebb behatárolni a fehérje mőködéséhez szükséges aminosavak helyét. Elképzelhetı, hogy a bemerülı hurkok a háromdimenziós szerkezetben térben közel helyezkednek el, és csúcspontjaik kapcsolatban állnak egymással. Emiatt lehetséges, hogy a szubsztrátok transzportjában is fontos szerepet játszanak, ahogy ez több más transzporter fehérjénél megfigyelhetı (pl. aquaporinok, GltPh).
5.1.2.6 Összehasonlítás az emlıs glutaminsav transzporterekkel A glutaminsav és a nátrium-kapcsolt glutaminsav transzporterek fontos szerepet játszanak a baktériumoktól az emberig minden szervezetben. Az emlıs központi idegrendszerben a többi neurotranszmitterhez képest a glutaminsav extrém nagy mennyiségben van jelen, amely elérheti az 5–10 mmol/kg-os koncentrációt (Sheldon és Robinson, 2007). A nagy mennyiségő extracelluláris glutaminsav viszont toxikus az idegsejtek számára, ezért nagyon fontos a gyors visszajuttatása a citoplazmába. Ezt a feladatot - túlnyomó részben – nátrium-kapcsolt glutaminsav transzporterek végzik (EAAT-k). A glutaminsav transzport módosulásait számos pszichiátriai- és egyéb kórképpel is összefüggésbe lehet hozni. A skizofrénia, major depresszió, amiotrófiás laterális szklerózis (ALS vagy Lou Gehrig-betegség), epilepszia, Huntington-kór, Alzheimer-kór, Parkinson-kór, agyi ischaemia, kényszerbetegség (OCD) és a demencia bizonyos formái esetében megváltozott glutaminsav transzport aktivitás figyelhetı meg, vagy feltételezhetı (Beart és O’Shea, 2007; Sheldon és Robinson, 2007). A GltS szekvenciája nem hasonlít az utóbbi
58
csoportba sorolható fehérjékéhez, mégis érdemes lehet összevetni a kétdimenziós szerkezeteket. Az emlıs glutaminsav transzporterek struktúrájának és funkciójának megismerésében a legnagyobb
elırelépés
a
Pyrococcus
horikoshii
Gltph
protein
térszerkezetének
röntgenkrisztallográfiás meghatározása volt (Yernool és mtsai, 2004). A Gltph 37 %-os homológiát mutat a humán EAAT2 fehérjével. Az aktív komplex trimer szerkezető, amelyben a citoplazma felıli oldalon egy nagy, egészen a membrán feléig benyúló hidrofil mélyedés található. A monomer Gltph szerkezete aszimmetrikus, összesen nyolc TMS-sel rendelkezik, az N- és C-terminális a citoplazmatikus térbe nyúlik (24. ábra).
24. ábra A Gltph topológiája (Yernool és mtsai, 2004). A szürke, számozott téglalapok a transzmembrán szekvenciákat szimbolizálják.
Két bemerülı hurok található a fehérjében, az egyik a 6.-7. TMS, a másik a 7.-8. TMS között. A struktúra alapján ez a két hurok alkotja azt a transzport során felváltva nyíló kapurendszert, amelyen keresztül a glutaminsav a citoplazmába jut. A szekvenciák összevetésekor a kifelé irányuló hurkok szekvenciájában szembetőnı hasonlóságot nem lehet észrevenni. A GltS-ben nem található meg az a konzervált „TRSSS” motívum sem, ami a Gltph-ban a glutamil-csoportot koordinálja (25. ábra). A befelé irányuló hurkokban összességében szintén kicsi a hasonlóság, ugyanakkor pont a hurok csúcsa az, ami figyelemre méltó egyezést mutat. A GltS esetében feltételezhetıen a GGHG szekvencia képezi a hajtő-struktúrát (Sobczak és Lolkema, 2005). A 12 aminosavnyi területen 6 aminosav azonos, és ezek közül kettı a Gltph-ban azonosított, Na+-kötésért felelıs glicineket jelenti.
59
HP1a
HP1b
GltPh ... ISFI-KHAKDAMLTAFVTRSSSGTLPVTMR----VAKEMG :: *: . *:*:* . *: *.:: :::.:* GltS … WRMMGKNYDAAVLAAGHCGFGLGATPTAIANMQAITERFG
HP2a
HP2b
GltPh …VGQQLTIVLTAVL----ASIGTAGVPGAGAIMLAMVLHSVGLPLTDPNV… * : * .:: .** :* *:** :.:. *:. . .:* GltS …IGMASLLGLDPLMGLLAGSITLSGGHGTGAAWSKLFIERYGFT-NATEV… 25. ábra A GltPh és GltS bemerülı hurok szekvenciáiának összehasonlítása A HP1a, -b és HP2a, -b a bemerülı hurkok rövid héixei. A csillag az azonosságokat jelöli, a szürke kiemelés a transzportban fontos aminosavakat jelöli a GltPh-ban. Az összehasonlítást a ClustalW programmal végeztük.
Elképzelhetı tehát, hogy a befelé irányuló hurok a GltS esetében is a Na+ megkötését végzi. A GltS funkcionális vizsgálata során érdemes tehát a G136 és G139 aminosavak szerepét megvizsgálni.
5.1.2.7 Riporter fúziók vagy cisztein-hozzáférési kísérletek? Az általunk végzett topológia-vizsgálat eredményei túlmutatnak a GltS-rıl nyert szerkezeti információkon. Munkánk során az alkalmazott kísérletes stratégia elınyével és hátrányával egyaránt szembesültünk, a tanulságokat érdemes összegezni. A riporter fúziós módszer alkalmazásakor többféleképpen is kialakíthatóak a szükséges konstrukciók. Az általunk használt módszerek közül kiválóan mőködött az egyirányú deléciós technika, mivel egy kísérlettel nagyszámú értékelhetı fúziót sikerült elıállítani. Azonban még ezzel a technikával sem tudtuk minden pozíció helyzetét egyértelmően azonosítani. Ezért célravezetıbbnek tőnik a kevesebb, de irányított módon kialakított fúziók létrehozása. Ez lehetıvé teszi azt is, hogy úgy tervezzük meg a konstrukciókat, hogy a riporterek kicserélhetıek legyenek, így minden pozícióból informatívabb adatok nyerhetık. Az alkalmazott riporterek közül a detektálási problémák a β-galaktozidáz használatát körülményessé teszik, ezért érdemes lehet más citoplazmatikus jelzı fehérjét, mint például a GFP-t vagy esetleg a kloramfenikol acetil-transzferázt választani.
60
A kisebb szerkezet-módosító hatása miatt a cisztein-hozzáférési módszer alkalmasabbnak tőnik a membránfehérjék topológiájának vizsgálatára. Ugyanakkor, ha a célfehérje egyszerő szerkezető, jól prediktálható transzmembrán szegmensekkel rendelkezik, akkor a jóval egyszerőbb C-terminális csonkolásos stratégia is sikerrel alkalmazható. A riporter fúziók emellett a fehérjeszerkezet kialakulásának dinamikájáról, a fehérjerészek szerkezeti önállóságáról, valamint a topológia meghatározó tényezıkrıl is hasznos információkat adhatnak. A módszer flexibilitásának köszönhetıen alkalmas a fehérjék széles körének gyors vizsgálatára, amelyet szükség esetén ki lehet egészíteni a bonyolultabb, de finomabb analízist biztosító cisztein-hozzáférési technikával. Összetettebb szerkezető fehérje vizsgálatakor a két módszer párhuzamos alkalmazása komplexebb információkat adhat, ahogy azt a GltS esetében tapasztaltuk.
.
61
6. Összefoglalás A membránfehérjék nagyon sok, alapvetı életfolyamatban vesznek részt, a funkcióképes membránok nélkülözhetetlen összetevıi. Segítik az életfolyamatokhoz szükséges anyagok szabályozott ki- és bejuttatását a sejtbe, felfogják és közvetítik a közegbıl származó jeleket (szignál transzdukció), enzimatikus aktivitással átalakíthatnak más molekulákat, és konkrét fizikai összeköttetést biztosítanak az egyes kompartmentek, például az extracelluláris tér és a citoplazma között. A sokféle fontos funkció miatt hibás mőködésük vagy hiányuk számos betegség kóroka. A rendelkezésre álló teljes genomszekvenciák bioinformatikai elemzése alapján a membránfehérjét kódoló gének gyakoriak, a nyitott leolvasási keretek mintegy 2030 %-át adják. Óriási jelentıségükhöz képest viszont kevés információ áll rendelkezésre a szerkezetükrıl és mőködésükrıl. A genomika, a proteomika, a rendszerbiológia, a bioinformatika és a nagy áteresztıképességő módszerek óriási mennyiségő információ felhalmozását biztosítják, ezzel nagy komplexitású, átfogó kutatások kivitelezését teszik lehetıvé. Természetesen ezek a hatékony eszközök sem tudnak megválaszolni minden felmerülı kérdést. A világ legjellemzettebb élılényét, az Escherichia colit a tudomány több mint 120 éve vizsgálja, és 1997-ben publikálták a K-12 törzs teljes genomszekvenciáját is. Ma már számos más törzsének is ismerjük a teljes DNS szekvenciáját, ennek ellenére a gének 24 %-ának a feladatáról nincs pontos ismeretünk, és csak 66 %-ról vannak kísérletes adatok (Karp és mtsai, 2007). Még rosszabb a helyzet az Eukariótákban: a Saccharomyces cerevisiae esetében 37 %, Arabidopsis thaliananál 5 %, Drosophila melanogasterben és egérben 4-4 % a kísérletesen igazolt funkciójú gének aránya. A membránfehérjék esetében hasonló arányú az azonosítatlan gének száma. Az E. coli genomjában közel 900, legalább egy transzmembrán szegmenssel rendelkezı fehérjét azonosítottak, ami azt jelenti, hogy a lehetséges gének mintegy 21 %-a kódol integrális membránfehérjét. A transzporterek számát ezen belül kb. 400-ra becsülik, közülük 180 teljesen ismeretlen funkciójú. Munkám során az E. coli baktérium két különbözı aminosav felvételéért felelıs transzportrendszerét vizsgáltam. A nagy affinitású metionin transzporter génjei az ismeretlen funkciójú leolvasási keretek közé tartoztak, feladatukat vizsgálatainkkal sikerült azonosítani. A dolgozat másik részét a glutaminsavat transzportáló GltS kétdimenziós szerkezetének vizsgálata és annak tanulságai képezik.
62
A nagy affinitású metionin transzport-rendszer azonosítása
E. coliban az L-metionin felvételét legalább két transzporter végzi (Kadner és Watson, 1974). Leírtak és jellemeztek egy nagy (metD) és egy kis (metP) affinitású felvételi rendszert. A metD pozícióját egészen pontosan sikerült behatárolni géntérképezéssel. Azt is igazolták, hogy a MetD egy ABC-transzporter, a D-metionin és a toxikus α-metil-metionin kizárólagos transzportere, emellett kifejezıdése a MetJ fehérje szabályozása alatt áll. A D-metionin transzportja ozmotikus sokk érzékeny, ami egy periplazmatikus kötı-fehérje jelenlétére utal. A kis affinitású transzporterrıl nagyon kevés információ áll rendelkezésre, génjét még ennek sem sikerült azonosítani. A E. coli géntérképe és genomszekvenciája összevetésekor azt vettük észre, hogy a metD-t határoló markerek között csak néhány lehetséges gén kódol membránfehérjét, és ezek közül mindössze egy lehet ABC transzporter. Utóbbi promóterében egyértelmően felismertük a MetJ szabályozófehérje kötıdési helyét is, emiatt nagy valószínőséggel prediktáltuk az abcyaeE-yaeC operon funkcióját. A klaszter irányított kiiktatásával valóban D-metionin transzport-deficiens törzset kaptunk. Ezután az egyes nyitott leolvasási kereteket expressziós vektorokba építettük. A kapott konstrukciók segítségével igazolni tudtuk, hogy a transzport csak akkor áll helyre, ha a három gén együttesen fejezıdik ki. Megállapítottuk továbbá, hogy az operon expresszióját a MetJ represszor valóban szabályozza. A metD azonosításával lehetıség nyílt az E. coli további metionin transzportereinek vizsgálatára is. A szakirodalom alapján az S-metil-metionin permeáz (MmuP) tőnt az egyik lehetséges kis affinitású transzporter-jelöltnek. A feltételezés ellenırzésére létrehoztunk egy metionin auxtróf kettıs deletáns törzset (∆metD, ∆mmuP). A fenotípus tesztelés eredménye azonban arra utalt, hogy az S-metil-metionin permeáz nem azonos a kis affinitású L-metionin transzporterrel. Az E. coli L-metionin felvételével kapcsolatos vizsgálataink eredményeként tehát azonosítottuk a nagy affinitású transzport rendszert. Megállapítottuk, hogy a metD lókuszt három gén alkotja, amelyek egy tipikus bakteriális ABC-transzporter rendszert kódolnak. A fenotípus tesztek és a promóter viselkedése alapján egyértelmővé vált, hogy az abc-yaeEyaeC klaszter a metionin-regulon részét képezi. Ennek megfelelıen a gének új, hivatalos elnevezése sorrendben metN, metI és metQ lett. A nagy affinitású transzport rendszer azonosításával lehetıvé vált a többi L-metionin transzporter génjeinek felkutatása is.
63
Bemerülı hurkok a GltS-ben
A glutaminsav egy központi jelentıségő aminosav, a glutaminnal együtt a legfontosabb amino-csoport donor és nitrogén-forrás (Reitzer, 2003). A legnagyobb mennyiségben elıforduló anion a citoplazmában, amely a fı ozmotikum K+ ellenionjaként van jelen. A glutaminsav felvételére is jellemzı a multiplicitás, E. coliban négy felvételi rendszer található. A dolgozat második része a Na+-dependens GltS kétdimenziós szerkezetének vizsgálatát mutatja be. Molekuláris biológiai technikák alkalmazásával, konkrétan riporter fúziók segítségével határoztuk meg a fehérje membránbeli lefutását. A GltS különbözı hosszúságú fragmentjeihez riporter fehérjéket illesztettünk (PhoA, LacZ) génmanipuláció segítségével. A riporterek kompartment specifikus aktivitása miatt - enzimatikus mérést követıen – eldönthetı, hogy a fúziós pont a citoplazmában vagy a periplazmában lokalizálódik. A kialakított 60 fúzió révén végeredményben az összes hurok elhelyezkedésére tudtunk következtetni. Munkánkkal párhuzamosan egy másik kutatócsoport ún. cisztein-hozzáférési kísérletekkel vizsgálta a GltS topológiáját (Dobrowolski és mtsai, 2007). Az általuk kapott kétdimenziós szerkezet jórészt megegyezett a riporter fúziók alapján készített modellel, viszont az 5-6. prediktált transzmembrán szegmensek eltérı pozícióját mutatta. A látszólagos ellentmondás feloldható volt azzal a feltételezéssel, hogy a prediktált 5. TMS egy szenzitív bemerülı hurkot képez, amit az utána következı 6. TMS stabilizál. Utóbbi hiányában és speciális szekvenciájának köszönhetıen, a szegmens valódi transzmembrán szekvenciaként képes viselkedni. Az eredmények alapján a GltS egy szimmetrikus felépítéső transzmembrán fehérje. Tíz membránt átérı szegmenst azonosítottunk, az N- és C-terminálisa a plazmamembrán periplazmatikus tér felöli oldalán helyezkedik el. A fehérje két nagyobb, öt-öt transzmembrán szegmenst tartalmazó, antiparallel helyzető egységbıl áll. A 4-5. és 9-10. transzmembrán szegmensek közötti két hidrofób régió feltételezhetıen a membránba bemerülı hurkot alkot. Elképzelhetı, hogy utóbbiak a háromdimenziós struktúrában térben egymáshoz közel helyezkednek el, és a hurkok csúcspontjai kapcsolatban állnak egymással. Emiatt lehetséges, hogy a szubsztrátok transzportjában is fontos szerepet játszanak, ahogy ez több más transzporter fehérjénél megfigyelhetı. A leírt kétdimenziós szerkezet lehetıséget teremt a GltS térszerkezetének és mőködésének elméleti vizsgálatához, valamint a kísérletes funkcionális analízis alapjául szolgál. 64
7. Summary Membrane proteins take part in lot of basic vital processes and are indispensable parts of biomembranes. They promote the regulated transport of the required substances, mediate the transfer of environmental signals (signal-transduction), modify other molecules and create physical connection between the compartments (e.g. the cytoplasm and the extracellular space). According to this, their malfunction or absence can cause numerous illnesses. The bioinformatic analyses of the available total genome sequences revealed that membrane protein-coding genes are common, they represent the 20-30 % of ORFs. Compared to their huge importance, little is known about the structure and mechanism of membrane proteins. Genomics, proteomics, system biology, bioinformatics and high throughput techniques can provide large amount of informations, giving us the possibility to perform extensive and complex research projects. However, these efficient tools still leave unanswered questions. Escherichia coli, the most characterized living form in the world, has been investigated for more than 120 years. The full genome sequence of the K-12 strain was published in 1997. Nowadays many other strain’s sequence is available, nevertheless we do not have precise information about 24% of the ORF’s function, and only 66% is verified experimentally (Karp et al, 2007). The situation of the eukaryotes is much worse, the proportion of the genes with justified function is 37% in Saccharomyces cerevisiae, 5% in Arabidopsis thaliana, 4 % in Drosophila melanogaster and in mouse respectively. Similar observations can be made in case of membrane proteins too. E. coli codes almost 900 proteins containing at least one transmembrane segment, which means that 21 % of the ORFs encode integral membrane proteins. The number of transporters is estimated to be 400, 180 with unidentified function. In the course of my work I examined two different Escherichia coli amino acid transporter systems. The genes of the high affinity methionin transporter (MetD) were amongst the unidentified ORFs. We managed to prove their function with our examinations. The other part of the dissertation presents the structural analysis of the glutamate specific transporter GltS and details of its consequences.
Identification of the high-affinity methionine transport system In Escherichia coli at least two L-metionin uptake systems exist (Kadner and Watson, 1974). A high-affinity (metD) and a low-affinity (metP) transporter was characterised. The
65
position of the metD system was punctually circumscribed with genetic mapping experiments. MetD was characterized as an ABC-transporter and the unique uptake system for Dmethionine and the toxic α-metil.methionine. Its expression is under the control of the MetJ repressor. The D-methionine transport was proved to be an osmotic shock sensitive process, which suggests the presence and participation of a periplasmic binding protein. The low affinity transport system is even less characterized, its genes are still unidentified. We compared the genetic map and the genome sequence of E. coli and noticed that there are only few membrane protein coding ORFs in the region of interest, and only one of them is a possible ABC-transporter. In the promoter sequence of the latter, we could indentify possible binding sites of the MetJ regulator, so we could predict the function of the abc-yaeEyaeC with high probability. The directed destruction of the operon indeed resulted in a Dmethionine transport deficient strain. Each ORF was built in expression vectors, and the created constructions were used for complementation test. Only the collective expression of the three ORFs could re-establish the transport. The identification of the high-affinity methionine transporter gave us the possibility to further characterize the other methionin permeases. The S-methyl-methionine transporter (MmuP) seemed to be possible candidate for the MetP system based on previously published data. To prove this assumption, we created a double deletant (∆metD, ∆mmuP) methionine auxotroph E. coli strain. The result of the phenotype-test clearly indicated that the MmuP is not identical with the low affinity L-methionine transporter. Our examination of the L-methionine uptake in E. coli resulted in the identification of the high-affinity transport system. We revealed that the metD locus containes three genes. From these ORFs three proteins are expressed which form a typical ABC-transporter system. The promoter activity and phenotype tests proved that the abc-yaeE-yaeC gene cluster is part of the methionine regulon, according to this the genes were renamed as metN, metI and metQ respectively. The identification of the high-affinity transport system gives us the possibility to explore the genes of other L-methionine transporters.
Reentrant loops in GltS The second part of this thesis describes the two dimensional structural analysis of GltS, which is one of the L-glutamate transporters in E. coli. Glutamate has a central metabolic role in E. coli. Together with glutamine they are the most important nitrogen sources and amino-group donors (Reitzer, 2003). It is the most abundant
66
anion in the cytoplasm as the couner-ion of K+. There are multiple glutamate-specific transporter systems in E. coli. The second part of the dissertation presents the twodimensional structural analysis of the Na+-dependent symporter GltS. With molecular biological techniques, namely reporter fusions, we analysed the membrane topology of GltS. Two reporter proteins (PhoA and LacZ) were fused to different lenght Nterminal parts of the GltS by gene manipulation methods. As the reporters have compartement specific activities, after enzymatic measurements it is possible to identify the periplasmic or cytoplasmic localization of the fusion points. With large number of fusions, the position of all loop regions could be deduced. Parallel to our study, another research team examined the topology of the GltS by the cysteine accessibility technique ((Dobrowolski és mtsai, 2007). Their structural model is in good correlation with our reporter fusion-based topology, only the 5-6. hydrophobic segments were found to be in different position. This contradiction was resolved by assuming that the 5. predicted transmembrane segment has a sensitive structure, which is stabilized by the following 6. TMS. In the absence of the latter, and due to its special sequence composition, the 5. segment can behave like a real transmembrane segment. Based on the combined results, GltS is a symmetrical protein. Ten transmembrane segments (TMS) were detected, the N- and C-terminal faces the periplasmic side of the plasmamembrane. The protein is formed from two larger antiparallel domains containing five TMSs each. Our results are in agreement with the hypothesis that two hydrophobic reentrant loops exist between the 4-5. and 9-10. transmembrane segments. The first reentrant loop streches into the membrane from the periplasmic space, the other from the cytoplasm. It is conceivable, that the two loops are connected to each other in the three dimensional structure. Thus, they can play an important role in the transport process, as it was observed with many transporters. Based on our experiences the structure of the first loop is sensitive, the following transmembrane segment seems to be necessery for its stabilization. In the absence of the latter, the fundamentally hidrophobic loop behaves like a real TMS. Based on the presented two-dimensional structure, the theoretical computation of the three-dimensional structure is possible. It can also help in the better understanding of L-glutamate transport, and identification of the substrate binding sites.
67
8. Köszönetnyilvánítás A legnagyobb köszönettel szüleimnek tartozom, akik lehetıvé tették számomra, hogy egyetemre járhassak és mindenben segítettek, támogattak. Köszönöm témavezetımnek Dr. Kálmán Miklósnak, hogy bizalmával és tanácsaival megajándékozott. Dr. Gál József szintén döntı mértékben járult hozzá a disszertáció elkészüléséhez. Nemcsak a felhasznált publikációk megalapozását köszönöm neki, hanem kutatói fejlıdésem elindítását is. Emlékezetes magyarázataiból most is építkezek, sokat közülük csak mostanában értettem meg igazán. Köszönöm Enikınek, hogy mindig és mindenhogy segít és segített az utamon. Köszönettel tartozom Prof. Dr. Nagy Lászlónak hozzájárulásáért. A sok mindennapi segítség mellett, hálás vagyok jelenlegi és volt kollégáimnak, mert megértéssel, nyitottsággal és barátsággal viszonyultak hozzám. Köszönöm Vörös Andreának, Dr. Bihari Zoltánnak, Dr. Kesserő Péternek, Dr. Kiss Istvánnak, Dr. Schnell Róbertnek, Kálmán Péternek, Dr. Csontos Józsefnek, Balázs Margitnak, Mlinarics Edinának, Bordás Diának és a BayBio összes dolgozójának!
68
9. Hivatkozások Andersen OS, Koeppe RE (2007) Bilayer Thickness and Membrane Protein Function: An Energetic Perspective. 36: 107-130 Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure Beart PM, O'Shea RD (2007) Transporters for L-glutamate: an update on their molecular pharmacology and pathological involvement. Br J Pharmacol. 2007 150(1):5-17. Review. Berlyn MK (1998) Linkage map of Escherichia coli K-12, edition 10: the traditional map. Microbiol Mol Biol Rev 62: 814–
69
