EKSPRESI GEN APETALA3-3 (PaphAP3-3) KELAS B MADS-BOX PADA PERKEMBANGAN BUNGA ANGGREK SELOP (Paphiopedilum glaucophyllum J. J. Smith) Syifa Sundari, Dahlia, Dwi Listyorini Universitas Negeri Malang E-mail:
[email protected] ABSTRAK: Paphiopedilum, yang dikenal sebagai slipper orchids termasuk dalam subfamili Cypripedioideae, famili Orchidaceae. Paphiopedilum glaucophyllum J. J. Smith. merupakan jenis anggrek endemik Jawa Timur. Keanekaragaman dan spesialisasi dari morfologi beberapa bunga anggrek telah diamati. Organ bunga diatur secara spesifik oleh interaksi famili gen MADS-box. Gen kelas B MADS-box memiliki dua clade yaitu APETALA3 (AP3) dan PISTILLATA (PI) mengkode MADS domain yang mengandung faktor transkripsi. Gen AP3 terbedakan dalam empat clade, interaksi kombinasi dari empat clade ini dengan gen homeotik yang lain menentukan perbedaan ciri dari periantium. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi ekspresi gen PaphAP3-3 (clade 1/ AP3B1) pada perkembangan bunga anggrek selop jenis Paphiopedilum glaucophyllum J. J. Smith. Penelitian ini berhasil melaporkan gen PaphAP3-3 diekspresikan disetiap organ bunga yaitu bagian sepal, petal, labelum, dan column pada tahapan kuncup bunga. Kata kunci: ekspresi gen, APETALA3-3, Paphiopedilum glaucophyllum J. J. Smith
kelas
B
MADS-box,
Orchidaceae,
ABSTRACT: Paphiopedilum (slipper orchids), is included in subfamily Cypripedioideae, family Orchidaceae. Paphiopedilum glaucophyllum J. J. Smith is endemic orchid of East Java. The diversity and specialization of floral morphology have been observed in some orchid species. Flower organ identity specifically is regulated by family gen interaction of MADS domain. Class-B floral homeotic genes encode MADS-domain transcription factors have two clades, namely APETALA3-like and PISTILLATA-like genes. AP3-like gene were divided into four subclade. The identity of the different perianth organs is specified by the combinatorial interaction of four AP3-like MADS-box genes with other floral homeotic genes. This study aimed to identity expression pattern of PaphAP3-3 (clade 1/ AP3B1)-like gene in floral development of Paphiopedilum glaucophyllum J. J. Smith. The result suggested that PaphAP3-3-like gene are expressed in all floral organ (sepals, petals, labellum, and column) at the floral bud stage. Keywords: gene expression, APETALA3-3, Paphiopedilum glaucophyllum J. J. Smith
B-class
MADS-box,
Orchidaceae,
Anggrek yang merupakan anggota dari famili Orchidaceae menarik bagi para peneliti karena memiliki karakteristik biologi yang unik (Su et al., 2013). Anggrek juga merupakan tanaman hias yang bernilai ekonomi tinggi dan digemari masyarakat karena nilai estetikanya (Direktorat Budidaya Tanaman Hias, 2008). Orchidaceae merupakan salah satu famili terbesar tanaman berbunga (Aceto & Gaudio, 2011), terdiri dari 25.000 spesies (Soon, 2005). Paphiopedilum, yang dikenal sebagai slipper orchids termasuk dalam subfamili Cypripedioideae, famili Orchidaceae (Cox et al., 1997). Paphiopedilum glaucophyllum J. J. Smith (Gambar 1) merupakan jenis anggrek endemik Jawa Timur (Govaerts, 2003; Dyer, 1906). Keanekaragaman dan spesialisasi dari morfologi bunga beberapa spesies anggrek telah diamati dalam dua dekade terakhir, sehingga mendorong minat untuk mempelajari gen yang terlibat dalam perkembangan bunga (Aceto & Gaudio, 2011). Organ bunga diatur secara spesifik oleh interaksi famili gen MADS-box (Bowman et al., 2012; Zahn et al., 2005). Gen MADS-box berkontribusi dalam mengenalkan model ABCDE yang mengontrol identitas organ
1
2
bunga. Pengetahuan tentang fungsi pengkodean ABCDE gen MADS-box di anggrek akan memberikan wawasan dalam morfogenetik perkembangan bunga (Tsai & Chen, 2006).
a Gambar 1.
b
Paphiopedilum glaucophyllum: a) Ilustrasi (Sumber: Dyer, 1906), b) Foto Asli (Sumber: http://www.slipperorchids.info)
Gen kelas B MADS-box dicirikan pada anggrek sebagai kelas yang memiliki subkelas paling banyak dan merupakan kelas yang banyak dipelajari dibandingkan dengan kelas lain (Aceto & Gaudio, 2011). Fungsi molekular kelas B MADS-box ini telah dipelajari lebih detail daripada gen homeotik bunga yang lain (Tsai & Chen, 2006). Kelas ini memiliki dua clade yaitu APETALA3 (AP3) dan PISTILLATA (PI) (Palomino & Theiβen, 2011; Zahn et al., 2005; Goto & Meyerowitz, 1994). Gen AP3 dan PI mengkode MADS domain yang mengandung faktor transkripsi yang berperan utama dalam penentuan ciri petal dan stamen (Palomino & Theiβen, 2011; Goto & Meyerowitz, 1994; Jack, 1992). Selain itu, kelas B MADS-box berkontribusi pada bentuk labelum bunga anggrek (Pan et al., 2011; Palomino & Theiβen, 2011). Gen AP3 terbedakan dalam empat clade (Gambar 2), yaitu clade 1 (AP3B1), clade 2 (AP3B2), clade 3 (AP3A1), dan clade 4 (AP3A2) (Hsiao et al., 2011; Pan et al., 2011). Interaksi kombinasi dari 4 clade ini dengan gen homeotik yang lain menentukan perbedaan ciri dari periantium (Palomino & Theiβen, 2009). Gen target yang diregulasi oleh aktifitas gen AP3 pada tanaman Arabidopsis diantaranya yaitu gen Dehydrin, gen Metallothionein yang diduga mengkode Piroresinol-lariciresinol reductase (PLR), gen Senescence-Associated1 (SEN1), gen NAP (NAC-LIKE, ACTIVATED BY AP3/PI), dan gen SUP (SUPERMAN) (Zik & Irish, 2003).
Gambar 2. Duplikasi gen APETALA3, dihasilkan empat clade (Sumber: Palomino & Teiβen, 2011)
3
Gen AP3 telah diisolasi dari beberapa anggrek (Tsai & Chen, 2006). Gen AP3 diketahui berperan dalam mengatur bentuk dan inisiasi pada anggrek Oncidium Gower Ramsey (Hsu & Yang, 2002). Studi yang telah dilakukan menjelaskan pola ekspresi gen AP3 pada tahapan kuncup bunga. Gen AP3-3 diekspresikan pada sepal, petal, labelum, column Paphiopedilum hybrid cultivar dan Brassavola nodosa, diekspresikan pada labelum Phaius tancarvilleae dan Dendrobium hybrid cultivar, dan diekspresikan pada column Oncidium hybrid cultivar (Pan et al., 2011). Cara atau metode untuk mengetahui terjadinya ekspresi gen adalah dengan memonitor keberadaan produk yang terbentuk dari setiap tahapan ekspresi gen, salah satunya yaitu mRNA. Deteksi keberadaan mRNA dengan RT-PCR didasarkan pada kemampuan untuk mensintesis single strand cDNA dari total mRNA. Keberadaan kontrol internal dalam analisis ekspresi gen merupakan hal penting serta erat hubungannya dengan interpretasi data yang dihasilkan (Sudarsono, 2012). Actin digunakan sebagai kontrol internal disebut dengan housekeeping gene, sintesis gen ini diperlukan untuk kelangsungan hidup sel (Thellin et al., 1999), gen Actin memiliki tingkat ekspresi yang stabil pada setiap sel (Biederman et al., 2004) Penelitian identifikasi gen PaphAP3-3 untuk mengetahui pola ekspresi pada setiap bagian bunga Paphiopedilum glaucophyllum J. J. Smith belum pernah dilakukan, sehingga untuk mengetahui hal tersebut dilakukan penelitian ini. METODE Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif eksploratif dengan pendekatan semi-kuantitatif. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Regulasi Genetik, Jurusan Biologi, dan Laboratorium Bioteknologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Malang pada Februari 2016- Mei 2016. Objek Penelitian Objek dalam penelitian ini adalah gen APETALA3-3 (PaphAP3-3) yang diisolasi dari anggrek Paphiopedilum glaucophyllum J. J. Smith pada tahapan kuncup bunga yang didapatkan dari DD’ Orchid Nursery Desa Dadaprejo, Kota Batu. Alat dan Bahan Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya yaitu: botol, autoclave, mikropipet, tip, gelas ukur, mortar, pistil, pinset, sentrifuge refrigerated, mikrotube, DNA/RNA UV-cleaner box, inkubator GFL, magnetic stirerr, termometer, beaker glass, Techne® Endurance TC-312 Thermal Cycler, Thermo Scientific NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer, Bio-Rad ChemiDoc™ XRS, neraca digital, labu takar, dan satu set alat Elektroforesis. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya yaitu: Akuades steril, DEPC (Dietilpyrocarbonate), alumunium foil, Kuncup bunga Paphiopedilum glaucophylum J. J. Smith, TriPure Isolation Reagent Roche, nitrogen cair, kloroform, isopropanol, etanol 75%, RNAse-free Water, Tetro Reverse Transcriptase Bioline, dNTP mix Bioline, RiboSafe RNAse Inhibitor Bioline, RNAse-free water, air, primer gen PaphAP3-3: primer forward F1 (5’ ATG GGG CGA GGG AAG ATA GAG AT-3’), serta primer reverse R1 (5’ CAT ATC ATG CAA GGC TAA GAT CAT GTG-3’), primer gen PaphActin, primer forward F1 (5’ GGC TAA CAG AGA GAA GAT GAC C-3’), serta primer reverse R1 (5’ AAT AGA CCC TCC AAT CCA GAC-3’) (Pan et al., 2011), MyTaq™ Red Mix Bioline, Water (ddH2O), bubuk agarose, Bufer TBE (Tris-Boric-acid-EDTA), EtBr (Ethidium Bromide), Loading Dye, Akuades steril, parafilm, marker RNA.
4
Prosedur Kerja Prosedur kerja dalam penelitian ini diawali dengan pembuatan RNA-se free water, kemudian isolasi total RNA berdasarkan prosedur TriPure Isolation Reagent Roche dengan modifikasi. Total RNA digunakan sebagai template dalam sintesis cDNA PaphAP3-3 dan cDNA PaphActin (RT-PCR). Hasil isolasi berupa RNA total, dan hasil RT-PCR yaitu berupa cDNA PaphAP3-3 dan cDNA PaphActin diukur konsentrasinya dengan menggunakan Thermo Scientific NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer. Prosedur PCR didasarkan pada MyTaq Red Mix Protocol Bioline yang dimodifikasi. Siklus PCR diawali dengan initial denaturation selama 1 menit dengan suhu 950C, denaturation selama 13 detik dengan suhu 950C, annealing selama 15 detik dengan suhu 580C untuk PaphAP3-3 sedangkan 540C untuk PaphActin, extention selama 15 detik dengan suhu 720C, dan final extention sebagai penutup dilakukan selama 5 menit dengan suhu 720C. Denaturation hingga annealing sebanyak 35 siklus. Prosedur terakhir yaitu elektroforesis, konsentrasi agarose yang digunakan yaitu 0.8%, kemudian dicek hasilnya menggunakan Bio-Rad ChemiDoc™ XRS. Analisis Data Data yang diperoleh berupa hasil nanodrop dan elektroforesis yang telah dicek menggunakan Bio-Rad ChemiDoc™ XRS. Data dianalisis secara deskriptif dengan membandingkan nilai kuantifikasi relatif ekspresi gen PaphAP3-3 pada sepal, petal, column, dan labelum dengan ekspresi housekeeping gene (gen PaphActin). HASIL PENELITIAN Konsentrasi RNA total pada setiap organ bunga disajikan pada Tabel 1 berikut. Tabel 1. Hasil Isolasi RNA Total P. glaucophyllum J. J. Smith Organ bunga Sepal Petal Labelum Column
Konsentrasi (ng/μl) 4270.7 2889.2 1925 4152
Kemurnian (A260/A280) 1.9 1.78 1.61 1.87
Ket RNA murni RNA murni RNA murni RNA murni
Produk yang dihasilkan dari tahapan RT-PCR berupa untai tunggal cDNA disajikan pada Tabel 2 berikut. Tabel 2. Hasil Sintesis cDNA PaphAP3-3 dan cDNA PaphActin Gen PaphAP3-3
PaphActin
Organ bunga Sepal Petal Labelum Column Sepal Petal Labelum Column
Konsentrasi (ng/μl) 438 354.6 405.0 457.1 370.1 391.9 396.8 416.3
Hasil sintesis untai tunggal cDNA dijadikan template pada proses perbanyakan dengan teknik PCR. Visualisasi pita cDNA PaphAP3-3 dan PaphActin (housekeeping gene) pada bagian sepal, petal, labelum, dan column sebagai berikut.
5
Gambar 3.
Visualisai pita elektroforesis gen PaphAP3-3 dan PaphActin yang diekspresikan pada setiap organ bunga dalam tahapan kuncup bunga. Actin digunakan sebagai kontrol internal. Se, sepal; Pe, petal; La, labelum; Co, column.
PEMBAHASAN Hasil visualisasi pita elektroforesis menunjukkan bahwa gen PaphAP3-3 dan gen PaphActin diekspresikan pada setiap organ yaitu sepal, petal, labelum, dan column. Ekspresi gen PaphAP3-3 yang lebih tinggi ditemukan pada bagian labelum dan rendah pada bagian petal, hal ini terlihat dari lebih tebalnya pita PaphAP3-3 pada bagian labelum dibandingkan dengan organ lain sepeti pada Gambar 3, tebal dan tipisnya pita secara kuantitatif menunjukan jumlah. Berdasarkan ketebalan pita gen PaphActin pada seluruh bagian bunga menunjukan tingkat ekspresi yang sama. Ekspresi gen PaphAP3-3 pada setiap organ bunga lebih rendah jika dibandingkan dengan ekspresi PaphActin (housekeeping gene). Pola ekspresi gen AP3 berkorelasi dengan tipe periantium (Palomino, & Theiβen, 2011). Organ sepal dan petal anggrek yang diteliti dapat dibedakan dengan mudah, sehingga jenis anggrek ini memiliki tipe periantium yang normal (non-peloria). Pola ekspresi gen PaphAP3-3 (clade 1/ AP3B1) yang dianalisis secara semi kuantitatif mirip dengan Paphiopedilum hybrid cultivar, yaitu ekspresi gen PaphAP3-3 diekspresikan pada setiap organ bunga dan ekspresi gen ini tinggi pada bagian labelum. Tingginya tingkat ekspresi gen PaphAP3-3 pada bagian labelum diduga berperan dalam perkembangan labelum karena gen ini berfungsi dalam proliferasi sel dan perkembangan labelum pada anggrek Oncidium (Chang et al., 2010). Ekspresi gen PaphAP3-3 yang spesifik dan sensitif dapat diketahui dengan melakukan penelitian lanjut menggunakan teknik qRT-PCR. SIMPULAN DAN SARAN Gen PaphAP3-3 diekspresikan disetiap organ bunga yaitu bagian sepal, petal, labelum, dan column pada tahapan kuncup bunga. Ekspresi gen PaphAp3-3 yang tinggi pada bagian labelum diduga berperan dalam perkembangan labelum anggrek Paphiopedilum glauchopyllum J. J. Smith. Diperlukan penelitian lebih lanjut, yaitu proses qRT-PCR untuk mengetahui ekspresi gen PaphAP3-3 secara kuantitatif. DAFTAR RUJUKAN Aceto, S. & Gaudio, L. 2011. The MADS and the Beauty: Genes Involved in the Development of Orchid Flowers. Current Genomics, 12 (5): 342-356.
6
Biederman J., Yee J., & Cortes P. Validation of internal control genes for gene expression analysis in diabetic glomerulosclerosis. Kidney International, 66: 2308–2314. Bowman, J. L., Smyth, D. R., and Meyerowitz, E. M. 2012. The ABC model off lower develoment: then and now. Development, 139 (22): 4095–4098. Chang, Y. Y., Kao, N. H., Li, J. Y., Hsu, W. H., Liang, Y. L., Wu, J. W., & Yang, C. H. 2010. Characterization of the possible roles for B class MADS box genes in regulation of perianth formation in orchid. Plant Physiol. 152: 837–853. Cox, A. V., Pridgeon, A. M., Albert, V. A., & Chase M. W. 1997. Phylogenetics of the slipper orchids (Cypripedioideae, Orchidaceae): nuclear rDNA ITS sequences. Plant Systematics and Evolution, Abstrak, 208 (3-4): 197-223. Direktorat Budidaya Tanaman Hias. 2008. Standar Prosedur Operasional Anggrek Dendrobium. Jakarta: Departemen Pertanian. Dean, J. D., Goodwin, P.H., & Hsiang T. 2002. Comparison of Relative RT-PCR and Northern Blot Analyses to Measure Expression of β-1,3-Glucanase in Nicotiana benthamiana Infected With Colltotrichum destructivum. Plant Molecular Biology Reporter, 20: 347356. Dyer, W. T. T. (Ed.). 1906. Curtis’s Botanical Magazine Illustrating and Describing Plant of the Royal Botanic Gardens of Kew, and of other Botanical Establishments. London: Lovell Reeve & Co., LTD. Goto, K. & Meyerowitz, E. M. 1994. Function and regulation of the Arabidopsis floral homeotic gene PISTILLATA. Genes Dev, 8: 1548–1560. Govaerts, R. 2003. World Checklist of Selected Plant Families, Royal Botanic Gardens Kew, (Online), (http://apps.kew.org/wcsp/home.do), diakses 2 Januari 2016. Hsiao, Y. Y., Pan, Z. J., Hsu, C. C., Yang, Y. P., Hsu, Y. C., Chuang, Y. C., Shih, H. H., Chen, W. H., Tsai, W. C., & Chen, H. H. 2011. Research on Orchid Biology and Biotechnology. Plant Cell Physiol, 52 (9): 1467–1486. Hsu, H. F. & Yang, C. H. 2002. An Orchid (An Orchid (Oncidium Gower Ramsey) AP3-like MADS Gene Regulates Floral Formation and Initiation. Plant Cell Physiol. 43(10): 1198–1209. Jack, T., Brockman, L. L. & Meyerowitz, E. 1992. The homeotic gen APETALA3 of Arabidopsis thaliana encodes a MADS box and is expressed in petals and stamens. Cell, Abstrak, 68: 683–697. Roche®. 2013. TriPure Isolation Reagent. Palomino, M. M., & Theiβen, G. 2009. Why are orchid flowers so diverse? Reduction of evalutionary constraints by paralogues of class B floral homeotic genes. Annals of Botany, 66: 1008- 1019.
7
Palomino, M. M., & Theiβen, G. 2011. Conserved differential expression of paralogous DEFICIENS- and GLOBOSA-like MADS-box genes in the flowers of Orchidaceae: refining the ‘orchid code’. The Plant Journal, 66: 1008- 1019. Pan, Z. J., Cheng, C .C., Tsai, W. C., Chung, M. C., Chen, W. H., Hu, J. M. & Chen, H. H. 2011. The Duplicated B-class MADS-Box Genes Display Dualistic Characters in Orchid Floral Organ Identity and Growth. Plant Cell Physiol. 52 (9), 1515-1531. Sudarsono, 2012. Metode Memonitor Terjadinya Ekspresi (https://pmblab.wordpress.com), diakses tanggal 2 Januari 2016.
Gen,
(Online),
Soon, T. E. 2005. Orchids of Asia. Singapore: Times Edition-Marshal Cavendish. Thellin O., Zorzi W., Lakaye, B., Borman, B. D., Coumans, B., Hennen, G., Grisar, T., Igout A., & Heinen E. 1999. Housekeeping genes as internal standards: use and limits. Journal of Biotechnology, 75: 291–295. Tsai, W. C. & Chen, H. H. 2006. The Orchid MADS-Box Genes Controlling Floral Morphogenesis. The Scientific World JOURNAL, 6: 1933–1944. Zahn, L. M., Leebens M. J., Depamphilis, C. W., Ma. H., & Theissen, G. 2005. To B or Not to B a Flower: The Role of Deficiens and Globosa Orthologs in the Evolution of the Angiosperms. Journal of Heredity, 96 (3): 225–240. Zik, M. & Irish, V. F. 2003. Global Identification of Target Genes Regulated by APETALA3 and PISTILLATA Floral Homeotic Gene Action. The Plant Cell, 15: 207-222.
