JUaNAL
SAINTIFIKA,
VOLUME II NO.2,
DESEMBER
2010
EFEKEKSTRAK ETANOLlKRlMPANGTEMU KUNCI (Boesenbergiapanduralil) MENINGKATANAKTIVITAS SITOTOKSIKOOXORUBICINTERHADAPSEL T47D Navista Sri Octa Ujiantari*, Niken Nur Widyakusuma, Franciscus F. Handoko, Anugerah B.Adina, Raditya Prima Istiaji Fakultas Fannasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta ABSTRAK Pengobatan kanker payudara dapat dilakukan dengan agen kemoterapi seperti doxorubicin. Namun, obat ini memiliki efek samping yang merugikan serta penggunaanjangka panjang dapat menyebabkan resistensi. Oleh karena itu, Temu Kunci (Boesenbergia pandurata) yang telah diteliti dapat menghambat sel kanker diharapkan dapat menjadi agen untuk mengurangi efek samping tersebut dan mengurangi terjadinya resistensi sel.
Ekstraketanolikrimpang Temu Kunci (ETK)yang diekstraksidenganetanol 96% diuji efek sitotoksiknya terhadap sel kanker payudara T47D dengan metode MTT pada perlakuan tunggal maupun kombinasi dengan doxorubicin untuk memperoleh IC50 dan indeks kombinasi (CI). Uji sitotoksik perlakuan tunggal ETK dan doxorubicin pada sel T47D diperoleh IC50 berturut-turut sebesar 56 pglmL dan 15 nM Dari hasil kombinasi antara ETK-doxorubicin diperoleh hampir semua indeks kombinasi < 0,9 yang berarti menunjukkan efek sinergisme. Konsentrasi kombinasi yang optimum adalah 3181C50 doxorubicin-Jl8 IC50 ETK. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ETK berpotensi sebagai agen terapi kombinasi untuk meningkatkan aktivitas kemoterapi. Kata kunci : Temu Kunci (Boesenbergia pandurata), sel T47D, P13K, kokemoterapi
PENDAHULUAN Kanker payudara merupakan kasus kanker yang menduduki peringkat pertama pada wanita di seluruh dunia serta merupakan penyebab kematian terbesar pada penderita kanker wanita di negara maju (l). Sedangkan pada negara berkembang seperti Indonesia kanker payudara merupakan kanker dengan insidensi tertinggi setelah kanker serviks (2). Sehingga penting untuk dikembangkan sebuah inovasi pengobatan yang aman untuk terapi kanker payudara. Terapi kanker payudara yang banyak digunakan saat ini adalah kemoterapi menggunakan doxorubicin (3). Melalui penelitian lebih lanjut diketahui terdapat efek samping yang timbul pada penggunaan doxorubicin seperti resistensi obat, kerusakan organ jantung, rasa mual, muntah dan rambut rontok (4). Kemudian diketahui bahwa penggunaan obat herbal sebagai kombinasi dengankemoterapi merupakan cara yang l.ebih baik pada pengobatan kasus kanker karena
dapat meningkatkan kemanjuran serta mengurangi toksisitas (5). Salah satu bahan alam yang berpotensi sebagai agen anti kanker adalah rimpang Temu Kunci (Bosenbergia pandurata). Beberapa penelitian menyebutkan bahwa salah satu kandungan senyawaaktifrimpangTemu Kunci yaitu panduratin A dapat menghambat pertumbuhan sel kanker (6). Sebuah penelitian menyatakan bahwa panduratin A mampu menginduksi apoptosis pada sel kanker kolon HT29 dengan analisisflowcytometry (7). Hasil dari penelitian lain menunjukkan PanduratinA juga mampu menginduksi apoptosis sel kanker prostatPC3 dan DUl45 manusia(8). Sehingga Temu Kunci berpeluang untuk menjadi agen terapi kombinasi sebagai alternatif upaya peningkatan aktivitas agen kemoterapi terhadap sel kanker. Selanjutnya diketahui salah satu mekanisme penghambatan kanker payudara adalah pemacuan induksi apoptosis melalui penghambatan aktivitas Phosphatidilinositol 3-Kinase (PI3K). Penghambatan 15
JURNAL SAINTIFIKA.
VOLUME II NO.2.
DESEMBER 2010
aktivitas PI3K dengan wortmannin (inhibitor PI3K) temyata dapat menyebabkan induksi apoptosis (9). Panduratin A sebagai senyawa aktif rimpang Temu Kunci diharapkan memiliki kemampuan penghambatan aktivitas PI3K, sehingga dapat menginduksi apoptosis sel kanker payudara. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi Temu Kunci sebagai agen terapi kombinasi dalam peningkatan aktivitas doxorubicin terhadap sel kanker payudara T47D. Pada akhimya, penelitian ini diharapkan dapat menjadi dasar ilmu pengetahuan dalam aplikasi pengembangan inovasi obat yang potensial dan aman untuk kanker payudara dari tanaman Temu Kunci.
Uji Sitotoksik dengan M1T Pada uji ini dibutuhkan: Media kultur, Pelarut sampel: Dimetil Sulfoxida (DMSO)(Sigma),Larutan stopper: Sodium Dodesi/ Sulfat(SDS) 10 % v/v (Merck) dalam HCl0,1N (Merck),0,5mglmLReagenMTT (3(4,5-dimetil tiazol-2-il(-2,5difeniltetrazoliumbromida))) yang dibuat dengancarnmelarutkan50 mg MTT (ditimbang denganneracaanalitik(Sartorius»dalam 10mL PBS,kemudianambill mLlarutandanencerkan dengan larutan media sampai 10 mL serta larutan pencuci: PBS (Phospat Buffer Saline) pH 7,4 yang dibuat dengan melarutkan 0,2 g KCl (HPLC grade, Sigma), 8 g NaCI (HPLC grade, Sigma), 1,15gNa2HP04(HPLCgrade, Sigma) dan KH2P04 (HPLC grade, Sigma) dalam 1 L aquadest.
METODEPENEUTIAN Tempat dan Waktu Pelaksanaan Penelitian ini dilaksanakan di LaboratoriumParasitologiFakultasKedokteran dan Laboratorium Farmakognosi bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada pada bulan Februari-Mei2009. Bahan Penelitian Bahan utama Bahan uji yang digunakan yaitu Doxorubicin yang diperoleh dari Rumah Sakit Sardjito serta serbuk rimpang Temu Kunci (Boesenbergia pandurata) yang dibeli dari Balai Besar Litbang Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TOOT), kemudian serbuk diekstraksi dengan metode maserasi selama 5 hari dengan penyari etanol 96 % (Merck)dan dikentalkan dengan rotary evaporator (Heidolph WB2000). Sel T47D sebagai model selkanker payudaradiperolehdari koleksiCancer Chemoprevention Research Center FakultasFarmasiUGM. Media Penumbuh Sel (Media Kultur/MK) Bahan dibuat dari serb uk Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco), Fetal Bovine Serum (FBS) 10% v/v(Gibco) dan Penisilin-Streptomisin 1% v/v (Gibco). Sel dipanen dari culture dish/flask (Iwaki) dengan TripsinEDTAO,25 % V/v(Gibco).
16
Metode Penelitian
Uji Kombinasi serta Pengamatan Sitotoksisitas dengan Metode M1T Sel T47D dengan kepadatan 5 x 103sell sumurandidistribusikanke dalam 96-wellplate (Nunc), kemudian diinkubasi selama 24 jam pada 37°C dalam inkubator C02 (Heraeus). Setelah24jam media dibuang,cuci dengan 100 J.llPBS lalubuangPBS,kemudianditambahkan media kultur sebagai kontrol media, 1,5% vIv DMSO sebagai kontrol DMSO, untuk perlakuan ETK digunakan konsentrasi 10,20, 30, 60, 100, 200 serta 250 J.lglmLsedangkan perlakuan doxorubicin 10, 25, 50, 75 dan 100 nM. Pada uji kombinasi dilakukan dengan membuatserikonsentrasicampuranETK-doxorubicin dari hasil IC50 uji sitotoksik tunggal dengan seri konsentrasi 1/2, 3/8, 1/4 dan 1/8 IC50, dalam uji kombinasi ini digunakan seri konsentrasi ETK yaitu 28, 21, 14dan 7 J.lglmL, sedangkan doxorubicin 8, 6, 4 dan 2 nM. Kemudian diinkubasi kembali selama 24 jam pada suhu 37°C. Pada akhir inkubasi, media dibuang, dicuci menggunakan 100J.llPBS lalu buangPBS,kemudianke dalam masing-masing well ditambahkan 100 il media kultur yang mengandung 5 mglmL MTT, diinkubasi lagi selama4jam padasuhu37°C.Reaksidihentikan denganstopperSDS 10% v/vdalam 0,1NHCl dan dibaca absorbansinya dengan ELISA
JURNAL SAINTIFIKA.
reader (Bio-rad) pada panjang gelombang 595 nm.
Analisis Data Uji Sitotoksisitas Data yang didapat dari ELISA Reader berupa hasil absorbansi masing masing sumuran dikonversikan dalam persen kehidupan (viabilitas) sel. Pengukuran kadar IC50 dilakukan dengan menggunakan persamaan : y = bx + a, yang diperoleh dari hasil regresi linier log konsentrasi dengan persen sel hidup. Harga IC50 merupakan konsentrasi yang dapat menghambat proliferasi atau pertumbuhan sel sebesar 50% populasi sel (10).
VOLUME II NO.2.
DESEMBER 2010
Ana/isis nilai indeks kombinasi (CI) Potensi aplikasi dalam terapi kombinasi dianalisis dengan menggunakan metode indeks kombinasi (combinatorial index methodlCI) yang ditentukan dengan menggunakan rumus: Dl D2 C 1= + ------Dxl Dx2
D1dan D2 merupakan konsentrasi dari masing-masing senyawa uji yang digunakan untuk uji kombinasi. Dx1 dan Dx2 merupakan konsentrasi senyawa uji tunggal yang disebabkan oleh perlakuan (x) pada persamaan regresi yang digunakan untuk menentukan dua kombinasi senyawa, apakah berupa efek sinergis, aditif atau antagonis (11) (Tabell).
Tabell. Interpretasi nilai CI
CI Interpretasi <0,1 sinergis sangat kuat 0,1-Q,3 sinergis kuat 0,3-Q,7 sinergis 0,7-Q,9 sinergis ringan-sedang
CI 0,9-1,1 1,1-1,45 1,45-3,3 >3,3
Interpretasi mendekati additif antagonis ringan-sedang antagonis antagonis kuat-sangat kuat
HASILDANPEMBAHASAN Efek Ekstrak Etanolik Rimpang Temu Kunci dan Doxorubicin Tunggal Terhadap Viabilitas Sel T47D
120 f100 ..,. f.;, 80 Q1
;;<:
60
:s 40
IC5056 !Jg/mL
Jj
20 0 -20 (A)
f'
120 100 80
.
40
I
20 0
t.
100
200
300
KonselltrasiEkstrakRimpangTemu Kunci (11mL)
J
.20 . (B)
IC50 15 oM
80111
80
100
180
EoDnaIrIlli. DDaJUbidD bJM}
17
JURNAL SAINTIFlKA,
VOLUME II NO.2,
DESEMBER 2010
..... .....
.....
.....
II
.
. ...,
.......
...---(C) (D) (E)
Gambar 1. Efek sitotoksik ekstrak etanolik rimpang Temu Kunci terhadap selT47D dengan metode MTT. Grafik hubungan seri kadar ekstrak etanolik rimpang Temu Kunci (A) sertadoxorubicin (B) terhadap viabilitassel T47D. Data diperolahmelalui2x replikasi :!:..sD(p<0,05). Gambar morfologi sel T47D pada perlakuan:Kontrol sel (C); Kontrol
DMSO(D) dengankadarDMSOtertinggi(1,5 % V/v)yangdigunakansebagaicosolven yang menunjukkan tidak ada pengaruh DMSO terhadap viabilitas serta morfologi sel T47D; serta perlakuanekstrak etanolikrimpang TemuKunci (E) setelah menginkubasi 5x I 03 sel pada kadar ekstrak 56 ~g/ml (perlakuan IC50) selama24jam.PerbesaranmikroskopIOOx.
Uj i sitotoksik dilakukan untuk menentukan potensi ketoksikan yang dihasilkan dari ETK dan doxorubicin terhadap sel T47Dyy Pada perlakuan sitotoksik tunggal ETK menunjukkan adanya korelasi antara konsentrasi larutanuji dengan efek toksik yang ditimbulkan. Hasil yang diperoleh pada perlakuanETK dan Doxorubicinmenunjukkan fenomena dose dependent yang ditunjukkan dengan efek toksik yang meningkat seiring peningkatan konsentrasi, yang berarti semakin keciljumlah sel yang hidup. Dari uji sitotoksik diperoleh nilai IC50 perlakuan tunggal ETK sebesar 56 ~g/mL sedangkan pada doxorubicin diperolehhasilIC50sebesar 15nM (Gambar lA-B). Melalui pengamatan menggunakan mikroskop dapat diketahui bahwa pada perlakuan ETK menunujukkan terdapatnya perubahan morfologi sel T47D dibandingkan kontrol sel T47D dan kontrol DMSO (Gambar IB-D). Efek Kombinasi Ekstrak Etanolik Rimpang Temu Kunci dan DoxorubicinTerhadap Viabilitas Sel T47D Uji kombinasi merupakan metode yang digunakan untuk menggambarkan efikasi dari hasil kombinasi antara ETK dengan doxorubi18
cin terhadap T47D menggunakan persamaan. Kombinasi doxorubicin dengan ekstrak uji memberikanindekskombinasi(TabelII). Tabel D. Nilai CI pada uji kombinasi antara ekstrak etanolik rimpang Temu Kunci dan doxorubicin terhadap sel T47D ekstrak rimpang Temu Kunci (l!g/mL)
8
28
0,114
0,139
0,922
2,006
21
0,082
0,096
0,395
1,540
14
0,062
0,063
0,169
0,972
7
0,032
0,031
0,092
0,408
doxorubicin (nM) 64
2
Efek sinergis (CI < 0,9) muncul hampir pada seluruh kombinasi antara doxorubicinETK, bahkan pada kombinasi antara doxorubicin pada konsentra~i8 dan 6 nM dengan ETK pada konsentrasi 21 ~g/mL, 14 ~g/mL dan 7 ~g/mL menghasilkanefek sinergisyang sangat kuat (Tabel II). Dapat diketahui pula bahwa semakinkecil konsentrasiETKyang digunakan maka efek sinergis yang dihasilkan akan
JURNAL SAINTIFlKA,
VOLUME II NO.2,
DESEMBER 2010
2 (A) Gambar 2. Efek kombinasi doxorubicin dengan ekstrak etanolik rimpang Temu Kunci terhadap persentase sel hidup T47D dengan metode MTT. Grafik hubungan perlakuan kombinasi ekstrak-doxorubicin terhadap persentase sel hidup (A), serta terhadap indeks kombinasi (B).
menjadi semakin besar, sedangkan pada Doxorubicin efek sinergis akan semakin besar seiring meningkatnya konsentrasi (Tabel III). Selain itu dapat diketahui bahwa konsentrasi kombinasi yang optimum adalah pada konsentrasi 6 nM doxorubicin- 7 f.lglmL ETK atau pada 3/8 IC50 doxorubicin-1/8 IC50 ETK. Data ini memperkuat hipotesis mengenai efek peningkatan sitotoksik dari doxorubicin oleh ETK.
Pembahasan Penelitianinimenunjukkanbahwaekstrak etanolik rimpang Temu Kunci (Boesenbergia pandurata) bersifat sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D. Hal tersebut diketahui melalui periakuan tunggal ETK yang menghasilkan IC50 sebesar 56 f.lglmL,selain itu perlakuan ekstrak menunjukkan dose dependent dimana peningkatan konsentrasi ekstrak dapat menghasilkan efek toksik yang semakin besar terhadap sel T47D. Ekstrak etanolikrimpangTemuKuncimemilikipotensi sebagai agen sitotoksik terhadap sel T47D. Suatu ekstrak dinyatakan memiliki efek siotoksik yang poten apabila memiliki harga IC50 kurang dari 100 f.lglmL(12). Melalui uji kombinasi diperoleh efek sinergisme pada aplikasikombinasiantara ektrakrimpangTemu
Kunci dengandoxorubicinpada hampirseluruh konsentrasi kombinasi. Serta diperoleh konsentrasi kombinasi yang optimum adalah 3/8 IC50 doxorubicin -'/8 IC50 ETK yang menunjukkan bahwa ETK mampu meningkatkankemampuansitotoksikdariDoxorubicin terhadap sel T47D. Mekanismepenghambatanpertumbuhan sel kanker dapat terjadi melalui berbagaipathway dan salah satunya adalah melaui peristiwa apoptosis. Apoptosis merupakan proses bunuh diri sel yang terprogram dan proses normal yang berperan dalam berbagai keperluan seperti perbaikanjaringan (3). Salah satu jalur yang berperan penting dalam apoptosis yaitu jalur PI3K (phosphoinositide 3-kinase).Beberapapenelitimenyatakanbahwa reseptortirosinkinase mengaktivasiPI3Kyang selanjutnya akan mengkatalisis fosforilasi Phosphatydilinositol(IP)membentukPI-3,4,5P3 (PIP3). Kemudian PIP3 mengaktitkan Akt memainkan peranan dalam menghambat apoptosis (9,13). Peneliti lain juga menyebutkan bahwa peningkatan Akt ini merupakan salah satu penyebab terjadinya resistensi sel terhadap agen kemoterapi (14). Penghambatan senyawa pada PI3K akan mencegah terjadinya fosforilasi Akt sehingga akan menginduksi terjadinya apoptosis. 19
JURNAL SAINTlFIKA.
VOLUME II NO.2,
DESEMBER 2010
Sedangkan pada doxorubicin sendiri telah diketahui dapat menginduksi terjadinya fosforilasi Akt melalui peningkatan aktivitas kinase pada PI3K. Akt yang teraktivasi kemudian dipindahkan ke sitoplasma dan atau mungkin diangkut ke dalam nukleus, hal ini yang kemudian melibatkan regulasi cell survival. Kemudiandiketahuiekspresi dari sebuah Akt teraktivasi pada Ras/PI3-K/Akt pathway mengakibatkan resistensi obat pada sel-sel kanker payudara (15). Melalui simulasi docking molecular menggunakan software Molecular Operating Environment (MOE) lisensi Fakultas Farmasi UGM yang telah dilakukan menunjukkan bahwa senyawa PanduratinAmemiliki afinitas terhadap PI3K. Pada interaksi yang terjadi antaraATP (ligan native) dengan PI3K terjadi pada residuSerin806,Asparagin951, danValin 882 (Gambar 3A). Sedangkanpada Panduratin
A dengan PI3K menunjukkan adanya interaksi yang sarna yaitu pada residu serin 806 Melalui keterangan tersebut, dapat diketahui bahwa kemungkinan mekanisme peningkatan aktivitas sitotoksik dari doxorubicin terhadap sel T47D adalah melalui afinitas yang terjadi antara PI3K-Panduratin A, yang menyebabkan PI3K tidak dapat memfosforilasi Akt dan mekanisme survival cell dapat dihambat, sehinga mencegah terjadinya resistensi sel T47D, selain itu PI3K merupakan salah satu protein anti-apoptosis, yang apabila dihambat aktivitasnya akibat terikat dengan Panduratin A proses apoptosis dapat berjalan dan menyebabkan kematian sel. Sehingga perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai ekspresi dari protein Akt terfosforilasi untuk mengetahui lebih lanjut mekanisme pemacuan apoptosis yang terjadi pada pemberian ekstrak etanolik rimpang Temu Kunci.
/
,
(C) (D) Gambar 3. Interaksi antara PI3K-ATP dan PI3K-PDT A. Terdapat 3jenis ikatan yang terjadi antara PI3K dan ATP yaitu ikatan dari gugus fosfat ATP dengan residu asn 951 dan serin 806, ikatan antara atom N dengan residu valin 882 (A); sedangkanpada PDTA dan PI3K ada satujenis ikatan yaitu ikatan antara atom 0 pada gugus metoksi PDT A dengan residu serin 806 (B,C,D) _Ikatan ATPdengan asn 951, serin 806 dan valin 882 pada PI3K
20
JURNAL SAINTlFIKA.
KESIMPULAN Dari penelitian ini didapatkan bahwa ekstrak etanolik rimpang Temu Kunci (Boesenbergia pandurata) dapat meningkatkan aktivitas agen kemoterapi doxorubicin terhadap sel T47D.
DAFfARPUSTAKA Doyle A and Griffiths JB. Cell and TissueCulture for Medical Research. New York: John Willey and Sons Limited; 2000. Flusberg DA, Numaguchi Y, and Ingber DE., Cooperative Control of Akt Phosphorylation. bcl-2 Expression, and Apoptosis by Cytoskeletal Microfilaments and Microtubules in Capillary Endothelial Cells.Mol Bioi Cell.200I; 12(10):30873094. Garcia M, JemalA, WardEM, CenterMM, Hao Y, Siegel RL, Thun MJ. Global Cancer Facts & Figures 2007. American Cancer SocietyInc. [serialonline]2004-2007; 1(1):[3screen].AvailablefTom: URL:http:/ /www.cancer.org/downloads /STT / Global]acts_ and]igures _2007_rev2.pdf. Acessed March 7. 2010. King RJB. Cancer Biology 2ndedition. London: Pearson Education Limited;2000. Kirana, Chandra, Jones GP, Record IR, and McIntosh GH. Anticancer Properties of Panduratin A Isolated from Boesenbergia Pandurata (Zingiberaceae). Journal of Natural Medicine. 2006;61:131-137 LiuY,Rui W,Qiu GQ,Nan KJ, SunXc. Inhibitory effect of Fuzheng Yiliuyin in Combination with Chemotherapeutics on Human Gastric Carcinoma Cell Strain. WorldJ Gastroenterol.2006;12(25):40714073. Li X, LuY,Liang K, Liu B and FanZ. Differential responses to doxorubicin-induced phosphorylation and activation of Akt in human breast cancer cells. Breast CancerResearch.2005;7:589-597. Rahmi F, Meiyanto E, and Susidarti RA. ApoptosisEffect ofAreca atechu1. Chloroform Fraction on T47Dcells,proceeding of Molecular Targeted Therapy Simposium.Yogyakarta;2008.
VOLUME II NO.2.
DESEMBER
2010
Reynolds and Maurer. Evaluating Response to Antineoplastic Drug Combination in Tissue Culture Models in Methods in Molecular Medicine, vol. TotowaNJ:HumanaPress incorporation;2005 Sulistijawati RS, Husodoputro HK, RiantoBUD.Diagnostictestof mammography in apalpable mass of the breast. Berkala Ilmu Kedokteran. 2008; 40(2): 81-88. Trankoontivakorn,Gassinee, Nakahara K, Shinmoto H, Takenaka M, Kameyama MO, Ono H, Yoshida M, Nagata T, and Tsushida T. Structural Analysis of a Novel Antimutagenic Activity of Flavonoids in Thai Spice, Fingerroot (Boesenbergia pandurata Schult.) Against MutagenicHeterocyclicAmines, J. Agric. Food, Chem. 2001;49(6):30463050. Tyagi,AK,Agarwal C, Chan DCF andAgarwal R. Synergistic Anti Cancer Effects of Silibinin with Conventional Cytotoxic Agents Doxorubicin, Cisplatin and Carboplatin against Human Breast Carcinoma MCF-7 and MDA-MB468 Cells, OncologyReports.2004;II :493-499 Tomoka T. Kyoko T, Yoriko V, Takahisa M, Takashi I, Stephen S, Yasushi F, and JunichiA. Taurineprevents the ischemiainduced apoptosis in cultured neonatal rat cardiomyocytes through Akt/ caspase-9 pathway. Biochem. biophys. res. Commun.2004;316(2):484-489. VedaJY,TezukaY,BanskotaAH,TranQL,Tran QK, Harimaya Y. Saiki I. and Kadota S. Antiproliferative Activity of Vietnamese Medicinal Plants. Bioi. Pharm. Bull. 2002;25 (6):753-760. Yun 1M, Kweon MH, Kwon HJ, Hwang JK, and Mukhtar H. Induction of Apoptosis and Cell Cycle Arrest by a Chalcone Panduratin A Isolatedfrom Kaempferia pandurata in Androgen-Independent Human Prostate Cancer Cells PC3 and DUI45. Carcinogenesis Advance Access.2006;27(7):1454-1464.
21
