UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biochemických věd

VLIV DIKROCELIÓZY NA BIOTRANSFORMACI ANTHELMINTIK U MUFLONA Rigorózní práce

Vedoucí rigorózní práce: Ing. Barbora Szotáková, Ph.D.

Mgr. Veronika Srpová Hradec Králové, 2007

2

Na tomto místě bych ráda poděkovala vedoucí mé rigorózní práce Ing. Barboře Szotákové, Ph.D. za pomoc při získávání potřebných dat a při jejich zpracování, za cenné rady a připomínky k této rigorózní práci. Dále děkuji Doc. RNDr. Jiřímu Lamkovi, CSc. za obstarání biologického materiálu. Mé díky patří také Ing. Vladimíru Kubíčkovi, CSc a Ivanu Vokřálovi za provedení HPLC analýzy. V neposlední řadě děkuji PharmDr. Marii Urbánkové za její spolupráci a všem zaměstnancům katedry biochemických věd za jejich ochotu poradit a pomoci. Za finanční podporu děkuji Grantové agentuře České republiky, která udělila projektu „Dikrocelióza hospodářských zvířat – obranné mechanismy motolice před účinky anthelmintik“ grant (524/07/0611).

3

OBSAH ABSTRAKT ..................................................................................................................... 6 ABSTRACT...................................................................................................................... 7 1 ÚVOD ......................................................................................................................... 8 2 TEORETICKÁ ČÁST .............................................................................................. 10 2.1 Muflon................................................................................................................. 10 2.2 Dikrocelióza ........................................................................................................ 13 2.2.1 Původce onemocnění .................................................................................... 13 2.2.2 Epidemiologie a prevalence .......................................................................... 16 2.2.3 Symptomatologie .......................................................................................... 17 2.2.4 Diagnostika ................................................................................................... 17 2.2.5 Profylaxe a léčba ........................................................................................... 18 2.3 Anthelmintika...................................................................................................... 18 2.3.1 Antinematodika ............................................................................................. 20 2.3.2 Antitrematodika ............................................................................................ 21 2.3.3 Anticestodika ................................................................................................ 21 2.3.4 Benzimidazolová anthelmintika ................................................................... 23 2.3.4.1

Zástupci benzimidazolů ....................................................................... 23

2.3.4.2

Indikace ................................................................................................ 25

2.3.4.3

Dávkování ............................................................................................ 26

2.3.4.4

Mechanismus účinku ........................................................................... 27

2.3.4.5

Neţádoucí účinky ................................................................................ 27

2.3.4.6

Chemická struktura .............................................................................. 27

2.3.4.7

Albendazol ........................................................................................... 30

2.3.4.8

Flubendazol .......................................................................................... 32

2.4 Biotransformace xenobiotik ................................................................................ 34 2.4.1 Fáze biotransformace .................................................................................... 35 2.4.2 Biotransformace u helmintů.......................................................................... 37 2.4.3 Místa biotransformace .................................................................................. 37

4 2.5 Biotransformační enzymy ................................................................................... 38 2.5.1 Oxidační enzymy .......................................................................................... 38 2.5.1.1

Cytochromy P450 ................................................................................ 39

2.5.1.2

Flavinové monooxygenázy .................................................................. 43

2.5.2 Redukční enzymy ......................................................................................... 45 2.5.2.1

Redukce karbonylové skupiny ............................................................. 46

2.5.3 Hydrolytické enzymy .................................................................................... 48 2.5.4 Konjugační enzymy ...................................................................................... 48 2.5.4.1

UDP-glukuronosyltransferáza ............................................................. 49

2.5.4.2

Glutathion-S-transferáza ...................................................................... 50

2.5.4.3

Sulfotransferáza ................................................................................... 51

2.5.4.4

N-acetyltransferáza .............................................................................. 52

2.5.4.5

N-,O-,S-methyltransferáza ................................................................... 52

2.5.4.6

Konjugace s aminokyselinami nebo cukry .......................................... 53

2.6 Faktory ovlivňující aktivitu biotransformačních enzymů ................................... 54 2.6.1 Mezidruhové rozdíly ..................................................................................... 54 2.6.2 Genetické faktory .......................................................................................... 55 2.6.3 Pohlaví .......................................................................................................... 56 2.6.4 Věk ................................................................................................................ 56 2.6.5 Patologický stav ............................................................................................ 57 2.6.6 Výţiva ........................................................................................................... 57 2.6.7 Enzymová indukce ........................................................................................ 58 2.6.8 Enzymová inhibice ....................................................................................... 59 3 CÍL PRÁCE .............................................................................................................. 61 4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST .................................................................................... 62 4.1 Uţitý materiál ...................................................................................................... 62 4.1.1 Biologický materiál....................................................................................... 62 4.1.2 Pomůcky a přístroje ...................................................................................... 63 4.1.3 Chemikálie .................................................................................................... 63 4.2 Metodika práce .................................................................................................... 64 4.2.1 Příprava subcelulárních frakcí ...................................................................... 64 4.2.2 Stanovení koncentrace bílkovin s vyuţitím BCA ......................................... 65 4.2.3 Inkubace subcelulárních frakcí se sledovanými anthelmintiky .................... 67

5 4.2.4 HPLC analýza anthelmintik a jejich metabolitů ........................................... 71 4.2.4.1

Achirální HPLC ................................................................................... 71

4.2.4.2

Chirální HPLC ..................................................................................... 73

4.2.5 Statistické zhodnocení výsledků ................................................................... 74 5 VÝSLEDKY ............................................................................................................. 75 5.1 Stanovení koncentrace bílkovin .......................................................................... 75 5.2 Biotransformace anthelmintik ............................................................................. 78 5.2.1 Biotransformace albendazolu v mikrosomech .............................................. 78 5.2.2 Biotransformace albendazolsulfoxidu v mikrosomech................................. 82 5.2.3 Biotransformace albendazolu a albendazolsulfoxidu v cytosolu .................. 85 5.2.4 Biotransformace flubendazolu v mikrosomech ............................................ 86 5.2.5 Biotransformace flubendazolu v cytosolu .................................................... 87 5.3 Stanovení kinetických parametrů – max. rychlosti a Michaelisovy konstanty ... 90 5.3.1 Zdánlivé kinet. parametry biotransformace albendazolu v mikrosomech .... 91 5.3.2 Zdánlivé kinet. parametry biotransformace albendazolsulfoxidu v mikrosomech .......................................................................................................... 94 5.3.3 Zdánlivé kinet. parametry biotransformace albendazolu a albendazolsulfoxidu v cytosolu ...................................................................................... 95 5.3.4 Zdánlivé kinet. parametry biotransformace flubendazolu v mikrosomech .. 95 5.3.5 Zdánlivé kinet. parametry biotransformace flubendazolu v cytosolu........... 97 5.4 Stanovení stereospecifity biotransformačních reakcí ......................................... 98 5.4.1 Stereospecifita S-oxidace albendazolu ......................................................... 98 5.4.2 Stereospecifita redukce flubendazolu ......................................................... 100 6 DISKUZE ............................................................................................................... 101 7 ZÁVĚR ................................................................................................................... 108 SEZNAM POUŢITÝCH ZKRATEK ........................................................................... 110 POUŢITÁ LITERATURA ........................................................................................... 112

6

ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Vědní obor: Patobiochemie a xenobiochemie Titul, jméno, příjmení kandidáta: Mgr. Veronika Srpová Titul, jméno, příjmení konzultanta: Ing. Barbora Szotáková, Ph.D. Název rigorózní práce:

Vliv dikroceliózy na biotransformaci anthelmintik u muflona Parazitární infekce mohou měnit schopnost hostitelského organismu metabolizovat léčiva a jiná xenobiotika ovlivněním biotransformačních enzymů. Tyto změny mohou mít různé farmakologické, toxikologické a fyziologické důsledky. V naší studii byl sledován in vitro metabolismus albendazolu, albendazolsulfoxidu a flubendazolu u muflona. Biotransformace těchto benzimidazolových anthelmintik byla srovnávána ve skupině zdravých muflonů a muflonů infikovaných motolicí kopinatou (Dicrocoelium dendriticum). Pro experiment byly vyuţity dvě skupiny 5-7 let starých samic muflona (Ovis musimon), v první skupině byla zvířata parazitologicky negativní, druhou skupinu tvořila zvířata s dikroceliózou. Z jaterního homogenátu zdravých i nemocných muflonek byly izolovány subcelulární frakce. Mikrosomální a cytosolické frakce byly inkubovány s albendazolem, albendazolsulfoxidem nebo flubendazolem. Parentní látky a jejich metabolity byly analyzovány metodou HPLC. Byly zjišťovány zdánlivé kinetické parametry biotransformačních reakcí (Vmax a Km). Koncentrace bílkovin v cytosolických frakcích byla vyšší u zdravých muflonek neţ u muflonek infikovaných motolicí kopinatou. V mikrosomálních frakcích obou skupin zvířat byl albendazol metabolizován dvoustupňovou S-oxidací, při níţ je tvořen nejprve albendazolsulfoxid a následně albendazolsulfon. Albendazolsulfoxid byl v mikrosomech konvertován na albendazolsulfon. V cytosolických frakcích nebyl albendazol oxidován, jeho metabolity nebyly detekovány. Ani v mikrosomálních ani v cytosolických frakcích nebyl albendazolsulfoxid zpětně redukován na albendazol. Flubendazol byl v mikrosomech i v cytosolu zdravých i nemocných muflonek metabolizován pouze cestou redukce karbonylové skupiny, hydrolyzovaný metabolit flubendazolu nebyl tvořen. Onemocnění dikroceliózou zvýšilo tvorbu jak albendazolsulfoxidu tak albendazolsulfonu. Afinita biotransformačních enzymů k albendazolu byla významně vyšší u nemocných muflonek neţ u zdravých. Zdánlivá Km redukce flubendazolu v mikrosomech byla také ovlivněna dikroceliózou. Afinita reduktáz k flubendazolu byla vyšší u zdravých muflonek neţ u muflonek s dikroceliózou. Stereospecifita oxidace albendazolu na enantiomery albendazolsulfoxidu u muflonek byla také dikroceliózou ovlivněna, dikrocelióza ještě zvýšila tvorbu (+)-ABZSO. Redukce flubendazolu u muflonek je výrazně stereospecifická a dikroceliózou ovlivněna není, u zdravých i nemocných muflonek byl tvořen jen (+)-FLU-R. Dikrocelióza u starých muflonek způsobila jen mírné změny v jaterní biotransformaci albendazolu, albendazolsulfoxidu a flubendazolu. Proto se neočekává ţádné neţádoucí ovlivnění farmakokinetiky zmiňovaných anthelmintik v důsledku infekce motolicí kopinatou.

7

ABSTRACT Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Field: Patobiochemistry and Xenobiochemistry Candidate: Mgr. Veronika Srpová Consultant: Ing. Barbora Szotáková, Ph.D. Title:

The effect of dicrocoeliosis on biotransformation of anthelmintics in mouflon Parasitic infections can modify the host´s ability to metabolize drugs and other xenobiotics by altering the biotransformation enzymes. These changes may have various pharmacological, toxicological or physiological consequences. In our study, in vitro metabolism of albendazole, albendazole sulfoxide and flubendazole was tested and compared in non-infected mouflons and in mouflons infected by lancet fluke (Dicrocoelium dendriticum). Two groups of 5-7 years old mouflon ewes (Ovis musimon) were used for our study. Animals in the first group were parasitologically negative and the second group consisted of fluke positive animals. Subcellular fractions of liver homogenates from non-infected and Dicrocoelium-infected mouflons were isolated. The hepatic microsomal and cytosolic fractions were incubated with albendazole, albendazole sulfoxide or flubendazole. The anthelmintics and their metabolites were analyzed using HPLC. Apparent kinetic parameters (Vmax and Km) of biotransformation reactions were investigated and compared in non-infected mouflons and in Dicrocoelium-infected mouflons. Protein concentrations in cytosolic fractions were higher in non-infected mouflons than in Dicrocoelium-infected mouflons. In microsomal fractions of both non-infected and infected mouflons, albendazole was metabolized through two-step S-oxidation yielding first albendazole sulfoxide followed by albendazole sulfone. Albendazole sulfoxide was converted to albendazole sulfone in microsomes. In cytosolic fractions albendazole was not oxidized. Either in microsomal or in cytosolic fractions, albendazole sulfoxide was not reduced to albendazole. In microsomal and cytosolic fractions of both non-infected and infected mouflons, flubendazole was metabolized only through reduction of carbonyl group, hydrolyzed metabolite of flubendazole was not formed. Dicrocoeliosis enhanced the formation of either albendazole sulfoxide or albendazole sulfone. Affinity of biotransformation enzymes for albendazole was significantly higher in Dicrocoelium-infected mouflons than in non-infected mouflons. Apparent Km for flubendazole reduction in microsomes was also influenced by dicrocoeliosis. Affinity of reductases for flubendazole was higher in non-infected mouflons than mouflons with dicrocoeliosis. Stereospecificity of albendazole oxidation was also affected by dicrocoeliosis. Dicrocoeliosis in mouflon increased (+)-ABZSO formation. Reduction of flubendazole is highly stereospecific in mouflon and it is not affected by dicrocoeliosis, only (+)-FLU-R was formed in both non-infected and infected mouflons. In conclusion, dicrocoeliosis in mouflons caused only mild changes in albendazole, albendazole sulfoxide and flubendazole hepatic biotransformation. Undesirable alterations in pharmacokinetics of mentioned benzimidazole anthelmintics are not expected.

8

1 ÚVOD Helmintózy jsou infekční choroby vyvolané mnohobuněčnými ţivočichy, pro něţ se vţilo označení červi. Většina helmintů patří mezi endoparazity, jejichţ konečnými hostiteli jsou člověk i různá zvířata, podle konkrétního parazitického druhu. Mnohé helmintózy jsou i zoonózami, jsou aktuální u všech obratlovců, včetně hospodářských zvířat (Lamka et Ducháček, 1998). Helmintózy představují jednu z nejrozšířenějších příčin ohroţení zdravotního stavu hospodářských, domácích i volně ţijících zvířat. Chovatelům hospodářských zvířat působí tyto nemoci značné ekonomické ztráty, samotným zvířatům pak velké zdravotní problémy a předčasnou smrt. Účinná léčba helmintóz můţe být někdy obtíţná, v závislosti na ţivotním cyklu parazita. Prevence a léčba helmintóz zvířat zahrnuje kombinaci zoohygienických opatření a vyuţívání velké skupiny různorodých léčiv s anthelmintickými účinky. Ačkoliv uplatnění v terapii helmintóz nacházejí i léčiva biosyntetického a přírodního původu, většina uţívaných anthelmintik je syntetického původu. Nejrozšířenější helmintózy jsou působeny třemi třídami červů (tasemnicemi – Cestoda, motolicemi – Trematoda a hlísticemi – Nematoda). Podobně jako helminti jsou dělena také anthelmintika. Podle anthelmintické účinnosti léčiv vůči parazitickým červům jednotlivých tříd rozlišujeme anticestodika, antitrematodika a antinematodika. Mnohá anthelmintika mohou mít současně účinky proti více třídám červů, dokonce i proti původcům zevních parazitóz (Lamka et Ducháček, 1998). Předmětem studia této práce je dikrocelióza a její vliv na biotransformaci benzimidazolových anthelmintik u muflona. Muflon (Ovis musimon) byl původně klasifikován jako spárkatá lovná zvěř, dnes se stal (zejména ve střední Evropě) důleţitým hospodářským ţivočišným druhem, chovaným pro maso. Mufloni jsou velmi náchylní k různým parazitózám, proto jsou jejich chovy často léčeny anthelmintiky. Vzhledem k velkému počtu helmintů, které mohou infikovat muflona, je vhodné uţít anthelmintika účinná proti širokému spektru helmintů. Velmi často jsou podávána právě benzimidazolová anthelmintika (např. albendazol). Tato léčiva podléhají po podání velmi rychle biotransformaci, jejich metabolity mohou přispívat k anthelmintickému účinku parentní účinné látky (např. albendazolsulfoxid).

9 U některých ţivočišných druhů (včetně muflona) byl prokázán významný vliv benzimidazolových anthelmintik na aktivitu biotransformačních enzymů (Velík et al., 2004; Baliharová et al., 2003a,b). Při zvýšeném kontaktu s xenobiotiky se organismus brání chemickému stresu zvýšením aktivity (exprese) biotransformačních enzymů. V případě léčby helmintóz se indukcí biotransformačních enzymů hostitele sniţují plazmatické hladiny podávaných anthelmintik, coţ můţe vést k selhání farmakoterapie. Sníţení plazmatické hladiny účinné látky zvyšuje šanci parazitů přeţít aplikaci léčiva. Tím indukce biotransformačních enzymů hostitele můţe nepřímo přispívat k rozvoji lékové rezistence parazitů. Parazitární choroby hospodářských zvířat jsou neustále v popředí zájmu odborné veřejnosti. Důvodem je celosvětová prevalence těchto onemocnění, silně negativní hospodářský dopad na produkční úroveň postiţených chovů, omezené spektrum prostředků vyuţitelných k prevenci a léčbě. Stále větším celosvětovým problémem se stává rezistence červů parazitujících v hospodářských zvířatech na dostupná anthelmintika. Muflon je pro člověka zdrojem masa, také pro jeho bezpečnou spotřebu je důleţité detailně znát biotransformaci podávaných anthelmintik v cílovém species. Tato práce by mohla přispět k objasnění biotransformace benzimidazolových anthelmintik u muflona. Hlavním záměrem našeho experimentu bylo srovnání biotransformace albendazolu a flubendazolu u zdravých a dikroceliózou postiţených samic muflona. Cílem bylo zjistit, zda je přeměna zmiňovaných anthelmintik ovlivněna samotným onemocněním, zda dikrocelióza moduluje aktivitu biotransformačních enzymů katalyzujících přeměnu benzimidazolových anthelmintik. Tato práce studuje in vitro přeměnu albendazolu a flubendazolu v cytosolické a mikrosomální frakci jaterní tkáně jednak zdravých muflonek a jednak muflonek s dikroceliózou.

10

2 TEORETICKÁ ČÁST 2.1 MUFLON Muflon (Ovis musimon) (obr. 1) bývá někdy povaţován za samostatný druh, jindy pouze za poddruh ovce divoké (Ovis ammon musimon). Donedávna se obecně soudilo, ţe pochází z Korsiky, Sardinie a Kypru a ţe v určitém období čtvrtohor obýval dokonce celou Evropu. Nové zoologické výzkumy však dokazují, ţe muflon je nejspíš zdivočelou formou domácích ovcí z Malé Asie, které se do Středozemí dostaly ve starověku, a ţe archeologické nálezy kostí patří domestifikovaným ovcím. Ať je však původ muflonů jakýkoliv, dnes je to oblíbená lovná srstnatá zvěř, která se vyskytuje ostrůvkovitě na mnoha místech Evropy (Červený et al., 2004). Na území ČR se muflon dostal poprvé do oborního chovu v 19. století (Hluboká nad Vltavou, Ţinkovy v Čechách). V Pozořicích u Brna byli mufloni vysazeni do volnosti, v letech 1935-1937 také na Křivoklátsku (Komárek, 1948). V současné době je muflon jiţ běţnou zvěří nejen v oborách, ale v mnoha oblastech i ve volné přírodě. Obývá hlavně kamenité terény listnatých a smíšených lesů pahorkatin, má rád suché a skalnaté svahy, ale přizpůsobí se i jinému prostředí. Daří se mu i ve vlhčích oblastech s měkkou půdou. Muflon nemá rád pouze vysokou sněhovou pokrývku (Červený et al., 2004).

Obrázek 1. Muflon - samec a samice (www.priroda.cz/clanky/foto/mufloni.jpg).

11 Tvarem těla a postavou se muflon podobá ovcím domácím, s nimiţ se také můţe velmi lehce kříţit. Délka těla dosahuje aţ 130 cm, ocas měří okolo 10 cm a výška v kohoutku je 90 cm. Muflon váţí 25-45 kg, samice je výrazně menší, váţí 20-28 kg. Mufloni se mohou doţít aţ patnácti let, průměrný věk je však mnohem niţší. Rezavohnědý muflon má na spodní části krku černou hřívu (rouno) a na bocích těla velké bílé skvrny (sedlo či čabraka). Samice jsou ţlutohnědé, v zimě rezavošedé, bez sedla a bez rouna. Spodek těla muflona je bělavý a slechy krátké. Čím je jedinec starší, tím má světlejší hlavu, protoţe světlá lícní maska se stářím zvětšuje. Letní srst je krátká, na zimu srst muflonům zhoustne a ztmavne. Samec muflona nosí mohutné, do kruhu zatočené vrubované rohy (toulce), muflonka je bezrohá, vzácně má malé zakrnělé toulečky. Muflončeti začínají toulce růst uţ ve dvou měsících ţivota, délkový přírůst je největší v prvním a druhém roce ţivota. Toulec přirůstá po celý rok (nepočítaje zimní měsíce), čímţ na něm vznikají roční vruby, podle kterých lze určit stáří zvířete. Mufloní zvěř ţije od jara do podzimu v tlupách, a to odděleně podle pohlaví. V mateřských tlupách se však někdy vyskytují i mladí mufloni. Starší mufloni tvoří samostatné menší skupinky nebo ţijí kromě doby říje zcela samotářsky. V době říje se připojují samci k tlupám muflonek, také v zimě jsou často obě pohlaví pohromadě. Pokud tlupa přechází, vede ji zpravidla nejzkušenější a nejopatrnější muflonka, v případě nebezpečí varuje ostatní členy tlupy hvízdnutím. Normální dorozumívací hlas je u muflonů (stejně jako u ovcí) bečení (Kolda et al., 2004) Říje u muflona probíhá od října do listopadu a samci při ní svádějí urputné souboje o ovládnutí samic v tlupě. Po 22 týdnech březosti se muflonka na čas z tlupy oddělí a v úkrytu porodí jedno aţ dvě jehňata. Mláďata ihned po oschnutí následují matku. Zelenou potravu začínají přijímat za dva týdny, mateřské mléko sají asi půl roku. Dospělým se stává mufloní jedinec po osmnácti měsících. Mladí berani se aktivně zapojují do reprodukce aţ ve třech letech (Červený et al., 2004). Potrava mufloní zvěře zahrnuje nejrůznější druhy bylin, traviny, zemědělské plodiny či listy, výhonky, plody a kůry lesních dřevin. Vegetaci spásají mufloni těsně u země. Nejaktivnější jsou mufloni za šera, mají výborný zrak, dobře běhají, obratně skáčou, ale voda je pro ně velkou překáţkou. Muflon má stanovenou dobu lovu od 1. srpna do 31. prosince, podle legislativy ochrany přírody a krajiny není zvláště chráněn (Červený et al., 2004). V ČR patří mufloní zvěř k lovné zvěři, jejíţ trofeje jsou velmi hledané a ţádané.

12 Srstnatou zvěř (a tedy i muflona) mohou postihnout některá virová, bakteriální nebo parazitární onemocnění. Nejvíce se u mufloní zvěře vyskytují některé endoparazitózy

(muellerióza,

trichostrongylóza,

dikrocelióza,

fasciolóza)

a

ektoparazitózy. Kromě všeobecného zeslabení, někdy i malátnosti a celkového postoje typického pro nemocného jedince, se projevují některá onemocnění typickými příznaky:  Kokcidióza – nechutenství, silná vyhublost, průjmy, krvavé, pošpiněné zadní běhy, v trusu viditelné kousky potrhané sliznice střev  Fasciolóza – těţké záněty jater, vlivem nedostatečné činnosti jater špatné trávení, ztráta hmotnosti, aţ úhyn zvířete  Dikrocelióza – mufloní zvěř hubne a slábne, na hrudi a pod hrudí se objevují otoky, napadená játra jsou zvětšená, ţlučovody rozšířené, zeslabení aţ úhyn zvířete  Muellerióza – napadení plicnivkami se projevuje kašlem a značnými dýchacími potíţemi, suché kašlání můţe přecházet aţ do křečovitých záchvatů, zvěři vytéká z větrníků hustý hlen, někdy aţ smrt udušením  Střečkovitost – klinické příznaky jsou dosti zjevné, zvěř je shrbená, špatně lehá i vstává, má zjeţenou srst (Lochman, 1983) Zajišťování dobrého zdravotního stavu zvěře, veterinární prevence a léčba patří k základním úkolům péče o zvěř. U spárkaté zvěře způsobují největší přímé i nepřímé ztráty parazitární onemocnění (cizopasní červi gastrointestinálního traktu a plic, střečkovitost, ektoparazité). Systematickému tlumení těchto chorob je v ČR tradičně věnována značná pozornost jiţ od počátku 70. let. Podávání vysoce účinných léčiv, postupná likvidace přírodních ohnisek parazitóz a další veterinární i chovatelská opatření se projevila v mnoha lokalitách sníţením intenzity i extenzity výskytu parazitóz i celkovým zlepšováním nejen zdravotního stavu, ale i kondice spárkaté zvěře. Zejména cílevědomé plošné tlumení parazitárních onemocnění v rámci okresů i rozsáhlých honebních celků se ukázalo jako vysoce účinné a úspěšné. Na praktickém zajišťování antiparazitárních akcí se podílejí veterinární lékaři, myslivečtí a další odborníci a v terénních podmínkách jednotlivých honiteb řadoví myslivci, zaměstnanci profesních lesnických a mysliveckých organizací. Nedílnou součástí úspěšné prevence parazitárních chorob je dodrţování hygienických podmínek aplikace léčiv, čištění krmných zařízení, mechanické odstraňování trusu po odčervení, dezinfekce okolí krmelců, likvidace mezihostitelů (Ševčík, 2000).

13

2.2 DIKROCELIÓZA 2.2.1 Původce onemocnění Původcem dikroceliózy je motolice kopinatá Dicrocoelium dendriticum RUDOLPHI, 1819 (syn.: Dicrocoelium lanceolatum), nazývaná téţ „malá jaterní motolice“. Systematické zařazení motolice kopinaté je patrné z tabulky 1, patří mezi Trematoda, čeleď Dicroceliidae (Buchar et al., 1995). Tabulka 1. Systematické členění nejvýznamnějších parazitických zástupců helmintů (Buchta et al., 1998; Kořínková, 2006). Scolecida (červi) kmen: Acanthocephales (vrtejši) kmen: Plathelminthes (ploštěnci) třída: Trematoda (motolice) Fasciola, Fasciolopsis, Dicrocoelium, Clonorchis, Opisthorchis, Schistosoma třída: Cestoda (tasemnice) Taenia, Hymenolepis, Echinococcus, Diphyllobothrium kmen: Nemathelminthes (oblovci, oblí červi) třída: Nematoda (hlístice) Ancylostoma,

Necator,

Strongyloides,

Ascaris,

Enterobius,

Toxocara, Wuchereria, Dranunculus, Onchocerca, Trichuris, Trichinella Motolice (Trematoda) zahrnují přes 4000 druhů rozšířených po celém světě. Většinou jde o endoparazity obratlovců, které přednostně napadají orgány trávicí soustavy, ale také plíce či krevní cesty (Buchta et al., 1998). Velikost motolic se pohybuje od 0,1 do 10 cm, tvar těla je většinou zploštělý, kopinatý, v přední polovině těla jsou motolice vybaveny zpravidla dvěma nepárovými přísavkami (ústní a břišní) (Hanzák et al., 1973). Aţ na výjimky (krevničky) se jedná o hermafrodity s komplexním ţivotním cyklem. Během svého vývoje procházejí larválními stádii a vystřídají alespoň dva hostitele (Buchta et al., 1998).

14 Motolice kopinatá (obr. 2) má listovitý tvar, tělo je ploché, průsvitné, dosahuje délky 5-15 mm. Břišní přísavka se nachází v přední polovině těla, za ní jsou umístěna kulovitá, lehce laločnatá varlata. Vaječník je situován v zadní části těla. Střed těla je vyplněn stromkovitě větvenou dělohou. Vajíčka (obr. 3) jsou nesouměrně oválná (měří 38-45 x 22-30 µm), hnědavé barvy, mají víčko, vylučují se rozrýhovaná (Jíra, 1998).

Obrázek 2. Motolice kopinatá, dospělý jedinec (http://www.cvm.okstate.edu).

Obrázek 3. Vajíčko motolice kopinaté (http://www.cdfound.to.it/HTML/dicr2.htm).

15 Motolice kopinatá se vyskytuje kosmopolitně, cizopasí ve ţlučových cestách v játrech býloţravých savců, zvláště ovcí, ale i skotu, koz a spárkaté zvěře. Neušetří však ani psy a kočky, dikrocelióza byla popsána vzácně i u člověka (Hanzák et al, 1973). Motolice kopinatá má velice sloţitý vývojový cyklus, trixenní (tříhostitelský), probíhající přes dva mezihostitele. Trvá přibliţně 6 měsíců. Cyklus je schématicky znázorněn na obrázku 4. Dospělí jedinci (1) se nacházejí ve ţlučových cestách definitivního hostitele, jsou hermafroditní, mají samčí i samičí pohlavní orgány, produkují oplozená vajíčka. Vajíčka (2) se dostávají ţlučovody do střeva a s výkaly do vnějšího prostředí. Vajíčko obsahuje miracidium, pro další vývoj musí být pozřeno prvním mezihostitelem, suchozemským plţem (nejčastěji zástupci rodů Zebrina, Helicella, Theba) (3). Miracidia migrují do hepatopankreatu plţe, ze zárodečných buněk se tvoří četné sporocysty první a druhé generace. Z druhé generace sporocyst se formuje řada pohyblivých cerkárií (cercaria vitrina) (4), které migrují do dýchací dutiny plţe. Zde dráţdí plicní tkáň, coţ stimuluje produkci hlenu v plicích. Cerkárie jsou slizovitým sekretem obaleny (4.1, 4.2) a vytlačeny dýchacím otvorem ven. Tyto slizové koule ulpívají na vegetaci, hlen představuje ochranu cerkárií před vysušením. Vývojová fáze v plţi trvá 3-5 měsíců, pro zrání sporocyst je potřeba teplota vyšší neţ 4ºC. Cerkárie ve slizovém obalu jsou pozřeny druhým mezihostitelem, mravencem rodu Formica (5). Cerkárie se vyvíjejí v metacerkárie, které se usidlují v různých částech těla mravence, některá se zpravidla lokalizuje v subesofageálním nervovém gangliu, kde encystuje (6). To ovlivňuje nervovou soustavu mravence a způsobuje, ţe se mravenec při poklesu teploty pod 15ºC nevrací zpět do mraveniště, ale následkem kataleptické křeče a paralýzy mandibul zůstává kusadly přichycen na vrcholcích rostlin. Zvyšuje se tak pravděpodobnost, ţe bude infikovaný mravenec pozřen pasoucím se definitivním hostitelem. Působením trávicích enzymů v duodenu hostitele metacerkárie excystuje a migruje ţlučovými cestami do jater. Zde dozrává v dospělého jedince a ţivotní cyklus motolice kopinaté se opakuje (Kořínková, 2006; Jíra, 1998).

16

Obrázek 4. Ţivotní cyklus motolice kopinaté (http://www.paru.cas.cz).

2.2.2 Epidemiologie a prevalence Výskyt nákazy člověka je sporadický. Člověk se infikuje náhodně při pozření mravence na vegetaci nebo na různých plodech. Nálezy jsou známy z Ruska, Francie, Španělska, Itálie, dále z Íránu, Brazílie a ze Zairu. V nemocnici v Rijádu (Saudská Arábie) bylo v letech 1984-1986 zaznamenáno vylučování vajíček motolice kopinaté u 208 osob, z toho u 134 osob byly přítomny relevantní klinické příznaky (Jíra, 1998).

17 Zatímco výskyt dikroceliózy u člověka je ojedinělý, u ţivočišných hostitelů je prevalence značně vysoká. Nákaza je celosvětově rozšířena, zejména v lokalitách, které poskytují optimální podmínky pro přeţití a vývoj suchozemských měkkýšů a mravenců jako mezihostitelů. Takovými regiony jsou střední Evropa (horské pastviny Alp Švýcarsko, jiţní Německo, Rakousko), Skandinávie, ale také severní Afrika, severní Amerika a Asie (http://www.infektionsbiologie.ch/parasitologie). V České republice se dikrocelióza vyskytuje především ve středních a jiţních Čechách a na jiţní Moravě (Ducháček et Lamka, 2003).

2.2.3 Symptomatologie Nemoc probíhá ve dvou fázích. V duodenu definitivního hostitele se uvolňují metacerkárie. V invazivní fázi migrují motolice jaterním parenchymem, v biliární fázi se usazují ve ţlučových cestách. Klinická manifestace u člověka bývá mírná vzhledem k náhodné nákaze a zpravidla malému počtu parazitů. K hlavním příznakům patří gastrointestinální dyskomfort, flatulence, zvracení, průjem či zácpa, ţlučové koliky (Jíra, 1998). U nemocných zvířat byla zaznamenána ztráta či změna důleţitých biomolekul, např. plazmatických proteinů. Bylo zjištěno, ţe zátěţ do 4 000 jedinců motolice kopinaté nezpůsobuje u ovcí signifikantní ztrátu plazmatických bílkovin. Klinické symptomy nejsou obvykle zjevné, dokud není onemocnění v těţkém stádiu. Na postiţení dikroceliózou ukazuje anémie, edém, vyhublost, v pokročilém stádiu i cirhóza jater, zjizvení jejich povrchu nebo zřetelné rozšíření ţlučovodů (Kuběnová, 2006).

2.2.4 Diagnostika Dikrocelióza zůstává často neodhalena a nerozpoznána pro její subklinický charakter. Nejběţněji pouţívanou technikou pro její diagnózu je koprologická zkouška. Stanovení diagnózy se opírá o mikroskopický nález vajíček motolice kopinaté ve stolici či v duodenální tekutině. Je třeba rozlišit nepravou nákazu, která se objevuje po poţití zvířecích tkání infikovaných motolicemi. V tomto případě vajíčka procházejí trávicím ústrojím beze změny jako tzv. tranzitní vajíčka (Jíra, 1998). Negativní koprologický nález však zcela nevylučuje dikroceliózu. Dospělí helminti bývají odhaleni v játrech při jejich nekropsii.

18 V posledních

letech

jsou

vyvíjeny

imunodiagnostické

metody

(imunofluorescence, precipitace, pasivní hemoaglutinační test, komplementární fixace, ELISA) jako alternativa ke koprologickým zkouškám a postmortální prohlídce jater. Výsledky však zatím nejsou optimální a spolehlivé, k čemuţ můţe přispívat relativně vysoká variabilita genomu motolic kopinatých (Kuběnová, 2006).

2.2.5 Profylaxe a léčba Za posledních 50 let byla prostudována řada aspektů dikroceliózy (etiologie, ţivotní cyklus motolice kopinaté, epidemiologie, patogeneze), ale její diagnóza a léčba dosud zůstávají diskutovaným a neuzavřeným tématem. Jak jiţ bylo zmíněno, dikrocelióza často zůstává nerozpoznána. Profylaxe tohoto parazitárního onemocnění je sloţitá a zatím na neuspokojivé úrovni vzhledem ke sloţitosti ţivotního cyklu motolice kopinaté a epidemiologii. Spousta anthelmintik je proti dikrocelióze prakticky neúčinná, jsou-li léčiva podána v dávkách doporučených při nákaze jinými gastrointestinálními či plicními helminty, a to z důvodu špatné dostupnosti motolic ve ţlučových cestách. Profylaxe v endemických oblastech je zaloţena na léčbě všech zvířat přímo vystavených infekci. Doporučuje se podat účinná anthelmintika dvakrát aţ třikrát do roka (na začátku jara a na podzim před ustájením zvířat). Mezi pouţívaná léčiva patří benzimidazolová anthelmintika (albendazol, mebendazol, fenbendazol, triklabendazol, thiabendazol) a pro-benzimidazoly (thiofanát). Je nutné podat vyšší dávky zmíněných anthelmintik (Lamka et Ducháček, 1998; Otranto et Traversa, 2002).

2.3 ANTHELMINTIKA Anthelmintika jsou léčiva pouţívaná k terapii či profylaxi helmintóz. Vzhledem k tomu, ţe ještě není ve všech případech dopodrobna znám mechanismus jejich účinku, ţe chybí některé údaje z biochemie helmintů a také ţe působení léčiva na parazita v těle hostitele je ovlivňováno řadou neznámých či nehodnotitelných faktorů, je výzkum anthelmintik velmi obtíţný. Jejich výzkum je značně ztíţen tím, ţe anthelmintika zpravidla působí jinak in vitro a jinak in vivo, ţe působí většinou velmi specificky (Šimůnek, 1979).

19 Mezi anthelmintiky dnes převládají léčiva chemická, synteticky připravená, která pro své výhodné vlastnosti (stále stejná jakost, ekonomicky výhodná výroba, vhodná forma pro uchovávání i pro aplikaci) prakticky zcela vytlačila rostlinné drogy a z nich izolované účinné látky. Některé drogy jsou pouţívány dodnes jako lidové prostředky k eliminaci helmintů z organismu hostitele, jejich účinnost však zůstává daleko za účinností léčiv syntetických (Šimůnek, 1979). Anthelminticky působící rostlinné látky patří do různých chemických skupin – laktony, fenoly, ftalidy, deriváty fluoroglucinu a alkaloidy (Jíra, 1998). V tabulce 2 jsou uvedeny některé příklady drog s anthelmintickým účinkem.

Tabulka 2. Některá rostlinná anthelmintika (Jíra, 1998). Rostlinná droga Arekové semeno Semen arecae catechu

Účinná látka arekolin (alkaloid)

Merlíkové semeno, merlíkový olej Semen chenopodii, Oleum

askaridol (terpenický endoperoxid)

chenopodii Kapraďový oddenek Radix filicis maris Květ koso Flos koso Kamala Camalla Cicvárový květ Flos Cinae

filixová kyselina (der. fluoroglucinu)

kosin, protokosin (der. fluoroglucinu)

rottlerin, izorottlerin (der. fluoroglucinu) santonin (seskviterpenický lakton)

Farmakologický výzkum chemických prostředků pro léčbu helmintóz přinesl v posledních dvou desetiletích významný pokrok. Byla připravena účinná anthelmintika proti významným trematodózám, cestodózám a nematodózám, která jsou netoxická, dostatečně účinná v jednorázové dávce nebo jsou účinná proti několika druhům helmintů současně, tzv. širokospektrá anthelmintika.

20 Anthelmintika můţeme třídit podle různých hledisek. Nejstarší princip klasifikace léčiv působících na střevní helminty je rozdělení na vermicida (léčiva helminty usmrcující) a vermifuga (léčiva vyvolávající paralýzu a následující vypuzení helminta

ze

střeva).

Další

klasifikace

je

podle

taxonomických

skupin

na antitrematodika, anticestodika a antinematodika. Farmakologická klasifikace dělí anthelmintika dle mechanismu působení (Jíra, 1998).

2.3.1 Antinematodika Nematodózy jsou z hlediska druhově-parazitologického nejrozsáhlejší skupinou helmintóz postihující prakticky všechny druhy hospodářsky i nehospodářsky chovaných zvířat. Předcházení a boj proti nematodózám je v současnosti zaloţen na kombinaci zoohygienických opatření a podávání antinematod hostitelským zvířatům. Část antinematodik má kromě účinku proti hlísticím také aktivitu antitrematodní, případně anticestodní. Léčiva s účinkem proti původcům nematodóz jsou v současnosti řazena do skupin avermektinů, benzimidazolů, imidazothiazolů, organofosfátů a léčiv jiných chemických struktur (tab. 3) (Lamka et Ducháček, 1998). Tabulka 3. Antinematodika uţívaná ve veterinární medicíně (Lamka et Ducháček, 1998). Zástupci léčiv

Skupina antinematodik Avermektiny

ivermektin, moxidektin, doramektin, bulmektin tiabendazol, mebendazol, fenbendazol, albendazol,

Benzimidazoly

luxabendazol,

kambendazol, triklabendazol,

oxfendazol, oxibendazol, flubendazol, parbendazol, ciklobendazol Probenzimidazoly

febantel, netobimin, thiofanát

Imidazothiazoly

levamizol, tetramizol

Organofosfáty

metrifonát, dichlorvos

Léčiva ostatních chemických struktur

pyrantel, nitroskanát, piperazin

21

2.3.2 Antitrematodika Trematodózy představují z parazitologického hlediska velmi závaţnou skupinu helmintóz, zejména u hospodářských a volně ţijících zvířat. Boj proti trematodózám lze směřovat na potlačení dospělých (v menší míře i nedospělých) stádií v definitivním hostiteli nebo na narušení vývojových cyklů motolic ovlivněním mezihostitelských organismů (zoohygienická opatření) (Lamka et Ducháček, 1998). Přehled léčiv uţívaných v terapii či profylaxi trematodóz je uveden v tabulce 4. Tabulka 4. Antitrematodika uţívaná ve veterinární medicíně (Lamka et Ducháček, 1998). Zástupci léčiv

Skupina antitrematodik Benzimidazoly (širokospektré)

fenbendazol,

albendazol,

triklabendazol

Probenzimidazoly

febantel, netobimin, thiofanát

Halogenované salicylanilidy

klosantel, rafoxanid

Léčiva ostatních chemických struktur

klorsulon

2.3.3 Anticestodika Cestodózy jsou druhově-parazitologicky skupinou menšího rozsahu postihující především masoţravce, býloţravce, ale i ryby. Potlačování cestodóz je moţné zásahem do vývojového cyklu tasemnic v definitivním hostiteli nebo ovlivněním populací mezihostitelů (Lamka et Ducháček, 1998). Anticestodika jsou chemicky velmi různorodou skupinou léčiv (tab. 5). Tabulka 5. Anticestodika uţívaná ve veterinární medicíně (Lamka et Ducháček, 1998). Zástupci léčiv

Skupina anticestodik

mebendazol, fenbendazol, albendazol, Benzimidazoly (širokospektré)

triklabendazol,

oxfendazol,

oxibendazol, flubendazol Probenzimidazoly Léčiva ostatních chemických struktur

febantel, netobimin, thiofanát niklosamid, prazikvantel, dichlorofen, nitroskanát

22

23

2.3.4 Benzimidazolová anthelmintika Skupina

benzimidazolových

anthelmintik

je

nejrozsáhlejší

skupinou

anthelmintik odvozenou od jediné chemické struktury (obr. 5). Benzimidazol je heterocyklická aromatická organická sloučenina se sumárním vzorcem C7H6N2 (http://www.ibpassociation.org/ encyclopedia/medicine/Benzimidazole.php).

Obrázek 5. Chemická struktura benzimidazolu (http://www.ibpassociation.org/ encyclopedia/medicine/Benzimidazole.php).

2.3.4.1 Zástupci benzimidazolů Podávání benzimidazolových anthelmintik je celosvětově rozšířeno zejména ve veterinární medicíně. Benzimidazoly uţívané jako veterinaria se řadí dle ATC klasifikace do skupiny Q09AA (Veterinaria-Anthelmintika) (AISLP) a jsou indikovány u helmintóz skotu, ovcí, koz, prasat, lovné zvěře, baţantů, psů, koček, koní, drůbeţe a holubů. V terapii či profylaxi endoparazitických nákaz u zvířat se pouţívají konkrétně

tiabendazol,

mebendazol,

fenbendazol,

albendazol,

kambendazol,

triklabendazol, oxfendazol, oxibendazol, flubendazol, luxabendazol, parbendazol, ciklobendazol.

Léčiva

netobimin,

febantel

a

thiofanát

jsou

proléčiva

(probenzimidazoly), v cílovém organismu jsou konvertovány na anthelminticky účinné metabolity (Lamka et Ducháček, 1998).

24 V humánní medicíně jsou z derivátů benzimidazolu terapeuticky vyuţívány mebendazol, albendazol, tiabendazol a triklabendazol (Lincová et Farghali, 2002). Dle ATC klasifikace léčiv spadají do skupiny P02CA (Anthelmintika-AntinematodikaBenzimidazolové deriváty) (AISLP). V tabulce 6 jsou uvedeny veterinární a humánní přípravky derivátů benzimidazolu registrované v ČR v roce 2007. Tabulka 6. Preparáty benzimidazolových anthelmintik registrované v ČR (AISLP). Preparáty veterinární

Účinná látka

ALBEX® A.U.V.

albendazol

ALDIFAL® A.U.V.

albendazol

ANTIVERM® A.U.V.

mebendazol

BIHELMINTH® A.U.V.

fenbendazol (+ prazikvantel)

BIOVETA FENBENDAZOL® A.U.V.

fenbendazol

CANIQUANTEL PLUS® A.U.V.

fenbendazol (+ prazikvantel)

CANIVERM®

fenbendazol (+ prazikvantel, pyrantel)

CESTAL PLUS® A.U.V.

fenbendazol (+ prazikvantel, pyrantel)

DEHINEL PLUS® A.U.V.

febantel (+ prazikvantel, pyrantel)

DRONTAL PLUS® A.U.V.

febantel (+ prazikvantel, pyrantel)

FENBION® A.U.V.

fenbendazol

FLUBENOL® A.U.V.

flubendazol

FLUMIXAN® A.U.V.

flubendazol

HELMIGAL® A.U.V.

fenbendazol

OPTIVERMIN® A.U.V.

fenbendazol (+ prazikvantel)

PANACUR® A.U.V.

fenbendazol

POLYVERKAN® A.U.V.

oxibendazol (+ niklosamid)

PRAZINON PLUS® A.U.V.

febantel (+ prazikvantel, pyrantel)

RAFENDAZOL® A.U.V.

mebendazol

TELMIN® A.U.V.

mebendazol

VITAMINTHE ORAL® A.U.V.

oxibendazol (+ niklosamid)

ZIPYRAN PLUS® A.U.V.

febantel (+ prazikvantel, pyrantel)

Preparáty humánní

Účinná látka

VERMOX®

mebendazol

ZENTEL®

albendazol

25 2.3.4.2 Indikace Benzimidazolová

anthelmintika

jsou

léčiva

s antinematodní,

z části

i

s antitrematodní a anticestodní (výjimečně i antimykotickou či antiprotozoální) aktivitou. Některé benzimidazoly patří k anthelmintikům s vůbec nejširším spektrem účinku. Z šíře spektra jejich anthelmintického účinku plyne i jejich uţití v lidské a veterinární medicíně. Patří k hojně uţívaným antinematodikům (terapie nematodóz plic, gastrointestinálního traktu i jiných orgánů a tkání), někteří zástupci nacházejí uplatnění i v léčbě cestodóz, neurocysticerkózy vyvolané larvou tasemnice Taenia solium (albendazol) či fasciolózy a jiných trematodóz (triklabendazol, albendazol, fenbendazol) (Lamka et Ducháček, 1998; Lincová et Farghali, 2002). Většina léčiv této skupiny anthelmintik působí proti vývojovým i dospělým stádiím helmintů, některé benzimidazoly mají i ovicidní účinek (Lamka et Ducháček, 1998). Typ anthelmintického účinku jednotlivých zástupců benzimidazolových léčiv je znázorněn v tabulce 7. Tabulka 7. Přehled benzimidazolů a jejich anthelmintického účinku (Lamka et Ducháček, 1998). Účinek Benzimidazol

antinematodní

anticestodní

Účinek antitrematodní

ovicidní

tiabendazol

x

mebendazol

x

x

fenbendazol

x

x

x

x

albendazol

x

x

x

x

kambendazol

x

oxfendazol

x

x

oxibendazol

x

x

flubendazol

x

x

triklabendazol

x

x

x

febantel

x

x

x

x

netobimin

x

x

x

x

thiofanát

x

x x

x

x

26 2.3.4.3 Dávkování Anthelmintická aktivita derivátů benzimidazolu je závislá na délce přetrvávání terapeutických koncentrací v tělních tekutinách a tkáních. U monogastrických zvířat (např. pes, kočka, prase) je většinou potřeba opakované podání léčiva, u zvířat polygastrických a jiných býloţravců (např. skot, ovce, kůň) lze benzimidazolová anthelmintika podat i jednorázově. Jednotlivé terapeutické dávky jsou závislé na konkrétních látkách a způsobu jejich podání zvířatům. Pohybují se v jednotkách aţ desítkách mg/kg ţivé hmotnosti (tab. 8). Léčiva jsou zvířatům podávána individuálně nebo hromadně. Existuje řada lékových forem jednotlivých benzimidazolů (Lamka et Ducháček, 1998).

Tabulka 8. Dávky a lékové formy derivátů benzimidazolu (Lamka et Ducháček, 1998). Benzimidazolové

Terapeutická dávka

Léková

anthelmintikum

[mg/kg ž.hm.]

forma

tiabendazol

dle potřeby

mebendazol

5-50

fenbendazol

5-50

albendazol

5-10

kambendazol

15-30

TBL POR

oxfendazol

4,5-5

SUS POR, PRM, PLV POR

oxibendazol

15

PLV POR, PST POR, TBL POR

flubendazol

15-22

PLV POR, PST POR, TBL POR

triklabendazol

10-12

SUS POR, PLV POR

febantel

5-35

netobimin

7,5-12

thiofanát

5,2-67,5

SUS OTO PST POR, GRA, PRM, TBL POR TBL POR, GRA, SUS POR, PLV POR, PST POR SUS POR, SOL, TBL POR, GRA

TBL POR, GRA, PST POR SUS POR, INJ PLV POR, PRM, SUS POR, SOL

27 2.3.4.4 Mechanismus účinku Benzimidazoly mají tři typy účinku. Prvním typem je inhibice fumarátreduktázy helmintů,

čímţ

je

ovlivněna

jejich

energetická

produkce.

Druhou

formu

anthelmintického účinku derivátů benzimidazolu je inhibice transportu glukózy s následnou redukcí glykogenových rezerv parazitujících červů. Třetím mechanismem jejich působení je vazba léčiva na tubulin, protein nutný k tvorbě mikrotubulů, primárně v absorpčních buňkách parazitů. Mezi tubulinem savců a helmintů existují strukturální rozdíly, proto nedochází k toxickému působení na hostitele. Výsledkem je neschopnost absorpce ţivin, rozvrat energetického metabolismu, vyčerpání zásob energie, imobilizace a následná smrt citlivých parazitů (Jíra, 1998; AISLP: SPC Albex®).

2.3.4.5 Nežádoucí účinky Při terapii benzimidazolovými anthelmintiky se mohou vyskytnout zaţívací potíţe (např. bolest ţaludku, nauzea, zvracení, průjem). Můţe se vyskytnout i vyráţka, kopřivka a svědění (AISLP: SPC Albex®). Některé benzimidazoly mají teratogenní účinek, negativně ovlivňují vývoj raných stádií plodu (Lamka et Ducháček, 1998).

2.3.4.6 Chemická struktura Benzimidazolové jádro nabízí moţnost substituce v sedmi různých pozicích. Přítomnost malého substituentu v poloze C2 (někdy i C5) je charakteristická pro benzimidazolová anthelmintika. Objemný substituent v poloze C2 je typický pro inhibitory protonové pumpy (kód ATC: A02BC), které jsou uţívány v terapii peptických vředů. Zavedením objemných substituentů do polohy C1 a C2 byly získány H1-antihistaminika (kód ATC: R06AX) (Velík et al., 2004). Molekulární struktura jednotlivých anthelmintik ze skupiny derivátů benzimidazolu je patrná z obrázků 6, 7.

28

febantel

netobimin

thiofanát

Obrázek 6. Chemická struktura probenzimidazolů (Lamka et Ducháček, 1998).

29

Obrázek 7. Chemická struktura benzimidazolových anthelmintik (Lamka et Ducháček, 1998).

30 2.3.4.7 Albendazol Důleţitým zástupcem benzimidazolových anthelmintik je albendazol, chemicky methyl-[5-(propylsulfanyl)-1H-benzimidazol-2-yl]karbamát (ČL 2002). Sumární vzorec albendazolu je C12H15N3O2S a jeho molekulární hmotnost je Mr = 265,34 g/mol. Albendazol je bílý nebo slabě naţloutlý prášek. Je prakticky nerozpustný ve vodě, snadno

rozpustný

v bezvodé

kyselině

mravenčí,

velmi

špatně

rozpustný

v dichlormethanu, prakticky nerozpustný v lihu 96% (ČL 2002). Albendazol (ABZ) se zpočátku uplatnil ve veterinární medicíně. Působí na hlístice, tasemnice a motolice, má vermicidní, larvicidní a ovicidní účinek. U lidí se albendazol po perorálním podání špatně vstřebává (méně neţ 5%). Albendazol se rychle biotransformuje v játrech a nedá se detekovat v plazmě. Primárním metabolitem je farmakologicky aktivní albendazolsulfoxid, který je zřejmě účinnou látkou působící proti infekci ve tkáních. Plazmatický poločas albendazolsulfoxidu je T½ = 8,5 hodiny. Plazmatické koncentrace albendazolsulfoxidu dosahují po perorálním podání jedné dávky 400 mg společně s jídlem hodnot 1,6 - 6,0 µmol/l. Pokud je dávka podána společně s tučným jídlem, které zvyšuje absorpci albendazolu asi na pětinásobek, je farmakologický účinek albendazolu vyšší. Albendazolsulfoxid a jeho metabolity se vylučují převáţně ţlučí, pouze malá část se vylučuje močí (AISLP: SPC Zentel®). Biotransformace albendazolu byla studována u člověka i řady ţivočišných druhů (u potkana, myši, králíka, drůbeţe, ovce, kozy, skotu, prasete i u psa). Je známo, ţe albendazol (s atomem síry v molekule) po parenterálním, perorálním či intraruminálním podání podléhá v organismu dvoustupňové S-oxidaci (obr. 8) (Velík et al., 2005). V prvním kroku je albendazol velmi rychle konvertován na chirální albendazolsulfoxid (ABZSO), také známý jako rikobendazol. Tato metabolická přeměna je katalyzována především cytochromem P4503A (CYP3A) a flavinovými monooxygenázami (FMO). Albendazolsulfoxid

je

následně

(ale

jiţ

daleko

pomaleji)

biotransformován

na albendazolsulfon (ABZSO2), přičemţ na katalýze této přeměny se nejvíce podílí podrodina

cytochromu

za anthelmintický

účinek

P4501A. (u

Zatímco

některých

albendazolsulfoxid

ţivočišných

druhů

je i

odpovědný za potenciální

embryotoxicitu), albendazolsulfon je farmakologicky inaktivní (Velík et al., 2003).

31

Obrázek 8. Biotransformace albendazolu (Kříţová, 2006).

Albendazol je metabolizován na dva enantiomery: (-)-ABZSO a (+)-ABZSO. Bylo zjištěno, ţe cytochromem je generován převáţně (-)-ABZSO enantiomer, oproti tomu systém flavinových monooxygenáz selektivně vytváří (+)-ABZSO (Moroni et al., 1995). Albendazolsulfoxid je aktivním metabolitem, ale farmakodynamika obou optických izomerů není plně objasněna. Oba enantiomery se liší difúzí do parazita, vazbou na tubulin parazita a metabolismem v parazitujících helmintech. Hlavní komponentou nesoucí anthelmintický účinek při léčbě albendazolem se zdá být (+)-ABZSO. Proto je důleţité charakterizovat stereospecifitu tvorby ABZSO in vivo a plazmatické hladiny obou antipodů po podání albendazolsulfoxidu.

Poměr

(+)/(-)-ABZSO

albendazolu

v plazmě

je

a

druhově

racemického specifický.

Přeţvýkavci, psovité šelmy a člověk mají tento poměr podobný, ve prospěch (+) enantiomeru. Poměr obou enantiomerů v krvi není konstantní, mnoţství (+)-ABZSO v čase vzrůstá. U potkana je na rozdíl od jiných druhů preferován (-) enantiomer, plazmatický poměr (+)/(-)-ABZSO je 0,6 (Velík et al., 2003).

32 Koncem 80. let minulého století byl popsán indukční efekt albendazolu na biotransformační enzymy, hlavně podrodinu CYP1A. Podávání albendazolu vedlo ke zvýšení katalytické aktivity CYP1A a obsahu bílkoviny u potkana. (El Amri et al., 1988; Baliharová et al., 2003a). Indukce CYP1A (měřena uţitím 7-ethoxyresorufinu jako specifického substrátu) byla zjištěna také u člověka, králíka a buněk HepG2. Závěry studia indukce u hlodavců a člověka nelze automaticky aplikovat na hospodářská zvířata, protoţe existují mezidruhové rozdíly v regulaci cytochromu P450. U cílových species podávání albendazolu je proto nutné provést indukční studie. Po opakovaném podávání albendazolu muflonům (samice, věk 5-8 let) signifikantně vzrostla aktivita CYP1A1 a CYP1A2 v játrech a tenkém střevě. V in vitro experimentu s primární kulturou mufloních hepatocytů nebyl indukční efekt na CYP1A významný. Indukce jaterních a intestinálních CYP1A po opakovaném podání albendazolu muflonům je příčinou zvýšené tvorby inaktivního albendazolsulfonu, coţ vede ke sníţení terapeutické účinnosti a k rozvoji rezistence helmintů. Navíc indukce CYP1A můţe ovlivňovat metabolismus současně či po sobě podaných léčiv, která jsou biotransformována tímto enzymem. Vysoká aktivita CYP1A také můţe vyústit v aktivaci určitých prokarcinogenů (např. polycyklických aromatických uhlovodíků, polychlorovaných bifenylů). Nově bylo zjištěno, ţe aktivita CYP1A vzrostla i po jednorázovém podání albendazolu. Všechny výše zmíněné farmakologické a toxikologické aspekty plynoucí z jednorázového i opakovaného podání albendazolu je třeba brát v úvahu při léčbě tímto benzimidazolovým derivátem (Velík et al., 2005). U potkana bylo zjištěno, ţe indukci CYP1A navozuje albendazol a jeho metabolit

albendazolsulfoxid,

ne

však

albendazolsulfon.

Indukční

efekt

albendazolsulfoxidu byl dokonce silnější neţ u mateřského léčiva. Kromě CYP1A albendazol u potkana slabě indukuje také cytochromy CYP2A6, CYP2E1, CYP2B1, CYP2B2 a konjugační enzym UDP-glukuronosyltransferázu (UGT) (Velík et al., 2004).

2.3.4.8 Flubendazol Flubendazol

(FLU)

je

dalším

dobře

známým

benzimidazolovým

anthelmintikem, je to p-fluorovaný analog mebendazolu. Na rozdíl od albendazolu není v molekule flubendazolu v pozici C5 přítomen atom síry, místo toho je zde obsaţena ketoskupina.

Chemicky

jde

o methyl-[5-(4-fluorobenzoyl)-1H-benzimidazol-2-yl]

karbamát. Sumární vzorec flubendazolu je C16H12FN3O3 a jeho molekulární hmotnost je Mr = 313,28 g/mol. Je prakticky nerozpustný ve vodě.

33 Flubendazol je anthelmintikum s širokým spektrem účinku proti hlísticím a tasemnicím. Je vyuţitelný v humánní i veterinární medicíně. Je pouţíván k prevenci a léčbě helmintóz zejména u drůbeţe, baţantů a prasat. Flubendazol se stejně jako ostatní benzimidazolová anthelmintika po perorálním podání špatně vstřebává, absorpci z gastrointestinálního traktu limituje velmi nízká rozpustnost ve vodě. Většina podané dávky léčiva se z těla vyloučí v nezměněném stavu stolicí. Flubendazol podléhá extenzivnímu jaternímu first-pass metabolismu, absorbované mnoţství léčiva je tedy velmi rychle biotransformováno. V krvi, ve všech tkáních a tělních tekutinách cílového species převaţují metabolity flubendazolu nad vlastní parentní látkou, koncentrace flubendazolu v krvi a moči je velmi nízká. Flubendazol má větší distribuční objem neţ albendazol, tkáňová distribuce souvisí s anthelmintickým účinkem proti tkáňovým parazitům. Hlavní metabolické cesty flubendazolu jsou shodné u všech ţivočišných druhů, u nichţ byla biotransformace flubendazolu studována. Buď je v molekule flubendazolu redukována přítomná ketoskupina, nebo je hydrolyzována karbamátová skupina (obr.9). Redukce ketoskupiny je hlavní metabolickou přeměnou flubendazolu u drůbeţe a baţantů, vzniká chirální metabolit (označovaný M8 či FLU-R) nesoucí hydroxyskupinu na asymetrickém uhlíku. Chemicky jde o methyl-[5-[(4-fluorofenyl)hydroxymethyl]1H-benzimidazol-2-yl]karbamát. U prasat je dominantní metabolickou cestou hydrolýza karbamátu. Takto vzniká metabolit označovaný jako M7 či FLU-H, chemicky (2-amino-1H-benzimidazol-5-yl)(4-fluorofenyl)methanon. Oba metabolity (redukovaný i hydrolyzovaný flubendazol) jsou později konvertovány na 2-aminoα-(4-fluorofenyl)-1H-benzimidazol-5-methanol (metabolit M6) (Moreno et al., 2004; http://www.emea.eu.int). Reduktázy karbonylové skupiny, které jsou zodpovědné za tvorbu redukovaného flubendazolu, patří mezi významné biotransformační enzymy. Jsou lokalizovány zejména v cytosolu, ale i v membránách endoplazmatického retikula buňky. Jako koenzymy vyţadují NADPH či NADH.

34

FLU-H FLU-R

Obrázek 9. Biotransformace flubendazolu (dle Kan et al., 1998).

2.4 BIOTRANSFORMACE XENOBIOTIK Lidé i zvířata jsou stále ve větší míře vystavováni nejrůznějším cizorodým látkám: lékům, průmyslovým a potravinářským chemikáliím, látkám, které znečišťují ţivotní prostředí. Pro sloučeninu tělu cizí se vţilo označení xenobiotikum (z řečtiny xenos = cizí) (Murray et al., 2001). Organismus se snaţí cizorodé látky, které se do něj náhodně či vědomě dostaly, eliminovat. Xenobiochemie je obor biochemie, který studuje metabolické přeměny látek tělu cizích a enzymy, které tyto přeměny katalyzují. Zkoumá vlivy, které mohou měnit aktivitu biotransformačních enzymů, odhaluje strukturu i vlastnosti metabolitů xenobiotik, přispívá k pochopení mechanismu účinku xenobiotika a studuje jejich vliv na důleţité metabolické cesty endogenních látek (Kvasničková, 1995). Eliminace

xenobiotika

z organismu

zahrnuje

většinou

dva

procesy:

biotransformaci a exkreci (obr. 10). Obecným principem biotransformace je změna struktury léčiva s cílem usnadnit jeho exkreci z organismu. Původní lipofilní látka se konvertuje na hydrofilnější, polárnější metabolity, které jsou z organismu vylučovány snadněji. Jen výjimečně jsou cizorodé látky vyloučeny z organismu beze změny. Z hlediska farmakologického účinku léčiva můţe při biotransformaci dojít k dvojí přeměně (Lincová et al., 2002; Duchoň et al., 1988):

35  biodeaktivace (detoxikace) -

vzniklý metabolit je méně účinný neţ původní léčivo či úplně neúčinný (indiferentní)

 bioaktivace (toxikace) -

původní léčivo se mění na metabolit rovněţ farmakologicky účinný nebo dokonce na metabolit toxický

Obrázek 10. Schéma eliminace xenobiotik z organismu.

2.4.1 Fáze biotransformace Biotransformace velkého počtu xenobiotik se uskutečňuje ve dvou fázích, na základě relativně malého počtu typů chemických reakcí (Lincová et al., 2002). Kaţdé xenobiotikum nemusí procházet oběma fázemi. Některé cizorodé látky mají ve své molekule skupiny schopné konjugace, nepotřebují I. fázi enzymových přeměn, nebo metabolity I. fáze jsou natolik polární, ţe mohou být vylučovány bez konjugace (Kvasničková, 1995).  I. fáze biotransformace V I. fázi biotransformace se mateřská látka mění na polárnější metabolity připojením či odhalením hydrofilních funkčních skupin. Této fáze biotransformace se účastní enzymy hydrolytické, redukční či oxidační. Výsledkem je obvykle ztráta farmakologické účinnosti původní látky, méně často změna účinnosti či dokonce její zvýšení. Proléčiva jsou farmakologicky neúčinné sloučeniny, které se teprve při biotransformaci mění na účinnou látku. Přehled biotransformačních reakcí I. fáze je uveden v tabulce 9.

36 Tabulka 9. Přehled biotransformačních reakcí I. fáze (dle Duchoň et al., 1988; Kvasničková, 1995). Biotransformační reakce I. fáze hydroxylace alifatických a aromatických sloučenin O- a N-dealkylace oxidativní deaminace oxidační reakce

sulfoxidace a desulfurace oxidace alkoholů a aldehydů S- a N-oxidace oxidace dvojné vazby redukce karbonylových sloučenin redukce nitrosloučenin

redukční reakce

redukce azosloučenin redukce sulfoxidů redukce N-oxidů redukční dehalogenace hydrolýza esterů a amidů

hydrolytické reakce

otevření heterocyklů a aromatických cyklů, uzavření heterocyklů hydrolytická dehalogenace

 II. fáze biotransformace Biotransformační reakce II. fáze se nazývají reakce konjugační či syntetické. Léčivo či polárnější metabolity I. fáze jsou schopny reagovat s endogenními sloučeninami,

produkty

intermediárního

metabolismu

buňky

(s kyselinou

glukuronovou, 3´-fosfoadenosin-5´-fosfosulfátem, glutathionem, acetylkoenzymem A, s S-adenosylmethioninem a některými aminokyselinami). Vzniklý konjugát je velmi polární a je snadno vylučován z organismu močí či stolicí. Některé konjugáty léčiv se vylučují do ţluči, ţlučovými cestami se dostávají do duodena, poté do dalších úseků střeva, kde se mohou v přítomnosti střevních hydroláz štěpit na konjugační činidlo a původní látku, která podstupuje enterohepatální cirkulaci vedoucí k prodlouţení účinku léčiva (Lincová et al., 2002).

37 Transport substrátů, metabolitů I. fáze a konjugátů skrz buněčné membrány je zprostředkováván speciálními proteinovými transportéry. Transport membránami je dnes některými autory označován jako 0. a III. fáze biotransformace. Mateřské léčivo a jeho metabolity se mohou odlišovat svými fyzikálněchemickými vlastnostmi, farmakodynamickým účinkem, toxicitou a farmakokinetikou (Velík et al., 2004).

2.4.2 Biotransformace u helmintů Biotransformační mechanismy parazitujících červů jsou zatím relativně velmi málo prozkoumány. Klíčová role v biotransformaci xenobiotik u červů je připisována redukčním, hydrolytickým a konjugačním enzymům (Barrett, 1997), zatímco u většiny jiných organismů mají dominantní úlohu v biotransformaci xenobiotik enzymy oxidační, zejména cytochromy P450. Existence oxidačního metabolismu xenobiotik u červů byla dlouhou dobu popírána, teprve v posledních letech některé práce přinesly nezvratné důkazy oxidace léčiv (albendazolu a triklabendazolu) pomocí enzymatického aparátu u některých druhů červů (např. Fasciola hepatica, Haemonchus contortus, Moniezia expansa a Ascaris suum). Parazitující helminti disponují řadou hydrolytických enzymů včetně O- a N-deacetyláz. Z redukčních enzymů byly u helmintů nalezeny reduktázy aldehydů a ketonů, azoreduktázy a nitroreduktázy. Dominantní úlohu z konjugačních enzymů mají glutathion-S-transferázy. Bylo zjištěno, ţe i parazitující helminti se mohou bránit chemickému stresu indukcí biotransformačních enzymů (Alvinerie et al., 2001)

2.4.3 Místa biotransformace Hlavním místem přeměny léčiv i dalších xenobiotik jsou játra, která mají významnou metabolickou aktivitu. Biotransformace v játrech je velmi důleţitá pro léčiva podávána perorálně. Efekt prvního průchodu játry („first pass“ efekt) významně limituje dostupnost léčiv silně metabolizovaných v játrech. Kromě jater se biotransformační enzymy nacházejí i v dalších orgánech, např. v ledvinách, v gastrointestinálním traktu, v kůţi, v plicích. V buňce jsou biotransformační enzymy lokalizovány zejména v mikrosomech (v membráně endoplazmatického retikula) a cytosolu, ale i v mitochondriích a v membráně buněčného jádra (Lincová et al., 2002).

38 Hydrolytické enzymy se vyskytují hojně v krevní plazmě, v erytrocytech a mikrosomální frakci jater a ledvin. Redukční enzymy jsou obsaţeny převáţně v cytosolu, ale také v membránách endoplazmatického retikula buňky a ve značné míře i v bakteriích střevní flóry. Enzymy oxidující xenobiotika tvoří početnou skupinu enzymů, z nichţ největší roli hrají mikrosomální monooxygenázy (cytochromy P450, flavinové monooxygenázy). Jsou to membránové enzymy, které jsou lokalizovány na hladkém endoplazmatickém retikulu buněk různých tkání, zvláště jater, plic, ledvin, střevní mukózy a placenty. Většina konjugačních enzymů se nachází v cytosolu, ale UDP-glukuronosyltrasferáza (jeden z nejvýznamnějších biotransformačních enzymů II. fáze) je lokalizována v membráně endoplazmatického retikula (Kvasničková, 1995).

2.5 BIOTRANSFORMAČNÍ ENZYMY Enzymy katalyzující biotransformaci léčiv a jiných cizorodých látek mají řadu zvláštností. Oproti enzymům intermediárního metabolismu nejsou strukturálně specifické. Výhodou nízké substrátové specifity je to, ţe se mohou podílet na biotransformaci velkého počtu chemicky různorodých sloučenin, a to i zcela nových (Lincová et al., 2002). Pro biotransformační enzymy je charakteristická nízká katalytická účinnost, která je někdy kompenzována velkým mnoţstvím enzymu. Biotransformační enzymy jsou indukovatelné působením mnoha xenobiotik (viz dále). Obecně lze říci, ţe substráty biotransformačních enzymů jsou lipofilní xenobiotika, která jsou enzymy konvertována na hydrofilnější produkty. Některé biotransformační enzymy zasahují i do metabolismu eobiotik (látek tělu vlastních) – mastných kyselin, ţlučových kyselin, steroidních hormonů, prostaglandinů a dalších.

2.5.1 Oxidační enzymy Oxidační reakce jsou nejrozšířenější reakce biotransformace xenobiotik. Spousta xenobiotik je metabolizována mikrosomálními monooxygenázami. Nejvýznamnější mikrosomální monooxygenázy jsou cytochromy P450 a flavinové monooxygenázy. Pro svou

aktivitu

potřebují

donor

vodíku,

kterým

je

redukovaný

nikotinamidadenindinukleotidfosfát (NADPH), a molekulární kyslík. Jeden atom kyslíku inkorporují do molekuly substrátu (DH) a druhý redukují na vodu (Kvasničková, 1995). Schematicky tuto reakci znázorňuje obrázek 11.

39 Xenobiotika jsou v organismu přeměňována i dalšími oxidačními enzymy, které jsou většinou rozpustné v cytosolu, ale nalezeny byly i v mitochondriích a mikrosomech. Katalyzují oxidaci primárních a sekundárních alifatických alkoholů, cyklických alkoholů, oxidaci aldehydů, poloacetalů, anorganických sulfidů či aromatizaci alicyklického jádra (nikoliv však steroidů). Mezi tyto oxidační enzymy patří alkoholdehydrogenáza, aldehyddehydrogenáza, monoaminooxidáza, xantinoxidáza, superoxiddismutáza, glutathionperoxidáza.

D-H + NADPH + H+ + O2 → D-OH + NADP+ + H2O Obrázek 11. Schéma aktivity monooxygenáz (Duchoň et al., 1988).

2.5.1.1 Cytochromy P450 Tento enzymový systém je hlavním katalyzátorem oxidačních biotransformačních reakcí. Patří k nejvíce probádaným biotransformačním enzymům. Cytochrom P450 (CYP) byl poprvé popsán Klingenbergerem v roce 1948. Je to hemoprotein typu b, je pevně vázán na membrány endoplazmatického retikula ţivočišných buněk, u bakterií je v rozpustné formě v cytosolu. Písmeno P v jeho názvu znamená pigment, číslo 450 je odvozeno od intenzivního absorpčního maxima komplexu redukované formy cytochromu s oxidem uhelnatým (CO) při vlnové délce 450 nm. Cytochrom P450 je velmi

labilní,

snadno

se

přeměňuje

v inaktivní

formu,

která

se

projeví

posunem absorpčního maxima komplexu ze 450 nm na 420 nm. Monooxygenázový systém s cytochromem P450

je

tvořen

pevným

spojením

hemoproteinu

s NADPH-cytochrom P450-reduktázou (poměr 10:1) jako zdrojem elektronů v prostředí fosfatidylcholinu. Fosfatidylcholin slouţí k udrţení nativní konformace obou enzymů a usnadňuje jejich vzájemné interakce (Kvasničková, 1995; Lincová et al., 2002).  Klasifikace Díky rozvoji metod, které umoţnily izolaci enzymů a jejich čištění, bylo zjištěno, ţe v DNA ţivočišných buněk existuje řada genů kódujících mnoho cytochromů

P450,

které

se

od

sebe

liší

primární

strukturou,

některými

fyzikálně-chemickými vlastnostmi a substrátovou specifitou. Cytochrom P450 má mnoho izoforem (u člověka 35). Všechny doposud popsané cytochromy P450 tvoří

40 nadrodinu enzymů (superfamily), která zahrnuje několik rodin, které se dělí ještě na podrodiny, a to na základě podobnosti v sekvenci aminokyselin. Rodiny obsahují enzymy s větší neţ 40% sekvenční podobností, označují se arabskou číslicí (např. rodina cytochromů CYP1, CYP2). V podrodinách jsou formy enzymů, jejichţ sekvenční podobnost je větší neţ 60%, jednotlivé podrodiny se označují velkými písmeny (např. CYP2A, CYP2B). Arabská číslice za písmenem pak označuje jiţ konkrétní izoformu (např. CYP1A1, CYP3A4) (Kvasničková, 1995).  Lokalizace a struktura Pod označení cytochromy P450 spadá velká skupina enzymů, jejichţ společnou vlastností je přítomnost hemu v molekule, jehoţ pátým ligandem je thiolátový anion pocházející z cysteinu. Šestým ligandem hemu (ţeleza) se v průběhu katalyzované reakce stává molekula kyslíku. Jednotlivé izoformy cytochromu P450 se liší svými apoproteiny. Cytochromy P450 se vyskytují téměř ve všech tkáních a orgánech – v játrech, ledvinách, prostatě, kůţi, nosním epitelu, placentě, mozku, plicích, slezině, pankreatu, gastrointestinálním traktu, vaječníkách a varlatech (Dostálek, 2006).

Obrázek 12. Počítačový model CYP3A4 (lidská izoforma) (http://kr.expasy.org/sprot/).

41  Mechanismus katalýzy oxidace Oxidační hemoprotein

reakce

cytochrom

katalyzované

monooxygenázovým

systémem

P450, NADPH-cytochrom P450-reduktázu,

vyţadují

NADPH

a

molekulární kyslík. Schematicky je cyklus oxidace zobrazen na obrázku 13. Ţelezitý ion v molekule volného CYP je převáţně v nízkospinové formě. Po vazbě na léčivo (DH) dochází ke změně konformace Fe3+ do vysokospinového stavu, jenţ lépe umoţňuje následnou redukci. Redukce Fe3+ na Fe2+ je způsobena přenosem elektronu z NADPH na CYP pomocí NADPH-cytochrom P450-reduktázy. V přítomnosti molekulárního kyslíku se tvoří komplex Fe2+O2DH, který přijímá proton a druhý elektron (z reduktázy či z cytochromu b5). Tvoří se peroxidový komplex Fe2+OOH∙DH. Druhý proton štěpí tento komplex za tvorby volné radikálové molekuly léčiva D∙, která s vázaným radikálem OH∙ tvoří hydroxylované léčivo (D-OH), jeţ se uvolňuje z komplexu současně s regenerací CYP do původního stavu (Lincová et al., 2002).

Obrázek 13. Přenos elektronů v monooxygenázovém cyklu CYP (Lincová et al., 2002).

42 NADPH-cytochrom P450 reduktáza je flavinový protein, slouţí jako akceptor elektronu z NADPH, který pak přenáší na komplex léčivo-cytochrom P450 (Fe3+DH). Obsahuje prostetické skupiny: flavinadenindinukleotid (FAD) a flavinmononukleotid (FMN). FAD přijímá elektron z NADPH a je jeho donorem pro FMN, který redukuje CYP (obr. 14) (Kvasničková, 1995). Cytochromy P450 katalyzují např. hydroxylaci alifatických, alicyklických a aromatických sloučenin, O- a N-dealkylaci, oxidaci izolované dvojné vazby, N-oxidaci, sulfoxidaci, deaminaci, desulfuraci (Kvasničková, 1995).

FAD

FMN

Obrázek 14. Přenos elektronu z NADPH na mikrosomální CYP450 (dle Kvasničková, 1995).

 Přehled některých izoforem CYP450 Savčí jaterní cytochromy P450 podílející se na biotransformaci xenobiotik jsou členy rodin CYP1, CYP2, CYP3 a CYP4 (Machala et al., 2003). Různé izoformy vykazují odlišnou, ale často se překrývající substrátovou specifitu. Hlavními enzymy metabolizujícími léčiva v lidských játrech jsou CYP1A2, CYP2A6, CYP2C9, CYP2D6, CYP2E1 a CYP3A4, který je z hlediska mnoţství odbourávaných léčiv a jiných xenobiotik nejvýznamnějším zástupcem cytochromů (Lincová et al., 2002). Podrodina

CYP3A.

Tato

podrodina

cytochromů

figuruje

jak

v biotransformačních procesech xenobiotik, tak i v metabolismu endogenních substrátů (steroidů). Členové podrodiny CYP3A se vyskytují zejména v játrech, ale i ve střevě a v ledvinách. Indukční vliv na CYP3A mají např. rifampicin, dexametazon, fenobarbital, naopak inhibován je makrolidy (Štorkánová, 2004).

43 Podrodina CYP1A. Zástupci této podrodiny, CYP1A1 a CYP1A2, se velmi významně podílejí na biotransformačních procesech xenobiotik. Lidská játra obsahují relativně vysokou hladinu CYP1A2, ale neobsahují CYP1A1. CYP1A1 je spíše přítomna v plicích, střevní stěně, kůţi, lymfocytech a placentě. CYP1A2 se nevyskytuje extrahepatálně.

Obě

jsou

izoformy

indukovatelné,

induktory

jsou

např.

polyhalogenované aromatické uhlovodíky (PAH), kofein, β-naftoflavon, theofylin, warfarin. Zvýšená aktivita těchto izoforem ovlivňuje výskyt nádorů (počet i růst) (Kříţová, 2006; Štorkánová L., 2004). Indukční efekt na cytochrom P450, zejména na CYP1A, byl popsán také u benzimidazolových anthelmintik (např. albendazol, fenbendazol).

Míra

indukce

je

silně

závislá

na

struktuře

jednotlivého

benzimidazolového derivátu, koreluje také s koncentrací induktoru (Baliharová et al., 2003a). Tabulka 10. Příklady substrátů, induktorů a inhibitorů některých cytochromů P450. CYP1A2 kofein ethoxyresorufin substráty methoxyresorufin theofylin warfarin PAH induktory omeprazol albendazol ciprofloxacin inhibitory α-naftoflavon

CYP2C9

CYP3A

diklofenak fenobarbital piroxikam THC

cyklosporin ethinylestradiol omeprazol steroidy

rifampicin

dexamethazon rifampicin fenobarbital sulfafenazol klotrimazol sulfinpyrazin ketokonazol makrolidy

CYP2E1 alkoholy benzen kofein chlorzoxazon 4-nitrofenol ethanol isoniazid dimethylsulfoxid 4-methylpyrazol

2.5.1.2 Flavinové monooxygenázy Flavinové monooxygenázy (FMO) byly poprvé popsány Zieglerem v roce 1964. Výrazná je jejich afinita k sloučeninám, které obsahují dusík, síru a fosfor v molekule. Těmito enzymy je biotransformována řada léčiv (např. alkaloidy, antihistaminika, inhibitory monoaminooxidázy), ale i látky ze zevního prostředí a polutanty vody a ovzduší. Některé substráty mají společné s cytochromem P450, na jejich metabolismu se podílejí různou měrou, vzniklé produkty se od sebe mohou lišit. V mechanismu katalýzy oxidace substrátu se obě monooxygenázy zásadně odlišují.

44  Mechanismus katalýzy oxidace Koenzymem flavinových monooxygenáz je flavinadenindinukleotid (FAD). FAD je redukován elektrony z NADPH+H+ na FADH2. Tato redukovaná forma pak reaguje s kyslíkem za vzniku 4a-hydroperoxidu flavinu (FAD-OOH), který interaguje se substrátem (X) za vzniku oxidovaného produktu (X-OH). Při této reakci se 4a-hydroperoxid mění na 4a-hydroxid flavinu (FAD-OH), který se dále regeneruje na FAD. Zvláštností této katalýzy je fakt, ţe k aktivaci kyslíku (tedy ke vzniku 4a-hydroperoxidu) dochází bez účasti substrátu. Enzym interaguje se substrátem jen v jednom kroku. Ostatní kroky katalytického cyklu znamenají regeneraci všech reakčních meziproduktů, kterých se substrát neúčastní (Kvasničková, 1995). Enzym FMO tedy existuje ve čtyřech detegovatelných formách: redukované, oxidované, hydroxylované a hydroperoxidové (obr. 15).

Obrázek 15. Pravděpodobný mechanismus katalytického cyklu FMO (Kříţová, 2006).

45  Lokalizace a struktura Flavinové monooxygenázy jsou přítomny takřka ve všech buňkách v organismu a jsou značně enzymově aktivní. Nejvyšší katalytickou aktivitu vykazují v játrech, ale jsou obsaţeny také v plicích, ledvinách a ve většině ostatních tkání. Subcelulárně jsou lokalizovány

v endoplazmatickém

retikulu.

Výsledky

mnoha

studií

s čistými

izolovanými enzymy (obratlovců, bakterií, hub) prokázaly mnohotnost forem FMO. Jednotlivé izoformy se odlišují primární strukturou, spektrálními vlastnostmi a substrátovou specifitou. Klasifikace izoforem vychází z primární struktury enzymové bílkoviny a zásady pro jejich nomenklaturu byly převzaty z nomenklatury cytochromů P450 (Kvasničková, 1995).  Substrátová specifita Substráty flavinových monooxygenáz jsou sloučeniny různé struktury, fyzikálně-chemických vlastností i biologické aktivity. Jejich společným strukturním znakem je přítomnost nukleofilního centra v molekule, které je často tvořeno heteroatomem. Je známo, ţe více neţ jeden náboj v molekule substrátu však aktivitu FMO blokuje. Eobiotické nukleofilní sloučeniny jsou díky vyššímu počtu nabitých skupin v molekule před katalytickým působením FMO chráněny (Kvasničková, 1995). Substráty FMO jsou aminy, thioly, sulfidy, thioamidy, fosfiny (Štorkánová, 2004). Reakce katalyzované FMO jsou např. oxidace primárních, sekundárních a terciálních aminů, oxidace sulfidů a sulfoxidů, oxidace thiolů, disulfidů, oxidace thioamidů a thiokarbamidů.

2.5.2 Redukční enzymy Redukční reakce jsou organismem vyuţívány podstatně méně neţ reakce oxidační, jsou většinou jen jednou z metabolických přeměn daného substrátu. Redukční přeměny xenobiotik zahrnují redukci karbonylových skupin, dvojných vazeb, N-oxidů, sulfoxidů, disulfidů, redukci aromatických nitrosloučenin a azosloučenin, redukční dehalogenaci, redukci hydroxamových kyselin. Většina redukčních enzymů je rozpuštěna v cytosolu, ale jsou známy i reduktázy, které jsou lokalizovány na membránách endoplazmatického retikula buňky. Redukční enzymy jsou také ve značné míře obsaţeny v bakteriích střevní flóry (Kvasničková, 1995).

46 2.5.2.1 Redukce karbonylové skupiny Redukce je významným biotransformačním krokem u řady aromatických, alicyklických a alifatických sloučenin nesoucích karbonylovou skupinu (Szotáková et al., 2004). Lidé a zvířata jsou vystaveni širokému spektru potenciálně toxických karbonylových sloučenin (aldehydů, ketonů a chinonů) endogenního či exogenního původu. Tyto sloučeniny mají schopnost tvořit Schiffovy báze s proteiny, reagovat s thiolovými skupinami buněčných makromolekul nebo mohou být mutagenní. Kromě toho chinony mohou podstupovat tzv. redoxní cyklický děj a vytvářet tak reaktivní kyslíkové radikály vedoucí k oxidačnímu stresu buněk (Ellis et al., 1995). Buňka potřebuje ochranu před karbonylovými sloučeninami kvůli jejich reaktivitě. Redukce karbonylové skupiny na odpovídající alkoholy představuje běţný způsob zvýšení polarity molekul, čímţ je podpořena jejich eliminace. Navíc tyto tvořené

hydroxyderiváty mohou

být

následně

konjugovány enzymy II. fáze

biotransformace, coţ vede k dalšímu usnadnění jejich exkrece. Redukce karbonylu je tedy důleţitým krokem v biotransformaci vedoucí k eliminaci endogenních a exogenních aldehydů, ketonů a chinonů (Maser, 1995). Současné genomové a cDNA analýzy naznačují, ţe redukční metabolismus cizorodých karbonylových sloučenin je zprostředkován mnoha enzymy, které se liší intracelulární lokalizací. Aţ na výjimky jsou enzymy zodpovědné za redukci karbonylu vysoce

exprimovány

v játrech.

Jsou

členy

dvou

proteinových

nadrodin -

aldo-ketoreduktáz (AKR) nebo krátkořetězcových dehydrogenáz/reduktáz (SDR) (Maser, 1995). Ačkoliv AKR a SDR nejsou homologní a mají zcela odlišnou trojrozměrnou strukturu, katalytické mechanismy těchto dvou nadrodin jsou analogické. U člověka je v současnosti známo dvanáct enzymů podílejících se na redukci xenobiotických karbonylových sloučenin (tab. 11) (Matsunaga et al., 2006). Reduktázy karbonylu plní důleţitou funkci jak v buněčném metabolismu fyziologicky nepostradatelných látek (steroidů, prostaglandinů a biogenních aminů), tak v přeměně toxických a lipofilních karbonylových sloučenin na méně reaktivní příslušné alkoholy. Mezi nejvýznamnější reduktázy léčiv obsahujících ve své molekule karbonylovou skupinu patří CBR1, 11β-HSD 1, AKR1C1, AKR1C2 a AKR1C4.

47

Tabulka 11. Lidské reduktázy karbonylu konvertující cizorodé karbonylové sloučeniny a jejich zařazení do proteinových nadrodin AKR a SDR (Matsunaga et al., 2006). Nadrodina Enzym aflatoxin B1 aldehydreduktázy (AKR7A2, AKR7A3) 20α-hydroxysteroiddehydrogenáza (AKR1C1) AKR

3α-hydroxysteroiddehydrogenáza typu 3 (AKR1C2) 17β-hydroxysteroiddehydrogenáza typu 5 (AKR1C3) 3α-hydroxysteroiddehydrogenáza typu 1 (AKR1C4) karbonylreduktázy (typ 1-4) (CBR1-4)

SDR

11β-hydroxysteroiddehydrogenáza 1 (11β-HSD 1) dehydrogenáza/reduktáza člen 4 SDR (DHRS4) L-xylulózoreduktáza

Aldo-ketoreduktázy (AKR) reprezentují rostoucí nadrodinu oxidoreduktáz. Nacházejí se u obratlovců, bezobratlých, rostlin, protozoí, hub a bakterií, coţ dokazuje, ţe se jedná o prastarou nadrodinu enzymů. Členové nadrodiny AKR jsou monomerní proteiny o délce přibliţně 320 aminokyselin. Váţí NAD(P)(H) a účastní se metabolismu širokého spektra substrátů – alifatických aldehydů, monosacharidů, steroidů, prostaglandinů a xenobiotik. Široká substrátová specifita ztěţuje přesné pojmenování těchto proteinů. Díky mnohočetnosti názvů pro jednotlivé členy AKR navrhli Jez a Penning (2001) rozšiřovatelný nomenklaturní systém pro jednotlivé enzymy patřící do nadrodiny AKR. Nomenklaturní systém je zaloţený na identitě sekvence aminokyselin. Na hladině 40% aminokyselinové identity byla nadrodina AKR rozčleněna do rodin (značených arabskými číslicemi). K datu vzniku této práce bylo známo jiţ patnáct rodin AKR. Na hladině 60% aminokyselinové identity se rozlišují jednotlivé podrodiny, které se označují velkými písmeny (Jez et Penning, 2001). AKR zahrnují aldehydreduktázy, aldózoreduktázy, dihydrodioldehydrogenázy, některé hydroxysteroiddehydrogenázy a prostaglandinsyntházy. V současné době počet charakterizovaných AKR dospěl ke 150 proteinům (http://www.med.upenn.edu/akr/).

48 SDR nadrodina patří mezi jednu z největších proteinových rodin, zahrnuje okolo 3000 primárních struktur funkčně rozlišných proteinů. Pro všechny členy SDR nadrodiny jsou typické některé obecné strukturní rysy, přestoţe shoda aminokyselinové sekvence je nízká (15-30%) (Jörnvall et al., 1995). Jedním z těchto znaků je oblast se střídajícími se úseky α-helixu a β-struktury (tzv. Rossmannův záhyb), dále katalyticky aktivní triáda aminokyselin sestávající ze Ser, Tyr a Lys zbytků a N-terminální kosubstrát-vázající místo se shodnou sekvencí bohatou na glycin (Gly-X-X-X-Gly-X-Gly) (Agarwal et al., 1995). Významnými členy této nadrodiny jsou karbonylreduktázy (CBR). Lidská karbonylreduktáza

CBR1

katalyzuje

NADPH-dependentní

redukci

různých

karbonylových sloučenin, nejlepšími substráty jsou o- a p-chinony polycyklických aromatických uhlovodíků. V lidských játrech a v placentě je CBR1 hlavní reduktázou chinonů. Endogenními substráty CBR1 jsou prostaglandiny a některé 3-ketosteroidy, ale redukuje také některé terapeuticky či toxikologicky významné sloučeniny (např. daunorubicin, doxorubicin, metyrapon, haloperidol, tabákový nitrosamin NNK). Karbonylreduktáza CBR4 je nově nalezeným enzymem, jehoţ katalytické vlastnosti a tkáňová distribuce zatím zůstávají neznámé (Matsunaga et al., 2006).

2.5.3 Hydrolytické enzymy Hydrolytické enzymy odštěpují z molekuly substrátu velký fragment, takţe změna struktury xenobiotika je rozsáhlejší neţ u produktů vzniklých jinými biotransformačními

enzymy.

Mezi

hydrolytické

enzymy

patří

arylesterázy,

karboxyesterázy, acetylesterázy, cholinesterázy a hydrolytické enzymy podílející se na štěpení konjugátů – β-glukuronidázy a glukosidázy (Kvasničková, 1995).

2.5.4 Konjugační enzymy Konjugační enzymy katalyzují průběh reakcí II. fáze biotransformace. Reakcemi oxidačními, redukčními i hydrolytickými vznikají polární elektrofilní či nukleofilní metabolity, které dále reagují s endogenními konjugačními činidly. Pro průběh konjugačních (syntetických) reakcí je zapotřebí energie – buď je aktivováno konjugační činidlo nebo se aktivuje substrát. Substráty konjugačních reakcí nemusí být vţdy produkty I. fáze metabolismu, některá xenobiotika ve své molekule obsahují skupiny, které jsou přímo schopné konjugace.

49 Rovněţ řada eobiotik podstupuje konjugaci – např. steroidní hormony, bilirubin, ţlučové kyseliny (Kvasničková, 1995). Většina konjugačních enzymů je lokalizována v cytosolu, významnou výjimku tvoří UDP-glukuronosyltransferáza, která je ukotvena v membráně endoplazmatického retikula. Mezi

konjugační

reakce

patří

glukuronidace,

sulfatace,

konjugace

s glutathionem, konjugace s aminokyselinami, acetylace, methylace.

2.5.4.1 UDP-glukuronosyltransferáza UDP-glukuronosyltrasferáza

(UGT)

je

enzym

II. fáze

biotransformace

katalyzující glukuronidaci. Konjugačním činidlem je UDP-glukuronát, který vzniká oxidací (dehydrogenací) UDP-glukózy. UGT je lokalizována převáţně v membráně hladkého endoplazmatického retikula, nejvyšší aktivitu má v játrech, v ledvinách, gastrointestinálním traktu a kůţi (Kvasničková, 1995). Glukuronidace je nejčastější konjugační reakce, glukuronidy tvoří řada xenobiotik (např. morfin, p-nitrofenol, nesteroidní antiflogistika), ale také eobiotika (např. bilirubin, steroidní a thyroidní hormony, serotonin) (Kříţová, 2006). Při

glukuronidaci

dochází

k přenosu

glukuronosylu

z UDP-glukuronátu

na vhodný nukleofilní akceptor (např. na hydroxylovou, karboxylovou, sulfhydrylovou skupinu nebo na aminoskupinu), substrátem UGT jsou tedy alkoholy, fenoly, karboxylové kyseliny, thioly či aminy. Při reakci dochází k inverzi na anomerním uhlíku cukerného zbytku z polohy α do polohy β (obr. 16) (Kvasničková, 1995).

Obrázek 16. Schéma konjugace s UDP-glukuronovou kyselinou (Kříţová, 2006).

50 Jako jiné biotransformační enzymy také UGT existuje v několika izoformách. Jejich nomenklatura (obdobně jako u cytochromů P450) vychází ze shody aminokyselinové sekvence (rodina, podrodina, konkrétní izoforma) (Kříţová, 2006). Lidskou UGT tvoří dvě rodiny enzymů – UGT 1 a UGT 2. Produkty reakce jsou O-, N-, S- nebo C-glukuronidy, jsou polární, většinou dobře rozpustné ve vodě a tedy i snadno eliminovatelné z organismu močí nebo ţlučí. Glukuronidy vylučované ţlučí mohou být ve střevě štěpeny glukuronidázami a účastnit se enterohepatální cirkulace.

2.5.4.2 Glutathion-S-transferáza Glutathion (γ-glutamylcysteinylglycin, GSH) je tripeptid skládající se z kyseliny glutamové, cysteinu a glycinu. Obecně známé označení glutathionu GSH zdůrazňuje přítomnost sulfhydrylové skupiny cysteinu, která představuje reakční skupinu molekuly.

Obrázek 17. Strukturní vzorec glutathionu (Kříţová, 2006). V organismu plní glutathion (obr. 17) důleţitou funkci, spolu s enzymem glutathionreduktázou se podílí na vzniku správných disulfidových vazeb v mnoha bílkovinách a polypeptidových hormonech. Kromě toho se glutathion účastní metabolismu některých xenobiotik (Murray et al., 2001). GSH je silným nukleofilním činidlem, reaguje se sloučeninami obsahujícími elektrofilní centrum (atom uhlíku či některý heteroatom – kyslík, dusík, síra). Velký počet potenciálně toxických elektrofilních xenobiotik je konjugováno s GSH. R + GSH → R-S-G Obrázek 18. Schéma konjugace s glutathionem (Murray et al., 2001).

51 Konjugaci s glutathionem katalyzuje skupina enzymů označovaných jako glutathion-S-transferázy (GST). Nacházejí se v cytosolu buněk, ve vysoké koncentraci jsou obsaţeny zejména v cytosolu hepatocytů (Murray et al., 2001). Existuje řada izoforem GST, jejich nomenklatura je obdobou názvosloví cytochromu P450. GST se vyznačují schopností vázat velký počet lipofilních molekul, jejich detoxikační účinek tedy spočívá nejen v přeměně xenobiotik na méně toxické konjugáty, ale i v jejich vazbě na svou molekulu. Konjugace glutathionu s některými sloučeninami (např. epoxidy, arenoxidy) nevyţaduje enzymovou katalýzu (Kvasničková, 1995). Konjugáty s glutathionem jsou dále transformovány, několika postupnými kroky jsou přeměněny aţ na příslušné merkapturové kyseliny. Nejprve je odštěpen glutamát, v dalším kroku glycin a zbývající cystein-S-konjugát je acetyltransferázou acetylován na merkapturovou kyselinu (Kvasničková, 1995). 2.5.4.3 Sulfotransferáza Při sulfátové konjugaci plní funkci konjugačního činidla 3´-fosfoadenosin5´-fosfosulfát (PAPS) (obr. 19), který vzniká reakcí mezi ATP a anorganickým sulfátem pomocí příslušné kinázy. Katalyzátorem sulfatace je skupina sulfotransferáz. Sulfotransferázy jsou cytosolické enzymy, vzájemně se odlišují sekvencí aminokyselin v molekule, substrátovou specifitou, termostabilitou. Sulfátovou konjugací jsou metabolizovány alkoholy, fenoly, hydroxylaminy, alicyklické steroidy, arylaminy. Výsledkem sulfatace je detoxikace cizorodých látek, jejich snadnější eliminace z organismu, některé sulfátové konjugáty však mohou být i toxické (dle povahy substrátu) (Kvasničková, 1995).

Obrázek 19. Strukturní vzorec 3´-fosfoadenosin-5´-fosfosulfátu (Kvasničková, 1995).

52 2.5.4.4 N-acetyltransferáza Acetylace patří mezi časté konjugační reakce xenobiotik i eobiotik. Xenobiotické substráty jsou převáţně aminy – arylaminy, alifatické aminy, hydraziny, sulfonamidy. Aktivním konjugačním činidlem je acetylkoenzym A (AcCoA), průběh acetylace je katalyzován enzymem N-acetyltransferázou (Kvasničková, 1995). R + AcCoA → Ac-R + CoA Obrázek 20. Schéma acetylace (Murray et al., 2001). N-acetyltransferáza je enzym se širokou substrátovou specifitou, přítomný v cytosolu různých tkání, zejména v játrech. Vyznačuje se výraznou rozdílností v enzymové aktivitě u různých ţivočišných druhů. Existují polymorfní typy acetyltransferáz, coţ hraje podstatnou roli při farmakoterapii. Populace se dělí na pomalé a rychlé acetylátory, podle rychlosti úbytku farmaka v krvi. Např. po podání antituberkulotika isoniazidu jsou pomalí acetylátoři vystaveni jeho toxickým účinkům, protoţe lék přetrvává v organismu těchto pacientů déle beze změny (Murray et al., 2001).

2.5.4.5 N-,O-,S-methyltransferáza Některá xenobiotika jsou podrobena v organismu methylaci katalyzované methyltransferázami vyuţívajícími S-adenosylmethionin (obr. 21) jako donor methylu (Murray et al., 2001).

Obrázek 21. Strukturní vzorec S-adenosylmethioninu (Kvasničková, 1995).

53 Methyltransferázy jsou enzymy s nízkou substrátovou specifitou, reagují s xenobiotiky různých struktur. N- a O-methyltransferázy jsou lokalizovány v cytosolu jaterních a nervových buněk. K O-methylaci dochází u sloučenin, které obsahují v molekule fenolické skupiny, N-methylaci podléhají aromatické a alifatické aminy i heterocyklický

dusík.

S-methyltransferázy

jsou

zakotveny

v membránách

endoplazmatického retikula, podílejí se na detoxikaci thiopurinů, thiopyrimidinů a celé řady thiolů. Na rozdíl od ostatních konjugačních reakcí se methylací sniţuje rozpustnost substrátu (Kvasničková, 1995).

2.5.4.6 Konjugace s aminokyselinami nebo cukry Pro biotransformaci cyklických i polycyklických karboxylových kyselin vyuţívá většina ţivých organismů konjugaci s aminokyselinami či cukry. Většina kyselin rostlinného původu s menší a střední molekulovou hmotností je konjugována s aminokyselinami, větší molekuly či makromolekulární kyseliny jsou vylučovány jako glykosidy. Při konjugaci karboxylové kyseliny a aminokyseliny vzniká amidová vazba, jejíţ tvorba vyţaduje energii. Ta je dodána aktivací karboxylové kyseliny. Kyselina je aktivována reakcí s koenzymem A (CoA) za přítomnosti ATP. Katalyzátorem této reakce je acylkoenzym A synthetáza. Vzniklý thioester přenese acyl k aminoskupině aminokyseliny pomocí enzymu aminoacidacylázy za vzniku amidu, přitom se regeneruje koenzym A. Karboxylové kyseliny konjugují nejčastěji s glycinem či s L-glutaminem. Enzymy podílející se na této konjugaci jsou obsaţeny v matrix mitochondrií jater a ledvin (Kvasničková, 1995).

R1COOH + ATP + CoA → R1COSCoA + AMP + PP R1COSCoA + R2NH2 → R1CONHR2 + CoA Obrázek 22. Schéma konjugace karboxylové kyseliny s aminokyselinou (Kvasničková, 1995).

54

2.6 FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ AKTIVITU BIOTRANSFORMAČNÍCH ENZYMŮ V metabolismu léčiv a jiných xenobiotik byly zjištěny velké inter- i intraindividuální rozdíly, jeţ mohou být výsledkem faktorů genetických, vývojových, patologického stavu organismu, výţivy a prostředí, mnohdy s velkým významem pro terapii. V současnosti jsou pečlivě studovány všechny vlivy, které působí na aktivitu biotransformačních enzymů. Rozdílná aktivita biotransformačních enzymů vede ve svém důsledku k variabilním plazmatickým a tkáňovým hladinám podaného farmaka či jiné cizorodé látky, coţ ovlivňuje vlastní terapeutický/toxický účinek látky na organismus (Lincová et al., 2002). Tabulka 12. Přehled faktorů vnějšího i vnitřního prostředí ovlivňujících aktivitu biotransformačních enzymů. Faktory interindividuální

Faktory intraindividuální

živočišný druh

věk

genetické faktory

patologický stav

pohlaví

výživa stres enzymová indukce enzymová inhibice biologické rytmy těhotenství

2.6.1 Mezidruhové rozdíly Mezidruhové rozdíly se projevují absencí či nízkou aktivitou určitých enzymů u některých ţivočišných druhů, ale také preferencí odlišných cest biotransformace stejného

substrátu

u

různých

species.

Příkladem

mezidruhových

rozdílů

v biotransformaci je chybění glukuronidace u koček, lvů a rysů, N-acetylace arylaminů u psů nebo velmi nízká N-hydroxylace alifatických aminů u potkanů. Příčinou rozdílů ve spektru a aktivitě biotransformačních enzymů je odlišná genetická výbava jednotlivých ţivočišných druhů, rozdílná genová exprese a aminokyselinové sloţení enzymů (Kvasničková, 1995).

55 Studium mezidruhových rozdílů v aktivitě biotransformačních enzymů je náplní srovnávací biochemie. Výsledky jsou důleţité pro predikci přeměn xenobiotik u člověka i zvířat. Extrapolace dat získaných u pokusných zvířat na člověka je obtíţná, hledají se biologické druhy, které mají metabolické pochody nejblíţe člověku (Kvasničková, 1995).

2.6.2 Genetické faktory Geneticky podmíněné rozdíly v metabolismu léčiv se odhalí tehdy, kdyţ se ve skupině lidí, kteří dostávají stejnou dávku farmaka ve stejném dávkovacím schématu, vyskytnou jedinci s nečekanou a mimořádnou odpovědí na dané léčivo. Buď se léčivo odbourává velmi pomalu, čímţ se zvyšuje riziko jeho kumulace (a tedy i výskytu toxických účinků) v organismu, anebo je farmakum biotransformováno příliš rychle, nemusí přitom dosáhnout terapeutických hladin (Kvasničková, 1995). Studiem geneticky podmíněných předpokladů pro variabilitu účinnosti a bezpečnosti léčiv se zabývá relativně mladý vědní obor – farmakogenetika. Snaţí se o individualizaci farmakoterapie, hledá léčivo „šité na míru“ kaţdému konkrétnímu pacientovi. Za cíl si klade zvýšit účinnost léčiva a zároveň sníţit riziko vzniku neţádoucích účinků individualizací dávek léčiva. Vzhledem ke geneticky podmíněným změnám metabolismu xenobiotik je moţné nalézt v populaci dva fenotypy - pomalé a rychlé metabolizátory. Některá odborná literatura uvádí fenotypy tři - pomalé, středně rychlé (normální) a rychlé metabolizátory.  Pomalí metabolizátoři U těchto jedinců je defektní či částečně vadný gen pro daný biotransformační enzym, coţ vede k tvorbě nefunkčního enzymu a ke sníţené rychlosti metabolismu léčiva. Důsledkem můţe být zvýšená biodostupnost léčiva nebo jeho zpomalená eliminace a přehnaná odpověď na podané farmakum.  Rychlí metabolizátoři Tito jedinci mají ve své genetické výbavě duplikovaný či amplifikovaný gen, který odpovídá za strukturu konkrétního enzymu. Dochází k rychlému odbourávání podané léčivé látky nebo naopak k rychlé bioaktivaci některých prokancerogenních cizorodých sloučenin.

56 Termín genetický polymorfismus enzymu vyjadřuje existenci různých variant téhoţ enzymu v populaci. Podstatou polymorfismu je mutace genu nesoucího informaci o struktuře daného enzymu. Vlivem mutací (často bodových) vzniká několik alelických variant (Slanař, 2007). Důsledkem genetických rozdílů můţe být individuální citlivost vůči některým xenobiotikům, vznik různých onemocnění vyvolaných farmaky či vyšší riziko nádorových onemocnění (Kvasničková, 1995). Příkladem

výrazného

enzymového

polymorfismu

je

polymorfismus

N-acetyltransferázy u lidí, ale i myší a králíků. Podle rychlosti acetylace se dělí populace na rychlé a pomalé acetylátory. Pomalý typ acetylace se projeví u homozygotních jedinců se dvěma recesivními alelami. U pomalých acetylátorů tuberkulotiků se výrazně projevuje toxicita podávaného isoniazidu (Slanař, 2007).

2.6.3 Pohlaví Pohlavní rozdíly v biotransformaci cizorodých látek jsou výrazné u potkanů, také u myší a některých hospodářských zvířat. Řada xenobiotik je dvakrát aţ třikrát rychleji metabolizována jaterními enzymy samců potkana v porovnání s enzymy samic. To vede k předpokladu, ţe některé biotransformační enzymy jsou ovlivňovány pohlavními hormony – androgeny, estrogeny, progestiny. U člověka jsou aktivity biotransformačních enzymů u muţů a u ţen srovnatelné, pohlavní rozdíly nejsou výrazné (Kvasničková, 1995).

2.6.4 Věk Dalším faktorem ovlivňujícím biotransformaci xenobiotik je věk. U lidského fetu jiţ v raném stádiu vývoje byl detekován cytochrom P450, i kdyţ byla prokázána niţší rychlost biotransformace léčiv neţ v postnatálním vývoji. Aktivity enzymů pro glukuronové, sulfátové, glutathionové konjugace a hydrolýzu epoxidů se dají prokázat i v plodu, ovšem na velmi nízké úrovni. U právě narozených dětí se postupně podstatně zvyšuje aktivita všech biotransformačních enzymů, ale biotransformační přeměny jsou i tak pomalejší neţ u dospělých. U osob vyššího věku dochází naopak ke sníţení aktivity biotransformačních enzymů, coţ vede ke zpomalenému odbourávání některých léčiv (např. fenobarbitalu, lidokainu, sulfonamidů). Kromě niţší aktivy biotransformačních enzymů je u seniorů sníţen i jaterní průtok krve, hmotnost jater klesá aţ o 20% (Lincová et al., 2002).

57

2.6.5 Patologický stav Poškození a choroby jater (cirhóza, steatóza jater, hepatitida, nádory jater, traumata, chronický alkoholismus, intoxikace hepatotoxickými látkami) vedou k poklesu monooxygenázové cytochromové aktivity, ke sníţení konjugační a hydrolytické přeměny léčiv a ke sníţení jaterní eliminace léčiv. Důsledkem je velmi silná farmakologická odpověď organismu na standardní dávky některých léčiv (např. tolbutamid, diazepam, morfin) (Lincová et al., 2002).

2.6.6 Výživa Vliv diety na biotransformaci léčiv byl sledován především na experimentálních zvířatech. Ukázalo se, ţe nezbytným předpokladem plné aktivity monooxygenázového systému je dostatečná přítomnost nenasycených mastných kyselin, vitaminu E a vitaminu C v potravě (Lincová et al., 2002). O vlivu základních ţivin v dietě nejsou ţádné výsledky jednoznačné. Cukry neovlivňují aktivitu monooxygenáz in vitro. Důleţitá pro biotransformační enzymy je přítomnost lipidů v potravě, protoţe estery cholesterolu, triglyceridy, cholesterol, mastné kyseliny a fosfolipidy se účastní tvorby membrán, na které je většina biotransformačních enzymů vázána. Zejména mikrosomální monooxygenázy jsou lokalizovány na membránách endoplazmatického retikula buněk a fosfolipidy jsou nezbytné pro jejich aktivitu. Dieta bez tuků a bez nenasycených mastných kyselin podávaná tři týdny potkanům způsobila pokles aktivity cytochromu P450, aktivita mikrosomálních monooxygenáz se upravila na normální hodnoty po opětovném podávání diety s obsahem tuků i nenasycených mastných kyselin. Nejvíce byl studován vliv proteinů v dietě. Sníţený přísun proteinů působí pokles aktivity oxidačních enzymů a výsledkem je pomalejší odbourávání xenobiotik v organismu, coţ můţe vést k toxicitě léků i látek zevního prostředí (Kvasničková, 1995).

58

2.6.7 Enzymová indukce Indukce biotransformačních enzymů je adaptivní odpovědí organismu na přítomnost některých xenobiotik, kterou se snaţí bránit před jejich akumulací a toxicitou (Kvasničková, 1995). Enzymovou indukci lze definovat jako nárůst aktivity specifického enzymu, která je důsledkem zvýšení exprese příslušného genu (tzv. transkripční mechanismus indukce), sníţení degradace proteinu nebo stabilizace mRNA (netranskripční mechanismy indukce) (Okey, 1990; Gibson et Skett, 2001). Proces indukce tedy trvá vţdy určitou dobu. Vzestup aktivity biotransformačního enzymu díky chemické indukci můţe odráţet dřívější, tedy nesoučasnou, přítomnost induktoru. Velikost indukce závisí na dávce (koncentraci) induktoru a trvání expozice. Indukční účinek xenobiotika je velmi druhově specifický (Boobis et al., 1990; Rice et al., 1992; Lu et Li, 2001). Některé induktory zvyšují aktivitu pouze jediného enzymu (izoformy), většina však působí současné zvýšení aktivity několika biotransformačních enzymů eventuálně i transportních systémů. Mechanismus indukčního působení je u několika nejznámějších induktorů detailně prozkoumán, u jiných je zatím pouze naznačen (Rodrigues, 2002). Jak jiţ bylo zmíněno v kapitole o benzimidazolech, u potkana vede podávání albendazolu k nárůstu aktivity CYP1A. Tato enzymová indukce albendazolem byla zjištěna také u člověka a králíka. Opakované podávání albendazolu muflonům signifikantně indukuje jaterní i intestinální CYP1A, coţ vede ke zvýšení rychlosti tvorby inaktivního albendazolsulfonu. Opakované podávání albendazolu tedy indukuje jeho vlastní metabolickou degradaci v játrech i tenkém střevě, coţ můţe způsobit pokles terapeutické účinnosti tohoto anthelmintika a rozvoj rezistence parazitů (Velík et al., 2005). Oproti tomu v pokusu in vitro prováděném s primární kulturou hepatocytů muflona nebyla indukce CYP1A výrazná (Baliharová et al., 2003b). Je tedy zřejmé, ţe výsledky získané in vitro pokusy nemusí korespondovat s in vivo situací. Příčinou rozdílných výsledků mohou být interakce albendazolu s buňkami (rozdílná doba kontaktu),

navíc

se

můţe

uplatňovat

inhibice

CYP1A

albendazolem

a

albendazolsulfoxidem, která je výraznější v in vitro experimentech neţ v pokusech in vivo (Velík et al., 2005).

59 Indukční efekt na CYP1A má mateřské léčivo albendazol a jeho metabolit albendazolsulfoxid. Albendazolsulfon se ukázal být oproti albendazolsulfoxidu velmi slabým induktorem. Analogicky i u dalšího benzimidazolového anthelmintika fenbendazolu a jeho sulfoxidového metabolitu oxfendazolu byl dodatečně prokázán indukční vliv na CYP1A. Indukční studie s fenbendazolem byla provedena u králíka in vivo, na primární kultuře králičích hepatocytů a na buňkách HepG2. Indukční efekt sulfoxidových metabolitů (albendazolsulfoxidu a oxfendazolu) byl silnější něţ u mateřských léčiv (Velík et al., 2004). Anthelmintika flubendazol a mebendazol podléhají v organismu hlavně redukční přeměně karbonylové skupiny, jsou biotransformovány reduktázami karbonylové skupiny. Ţádné z těchto léčiv nevykazovalo indukční účinek na cytochromy P450 u testovaných druhů hospodářských zvířat, coţ podporuje klasickou teorii, ţe xenobiotikum většinou indukuje ty enzymy, které katalyzují jeho biotransformaci. Flubendazol a mebendazol se biotransformují redukční cestou, mají lipofilní charakter, podávají se zvířatům opakovaně a dlouhodobě. Tato fakta naznačují moţnost indukce reduktáz karbonylové skupiny u hospodářských zvířat.

2.6.8 Enzymová inhibice Enzymovou inhibicí se rozumí pokles aktivity biotransformačních enzymů působením xenobiotika (Velík et al., 2004; Gibson et Skett, 2001). K poklesu aktivity můţe dojít několika mechanismy. Inhibice můţe být vratná či nevratná:  Reverzibilní (vratná) inhibice Kompetitivní inhibitor „soutěţí“ s molekulou substrátu o vazbu na aktivní místo enzymu. Výsledný inhibiční efekt závisí na poměru afinit substrátu a inhibitoru k vazebnému místu enzymu a na jejich koncentraci. V přítomnosti kompetitivního inhibitoru lze dosáhnout maximální rychlosti reakce, ale při vyšší koncentraci substrátu. Struktura kompetitivního inhibitoru je často podobná struktuře substrátu. Při nekompetitivní vratné inhibici nebrání inhibitor vazbě substrátu na aktivní místo enzymu, ale znesnadňuje průběh katalytické reakce. V tomto případě zvýšením koncentrace substrátu nelze zvrátit inhibiční vliv inhibitoru. Výsledný inhibiční účinek závisí na koncentraci inhibitoru a jeho afinitě k enzymu.

60  Irreverzibilní (nevratná) inhibice K nevratné inhibici enzymu dochází při jeho inaktivaci (destrukcí jiţ vytvořeného enzymu či pevnou kovalentní vazbou inhibitoru na aktivní místo enzymu). Byl proveden experiment s jaterními mikrosomy potkana a muflona, kdy byl sledován vliv albendazolu na aktivitu cytochromu P450. Výsledky ukázaly, ţe albendazol i jeho metabolit albendazolsulfoxid (ne však albendazolsulfon) vykazují významnou schopnost inhibovat CYP aktivitu u obou testovaných species. Jedna sloučenina tedy můţe působit jako induktor a zároveň také jako inhibitor téhoţ enzymu. V in vitro studiích můţe CYP inhibice maskovat CYP indukci (Baliharová et al., 2005). Modulace aktivity biotransformačních enzymů mění intenzitu účinku a biologický poločas současně nebo po sobě podávaných léčiv. Mohou se zvýšit plazmatické hladiny účinné látky, přičemţ se zvyšuje riziko výskytu neţádoucích vedlejších nebo toxických účinků léčiva. Nebo naopak mohou plazmatické hladiny léčiv klesnout pod hranici minimální koncentrace potřebné pro dosaţení poţadovaného terapeutického účinku. U hospodářských zvířat můţe dojít k neočekávanému prodlouţení eliminace léčiva nebo jeho metabolitů, přičemţ tato xenobiotika mohou být přítomna v ţivočišných produktech. Změna aktivity některých biotransformačních enzymů můţe vyústit ve zvýšenou citlivost ke kontaminantám ţivotního prostředí, tím můţe být vyvolána patogeneze (Velík et al., 2004). S ohledem na výše zmíněné skutečnosti, indukční nebo inhibiční efekt je nezbytné monitorovat u všech uţívaných léčiv. Je třeba mít na paměti, ţe extrapolace dat získaných u člověka nebo laboratorních zvířat na jiné ţivočišné druhy je limitována v důsledku značných mezidruhových rozdílů v odpovědi na přítomnost induktoru či inhibitoru (Boobis et al., 1990).

61

3 CÍL PRÁCE Tato rigorózní práce je součástí projektu „Dikrocelióza hospodářských zvířat – obranné mechanismy motolice před účinky anthelmintik“ podporovaného Grantovou agenturou České republiky (grant 524/07/0611). Hlavním cílem této práce bylo zjistit, zda má dikrocelióza vliv na aktivitu biotransformačních enzymů u muflona a zda toto parazitární onemocnění ovlivňuje biotransformaci

sledovaných

benzimidazolových

anthelmintik

(albendazolu,

albendazolsulfoxidu a flubendazolu). Pro dosaţení stanoveného cíle bylo třeba:  připravit subcelulární frakce z jater zdravých muflonek a muflonek s dikroceliózou  stanovit koncentraci bílkovin v mikrosomální a cytosolické frakci jater zdravých a nemocných muflonek  stanovit kinetické parametry biotransformace ABZ, ABZSO a FLU in vitro v cytosolické a mikrosomální frakci jater zdravých a nemocných muflonek  vzájemně porovnat zjištěné kinetické parametry biotransformačních reakcí v cytosolu a v mikrosomech, z toho odvodit, v jaké subcelulární frakci probíhá biotransformace sledovaných anthelmintik intenzivněji  vzájemně porovnat zjištěné kinetické parametry biotransformačních reakcí zdravých muflonek a muflonek s dikroceliózou, z toho odvodit, zda dikrocelióza nějakým způsobem ovlivňuje metabolickou konverzi ABZ, ABZSO a FLU  zjistit vzájemný poměr tvořených enantiomerů chirálních metabolitů ABZSO a FLU-R a porovnat tento poměr ve skupině zdravých a nemocných muflonek

62

4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1 UŽITÝ MATERIÁL 4.1.1 Biologický materiál K provádění pokusů in vitro byly pouţity mikrosomální a cytosolické frakce připravené z jater zdravých a dikroceliózou postiţených samic muflona (Ovis musimon). Konkrétně byly k experimentu vyuţity tři zdravé samice muflona, staré 5-7 let. Dvě z nich pocházely z oblasti Janovice, třetí z lokality Velký Dub. Pro dosaţení cílů této práce bylo třeba získat také játra nemocných muflonek, infikovaných motolicí kopinatou. K pokusu byly vyuţity čtyři muflonky s dikroceliózou ve věku 5-7 let, které byly chovány v oboře Vlkov.

Obrázek 23. Samice muflona (Ovis musimon) (http://ro.wikipedia.org/wiki/Muflon). Tabulka 13. Označení zdravých a nemocných muflonek vyuţitých v experimentu. Zdravé muflonky

Nemocné muflonky

36 37 38

99 100 101 102

63

4.1.2 Pomůcky a přístroje Pomůcky:  laboratorní sklo (kádinky, odměrné baňky, odměrné válce, pipety), centrifugační kyvety, mikrozkumavky, stojánky na kyvety a mikrozkumavky, automatické pipety, multikanálová pipeta, pipetovací špičky, mikrotitrační destička, vialky, ledový blok, nádoba na led, stopky, inserty, váţenka, navaţovací kopist, magnetické míchadlo, buničinové čtverečky, parafilm, nůţky, lihový fix a další Přístroje a zařízení:  freezer Heraeus HeraFreeze  laboratorní předváţky OWA Labor  analytické váhy Scaltec SBC 22  laboratorní magnetická míchačka IKA Color Squid Hyrtel HTR 8068  digitální pH-metr Jenway LTD 3020  pístový homogenizátor Potter S  centrifuga Heraeus Biofuge Stratos – rotor #3335  ultracentrifuga Beckman Coulter  ultrazvuková lázeň Bandelin Sonorex  čtečka absorbance Biorad Microplate Reader 550  třepačka IKA MS2 Minishaker  centrifuga Eppendorf 5415D  termoblok Eppendorf Thermomixer Comfort  koncentrátor Eppendorf Concentrator 5301  vysokoúčinný kapalinový chromatograf Shimadzu 10 AVP  vysokoúčinný kapalinový chromatograf Thermo Electron

4.1.3 Chemikálie  set pro stanovení bílkovin s BCA - Sigma, ČR  albendazol - Sigma, ČR  albendazolsulfoxid - Toronto Research Chemicals, Kanada  flubendazol – Janssen, ČR  NADPH - Sigma, ČR

64  DMSO - Fluka, ČR  amoniak - Lachema, ČR  octan ethylnatý - Sigma, ČR  acetonitril pro kapalinovou chromatografii - Sigma, ČR  isopropylalkohol - Merck  běţné chemikálie čistoty p.a. - Penta, ČR; Lachema, ČR: Na2HPO4 ∙ 12H2O, NaH2PO4 ∙ 2H2O, KH2PO4, K2HPO4, NaClO4, HCl, NaOH, glycerol

4.2 METODIKA PRÁCE 4.2.1 Příprava subcelulárních frakcí Abychom mohli sledovat vliv dikroceliózy na aktivitu biotransformačních enzymů, bylo třeba získat játra nemocných i zdravých muflonek. Játra byla vyjmuta z dutiny břišní muflonek bezprostředně po jejich smrti. Levý lalok jaterní byl rozdělen na malé kousky, které byly následně zmraţeny tekutým dusíkem. Aţ do přípravy subcelulárních frakcích byly uchovávány v hlubokomrazícím boxu při -80ºC. Principem přípravy subcelulárních frakcí je rozrušení buněčné struktury a následné oddělení mikrosomů od cytosolu frakční ultracentrifugací. Postup práce:  Vzorky jater zdravých i nemocných muflonek byly vyndány z hlubokomrazícího boxu. Po mírném roztátí při laboratorní teplotě byly nastříhány na velmi malé kousky a rozváţeny do mističek po 5 g. Z jater kaţdého zvířete bylo naváţeno přibliţně 10 g (z kaţdé muflonky 2 x 5 g). Mističky se vzorky jater byly uloţeny na led. Homogenizace:  Vzorek jater byl z mističky přendán do pístového homogenizátoru Potter S (1500 otáček/min.), bylo přilito 15 ml sodnofosfátového pufru (0,1 M; pH 7,4). Homogenizace byla provedena pohybem pístu nahoru a dolů (celkem 3x), čímţ došlo k rozrušení buněčných stěn. Obsah homogenizátoru byl přelit do centifugační kyvety. Homogenizátor byl vypláchnut dalšími 15 ml pufru, pufr byl poté přilit k obsahu v kyvetě. Takto byly zhomogenizovány postupně všechny vzorky jater.

65 Centrifugace:  Centrifuga Heraeus byla nejprve vychlazena na 4ºC, poté v ní byly odstředěny kyvety se zhomnogenizovaným obsahem (5000 g, 20 min., 4ºC). Peletu z prvního točení tvořily potrhané buněčné membrány, vazivo, cévy, jádra.  Supernatant z prvního točení byl přelit do čistých kyvet a znovu odstředěn v téţe centrifuze (20000 g, 60 min., 4ºC). Po druhém stočení tvořily peletu usazenou na dně kyvet mitochondrie.  Supernatant z druhého točení byl opatrně přelit do kyvet pro ultracentrifugu Beckman a v ní následně ultracentrifugován (105000 g, 60 min., 4ºC).  Po ultracentrifugaci byla opatrně odebrána horní vrstva – cytosol. Poté byl cytosol rozpipetován za stálého míchání po 1,1 ml do řádně označených mikrozkumavek.  Peletu na dně kyvet po ultracentrifugaci tvořily mikrosomy. Pro jejich přečištění byla peleta resuspendována v 5 ml sodnofosfátového pufru malým homogenizačním pístem. Kyvety pak byly do tří čtvrtin doplněny pufrem, vyváţeny, uzavřeny, vloţeny do rotoru ultracentrifugy a znovu odstředěny (105000 g, 60 min., 4ºC).  Supernatant byl po ultracentrifugaci vylit a k peletě (přečištěné mikrosomy) bylo přidáno 5 ml sodnofosfátového pufru s 20% glycerolu. Peleta byla resuspendována homogenizačním pístem, poté byly mikrosomy slity do kádinek a pro dosaţení lepší homogenizace na chvíli vloţeny do ultrazvukové lázně. Za stálého míchání pak byly mikrosomy rozpipetovány do mikrozkumavek po 1,1 ml a 0,33 ml.  Mikrozkumavky s mikrosomy a cytosolem byly řádně označeny a zmraţeny. Aţ do dalšího zpracování byly uchovávány v hlubokomrazícím boxu při teplotě -80ºC.

4.2.2 Stanovení koncentrace bílkovin s využitím BCA Principem pouţité metody pro stanovení koncentrace bílkovin v připravených subcelulárních frakcích je reakce proteinů s měďnatými ionty (Cu2+) v alkalickém prostředí. Měď přechází na Cu+ ionty, které vytvářejí v prostředí o pH kolem 10 stabilní modrofialový komplex s BCA (bicinchoninovou kyselinou). Intenzita zbarvení je přímo úměrná mnoţství bílkoviny. Absorbance komplexu se proměřuje při vlnové délce λ = 562 nm (Smith et al., 1985). Před měřením byl připraven v čas potřeby pracovní roztok C smícháním komerčně dodávaných roztoků A a B v poměru 50:1.  Roztok A: NaHCO3, Na2CO3, BCA v 0,1 M NaOH  Roztok B: 4% roztok CuSO4 ∙ 6 H20

66 Nejprve byla sestrojena kalibrační křivka vyjadřující závislost absorbance na koncentraci bílkoviny. Tato závislost byla zjištěna proměřením absorbancí šesti připravených standardních roztoků o známé koncentraci bílkoviny. Jako standardní bílkovina byl pouţit hovězí sérový albumin (BSA). Roztoky byly připraveny z výchozího 0,1% roztoku BSA a redestilované vody (tab. 14). Tabulka 14. Sloţení roztoků pro kalibrační křivku. Označení

Konc. BSA v roztoku

0,1% roztok BSA

Redestilovaná voda

roztoku

[µg/ml]

[µl]

[µl]

1

0

0

500

2

200

100

400

3

400

200

300

4

600

300

200

5

800

400

100

6

1000

500

0

Kalibrační křivka je přímka, byla provedena lineární regrese a na základě zjištěných parametrů rovnice přímky a naměřených absorbancí byla vypočtena koncentrace bílkovin [mg/ml] v jednotlivých subcelulárních frakcích zdravých a nemocných muflonek. Postup práce:  Pro vlastní stanovení koncentrace bílkovin v připravených subcelulárních frakcích byly mikrosomy naředěny redestilovanou vodou 20x a cytosol 40x. Byla připravena vţdy dvě ředění kaţdé frakce (ze dvou různých mikrozkumavek s cytosolem či mikrosomy z téţe muflonky), z kaţdého ředění čtyři vzorky, celkem tedy osm paralelních vzorků pro měření koncentrace bílkoviny pro kaţdé mikrosomy a cytosol.  Do kaţdé z jamek mikrotitrační destičky bylo naneseno 10 µl vzorku bílkovin (naředěné mikrosomy, cytosol či kalibrační roztoky) a 200 µl pracovního roztoku C. U slepých vzorků bylo místo bílkovin naneseno 10 µl redestilované vody. Pro nanášení roztoku C byla pouţita multikanálová pipeta, do kaţdého jednoho sloupečku destičky (8 jamek) byl napipetován vţdy stejný vzorek.

67  Po promíchání sloţek v jamkách byla destička 30 minut inkubována při 37°C. Hodnoty absorbance byly změřeny při 562 nm na čtečce Biorad Microplate Reader, model 550. Jako nulová absorbance byla na přístroji nastavena hodnota absorbance destilované vody.  Výsledná hodnota absorbance kaţdého vzorku byla průměrem z 8 naměřených hodnot, od nichţ byl odečten průměr absorbance slepých vzorků.

4.2.3 Inkubace subcelulárních frakcí se sledovanými anthelmintiky Předmětem studia této práce jsou benzimidazolová anthelmintika albendazol, albendazolsulfoxid a flubendazol. Albendazol obsahuje v molekule atom síry, v organismu podstupuje dvoufázovou S-oxidaci. Nejprve vzniká albendazolsulfoxid, který je dále oxidován na albendazolsulfon. Tvorbu albendazolsulfoxidu katalyzují zejména FMO a CYP3A, druhý oxidační krok je katalyzován převáţně podrodinou cytochromů CYP1A (Velík et al., 2004). Flubendazol vzhledem k odlišné struktuře (ketoskupina v molekule) nepodléhá v organismu oxidaci, ale ubírá se redukční nebo hydrolytickou cestou biotransformace (http://www.emea.eu.int). Platí úměra mezi aktivitou biotransformačních enzymů a mnoţstvím substrátu (ABZ, ABZSO, FLU), které je za určitou časovou jednotku enzymaticky přeměněno na dané metabolity. Směsné vzorky mikrosomů a cytosolu zdravých a nemocných muflonek byly inkubovány se sledovanými anthelmintiky o různých koncentracích za přítomnosti koenzymu NADPH. Po inkubaci bylo zjišťováno mnoţství metabolitů vzniklých během reakce v inkubační směsi za vyuţití vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) (kapitola 4.2.4). Principem HPLC analýzy je dělení látek mezi stacionární fází naplněnou v koloně a mobilní fází procházející kolonou za vysokého tlaku. Z mnoţství jednotlivých metabolitů sledovaných anthelmintik vytvořených za 1 minutu byla stanovena aktivita biotransformačních enzymů. Zároveň byly zjišťovány kinetické parametry probíhajících reakcí. Zvyšuje-li se koncentrace substrátu [S], zatímco ostatní reakční podmínky zůstávají konstantní, pak naměřená rychlost reakce ν roste aţ k maximální hodnotě Vmax. Rychlost enzymové reakce roste se vzrůstající koncentrací substrátu aţ do okamţiku, kdy je enzym „nasycen“ substrátem. Po dosaţení maximální hodnoty Vmax jiţ není rychlost dalším růstem koncentrace substrátu ovlivněna, protoţe substrát je oproti enzymu přítomen ve velkém molárním nadbytku.

68 Koncentrace substrátu, při níţ reakce probíhá polovinou maximální rychlosti, se nazývá Michaelisova konstanta (Km). Hodnota Km má praktické vyuţití k odhadu afinity enzymu k substrátu. Platí, ţe čím menší je hodnota Km, tím vyšší je afinita. Chování mnoha enzymů při změně koncentrace substrátu popisuje rovnice, kterou odvodili Michaelis a Mentenová:



Vmax  S  K m  S 

ν…počáteční rychlost enzymově katalyzované reakce Vmax…maximální rychlost reakce [S]…koncentrace substrátu Kinetické parametry Vmax a Km se stanovují grafickými technikami nebo se vyuţívá počítačových programů. Mnohé enzymy neposkytují saturační křivku, která by dovolovala určení Vmax a Km z grafu závislosti ν na [S]. Je výhodné převést rovnici Michaelise-Mentenové na reciproké hodnoty, čímţ získáme lineární závislost 1/ν na 1/[S]:

1





Km 1 1   Vmax S  Vmax

Graf závislosti 1/ν na 1/[S] se nazývá Lineweaverův-Burkův nebo také dvojitě reciproký. Směrnice přímky je Km/Vmax. Průsečík přímky s osou y odpovídá hodnotě 1/Vmax, průsečík s osou x hodnotě -1/Km (Murray et al., 2001). Z výsledků HPLC byly sestrojeny grafy dle Michaelise-Mentenové a dle Lineweavera-Burka jednak pro mikrosomální frakci a jednak pro cytosolickou frakci zdravých a nemocných muflonek pro kaţdý substrát (ABZ, ABZSO, FLU). Pomocí počítačového programu GraphPad Prism 5.00 byly stanoveny hodnoty zdánlivých kinetických parametrů Km a Vmax pro kaţdé sledované anthelmintikum.

69 Postup práce:  Nejprve byly připraveny zásobní roztoky substrátů (ABZ, ABZSO, FLU) v dimethylsulfoxidu o vzrůstající koncentraci (tab. 15) a zásobní 3mM vodný roztok NADPH (2,37 mg NADPH/ml redestilované vody). Sodnofosfátový pufr o pH 7,4 byl připraven z vodných 0,1M roztoků Na2HPO4 a NaH2PO4. Tabulka 15. Koncentrace připravených zásobních roztoků ABZ, ABZSO a FLU a jejich výchozí koncentrace v inkubační směsi. Konc. zásobních roztoků

Výchozí konc. ABZ, ABZSO a FLU

ABZ, ABZSO a FLU

v inkubační směsi

[μmol/l]

[μmol/l]

0

0

50

0,5

100

1,0

250

2,5

500

5,0

1000

10,0

2500

25,0

 Slitím vzorků jednotlivých cytosolických frakcí zdravých muflonek (36, 37, 38) byl připraven směsný cytosol zdravých zvířat, slitím vzorků jednotlivých cytosolických frakcí nemocných muflonek (99, 100, 101, 102) vznikl směsný cytosol nemocných zvířat. Obdobně byly připraveny směsné mikrosomy zdravých a nemocných muflonek.  Inkubace probíhala v označených mikrozkumavkách. Byla provedena čtyři paralelní měření pro kaţdou koncentraci daného substrátu. Sloţení inkubační směsi je uvedeno v tabulce 16. Celkový objem inkubační směsi v mikrozkumavce byl 300µl, výchozí koncentrace substrátů v inkubační směsi jsou uvedeny v tabulce 15. Připravené zásobní roztoky a směsné subcelulární frakce byly během měření uchovávány v ledové lázni.

70 Tabulka 16. Sloţení inkubační směsi o celkovém objemu 300 μl. Jednotlivé složky inkubační směsi 3 µl zásobního roztoku substrátu 97 µl sodnofosfátového pufru (0,1 M; pH 7,4) 100 µl zásobního roztoku NADPH (3mM) 100 µl směsného cytosolu / směsných mikrosomů  Do mikrozkumavek byl napipetován uvedený objem zásobního roztoku substrátu (ABZ, ABZSO, FLU) o dané koncentraci, sodnofosfátového pufru a zásobního roztoku NADPH.  Mikrozkumavky byly přendány do termobloku předehřátého na 37ºC.  Vlastní enzymová reakce byla odstartována přidáním 100 µl mikrosomů či cytosolu. Všechny mikrozkumavky byly uzavřeny a poté za stálého třepání (500 RPM) inkubovány 60 minut při 37°C.  Inkubace byla ukončena přidáním 30 µl koncentrovaného amoniaku a ochlazením inkubační směsi na 0°C v ledové lázni. Směs byla po přidání amoniaku promíchána.  Následujícím krokem byla extrakce lipofilních látek ze směsi do octanu ethylnatého. Ke kaţdému vzorku bylo přidáno 700 μl octanu ethylnatého a poté byly mikrozkumavky 2 minuty intenzivně protřepávány na třepačce. Pro oddělení vodné a octanové fáze byly vzorky centrifugovány (5 000 otáček/min, 3 min). Horní octanová vrstva (600 μl) byla pipetou přenesena do označených vialek.  Extrakty pak byly odpařeny v koncentrátoru do sucha (při 45°C asi 20 min). Suché vzorečky byly uchovávány aţ do HPLC analýzy v chladu a temnu.

Obdobně byly připraveny a následně inkubovány také chemické slepé vzorky, které v reakční směsi neobsahovaly mikrosomy ani cytosol, a biologické slepé vzorky s nulovou koncentrací substrátu. Důvodem jejich přípravy bylo potvrzení správného průběhu inkubace a HPLC analýzy a zjištění neenzymatické přeměny sledovaných anthelmintik.

71

4.2.4 HPLC analýza anthelmintik a jejich metabolitů Směsné mikrosomy a směsný cytosol zdravých a nemocných muflonek byly inkubovány s různými koncentracemi sledovaných anthelmintik. Po inkubaci a následné extrakci lipofilních látek do octanu ethylnatého byla provedena HPLC analýza parentních látek a jejich metabolitů. Jednotlivé metabolity byly identifikovány na základě retenčních časů referenčních látek (tab. 17). Tabulka 17. Retenční časy sledovaných anthelmintik a jejich metabolitů za daných chromatografických podmínek. Látka

Retenční čas (tR)

ABZSO ABZSO2 ABZ (-)-ABZSO (+)-ABZSO

5,3 min. 7,4 min. 17,3 min. 6,3 min. 18,6 min.

FLU-H FLU-R FLU (-)-FLU-R (+)-FLU-R

5,2 min. 6,2 min. 23,3 min. 13,9 min. 16,5 min.

4.2.4.1 Achirální HPLC HPLC analýza vzorků inkubovaných s ABZ a ABZSO  Před vlastním provedením HPLC byly odparky rozpuštěny ve 400 µl mobilní fáze. Mobilní fázi tvořila směs acetonitrilu (ACN) a fosfátového pufru (0,025 M KH2PO4; pH 3) v poměru 1:2 v/v.  HPLC byla provedena na přístroji Shimadzu 10 AVP. Byla pouţita kolona LiChroCART® (250x3 mm) s náplní LiChrospher® 60 RP-select B (5 μm) a předkolonka LiChroCART® (4x4 mm) se stejnou stacionární fází. Průtok mobilní fáze kolonou byl nastaven na 0,5 ml/min. Analýza probíhala za tlaku 14,3 MPa a při teplotě 25°C. Jednotlivé sloţky vzorku separované v koloně byly detekovány fluorescenčním detektorem Shimadzu RF-10 AXL (λex = 290 nm, λem = 320 nm).  Nástřik na kolonu byl 50 µl vzorku.

72

Obrázek 24. Ukázka HPLC chromatogramu dělení albendazolu a jeho metabolitů albendazolsulfoxidu a albendazolsulfonu.

HPLC analýza vzorků inkubovaných s FLU  Před vlastní HPLC analýzou byly odparky rozpuštěny v mobilní fázi. Mobilní fázi tvořila směs acetonitrilu (ACN) a fosfátového pufru (0,025 M KH2PO4; pH 3) v poměru 3:7 v/v.  HPLC byla provedena na přístroji Shimadzu 10 AVP. Byla pouţita kolona LiChroCART® (250x3 mm) s náplní LiChrospher® 60 RP-select B (5 μm) a předkolonka LiChroCART® (4x4 mm) se stejnou stacionární fází. Průtok mobilní fáze kolonou byl nastaven na 1,0 ml/min. Analýza probíhala za tlaku 12,5 MPa při teplotě 25°C. Jednotlivé sloţky vzorku separované v koloně byly detekovány fluorescenčním detektorem Shimadzu RF-10 AXL (λex = 290 nm, λem = 320 nm).

73

Obrázek 25. Ukázka HPLC chromatogramu dělení flubendazolu a jeho metabolitů desethykarboxyflubendazolu (FLU-H) a redukovaného flubendazolu (FLU-R).

4.2.4.2 Chirální HPLC Chirální HPLC analýza enantiomerů ABZSO  Při achirálním dělení byl separován ABZSO a přenesen do vialky. Poté byla mobilní fáze odpařena v koncentrátoru.  Před

vlastním

ve 200 µl mobilní

provedením fáze.

chirální

Mobilní

fázi

HPLC tvořil

byly

odparky

rozpuštěny

0,2% isopropylalkohol

(IPA)

v sodnofosfátovém pufru (0,01 M NaH2PO4 a Na2HPO4 ; pH 6,9).  Chirální HPLC byla provedena na přístroji Shimadzu 10 AVP. Byla pouţita kolona AGP Chiral (150x4 mm). Průtok mobilní fáze kolonou byl nastaven na 0,9 ml/min. Analýza probíhala za tlaku 12,3 MPa a při teplotě 25°C. Jednotlivé enantiomery ABZSO byly detekovány fluorescenčním detektorem Shimadzu RF-10 AXL (λex = 290 nm, λem = 320 nm).  Nástřik na kolonu byl 100 µl vzorku.

74 Chirální HPLC analýza enantiomerů FLU-R  Před vlastním provedením chirální HPLC byly odparky rozpuštěny v mobilní fázi. Mobilní fázi tvořila směs methanolu

a 1 M vodného roztoku NaClO4

v poměru 3:1 v/v, pH 6,7.  Chirální HPLC byla provedena na chromatografu Thermo Electron. Byla pouţita chromatografická kolona Diacel® (250x4,6 mm) s náplní Chiralcel OD-R. Průtok mobilní fáze kolonou byl nastaven na 0,5 ml/min. Analýza probíhala při teplotě 25°C. Jednotlivé enantiomery FLU-R byly detekovány fluorescenčním detektorem FL3000 (λex = 290 nm, λem = 320 nm).

4.2.5 Statistické zhodnocení výsledků Rozdíly mezi zjištěnými hodnotami koncentrace bílkovin v mikrosomech nebo cytosolu zdravých muflonek a muflonek s dikroceliózou byly statisticky zhodnoceny nepárovým Studentovým t-testem se spolehlivostí 0,95. Stejnou metodou byly statisticky srovnávány i zdánlivé kinetické parametry (Km a Vmax)

biotransformačních

reakcí

ve skupině zdravých a nemocných muflonek.

jednotlivých

sledovaných

anthelmintik

75

5 VÝSLEDKY 5.1 STANOVENÍ KONCENTRACE BÍLKOVIN Při zjišťování koncentrace bílkovin v mikrosomech a cytosolu připravených z jater zdravých a nemocných muflonek bylo postupováno výše popsaným způsobem (kapitola 4.2.2). Bylo potřeba nejprve sestrojit kalibrační křivku vyjadřující závislost absorbance na koncentraci bílkoviny. Byly proměřovány absorbance připravených roztoků BSA o známé koncentraci. Kalibrační křivka byla sestrojena metodou lineární regrese (obr. 26).

1,000 0,900 0,800

Absorbance

0,700 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

koncentrace bílkovin [µg/ml]

Obrázek 26. Kalibrační křivka. Rovnice získané přímky je y = 0,000741x s hladinou spolehlivosti R2 = 0,987822.

U jednotlivých vzorků mikrosomů a cytosolu byla změřena absorbance, od naměřených hodnot byla odečtena průměrná absorbance slepých vzorků a z parametrů rovnice přímky byly vypočítány koncentrace bílkovin v jednotlivých mikrosomálních a cytosolických frakcích.

76 Střední hodnoty zjištěných koncentrací bílkovin v jednotlivých vzorcích mikrosomů nemocných a zdravých muflonek jsou uvedeny v tabulce 18. Průměrná koncentrace bílkovin v mikrosomech nemocných zvířat je 12,428 ± 0,935 mg/ml, v mikrosomech zdravých zvířat 13,525 ± 0,694 mg/ml. Tabulka 18. Koncentrace bílkovin [mg/ml] v mikrosomální frakci zdravých a nemocných muflonek. Mikrosomální frakce

Nemocné muflonky

Zdravé muflonky

99 100 101 102 průměr 36 37 38 průměr

Absorbance 0,491 ± 0,025 0,570 ± 0,029 0,506 ± 0,011 0,512 ± 0,013 0,560 ± 0,022 0,586 ± 0,029 0,534 ± 0,030

Konc. bílkovin [mg/ml] 11,649 ± 0,664 13,784 ± 0,777 12,057 ± 0,299 12,223 ± 0,343 12,428 ± 0,935 13,530 ± 0,602 14,216 ± 0,774 12,828 ± 0,811 13,525 ± 0,694

Střední hodnoty zjištěných koncentrací bílkovin v jednotlivých vzorcích cytosolu nemocných a zdravých muflonek jsou uvedeny v tabulce 19. Průměrná koncentrace bílkovin v cytosolu nemocných muflonek je 14,870 ± 0,437 mg/ml, zatímco u zdravých zvířat je průměrná koncentrace bílkovin 17,611 ± 0,297 mg/ml. Tabulka 19. Koncentrace bílkovin [mg/ml] v cytosolické frakci zdravých a nemocných muflonek. Cytosolická frakce

Nemocné muflonky

Zdravé muflonky

99 100 101 102 průměr 36 37 38 průměr

Absorbance 0,358 ± 0,033 0,356 ± 0,021 0,354 ± 0,023 0,372 ± 0,028 0,406 ± 0,026 0,417 ± 0,026 0,410 ± 0,032

Konc. bílkovin [mg/ml] 14,740 ± 1,756 14,675 ± 1,148 14,551 ± 1,226 15,516 ± 1,522 14,870 ± 0,437 17,344 ± 1,405 17,931 ± 1,425 17,559 ± 1,750 17,611 ± 0,297

77 Graficky jsou střední hodnoty zjištěných koncentrací bílkovin v jednotlivých mikrosomálních a cytosolických frakcích zdravých a nemocných muflonek znázorněny na obrázcích 27 a 28.

Koncentrace bílkovin [mg/ml].

20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 99

100

101

102

36

37

38

Obrázek 27. Grafické znázornění koncentrace bílkovin v jaterní mikrosomální frakci nemocných (99, 100, 101, 102) a zdravých (36, 37, 38) muflonek.

.

Koncentrace bílkovin [mg/ml]

20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 99

100

101

102

36

37

38

Obrázek 28. Grafické znázornění koncentrace bílkovin v jaterní cytosolické frakci nemocných (99, 100, 101, 102) a zdravých (36, 37, 38) muflonek.

78 Bylo statisticky prokázáno pomocí Studentova t-testu se spolehlivostí 0,95, ţe střední hodnoty koncentrací bílkovin v cytosolických frakcích zdravých muflonek jsou vyšší neţ u muflonek s dikroceliózou. Koncentrace bílkovin v mikrosomech nemocných a zdravých zvířat se vzájemně výrazně neliší. Koncentrace bílkovin byla celkově vyšší v cytosolu neţ v mikrosomech.

5.2 BIOTRANSFORMACE ANTHELMINTIK Po inkubaci mikrosomálních a cytosolických frakcí s ABZ, ABZSO a FLU a následné extrakci vzniklých metabolitů do octanu ethylnatého byla provedena HPLC analýza. Postup práce při inkubaci a HPLC byl popsán v kapitolách 4.2.3 a 4.2.4. Výstupem z HPLC analýzy jednotlivých vzorků bylo mnoţství metabolitu vytvořené během 60 minut inkubace se substrátem. Rychlost proběhlé biotrasformační reakce byla vyjádřena jako látkové mnoţství daného metabolitu vzniklé katalýzou enzymů v jednom mililitru mikrosomů či cytosolu za jednu minutu reakce [pmol/ml/min]. Takto získané hodnoty byly vztaţeny na koncentraci bílkovin v mikrosomech či cytosolu, čímţ byla vyjádřena specifická aktivita enzymů [pmol/min/mg] podílejících se na biotransformaci sledovaných anthelmintik.

5.2.1 Biotransformace albendazolu v mikrosomech Albendazol

byl

v průběhu

inkubace

oxidován

v prvním

kroku

na albendazolsulfoxid, v následujícím kroku na albendazolsulfon. HPLC analýzou byla detekována jednak parentní látka a jednak oba metabolity. V tabulkách 20 a 21 jsou uvedeny rychlosti, jakými probíhala oxidace ABZ na ABZSO při sledovaných koncentracích ABZ (substrátu) a specifické aktivity enzymů katalyzujících přeměnu ABZ na ABZSO v mikrosomální frakci zdravých a nemocných muflonek. Molekulární hmotnost ABZSO je Mr = 281 g/mol.

79

Tabulka 20. Enzymová kinetika konverze ABZ na ABZSO v mikrosomální frakci zdravých muflonek. Mikrosomy zdravých muflonek Koncentrace ABZ

ABZSO

Rychlost rce

Specifická enzymová

[μmol/l]

[ng/ml/min]

[pmol/ml/min]

aktivita [pmol/min/mg]

0

0

0

0

0,5

3,08 ± 0,16

10,95 ± 0,56

0,81 ± 0,04

1,0

5,27 ± 0,63

18,74 ± 2,25

1,39 ± 0,17

2,5

14,31 ± 1,88

50,94 ± 6,69

3,77 ± 0,49

5,0

28,35 ± 3,29

100,87 ± 11,69

7,46 ± 0,86

10,0

52,67 ± 8,62

178,42 ± 30,67

13,86 ± 2,27

25,0

109,03 ± 2,62

388,00 ± 9,31

28,69 ± 0,69

Tabulka 21. Enzymová kinetika konverze ABZ na ABZSO v mikrosomální frakci nemocných muflonek. Mikrosomy nemocných muflonek Koncentrace ABZ

ABZSO

Rychlost reakce

Specifická enzymová

[μmol/l]

[ng/ml/min]

[pmol/ml/min]

aktivita [pmol/min/mg]

0

0

0

0

0,5

3,68 ± 1,08

13,10 ± 3,83

1,05 ± 0,31

1,0

5,76 ± 0,24

20,48 ± 0,83

1,65 ± 0,07

2,5

15,08 ± 2,09

53,65 ± 7,44

4,32 ± 0,60

5,0

31,98 ± 2,47

113,80 ± 8,79

9,16 ± 0,71

10,0

58,44 ± 16,80

207,97 ± 59,80

16,73 ± 4,81

25,0

108,41 ± 8,05

385,80 ± 28,65

31,04 ± 2,31

Závislost aktivity biotransformačních enzymů oxidujících ABZ na ABZSO v mikrosomální frakci jater zdravých a nemocných muflonek na koncentraci substrátu (ABZ) je graficky znázorněna na obrázku 29. Tato závislost je nelineární. Specifická enzymová aktivita v mikrosomech nemocných muflonek byla vyšší neţ v mikrosomech muflonek zdravých.

Specifická enzymová aktivita [pmol/min/mg].

80

35 30 25 20 15 zdravé

10

nemocné

5 0 0

5

10

15

20

25

Koncentrace ABZ [μmol/l] Obrázek 29. Grafické znázornění závislosti aktivity mikrosomálních enzymů konvertujících ABZ na ABZSO na výchozí koncentraci substrátu (ABZ) v inkubační směsi. Tabulky 22 a 23 uvádí specifické aktivity mikrosomálních enzymů podílejících se na druhé fázi oxidace albendazolu, a to na přeměně ABZSO (vzniklého oxidací ABZ) na ABZSO2. Molekulární hmotnost ABZSO2 je Mr = 297 g/mol.

Tabulka 22. Enzymová kinetika konverze ABZSO (vzniklého oxidací ABZ) na ABZSO2 v mikrosomální frakci zdravých muflonek. Mikrosomy zdravých muflonek Koncentrace ABZ

ABZSO2

Rychlost rce

Specifická enzymová

[μmol/l]

[ng/ml/min]

[pmol/ml/min]

aktivita [pmol/min/mg]

0

0

0

0

0,5

0,05 ± 0,01

0,16 ± 0,02

0,012 ± 0,002

1,0

0,07 ± 0,01

0,22 ± 0,02

0,017 ± 0,001

2,5

0,15 ± 0,01

0,51 ± 0,03

0,038 ± 0,002

5,0

0,29 ± 0,01

0,97 ± 0,05

0,072 ± 0,004

10,0

0,43 ± 0,04

1,45 ± 0,13

0,107 ± 0,010

25,0

0,95 ± 0,08

3,21 ± 0,27

0,237 ± 0,020

81 Tabulka 23. Enzymová kinetika konverze ABZSO (vzniklého oxidací ABZ) na ABZSO2 v mikrosomální frakci nemocných muflonek. Mikrosomy nemocných muflonek Koncentrace ABZ

ABZSO2

Rychlost rce

Specifická enzymová

[μmol/l]

[ng/ml/min]

[pmol/ml/min]

aktivita [pmol/min/mg]

0

0

0

0

0,5

0,05 ± 0,02

0,18 ± 0,07

0,015 ± 0,006

1,0

0,07 ± 0,01

0,23 ± 0,03

0,018 ± 0,002

2,5

0,14 ± 0,02

0,47 ± 0,06

0,038 ± 0,005

5,0

0,26 ± 0,01

0,87 ± 0,04

0,070 ± 0,003

10,0

0,42 ± 0,13

1,40 ± 0,43

0,113 ± 0,035

25,0

0,74 ± 0,24

2,50 ± 0,81

0,202 ± 0,065

Závislost aktivity mikrosomálních enzymů oxidujících ABZSO na ABZSO2 na výchozí koncentraci ABZ je znázorněna na obrázku 30. Enzymová aktivita

0,5 zdravé nemocné

0,4

.

Specifická enzymová aktivita [pmol/min/mg]

u zdravých muflonek je zobrazena růţovou barvou, u nemocných muflonek modrou.

0,3 0,2 0,1 0,0 0

5

10

15

20

25

Koncentrace ABZ [μmol/l]

Obrázek 30. Grafické znázornění závislosti aktivity mikrosomálních enzymů konvertujících ABZSO na ABZSO2 na výchozí koncentraci substrátu (ABZ) v inkubační směsi.

82 Z grafu je patrné, ţe oxidace ABZSO na ABZSO2 v mikrosomech zdravých a nemocných muflonek probíhá přibliţně stejnou rychlostí, která je však v porovnání s rychlostí oxidace ABZ na ABZSO podstatně niţší. Názorněji ukazuje rozdíl v rychlosti obou reakcí obrázek 31. Modře a růţově je znázorněna oxidace ABZ na ABZSO u zdravých a nemocných muflonek, zeleně je znázorněna přeměna ABZSO na ABZSO2, která probíhá u zdravých a nemocných muflonek bez významného rozdílu.

.

Specifická enzymová aktivita [pmol/min/mg]

ABZSO zdravé

ABZSO nemocné

ABZSOO zdravé a nemocné

35 30 25 20 15 10 5 0 0

5

10

15

20

25

Koncentrace ABZ [μmol/l] Obrázek 31. Porovnání rychlosti prvního a druhého kroku v S-oxidaci ABZ v mikrosomální frakci jater muflonek zdravých a muflonek s dikroceliózou.

5.2.2 Biotransformace albendazolsulfoxidu v mikrosomech Albendazolsulfoxid (pouţitý jako substrát) byl během inkubace konvertován na albendazolsulfon. HPLC analýzou byl detekován jednak původní substrát ABZSO a jednak jeho S-oxidovaný metabolit ABZSO2. ABZ byl detekován v zanedbatelném mnoţství srovnatelném se slepými vzorky, z čehoţ lze usuzovat, ţe ABZSO není mikrosomálními enzymy zpětně redukován na ABZ. V tabulkách 24 a 25 jsou uvedeny rychlosti, jakými probíhala oxidace ABZSO na ABZSO2 při sledovaných koncentracích substrátu (ABZSO) a specifické aktivity mikrosomálních enzymů katalyzujících oxidaci ABZSO u zdravých a nemocných muflonek. Molekulární hmotnost ABZSO2 je Mr = 297 g/mol.

83 Tabulka 24. Enzymová kinetika konverze ABZSO (jako výchozího substrátu) na ABZSO2 v mikrosomální frakci zdravých muflonek. Mikrosomy zdravých muflonek Konc. ABZSO

ABZSO2

Rychlost rce

Specifická enzymová

[μmol/l]

[ng/ml/min]

[pmol/ml/min]

aktivita [pmol/min/mg]

0

0

0

0

0,5

0,14 ± 0,01

0,46 ± 0,03

0,034 ± 0,002

1,0

0,23 ± 0,02

0,76 ± 0,07

0,056 ± 0,005

2,5

0,47 ± 0,08

1,59 ± 0,26

0,118 ± 0,019

5,0

0,99 ± 0,06

3,34 ± 0,21

0,247 ± 0,016

10,0

2,17 ± 0,40

7,31 ± 1,34

0,540 ± 0,099

25,0

3,55 ± 0,12

11,95 ± 0,42

0,883 ± 0,031

Tabulka 25. Enzymová kinetika konverze ABZSO (jako výchozího substrátu) na ABZSO2 v mikrosomální frakci nemocných muflonek. Mikrosomy nemocných muflonek Konc. ABZSO

ABZSO2

Rychlost rce

Specifická enzymová

[μmol/l]

[ng/ml/min]

[pmol/ml/min]

aktivita [pmol/min/mg]

0

0

0

0

0,5

0,11 ± 0,01

0,37 ± 0,04

0,030 ± 0,004

1,0

0,23 ± 0,04

0,78 ± 0,15

0,063 ± 0,012

2,5

0,53 ± 0,18

1,79 ± 0,61

0,144 ± 0,049

5,0

0,71 ± 0,04

2,40 ± 0,12

0,193 ± 0,009

10,0

2,03 ± 0,62

6,83 ± 2,10

0,549 ± 0,169

25,0

3,31 ± 0,21

11,16 ± 0,71

0,898 ± 0,057

Pro názornější srovnání průběhu oxidace ABZSO v mikrosomální frakci jater jednak zdravých a jednak nemocných muflonek byl sestrojen graf (obr. 32). Z grafu je patrné, ţe aktivita mikrosomálních enzymů konvertujících ABZSO na ABZSO2 je ve skupině nemocných muflonek přibliţně na stejné úrovni jako ve skupině zdravých muflonek, rozdíl je zanedbatelný.

Specifická enzymová aktivita [pmol/min/mg]

84

1,2 1,0 0,8 0,6

zdravé

0,4

nemocné

0,2 0,0 0

5

10

15

20

25

Koncentrace ABZSO [μmol/l]

Obrázek 32. Grafické znázornění závislosti aktivity mikrosomálních enzymů konvertujících ABZSO na ABZSO2 na výchozí koncentraci substrátu (ABZSO) v inkubační směsi.

Ze srovnání rychlosti oxidace ABZ na ABZSO a rychlosti konverze ABZSO na ABZSO2 vyplývá, ţe první krok v oxidaci ABZ probíhá daleko rychleji neţ druhá reakce – oxidace ABZSO. Aktivita mikrosomálních enzymů katalyzujících tvorbu ABZSO z ABZ se pohybuje řádově v desítkách pmol/min/mg proteinu, zatímco aktivita mikrosomálních

enzymů

katalyzujících

S-oxidaci

ABZSO

v desetinách

pmol/min/mg proteinu (při stejných výchozích koncentracích substrátů). Dobře viditelný je tento rozdíl na obrázku 33. Modře a růţově je znázorněna rychlost oxidace ABZ na ABZSO u zdravých a nemocných muflonek, oranţově je znázorněna rychlost oxidace ABZSO jako výchozího substrátu na ABZSO2, která probíhá u zdravých a nemocných muflonek jen se zanedbatelným rozdílem. Ze srovnání enzymové kinetiky S-oxidace ABZSO jednak vzniklého oxidací ABZ a jednak pouţitého jako výchozí substrát reakce je patrné, ţe ABZSO2 je tvořen téměř ve stejném mnoţství, ať je pouţit jako výchozí substrát ABZ nebo ABZSO (obr. 31 a 33).

85

Specifická enzymová aktivita [pmol/min/mg]

ABZSO zdravé

ABZSO nemocné

ABZSOO zdravé a nemocné

35 30 25 20 15 10 5 0 0

5

10

15

20

25

Koncentrace substrátu [μmol/l]

Obrázek 33. Porovnání průběhu oxidace ABZ a ABZSO jako výchozích substrátů v mikrosomech zdravých a nemocných muflonek.

5.2.3 Biotransformace albendazolu a albendazolsulfoxidu v cytosolu Jak jiţ bylo zmíněno v kapitole o albendazolu (kapitola 2.3.4.7), cesta jeho biotransformace se ubírá dvoustupňovou S-oxidací. Na oxidaci ABZ se podílejí zejména cytochromy podrodiny CYP3A a flavinové monooxygenázy, oxidaci ABZSO katalyzuje podrodina CYP1A. Všechny tyto enzymy jsou lokalizovány v mikrosomech. Na základě této skutečnosti lze usuzovat, ţe po inkubaci cytosolické frakce s ABZ nebo s ABZSO bude HPLC analýzou detekováno jen nepatrné mnoţství metabolitů (ABZSO a ABZSO2). Získané výsledky potvrdily předpoklad, ţe v cytosolu nejsou ABZ ani ABZSO přeměňovány na své S-oxidované metabolity. Mnoţství detekovaných metabolitů v cytosolu odpovídalo hodnotám slepých vzorků. Po inkubaci cytosolické frakce s ABZSO byl také ABZ detekován pouze v zanedbatelném mnoţství srovnatelném se slepými vzorky, z čehoţ lze usuzovat, ţe ABZSO není cytosolickými enzymy zpětně redukován na ABZ.

86

5.2.4 Biotransformace flubendazolu v mikrosomech Flubendazol je in vivo odbouráván redukcí ketoskupiny nebo hydrolýzou karbamátu. Po inkubaci mikrosomů s FLU byla HPLC analýzou detekována jednak parentní látka a jednak redukovaný metabolit FLU-R. Hydrolyzovaný metabolit FLU-H ve vzorcích nebyl zjištěn. V tabulkách 26 a 27 je uveden přehled rychlostí redukční reakce při sledovaných výchozích koncentracích substrátu (FLU). Jsou zde také uvedeny specifické aktivity enzymů katalyzujících redukci FLU v mikrosomální frakci jater zdravých muflonek a muflonek s dikroceliózou. Tabulka 26. Enzymová kinetika redukce ketoskupiny FLU v mikrosomální frakci jater zdravých muflonek. Mikrosomy zdravých muflonek Koncentrace FLU

Rychlost reakce

Specifická enzymová

[μmol/l] 0 0,5

[pmol/ml/min] 0 0,76 ± 0,21

aktivita [pmol/min/mg] 0 0,056 ± 0,015

1,0

1,71 ± 0,38

0,127 ± 0,028

2,5

2,53 ± 0,64

0,187 ± 0,047

5,0

5,25 ± 0,66

0,388 ± 0,049

10,0

9,23 ± 2,75

0,682 ± 0,203

25,0

13,67 ± 0,73

1,011 ± 0,054

Tabulka 27. Enzymová kinetika redukce ketoskupiny FLU v mikrosomální frakci jater muflonek s dikroceliózou. Mikrosomy nemocných muflonek Koncentrace FLU

Rychlost reakce

Specifická enzymová

[μmol/l] 0 0,5

[pmol/ml/min] 0 0,77 ± 0,07

aktivita [pmol/min/mg] 0 0,062 ± 0,006

1,0

0,93 ± 0,46

0,075 ± 0,037

2,5

2,09 ± 0,37

0,168 ± 0,030

5,0

3,37 ± 0,63

0,271 ± 0,051

10,0

5,30 ± 0,37

0,426 ± 0,030

25,0

10,06 ± 1,88

0,809 ± 0,151

87 Pro snadnější a názornější srovnání rychlosti redukce FLU v jaterních mikrosomech zdravých muflonek a muflonek infikovaných motolicí kopinatou poslouţí obrázek 34, který zobrazuje průběh reakce ve skupině zdravých a nemocných zvířat.

Specifická enzymová aktivita [pmol/min/mg]

1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 zdravé

0,2

nemocné

0,0 0

5

10

15

20

25

Koncentrace FLU [μmol/l] Obrázek 34. Grafické znázornění závislosti aktivity mikrosomálních enzymů konvertujících FLU na redukovaný metabolit FLU-R na výchozí koncentraci substrátu (FLU) v inkubační směsi. Z obrázku 34 je patrné, ţe aktivita enzymů katalyzujících redukci ketoskupiny v molekule FLU v mikrosomální frakci zdravých muflonek je vyšší neţ v mikrosomální frakci muflonek s dikroceliózou.

5.2.5 Biotransformace flubendazolu v cytosolu Flubendazol byl během inkubace s cytosolickou frakcí zdravých a nemocných muflonek redukován na hydroxymetabolit FLU-R. HPLC analýzou byl detekován jednak substrát (FLU) a jednak jeho redukovaný metabolit FLU-R. Hydrolyzovaný metabolit FLU-H nebyl ve vzorcích detekován. V tabulkách 28 a 29 jsou uvedeny rychlosti, jakými probíhala redukce FLU při sledovaných koncentracích substrátu a specifické aktivity cytosolických enzymů katalyzujících redukci FLU u zdravých a nemocných muflonek.

88

Tabulka 28. Enzymová kinetika redukce ketoskupiny FLU v cytosolické frakci jater zdravých muflonek. Cytosol zdravých muflonek Koncentrace FLU

Rychlost reakce

Specifická enzymová

[μmol/l]

[pmol/ml/min]

aktivita [pmol/min/mg]

0

0

0

0,5

12,56 ± 2,86

0,929 ± 0,211

1,0

30,36 ± 2,57

2,245 ± 0,190

2,5

39,03 ± 0,95

2,886 ± 0,070

5,0

69,45 ± 15,16

5,135 ± 1,121

10,0

117,97 ± 36,05

13,159 ± 2,666

25,0

315,00 ± 50,66

23,290 ± 3,746

Tabulka 29. Enzymová kinetika redukce ketoskupiny FLU v cytosolické frakci jater muflonek s dikroceliózou. Cytosol nemocných muflonek Koncentrace FLU

Rychlost reakce

Specifická enzymová

[μmol/l]

[pmol/ml/min]

aktivita [pmol/min/mg]

0

0

0

0,5

10,50 ± 1,02

0,845 ± 0,082

1,0

21,70 ± 1,44

1,746 ± 0,116

2,5

28,04 ± 9,21

2,256 ± 0,741

5,0

91,09 ± 37,95

7,329 ± 3,054

10,0

142,18 ± 47,00

11,440 ± 3,782

25,0

262,93 ± 39,29

21,157 ± 3,162

Graficky je zobrazen průběh redukce ketoskupiny FLU na hydroxyskupinu na obrázku 35. Porovnává aktivitu cytosolických redukčních enzymů ve skupině zdravých a nemocných muflonek.

89

Specifická enzymová aktivita [pmol/min/mg]

30 zdravé

25

nemocné

20 15 10 5 0 0

5

10

15

20

25

Koncentrace FLU [μmol/l]

Obrázek

35.

Grafické znázornění

závislosti

aktivity cytosolických enzymů

konvertujících FLU na redukovaný metabolit FLU-R na výchozí koncentraci substrátu (FLU) v inkubační směsi. Z obrázku 35 je patrné, ţe redukce ketoskupiny v molekule FLU probíhá téměř stejnou rychlostí v cytosolické frakci zdravých muflonek jako u muflonek infikovaných motolicí kopinatou. Flubendazol je v organismu biotransformován buď redukcí jeho karbonylové skupiny na hydroxymetabolit FLU-R, nebo dochází k hydrolýze karbamátu a vzniká hydrolyzovaný metabolit FLU-H. V našem in vitro experimentu s mikrosomálními a cytosolickými frakcemi z jater zdravých a nemocných muflonek bylo zjištěno, ţe FLU-H nevzniká ani během inkubace FLU s mikrosomy, ani během inkubace s cytosolem. Redukci karbonylové skupiny katalyzují redukční enzymy. Reduktázy jsou lokalizovány převáţně v cytosolu. Na základě této skutečnosti lze usuzovat, ţe po inkubaci subcelulárních frakcí s FLU bude v cytosolické frakci HPLC analýzou detekováno větší mnoţství redukovaného metabolitu FLU-R neţ v mikrosomech. Naměřené výsledky tento předpoklad potvrdily, v cytosolu bylo po inkubaci s FLU detekováno asi dvacetinásobně větší mnoţství FLU-R neţ v mikrosomech.

90 Rozdíl v aktivitách mikrosomálních a cytosolických enzymů redukujících flubendazol je dobře patrný na obrázku 36. Červeně a modře jsou zobrazeny aktivity reduktáz FLU v cytosolu zdravých a nemocných muflonek, zeleně jsou zobrazeny aktivity reduktáz v mikrosomech.

Specifická enzymová aktivita [pmol/min/mg]

30 zdravé CYT

25

nemocné CYT zdravé a nemocné MIK

20 15 10 5 0 0

5

10

15

20

25

Koncentrace FLU [μmol/l] Obrázek 36. Graf porovnávající aktivity cytosolických a mikrosomálních reduktáz ketoskupiny FLU u zdravých a nemocných muflonek.

5.3 STANOVENÍ KINETICKÝCH PARAMETRŮ

–

MAXIMÁLNÍ

RYCHLOSTI A MICHAELISOVY KONSTANTY Enzymy jsou katalyzátory chemických reakcí probíhajících v organismu, ovlivňují reakční rychlost. U většiny enzymově katalyzovaných reakcí je reakční rychlost ν závislá na koncentraci substrátu, dokud nedojde k „nasycení“ enzymu substrátem. Hlavními kinetickými parametry enzymových reakcí jsou maximální rychlost Vmax a Michaelisova konstanta Km (kapitola 4.2.3). Pokud se nejedná o čistý enzym, ale o subcelulární frakce, hovoříme o zdánlivé maximální rychlosti a o zdánlivé Michaelisově konstantě. V této práci tedy Vmax značí zdánlivou maximální rychlost a Km zdánlivou Michaelisovu konstantu. Kinetika biotransformačních reakcí ABZ, ABZSO a FLU byla sledována v rozmezí koncentrací substrátů 0-25 μmol/l.

91 Horní hranice sledovaných koncentrací byla limitována velmi nízkou rozpustností ABZ, ABZSO a FLU ve vodné fázi (a tedy i v reakční směsi). Po inkubaci subcelulárních frakcí s NADPH a substrátem (ABZ, ABZSO, FLU) o koncentraci 0; 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 10,0 a 25,0 μmol/l bylo ve vzorcích detekováno mnoţství vzniklých metabolitů pomocí HPLC. Byly sestrojeny grafy závislosti rychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu dle Michaelise-Mentenové (kapitola 5.2). Pro hodnocení kinetických parametrů jednotlivých biotransformačních reakcí ABZ, ABZSO a FLU byla vyuţita transformace dle Lineweavera-Burka. Zdánlivé hodnoty Km a Vmax byly vypočítány počítačovým programem GraphPad Prism 5.00.

5.3.1 Zdánlivé kinetické parametry biotransformace albendazolu v mikrosomech Byl sestrojen graf závislosti 1/ν na 1/[S], kde [S] představuje výchozí koncentraci substrátu ABZ, jednak pro S-oxidaci ABZ a jednak pro S-oxidaci jeho metabolitu ABZSO. Na obrázku 37 jsou na osu y vyneseny reciproké hodnoty rychlosti vzniku ABZSO z ABZ, na osu x odpovídající reciproké hodnoty výchozích koncentrací substrátu (ABZ).

1,5 zdravé

1,0

1/v

-1

[min∙mg∙pmol ]

nemocné

0,5

0,0 -0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-0,5 1/[S] [l∙μmol-1 ] Obrázek 37. Lineweaverova-Burkova závislost 1/ν na 1/[S] pro přeměnu ABZ na ABZSO v mikrosomální frakci jater zdravých a nemocných muflonek.

92 Platí, ţe průsečík přímky s osou y představuje hodnotu 1/Vmax, průsečík přímky s osou x hodnotu -1/Km. Hodnoty zdánlivé maximální rychlosti reakce Vmax a zdánlivé Michaelisovy konstanty Km pro oxidaci ABZ na ABZSO v mikrosomech zdravých a nemocných muflonek byly vypočítány počítačovým programem GraphPad Prism 5.00 (tab. 30). Tabulka 30. Zdánlivé kinetické parametry konverze ABZ na ABZSO v mikrosomech zdravých a nemocných muflonek. Muflonky

Vmax [pmol/min/mg]

Km [µmol/l]

zdravé

101,6 ± 3,0

63,5 ± 2,5

nemocné

78,0 ± 4,6

37,6 ± 3,3

Hodnota Vmax S-oxidace ABZ v mikrosomální frakci jater zdravých muflonek je 101,6 ± 3,0 pmol/min/mg. Hodnota Vmax S-oxidace ABZ v mikrosomech muflonek s dikroceliózou je 78,0 ± 4,6 pmol/min/mg. Nepárovým t-testem bylo prokázáno se spolehlivostí 0,95, ţe střední hodnota Vmax ve skupině zdravých muflonek je větší neţ střední hodnota Vmax u nemocných muflonek. Michaelisova konstanta Km pro konverzi ABZ na ABZSO v mikrosomech zdravých muflonek je 63,5 ± 2,5 µmol/l, v mikrosomech nemocných muflonek 37,6 ± 3,3 µmol/l. Se spolehlivostí 0,95 bylo prokázáno, ţe Km pro S-oxidaci ABZ v mikrosomální frakci zdravých muflonek je větší neţ ve skupině nemocných muflonek. Výsledky naznačují, ţe konverze ABZ na ABZSO v mikrosomech můţe u zdravých muflonek probíhat vyšší maximální rychlostí neţ u nemocných, ale afinita mikrosomálních oxidačních enzymů k ABZ je u zdravých muflonek niţší neţ u muflonek nemocných. Byly zjišťovány také zdánlivé kinetické parametry konverze ABZSO (vzniklého z ABZ

jako

výchozího

substrátu)

na

ABZSO2.

Byl

sestrojen

graf

dle

Lineweavera-Burka (obr. 38), na osu y byly vyneseny reciproké hodnoty rychlosti vzniku ABZSO2, na osu x reciproké hodnoty výchozích koncentrací substrátu (ABZ).

93

100,0

1/v

-1

[min∙mg∙pmol ]

80,0 60,0 40,0 zdravé nemocné

20,0 0,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-20,0 -1

1/[S] [l∙μmol ] Obrázek 38. Lineweaverova-Burkova závislost 1/ν na 1/[S] pro přeměnu ABZSO na ABZSO2 v mikrosomální frakci jater zdravých a nemocných muflonek. Jako výchozí substrát byl s mikrosomy inkubován ABZ. V počítačovém programu GraphPad Prism 5.00 byly zjištěny hodnoty zdánlivých kinetických parametrů druhého oxidačního kroku v biotransformaci ABZ, jednak ve skupině zdravých muflonek a jednak ve skupině muflonek nemocných (tab. 31). Tabulka 31. Zdánlivé kinetické parametry konverze ABZSO na ABZSO2 v mikrosomech zdravých a nemocných muflonek. Výchozí substrát byl ABZ. Muflonky

Vmax [pmol/min/mg]

Km [µmol/l]

zdravé

0,7 ± 0,2

51,4 ± 15,1

nemocné

0,4 ± 0,1

23,5 ± 2,7

Hodnota Vmax konverze ABZSO (vzniklého oxidací ABZ) na ABZSO2 v mikrosomální frakci zdravých muflonek je statisticky významně vyšší neţ Vmax stejné reakce v mikrosomech muflonek s dikroceliózou. Také hodnota Km je u zdravých muflonek signifikantně vyšší oproti Km u nemocných muflonek. Z toho vyplývá, ţe afinita mikrosomálních oxidačních enzymů k ABZSO je vyšší u muflonek s dikroceliózou neţ u kontrolní skupiny zdravých muflonek.

94

5.3.2 Zdánlivé kinetické parametry biotransformace albendazolsulfoxidu v mikrosomech ABZSO byl jako výchozí substrát inkubován s mikrosomy v přítomnosti NADPH. HPLC analýzou bylo detekováno mnoţství metabolitu ABZSO2 a vypočítány rychlosti S-oxidace ABZSO v jednotlivých vzorcích. Zpětná redukce ABZSO na ABZ v mikrosomech neprobíhá (kapitola 5.2.2). Byl sestrojen graf závislosti 1/ν na 1/[S], kde [S] představuje výchozí koncentraci ABZSO, pro přeměnu ABZSO na ABZSO2 v mikrosomální frakci jater zdravých a nemocných muflonek (obr. 39).

40,0

1/v

-1

[min∙mg∙pmol ]

30,0 20,0 zdravé

10,0

nemocné

0,0 -0,50

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

-10,0 -1

1/[S] [l∙μmol ] Obrázek 39. Lineweaverova-Burkova závislost 1/ν na 1/[S] pro přeměnu ABZSO na ABZSO2 v mikrosomální frakci jater zdravých a nemocných muflonek. Jako výchozí substrát byl s mikrosomy inkubován ABZSO. V programu GraphPad Prism 5.00 byly zjištěny hodnoty Vmax a Km S-oxidace ABZSO v mikrosomální frakci zdravých a nemocných muflonek (tab. 32). Tabulka 32. Zdánlivé kinetické parametry konverze ABZSO na ABZSO2 v mikrosomech zdravých a nemocných muflonek. Výchozí substrát byl ABZSO. Muflonky

Vmax [pmol/min/mg]

Km [µmol/l]

zdravé

2,0 ± 0,3

30,2 ± 7,5

nemocné

2,2 ± 0,6

35,7 ± 14,3

95 Rozdíl hodnot maximálních rychlostí Vmax S-oxidace ABZSO v mikrosomech zdravých muflonek a v mikrosomech muflonek s dikroceliózou není statisticky významný. Michaelisova konstanta konverze ABZSO jako výchozího substrátu na ABZSO2 v mikrosomální frakci zdravých muflonech a muflonek s dikroceliózou se také statisticky významně neliší. Ze zjištěných kinetických parametrů vyplývá, ţe oxidace ABZSO jako výchozího substrátu můţe probíhat stejnou maximální rychlostí v mikrosomální frakci jak muflonek zdravých, tak muflonek infikovaných motolicí kopinatou. Afinita mikrosomálních oxidačních enzymů k ABZSO je také u obou skupin zvířat bez signifikantního rozdílu.

5.3.3 Zdánlivé

kinetické

parametry

biotransformace

albendazolu a

albendazolsulfoxidu v cytosolu V cytosolu nebyl ani ABZ ani ABZSO oxidován, detekované mnoţství metabolitů S-oxidovaných metabolitů ABZSO a ABZSO2 v cytosolu odpovídalo hodnotám slepých vzorků. Ukázalo se, ţe ani v cytosolické frakci není ABZSO zpětně redukován na ABZ (kapitola 5.2.3).

5.3.4 Zdánlivé kinetické parametry biotransformace flubendazolu v mikrosomech FLU byl inkubován s mikrosomy v přítomnosti NADPH. HPLC analýzou bylo detekováno mnoţství vzniklého redukovaného metabolitu FLU-R a vypočítány rychlosti redukce ketoskupiny FLU v jednotlivých vzorcích. Hydrolyzovaný metabolit FLU-H nebyl ve vzorcích detekován (kapitola 5.2.4). Byl sestrojen graf závislosti 1/ν na 1/[S], kde [S] představuje výchozí koncentraci FLU, pro redukci FLU v mikrosomální frakci jater zdravých a nemocných muflonek (obr. 40). Zdánlivé hodnoty kinetických parametrů Vmax a Km pro redukci FLU byly vypočítány programem GraphPad Prism 5.00, jsou uvedeny v tabulce 33.

96

30,0

[min∙mg∙pmol ]

25,0

1/v

-1

20,0 15,0 10,0

zdravé

5,0

nemocné

0,0 -0,5

-5,0

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

1/[S] [l∙μmol-1 ] Obrázek 40. Lineweaverova-Burkova závislost 1/ν na 1/[S] pro redukci FLU v mikrosomální frakci jater zdravých a nemocných muflonek.

Tabulka 33. Zdánlivé kinetické parametry redukce FLU v mikrosomech zdravých a nemocných muflonek. Muflonky

Vmax [pmol/min/mg]

Km [µmol/l]

zdravé

1,7 ± 0,1

15,6 ± 2,2

nemocné

1,6 ± 0,2

25,7 ± 4,9

Ze zjištěných hodnot Vmax redukce FLU v mikrosomální frakci zdravých a nemocných muflonek vyplývá, ţe redukce FLU můţe probíhat stejnou maximální rychlostí u obou skupin zvířat. V hodnotách Vmax není rozdíl statisticky významný. Srovnáním hodnot Km ve skupině zdravých a nemocných muflonek bylo zjištěno, ţe Michaelisova konstanta konverze FLU na FLU-R v mikrosomech je signifikantně vyšší u muflonek s dikroceliózou něţ u muflonek zdravých. Lze tedy odvodit, ţe mikrosomální reduktázy zdravých muflonek mají vyšší afinitu k FLU neţ reduktázy muflonek nemocných.

97

5.3.5 Zdánlivé

kinetické

parametry

biotransformace

flubendazolu

v cytosolu FLU ve sledovaných koncentracích byl inkubován s cytosolickými frakcemi jater zdravých a nemocných muflonek v přítomnosti NADPH. Následně byla provedena HPLC analýza parentní látky a jejích metabolitů. Hydrolyzovaný metabolit FLU-H nebyl ve vzorcích detekován, vznikal pouze redukovaný metabolit FLU-R. Z detekováno mnoţství vzniklého FLU-R byly vypočítány rychlosti redukce ketoskupiny FLU v jednotlivých vzorcích (kapitola 5.2.5). Na obrázku 41 je graf závislosti 1/ν na 1/[S], kde [S] představuje výchozí koncentraci FLU, pro redukci FLU v cytosolické frakci jater zdravých a nemocných muflonek.

1,0

[min∙mg∙pmol-1 ]

1/v

1,5

0,5

zdravé nemocné

0,0 -0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

-0,5 -1

1/[S] [l∙μmol ]

Obrázek 41. Lineweaverova-Burkova závislost 1/ν na 1/[S] pro redukci FLU v cytosolické frakci jater zdravých a nemocných muflonek.

Tabulka 34. Zdánlivé kinetické parametry redukce FLU v cytosolu zdravých a nemocných muflonek. Muflonky

Vmax [pmol/min/mg]

Km [µmol/l]

zdravé

66,1 ± 17,7

45,4 ± 17,2

nemocné

48,1 ± 7,3

31,8 ± 7,5

98 Zdánlivé hodnoty Vmax a Km pro redukci FLU v cytosolické frakci zdravých a nemocných muflonek byly zjištěny v počítačovém programu GraphPad Prism 5.00. Jsou uvedeny v tabulce 34. Se spolehlivostí 0,95 nebyl prokázán statisticky významný rozdíl v hodnotách Vmax redukce FLU v cytosolické frakci zdravých a nemocných muflonek. Redukce ketoskupiny FLU v cytosolu můţe probíhat stejnou maximální rychlostí u obou skupin zvířat. Rozdíl v hodnotách Michaelisovy konstanty Km pro redukci FLU v cytosolu zdravých

muflonek

a

v cytosolu

s dikroceliózou

muflonek

nebyl

statisticky

signifikantní. Afinita cytosolických reduktáz k FLU ve skupině nemocných muflonek je srovnatelná s afinitou reduktáz ve skupině muflonek infikovaných motolicí kopinatou.

5.4 STANOVENÍ

BIOTRANSFORMAČNÍCH

STEREOSPECIFITY

REAKCÍ Při

biotransformaci

achirální

sloučeniny

můţe

vzniknout

metabolit

s asymetrickým centrem, osou či rovinou chirality v molekule. Metabolit s jedním chirálním centrem existuje jako levotočivý či pravotočivý enantiomer, podle směru stáčení roviny polarizovaného světla. Enantiomery mají stejný strukturní vzorec, liší se prostorovým

uspořádáním

substituentů

na

asymetrickém

centru.

Enzymová

stereospecifita je definována jako schopnost enzymů preferenčně tvořit pouze jeden stereoizomer.

5.4.1

Stereospecifita S-oxidace albendazolu Albendazol je enzymaticky oxidován na chirální metabolit albendazolsulfoxid,

který existuje jako (-)-ABZSO a (+)-ABZSO. Pomocí chirální HPLC (kapitola 4.2.4.2) bylo stanoveno mnoţství jednotlivých enantiomerů ABZSO vytvořených během inkubace ABZ s mikrosomy a NADPH. Z tabulky 35 vyplývá, ţe preferenčně vzniká (+)-ABZSO, a to jak u muflonek zdravých, tak u muflonek infikovaných motolicí kopinatou.

99 Tabulka 35. Poměrné mnoţství enantiomerů ABZSO vytvořených během inkubace ABZ s mikrosomy zdravých a nemocných muflonek. Muflonky

Relativní množství (+)-ABZSO

Relativní množství (-)-ABZSO

zdravé

59,65% ± 0,95%

40,35% ± 0,95%

nemocné

63,02% ± 1,17%

36,98% ± 1,17%

Názorněji ukazuje poměr jednotlivých enantiomerů ABZSO vzniklých enzymatickou přeměnou ABZ během inkubace s mikrosomální frakcí jater zdravých a nemocných muflonek obrázek 42. Je patrné, ţe převaţuje tvorba (+)-ABZSO, a to jak u muflonek zdravých, tak u muflonek s dikroceliózou.

Relativní množství enantiomerů ABZSO (%).

100% 90%

zdravé

80%

nemocné

70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% (-)-ABZSO

(+)-ABZSO

Obrázek 42. Schematické znázornění procentuálního zastoupení jednotlivých enantiomerů ABZSO vytvořených během inkubace ABZ s mikrosomy zdravých a nemocných muflonek.

Poměr

enantiomerů

(+)-ABZSO/(-)-ABZSO

je

ve

skupině

zdravých

muflonek 1,5, ve skupině muflonek infikovaných motolicí kopinatou je tento poměr 1,7. U nemocných muflonek je mírně zvýšena tvorba (+)-ABZSO oproti kontrolní skupině zdravých muflonek.

100

5.4.2 Stereospecifita redukce flubendazolu Ketoskupina v molekule flubendazolu je působením redukčních enzymů konvertována na hydroxyskupinu, vzniká chirální metabolit flubendazolu FLU-R. Chirální HPLC byl zjišťován poměr jednotlivých enantiomerů redukovaného flubendazolu, vytvořených během inkubace FLU s cytosolickými frakcemi a NADPH. Ukázalo se, ţe redukční enzymy rozpuštěné v cytosolu jaterních buněk muflona, které konvertují FLU na FLU-R, jsou výrazně stereospecifické. Flubendazol je v cytosolu redukován na (+)-FLU-R, a to jak u muflonek zdravých, tak u muflonek infikovaných motolicí kopinatou.

Relativní množství enantiomerů FLU-R (%).

100% 90% 80%

zdravé nemocné

70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% (-)-FLU-R

(+)-FLU-R

Obrázek 43. Schematické znázornění procentuálního zastoupení jednotlivých enantiomerů FLU-R vytvořených během inkubace FLU s cytosolem zdravých a nemocných muflonek.

101

6 DISKUZE Muflon je v současné době důleţitým hospodářským ţivočišným druhem, chovaným pro maso. Mufloni jsou velmi náchylní k různým parazitózám, jejich chov ve volné přírodě, oborách a na farmách vyţaduje pravidelné preventivní nebo terapeutické podávání anthelmintik. Vzhledem k velkému počtu helmintů, které mohou infikovat muflona, je vhodné uţít anthelmintika účinná proti širokému spektru helmintů. Velmi často jsou podávána benzimidazolová anthelmintika. Tato léčiva jsou v organismu muflona velmi rychle konvertována na polárnější metabolity, které jsou snadněji vylučovány z organismu. Od aktivity biotransformačních enzymů se odvíjí účinek léčiv a jeho trvání, ale také toxicita léčiv. Aktivitu biotransformačních enzymů ovlivňuje řada faktorů, kromě jiných i zdravotní stav organismu. Předmětem studia této práce je dikrocelióza způsobená motolicí kopinatou a vliv tohoto parazitárního onemocnění na in vitro biotransformaci

sledovaných

benzimidazolových

anthelmintik

(albendazolu,

albendazolsulfoxidu a flubendazolu) u starších samic muflona. Parazitární infekce mohou měnit schopnost hostitelského organismu metabolizovat léčiva a jiná xenobiotika ovlivněním biotransformačních enzymů, tyto změny mohou mít různé farmakologické, toxikologické nebo fyziologické důsledky. Tato práce navazuje na řadu jiţ dříve provedených in vivo a in vitro experimentů zaměřených na studium vlivu dikroceliózy na aktivitu biotransformačních enzymů u různých ţivočišných druhů. Mohla by být přínosem pro doplnění poznatků o metabolických cestách albendazolu, albendazolsulfoxidu a flubendazolu u muflona. Pro posouzení vlivu dikroceliózy na biotransformaci sledovaných anthelmintik u muflona bylo pouţito několik metod blíţe specifikovaných v experimentální části. Pokus byl realizován in vitro, vyuţity byly vzorky jaterní tkáně ze třech 5-7 let starých zdravých muflonek (parazitologicky negativních) a ze čtyř 5-7 let starých muflonek infikovaných motolicí kopinatou. Vzorky jaterní tkáně byly nejprve zhomogenizovány a poté byly frakční ultracentrifugací izolovány subcelulární frakce – mikrosomy a cytosol. V kaţdé připravené mikrosomální a cytosolické frakci byla stanovena koncentrace bílkovin, jejíchţ hodnot bylo vyuţito pro vyjádření specifické aktivity enzymů katalyzujících biotransformační reakce albendazolu, albendazolsulfoxidu a flubendazolu. Koncentrace proteinu byla stanovena metodou BCA. Hodnoty koncentrace bílkovin v subcelulárních frakcích byly v rámci jednotlivých skupin

102 (zdravých a nemocných muflonek) vyrovnané. Střední hodnoty koncentrace bílkovin v cytosolických frakcích zdravých muflonek byly statisticky významně vyšší neţ střední

hodnoty

koncentrace

bílkovin

v cytosolických

frakcích

muflonek

s dikroceliózou. Koncentrace bílkovin v mikrosomech nemocných a zdravých zvířat se vzájemně výrazně nelišila. Koncentrace bílkovin byla celkově vyšší v cytosolu neţ v mikrosomech. Ze sníţené koncentrace bílkovin v cytosolických frakcích nemocných muflonek lze usuzovat, ţe dikrocelióza tlumí proteosyntézu, coţ se můţe projevit i v celkovém klinickém obrazu nemocného zvířete jako ztráta hmotnosti a slabost. Aby mohly být vzájemně porovnány in vitro biotransformační přeměny albendazolu, albendazolsulfoxidu a flubendazolu ve skupině zdravých muflonek a muflonek s dikroceliózou, byly připraveny směsné mikrosomální a cytosolické frakce zdravých muflonek a muflonek infikovaných motolicí kopinatou. Poté byly subcelulární frakce zdravých a nemocných zvířat inkubovány 60 minut s NADPH a se sledovanými anthelmintiky o koncentraci 0; 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 10,0 a 25,0 μmol/l. Horní hranice zvolených koncentrací substrátu byla limitována velmi nízkou rozpustností ABZ, ABZSO a FLU ve vodné fázi (a tedy i v reakční směsi). Inkubace probíhala v termobloku vyhřátém na 37ºC, aby byly nastaveny teplotní podmínky obdobné podmínkám in vivo. Po inkubaci mikrosomálních a cytosolických frakcí s NADPH a substrátem (ABZ, ABZSO, FLU) o koncentraci 0-25,0 μmol/l bylo ve vzorcích detekováno mnoţství parentní látky a vzniklých metabolitů pomocí HPLC. Je známo, ţe albendazol je po podání v organismu rychle metabolizován, podléhá dvoustupňové S-oxidaci. V prvním kroku je tvořen metabolit albendazolsulfoxid, který následně podstupuje konverzi na albendazolsulfon. První oxidační krok je katalyzován enzymy FMO a CYP3A,

tvorbu

albendazolsulfonu

katalyzují

enzymy

podrodiny

CYP1A.

Albendazolsulfoxid je chirální sloučenina, která existuje ve dvou enantiomerních formách: (+)-ABZSO a (-)-ABZSO. Bylo zjištěno, ţe (-)-ABZSO je generován zejména podrodinou CYP3A, zatímco (+)-ABZSO je tvořen převáţně systémem FMO (Velík et al., 2003). Jsou známy i hlavní metabolické cesty flubendazolu. Buď je v molekule flubendazolu redukována přítomná ketoskupina, nebo je hydrolyzována karbamátová skupina. Za tvorbu redukovaného flubendazolu jsou zodpovědné reduktázy karbonylové skupiny. Redukovaný flubendazol je chirální sloučenina, která existuje jako (+)-FLU-R a (-)-FLU-R (Moreno et al., 2004).

103 Byl testován metabolismus albendazolu v mikrosomální frakci jater muflonek zdravých a muflonek s dikroceliózou. V obou skupinách byly HPLC analýzou detekovány albendazol (jako parentní látka), albendazolsulfoxid a albendazolsulfon. Aby mohl být posouzen vliv dikroceliózy na biotransformaci albendazolu, byla porovnávána rychlost tvorby albendazolsulfoxidu a rychlost vzniku albendazolsulfonu ve skupině zdravých muflonek a muflonek infikovaných motolicí kopinatou. Aktivita enzymů konvertujících ABZ na ABZSO v mikrosomech byla u muflonek s dikroceliózou vyšší neţ v mikrosomech muflonek zdravých, počáteční rychlost tvorby ABZSO byla vyšší u nemocných muflonek neţ u zdravých. Počítačovým programem GraphPad Prism 5.00 byly vypočítány zdánlivé kinetické parametry konverze ABZ na ABZSO (hodnoty Km a Vmax). Se spolehlivostí 0,95 bylo prokázáno, ţe maximální rychlost Vmax ve skupině zdravých muflonek je vyšší neţ Vmax u nemocných muflonek a ţe Michaelisova konstanta Km pro S-oxidaci ABZ v mikrosomální frakci zdravých muflonek je větší neţ ve skupině nemocných muflonek. Výsledky ukazují, ţe rychlost tvorby ABZSO je sice v počáteční fázi kinetiky (v závislosti na stoupající koncentraci ABZ) vyšší u muflonek s dikroceliózou neţ u zdravých zvířat, ale při vysokých koncentracích substrátu dosáhne vyšší maximální rychlost pro zdravé muflonky. Afinita mikrosomálních oxidačních enzymů k ABZ je vyšší u nemocných muflonek neţ u muflonek zdravých, u nemocných zvířat je ale zřejmě niţší koncentrace příslušných enzymů. Konverze ABZ na ABZSO tak v mikrosomech můţe u zdravých muflonek dosáhnout vyšší maximální rychlost neţ u muflonek nemocných. Ze srovnání rychlosti prvního a druhého kroku v oxidaci ABZ vyplývá, ţe tvorba ABZSO probíhá daleko rychleji neţ konverze ABZSO na ABZSO2, a to jak u muflonek zdravých, tak u muflonek infikovaných motolicí kopinatou. Aktivita mikrosomálních enzymů katalyzujících tvorbu ABZSO z ABZ se pohybuje řádově v desítkách

pmol/min/mg

proteinu,

zatímco

aktivita

mikrosomálních

enzymů

katalyzujících tvorbu ABZSO2 v desetinách pmol/min/mg proteinu. Při pouţití albendazolu jako výchozího substrátu, tvorba ABZSO2 probíhala u zdravých a nemocných muflonek přibliţně stejnou rychlostí, ale hodnota Vmax konverze ABZSO (vzniklého oxidací ABZ) na ABZSO2 v mikrosomální frakci zdravých muflonek byla statisticky významně vyšší neţ Vmax stejné reakce v mikrosomech muflonek s dikroceliózou. Hodnota Km byla u zdravých muflonek signifikantně vyšší oproti Km u nemocných muflonek. Z toho vyplývá, ţe afinita mikrosomálních oxidačních enzymů

104 k ABZSO je vyšší u muflonek s dikroceliózou neţ u kontrolní skupiny zdravých muflonek. Po inkubaci albendazolsulfoxidu s mikrosomy zdravých a nemocných muflonek byla

ve

vzorcích

chromatograficky

detekována

jednak

parentní

látka

(albendazolsulfoxid) a jednak S-oxidovaný metabolit albendazolsulfon. Albendazol nebyl ve vzorcích detekován, z čehoţ lze usoudit, ţe albendazolsulfoxid není v mikrosomech zpětně redukován na albendazol. Ze srovnání rychlosti tvorby ABZSO2 v mikrosomech muflonek zdravých a muflonek s dikroceliózou je patrné, ţe S-oxidace ABZSO probíhá u obou skupin přibliţně stejnou rychlostí. Rozdíl hodnot maximálních rychlostí Vmax S-oxidace ABZSO v mikrosomech zdravých muflonek a v mikrosomech muflonek s dikroceliózou nebyl statisticky významný. Michaelisova konstanta konverze ABZSO jako výchozího substrátu na ABZSO2 v mikrosomální frakci zdravých muflonech a muflonek s dikroceliózou se také statisticky významně nelišila. Ze zjištěných kinetických parametrů vyplývá, ţe oxidace ABZSO jako výchozího substrátu můţe probíhat stejnou maximální rychlostí v mikrosomální frakci jak muflonek zdravých, tak muflonek infikovaných motolicí kopinatou. Afinita mikrosomálních oxidačních enzymů k ABZSO je také u obou skupin zvířat bez signifikantního rozdílu. Ze srovnání enzymové kinetiky S-oxidace ABZSO jednak vzniklého oxidací ABZ a jednak pouţitého jako výchozí substrát reakce je patrné, ţe ABZSO2 je v mikrosomech tvořen téměř ve stejném mnoţství, ať je pouţit jako výchozí substrát ABZ nebo ABZSO. Při pouţití albendazolsulfoxidu jako výchozího substrátu byla rychlost jeho konverze na albendazolsulfon srovnatelná s rychlostí stejné konverze při pouţití albendazolu jako substrátu. V cytosolu

zdravých

i

nemocných

muflonek

nebyly

albendazol

ani

albendazolsulfoxid přeměňovány na své S-oxidované metabolity. HPLC analýzou byly detekovány pouze parentní látky, mnoţství metabolitů detekovaných v cytosolu odpovídalo hodnotám slepých vzorků. Tyto výsledky souhlasí s dřívějšími poznatky, ţe na S-oxidaci ABZ se podílí FMO a CYP (Velík et al., 2003). Z našich výsledků lze tedy vyvodit závěr, ţe v cytosolu muflonek nejsou zastoupeny ani jiné enzymy katalyzující dvoustupňovou

S-oxidaci

albendazolu.

Po

inkubaci

cytosolické

frakce

s albendazolsulfoxidem nebyl albendazol detekován, z čehoţ lze usuzovat, ţe ABZSO není cytosolickými enzymy zpětně redukován na ABZ. ABZ ani ABZSO tedy nejsou vhodnými substráty pro cytosolické enzymy.

105 Byla

sledována

také

biotransformace

flubendazolu

v cytosolických

a

mikrosomálních frakcích jater muflonek zdravých a muflonek s dikroceliózou. V obou skupinách byly HPLC analýzou detekovány flubendazol (jako parentní látka) a jeho redukovaný metabolit. Hydrolyzovaný metabolit flubendazolu nebyl detekován ani v cytosolické ani v mikrosomální frakci, z čehoţ lze usoudit, ţe flubendazol je u samic muflona odbouráván pouze cestou redukce ketoskupiny. Aby mohl být posouzen vliv dikroceliózy na biotransformaci flubendazolu, byla porovnávána rychlost tvorby redukovaného flubendazolu ve skupině zdravých muflonek a muflonek infikovaných motolicí kopinatou. Flubendazol byl během inkubace s cytosolickou frakcí zdravých a nemocných muflonek redukován na chirální hydroxymetabolit FLU-R. Redukce ketoskupiny v molekule FLU probíhala téměř stejnou rychlostí v cytosolické frakci zdravých muflonek jako u muflonek infikovaných motolicí kopinatou. Nebyl prokázán statisticky významný rozdíl v hodnotách Vmax redukce FLU v cytosolické frakci zdravých a nemocných muflonek. Redukce ketoskupiny FLU v cytosolu můţe probíhat stejnou maximální rychlostí u obou skupin zvířat. Rozdíl v hodnotách Km pro redukci FLU v cytosolu zdravých muflonek a v cytosolu muflonek s dikroceliózou nebyl statisticky signifikantní. Afinita cytosolických reduktáz k FLU ve skupině nemocných muflonek je tedy srovnatelná s afinitou reduktáz k FLU ve skupině muflonek infikovaných motolicí kopinatou. Redukci karbonylové skupiny katalyzují reduktázy, které jsou lokalizovány převáţně v cytosolu. Na základě této skutečnosti bylo moţno předpokládat, ţe po inkubaci subcelulárních frakcí s FLU bude v cytosolické frakci detekováno větší mnoţství redukovaného metabolitu FLU-R neţ v mikrosomech. Naměřené výsledky tento předpoklad potvrdily, v cytosolu bylo po inkubaci s FLU detekováno asi dvacetinásobně větší mnoţství FLU-R neţ v mikrosomech. Aktivita enzymů katalyzujících redukci ketoskupiny v molekule FLU v mikrosomální frakci zdravých muflonek byla mírně zvýšena oproti mikrosomální frakci muflonek s dikroceliózou. Ze zjištěných hodnot Vmax redukce FLU v mikrosomální frakci zdravých a nemocných muflonek vyplývá, ţe redukce FLU můţe probíhat stejnou maximální rychlostí u obou skupin zvířat. V hodnotách Vmax nebyl statisticky významný rozdíl. Srovnáním hodnot Km ve skupině zdravých a nemocných muflonek bylo zjištěno, ţe Michaelisova konstanta konverze FLU na FLU-R v mikrosomech byla signifikantně vyšší u muflonek

106 s dikroceliózou něţ u muflonek zdravých. Lze tedy usoudit, ţe mikrosomální reduktázy muflonek s dikroceliózou mají sníţenou afinitu k FLU oproti zdravým muflonkám. Albendazolsulfoxid a redukovaný flubendazol jsou sloučeniny s asymetrických centrem

v molekule.

Pomocí

chirální

HPLC

byla

sledována

stereospecifita

biotransformačních reakcí, kterými tyto metabolity vznikají. Bylo stanoveno mnoţství jednotlivých enantiomerů ABZSO vytvořených během inkubace ABZ s mikrosomy. Výsledky naznačují, ţe preferenčně vzniká (+)-ABZSO, a to jak u muflonek zdravých, tak

u

muflonek

infikovaných

motolicí

kopinatou.

Poměr

enantiomerů

(+)-ABZSO/(-)-ABZSO je ve skupině zdravých muflonek 1,5, ve skupině muflonek s dikroceliózou je tento poměr 1,7. U nemocných muflonek je tedy mírně zvýšena tvorba (+)-ABZSO oproti kontrolní skupině zdravých muflonek. Jiţ dříve provedená studie (Skálová et al., 2007) sledující vliv dikroceliózy na aktivitu některých jaterních biotransformačních enzymů u samců muflona přinesla poznatky o tom, ţe dikrocelióza u muflona způsobuje jen mírné změny v jaterní biotransformaci albendazolu. U mladých samců muflona infikovaných motolicí kopinatou vzrostla aktivita FMO oproti skupině zdravých muflonů a naopak došlo u nemocných zvířat k signifikantnímu poklesu aktivity GST. V našem experimentu byla u muflonek s dikroceliózou mírně zvýšena rychlost tvorby ABZSO a ABZSO2 v mikrosomech během inkubace mikrosomů s ABZ. Hodnota Km byla u nemocných muflonek niţší neţ u muflonek zdravých. Navíc bylo zjištěno, ţe vlivem dikroceliózy je v mikrosomech nemocných zvířat tvořen ve větší míře (+)-ABZSO oproti zdravým muflonkám. Zvýšení rychlosti oxidace ABZ a zvýšení poměru (+)-ABZSO/(-)-ABZSO u nemocných muflonek by mohlo být důsledkem zvýšené aktivity FMO, které jsou za tvorbu (+)-ABZSO zodpovědné. Pro potvrzení této domněnky by bylo třeba stanovit aktivitu FMO ve skupině zdravých a nemocných muflonek. Z výsledků našeho experimentu také vyplývá, ţe dikrocelióza mírně sniţuje afinitu mikrosomálních reduktáz k FLU ve srovnání se zdravými zvířaty. Chirální HPLC byl zjišťován poměr jednotlivých enantiomerů redukovaného flubendazolu, vytvořených během inkubace FLU s cytosolickými frakcemi. Ukázalo se, ţe cytosolické redukční enzymy konvertující FLU na FLU-R jsou výrazně stereospecifické. Flubendazol je v cytosolu redukován jen na (+)-FLU-R, a to jak u muflonek zdravých, tak u muflonek infikovaných motolicí kopinatou. Stereospecifita cytosolických redukčních enzymů tedy není tímto onemocněním ovlivněna.

107 V této práci byl testován vliv dikroceliózy na biotransformaci albendazolu, albendazolsulfoxidu a flubendazolu. Bylo zjištěno, ţe motolice kopinatá nemění metabolické cesty sledovaných anthelmintik. Také kinetické parametry většiny studovaných biotransformačních reakcí zůstaly dikroceliózou neovlivněny nebo byly ovlivněny jen v malé míře. Dikrocelióza u starých muflonek nezpůsobuje výrazné změny v biotransformaci albendazolu, albendazolsulfoxidu a flubendazolu, které by ústily v neţádoucí ovlivnění farmakokinetiky zmiňovaných anthelmintik.

108

7 ZÁVĚR Na základě provedených experimentů a vyhodnocení jejich výsledků jsme dospěli k následujícím závěrům:  V cytosolických frakcích jater zdravých muflonek byla signifikantně vyšší koncentrace proteinů oproti cytosolickým frakcím jater muflonek s dikroceliózou. Koncentrace bílkovin v mikrosomálních frakcích byla u obou skupin muflonek srovnatelná.  Albendazol byl v mikrosomálních frakcích jater zdravých i nemocných muflonek konvertován

nejprve

na

albendazolsulfoxid,

který

byl

dále

přeměněn

na albendazolsulfon. Albendazolsulfoxid inkubovaný s mikrosomy jako substrát byl oxidován mikrosomálními enzymy na albendazolsulfon, jeho zpětná redukce na albendazol neprobíhala. V cytosolu neprobíhala ani oxidace albendazolu ani albendazolsulfoxidu,

nedošlo

ani

ke

zpětné

redukci

albendazolsulfoxidu

na albendazol. Flubendazol byl v cytosolu a v mikrosomech metabolizován pouze redukční cestou, hydrolyzovaný metabolit nevznikal. Redukce ketoskupiny flubendazolu probíhala intenzivněji v cytosolických frakcích neţ v mikrosomálních.  Porovnáním enzymové kinetiky konverze albendazolu na albendazolsulfoxid a následně na albendazolsulfon v mikrosomech nemocných a zdravých muflonek bylo zjištěno, ţe tvorba albendazolsulfoxidu a albendazolsulfonu probíhá o něco rychleji u muflonek s dikroceliózou. Konverze albendazolsulfoxidu (pouţitého jako výchozí substrát reakce) na albendazolsulfon probíhala v mikrosomech zdravých a nemocných muflonek téměř stejnou rychlostí. Redukce flubendazolu v cytosolu probíhala u obou skupin zvířat srovnatelnou rychlostí, zatímco v mikrosomech byl flubendazol redukován trochu rychleji u zdravých muflonek neţ u muflonek s dikroceliózou.

109  Ze zjištěných zdánlivých kinetických parametrů in vitro biotransformace sledovaných benzimidazolových anthelmintik vyplývá, ţe statisticky významný rozdíl v hodnotách Vmax a Km u zdravých a nemocných muflonek byl zaznamenán jen u: – dvoustupňové oxidace albendazolu v mikrosomech (Vmax a Km byly vyšší ve skupině zdravých muflonek neţ u muflonek s dikroceliózou) – redukce flubendazolu v mikrosomech (Km byla vyšší u muflonek s dikroceliózou neţ u zdravých muflonek)  U muflonek zdravých i muflonek s dikroceliózou byla zaznamenána preferenční tvorba enantiomeru (+)-ABZSO oproti (-)-ABZSO. Poměr jednotlivých enantiomerů (+)-ABZSO/(-)-ABZSO byl u nemocných muflonek vyšší neţ u muflonek zdravých. Dikrocelióza tedy způsobuje mírné zvýšení stereospecifity sulfoxidace albendazolu, pravděpodobně zvýšením aktivity FMO. Stereospecifita enzymů redukujících flubendazol není tímto onemocněním ovlivněna. V této rigorózní práci nebyl zjištěn výrazný vliv dikroceliózy na in vitro biotransformaci albendazolu, albendazolsulfoxidu a flubendazolu u starších samic muflona.

Dikrocelióza

biotransformačních reakcí.

jen

mírně

ovlivnila

kinetické

parametry

některých

110

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK 11β-HSD 1

11β-hydroxysteroiddehydrogenáza typ 1

ABZ

albendazol

ABZSO

albendazolsulfoxid

ABZSO2

albendazolsulfon

AcCoA

acetylkoenzym A

ACN

acetonitril

AKR

aldo-ketoreduktázy

ALR

aldehydreduktáza

AMP

adenosinmonofosfát

ATC klasifikace

anatomicko-terapeuticko-chemická klasifikace

ATP

adenosintrifosfát

BCA

bicinchoninová kyselina

BSA

hovězí sérový albumin

CBR

karbonylreduktáza

cDNA

(copy)DNA

CoA

koenzym A

CYP

cytochrom P450

DD

dihydrodioldehydrogenáza

DHRS4

dehydrogenáza/reduktáza člen 4 SDR

DMSO

dimethylsulfoxid

FAD

flavinadenindinukleotid

FLU

flubendazol

FLU-H

hydrolyzovaný metabolit flubendazolu

FLU-R

redukovaný metabolit flubendazolu

FMN

flavinmononukleotid

FMO

flavinové monooxygenázy

GRA

granulát

GSH

glutathion

GST

glutathion-S-transferáza

HPLC

vysokoúčinná kapalinová chromatografie

HSD

hydroxysteroiddehydrogenáza

INJ

injekce

111 IPA

isopropylalkohol

Km

Michaelisova konstanta

M6, M7, M8

metabolity flubendazolu

NAD+

nikotinamidadenindinukleotid (oxidovaná forma)

NADH NADP

+

nikotinamidadenindinukleotid (redukovaná forma) nikotinamidadenindinukleotidfosfát (oxidovaná forma)

NADPH

nikotinamidadenindinukleotidfosfát (redukovaná forma)

PAPS

3´-fosfoadenosin-5´-fosfosulfát

PLV POR

prášek k p.o. podání léčiva prostřednictvím pevného krmiva

PP

difosfát

PRM

premix

PST POR

pasta k perorálnímu podání léčiva

SDR

dehydrogenázy/reduktázy s krátkým řetězcem

SOL

roztok k vnitřnímu podání léčiva

SUS OTO

suspenze pro podání léčiva do zevního zvukovodu

SUS POR

suspenze pro perorální podání léčiva

syn.

synonymum

TBL POR

tableta k perorálnímu podání léčiva

THC

tetrahydrokanabinol

tR

retenční čas

UDP

uridindifosfát

UGT

UDP-glukuronosyltransferáza

Vmax

maximální rychlost reakce

112

POUŽITÁ LITERATURA 

Agarwal A.K., Rogerson F.M., Mune T., White P.C.: Gene structure and chromosomal localization of the human HSD11K gene encoding the kidney (type 2) isozyme of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase, Genomics, 29(1), 1995, 195-199



AISLP mikroverze 2007.2: databáze léků (http://www.aislp.cz)



AISLP: SPC přípravku Albex®, Chanelle Pharmaceuticals Manufacturing Ltd., Irsko, 2005



AISLP:

SPC

přípravku

Zentel®,

SmithKline

Beecham

Laboratoires

Pharmaceutiques, Francie, 2005 

Alvinerie M., Dupuy J., Eeckhoutte C., Sutra J.F., Kerboeuf D.: In vitro metabolism of moxidectin in Haemonchus contortus adult stages, Parasitol. Res., 87(9), 2001, 702-704



Baliharová V., Skálová L., Maas R.F.M., De Vrieze G., Bull S., Fink-Gremmels J.: The effects of benzimidazole anthelmintics on P4501A in rat hepatocytes and HepG2 cells, Res. Vet. Sci., 75, 2003a, 61-69



Baliharová V., Velík J., Fimanová K., Lamka J., Szotáková B., Šavlík M., Skálová L.: Inhibitory effect of albendazole and its metabolites on cytochromes P450 activities in rat and mouflon in vitro, Pharmacol. Reports, 57, 2005, 97-106



Baliharová V., Velík J., Lamka J., Balarinová R., Skálová L.: The effect of albendazole and its metabolites on hepatic cytochromes P450 activities in mouflon and rat, Res. Vet. Sci., 75, 2003b, 231-239



Barrett J.: Helminth detoxification mechanisms, J. Helminthol., 71(2), 1997, 85-89



Boobis A.R., Sesardic D., Murray B.P., Edwards R.J., Singleton A.M., Rich K.J., Murray S., De La Torres R., Segura J., Pelkonen O., Pasanen M., Kobayashi S., ZhiGuang T., Davies D.S.: Species variation in the response of the cytochrome P450 dependent monooxygenase system to inducers and inhibitors, Xenobiotica, 20, 1990, 1139-1161



Buchar J., Ducháč V., Hůrka K., Lellák J.: Klíč k určování bezobratlých, Scientia s.r.o., Praha, 1995, 52-54

113 

Buchta V., Jílek P., Horáček J., Horák V.: Základy mikrobiologie a parazitologie pro farmaceuty, Karolinum, Praha, 1998, 166-173



Červený J., Kamler J., Kholová H., Koubek P., Martínková N.: Encyklopedie myslivosti, Ottovo nakladatelství s.r.o., Praha, 2004, 341-343, 411



Dostálek M.: Enzymatický systém cytochromu P450, Postgraduální medicína, 1/2006, 46-54



Ducháček L., Lamka J.: Dicrocoeliosis – the present state of knowledge with respect to wildlife species, Acta Vet. Brno, 72, 2003, 613-626



Duchoň J. a spol.: Lekárska chémia a biochémia, Osveta, 1988, 673-685



El Amri H.S., Fargetton X., Benoit E., Totis M., Batt A-M.: Inducing effect of albendazole

on

rat

liver

drug-metabolizing

enzymes

and

metabolite

pharmacokinetics, Toxicol. Appl. Pharmacol., 92, 1988, 141-149 

Ellis E.M., Hayes J.D.: Substrate specificity of an aflatoxin-metabolizing aldehyd reductase, Biochem. J, 312, 1995, 535-541



Gibson G.G., Skett P.: Introduction to drug metabolism, Nelson Thornes Publishers, Cheltenham, United Kingdom, 2001



Hanzák J., Halík L., Mikulová M.: Světem zvířat, V.díl, Bezobratlí (1.část), Albatros, Praha, 1973, 134-138



Jez J.M., Penning T.M.: The aldo-keto reductase (AKR) superfamily: an update, Chem. Biol. Interact, 130-132, 2001, 499-525



Jíra J.: Lékařská helmintologie, Helmintoparazitární nemoci, Galén, 1998, 126-129



Jörnvall H., Persson B., Krook M., Atrian S., Gonzalez-Duarte R., Jeffery J., Ghosh D.: Short-chain dehydrogenases/reductases (SDR), Biochemistry, 34, 1995, 6003-6013



Kan C.A., Keukens H.J., Tomassen M.J.H.: Flubendazole residues in eggs after oral administration to laying hens: determination with reversed phase liquid chromatography, Analyst, 123, 1998, 2525-2527



Kolda F. a spol.: Myslivost - O zvěři, lovu a zákonech, Nakladatelství Plot, Praha, 2004, 45-47

114 

Komárek J.: Myslivost v českých zemích, 2. vydání, ČIN, Praha, 1948, 141-144



Kopečná V.: Stanovení aktivit redukčních enzymů v subcelulárních frakcích jater hospodářských zvířat, Rigorózní práce, FaF HK, 2002



Kořínková K.: Obecná parazitologie, UJEP, Ústí nad Labem, 2006, 37-71, (http://biology.ujep.cz/studijni%20materialy/Obecna%20parazitologie.pdf)



Kříţová V.: Indukce enzymů benzimidazolovými anthelmintiky, Diplomová práce, FaF HK, 2006



Kuběnová M.: Studium biotransformačních enzymů u parazita motolice kopinaté, Diplomová práce, FaF HK, 2006



Kvasničková E.: Xenobiochemie, Univerzita Karlova, Praha, 1995



Lamka J., Ducháček L.: Veterinární léčiva pro posluchače farmacie, Karolinum, Praha, 1998, 67-84



Lincová D., Farghali H. a spol.: Základní a aplikovaná farmakologie, Karolinum-Galén, Praha, 2002, 495-497



Lochman J.: Průběrný odstřel mufloní zvěře, Ministerstvo zemědělství a výţivy ČSR, Praha, 1983, 63-68



Lu C., Li A.P.: Species comparison in P450 induction: effects of dexamethasone, omeprazole, and rifampin on P450 isoforms 1A and 3A in primary cultured hepatocytes from man, Sprague-Dawley rat, minipig, and beagle dog, Chem. Biol. Interact., 134, 2001, 271-281



Machala M., Souček P., Neča J., Ulrich R., Lamka J., Szotáková B., Skálová L.: Inter-species comparisons of hepatic cytochrome P450 enzyme levels in male ruminants, Arch. Toxicol., 77, 2003, 555-560



Maser E.: Xenobiotic carbonyl reduction and physiological steroid oxidoreduction – the pluripotency of several hydroxysteroid dehydrogenases, Biochem. Pharmacol., 49, 1995, 421-440



Matsunaga T., Shintani S., Hara A.: Multiplicity of mammalian reductases for xenobiotic carbonyl compounds, Drug Metab. Pharmacokinet., 21(1), 2006, 1-18



Ministerstvo zdravotnictví ČR: Český lékopis 2002, Grada, Praha, 2003

115 

Moreno L., Alvares l., Mottier L., Virkel G., Sanches Bruni S., Lanusse C.: Integrated pharmacological assessment of flubendazole potential for use in sheep: disposition kinetics, liver metabolism and parasite diffusion ability, J. Vet. Pharmacol. Therap., 27, 2004, 299-308



Moroni P., Buronfosse T., Longin Sauvageon C., Delatour P., Benoit E.: Chirar sulfoxidation of albendzole by the flavin adenin dinucleotide-containing and cytochrom P450-dependent monooxygenases from rat liver microsomes, Drug Metab. Disp., 2, 1995, 160-165



Murray R.K., Granner D.K., Mayes P.A., Rodwell V.W.: Harperova biochemie, 3. české vydání, H&H, Jinočany, 2001, 743-748



Okey A.B.: Enzyme induction in the cytochrome P-450 system, Pharmacol. Ther., 45, 1990, 241-298



Otranto D., Traversa D.: A review of dicrocoeliosis of ruminants including recent advances in the diagnosis and treatment, Vet. Parasitol., 107(4), 2002, 317-335



Rice J.M., Diwan B.A., Ward J.M., Nims R.W., Lubet R.A.: Phenobarbital and related compounds: approaches to interspecies extrapolation, Prog. Clin. Biol. Res., 374, 1992, 231-249



Rodrigues A.D.: Drug-drug interactions, Marcel Dekker Inc., New York, NY, USA, 2002



Skálová L., Kříţová V., Cvilink V., Szotáková B., Štorkánová L., Velík J., Lamka J.: Mouflon (Ovis musimon) dicrocoeliosis: Effects of parasitosis on the activities of biotransformation enzymes and albendazole metabolism in liver, Vet. Parasitology, 146, 2007, 254-262



Slanař O.: Farmakogenetika – zdroj variability lékové odpovědi, přednáška v rámci postgraduálního vzdělávání zdravotníků, 2007



Smith P.K., Krohn R.I., Hermanson G.T., Mallia A.K., Gartner F.H., Provenzano M.D., Fujimoto E.K., Goeke N.M., Olson B.J., Klenk D.C.: Measurement of protein using bicinchoninic acid, Anal. Biochem., 150, 1985, 76-85

116 

Szotáková B., Baliharová V., Lamka J., Noţinová E., Wsól V., Velík J., Machala M., Neča J., Souček P., Šusová S., Skálová L.: Comparison of in vitro activities of biotransformation enzymes in pig, cattle, goat and sheep, Res. Vet. Sci., 76, 2004, 43-51



Ševčík B.: Tlumení parazitóz spárkaté zvěře z hlediska myslivecké praxe, Myslivost, 12, 2000



Šimůnek J.: Speciální farmakologie pro studující veterinární medicíny, Státní pedagogické nakladatelství, Praha, 1979, 215-225



Štorkánová L.: Vliv dikroceliózy na aktivitu biotransformačních enzymů muflona, Rigorózní práce, FaF HK, 2004



Szotáková B., Baliharová V., Lamka J., Noţinová E., Wsól V., Velík J., Machala M., Neča J., Souček P., Šusová S., Skálová L.: Comparison of in vitro activities of biotransformation enzymes in pig, cattle, goat and sheep, Res. Vet. Sci., 76, 2004, 43-51



Velík J., Baliharová V., Fink-Gremmels J., Bull S., Lamka J., Skálová L.: Benzimidazole drugs and modulation of biotransformation enzymes, Res. Vet. Sci., 76, 2004, 95-108



Velík J., Baliharová V., Skálová L., Szotáková B., Wsól V., Lamka J.: Stereospecific biotransformation of albendazole in mouflon and rat-isolated hepatocytes, J. Vet. Pharmacol. Therap., 26, 2003, 297-302



Velík J., Szotáková B., Baliharová V., Lamka J., Šavlík M., Wsól V., Šnejdrová E., Skálová L.: Albendazole repeated administration induces cytochromes P4501A and accelerates albendazole deactivation in mouflon (Ovis musimon), Res. Vet. Sci., 78, 2005, 255-263

117 Internetové zdroje: 

http://de.wikipedia.org/wiki/Flubendazol



http://kr.expasy.org/sprot/



http://ro.wikipedia.org/wiki/Muflon



http://www.cdfound.to.it/HTML/dicr2.htm



http://www.cvm.okstate.edu



http://www.emea.eu.int/



http://www.ibpassociation.org/encyclopedia/medicine/Benzimidazole.php



http://www.infektionsbiologie.ch/parasitologie/seiten/modellparasiten/mp03dicr.htm l#top



http://www.med.upenn.edu/akr/



http://www.paru.cas.cz



http://www.priroda.cz/clanky/foto/mufloni.jpg