UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie

Bc. Kateřina Růžičková Charakterizace fosfatas v rostlinách tabáku (Nicotiana tabacum L.) Characterization of phosphatases in tobacco plants (Nicotiana tabacum L.)

Diplomová práce

Vedoucí diplomové práce: Doc. RNDr. Helena Ryšlavá, CSc. Konzultant: RNDr. Veronika Doubnerová, PhD.

Praha, 2011

Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci v ypracovala samostatně pod vedením školitelk y doc. RNDr. Helen y Ryšlavé, CSc. a všechn y použité pramen y jsem řádně citovala. V Praze dne

……………………………. Kateřina Růžičková

1

Ráda b ych touto cestou poděkovala všem, kteří mě podporovali a pomáhali mi v průběhu této práce. Chtěla b ych poděkovat své školitelce d oc. RNDr.

Heleně Ryšlavé, CSc. za skvělé vedení, cenné rady a trpělivost, dále RNDr. Veronice Doubnerové, PhD. za vstřícnost a všestrannou pomoc při řešení experimentální části práce. Děkuji také své rodině za jejich podporu v průběhu celého studia. Děkuji vám!

2

A BSTRAKT Fosfatas y (EC 3.1.3.x) jsou skupina enz ymů, které h ydrol yzují fosfoestery. Významně tak ovlivňují energetick ý metabolismus buňk y i jeho regulaci. Fosfatas y defosforylující protein y jsou nedílnou součástí signálních drah a odpovědí na stres a regulují enz ym y. Tato práce se věnuje studiu fosfatas získan ých z listů tabáku (Nicotiana tabacum L.). Byl y připraven y enz ymové preparát y k yselou i zásaditou extrakcí. Za použití chromogenního substrátu pNP-fosfátu b yl a zjištěna v yšší fosfatasová aktivita gl ykos ylované frakce než ve frakci nezach ycené na Con A Sepharose. Studium vlivu iontů na fosfatasovou aktivitu zaznamenalo aktivaci iont y Mg 2 + a Ca 2 + a inhibici ionty Co 2 + a Mn 2 + . Zn 2 + iont y fosfatasovou aktivitu neovlivňoval y. Gl yk os ylované fosfatas y štěpil y rovněž další nízkomolekulární substrát y fosfoserin, ATP a glukosa-6-P. Při studiu proteinfosfatasové aktivit y b ylo zjištěno, že substrátem gl ykos ylované frakce fosfatas je fosvitin, ale ne kasein ani tryptické štěp y kaseinu. Podrobn ým měřením b ylo zjištěno, že pH optimum pro všechn y substrát y leží v oblasti pH 5-6. Gl ykos ylované fosfatas y štěpí také fosfát v molekule PEPC ze semen kukuřice. Klíčová slova: fosfatasa, proteinfosfatasa, tabák, Con A Sepharosa, pNPfosfát, ATP, P-serin, glukosa-6-P, fosvitin

3

A BSTRACT Phosphateses (EC 3.1.3.x) are a group of enz ymes that h ydrolyze phosphoesters. That way they affect the energetic metabolism of a cell and its regulation. Phosphatases that dephosphorylate proteins are an integral part of signaling pathways, stress responses and they modulate enz ymatic activit y. This thesis deals with the stud y of phosphatases obtained from tobacco leaves (Nicotiana tabacum, L.). Solution of enz ymes was prepared b y extraction in both acidic and alkaline buffers. Through the use of the chromogenic substrate pNP-phosphate it was determined that there is a higher phosphatase activit y in the gl ycosylated fraction than in the fraction that did not bind to Con A Sepharose. The research of the ions effect on the phosphatase activit y has determined that Mg 2 + and Ca 2 + show positive effect on the phosphatase activit y while the effect of Co 2 + and Mn 2 + is inhibitory. The Zn 2 + ions have shown no effect whatsoever. The gl ycos ylated phosphatases also dephosphorylated low-weight-molecular substrates phosphoserine, ATP and glucose-6-phosphate. The research of protein phosphatase activit y discovered the affinit y to the substrate phosvitin, although neither to casein nor its tryptic cleaves. Detailed experiments have shown that the pH optima for all the substrates lie from pH 5 to 6. Gl ycos ylated phosphatases also h ydrol yze the phosphate in the PEPC molecules from Zea mays seeds. Keywords: phosphatase, protein phosphatase, tobacco, Con A Sepharose, pNP-phosphate, ATP, P-serine, glucose-6-P, phosvitin

4

Seznam použitých zkratek a - aktivita ADP - adenosindifosfát ATP - adenosintrifosfát BSA - hovězí sérov ý albumin DTT - dithiothreitol EDTA - k yselina ethylenediaminetetraoctová G6P - glukosa-6-fosfát K m - Michaelisova konstanta MDH - malátdeh ydrogenasa NADH - nikotinamid adenin dinukleotid PEP - fosfoenolp yruvát PEPC - fosfoenolp yruvátkarbox ylasa PMSF - fen ylmeth ylsulfon ylfluorid pNP - para-nitrofenol PVP - pol yvin ylp yrrolidon SDS - dodecylsíran sodn ý TEMED - N, N, N', N' - tetrameth ylendiamin TRIS - tris(h ydrox ymeth yl)aminomethan V l i m - maximální reakční rychlost

5

O BSAH 1. Ú V O D ................................................................................................ 9 1.1. F O S F O R A J E H O V Ý Z N A M P R O R O S T LI N Y ........................................... 9 1.2. Fosfatasy ...................................................................................... 9 1.2.1. Al kalické fosfat asy ................................................................... 9 1.2.2. Kyselé fosfatas y ..................................................................... 11 1.2.2.1. Extracelulární kyselé fosfatas y ........................................... 11 1.2.2.2. Intracelulární kyselé fosfatas y ............................................ 12 1.2.2.3. Speciali zované fosfatasy .................................................... 13 1.2.2.3.a Phytas y ....................................................................... 13 1.2.2.3.b Fosfogl ykolátfosfatasa .................................................. 14 1.2.2.3.c 3-fosfogl ycerátfosfatasa ................................................ 14 1.2.2.3.d Fosfoenolpyr uvátfosfatasa ............................................ 14 1.2.3. Proteinfosfatas y ..................................................................... 15 1.2.3.1. Ser/Thr proteinfosfatasy ..................................................... 16 1.2.3.2. Proteinfosfatasová akti vita kysel ých fosfatas ....................... 19 1.3. V Ý Z K U M F O S F A T A S O V É AK T I V I TY ................................................. 19 1.4. P R O TE I N F O S F A T A S A D E F O S F O R Y L U J Í C Í F O S F O E N O LP Y R U V Á TK A R B O X Y L A S U ................................................................................................ 22 2. C Í L P R Á C E ...................................................................................... 25 3. M A T E R I Á L A M E T O D Y ...................................................................... 26 3.1. M A T E R I Á L A P Ř Í S T R O J E ................................................................ 26 3.1.1. Rostlinný mater iál .................................................................. 26 3.1.2. Chemi kálie a enzymy .............................................................. 26 3.1.3. Přístroj e ................................................................................ 27 3.2. M E T O D Y A P O S T U P Y ..................................................................... 28 3.2.1. Příprava enzymu ..................................................................... 28 3.1.1.1. Homogeni zace a extrakce ................................................... 28 3.2.1.2. Afinitní chromatografie na Con A Sepharose ........................ 28 3.2.1.3. Stanovení množst ví proteinů ............................................... 30 3.2.2. Stanovení fosfat asové akti vity ................................................. 30 3.2.2.1. Stanovení fosf atasové aktivit y v závi slosti na pH ................. 30 3.2.2.2. Stanovení fosf atasové aktivit y v závi slosti na koncentraci s ubstrátu ................................................................................................ 31

6

3.2.3. Stanovení fosfat asové akti vity vůči dal ším substrátům ............... 31 3.2.3.1. Stanovení vol ného fosfátu .................................................. 31 3.2.3.2. Stanovení akti vit y vůči ní zkomolekulárním substrátům ......... 32 3.2.3.3. Stanovení akti vit y vůči fos vitinu ........................................ 32 3.2.3.4. Příprava roztoku kaseinu a stanovení fosfatasové akti vity vůči kaseinu ............................................................................................... 33 3.2.4. Elektroforetické metody .......................................................... 33 3.2.4.1. Elektroforetická separace v prostředí SDS ........................... 34 3.2.4.2. Detekce proteinů na pol yakr ylamidovém gelu ....................... 35 3.2.5. Vliv fosfatasové akti vit y na PEPC ze semen kukuřice ................ 35 3.2.5.1. Příprava PEPC ................................................................... 35 3.2.5.2. Stanovení akti vit y PEPC .................................................... 35 3.2.5.3. Vliv defosfor ylace na akti vitu PEPC ................................... 36 3.2.5.4. Stanovení inhi bice PEPC malátem ....................................... 36 3.2.5.5. Stanovení akti vace PEPC glukosa-6-fosfátem ....................... 36 3.2.6. Stanovení ki netických konstant ................................................ 36 4. V Ý S L E D K Y ...................................................................................... 38 4.1. P Ř Í P R AV A F O S F A T A S Y Z L I S T Ů T A B Á K U .......................................... 38 4.1.1. Stanovení závis losti fosfatasové akti vity na čase....................... 38 4.1.2. Opti malizace extrakce fosfatasové aktivit y ............................... 39 4.1.3. Afinitní chromatografie na koloně Con A Sepharos y ................. 40 4.1.4. Elektroforetická separace ........................................................ 42 4.2. C H A R A K TE R I Z A C E F O S F A T A S O V É A K T I V I T Y V Ů Č I S U B S T R Á T U P NP- F O S F Á T ................................................................................................ 44 4.2.1. Vliv pH prostředí na fosfatasovou akt ivitu ............................... 44 4.2.2. Vliv teplot y na fosfatasovou akti vitu ....................................... 45 4.2.2.1. Teplotní stabilita ............................................................... 46 4.2.2.2. Teplotní optimum .............................................................. 46 4.2.3. Vliv přítomnost i iontů na fosfatasovou aktivitu......................... 47 4.2.3.1. Vliv hořečnat ých iontů na fosfatasovou akti vitu ................... 47 4.2.3.2. Vliv vápenat ých iontů na fosfatasovou akti vitu .................... 49 4.2.3.3. Vliv kobaltnat ých iontů na fosfatasovou akti vitu .................. 50 4.2.3.4. Vliv manganatých iontů na fosfatas ovou akti vitu .................. 51 4.2.3.5. Vliv železit ých iontů na fosfatasovou aktivitu ...................... 52 4.2.3.6. Vliv ni kelnat ých iontů na fosfatasovou akti vitu .................... 53 4.2.3.7. Vliv zinečnat ých iontů na fosfatasovou akti vitu ................... 54

7

4.2.4. Závislost fosfat asové akti vity na koncentraci substrátu pNP-fosfátu ................................................................................................ 55 4.3. C H A R A K TE R I Z A C E F O S F A T A S O V É A K T I V I T Y V Ů Č I N Í Z K O M O LE K U L Á R N Í M S U B S TR Á T Ů M .......................................................................................

58

4.3.1. Charakteri zace fosfatasové akti vit y vůči P-serinu ..................... 58 4.3.1.1. Závislost fosf atasové aktivit y na čas e .................................. 58 4.3.1.2. Závislost fosf atasové aktivit y na pH .................................... 59 4.3.1.3. Závislost fosf atasové aktivit y na koncentraci substrátu P-s erinu ................................................................................................ 60 4.3.2. Charakteri zace fosfatasové akti vit y vůči ATP ........................... 62 4.3.2.1. Závislost fosf atasové aktivit y na čas e .................................. 62 4.3.2.2. Závislost fosf atasové aktivit y na pH .................................... 62 4.3.2.3. Závislost fosf atasové aktivit y na koncentraci substrátu ATP .. 63 4.3.2. Charakteri zace fosfatasové akti vit y vůči glukosa-6-P ................ 65 4.3.3.1. Závislost fosfatasové aktivit y na čas e ................................. 65 4.3.3.2. Závislost fosf atasové aktivit y na pH .................................... 66 4.3.3.3. Závislost fosf atasové aktivit y na koncentraci substrátu glukosa-6fosfát ................................................................................................ 67 4.4. C H A R A K TE R I Z A C E F O S F A T A S O V É A K T I V I T Y V Ů Č I V Y S O K O M O LE K U L Á R N Í M S U B S TR Á T Ů M .......................................................................................

69

4.4.1. Charakteri zace fosfatasové akti vit y vůči kaseinu....................... 69 4.4.2. Charakteri zace fosfatasové akti vit y vůči proteinu fos vitinu ....... 69 4.4.2.1. Závislost fosfatasové aktivit y na čas e ................................. 69 4.3.2.2. Závislost fosf atasové aktivit y na pH .................................... 70 4.3.2.3. Závislost fosf atasové aktivit y na koncentraci substrátu fosvitinu ................................................................................................ 71 4.5. V LI V F O S F A T A S O V É AK T I V I TY N A A K T I V I T U F O S F O E N O L P Y R U V Á TK A R B O X Y L AS Y

....................................................... 72

4.5.1. Změna akti vit y PEPC po působení fos fatas tabáku ..................... 72 4.5.2. Vlastnosti PEPC po působení fosfatas tabáku ............................ 73 5. D I S K U S E ......................................................................................... 74 6. S O U H R N .......................................................................................... 80 7. S E Z N A M P O U Ž I T É L I T E R A T U R Y ......................................................... 81

8

1. ÚVOD Tématem této práce je studium fosfatasové aktivity v rostlinných tkáních.

1.1. F OSFOR

A J EHO VÝZNAM PRO ROSTLINY

Jeden z nejvýznamnějších prvků pro růst rostlin, fosfor, je zároveň také jedním z prvků nejméně dostupných. Autotrofní organismy, kterými jsou i rostliny, získávají minerální živiny přímo z prostředí. Fosfor tak získávají ve formě fosfatového aniontu (P i ).

[1]

Hydrolýza monoesterů fosfátu v organismech je klíčovým procesem těsně svázaným s energetickým metabolismem, metabolickou regulací a širokým spektrem buněčných signálních drah. P i je také významnou strukturní jednotkou mnoha biomolekul. Z toho důvodu jsou asimilace, ukládání a metabolismus P i nezbytné pro růst a vývoj rostliny. Fosfatasy se podílí na získávání a zužitkování fosfátu. Tyto všudypřítomné enzymy hydrolysují P i z monoesterů kyseliny fosforečné termodynamicky výhodným procesem (∆G°' ≤ -9kJ mol - 1 ). [2]

1.2. F OSFATASY Tradičně jsou fosfatasy klasifikované podle jejich optimálního reakčního pH jako alkalické a kyselé.

[2]

1.2.1. ALKALICKÉ FOSFATASY Alkalické fosfatasy (EC 3.1.3.1) jsou zpravidla dimerní molekuly, které hydrolyzují široké spektrum monoesterů při pH optimu ~8. V

9

savčích buňkách nacházíme mnohé isozymy navázané na cytoplasmické membráně, oproti tomu bakteriální enzym je volný, postrádá kovalentní modifikace jako je glykosylace nebo napojení na mastnou kyselinu. Alkalická fosfatasa z E.coli (obr. 1) byla tak jednou z prvních blíže specifikovaných fosfatas.

[2]

Ob r áz e k 1 : S tr u kt ur a a k t iv n í ho mí s ta al k al ic ké f o s fa ta s y z E .co li. Mo l e k ul y zi n k u t vo ř í d vo uj ad er n é ce n tr u m, k t er é j e p ř e mo s tě no o d št ě p o va n ý m f o s fát e m.

[2]

Rostlinné alkalické fosfatasy zpravidla vykazují úplnou substrátovou specifitu. Příkladem této skupiny fosfatas jsou cytosolické fruktosa1,6-bisfosfatasa (EC 3.1.3.11) a sacharosa-6-fosfátfosfatasa (EC 3.1.3.24). Obě jsou součástí glukoneogenetické dráhy.

[1, 3]

10

1.2.2. KYSELÉ FOSFATASY Oproti tomu kyselé fosfatasy (EC 3.1.3.2) většinou tak přísnou substrátovou specifitu nemají. Přesto je lze rozlišit do dvou skupin na základě jejich substrátových preferencí.

[1]

První skupinou jsou fosfatasy skutečně nespecifické. Vyskytují se v širokém spektru rostlin a pletiv a značně se mezi sebou liší na základě jejich f yzikálních vlastností. Všechny však hrají význačnou roli v produkci, transportu a recyklaci P i .

[1]

Druhou skupinou kyselých fosfatas jsou specializované enzymy, jako jsou 3-P-glycerátfosfatasa (EC 3.1.3.38) nebo fosfoenolpyruvátfosfatasa (EC 3.1.3.60); Obě vykazují jasnou preferenci substrátu, jsou ale schopné defosforylovat i jiné substráty. Fosfatasy z této skupiny mívají jasně odlišitelné metabolické funkce. [1]

1.2.2.1. Extracelulární kyselé fosfatasy

Extracelulární fosfatasy se mohou nacházet v buněčných stěnách, nebo být vylučované povrchem kořenů do okolní půdy. Fosfatasy vylučované kořeny jsou zodpovědné za získávání fosfátových iontů z organických i anorganických zdrojů. Funkcí fosfatas v buněčných stěnách by mohlo být vychytávání fosfatových iontů z mezibuněčných prostor.

[1]

Významnou skupinou kyselých fosfatas jsou purpurové kyselé fosfatasy (EC 3.1.3.2) jsou snadno rozlišitelné od ostatních kyselých fosfatas díky fialovému zabarvení, které má jejich roztok. To je způsobeno přítomností aktivního centra se dvěma ionty kovů V případě savčích enzymů existuje aktivní centrum ve dvou formách oxidované Fe I I I -Fe I I I centrum je fialové a vykazuje jen malou aktivitu 11

(obr. 2); redukovaná Fe I I -Fe I I forma je růžová a enzymaticky aktivní. V případě fosfatas rostlinných aktivní centrum obsahuje železitý a zinečnatý iont. Tyto enzymy se také odlišují jejich resistencí vůči vinanu, což je silný inhibitor dalších kyselých fosfatas.

[2]

Ob r áz e k 2 : P ř ed p o klád a ná s tr u kt ur a o xid o v a né f o r my a kt i v ní ho ce n tr a s e d vě ma io nt y žele za v s a včí c h p ur p ur o v ýc h k ys el ýc h fo s f at as ác h.

[2]

Purpurové kyselé fosfatasy se řadí mezi extracelulární, jsou vázané v buněčných stěnách a vylučovány kořeny do půdy.

[4]

Nedávná studie ukázala, že při nedostatku fosfátu vykazuje tabák zvýšenou phytasovou aktivitu (viz níže). Kyselina phytová je důležitý zdroj fosfátových iontů v semenech a pylu, vyskytuje se ale také ve zvýšeném množství v půdě. V půdě s nízkým obsahem fosfátu kořeny tabáku vylučují zvýšené množství kyselé fosfatasy, která phytát defosforyluje.

[5]

1.2.2.2. Intracelulární kyselé fosfatasy

Intracelulární kyselé fosfatasy (EC 3.1.3.2) se zdají být všudypřítomné. Jejich přítomnost byla dokázána v semenech, listech, 12

stoncích i kořenech, květech i plodech a zásobních hlízách rostlin. Na základě jejich optimálního pH, které se zpravidla nachází mezi 5 a 6, je možné soudit, že se v buňce kyselé fosfatasy vyskytují především ve vakuolách. Tomu nasvědčují i další výzkumy [6]. Kompartmentace fosfatas do rostlinných vakuol umožňuje enzymu přístup jen k těm substrátům, které jsou skladovány ve vakuolách. Zároveň je tak buňka chráněna před značným poškozením, které by mohlo nastat při nekontrolované fosfatasové aktivitě v cytoplasmě. Některé studie ale ukázaly, že se kyselé fosfatasy v buňce mohou nacházet i v cytoplazmě, tzn. kyselé pH optimum fosfatas nezabraňuje fosfatasám fungovat v prostředí nekyselých metabolických kompartmentů.

[1]

1.2.2.3. Specializované fosfatasy

Existují specializované typ y intracelulárních kyselých fosfatas, které mají zřetelnou, i když ne absolutní substrátovou specifitu. Předpokládá se, že mají více specializovanou metabolickou funkci, než fosfatasy bez jakékoli specifity.

[1]

1.2.2.4.a Phytasy

Kyselina phytová (inositol hexafosfát - obr. 3) je důležitým zdrojem fosfátu a inositolu v klíčících semenech. Její štěpení zprostředkovávají enzymy phytasy (EC 3.1.3.8). Na rozdíl od jiných specializovaných kyselých fosfatas jsou phytasy poměrně nespecifické vůči dalším substrátům a dokážou s podobnou účinností hydrolysovat spektrum přírodních i syntetických fosfoesterů. Kyselé fosfatasy v klíčících semenech tak jsou nazývané phytasami především proto, že kyselina phytová je jejich nejčastější substrát v přirozených podmínkách.

[1]

13

Ob r áz e k 3 : K ys e li na p h y to v á.

[5]

1.2.2.4.b Fosfoglykolátfosfatasa

Fosfoglykolátfosfatasa (EC 3.1.3.18) se, na rozdíl od jiných kyselých fosfatas, vyznačuje absolutní substrátovou specifitou vůči svému substrátu. Fosfoglykolátfosfatasa katalyzuje konverzi P-glykolátu na glykolát, tato reakce je součástí fotorespirační dráhy. [ 1 ] 1.2.2.4.c 3-fosfoglycerátfosfatasa

Přítomnost tohoto enzymu (EC 3.1.3.38) byla prokázána v desítkách rostlinných druhů. Katalyzuje odštěpení P i z molekuly 3fosfoglycerátu a poskytuje tak alternativní metabolickou dráhu od glycerátu k serinu namísto fotorespirace a glykolátové dráhy v listech. Tento enzym preferuje 3-fosfoglycerát jako substrát, katalyzuje však hydrolýzu i dalších fosfoesterů.

[1]

1.2.2.4.d Fosfoenolpyruvátfosfatasa

PEP-fosfatasa (EC 3.1.3.60) defosforyluje i jiné substráty než PEP, má však k němu mnohem vyšší afinitu ve srovnání s jinými fosfoestery.

14

Zdá se také, že o PEP při nízké hladině P i iontů soupeří s cytosolickou pyruvátkinasou, která zprostředkovává přenos Pi z PEP na ADP. V případě vážného nedostatku P i iontů je pyruvátkinasa z důvodu nedostatku substrátu ADP téměř neaktivní a defosforylaci PEP zprostředkovává PEP-fosfatasa. Tato energeticky náročná adaptace umožňuje rostlinám při nedostatku P i iontů využívat fosfátové ionty získané z katabolismu adenylátů, a tak nedochází k narušení konverze PEP na pyruvát. Zdá se také, že zastává roli recyklačního systému, který hydrolyzuje (volné) fosfoestery. Získané P i ionty jsou pak reasimilovány do metabolismu hladovějících buněk.

[7]

1.2.3. PROTEINFOSFATASY Modifikace proteinů fosforylací a defosforylací je významným regulačním mechanismem pro rozličné buněčné funkce. Proteinové fosfatasy (EC 3.1.3.16) ovlivňují metabolismus rostlin i dalších organismů jak v krátkých časových úsecích, tak dlouhodobě. Jsou součástí mnoha signálních drah a zapojují se například do odpovědi rostlin na stresové podmínky.

[8]

Proteinfosfatasy dělíme podle jejich substrátové specifity na fosfatasy defosforylující serylové a threonylové zbytky a na fosfatasy, které defosforylují zbytky aminokyseliny tyrosinu. Existují také proteinfosfatasy s podvojnou specifitou (obr. 4).

[9]

Některé proteinové fosfatasy obsahují, podobně jako kyselé purpurové fosfatasy, centra se dvěma ionty kovů. Příkladem je Ser/Thr fosfatasa typu 2B, která obsahuje centrum s iontem železa a zinku.

[2]

15

Ob r áz e k 4 : Ro zd ěl e ní p r o tei n fo s f ata s p o d le s ub s tr áto v é sp ec i fi t y. Ser yl o vé a th r eo n ylo v é zb yt k y j so u d e fo s fo r ylo vá n y p r o te i n fo s fa ta sa mi s k up i n P P P , P P M a D SP . P r o tei n fo s fa ta s y s k up i n y DSP ta ké , sp o l u s p r o t ei n fo s fa ta sa mi s k up i n y P T P , d efo s fo r yl uj í t yr o s yl o vé zb yt k y.

[9]

1.2.3.1. Ser/Thr proteinfosfatasy

Ser/Thr proteinfosfatasy se dělí na základě homologie genů do dvou skupin. Do první skupiny genů patří navzájem příbuzné enzymy skupin PP1, PP2A a PP2B, které jsou ovlivňované kalcineurinem a komplexem kalmodulinu s vápenatými ionty. Druhou skupinou je PPM, která zahrnuje enzymy rodiny PP2C a několik dalších Ser/Thr fosfatas ragulovatelných hořečnatými ionty. Na základě farmakologických vlastností a substrátové specifity vůči podjednotkám fosforylasy-kinasy můžeme Ser/Thr dělit do dvou hlavních skupin, PP1 a PP2A. Skupina PP2 se dále rozpadá do třech 16

dalších podle jejich závislosti na dvoumocných kationtech. Při rozlišování hrají roli i inhibitory, jako je kyselina okadaová, kaliculin A a cantharidin.

[9; 10; 11]

Studie rostlinných fosfatas prokázaly přítomnost proteinfosfatas, které odpovídají fosfatasam PP1 a PP2A z živočišných buněk.

[8]

Rostlinné proteinfosfatasy typu PP1 a PP2A (obr. 5 a 6) zprostředkovávají defosforylaci a regulaci několika cytosolických enzymů, jako je sacharosa-6-P synhtasa, PEP karboxylasa nebo chinát dehydrogenasa.

[8]

Ob r áz e k 5 : Mo d e l kr ys t a lo v é str u k t ur y p r o tei no v é fo s f at as y t yp u 1 s na v á za n ý m p ep tid e m: k r u h - ka ta l yt ic ké ce nt r u m; tr o j ú h el n í k y - tř i žl áb k y v yb í h aj íc í z ka ta l yt ic ké ho ce n tr a. [ 1 2 ]

17

Ob r áz e k 6 : Mo d e l p r o t ei no vé fo s f at as y t yp u 2 A: zele n á - k ata l yt ic ká p o d j ed no t k a P P 2 Ac ; ž l ut á - r e g u lač n í p o d j ed no t k a A; mo d r á - r e g ula č ní p o d j ed no t ka B [ 1 3 ]

Funkce proteinových fosfatas přímo ovlivňuje růst rostliny, například fosfatasa prvního typu ovlivňuje tepelnou citlivost rostlin

[14]

, životní

cyklus buněk, syntézu proteinů a metabolismus při sníženém množství živin. V živočišných buňkách je součástí metabolismu glykogenu.

[13]

Spolu s proteinfosfatasou typu 2A dále reguluje přenos signálu kyseliny abscisové

[15]

a transmembránový přenos draselných iontů v

mesof ylových buňkách listů

[16]

.

Proteinfosfatasa typu 2A reguluje auxinový transport na procesu dělení buňky kvetení

[21]

patogeny

[19, 20]

[17, 18]

, podílí se

. Dále také ovlivňuje časové řízení

a zlepšuje schopnost rostlin reagovat na stres suchem

[23]

, nebo chladem.

[22]

,

[24]

18

Jednou z funkcí proteinové fosfatasy typu 2A je také defosforylace fosfoenolpyruvát karboxylasy. Té se budu věnovat později. Na stres reagují také fosfatasy typu 2C z rodiny PPM. V případě stresu suchem je jejich exprese silně zvýšená, oxidativní stres a horko naopak způsobují snížení exprese.

[25]

Ovlivňují také dráhu kyseliny

abscisové a funkce rostlinného meristému.

[26]

1.2.3.2. Proteinfosfatasová aktivita kyselých fosfatas

Byla zaznamenána i fosfatasová aktivita kyselých fosfatas vůči fosforylovaným aminokyselinám a fosfoproteinům. Některé kyselé fosfatasy jsou aktivní vůči P-serinu a P-threoninu.

[1]

Lidská kyselá fosfatasa z plazmatické membrány nádorových astrocytů je striktně specifická vůči P-tyrosinu, rostlinné kyselé fosfatasy takovou specifitu nevykazují

[27]

. Přesto je však jejich afinita k P-

tyrosinu vyšší, než k dříve zmiňovaným fosforylovaným aminokyselinám. V rostlinných pletivech se také nacházejí v hojném množství.

[1]

1.3. V ÝZKUM

FOSFATASOVÉ AKT IV ITY

Přesné f yziologické role rostlinných fosfatas je kvůli jejich rozmanitosti a všudypřítomnosti těžké určit. Nejčastějším substrátem pro in vitro zkoumání fosfatasové aktivity je para-nitrofenylfosfát (pNP-fosfát - obr. 7).

[1]

Dalšími používanými substráty jsou ADP,

ATP, glukosa-6-fosfát a fosfoenolpyruvát, P-serin a P-tyrosin.

[7, 28, 29,

30, 31, 32, 33]

19

Ob r áz e k 7 : P a ra - n i tr o fe n yl f o s f át.

[5]

Dosavadní výzkumy rostlinných kyselých fosfatas se věnovaly mimo jiné vlivu iontů na fosfatasovou aktivitu. Vesměs se shodují na tom, že vlivem hořečnatých a vápenatých iontů dochází ke zvýšení enzymové aktivity. Zinečnaté, železité a měďnaté ionty naopak způsobovaly snížení aktivity, stejně tak ionty olova, orthofosfát, askorbát, glutamát a aspartát. Vinan snižoval aktivitu kyselých fosfatas, s výjimkou purpurových kyselých fosfatas. Výzkumy se neshodují na vlivu molybdenátu na kyselé fosfatasy, některé mu přisoudily inhibiční vlastnosti, jiné nepozorovaly žádný vliv na aktivitu. Optimální pH kyselých fosfatas bylo stanoveno v hodnotách od 5 do 5,8, tedy v kyselém prostředí. Většina kyselých fosfatas je glykosylovaná, proto byla při jejich purifikaci často využívaná afinita ke konkanavalinu A. [7, 28, 29, 30, 31, 32, 33]

Pro výzkum proteinových fosfatas se dále používají fosfokasein, fosfohiston a syntetické peptidové substráty. Polya a kol. uvádí, že proteinfosfatasy z klíčků pšenice nereagují s neproteinovými monofosfáty, uvádí také, že přítomnost hořečnatých a vápenatých iontů aktivitu fosfatas nijak nestimulovala.

[34]

V jiných případech jsou

úspěšně používány i nízkomolekulární substráty.

[35, 36]

20

Podobně jako kyselé fosfatasy jsou i ty proteinové inhibovány zinečnatými ionty, volným fosfátem, vanadátem a molybdenátem a ionty rtuti. Dalšími inhibitory jsou pro proteinové fosfatasy specifické kyselina okadaová (obr. 8), L-mikrocystin (obr. 9), kaliculin A (obr. 10) a cantharidin (obr. 11). Inhibitory proteinových fosfatas 1 a 2 jsou dva tepelně stálé proteiny získávané z jater a svalové tkáně. Tyto fosfatasy vykazují alkalické pH optimum.

Ob r áz e k 8 : S tr u kt ur a k y se li n y o k ad ao vé.

Ob r áz e k 9 : S tr u kt ur a mi kr o c ys t i n u - L R .

[11, 35, 36]

[2]

[37]

[38]

21

Ob r áz e k 1 0 : S tr u kt ur a k ali c ul i n u A.

[39]

Ob r áz e k 1 1 : S tr u kt ur a c an t har id i n u.

[40]

1.4. P ROTEINFOSFATASA

DEFOSFORYLUJ ÍCÍ

FOSFOENOLPYRUVÁTKARBOX YLASU

Aktivita fosfoenolpyruvátkarboxylasy (PEPC) a její kinetické vlastnosti jsou regulovány specifickou reversibilní fosforylací přesně stanoveného serylového zbytku poblíž N-koncové části proteinu. Fosforylace je zprostředkována specifickou Ser/Thr kinasou (PEPCk). Defosforylace probíhá za účasti proteinfosfatasy typu 2A (obr. 12).

[41,

42]

22

Ob r áz e k 1 2 : S c hé ma r e g ul ace fo s f o r yla ce P E P C

[43]

Biochemické a imunologické výzkumy ukazují podobnost této fosfatasy PP2A enzymům v dalších eukaryotických organismech. Tak jako ostatní proteinfosfatasy typu 2A se skládá z dimeru regulační podjednotky A a katalytické podjednotky PP2Ac, na který se váže regulační podjednotka typu B. Fosfatasová aktivita tohoto enzymu je nezávislá na na iontech kovů a netečná vůči inhibitorům, které působí na proteinfosfatasu typu 1, levamisolu a I-2 proteinu. Vykazuje naopak velkou citlivost vůči inhibici kyselinou okadaovou a mikrocystinem-LR. Polykationty jako protamin nebo poly-L-lysin enzym aktivují.

[42]

23

Důležitou vlastností této proteinfosfatasy je absence striktní substrátové specifity vůči PEPC. Tím se liší od PEPC-kinasy, která je vůči svému substrátu vysoce specifická.

[42]

V případě PEPC neslouží fosforylace enzymu jako "zapnutí" do aktivního stavu, ale změnu kinetických vlastností. To může znamenat zvýšení afinity enzymu k substrátu, zvýšení maximální rychlosti reakce, zvýšení citlivosti vůči aktivaci glukosa-6-fosfátem a naopak snížení citlivosti vůči inhibici malátem, změnu Hillova koeficientu. Tato změna se pravděpodobně neprojevuje stejně pro všechny PEPC, ale závisí na typu a funkci enzymu z jednotlivých rostlinných druhů. Například purifikovaná PEPC z listů tabáku je ve fosforylované formě aktivnější a dosahuje vyšší maximální reakční rychlosti, nemění se ale její citlivost vůči malátu. Oproti tomu PEPC ze semen kukuřice ve své fosforylované formě vůči malátu citlivější je. Zajímavý je také rozdíl v závislosti rychlosti reakce na koncentraci substrátu PEP, kinetika defosforylované formy je sigmoidální.

[43, 44, 45, 46, 52, 53]

24

2. CÍL PRÁCE Cílem této diplomové práce b ylo: 1) Optimalizovat podmínk y extrakce fasfatas z listů tabáku, rozdělit fasfatas y na gl ykos ylované a negl ykosilované. 2) Zjistit substrátovou specifitu fosfatas připraven ých z listů tabáku vůči pNP-fosfátu a dalším nízkomolekulárním substrátům. 3) Zjistit, zda jsou substrátem fosfatas z tabáku protein y s v ysokým obsahem fosfátu. 4) Zjistit, zda působí fosfatas y z listů tabáku defosforylaci fosfoenolp yruvátkarbox ylas y ze semen kukuřice.

25

3. MATERIÁL A METODY 3.1. M ATERIÁL

A PŘÍSTROJ E

3.1.1. ROSTLINNÝ MATERIÁL Rostlin y Nicotiana tabacum L. cv. Petit Havana, SR1, b yl y laskavě posk ytnut y RNDr. Helenou S ynkovou, CSc. Ústav experimentální botanik y AV ČR (ÚEB AV ČR) Semena Zea mays L. cv. CE 205 S ve formě kukuřičné mouk y

3.1.2. CHEMIKÁLIE A ENZYMY 4-nitrophen ylfosfát disodná sůl hexah ydrát (pNP-fosfát) - Fluka, Velká Británie Adenosintrifosfát (ATP) - Sigma, USA Akrylamid - Sigma, USA Bradfordové činidlo - Sigma, USA Con A Sepharosa - Pharmacia, Švédsko Coomasie Brilliant Blue R250 (CBB) - Sigma, USA Dithiothreitol (DTT) - Sigma, USA Dodecylsíran sodn ý (SDS) - Sigma, USA Ethanol - Lach-ner, ČR Eth ylendiamintetraacetát (EDTA) - Lachema, ČR Fen ylmeth ylsulfon yl fluorid (PMSF) - Sigma, USA Fosfoenolp yruvát sodn ý (PEP) - Sigma, USA Fosfo-L-serin - Sigma, USA Fosvitin - Sigma, USA Gl ycerol - Penta, ČR Gl ycin - Degussa, ČR Glukosa-6-fosfát - Sigma, USA Hovězí sérov ý albumin (BSA) - Sigma, USA Kasein z hovězího mléka - Sigma, USA 26

Kyselina octová - Lach-ner ČR L-malát sodn ý - Sigma, USA Malátdeh ydrogenasa (M2634-5KU; 700U/mg) - Sigma, USA MgCl 2 - Sigma, USA N, N, N', N' - tetrameth ylendiamin (TEMED) - Serva, USA N, N'-meth ylenbisakrylamid - Sigma, USA NaCl - Penta, ČR NADH - Sigma, USA NaHCO 3 - Lachema, ČR Peroxodisíran amonný - Boehringer, Německo Pol yvin ylp yrrolidon (PVP) - Sigma, USA Standardní protein y pro elektroforetickou separaci v prostředí SDS - Serva, Německo Tris(h ydrox ymeth yl)aminomethan (TR IS) - Sigma, USA Trypsin - Merck, Německo Ostatní chemikálie - Lachema, ČR; Sigma, USA

3.1.3. PŘÍSTROJE Anal ytické váh y 100A – Denver Instrument Compan y, USA Centrifuga Univerzal 32 R – Hettich, Německo Elektroforetická souprava Whatman – Biometra, Německo Inkubátor se suchou lázní Elite – Schoeller instruments, Velká Británie pH metr Ultrabasic UB 10 – Denver Instrument Compan y, USA Spektrofotometr Ultrospec 2100 – Amersham Pharmacia Biotech, Velká Británie Magnetická míchačka – Labortechnik, Německo

27

3.2. M ETODY

A POSTUPY

3.2.1. PŘÍPRAVA ENZYMU

3.2.1.1. Homogenizace a extrakce Extrakční podmínk y ovlivňují aktivitu zkoumaného enz ymu. Roli hraje nejen pH a použit ý pufr, ale také přídavek látek, které napomáhají zachovat enz ymovou aktivitu. PMSF a EDTA jsou inhibitory proteas. Zatímco PMSF inhibuje serinové proteas y, EDTA v ych ytává volné kovové iont y, a tak inhibuje metaloproteas y. DTT zabraňuje nežádoucí tvorbě disulfidick ých můstků. Prvním krokem v procesu příprav y enz ymu je homogenizace rostlinného materiálu. Přibližně 3 g listů tabáku jsem rozmělnila ve třecí misce. Potom jsem přidala trojnásobek navážk y listů tabáku v ml objemu extrakčního pufru o složení 50 mM Tris/HCl pH 8,1 nebo 50 mM acetátový pufr pH 4,9; 1 mM PMSF; 1 mM EDTA; 1 mM DTT. V případě zkoumání vlivu extrakční směsi na enz ymovou aktivitu b yl y inhibitory proteas a DTT přidáván y samostatně. Extrakce jsem prováděla paralelně ve dvou pH (pH 8,1 a pH 4,9) pro srovnání vlivu extrakčního pH na aktivitu vůči různým substrátům. K homogenátu jsem přidala malé množství PVP, který váže fenolické látk y, které tak zůstávají v sedimentu. Zkumavky jsem potom centrifugovala 15 min při 15000 g, 4°C. Před dalším postupem jsem oddělila a uchovala 1 ml supernatantu pro další měření. Tuto frakci jsem označovala 'hrub ý extrakt' HE.

3.2.1.2. Afinitní chromatografie na Con A Sepharose Lektin y jsou skupina proteinů, které dokážou reversibilně vázat specifické cukerné zb ytk y. Imobilizované lektin y jsou nedoceniteln ým nástrojem při

28

izolaci a separaci glykoproteinů, gl ykolipidů, pol ysacharidů, ale i subcelulárních částic a buněk.

[47]

Lektin konkanavalin A je tetramerní metaloprotein, který specifick y váže molekul y obsahující α-D-mannop yranos yl ové a α-D-glukop yranos ylové struktury a sterick y podobné cukerné zb ytk y. Imobilizovan ý na Sepharose tak umožňuje separovat gl ykos ylované molekul y.

[47]

Do kolon y o objemu 10 ml jsem nalila přibližně 5 ml Con A Sepharos y. Tento chromatografick ý nosič jsem ekvilibrovala 50 ml základního pufru (0,02 M Tris/HCl pH 7; 0,5 M NaCl). Kolonu jsem následně prom ývala 50 ml pufru I (základní pufr s přídavkem 1 mM CaCl 2 , 1 mM MnCl 2 ). Na kolonu jsem nanesla HE a nechala zapustit. Od nanesení HE jsem začala jímat eluovan ý roztok do kalibrovan ých zkumavek do frakcí o objemu přibližně 4 ml. Průběžně jsem měřila obsah proteinů pomocí absorbance při vlnové délce 280 nm (A 2 8 0 ) proti pufru I. Jakmile se hodnot y A 2 8 0 přiblížil y nule, začala jsem kolonu prom ývat pufrem II (základní pufr s přídavkem 0,2 M α-D-meth ylglukosid), čímž jsem uvolnila navázané protein y z nosiče, a eluované frakce jsem zach ytávala po 2 ml objemu. Obsah proteinů jsem tentokrát měřila proti pufru II. Kd yž se A 2 8 0 opět přiblížila nulov ým hodnotám, chromatografii jsem ukončila. Pro každou frakci jsem pak provedla stanovení fosfatasové aktivit y vůči pNP-fosfátu (viz kapitola 3.4.2.). Frakce s nejv yšší aktivitou, zvlášť pro nezach ycené a pro zach ycené protein y, jsem pak spojila. ConA- jsem označovala frakci nezach ycen ých, negl yk os ylovan ých proteinů, ConA+ potom frakci proteinů na koloně zach ycen ých, gl ykos ylovan ých. Pro ConA+, ConA- a HE jsem znovu změřila fosfatasovou aktivitu a stanovila jsem množství bílkovin metodou podle Bradfordové (kapitola 3.4.1.3.).

29

3.2.1.3. Stanovení množství proteinů Stanovení množství proteinů podle Marion Bradfordové v yužívá posunu maxima absorbance barv y Coomassie Brilliant Blue G-250 z 465 nm na 595 nm, ke kterému dochází při navázání aminok yselin y argininu a h ydrofobních aminokyselin. Pro měření jsem v ytvořila kalibrační křivku z roztoků hovězího sérového albuminu (BSA).

[48]

Pro stanovení obsahu proteinů jsem 25 min inkubovala 33 µl vzorku s 1 ml činidla Bradfordové. Absorbanci jsem měřila při 595 nm. Jako referenční vzorek sloužilo 33 µl příslušného pufru.

3.2.2. STANOVENÍ FOSFATASOVÉ AKTIVITY Jako substrát pro měření fosfatasové aktivit y b yl používán pNP-fosfát, fosfoderivát chromoforu para-nitrofenolu (pNP). Ten má žluté zabarvení, které lze po odštěpení fosfátové skupin y měřit při vlnové délce 405 nm. Reakční směs obsahovala 100 µl 100 mM citrátového pufru pH 5,5, 25µl destilované vod y a 50 µl 20 mM pNP-fosfátu. Reakce b yla zahájena přidáním 25 µl testovaného vzorku do reakční směsi. Po deseti minutách b yla reakce ukončena přidáním 800 µl 0,1 M borátového pufru pH 9,0. Jako referenční vzorek pro měření A 4 0 5 sloužila reakční směs, do které b yl zkouman ý vzorek přidán až po ‚zastavení‘ borátov ým pufrem. Reakce probíhala při laboratorní teplotě. Specifická aktivita byla v ypočtena jako aktivita vztažená na 1 mg proteinu. Molární absorbční koeficient pNP ε 4 0 5 =1,8.10 4 mol - 1 .l.cm - 1 .

3.2.2.1. Stanovení fosfatasové aktivity v závislosti na pH Pro získání požadované škál y pH b yla připravena řada 100 mM citrátov ých pufrů v rozsahu pH 3-6,5 a řada 100 mM Tris-HCl pufrů v rozsahu pH 78,7. Pro stanovení fosfatasové aktivit y v závislosti na pH b yl v yužit obdobn ý postup jako v kapitole 3.4.2.

30

3.2.2.2. Stanovení fosfatasové aktivity v závislosti na koncentraci substrátu Reakční směs pro stanovení aktivit y v závislosti na koncentraci substrátu obsahovala 100 µl 100 mM citrátového pufru pH 5,5. Dále b ylo přidáno takové množství 20 mM pNP-fosfátu, aby b yla v ytvořena škála koncentrací substrátu v hodnotách 0,5-7 mM. Směs byla doplněna na 175 µl destilovanou vodou. Dále b yl postup obdobn ý jako v kapitole 3.4.2.

3.2.3. STANOVENÍ FOSFATASOVÉ AKTIVITY VŮČI DALŠÍM SUBSTRÁTŮM Kromě pNP-fosfátu jsem zkoumala i aktivitu získan ých enz ymů vůči dalším nízkomolekulárním substrátům (fosfoserin /P-serin/, adenosintrifosfát /ATP/ a glukosa-6-fosfát /G6P/) a vůči fosforylovan ým proteinům (kasein, phosvitin).

3.2.3.1. Stanovení volného fosfátu Měření fosfatasové aktivit y vůči jin ým substrátům, než je pNP-fosfát, je založené na stanovení volného fosfátu. Voln ý fosfát reaguje s mol ybdenanem amonn ým a tvoří spolu bezbarv ý komplex (NH 4 ) 3 PO 4 12MoO 4 . Ten je redukován na barevn ý komplex, jehož přítomnost lze měřit při vlnové délce 660 nm.

[44]

Během stanovování volného fosfátu ve vzorku b ylo do 200 µl zjišťovaného vzorku postupně přidáno 100 µl 5 M H 2 SO 4 , 200 µl 2% (NH 4 ) 2 MoO 4 , 10 µl čerstvě připraveného redukčního činidla a 490 µl destilované vody. Redukční činidlo se skládá z 0,2 g 1-amino-2-naftol-4-sulfonové kyseliny, 1,2 g NaHCO 3 a 1,2 g Na 2 SO 3 . Před měřením je vždy připravován čerstvý roztok rozpuštěním 0,025 g prášku v 1 ml vody. Reakce běžela po dobu 15 min a poté byla změřena absorbance při vlnové délce 660 nm. Pro stanovení množství uvolněného fosfátu byla s pomocí fosfátového pufru sestrojena kalibrační přímka o koncentraci 0,01-0,2 mM (obr. 13).

31

Ob r áz e k 1 3 : Ka lib r ač ní kř i v ka p r o s ta no ve n í vo l né ho fo s f át u.

3.2.3.2. Stanovení aktivity vůči nízkomolekulárním substrátům Reakční směs obsahovala 100 µl 100 mM citrátového pufru pH 5,5, 25 µl destilované vod y a 50 µl 20 mM substrátu (P-serin, ATP nebo G6P). Reakce b yla zahájena přidáním 25 µl enzymu. Po 15 minutách b yla ukončena přidáním 100 µl 5 M H 2 SO 4 , což je první krok ke stanovení volného fosfátu, jak je popsané v kapitole 3.4.3.2. Stanovování závislosti fosfatasové aktivity v závislosti na pH a na koncentraci substrátu probíhalo analogick y k postupům v kapitolách 3.4.2.1. a 3.4.2.2., jen namísto zastavení reakce přidáním borátového pufru b yla reakce zastavena přidáním 5 M H 2 SO 4 , jak je uvedeno výše. Jako referenční vzorek vžd y sloužil vzorek bez přidaného substrátu.

3.2.3.3. Stanovení aktivity vůči fosvitinu Reakční směs pro stanovení fosfatasové aktivit y obsahovala 100 µl 100 mM citrátového pufru pH 5,5, 25 µl destilované vod y a 50 µl 0,1 mM fosvitinu. Reakci jsem zahájila přidáním 25 µl enz ymu. Po 15 minutách b yla

32

ukončena přidáním 100 µl 5 M H 2 SO 4 a pokračovala stanovením volného fosfátu, jak je popsané v kapitole 3.4.3.2. Stanovování závislosti fosfatasové aktivity v závislosti na pH a na koncentraci substrátu odpovídalo postupům v kapitolách 3.4.2.1. a 3.4.2.2. Namísto zastavení reakce přidáním borátového pufru b yla reakce zastavena přidáním 5 M H 2 SO 4 , jak je uvedeno v ýše. Jako stanovení jsem použila shodnou reakční směs, do které neb yl přidán roztok substrátu.

3.2.3.4. Příprava roztoku kaseinu a stanovení fosfatasové aktivity vůči kaseinu V 90 ml vod y s přídavkem 2 ml 1 M NaOH jsem na vodní lázni rozpouštěla 5 g kaseinu. Po 9 hodinách jsem roztok zfiltrovala přes gázu a doplnila na 100 ml vodou, čímž jsem získala 5% roztok.

[49]

Stanovovala jsem fosfatasovou aktivitu vůči kaseinu podle postupu uvedeného v kapitole 3.4.3.2., jen s použitím 1 mM a 0,5 mM substrátu. Vedle kaseinu jako substrátu jsem si připravila tryptické štěpy kaseinu. 350 µl 5% kaseinu jsem smísila s 40 µl 2% roztoku trypsinu a nechala inkubovat při 36 °C po dobu 2 a 24 hodin. Tyto peptid y jsem rovněž testovala jako možné substrát y fosfatasové aktivit y.

[49]

3.2.4. ELEKTROFORETICKÉ METODY Elektroforéza je metoda založená na schopnosti nabit ých částic poh ybovat se stejnosměrn ým elektrick ým polem. R ychlost, kterou se částice poh ybují, závisí na velikosti molekul y a na velikosti jejího náboje. Jako nosič se většinou používá pol yakrylamidov ý gel, který vzniká kopol ymerací akrylamidu a N,N'-meth ylenbisakrylamidu. Gel je pevn ý a čirý a důležitou vlastností je i jeho inertnost.

33

3.2.4.1. Elektroforetická separace v prostředí SDS SDS-PAGE je elektroforetická separace, která probíhá v prostředí pol yakrylamidového gelu. Při SDS-PAGE elektroforéze dochází k rozdělení proteinů podle velikosti. Přítomen je detergent SDS, který překrývá náboj proteinu a posk ytuje mu jednotn ý záporn ý náboj. SDS-elektroforéza byla prováděna metodou podle Ulricha K. Laemmliho. [50]

Ke vzorkům (HE, ConA-, ConA+) b yl přidán SDS vzorkov ý pufr v poměru 1:1. Před nanesením na gel b yl y vzork y krátce přiveden y k varu. Byl použít 3% zaostřovací gel a 12% gel separační. Separace probíhala na elektroforetické soupravě Multigel Biometra v SDS elektrodovém pufru. Vzork y jsem do jamek nanášela pomocí Hamiltonov y stříkačk y v takov ých objemech, ab y jednotlivé vzork y odpovídal y přibližně stejnému množství proteinů. Elektroforéza probíhala při napětí 70 V pro zaostřovací gel, pro separační gel b ylo napětí zv ýšeno na 140 V. SDS vzorkový pufr obsahoval: 0,5 M Tris-HCl pufru pH 6,8; 100 mM DTT; 10% SDS; 20% glycerolu; 0,1 % bromfenolové modři. SDS elektrodový pufr obsahoval: 25 mM Tris pufru pH 8,3; 250 mM glycinu; 3,5 mM SDS. 3% zaostřovací gel se skládal z: 3 ml H 2 O; 0,4 ml 30% akrylamidu; 0,5 ml 1,0 M Tris/HCl pufru pH 6,8;- 40 µl 10% SDS; 8 µl TEMED; 40 µl 10% persíranu. 12% separační gel se skládal z: 4,9 ml H 2 O; 6,0 ml 30% akrylamidu; 3,8 ml 1,5 M Tris/HCl pufru pH 8,8; 150 µl 10% SDS; 6 µl TEMED; 150 µl 10% persíranu. Roztok persíranu musel b ýt připravován vždy čerstv ý.

34

3.2.4.2. Detekce proteinů na polyakrylamidovém gelu Separační gel jsem opatrně opláchla a vložila do barvící lázně obsahující Coomasie Brilliant Blue. Po obarvení b yla přeb ytečná barva vym ývána odbarvovacím roztokem. Barvící lázeň obsahovala: 2 g Coomasie Brilliant Blue R 250; 0,5 g Coomasie Brilliant Blue G 250; 425 ml ethanolu; 100 ml kyseliny octové; 50 ml methanolu; 425 ml H 2 O. Odbarvovací roztok se skládal z: 650 ml H 2 O; 250 ml ethanolu; 100 ml kyseliny octové.

3.2.5. VLIV FOSFATASOVÉ AKTIVITY NA PEPC ZE SEMEN KUKUŘICE

3.2.5.1. Příprava PEPC Ke 30 g homogenizovan ých kukuřičn ých semen jsem přidala 200 ml pufru A (100 mM Tris-HCl pH 7,8; 1 mM DTT; 1 mM EDTA; 5 mM MgCl 2 ; 5% gl ycerol) a vše lehce míchala po dobu 30 min. Po přefiltrování přes dvě vrstv y gáz y jsem extrakt centrifugovala 45 min při 9600×g a 4°C. Provedla jsem precipitaci síranem amonným při hodnotách nas ycení 30% a 60%. Po každém srážení b yl roztok centrifugován 45 min při 9600×g a 4°C. Precipitát získan ý po 60% nas ycení jsem resuspendovala ve 2 ml pufru B (25 mM Tris-HCl pH 7,8; 0,5 mM DTT; 5 mM MgCl 2 ; 1 mM EDTA; 5% gl ycerol).

3.2.5.2. Stanovení aktivity PEPC Aktivitu PEPC jsem měřila spřaženou reakcí s malátdeh ydrogenasou (MDH) jako pokles absorbance při 340 nm. Reakční směs pro detekci aktivit y obsahovala 100 mM Tris-HCl pH 8,1; 5 mM NaHCO 3 ; 2 mM MgCl 2 ; 0,2 mM NADH; 2 mM PEP; ~4 U MDH v celkovém objemu 1 ml.

35

Výsledná rychlost reakce b yla získána lineární regresí 10 měření absorbance v průběhu 3 minut.

3.2.5.3. Vliv defosforylace na aktivitu PEPC 250 µl PEPC jsem smísila v poměru 1:1 s fosfatasou a průběžně po dobu 2 h sledovala vliv defosforylace stanovením aktivit y PEPC, jak je popsáno v kapitole 3.4.5.2. Jako referenční vzorek mi sloužila směs 1:1 PEPC s pufrem (0,02 M Tris/HCl pH 7; 0,5 M NaCl). Ta b yla používána jako paralelní vzorek pro navazující měření.

3.2.5.4. Stanovení inhibice PEPC malátem Reakční směs obsahovala 100 mM Tris-HCl pH 7,3; 5 mM NaHCO 3 ; 2 mM MgCl 2 ; 0,2 mM NADH; 2 mM PEP; ~4 U MDH; 2 mM malát v celkovém objemu 1 ml. Jako referenční vzorek sloužila směs bez přídavku malátu. Aktivita PEPC b yla stanovena metodou popsanou v kapitole 3.4.5.2.

3.2.5.5. Stanovení aktivace PEPC glukosa-6-fosfátem Reakční směs obsahovala 100 mM Tris-HCl pH 7,3; 5 mM NaHCO 3 ; 2 mM MgCl 2 ; 0,2 mM NADH; 0,2 mM PEP; ~4 U MDH; 2 mM G6P v celkovém objemu 1 ml. Jako referenční vzorek sloužila směs bez přídavku G6P. Aktivitu PEPC jsem stanovila metodou popsanou v kapitole 3.4.5.2.

3.2.6. STANOVENÍ KINETICKÝCH KONSTANT Kinetické parametry Michaelisovu konstantu (K m ) a maximální reakční rychlost (V l i m ) jsem v ypočítala nelineární regresí v programu MS Excel proložením experimentálních dat hodnotami v ypočten ými z příslušné rovnice (rovnice 1).

36

Rovnice 1:

v=

Vlim ⋅ [S ] K m + [S ]

v

...

reakční rychlost

[S]

...

koncentrace substrátu

Vlim

...

maximální reakční rychlost

Km

...

Michaelisova konstanta

37

4. VÝSLEDKY V této práci jsem se zab ývala fosfatasovou aktivitou přítomnou v listech tabáku. Měření jsem prováděla jednak za použití chromogenního substrátu para-nitrofen ylfosfátu, dále za použití fosforylovan ých nízkomolekulárních látek. Enz ymové preparát y s fosfatasovou aktivitou jsem také testovala, zda mají proteinfosfatasovou aktivitu.

4.1. P ŘÍPRAVA

FOSFATASY Z LISTŮ TABÁKU

4.1.1. STANOVENÍ ZÁVISLOSTI FOSFATASOVÉ AKTIVITY NA ČASE Stanovovala jsem časov ý průběh štěpení pNP-fosfátu při reakci katal yzované fosfatasami metodou popsanou v kapitole 3.2.2. Z obr. 14 je patrné, že je přírůstek p-NP za dobu 20 min lineární a nedochází k jeho zpomalení. Pro další měření jsem tak mohla použít jakoukoli reakční dobu z tohoto intervalu.

Ob r áz e k 1 4 : Z á vi s lo st m no ž s t ví p r o d u k t u p - NP v zn i kl é ho d e fo s fo r yl ac í p - NP P na ča se .

38

4.1.2. OPTIMALIZACE EXTRAKCE FOSFATASOVÉ AKTIVITY Testovala jsem vliv extrakčních podmínek na fosfatasovou aktivitu. Použila jsem extrakci v k yselém prostředí (50 mM acetátov ý pufr pH 4,9) a v prostředí alkalickém (50 mM Tris/HCl pufr pH 8,1). Do těchto pufrů jsem ještě přidávala inhibitory proteas, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA a/nebo redukční činidlo 1 mM DTT. Výsledk y testování různ ých extrakčních podmínek na fosfatasovou aktivitu dokumentuje obr. 15. Fosfatasová aktivita měřená za standardních podmínek (pNP-fosfát 5 mM; pH 5,5; 25°C; 10 min) b yla vyšší při použití alkalické extrakce než při použití extrakce k yselé. Při alkalické extrakci neměl y jednotlivé inhibitory proteas a DTT podstatn ý vliv na fosfatasovou aktivitu, při použití v kombinaci došlo k 20% zv ýšení aktivit y. Při k yselé extrakci je patrn ý malý nárůst aktivit y za použití jednotliv ých inhibitor proteas, jejich kombinace pak už k dalšímu zv ýšení aktivit y nevedla.

Ob r áz e k 1 5 : Vl i v e x tr a k čn íc h p o d mí n e k n a fo s fa ta so vo u a k ti v it u.

39

4.1.3. AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE NA KOLONĚ CON A SEPHAROSY Separaci na sloupci Con A Sepharos y jsem provedla způsobem popsan ým v kapitole 3.4.1.2. Při ní došlo k oddělení glykos ylovan ých a negl ykos ylovan ých proteinů z extrahované směsi. Separaci jsem prováděla pro enz ymovou aktivitu získanou jak k yselou, tak alkalickou extrakcí. Na kolonu jsem nanesla přibližně 5 ml hrubého extraktu. Při chromatografii jsem jímala frakce o objemu přibližně 3 ml, v nich jsem průběžně sledovala obsah bílkovin měřením absorbance při vlnové délce 280 nm. Dále jsem ve frakcích proměřovala fosfatasovou aktivitu za standardních podmínek (pNP-fosfát 5 mM; pH 5,5; 25°C; 10 min). Na obrázcích 16 a 17 vidíme průběh chromatografie. Hlavní část enz ymů s fosfatasovou aktivitou b yla zach ycena na sloupci Con A Sepharos y. Z něj b yla eluována pomocí roztoku 0,2 M α-D-meth ylglukop yranosidu. Frakce s měřitelnou fosfatasovou aktivitou jsem spojila a změřila jejich v ýslednou aktivitu, specifickou aktivitu a obsah bílkovin. Výs ledné hodnot y pro vzork y z alkalické i k yselé extrakce jsou uveden y v tabulkách 1 a 2. T ab ul ka 1 : Ro zd ěl e ní fo s fa ta so vé a kt i vi t y na ko l o ně Co n A Sep h ar o s y, p r o al ka li c ko u ex tr a k ci.

Frakce

Obsah proteinů [mg/ml]

Aktivita [µmol/min*ml]

Specifická Získan ý aktivita objem [µmol/min*mg] [ml]

HE

1,268

0,14

4,54

6

ConA-

0,524

0,01

0,73

6

ConA+

0,023

0,12

205,99

6

40

T ab ul ka 2 : Ro zd ěl e ní fo s fa ta so vé a kt i vi t y na ko l o ně Co n A Sep h ar o s y, p r o k ys e lo u ex tr a k ci.

Frakce

Obsah proteinů [mg/ml]

Aktivita [µmol/min*ml]

Specifická Získan ý aktivita objem [µmol/min*mg] [ml]

HE

0,426

0,11

10,77

5

ConA-

0,106

0,01

3,61

8

ConA+

0,01

0,07

277,33

6

Ob r áz e k 1 6 : C hr o mato g r af ic k á s ep ar ace fo s f ata s o vé a kt i vi t y z í s ka né al k ali c ko u ex tr a k cí n a s lo up c i Co n A S ep har o s y; o b s a h b í l k o vi n - ab so r b a n ce p ř i 2 8 0 n m ( mo d r á) ; fo s fa ta so vá a kt i vi ta ( žl u tá) ; E - el uc e 0 ,2 M α -D - me t h yl g l u ko p yr a no s id e m; Co n A- sp o j e ná ne g l yk o s ylo v a n á fr a kc e; Co n A+ - sp o j e ná g l yk o s ylo v a ná fr a kce .

41

Ob r áz e k 1 7 : C hr o mato g r af ic k á s ep ar ace fo s f ata s o vé a kt i vi t y z í s ka né k ys elo u e x tr a k cí na s lo up c i Co n A S ep ha r o s y; o b s a h b í l ko vi n - a b so r b a n ce p ř i 2 8 0 n m ( mo d r á) ; fo s fa ta so vá a kt i vi ta ( žl u tá) ; E - el uc e 0 ,2 M α -D - me t h yl g l u ko p yr a no s id e m; Co n A- sp o j e ná ne g l yk o s ylo v a n á fr a kc e; Co n A+ - sp o j e ná g l yk o s ylo v a ná fr a kce .

4.1.4. ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE Zastoupení bílkovin v jednotliv ých frakcích b ylo sledováno elektroforetickou separací v prostředí SDS. Pro porovnání b yl y použit y vzork y z extrakce pufrem Tris/HCl pH 8,1 a acetátov ým pufrem pH 4,9; hrub ý extrakt, nezach ycená frakce (negl ykos ylovaná) a frakce zach ycená na Con A Sepharose (glykos ylovaná). Použitá metoda je popsaná v kapitole 3.2.4.1. Jako standard y relativních molekulov ých hmotností jsem použila albumin (66 000), ovalbumin (45 000), gl yceraldeh yd-3-fosfát deh ydrogenasu (36 000), karbonát anh ydrasa (29 000), trypsinogen (24 000), inhibitor trypsinu (20 000). Z obrázku č. 18 můžeme soudit, že gl ykos ylovaná frakce (kConA+, aConA+) obsahuje především molekul y o relativní molekulové hmotnosti přibližně 30 000. Lze také pozorovat slabší tenk ý proužek bílkovin o relativní molekulové hmotnosti přibližně 23 000. Širší slabší proužek

42

vidíme také v oblasti relativních molekulov ých hmotností okolo hodnot y 66 000. Dráh y hrubého extraktu (HE) a neglykos ylované frakce (ConA-) jsou si navzájem podobné a můžeme na nich pozorovat větší množství bílkovin. Je také patrné, že při k yselé extrakci jsou získáván y jiné protein y než při extrakci alkalické. V případě vzorků získan ých k yselou extrakcí (kHE, kConA-) vidíme několik v ýraznějších proužků především v oblasti od 23 000 do 45 000. V drahách alkalické extrakce (aHE, aConA-) můžeme pozorovat proužk y 45 000 a 66 000 a větší množství bílkovin v nerozlišen ých v yšších hodnotách.

Ob r áz e k 1 8 : Ge l p o e le k tr o fo r e tic k é sep ar ac i v d en at ur uj í cí m p r o s tř ed í b ar v e n ý Co o ma s ie B r il lia n t B l ue ; LM - sta nd ar d ; s tB S A - s ta nd ar d B S A; k Co n A + gl y k o s yl o va ná fr a kc e z ex tr a k ce v p H 4 ,9 ; k Co n A- - ne g l yk o s ylo va n á fr ak ce z e xt r a kc e v p H 4 ,9 ; kHE - hr ub ý e xt r a kt z e x tr a k ce p ř i p H 4 ,9 ; a Co n A+ - g l yk o s ylo va n á fr a k ce z ex tr a k ce v p H 8 ,1 ; a Co n A- - ne g l yk o s ylo va n á fr ak ce z e xt r a kc e v p H 8 , 1 ; a HE - hr ub ý ex tr a k t z e xtr a kce p ř i p H 8 ,1 .

43

4.2. C HARAKTERIZACE

FOSFATASOVÉ AKTIV IT Y VŮČI SUBSTRÁTU

P NP- FOSFÁT

4.2.1. VLIV PH PROSTŘEDÍ NA FOSFATASOVOU AKTIVITU Sledovala jsem fosfatasovou aktivitu gl ykos ylované a negl ykos ylované frakce v rozsahu pH 3,0 - 8,7 (viz 3.2.2.1.) a to jak pro vzork y získané jak k yselou, tak alkalickou extrakcí. V případě alkalické extrakce (obr. 19) vidíme, že pH optimum fosfatasové aktivit y leží při pH 5,5. Pro gl ykos ylovanou frakci (ConA+) je nárůst aktivit v oblasti pH optima v ýrazn ý, a to především v k yselé oblasti, až o 40% na jeden stupeň pH. Směrem k alkalické oblasti je pokles pozvolnější, přesto však značn ý. Negl ykos ylovaná frakce (ConA-) má také pH optimum 5,5, nárůst i pokles aktivit y je však méně v ýrazn ý, jen asi 20% na jeden stupeň pH.

Ob r áz e k 1 9 : Z á vi s lo st f o s fa ta so vé a kt i vi t y na p H p r o s ub s tr á t p NP - fo s f át p r o v zo r k y zí s ka né al k al ic ko u e x tr a kc í; Co n A+ - gl yk o s ylo v an á fr a k ce ( o sa v le vo ) ; Co n A- ne g l yk o s ylo va n á fr a k ce ( o sa vp r a vo ) .

44

Vzork y získané k yselou extrakcí (obr. 20), a to jak gl ykos ylované (ConA+), tak negl yk os ylované (ConA-), taktéž v ykazoval y nejv yšší fosfatasovou aktivitu při pH 5,5. Pro gl yk os ylovanou frakci b yl nárůst opět velmi v ýrazn ý, a to především v k yselé oblasti až o 65% na jeden stupeň pH. Směrem k alkalické oblasti b yl pokles zprvu pozvolnější a to přibližně až k pH 7, poté opět došlo k prudkému poklesu. Podobně jako u vzorků získan ých alkalickou extrakcí, i zde zaznamenala fosfatasová aktivita negl ykos ylované frakce jen mírn ý nárůst, asi 50% na jeden stupeň pH .

Ob r áz e k 2 0 : Z á vi s lo st f o s fa ta so vé a kt i vi t y na p H p r o s ub s tr á t p NP - fo s f át p r o v zo r k y zí s ka né k ys e lo u e x tr a k cí ; Co n A+ - gl yk o s yl o va n á fr a kc e ( o sa v le vo ) ; Co n A- ne g l yk o s ylo va n á fr a k ce ( o sa vp r a vo ) .

4.2.2. VLIV TEPLOTY NA FOSFATASOVOU AKTIVITU Sledovala jsem vliv teplot y na fosfatasovou aktivitu gl ykos yl ované frakce získané extrakcí v k yselém prostředí a stanovila teplotní stabilitu a teplotní optimum fosfatasové aktivit y. Aktivitu jsem stanovovala při pH optimu enz ymu (pH 5,5). Metoda stanovení je popsána v kapitole 3.2.2.

45

4.2.2.1. Teplotní stabilita Sledovala jsem vliv inkubační teplot y enzymu na jeho stabilitu. Enz ym b yl po dobu 10 min inkubován v lázni při teplotách v rozmezí 22 - 80 °C. Jak ukazuje obrázek 21, fosfatasová aktivita zůstávala stabilní až do teplot y 50 °C. Při v yšších teplotách začala fosfatasová aktivita klesat, při 70 °C došlo k inaktivaci enzymu.

Ob r áz e k 2 1 : Vl i v tep lo t y n a s tab il it u e nz y mu s fo s fa ta so vo u a k ti v ito u z g l yk o s yl o va n é fr a k ce k ys e lé e xtr a kce p r o s ub str át p NP - fo s fát .

4.2.2.2. Teplotní optimum Sledovala jsem také vliv teplot y reakční směsi na aktivitu enzymu. Z grafu je patrné, že fosfatasová aktivita nejprve zvolna vzrůstá a dosahuje maxima při 60 °C, poté nastává prudk ý pokles aktivit y. Teplotní optimum pro fosfatasovou aktivitu je 60 °C.

46

Ob r áz e k 2 2 : Vl i v tep lo t y n a fo s fat a so vo u a k ti vi tu gl yk o s ylo v a né fr a kce k ys e lé e x tr a k ce p r o s ub str át p NP - fo s fát .

4.2.3. VLIV PŘÍTOMNOSTI IONTŮ NA FOSFATASOVOU AKTIVITU Je známo (kap. 1.3), že některé fosfatas y jsou aktivován y ionty kovů. Sledovala jsem proto vliv přítomnosti některých iontů (Mg 2 + , Ca 2 + , Mn 2 + , Co 2 + , Fe 3 + , Ni 2 + , Zn 2 + ) na fosfatasovou aktivitu. Měření jsem prováděla podle postupu v kapitole 3.2.2. Sledovala jsem, jak ým způsobem iont y ovlivňují fosfatasovou aktivitu gl ykos ylované i negl ykos ylované frakce získan ých alkalickou extrakcí a gl ykos ylované frakce získané k yselou extrakcí.

4.2.3.1. Vliv hořečnatých iontů na fosfatasovou aktivitu U vzorků získan ých alkalickou extrakcí (obr. 23) zv yšovala přítomnost iontů Mg 2 + fosfatasovou aktivitu gl ykos ylované frakce až do koncentrace 1 mM, a to přibližně o 43 %. Vyšší koncentrace iontů už neměly na fosfatasovou aktivitu vliv. U negl ykos ylované frakce jsem mohla pozorovat podobn ý průběh, ale došlo jen ke 21% zv ýšení aktivit y.

47

Ob r áz e k 2 3 : Vl i v ho ř eč n at ýc h io nt ů n a fo s fa ta so vo u a kti v it u , a l kal ic k á e xt r a kc e; Co n A+ - g l yk o s yl o va n á fr a k ce ( o s a vle vo ) ; Co n A- - ne g l yk o s ylo va n á fr ak ce ( o sa vp r a vo ) .

Podobn ý nárůst fosfatasové aktivit y při přídavku Mg 2 + iontů můžeme sledovat také u gl ykos ylované frakce získané k yselou extrakcí (obr. 24), tam ale došlo jen k 10 % zv ýšení.

Ob r áz e k 2 4 : Vl i v ho ř eč n at ýc h io nt ů n a fo s fa ta so vo u a kti v it u , k ys el á e x tr ak ce; Co n A+ gl y k o s yl o va ná fr a kc e.

48

4.2.3.2. Vliv vápenatých iontů na fosfatasovou aktivitu Přítomnost Ca 2 + iontů zv yšovala fosfatasovou aktivitu gl ykosylované frakce z alkalické extrakce (obr. 25) především ve v yšších koncentracích a to až o 45 %. U neglykos ylované frakce je naopak možné zaznamenat mírn ý (15%) pokles fosfatasové aktivit y.

Ob r áz e k 2 5 : Vl i v váp e n at ýc h io nt ů n a fo s fa ta so vo u a kti v it u , a l kal ic k á e xt r a kc e; Co n A+ - g l yk o s ylo va n á fr a k ce ( o sa v le vo ) ; Co n A- - ne g l yk o s yl o va ná fr a kc e ( o s a v p r a vo ) .

K mírnému (7%) zv ýšení fosfatasové aktivit y přídavkem Ca 2 + iontů docházelo i v případě gl ykos ylované frakce k yselé extrakce (obr. 26), a to až do koncentrace 0,5 mM.

Ob r áz e k 2 6 : Vl i v váp e n at ýc h io nt ů n a fo s fa ta so vo u a kti v it u , k ys el á e x tr ak ce; Co n A+ gl y k o s yl o va ná fr a kc e.

49

4.2.3.3. Vliv kobaltnatých iontů na fosfatasovou aktivitu Přítomnost Co 2 + iontů způsobila mírné snížení fosfatasové aktivit y gl ykos ylované frakce jak v případě alkalické (obr. 27), tak v případě k yselé (obr. 28) extrakce, a to o 12%, respektive 11%. Negl ykos ylovaná frakce alkalické extrakce (obr. 27) nev ykazovala při přídavku Co 2 + iontů v ýrazné změn y.

Ob r áz e k 2 7 : Vl i v ko b a lt na t ýc h io nt ů n a fo s fa ta s o vo u a kti v it u , a l kal ic k á ex tr a k ce; Co n A+ - g l yk o s yl o va n á fr a k ce ( o s a vle vo ) ; Co n A- - ne g l yk o s ylo va n á fr ak ce ( o sa vp r a vo ) .

Ob r áz e k 2 8 : Vl i v ko b a lt na t ýc h io nt ů n a fo s fa ta s o vo u a kti v it u , k ys el á e x tr a kc e; Co n A+ gl y k o s yl o va ná fr a kc e.

50

4.2.3.4. Vliv manganatých iontů na fosfatasovou aktivitu Přítomnost Mn 2 + iontů způsobila v ýrazné snížení fosfatasové aktivit y všech měřen ých frakcí. V případě alkalické extrakce došlo ke snížení aktivit y obou frakcí, gl ykos ylované i negl ykos ylované, o 30% (obr. 29]). U gl ykos ylované frakce k yselé extrakce (obr. 30) došlo ke snížení fosfatasové aktivit y o 22 %.

Ob r áz e k 2 9 : Vl i v ma n g a na t ýc h io nt ů n a fo s fa ta s o vo u a kti v it u , a l kal ic k á ex tr a k ce; Co n A+ - g l yk o s yl o va n á fr a k ce ( o s a vle vo ) ; Co n A- - ne g l yk o s ylo va n á fr ak ce ( o sa vp r a vo ) .

Ob r áz e k 3 0 : Vl i v ma n g a na t ýc h io nt ů n a fo s fa ta s o vo u a kti v it u , k ys el á e x tr a kc e; Co n A+ - g l yk o s ylo va n á fr a k ce.

51

4.2.3.5. Vliv železitých iontů na fosfatasovou aktivitu Fosfatasová aktivita gl ykos ylované frakce k yselé extrakce b yla přítomností Fe 3 + iontů zv ýšena až o 2 6%. Toto zv ýšení je patrné především ve v yšších koncentracích Fe 3 + iontů. Negl ykos ylovaná frakce nev ykazovala žádné měřitelné změn y (Obr. 31).

Ob r áz e k 3 1 : Vl i v ž el eži t ýc h io nt ů na fo s fa ta so vo u a k ti v it u , a l kal ic k á e x t r ak ce ; Co n A+ gl y k o s yl o va ná fr a kc e ( o sa v le vo ) ; Co n A- - ne g l yk o s ylo v a ná fr a kce ( o s a vp r a vo ) .

V případě gl ykos ylované frakce z k yselé extrakce (obr. 32) způsobila přítomnost Fe 3 + iontů pokles fosfatasové aktivit y, patrn ý především při v yšších koncentracích iontu, a to až o 17 %.

52

Ob r áz e k 3 2 : Vl i v ž el ezi t ýc h io nt ů na fo s fa ta so vo u a k ti v it u , k ys el á e x tr a k ce; Co n A+ gl y k o s yl o va ná fr a kc e.

4.2.3.6. Vliv nikelnatých iontů na fosfatasovou aktivitu Přítomnost iontů způsobila především ve v yšších koncentracích iontů mírné zvýšení fosfatasové aktivit y gl ykos ylované frakce alkalické extrakce (obr. 33), přibližně o 10 %. Negl ykos ylovaná frakce neprojevila žádné měřitelné fosfatasové aktivit y.

Ob r áz e k 3 3 : Vl i v n i kel n at ýc h io nt ů n a fo s fa ta so vo u a kti v it u , a l kal ic k á e xt r a kc e; Co n A+ - g l yk o s ylo va n á fr a k ce ( o sa v le vo ) ; Co n A- - ne g l yk o s yl o va ná fr a kc e ( o s a v p r a vo ) .

53

Gl ykos ylovaná frakce k yselé extrakce (obr. 34) v ykazovala v přítomnosti Ni 2 + iontů zv ýšenou fosfatasovou aktivitu, o 18%, a to především při v yšších koncentracích iontů.

Ob r áz e k 3 4 : Vl i v n i kel n at ýc h io nt ů n a fo s fa ta so vo u a kti v it u , k ys el á e x tr ak ce; Co n A+ gl y k o s yl o va ná fr a kc e.

4.2.3.7. Vliv zinečnatých iontů na fosfatasovou aktivitu Přítomnost Zn 2 + iontů nezpůsobila žádné v ýrazné změn y v aktivitě žádné z měřen ých frakcí. (Obr. 35)

Ob r áz e k 3 5 : Vl i v z i ne č n at ýc h io nt ů n a fo s fa ta so vo u a kti v it u , a l kal ic k á e xt r a kc e; Co n A+ - g l yk o s yl o va n á fr a k ce ( o s a vle vo ) ; Co n A- - ne g l yk o s ylo va n á fr ak ce ( o sa vp r a vo ) .

54

4.2.4. ZÁVISLOST FOSFATASOVÉ AKTIVITY NA KONCENTRACI SUBSTRÁTU PNPFOSFÁTU

Závislost rychlosti reakcí katal yzovan ých fosatasami na koncentraci pNPfosfátu v gl ykos ylovan ých a negl ykos ylovan ých frakcích získan ých jak k yselou, tak alkalickou extrakcí, je znázorněna na obrázcích 36, 37, 38 a 39. Ve všech případech je to závislost h yperbolická. Základní kinetické parametry, Michaelisovu konstantu K m a maximální rychlost reakce V m a x , jsem stanovila pomocí nelineární regrese. Výsledk y jsou uveden y v tabulce 3. Ověření těchto údajů b ylo provedeno dvojnásobně reciprokým v ynesením podle Lineweavera a Burkea (vložené obrázk y). Postup stanovení je uveden v kapitole 3.2.2.2.

A

Ob r áz e k 3 6 : Z á vi s lo st r yc h lo st i r ea k ce k ata l yzo va n é fo s fa ta so vo u a k ti v i to u gl y k o s yl o va né fr a kc e a l ka li c ké e x tr a k ce n a ko n ce ntr aci s ub s tr át u p NP - f o s fá t u ( A) . D vo j ná so b ně r ec ip r o ké v yn e se n í p o d le L i ne wea ver a a B ur k ea zá vi s lo s ti r yc hlo st i r ea kce kat al yz o va né fo s fa ta so vo u a k ti v ito u gl yk o s ylo v a né fr a kce al k al ic ké e xtr a kce na ko nc e ntr aci s ub s tr át u p NP - fo s f át u ( B ) .

55

Ob r áz e k 3 7 : Z á vi s lo st r yc h lo st i r ea k ce k ata l yzo va n é fo s fa ta so vo u a k ti v i to u gl y k o s yl o va né fr a kc e k y se lé e x tr a k ce na ko nce n t r aci s ub st r át u p NP - fo s fá tu ( A) . D vo j ná so b ně r ec ip r o ké v yn e se n í p o d le L i ne wea ver a a B ur k ea zá vi s lo s ti r yc hlo st i r ea kce kat al yz o va né fo s fa ta so vo u a k ti v ito u gl yk o s ylo v a né fr a kce k ys e lé ex tr a k ce na ko nc e ntr aci s ub s tr át u p NP - fo s f át u ( B ) .

Ob r áz e k 3 8 : Z á vi s lo st r yc h lo st i r ea k ce k ata l yzo va n é fo s fa ta so vo u a k ti v i to u ne g l yk o s ylo va n é fr a k ce al ka lic k é e x tr a kc e na ko nc e ntr aci s ub s tr át u p NP - fo s fá t u ( A) . D vo j ná so b ně r ec ip r o ké v yn e se n í p o d le L i ne wea ver a a B ur k ea zá vi s lo s ti r yc hlo st i r ea kce kat al yz o va né fo s fa ta so vo u a k ti v ito u ne gl yk o s ylo v a né fr a kce al k a lic k é e x tr a kc e na k o nce n tr ac i s ub str á t u p NP - f o s f át u ( B ) .

56

Ob r áz e k 3 9 : Z á vi s lo st r yc h lo st i r ea k ce k ata l yzo va n é fo s fa ta so vo u a k ti v i to u ne g l yk o s ylo va n é fr a k ce k ys e lé e x tr a k ce na ko nc en tr a ci s ub str át u p NP - fo s fá t u ( A) . D vo j ná so b ně r ec ip r o ké v yn e se n í p o d le L i ne wea ver a a B ur k ea zá vi s lo s ti r yc hlo st i r ea kce kat al yz o va né fo s fa ta so vo u a k ti v ito u ne gl yk o s ylo v a né fr a kce k ys e lé e x tr a k ce na ko nc e ntr aci s ub s tr át u p NP - fo s f át u ( B ) . T ab ul ka 3 : Ki n et ic ké p a r a metr y ( K m - Mic h ae li s o va ko ns ta n ta; V m a x - m ax i má l ní r yc h lo st r ea kc e) fo s fa ta s o vé a kt i vi t y gl yk o s yl o v an ýc h ( Co n A+) a n e gl yk o s ylo v a n ýc h ( Co n A- ) fr a k cí zí s ka n ýc h a l ka li c ko u a k ys e lo u e xt r a kc í.

extrakce

frakce

Km [mM]

Vmax [µmol/min*mg]

ConA+

0,39

55,97

ConA-

1,19

2,03

ConA+

0,34

84,11

ConA-

1,70

6,49

alkalická

k yselá Afinita enz ymu k substrátu b yla pro enz ymy z gl ykos ylované frakce v případě alkalické i kyselé extrakce v yšší než fosfatas y z frakce negl ykos ylované. Maximální rychlost reakce vztažená na mg proteinu b yla také mnohem v yšší pro enz ym y z gl ykos ylovan ých frakcí.

57

4.3. C HARAKTERIZACE

FOSFATASOVÉ AKTIV IT Y VŮČI

NÍZK OMOLEKULÁRNÍM SUBSTRÁTŮM

Zkoumala jsem, zda jako substrát y pro fosfatasovou aktivitu z listů tabáku mohou kromě pNP-fosfátu sloužit i další nízkomolekulární fosforylované látk y. Sledovala jsem fosfatasovou aktivitu vůči P-serinu, ATP a glukosa6-fosfátu. Fosfatasovou aktivitu jsem určovala pomocí stanovení volného fosfátu podle postupu uvedeného v kapitole 3.2.3.1.

4.3.1. CHARAKTERIZACE FOSFATASOVÉ AKTIVITY VŮČI P-SERINU Při stanovování fosfatasové aktivit y vůči substrátu fosfoserinu jsem pracovala s gl ykos yl ovanou i negl ykos ylovanou frakcí k yselé i alkalické extrakce. Protože fosfatasová aktivita neglykos ylované frakce vůči P-serinu nev ykazovala žádné měřitelné hodnot y, uvádím pouze v ýsledky práce s gl ykos ylovanou frakcí.

4.3.1.1. Závislost fosfatasové aktivity na čase Sledovala jsem časov ý průběh štěpení P-serinu při reakci katal yzované fosfatasami. Metoda je popsána v kapitole 3.2.3.2. Na obr. 40 můžeme vidět, že je přírůstek volného fosfátu lineární po dobu 20 min, ke 30 min už dochází ke zpomalení. Další měření jsem proto prováděla v intervalu do 20 min.

58

Ob r áz e k 4 0 : Z á vi s lo st m no ž s t ví u vo l ně né ho fo s f át u na ča se p ř i št ěp e n í P - ser i n u fo s fa ta sa mi .

4.3.1.2. Závislost fosfatasové aktivity na pH Fosfatasovou aktivitu gl ykos ylovan ých frakcí k yselé a alkalické extrakce jsem sledovala při rozsahu pH 3,0 - 8,6. U obou frakcí (obr. 41) můžeme sledovat značn ý nárůst fosfatasové aktivity v mírně k yselém pH s pH optimem 6,5. Směrem k alkalické oblasti je pokles prudší než směrem k oblasti k yselé. Obě frakce mají navzájem velmi podobnou závislost fosfatasové aktivit y na pH.

Ob r áz e k 4 1 : Z á vi s lo st f o s fa ta so vé a kt i vi t y na p H p r o s ub s tr á t P - ser i n p r o gl y k o s yl o va né fr a kc e z í s ka né k ys elo u ( k Co n A+, mo d r á) a al k al ic ko u e x t r ak cí ( a Co n A+, čer ve ná) e xt r a kc í.

59

4.3.1.3. Závislost fosfatasové aktivity na koncentraci substrátu P-serinu Na obrázcích 42 a 43 je znázorněna h yperbola závislosti rychlosti reakce katal yzované fosfatasami na koncentraci substrátu P-serinu pro gl ykos ylované frakce k yselé, respektive alkalické extrakce. Michaelisova konstanta K m a maximální rychlost reakce V m a x (tab. 4) b yl y stanoven y pomocí nelineární regrese. Ověření údajů b ylo provedeno dvojnásobně reciprok ým v ynesením dle Lineweavera a Burkea (vložené obrázk y).

Ob r áz e k 4 2 : Z á vi s lo st r yc h lo st i r ea k ce k ata l yzo va n é fo s fa ta so vo u a k ti v i to u gl y k o s yl o va né fr a kc e k y se lé e x tr a k ce na ko nce n t r aci s ub st r át u P - ser i n u ( A) . D vo j ná so b ně r ec ip r o ké v yn e se n í p o d le L i ne wea ver a a B ur k ea zá vi s lo s ti r yc hlo st i r ea kce kat al yz o va né fo s fa ta so vo u a k ti v ito u gl yk o s ylo v a né fr a kce k ys e lé ex tr a k ce na ko nc e ntr aci s ub s tr át u P - ser i n u ( B ) .

60

Ob r áz e k 4 3 : Z á vi s lo st r yc h lo st i r ea k ce k ata l yzo va n é fo s fa ta so vo u a k ti v i to u gl y k o s yl o va né fr a kc e a l ka li c ké e x tr a k ce n a ko n ce ntr aci s ub s tr át u P - se r i n u ( A) . D vo j ná so b ně r ec ip r o ké v yn e se n í p o d le L i ne wea ver a a B ur k ea zá vi s lo s ti r yc hlo st i r ea kce kat al yz o va né fo s fa ta so vo u a k ti v ito u gl yk o s ylo v a né fr a kce al k al ic ké e xtr a kce na ko nc e ntr aci s ub s tr át u P - ser i n u ( B ) . T ab ul ka 4 : Ki n et ic ké p a r a metr y ( K m - Mic h ae li s o va ko ns ta n ta; V m a x - m ax i má l ní r yc h lo st r ea kc e) fo s fa ta s o vé a kt i vi t y gl yk o s yl o v an ýc h fr a k cí zí s ka n ýc h al ka lic ko u a k ys e lo u e x tr a kc í p r o s ub str át P - ser i n.

Km Extrakce [mM]

Vmax [µmol/min*mg]

k yselá

1,70

41,67

alkalická 0,37

25,92

Afinita enz ymu k substrátu P-serinu b yla v yšší v případě frakce získané alkalickou extrakcí. Gl ykos ylovaná frakce získaná k yselou extrakcí měla v yšší maximální reakční rychlost.

61

4.3.2. CHARAKTERIZACE FOSFATASOVÉ AKTIVITY VŮČI ATP Stanovovala jsem fosfatasovou aktivitu vůči substrátu ATP gl ykos ylované i negl ykos ylované frakce k yselé i alkalické extrakce. Fosfatasová aktivita negl ykos ylované frakce nev ykazovala žádné měřitelné hodnoty, jsou proto uveden y pouze v ýsledk y práce s gl ykos yl ovanou frakcí.

4.3.2.1. Závislost fosfatasové aktivity na čase Při reakci katal yzované fosfatasami b yl sledován časov ý průběh štěpení ATP. Z obrázku 44 vidíme, že po dobu 20 min je přírůstek volného fosfátu lineární, poté dochází ke zpomalení přírůstku. Další měření tak mohla b ýt prováděna v intervalu do 20 min.

Ob r áz e k 4 4 : Z á vi s lo st m no ž s t ví u vo l ně né ho fo s f át u na ča se p ř i št ěp e n í AT P fo s fa ta sa mi .

4.3.2.2. Závislost fosfatasové aktivity na pH Závislost fosfatasové aktivit y gl ykos ylovan ých frakcí alkalické extrakce jsem sledovala při rozsahu pH 3,0-8,6 (obr. 45). Optimální reakční pH nacházíme při hodnotě pH 5. Směrem ke k yselé oblasti je změna aktivit y

62

pozvolnější, směrem k alkalické oblasti dochází k prudšímu poklesu aktivit y.

Ob r áz e k 4 5 : Z á vi s lo st f o s fa ta so vé a kt i vi t y na p H p r o s ub s tr á t AT P p r o gl y k o s yl o va no u fr a k ci k ys e lé e xtr a kce .

4.3.2.3. Závislost fosfatasové aktivity na koncentraci substrátu ATP Hyperbolická závislost rychlosti reakce katal ysované fosfatasami na koncentraci ATP je znázorněná na obrázcích 46 a 47. Kinetické parametry Michaelisova konstanta K m a maximální rychlost reakce V m a x b yl y stanovován y metodou nelineární regrese, získané hodnot y jsou zaznamenán y v tabulce 5. Údaje b yl y ověřen y dvojnásobně reciprok ým v ynesením podle Lineweavera a Burkea (vložené obrázk y).

63

Ob r áz e k 4 6 : Z á vi s lo st r yc h lo st i r ea k ce k ata l yzo va n é fo s fa ta so vo u a k ti v i to u gl y k o s yl o va né fr a kc e a l ka li c ké e x tr a k ce n a ko n ce ntr aci s ub s tr át u AT P ( A) . D vo j ná so b ně r ec ip r o ké v yn e se n í p o d le L i ne wea ver a a B ur k ea zá vi s lo s ti r yc hlo st i r ea kce kat al yz o va né fo s fa ta so vo u a k ti v ito u gl yk o s ylo v a né fr a kce al k al ic ké e xtr a kce na ko nc e ntr aci s ub s tr át u AT P ( B ) .

Ob r áz e k 4 7 : Z á vi s lo st r yc h lo st i r ea k ce k ata l yzo va n é fo s fa ta so vo u a k ti v i to u gl y k o s yl o va né fr a kc e k y se lé e x tr a k ce na ko nce n t r aci s ub st r át u AT P ( A) . D vo j ná so b ně r ecip r o k é v yn e se n í p o d l e Li n e we a ver a a B ur ke a zá vi slo s ti r yc h lo st i r ea k ce ka ta l yzo va n é fo s fa ta so v o u a kti v ito u gl yk o s ylo v an é fr a k ce k ys e lé e xtr a k ce na ko nc e ntr aci s ub s tr át u AT P ( B ) .

64

T ab ul ka 5 : Ki n et ic ké p a r a metr y ( K m - Mic h ae li s o va ko ns ta n ta; V m a x - m ax i má l ní r yc h lo st r ea kc e) fo s fa ta s o vé a kt i vi t y gl yk o s yl o v an ýc h fr a k cí zí s ka n ýc h al ka lic ko u a k ys e lo u e x tr a kc í p r o s ub str át AT P .

Extrakce

Km [mM]

Vmax [µmol/min*mg]

k yselá

0,26

35,22

alkalická 0,30

45,27

Míra afinit y k substrátu je pro obě gl ykosylované frakce, získané k yselou i alkalickou extrakcí, srovnatelná. Frakce získaná alkalickou dosahuje v yšší maximální reakční rychlosti.

4.3.2. CHARAKTERIZACE FOSFATASOVÉ AKTIVITY VŮČI GLUKOSA-6-P Byla stanovována fosfatasová aktivita vůči substrátu glukosa-6-fosfát pro gl ykos ylované i neglykos ylované frakce získané k yselou i alkalickou extrakcí. Fosfatasová aktivita negl ykos ylované frakce nedosahovala měřiteln ých hodnot, uvádím proto pouze v ýsledk y práce s gl ykos ylovanou frakcí.

4.3.3.1. Závislost fosfatasové aktivity na čase Sledovala jsem časov ý průběh štěpení glukosa-6-fosfátu při reakci katal yzované fosfatasami. Z obrázku 48 je patrná lineární závislost v intervalu do 20 min a poté mírn ý pokles rychlosti přírůstku volného fosfátu. Další měření tak mohla b ýt prováděna v intervalu do 20 min.

65

Ob r áz e k 4 8 : Z á vi s lo st m no ž s t ví u vo l ně né ho fo s f át u na ča se p ř i št ěp e n í G6 P fo s fa ta sa mi .

4.3.3.2. Závislost fosfatasové aktivity na pH Sledovala jsem závislost fosfatasové aktivit y gl ykos ylovan ých frakcí alkalické extrakce v pH rozsahu 3,0-8,6 a hledala pH optimum (obr. 49). Nárůst fosfatasové aktivit y b yl v k yselé oblasti pozvoln ý a pH optimum se nacházelo při hodnotě pH 6. V alkalické oblasti docházelo k prudšímu poklesu fosfatasové aktivit y.

Ob r áz e k 4 9 : Z á vi s lo st f o s fa ta so vé a kt i vi t y na p H p r o s ub s tr á t G6 P p r o gl y k o s yl o va no u fr a k ci k ys e lé e xtr a kce .

66

4.3.3.3. Závislost fosfatasové aktivity na koncentraci substrátu glukosa-6-fosfát Na obrázcích 50 a 51 je znázorněna h yperbolická závislost rychlosti reakce katal yzované fosfatasami na koncentraci substrátu G6P. Metodou nelineární regrese jsem stanovovala Michaelisovu konstantu K m a maximální rychlost reakce V m a x (tab. 6) a ověřovala je dvojnásobně reciprok ým vynesením podle Lineweavera a Burkea (vložené obrázk y).

Ob r áz e k 5 0 : Z á vi s lo st r yc h lo st i r ea k ce k ata l yzo va n é fo s fa ta so vo u a k ti v i to u gl y k o s yl o va né fr a kc e a l ka li c ké e x tr a k ce n a ko n ce ntr aci s ub s tr át u G6 P ( A) . D vo j ná so b ně r ec ip r o ké v yn e se n í p o d le L i ne wea ver a a B ur k ea zá vi s lo s ti r yc hlo st i r ea kce kat al yz o va né fo s fa ta so vo u a k ti v ito u gl yk o s ylo v a né fr a kce al k al ic ké e xtr a kce na ko nc e ntr aci s ub s tr át u G 6 P ( B ) .

67

Ob r áz e k 5 1 : Z á vi s lo st r yc h lo st i r ea k ce k ata l yzo va n é fo s fa ta so vo u a k ti v i to u gl y k o s yl o va né fr a kc e k y se lé e x tr a k ce na ko nce n t r aci s ub st r át u G6 P ( A) . D vo j ná so b ně r ecip r o k é v yn e se n í p o d l e Li n e we a ver a a B ur ke a zá vi slo s ti r yc h lo st i r ea k ce ka ta l yzo va n é fo s fa ta so v o u a kti v ito u gl yk o s ylo v an é fr a k ce k ys e lé e xtr a k ce na ko nc e ntr aci s ub s tr át u G 6 P ( B ) . T ab ul ka 6 : Ki n et ic ké p a r a metr y ( K m - Mic h ae li s o va ko ns ta n ta; V m a x - m ax i má l ní r yc h lo st r ea kc e) fo s fa ta s o vé a kt i vi t y gl yk o s yl o v an ýc h fr a k cí zí s ka n ýc h al ka lic ko u a k ys e lo u e x tr a kc í p r o s ub str át AT P .

Extrakce k yselá

Km [mM]

Vmax [µmol/min*mg]

0,47

24,99

alkalická 0,67

32,38

Gl ykos ylovaná frakce získaná k yselou extrakcí v ykazuje mírně v yšší afinitu k substrátu. Frakce získaná alkalickou extrakcí pak dosahuje v yšší maximální reakční rychlosti.

68

4.4. C HARAKTERIZACE

FOSFATASOVÉ AKTIV IT Y VŮČI

VYSOKOMOLEKULÁRNÍM SUBSTRÁTŮM

Kromě nízkomolekulárních substrátů jsem testovala také schopnost fosfatasové aktivit y získané z listů tabáku defosforylovat fosfoprotein y. Za substrát y mi sloužil y protein y kasein a fosvitin.

4.4.1. CHARAKTERIZACE FOSFATASOVÉ AKTIVITY VŮČI KASEINU Sledovala jsem, zda připravené fosfatas y budou působit na fosfoprotein kasein metodou stanovení volného fosfátu, která je popsána v kapitole 3.2.3.1. Neb yla zjištěna žádná aktivita vůči kaseinu, ať u gl yk os ylované nebo negl ykos ylované frakce, a to pro frakce získané jak alkalickou, tak k yselou extrakcí. Nechala jsem kasein štěpit působením enzymu trypsinu (kap. 3.2.3.4.) a po dvou hodinách odebrala vzork y. Ani vůči těmto štěpům neb yla prokázána žádná fosfatasová aktivita připraven ých enzymů. Stejně tak neb yla naměřena žádná aktivita vůči kaseinov ým štěpům vznikl ým štěpením trypsinem po dobu 24 hodin.

4.4.2. CHARAKTERIZACE FOSFATASOVÉ AKTIVITY VŮČI PROTEINU FOSVITINU Stanovovala jsem fosfatasovou aktivitu pro gl ykos ylovanou i negl ykos ylovanou frakci k yselé extrakce. Protože aktivita neglykos ylované frakce nedosahovala žádn ých měřiteln ých hodnot, uvádím pouze v ýsledk y aktivit frakce gl ykosylované. Postup měření je uveden v kapitole 3.4.3.3.

4.4.2.1. Závislost fosfatasové aktivity na čase Sledovala jsem časov ý průběh štěpení fosvitinu při reakci katal yzované fosfatasami. Z obrázku 52 je patrná lineární závislost v intervalu do 30 min. Další měření tak mohla b ýt prováděna v tomto intervalu.

69

Ob r áz e k 5 2 : Z á vi s lo st m no ž s t ví u vo l ně né ho fo s f át u na ča se p ř i št ěp e n í f o s vi ti n u fo s fa ta sa mi .

4.3.2.2. Závislost fosfatasové aktivity na pH Sledovala jsem fosfatasovou aktivitu gl ykos ylovan ých frakcí kyselé extrakce vůči fosvitinu při rozsahu pH 3,0-8,6. Měřená aktivita v ykazovala poměrně strm ý nárůst naměřen ých hodnot až k pH optimu 5,5. V alkalické oblasti je opět pokles poměrně strm ý (obr. 53).

Ob r áz e k 5 3 : Z á vi s lo st f o s fa ta so vé a kt i vi t y na p H p r o s ub s tr á t fo s vi ti n p r o gl y k o s yl o va no u fr a kc i k ys e lé e x tr a k ce

70

4.3.2.3. Závislost fosfatasové aktivity na koncentraci substrátu fosvitinu Závislost rychlosti reakce katal yzované glykos ylovanou frakcí z k yselé extrakce je h yperbolická (obr. 54). Základní kinetické parametry, Michaelisovu konstantu K m a maximální rychlost reakce V m a x , jsem stanovila pomocí metod y nelineární regrese. Výsledk y jsem uvedla do tabulk y 6. Získané údaje jsem ověřila dvojnásobně reciprok ým v ynesením podle Lineweavera a Burkea (vložen ý obrázek).

Ob r áz e k 5 4 : Z á vi s lo st r yc h lo st i r ea k ce k ata l yzo va n é fo s fa ta so vo u a k ti v i to u gl y k o s yl o va né fr a kc e k y se lé e x tr a k ce na ko nce n t r aci s ub st r át u f o s v it i n u ( A) . D vo j ná so b ně r ec ip r o ké v yn e se n í p o d le L i ne wea ver a a B ur k ea zá vi s lo s ti r yc hlo st i r ea kce kat al yz o va né fo s fa ta so vo u a k ti v ito u gl yk o s ylo v a né fr a kce k ys e lé ex tr a k ce na ko nc e ntr aci s ub s tr át u fo s vi ti n u ( B ) . T ab ul ka 7 : Ki n et ic ké p a r a metr y ( K m - Mic h ae li s o va ko ns ta n ta; V m a x - m ax i má l ní r yc h lo st r ea kc e) fo s fa ta s o vé a kt i vi t y gl yk o s yl o v an ýc h fr a k cí zí s ka n ýc h k ys e lo u ex tr a k cí p r o s ub s tr át fo s vi ti n .

Extrakce k yselá

Km [µM] 4,33

Vmax [µmol/min*mg] 13,53 71

Afinita gl ykos ylované frakce k substrátu je v ysoká. Maximální reakční rychlost je nižší než u nízkomolekulárních substrátů.

4.5. V LIV

FOSFATASOVÉ AKTIV IT Y NA VLASTNOST I

FOSFOENOLPYRUVÁTKARBOXYLASY

Defosforylace PEPC mění kinetické vlastnosti enz ymu. Zkoumala jsem změnu aktivit y defosforylované PEPC, změnu citlivosti vůči inhibici malátem a vůči aktivaci glukosa-6-fosfátem. K defosforylaci PEPC b yla použita jak glykos ylovaná tak neglykos ylovaná frakce k yselé extrakce. Protože vliv neglykos ylované frakce nev ykazoval žádné měřitelné v ýsledk y, uvádím pouze v ýsledk y frakce gl ykos ylované.

4.5.1. ZMĚNA AKTIVITY PEPC PO PŮSOBENÍ FOSFATAS TABÁKU Pozorovala jsem změnu aktivit y PEPC během 2 hodin působení fosfatasové aktivit y gl ykos ylované frakce získané k yselou extrakcí. Z obrázku 55 je patrn ý pokles aktivity v čase, v ýraznější pro PEPC s přidanou fosfatasovou aktivitou gl ykos ylované frakce k yselé extrakce. Pokles aktivity u kontrolního vzorku můžeme přisoudit působení vnitřních fosfatas nedostatečně purifikovaného vzorku.

Ob r áz e k 5 5 : Č aso v á z á v is lo st a k ti v it y P E P C v yj ád ř e ná v p r o ce n tec h p o p ů so b e n í fo s fa ta s. 1 0 0 % z n a me n á ak ti v it u P E P C v ča se t= 0 .

72

4.5.2. VLASTNOSTI PEPC PO PŮSOBENÍ FOSFATAS TABÁKU Pro PEPC ze semen kukuřice inkubovanou 2h s fosfatasami z rostlin tabáku b yl y změřen y následující hodnot y: aktivita PEPC při pH 8,1 a 7,3; inhibice malátem při pH 7,3; a aktivace G6P při pH 7,3 a subsaturační koncentraci PEP. Přesné koncentrace a postup jsou uveden y v kapitolách 3.2.5.4. a 3.2.5.5. Získané v ýsledk y jsou shrnut y v tabulce 8. Z uvedené tabulk y 8 v ypl ývá, že došlo k defosforylaci PEPC, tzn. b yl zjištěn pokles aktivity po 2hodinové inkubaci. Ke snížení aktivit y došlo i v kontrolní reakční směsi. Toto snížení aktivit y b ylo pravděpodobně způsobeno přítomností fosfatas y v preparátu PEPC. Také další parametry, které se používají k charakterizaci stavu fosforylace PEPC, jako poměr aktivit y PEPC při pH 7,3 a 8,1, inhibice malátem a aktivace G6P, ukazují na defosforylovan ý enzym v obou případech. T ab ul ka 8 : Vl i v p ů so b e n í fo s fat a s z r o s tli n tab á k u n a a kt i vi t u P E P C z k u k uř ice : 1 ) Z mě na a kt i vi t y j e u ve d en a v %; 1 0 0 % z na me n á a kt i vi t u P E P C v ča s e t =0 p r o in k u b ač n í s mě s s fo s fa ta so u i ko ntr o l u. 2 ) I n h ib i ce ma lá te m j e u v ed e na v %; 1 0 0 % zn a me ná a kt i vi t u P E P C p ř i p H 7 ,3 b ez p ř íd a v k u ma lá t u. 3 ) Ak t i va ce G6 P j e u ved e na v %; 1 0 0 % z na me n á a k ti v i tu P E P C p ř i p H 7 ,3 , s ub sa t ur ač n í ko nc e ntr aci P E P a b ez p ř íd a v k u G6 P .

Kontrola

PEPC + fosfatasa z listů tabáku

změna aktivit y po 2h inkubaci 1 )

58%

65%

poměr aktivit y pH 7,3/8,1

0,79

0,65

inhibice malátem 2 )

41%

36%

167%

180%

aktivace G6P 3 )

73

5. DISKUSE Fosfor, v ýznamn ý prvek pro život, se v organismech v ysk ytuje ve formě fosfátov ých iontů P i . Ty jsou esterick y vázané na mnohé organické molekul y. Hydrol ýzu těchto monoesterů fosfátu zprostředkovávají enz ym y fosfatas y (EC 3.1.3.x). Fosfatas y jsou enzym y přítomné ve všech živ ých organismech, v ysk ytují se napříč různ ými pletiv y a tkáněmi a i jejich role v organismu se různí. Fosfatas y tak hrají roli v metabolické regulaci, podílí se na energetickém metabolismu, zajišťují P i pro stavební účely, čímž ovlivňují i růst a v ýv oj organismů.

[1, 2, 11]

Tradičně se fosfatasy dělí podle optimálního pH na k yselé a alkalické. V rostlinách se zpravidla nev ysk ytuje klasická alkalická fosfatasa (EC 3.1.3.1) bez substrátové specifit y, jak ji známe z živočišn ých buněk [51], rostlinné alkalické fosfatas y jsou enz ymy s absolutní specifitou a jasně definovanou rolí v metabolismu.

[1, 2]

Rostlinné k yselé fosfatas y (EC 3.1.3.2) takovou specifitu nev ykazují, přesto je můžeme rozdělit na enz ym y bez substrátové specifity a na specializované enz ymy, které preferují jist ý substrát, jejich specifita však není absolutní.

[1]

Zvláštní pozornost si zaslouží proteinové fosfatas y (EC 3.1.3.16). Ty zajišťují defosforylaci proteinů, což je významná posttranslační modifikace. Zapojují se tak do signálních drah v rostlinách a podílejí se například na schopnosti rostlin reagovat na stresové podmínk y.

[8]

Cílem této práce b ylo blíže specifikovat fosfatasovou aktivitu v rostlinách tabáku a zhodnotit schopnost získan ých fosfatas defosforylovat jak nízkomolekulární substrát y, tak fosforylované protein y. Zvláštní pozornost b yla věnována vlivu defosforylace na aktivitu fosfoenolp yruvátkarbox ylas y (EC 4.1.1.31).

74

Dosavadní v ýzkum y zpravidla upřednostňoval y extrakci v k ys elém prostředí pro studium k ysel ých fosfatas

[28, 29, 30, 33]

a pro studium

proteinov ých fosfatas extrakci v prostředí alkalickém.

[39, 35, 42, 43]

K

extrakci fosfatasové aktivit y z listů tabáku jsem používala pufry o různém složení a pH. Použití alkalické extrakce bylo citlivější na přidání obou inhibitorů proteas a DTT, při k yselé extrakci se aktivita nav ýšila mírně při přidávání jednotliv ých stabilizačních prvků, jejich kombinace ale už aktivitu dál nezv yšovala (obr. 15). Extrakce v alkalickém prostředí posk ytovala větší množství proteinů a tím i v yšší aktivitu vztaženou na objem enz ymu, při použití k yselé extrakce jsem ale získala frakci s v yšší specifickou aktivitou (tabulk y 1 a 2). Různé způsob y extrakce také vedl y k odlišnému profilu bílkovin (obr. 18). Studium rostlinn ých fosfatas často v yužívá afinitní chromatografii na Con A Sepharose, to kvůli gl ykos ylované povaze některých fosfatas. 33]

[7, 28, 30, 31,

Provedla jsem separaci fosfatasové aktivity na Con A Sepharose a

získala tak glykosylovanou a neglykosylovanou frakci. Glykosylovaná frakce, byť s nízkým množstvím proteinů, vykazovala značnou aktivitu a její specifická aktivita byla o dva řády vyšší než specifická aktivita neglykosylované frakce (tabulky 1 a 2). Nízký obsah proteinů v glykosylované frakci potvrdila i elektroforetická separace v prostředí SDS (obr. 18). Fosfatasová aktivita v listech tabáku vykazovala vysoké teplotní optimum (60 °C). Zjištěná teplotní stabilita enzymu (50 °C) odpovídá stabilitě kyselé fosfatasy získané z Lupinus luteolus.

[29]

pH optima fosfatasové aktivity naměřená pro různé substráty se většinou nacházela v kyselé oblasti a to nejen pro nízkomolekulární substráty, ale i pro fosfoprotein fosvitin (tab. 9). Můžeme tak soudit, že i defosforylace fosvitinu probíhala za účasti kyselých fosfatas a ne fosfatas proteinových, jejichž reakční pH optimum leží v alkalické oblasti.

[2]

75

T ab ul ka 9 : p H o p t i mu m fo s fa ta so vé a kt i vi t y p r o r ůz n é s ub s tr á t y

substrát

pH

pNP-fosfát pro ConA+

5,5

pNP-fosfát pro ConA-

5,5

P-serin

6,5

ATP

5

G6P

6

fosvitin

5,5

Dvojmocné iont y ionty mají v ýznamn ý vliv na fosfatasovou aktivitu. Vliv sledovan ých iontů je shrnut v tabulce 10. Nejv ýraznější pozitivní vliv na aktivitu v ykazoval y hořečnaté iont y. To je rys t ypick ý pro některé k yselé fosfatas y a proteinfosfatas y t ypu 2C.

[11, 33]

Aktivace vápenat ými iont y se

opět projevuje u k ysel ých fosfatas a dále u proteinfosfatas t yp u 2B.

[11, 31]

Pokles aktivit y pod vlivem kobaltnat ých iontů odpovídá vlastnostem k ysel ých fosfatas.

[33]

Výrazná deaktivace manganat ými iont y b yla

zaznamenána i u jednoho t ypu k yselé fosfatas y.

[33]

Manganaté iont y mají

často podobné účinky na enz ymovou aktivitu jako hořečnaté iont y. To se projevuje i u některých rostlinn ých fosfatas, nacházíme ale i výjimk y.

[33]

Rozdíln ý vliv železitých iontů na gl ykos ylované frakce k yselé a alkalické extrakce naznačuje, že každou z extrakcí získáváme různé protein y s fosfatasovou aktivitou. Mnohé v ýzkum y potvrzují zinečnaté iont y jako spolehliv ý inhibitor fosfatasové aktivit y,

[28, 30, 33, 34]

je proto překvapivé,

že zde neb ylo zaznamenáno žádné působení.

76

T ab ul ka 1 0 : Vl i v p ř íd a v k u io nt ů n a fo s fa ta so v u ak ti v it u ; ↑ - n ár ů st ; ↑ ↑ - v ýr az n ý nár ů s t; ↓ - p o kl es ; ~ - b eze z mě n y; N - ne sta no v o vá no

Alkalická extrakce

Kyselá extrakce

Iont y

ConA+

ConA-

ConA+

Mg 2 +

↑↑

↑

↑

Ca 2 +

↑↑

↓

↑

Co 2 +

↓

~

↓

Mn 2 +

↓↓

↓

↓

Fe 3 +

↑↑

~

↓

Ni 2 +

↑

~

↑

Zn 2 +

~

~

N

Porovnávala jsem kinetické parametry fosfatasové aktivit y gl ykos ylovan ých a negl ykos ylovan ých frakcí získan ých k yselou a alkalickou extrakcí pro různé substrát y (tab. 11). S v ýjimkou pNP-fosfátu neb ylo možné měřit fosfatasovou aktivitu negl ykos ylovan ých frakcí. Gl ykos ylovaná frakce k yselé extrakce v ykazovala zpravidla větší afinitu k substrátu, v ýjimkou b yl substrát P-serin. V případě pNP-fosfátu a P-serinu také dosahovala v yšší maximální reakční rychlosti, naopak tomu b ylo u substrátů G6P a ATP. Jedním z cílů této diplomové práce b ylo studium proteinfosfatasové aktivit y enz ymov ých preparátů získan ých z rostlin tabáku. Testovala jsem jednak protein y obsahující mnoho fosfátov ých skupin, kasein z hovězího mléka a fosvitin ze slepičího žloutku, jednak rostlinn ý enz ym PEPC, který obsahuje pouze jednu fosfátovou skupinu, která znamená v ýznamnou modifikaci kinetick ých vlastností.

[44, 52]

77

Velmi vhodn ým substrátem se ukázal fosvitin, enz ymov ý preparát v ykazoval o dva řády v yšší afinitu než k nízkomolekulárním substrátům (tab. 11). Je zajímavé, že pro kasein ani pro tryptické štěp y kaseinu neb yl zjištěn odštěpen ý fosfát po působení fosfatas y z tabáku. Domnívám se, že pro tento substrát bude třeba zvolit jinou detekční metodu a zjistit, že skutečně nedochází k h ydrol ýze fosfátu. T ab ul ka 1 1 : Ki n et ic ké k o n st a nt y p r o r ůz né s ub st r át y a fr a kc e; X - n e ní s ub str áte m; N ne s ta no vo vá no ;

Alkalická extrakce substrát

veličina K m [mM]

ConA+

ConA-

Kyselá extrakce ConA+

ConA-

0,39

1,19

0,34

1,70

55,97

2,03

84,11

6,49

pNP-fosfát V m a x [µmol/min*mg] K m [mM]

0,37

X

1,70

X

25,92

X

41,67

X

0,30

X

0,26

X

45,27

X

35,22

X

0,67

X

0,47

X

V m a x [µmol/min*mg]

32,38

X

24,99

X

K m [mM]

N

N

4,33.10 - 3

X

V m a x [µmol/min*mg]

N

N

13,53

X

K m [mM]

X

X

X

X

V m a x [µmol/min*mg]

X

X

X

X

K m [mM]

X

X

X

X

V m a x [µmol/min*mg]

X

X

X

X

P-serin V m a x [µmol/min*mg] K m [mM] ATP V m a x [µmol/min*mg] K m [mM] G6P

fosvitin

kasein tryptické štěp y kaseinu

Pro zkoumání vlivu fosfatas y z tabáku na PEPC b yla zvolena PEPC ze semen kukuřice, protože je stabilnější než obdobn ý enz ym izolovan ý z 78

fotos yntetick ých částí rostlin a vlastnosti fosforylované a nefosforylované PEPC b yl y podrobně studován y v naší laboratoři.

[44, 52]

Při sledování

časového průběhu působení fosfatas y tabáku na PEPC ze semen kukuřice je patrn ý pokles aktivity, mírn ý pokles aktivit y b yl ale zjištěn i ve slepém pokusu, přestože b yl y použit y inhibitory proteas (obr. 55). Tento pokles aktivit y PEPC b y mohl b ýt způsoben přítomností fosfatas y v preparátu PEPC. Tento předpoklad potvrzují i další v ýsledk y: poměr aktivit y pH 7,3/8,1, inhibice malátem a aktivace glukosa-6-fosfátem. Pro tento pokus bude třeba připravit purifikovan ý preparát PEPC.

79

6. SOUHRN 1) Kyselou a alkalickou extrakcí b yl připraven enz ymov ý preparát s fosfatasovou aktivitou z listů tabáku. 2) Vyšší fosfatasová aktivita vůči substrátu pNP-fosfátu b yla zjištěna v gl ykos ylované frakci než ve frakci nevázající se na Con A Sepharosu, a to v případě k yselé i zásadité extrakce. 3) Byl studován vliv iontů kovů na fosfatasovou aktivitu; Mg 2 + , Ca 2 + měl y aktivační účinek; Mn 2 + a Co 2 + se projevoval y inhibičním účinkem; v případě Zn 2 + neb yl y zaznamenán y žádné účink y. 4) Pouze pro gl ykos ylovan ý enz ymov ý preparát b yla zjištěna schopnost h ydrol yzovat fosfát ze substrátů P-serin, ATP a glukosa-6-fosfát. 5) Gl ykos ylovan ý enz ymov ý preparát v ykazoval i proteinfosfatasovou aktivitu; štěpil fosfát z fosvitinu a z PEPC ze semen kukuřice.

80

7. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY 1] Duff, S.M.G., Sarath, G., Plaxton, W.C.: Physiol Plant 90, 791-800 (1994) 2] Vincent, J .B., Crowder, M.W., Averill, B.A.: Trends Biochem. Sci. 17, 105110 (1992) 3] Chen, S., Haj irezaei, M., Peis ker, M., Tschiersch, H., Sonnewal d, U., Börnke, F.: Planta 221, 479-492 (2005) 4] Kaida, R., Sage-Ono, K., Kamada, H., Okuyama, H., Syono, K., Kaneko, T.S.: Biochim Biophys Acta 1625, 134-140 (2003) 5] Lung, S-C., Leung, A., Kuang, R.. Wang, Y., Leung, P., Li m, B-L.: Phytochemistry 69, 365-373 (2008) 6] Nishi mura, M., Beevers, H.: Plant Physiol. 62, 44-48 (1978) 7] Duff, S.M.G., Lefebvre, D.D., Plaxton, W.C.: Plant Physiol. 90, 734-741 (1989) 8] MacKintosh, C., Coggins , J ., Cohen, P.: Biochem. J. 273, 733-738 (1991) 9] Far kas, I., Dombrádi, V., Miskei , M., Szabados, L., Koncz, C.: Trends Plant Sci. 12, 169-176 ( 2007) 10] Cohen, P.T.W.: Tr ends Biochem. Sci. 22, 245-251 (1997) 11] Luan, S.: Annu. Rev. Plant Biol. 54, 63-92 (2003) 12] Ceulemans, H., Bollen, M.: Physiol Rev. 84, 1-39 (2004) 13] Shi Y.: Sci China Ser C-Life Science 52, 135-146 (2009) 14] Ferreira, P.C.G., Hemerl y, A.S., Van M ontagu, M., Inzé, D.: Plant J. 4, 8187 (1993) 15] Kwak, J .M., Moon, J -H., Murata, Y., Kuchitsu, K., Leonhardt, N., DeLong, A., Schroeder, J .I.: Pl ant Cell 14, 2849-2861 (2002) 16] Li, W., Luan, S., Schreiber, S.L., Ass man, S.M.: Plant Physiol. 106, 963-970 (1994) 17] Garbers, C., DeLong, A., Deruére, J ., Bernasconi, P., Söll, D.: EMBO J. 15, 2115-2124 ( 1996) 18] Zhou, H-W., Nuss baumer, C., Chao, Y., DeLong, A.: Plant Cel l 16, 709-722 (2004) 19] Sontag, E., Nunbhakdi -Crai g, V., Bloom, G.S., Mumby, M.C.: J. Cell Biol. 128, 1131-1144 ( 1995)

81

20] Camillieri, C., Azi mzadeh, J ., Pastuglia, M., Bellini, C., Grandj ean, O., Bouchez, D.: Plant Cell 14, 833-845 (2002) 21] Kim, D-H., Kang, J -G., Yang, S-S., Chung, K -S., Song, P-S., Park, C-M.: Plant Cell 1414, 3043-3056 (2002) 22] Xu, C.Y., Mao, X., J ia, X., Chang, X.: Ann. Bot. 99, 439-450 ( 2007) 23] Yu, R.M .K., Wong, M.M.L., J ack, R.W., Kong, R.Y.Ch.: Planta 222, 757768 (2005) 24] Monroy, A.F., Sangvan, V., Dhinsa R.S.: Plant J. 13, 653-660 ( 1998) 25] Vránová, E., Langebartels, C., Van Montagu, M., Inzé, D., Van Camp, W.: J. Exp. Bot. 51, 1763-1764 (2000) 26] Schwei ghofer, A., Hirt, H., Mes kiene, I.: Trends Plant Sci. 9, 236-243 (2004) 27] Leis, J .F., Kaplan, N.O.: Proc. Natl. Acad. Sci 79, 6507-6511 ( 1982) 28] Olczak, M., Wątor ek, W., Morawiecka, B.: Biochi m Biophys Acta 1341, 1425 (1997) 29] Gellatly, K.S., Moorhead, G.B.G., Duff, S.M.G., Lefebvre, D.D.; Plaxtonn, W.C.: Plant Physiol. 106, 223-232 (1994) 30] Ferreira, C.V.: Gr anj eiro, J .M., Taga, E.M., Aoyama, H.: Plant Physiol. Biochem. 36, 487-494 (1998) 31] Coello, P.: Physiol Plant 116, 293-298 ( 2002) 32] Smith, R.D., Wal ker, J .C.: Annu. Rev. Pl ant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 101-125 (1996) 33] Bozzo, G.G., Raghothama, K.G., Plaxton, W.C.: Eur. J. Biochem. 269, 62786286 (2002) 34] Pol ya, G.M., Harit ou, M.: Biochem. J. 251, 357-363 (1988) 35] Stubbs, M.D., Tran, H.T., Atwell, A.J ., Smith, C.S., Olson, D., Moorhead, G.B.G.: Biochim Biophys Acta 1550, 52-63 ( 2001) 36] Hammer, M.F., M arkwell, J ., Sarath, G.: Plant Phisiol. 113, 227-233 (1997) 37] Struktura kyseliny okadaové - přístupné z URL: (13.8.2009) 38] Struktura mikrocystinu-LR - přístupné z URL: (23.8.2009)

82

39] Struktura kaliculi nu A - přístupné z URL: 40] Struktura cantharidinu - přístupné z URL: 41] Carter, P.J ., Ni mmo, H.G., Fewson, C.A., Wilkins, M.B.: The FEBS Jour nal 263, 233-236 (1990) 42] Dong, L., Er molova, N.V., Chollet, R.: Planta 213, 379-389 (2001) 43] Ryšlavá, H.: Příspěvek k poznání úlohy proteinů v regulaci buněčných procesů: Habilitační práce PřF UK Praha, katedra biochemie (2008) 44] Černý, M.: Izolace a charakterizace fosf oenolpyruvátkarboxyl asy ze semen Zea mays: Diplomová práce PřF UK Praha, katedra biochemie (2007) 45] Izui, K., Matsumura, H, Furumoto, T., K ai, Y.: Annu. Rev. Plant Biol. 55, 69-84 (2004) 46] Müller, K.: Regulation of phosphoenolpyruvate carboxylase in tobacco plants during potyviral infection: Disertační práce PřF UK Praha, katedra biochemie (2008) 47] Kobata, A., Yamas hita, K.: Fractination of Oligosaccharides v kni ze Glycobiology A Practi cal Approach (Fukuda, M. ed.), Oxford Uni versity Press (1993) 48] Bradford, M.M.: Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976) 49] Barthová, J ., Sofr ová, D., Tichá, M.: Základní praktikum z biochemie, skriptum PřF UK Praha (1984) 50] Laemmli, U.: Nature 227, 680-685 (1970) 51] Posen, S.: Ann. of Intern. Med. 67, 183-203 (1967) 52] Černý, M., Doubnerová, V., Müller, K., Ryšlavá, H.: Biochimi e 92, 13621370 (2010) 53] Müller, K., Doubnerová, V., Synková, H., Čeřovs ká, N.: Biol. Chem. 390, 245-251 (2009)

83

Svoluji k zapůjčení této práce pro studijní účel y a prosím, ab y b yla řádně vedena evidence v yp ůjčovatelů.

Jméno a přímení s adresou

Číslo OP

Datum v ypůjčení

Poznámka

84