ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI Leuconostoc

17

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI Leuconostoc mesenteroides PENDEGRADASI SIANIDA Abstrak Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri Leuconostoc mesenteroides dari umbi singkong fermentasi yang berfungsi sebagai pendegradasi sianida. Menggunakan umbi singkong yang sudah diparut dan diinkubasi dalam kondisi anaerob selama tujuh hari pada suhu kamar. Identifikasi dilakukan terhadap ciri-ciri morfologis, fisiologis dan sifat-sifat biokimiawi isolat, selanjutnya isolat diuji aktivitas β-glukosidase dan konsentrasi sianida. Hasil pengamatan terdapat 4 isolat (A, B, C dan D) sebagai bakteri Leuconostoc mesenteroides yang mampu menurunkan sianida dibandingkan dengan kontrol. Kesimpulan dari penelitian ini adalah isolat C mempunyai kemiripan terbesar dengan bakteri Leuconostoc mesenteroides dengan akvititas enzim β-glukosidase yang tinggi dan konsentrasi sianida yang rendah. Kata kunci: isolat, identifikasi, β-glukosidase, Leuconostoc mesenteroides, sianida Abstract The research was conducted to isolate and indentify Leuconostoc mesenteroides bacteria from fermented cassava tuber, which can degrade cyanide. The ground cassava tubers were incubated in anaerob condition for seven days in room temperature. Identification was done based on morphology, phisiology and biochemistry characteristics of isolates, and then the isolates were examined their β-glukosidase activity and cyanide degradation. The results showed that there were 4 isolates (A, B, C and D) as Leuconostoc mesenteroides bacteria that had ability to reduce cyanide in cassava tuber. The conclusion of this research was that C isolate had the biggest similiarity with Leuconostoc mesenteroides bacteria and had the highest enzyme β-glukosidase activity as well as the lowest cyanide concentration. Keywords:

isolate, identification, β-glukosidase, Leuconostoc mesenteroides, cyanide Pendahuluan

Pemecahan glukosida sianogenik terjadi apabila jaringan tanaman rusak, sehingga enzim β-glukosidase atau linamarase yang terdapat pada jaringan tersebut dibebaskan dan bekerja menghidrolisis senyawa glukosida tersebut dan pada akhirnya dihasilkan sianida bebas. Sianida bebas yang dihasilkan dari glukosida sianogenik ini dikenal sebagai racun yang amat kuat. Pada dosis yang besar menyebabkan keracunan akut yang mematikan. Pada dosis yang rendah sekali kemungkinan dijumpai

18

gejala keracunan yang kronik. Keadaan ini menjadikan faktor pembatas dari singkong untuk dipakai secara langsung baik untuk ternak maupun manusia. Bakteri yang diisolasi dari fermentasi umbi singkong akan lebih efektif untuk menurunkan kadar sianida, karena bakteri tersebut mudah beradaptasi dibandingkan bakteri yang diisolasi dari produk lain. Leuconostoc mesenteroides merupakan salah satu dari kelompok bakteri asam laktat dan dapat diisolasi dari fermentasi umbi singkong (Amoa-Awua et al. 1996). Presentase bakteri ini sebesar 14.5% dari bakteri asam laktat dan menghasilkan enzim β-glukosidase, yang berperan dalam menghidrolisis glukosida sianogenik (Obilie et al. (2004). Hasil penelitian Gueguen et al. (1997) menunjukkan bahwa aktivitas enzim βglukosidase dari bakteri Leuconostoc mesenteroides yang diisolasi dari singkong mampu menghidrolisis glukosida sianogenik. Glukosida sianogenik yang terdapat pada singkong dihidrolisis dengan bantuan enzim β-glukosidase menjadi sianohidrin dan glukosa. Enzim hidroksinitril liase akan mengubah sianohidrin menjadi aseton dan sianida. Semakin tinggi aktivitas β-glukosidase yang dihasilkan oleh bakteri Leuconostoc mesenteroides maka semakin sedikit sianida yang dihasilkan untuk proses detoksifikasi. Berdasarkan hal diatas dilakukan penelitian isolasi dan identifikasi bakteri Leuconostoc mesenteroides dari umbi singkong fermentasi pendegradasi sianida. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan isolat bakteri Leuconostoc mesenteroides dari umbi singkong fermentasi. Manfaat penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan galur bakteri Leuconostoc mesenteroides yang mampu mendegradasi sianida. Bahan dan metode Waktu dan Tempat Penelitian dilakukan dari bulan Juni sampai Oktober 2007 di Laboratorium Mikrobiologi Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Nutrisi Ternak Perah Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor.

19

Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah umbi singkong varietas pahit diperoleh dari industri tapioka Kedung Halang Bogor. Medium yang digunakan antara lain MRSB (de man rogosa shape broth), MRSA (de man rogosa shape agar), bakto agar, pewarnaan gram, gibson semi solid, ekstrak khamir, trypton, pepton, Larginin monokhlorida, dan beberapa medium penunjang seperti sukrosa, galaktosa, rafinosa, fruktosa, arabinosa, laktosa, xilosa, maltosa, mannitol, dan selulosa. Untuk pengujian konsentrasi sianida digunakan media MRSB, KCN, buffer CN, kloramin t, asam barbiturik dan piridin. Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi inkubator, autoklaf, bunsen, spektrofotometer, mikroskop, cawan petri, ose, pH meter, tabung reaksi, labu erlenmeyer, gelas ukur, gelas piala, vorteks, mikropipet, koloni counter, jangka sorong, timbangan dan batang pengaduk. Metode Penelitian Persiapan Sampel Umbi singkong yang sudah diparut, dimasukkan ke dalam plastik sampai padat. Kemudian ditutup rapat dan diinkubasi dalam kondisi anaerob selama tujuh hari pada suhu kamar. Isolasi Bakteri (Aryanyata 1991) Isolasi bakteri dilakukan dengan mensuspensikan sebanyak 10 g sampel kedalam 90 ml larutan 0.85% NaCl (pengenceran 10-1).

Kemudian dibuat

-6

pengenceran berseri sampai 10 kedalam larutan garam fisiologis, tiga seri dari pengenceran terakhir diplating sebanyak 1 ml kedalam cawan petri steril. Tambahkan 15-20 ml media MRS agar untuk melihat pertumbuhan koloni. Lakukan penggoyangan secara mendatar dan setelah agar membeku, diinkubasi pada suhu 370C selama 24-48 jam. Koloni yang diamati dengan penampakan rata dan berwarna kuning disekitar koloni. Koloni dengan warna dan ukuran yang berbeda digoreskan kembali ke medium yang sama dengan goresan kuadran (pemurnian). Inkubasi dilakukan pada kondisi yang sama dengan diatas. Penggoresan dilakukan sampai didapat koloni yang seragam, sebanyak empat koloni yang murni dipilih dan

20

dilakukan pewarnaan gram dan uji katalase. Sebagai pembanding untuk mendapat koloni yang sama, dilihat juga koloni yang didapat dari isolat murni Leuconostoc mesenteroides yang diperoleh dari UGM. Keempat isolat murni dibuatkan stok kultur dalam media MRSA yang ditambah CaCO3 dan disimpan suhu pada 5-7oC selama dua bulan. Identifikasi Bakteri (Fardiaz 1989) Keempat isolat diidentifikasi sampai tingkat species, langkah pertama yang dilakukan adalah mempersiapkan kultur kerja dari stok kultur. Caranya adalah dengan menginokulasikan sebanyak 3-4 ose stok kultur kedalam MRS broth dan diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam. Identifikasi dilakukan terhadap ciri-ciri morfologis, fisiologis dan sifat-sifat biokimiawi bakteri. Ciri- Ciri Morfologis Ciri morfologis yang diamati adalah pewarnaan gram, katalase, motilitas dan spora. Metode pengamatan sebagai berikut: Pewarnaan Gram (Hadioetomo 1993) Sebanyak 1 lup penuh air steril diletakkan pada kaca objek, kemudian dengan jarum ose steril pindahkan sedikit isolat keatasnya, campurkan dan sebarkan hingga rata dan dibiarkan olesan kering udara.

Kaca objek dilalukan diatas api

bunsen, dimana kaca objek harus terasa agak panas bila ditempelkan pada punggung tangan, atau sekali-kali kering anginkan di udara hingga terbentuk lapisan kultur yang tipis dan merata. Pewarnaan gram dimulai dengan meneteskan pewarna primer (kristal violet) secara merata diatas kultur pada kaca objek, dan dibiarkan selama 1 menit. Miringkan kaca objek untuk membuang kelebihan kristal violet, lalu dibilas dengan air dari botol pijit dan sisa air diserap dengan menggunakan kertas serap. Olesan ditetesi dengan lugol selama 2 menit, miringkan kaca objek seperti diatas dan kemudian bilas dengan air, sisa warna yang masih ada dihilangkan dengan pemucat warna etanol 95%, tetes demi tetes selama 10-20 detik sampai zat warna kristal tidak terlihat lagi mengalir dari kaca objek. Cuci kembali dengan air dari botol pijit, lalu tiriskan dan selanjutnya ditetesi dengan larutan safranin selama 10-

21

20 detik. Miringkan kaca objek dan kembali dibilas dengan air dari botol pijit, tiriskan dan sisa air yang masih ada diserap dengan kertas serap. Preparat siap untuk diperiksa dengan mikroskop. Pemeriksaan dengan mikroskop dilakukan dengan menggunakan lensa objektif minyak imersi, dimulai dari pembesaran yang terendah dan berangsurangsur diganti dengan yang tertinggi. Pengamatan dilakukan terhadap bentuk, cara pengelompokan (tunggal, berpasangan, berantai, bergerombolan). Reaksi gram positif ditandai dengan warna sel ungu atau biru dan gram negatif bewarna merah muda. Uji Katalase (Hadioetomo 1993) Sebanyak 2 tetes H2O2 3% diletakkan diatas kaca objek yang bersih, kemudian dipindahkan dengan lup inokulasi satu ose kultur isolat keatasnya dan campurkan

hingga

merata.

Timbulnya

gelembung-gelembung

gas

CO2

menunjukkan uji katalase positif. Uji Motilitas (Fardiaz 1989) Secara aseptis dengan jarum ose yang diluruskan bagian ujungnya. Sebanyak satu ose kultur ditusuk dalam media motiliti medium (MM) 0.5%. Media tersebut diinkubasi pada suhu optimum 30oC selama 24 jam. Bila pertumbuhan koloni penyebar maka uji motilitas bersifat positif dan bila pertumbuhan hanya berupa garis saja maka maka uji motilitas bersifat negatif. Uji Spora (Fardiaz 1989) Air steril sebanyak 1-2 lup penuh diletakan kedalam kaca objek. Jarum inokulasi mengambil sedikit biakan dan diletakan diatas tetesan air steril pada kaca objek. Kultur yang diletakan diatas tetesan air steril, dicampurkan dan disebarkan hingga rata. Olesan dibiarkan kering oleh udara, kaca objek yang telah berisi biakan tersebut dilalukan diatas api bunsen hingga terasa panas. Olesan kultur ditetesi malacite green dan dipanaskan diatas api selama 10 detik. Olesan dibilas dengan air dari botol akuades, setelah kelebihan air pada kaca objek diserap menggunakan kertas serap. Olesan bakteri ditetesi dengan sapronin, kaca

22

objek dimiringkan untuk membuang kelebihan safronin, lalu olesan dibilas dengan air dari botol akuades, setelah itu kelebihan air pada kaca objek diserap menggunakan kertas serap. Isolat diamati dengan menggunakan mikroskop. Ciri-Ciri Fisiologis Ciri fisiologis yang diamati adalah pertumbuhan pada berbagai suhu, pH dan penambahan etanol 10%. Metode pengamatan sebagai berikut: Pertumbuhan pada Suhu Berbeda (Hayakawa 1993) Satu lup kultur isolat diinokulasikan kedalam tabung yang berisi medium MRSB (masing-masing duplo). Diinkubasikan selama 7-14 hari dengan mengatur suhu satu seri tabung pada suhu 15oC, 30oC, 37oC dan 45oC. Adanya pertumbuhan terlihat dengan adanya kekeruhan pada tabung. Pertumbuhan pada pH Berbeda (Hayakawa 1993) Satu lup kultur isolat diinokulasikan kedalam tabung yang berisi medium MRSB (masing-masing duplo). Diinkubasikan selama 7-14 hari pada suhu 30oC dengan mengatur pH satu seri tabung pada pH 6.5 dan 4.8. Adanya pertumbuhan terlihat dengan adanya kekeruhan pada tabung. Pertumbuhan pada Etanol (Hayakawa 1993) Satu seri tabung yang berisi MRSB ditambahkan etanol dengan konsentrasi 10%, satu seri tabung MRSB dibuat sebagai kontrol. Selanjutnya diinokulasikan 1 lup penuh kultur isolat dan inkubasi dilakukan pada suhu 30oC selama 7-14 hari. Pertumbuhan dilihat dengan membandingkan antara kontrol dan perlakuan, bila terjadi kekeruhan maka dinyatakan adanya pertumbuhan. Ciri-Ciri Biokimiawi Ciri biokimia yang diamati adalah produksi CO2 dari glukosa, produksi amonia dari arginin, produksi dekstran dari sukrosa, fermentasi karbohidrat (selulosa, sukrosa, laktosa, rafinosa, arabinosa, fruktosa, manitol, maltosa, xilosa,galaktosa). Metode pengamatan sebagai berikut: Produksi CO2 dari Glukosa (Nuraida 1988) Media agar semi padat gibson dicairkan dan diturunkan suhunya sampai o

45 C, tambahkan kira-kira 0.5 ml isolat kultur yang telah ditumbuhkan dalam MRSB, selanjutnya tuangkan

agar cair diatasnya kira-kira 2-3 cm untuk

23

menciptakan kondisi anaerobik. Inkubasi dilakukan pada suhu 30oC selama 2-5 hari. Reaksi positif ditandai dengan terbentuk gas yang ditandai dengan pecahnya agar. Produksi Amonia dari Arginin (Nuraida 1988) MRSB arginin (MRSB+0.3% arginin) diinokulasikan dengan 1 ose kultur. Kultur

kemudian

diinkubasikan

suhu 30oC selama 2-5 hari. Kultur isolat

sebanyak 0.5-1 ml dimasukkan kedalam tabung reaksi kosong dan ditambahkan reagen nessler dengan volume yang sama. Reaksi positif ditandai warna orange kecoklatan setelah penambahan reagen nessler. Produksi Dekstran dari Sukrosa ( Harrigan & McCance 1976) Sebanyak 0.1 ml kultur isolat berumur 24 jam diinokulasikan kedalam cawan petri steril, pada bagian atasnya dituangkan medium sukrosa agar digoyang hingga merata. Kemudian diinkubasikan pada suhu 30oC selama 5 hari. Reaksi positif ditandai dengan pertumbuhan pada cawan. Fermentasi Karbohidrat (selulosa, sukrosa, laktosa, rafinosa, arabinosa, fruktosa, manitol, maltosa, xilosa,galaktosa) (Harrigan & McCance 1976). Medium cair yang digunakan adalah MRSB tanpa gula dan meat ekstrak, tambahkan 0.004% BCP (Brom Cresol Purple) sebagai indikator, kemudian sterilisasi 121oC 15 menit. Siapkan larutan 10% gula-gula yang digunakan untuk fermentasi karbohidrat dan sterilisasi dengan cara filtrasi dan tambahkan secara aseptik hingga konsentrasi akhir 2%. Selanjutnya inokulasikan kultur yang telah disegarkan dan inkubasi pada suhu 30oC selama 1-2 hari. Amati pertumbuhan dengan terjadinya perubahan warna medium dari ungu menjadi kuning (reaksi positif) dan jika didalam tabung terbentuk gas menunjukan isolat membentuk gas. Uji Aktivitas β-glukosidase dan Konsentrasi Sianida Keempat Isolat hasil identifikasi selanjutnya diuji untuk mengetahui kemampuan aktivitas β-glukosidase dan konsentrasi sianida. Metode pengujian adalah sebagai berikut:

24

Pengujian Aktivitas β-glukosidase Substrat yang digunakan adalah p-NPG 0.1% (b/v). Ekstrak enzim, larutan buffer sitrat pH 5.0 dan substrat diprainkubasi selama 10 menit pada suhu 50°C. Setelah itu ekstrak enzim dengan pengenceran yang tepat sebanyak 0.5 ml dicampurkan dengan 0.5 ml buffer sitrat dan 0.5 ml substrat. Larutan kemudian diinkubasi pada suhu 50°C selama 60 menit. Setelah waktu inkubasi selesai, ditambahkan larutan Na2CO3 1M sebanyak 1.0 ml lalu divorteks dan diukur spektrofotometer pada panjang gelombang 400 nm. Kontrol dibuat dengan komposisi yang sama namun enzim dicampur setelah penambahan larutan Na2CO3 1M sebanyak 1.0 ml. Sebagai blanko digunakan 1 ml akuades, larutan bufer 0.5 ml dan 1 ml Na2CO3. Larutan standar dibuat dengan menggunakan larutan p-nitrofenol. Kisaran konsentrasi standar adalah 0-30 μg/ml. Satu unit (U) aktivitas enzim β-glukosidase adalah banyaknya enzim yang dapat menghasilkan 1 μmol nitrofenol dalam 1 menit pada kondisi percobaan, dengan perhitungan sebagai berikut : Aktivitas β-glukosidase (U/ml) = (nitropenal sampel – kontrol) x faktor pengencer waktu inkubasi x BM nitropenol Pengujian Sianida Isolat ditumbuhkan di tabung reaksi yang berisi 5 ml media MSB cair yang telah ditambahkan larutan KCN dengan konsentrasi 50 ppm sebanyak 0.5 ml dan inkubasi selama 24 jam pada suhu 30oC dengan kondisi anaerob untuk dianalisis kandungan sianida. Koloni yang sudah ditumbuhkan disentrifugasi dengan kecepatan 4 500 rpm selama 15 menit, sehingga terpisah supernatan dan endapan. Sebanyak 0.1 ml supernatan diambil dengan menggunakan spuit dari tabung perlakuan, lalu dimasukkan kedalam tabung reaksi dan ditambahkan akuades sebanyak 1.9 ml. Selanjutnya dimasukkan kedalamnya 2 ml buffer CN dan 0.5 ml kloramin t 1%, divorteks dan didiamkan selama 2 menit. Setelah itu ditambahkan 0.5 ml larutan asam barbiturik-piridin dan divorteks kembali serta siap dibaca pada spektofotometer dengan panjang gelombang 578 nm. Perhitungan dilakukan dengan membuat persamaan regresi dari larutan standar KCN berdasarkan nilai absorbansi terhadap konsentasi KCN.

25

Analisis Data Data yang diperoleh dari pengamatan morfologis, fisiologis, sifat biokimiawi, aktivitas enzim β-glukosidase dan konsentrasi sianida

dianalisis

secara deskriptif. Hasil dan Pembahasan Isolasi dan Identifikasi Bakteri Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides merupakan kelompok bakteri asam laktat yang pertumbuhannya memerlukan nutrien yang lengkap dan ditemukan pada tanaman, produk susu, daging dan berbagai produk fermentasi (Holzaptel & Schilinger 1992). Dalam penelitian ini telah berhasil diisolasi empat isolat bakteri yang diduga Leuconostoc mesenteroides dari umbi singkong fermentasi dan satu isolat bakteri Leuconostoc mesenteroides dari UGM. Identifikasi dilakukan terhadap lima isolat berdasarkan pengamatan ciri morfologis, fisiologis dan sifat biokimiawi bakteri. Data hasil identifikasi ini (Tabel 4) kemudian dicocokkan dengan kunci identifikasi bakteri Bergey’S Manual of Determinative Bacteriology ( Holt et al. 1996).

Isolat A

Isolat D

Isolat B

Isolat C

Isolat L

Gambar 2 Bentuk morfologis isolat umbi singkong fermentasi (pembesaran 40x)

Secara morfologis kelima isolat (A,B,C,D dan L) termasuk kelompok bakteri Leuconostoc, hal ini terlihat dari bentuknya oval berantai (Gambar 2) dan pewarnaan gram positif yang ditandai warna ungu. Ciri–ciri genus Leuconostoc adalah reaksi gram positif dan bentuk selnya oval berpasangan dan kadangkadang terlihat oval berantai ( Holt et al. 1996; Lore et al. 2005; Santos et al.

26

2005). Bibiana (1988) menyatakan

bahwa pewarnaan gram positif ditandai

dengan sel warna biru atau ungu dan gram negatif warna merah. Dinding sel bakteri gram positif mengandung lipida yang rendah sehingga sewaktu penambahan alkohol terjadi dehidrasi dan pengecilan lubang pori-pori, keadaan ini menyebabkan zat warna tetap terikat dan tetap warna biru. Tabel 4 Karakteristik morfologis, fisiologis dan biokimiawi isolat pada umbi singkong fermentasi Karakteristik

Bentuk Pewarnaan gram Katalase Motilitas Spora Pertumbuhan pada suhu

Isolat A oval berantai + -

B oval berantai + -

C oval berantai + -

D oval berantai + -

L oval berantai + -

150C

+

+

+

+

-

0

30 C

+

+

+

+

+

0

37 C

D

d

d

d

d

0

+

-

-

+

-

+/+ + -

+/+ + -

-/+ + -

-/+ + -

-/+ + -

+

+

+

+

+

+ + + + + + + -

+ d + + + -

+ + d d + + +

+ d + d + d

+ d + d d + + -

+ +

+ +

+ +

+ +

+ +

45 C Pertumbuhan pada pH 4.8 dan 6.5 etanol 10% Produksi CO2 dari glukosa Produksi NH3 dari arginin Produksi dektran dari sukrosa Fermentasi karbohidrat Sukrosa Selulosa Xilosa Laktosa Rafinosa Maltosa Fruktosa Mannitol Arabinosa Galaktosa

(+) = >90% atau lebih strain positif (keruh); (-) = 90% atau lebih negatif (jernih); (d) = 10-90% strain positif (samar)

27

Katalase adalah enzim yang mengkatalisasikan penguraian hidrogen peroksida (H2O2) menjadi air dan oksigen. Hidrogen peroksida bersifat toksik terhadap sel karena bahan ini menginaktivasikan enzim dalam sel. Enzim ini terdapat pada sel-sel yang mempunyai metabolisme aerobik. Bakteri anaerob tidak mempunyai enzim katalase. Hasil pengamatan kelima isolat (A, B, C, D dan L) menunjukkan katalase negatif (-) karena tidak terbentuknya gelembung udara setelah isolat tersebut ditetesi H2O2 3%. Marlina (2008) melaporkan katalase positif ditandai terbentuknya gelembung udara pada kaca objek sedangkan katalase negatif tidak terbentuknya gelembung udara. Hemme et al. (2004) menyatakan Leuconostoc merupakan bakteri fakultatif anaerob dengan ciri-ciri adalah katalase negatif, yang ditandai tidak ada aktivitas enzim katalase dalam mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen (Jay 1996). Motilitas dari kelima isolat menunjukkan non motil. Menurut Hemme et al. (2004), genus Leuconostoc bersifat non motil. Isolat non motil menunjukkan bahwa bakteri tersebut tidak mempunyai flagella sebagai organ untuk bergerak. Flagella adalah salah satu struktur utama diluar sel bakteri yang menyebabkan terjadinya pergerakan (motilitas) pada sel bakteri. Flagella terbuat dari sub unitsub unit protein yang disebut flagelin. Bacillus dan Spirilum merupakan sebagian besar spesies bakteri yang memiliki flagella sebagai alat geraknya, tetapi jarang ditemukan pada bakteri yang berbentuk kokus (Pelczar & Chan 2005). Kelima isolat dengan penambahan etanol 10% menunjukkan bahwa isolat tersebut tidak mampu tumbuh yang ditandai reaksi negatif (-), selain itu juga kelima isolat tidak berspora yang ditanda reaksi negarif (-). Menurut Holt et al. (1996), Leuconostoc tidak mampu tumbuh dengan penambahan etanol 10% dan tidak berspora (Hemme et al. 2004). Bibiana (1988) menyatakan bahwa spora bersifat tahan terhadap kondisi lingkungan yang ekstrim dan adanya bahan kimia beracun. Spora dibentuk oleh spesies bakteri yang mampu mengatasi lingkungan yang tidak menguntungkan bakteri. Biasanya spesies bakteri yang termasuk dalam genus Clostridium dan Bacillus memiliki spora. Spora yang terdapat didalam sel disebut endospora. Pada sel bakteri ini hanya terdapat satu spora. Jika sel semakin tua, maka sel vegetatif akan pecah sehingga endospora akan melepaskan dari sel dan membentuk spora bebas. Spora bersifat tahan terhadap pewarnaan, akan tetapi

28

sulit untuk melepaskan zat warna yang terserap kedalamnya, sehingga tidak dapat mengikat zat warna lain yang diberikan berikutnya. Zat warna yang sering digunakan untuk warna spora dalah malachite green yang akan tetap terikat oleh spora setelah pencucian dengan air. Kelima isolat mampu tumbuh pada suhu 30oC yang ditandai reaksi positif (+) dan kelihatan samar (d) pada suhu 37oC. Menurut Batt (1999) genus Leuconostoc dapat tumbuh pada suhu 30oC dan terlihat masih samar pada suhu 37oC (Holt et al.1996). Leuconostoc merupakan kelompok bakteri mesofil yang tumbuh pada kisaran suhu 20-45oC, dimana suhu optimum untuk pertumbuhannya berkisar 20-30oC (Kusmiati & Malik 2002). Namun ada juga genus Leuconostoc yang tidak tumbuh pada suhu 45oC (Elida 2002). Suhu berpengaruh terhadap kehidupan bakteri dalam hal reaksi dan metabolisme sel (Pirt 1975). Suhu yang terlalu tinggi dapat menyebabkan denaturasi protein yang mengakibatkan kematian sel. Suhu yang terlalu rendah akan mengurangi aktivasi enzim, sehingga pertumbuhan bakteri terganggu (Cortezi et al. 2005). Suhu ekstrim diluar suhu optimum untuk pertumbuhan organisme akan berakibat inaktifnya enzim atau fungsi struktur sel seperti membran sel (Moat & Foster 2002). Peningkatan suhu 5-10oC diatas suhu optimum dapat menyebabkan lisis dan kematian sel mikroorganisme (Lay 1994). Kelima isolat mampu tumbuh pada pH 6.5 yang ditandai reaksi positif (+), sedangkan pada pH 4.8 isolat A dan B dapat tumbuh yang ditandai reaksi positif (+) dan isolat C, D dan L

tidak tumbuh yang ditandai reaksi negatif (-).

Leuconostoc mampu tumbuh pada pH 6.5 (Drosinos et al. 2006), serta dapat dan tidak tumbuh pada pH 4.8 tergantung spesies Leuconostoc (Holt et al.1996). Derajat keasaman (pH) minimum dan maksimum bagi kebanyakan bakteri berkisar antara pH 4 dan 9 (Schlegel 1994). Besarnya pH media pertumbuhan memberikan pengaruh langsung pada permeabilitas sel dan aktivitas fisiologis lainnya. Bila terjadi penyimpangan pH, pertumbuhan dan metabolisme bakteri dapat terhenti. Pada umumnya bakteri asam laktat dapat bertahan pada pH 3.2, beberapa diantaranya hanya mampu tumbuh pada kisaran pH 4.0-4.5 (Jay 1996). Pengujian produksi CO2 dari glukosa yang bertujuan untuk membedakan antara bakteri asam laktat homofermentatif dan heterofermentatif. Kelima isolat

29

tersebut menunjukkan reaksi positif (+) yang ditandai terbentuknya gas dengan pecahnya agar. Menurut Jay (1996) bakteri heterofermentatif dapat menghasilkan asam laktat, etanol dan CO2, sedang bakteri homofermentatif mengubah 95 % glukosa atau heksosa lain menjadi asam laktat dan sejumlah kecil CO2 serta asamasam volatil, hal inilah yang menyebabkan golongan homofermentatif mampu menghasilkan asam laktat dalam jumlah yang lebih besar dibandingkan dengan golongan

heterofermentatif.

Leuconostoc

mesenteroides

termasuk

dalam

kelompok bakteri heterofermentatif yang dapat memproduksi gas dari glukosa (Ogier et al. 2008; Kihal et al. 2007). Pengujian produksi amonia dari arginin bertujuan untuk membedakan Lactobacilus dan Leuconostoc. Hasil pengamatan kelima isolat tersebut tidak mampu menghasilkan NH3 dari arginin yang ditandai reaksi negatif (-). Keluarga Leuconostoc mesenteroides tidak menghasilkan amonia dari arginin dan hanya menghasilkan D isomer dari asam laktat (Tamang et al. 2008; Sengeun et al. 2009). Sedangkan

pengujian produksi dekstran dari sukrosa bertujuan untuk

membedakan species dari genus Leuconostoc. Kelima isolat mampu menghasilkan dekstran dari sukrosa yang terlihat adanya pertumbuhan pada cawan yang ditandai reaksi positif (+). Menurut Sarwat et al. (2008) bakteri Leuconostoc mesenteroides dapat memproduksi dekstran. Berdasarkan kunci identifikasi bakteri Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (Holt 1996), menunjukkan bahwa persentase pengujian fermentasi karbohidrat yang secara berturut–turut isolat L (80%), Isolat isolat C (70%), isolat B dan isolat D (60%) serta isolat A (50%) mendekati kategori kelompok bakteri Leuconostoc mesenteroides. Menurut Zavaglia

et al. (1998) terdapat

sedikit kesulitan dalam mengidentifikasi spesies bakteri asam laktat berdasarkan fermentasi gula-gula, dimana terdapat hasil-hasil yang meragukan karena diamati dengan kasat mata. Aktivitas Enzim β-glukosidase dan Konsentrasi Sianida Bakteri

asam

laktat

seperti

Leuconostoc

mesenteroides

dapat

memproduksi β-glukosidase yang berperan dalam proses hidrolisis glukosida sianogenik. Hasil pengukuran aktivitas enzim β-glukosidase dan kemampuan isolat dalam menurunkan sianida tertera pada Tabel 5.

30

Tabel 5 Rataan aktivitas enzim β-glukosidase dan konsentrasi sianida tanpa dan dengan penambahan isolat yang diinkubasi selama 24 jam No Isolat Konsentrasi Sianida (ppm) β-glukosidase (Unit/ml 1 Kontrol 37.99 0.00 2 A 15.63 0.19 3 B 13.63 0.21 4 C 13.29 0.23 5 D 13.40 0.20 6 L 13.57 0.21 Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa konsentrasi sianida dari kelima isolat (A, B, C, D, dan L) lebih rendah dibandingkan dengan kontrol (tanpa isolat) setelah diinkubasi selama 24 jam. Konsentrasi sianida yang rendah tersebut terjadi karena adanya aktivitas enzim β-glukosidase yang dihasilkan oleh kelima isolat. Pada penelitian ini aktivitas enzim β-glukosidase secara berturut-turut yaitu isolat A (0.19 unit/ml), isolat B (0.21 unit/ml), isolat C (0.23 unit/ml), isolat D (0.20 unit/ml) dan isolat L (0.21 unit/ml), dan ada kecenderungan semakin tinggi aktivitas enzim β-glukosidase pada penelitian ini maka semakin rendah konsentrasi sianida yang dihasilkan oleh kelima isolat terutama pada isolat C, dimana secara morfologis, fisiologis dan biokimiawi (Tabel 4) isolat tersebut mempunyai kemiripan terbesar dengan bakteri Leuconostoc mesenteroides setelah dicocokkan dengan kunci identifikasi bakteri Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Kobawila et al. (2005) menyebutkan bahwa bakteri asam laktat seperti Leuconostoc mesenteroides dan Lactobacillus dapat memproduksi βglukosidase yang berperan dalam proses hidrolisis glukosida sianogenik. Lei et al. (1999) melaporkan bahwa strains Lactobacilus plantarum, Leuconostoc mesenteroides, Candida tropicalis dan Penicillium sclerotiorum

mampu

mendegradasi glukosida sianogenik. Dimuth et al. (2004) menjelaskan bahwa enzim β-glukosidase berperan dalam proses hidrolisis glukosida sianogenik dalam bentuk linamarin akan dihidrolisis oleh enzim β-glukosidase membentuk B-D glukopironase dan

aseton sinohidrin. Kemudian sianohidrin dengan bantuan

enzim hidroksinitril liase akan diubah menjadi aseton dan sianida (Yusuf et al. 2006; Santana et al. 2002). Selanjutnya sianida dengan bantuan beberapa enzim yaitu sianase, sianida hidrotase dan sianida dihidrotase akan diubah menjadi CO2, amonia dan asam format yang berperan dalam aktivitas metabolisme untuk

31

pertumbuhan bakteri (Gufta et al. 2009). Semakin tinggi aktivitas β-glukosidase yang dihasilkan oleh bakteri Leuconostoc mesenteroides maka semakin sedikit sianida yang dihasilkan untuk proses detoksifikasi (Gueguen et al. 1997).

Gambar 3 Hidrolisis linamarin (Yusuf et al. 2006) Simpulan Isolat C mempunyai kemiripan terbesar dengan bakteri Leuconostoc mesenteroides dengan akvititas enzim β-glukosidase yang tinggi dan konsentrasi sianida yang rendah. Daftar Pustaka Amoa-Awua WKA, Appoh F, Jakobsen M. 1996. Lactic acid fermentation of cassava into agbelima. Int. J. Food Microbiol.31, 87– 98. Aryanyata RW, Fleet GH, Buckle KA. 1991. The accurrence and growth of microorganism during the fermentation of fish sausage. J food Microbial. 13.45-50. Batt CA. 1999. Lactococcus. Didalam Robinson RK, Batt CA, Patel PD. Editor. Encyclopedia of Food Microbiology II. London. Academic Pr. Bibiana. WL, Sugyo H. 1988. Mikrobiologi. Pusat Antar Universitas Bioteknologi Institut Pertanian Bogor. Bogor. Cortezi M, Monti R, Cortiero J. 2005. Temperature effect on dextransucrase production by Leuconostoc mesenteroides FT 045 B isolated from Alcohol and Sugar Mill Plant. Afr J of Biotechnol.4(3): 279-285. Dimuth S, Garzaon DA, White W, Sayre RT. 2004. Over –expression of hyroxynitrile lyase in transgenic cassava roots accelerates cyanogenesis and food detoxification. J. Plants Biotec.2:37-43. Drosinos EH, Mataragas M, Metaxopoulos J. 2006. Modeling of growth and bacteriocin production by Leuconostoc mesenteroides E131. Meat Sci. 74: 690–696.

32

Elida M. 2002. Propil Bakteri asam laktat dari dadih yang difermentasi dalam berbagai jenis bambu dan potensinya sebagai probiotik. [Tesis]. Program Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. Fardiaz S. 1989. Mikrobiologi Pengolahan Pangan. Institut Pertanian Bogor. Bogor. Gueguen YPC, Labrot P, Arnoud P, Galzy. 1997. Purification and characterization of an intracellular β-glukosidase from a new strain of Leuconostoc mesenteroides isolated from cassava. J Appl Microb. 82:469-476. Hadioetomo RS .1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta. Penerbit Gramedia. Harigan WF, McCane. 1976. Laboratory Methods in Food and Dairy Microbiology. London: Academic Pr. Hayakawa K.1993. Classification and actions af food microorganism with particular reference to fermented foods and lactic acid bacteria. Di dalam : Nakazawa Y, Hosono A, editor. Functions of Fermented Milk Challenges for the Health Science. London.: Elsevier Science. Hemme D, Catherine, Scheunemann F. 2004. Leuconostoc, characteristics, use in dairy technology and prospects in functional foods. Int Dairy J.14: 467– 494. Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT, Williams ST. 1996. Bergey’s Manual of Determiantive Bacteriology. Edisi ke-9 Baltimore, Maryland: William and Wilkins Campany. Holzapfel WH, Schillinger U. 1992. The genus Leuconostoc. In: Barlows, A., Truper HG, Dworkin M, Harder W, Schleifer KH (Eds.). The Prokaryotes Vol. 2. Springer. Berlin.1509–1534. Gupta N, Balomajumder C, Agarwal CK. 2009. Enzymatic mechanism and biochemistry for cyanide degradation: A review. Journal of Hazardous Materials. xxx xxx–xxx Jay JM.1996. Modern Food Microbial. Chapman and Hill. New York. USA. Kihal M, Prevost H, Henni DE, Benmechernene Z, Diviès C. 2007. Carbon Dioxide Production by Leuconostoc mesenteroides Grown in Single and Mixed Culture with Lactococcus lactis in Skimmed Milk. World J of Dairy & Food Sci. 2(2): 62-68. Kobawila SC, Louembe D, Keleke S, Hounhouigan J, Gamba G. 2005, Reduction of the cyanide during fermentation of cassava roots and leaves to produce bikedi and ntoba, Two Food Products From Kongo. Afr J Biotech. 4(7):689-696. Kusmiati, Malik A. 2002. Aktivitas bakteriosin dari bakteri Leuconostoc mesenteroides pbac1 pada berbagai media. Makara Kesehatan. 6(1):1-7. Lay BW. 1994. Analsisis mikroba di laboratorium. Rajawali Grafindo Persada. Jakarta.

33

Lei V, Amoa-Awua WKA, Brimer L. 1999. Degradation of cyanogenic glycosides by Lactobacillus plantarum strains from spontaneous cassava fermentation and other microorganisms. Int J of Food Microbiol. 53:169– 184. Lore TA, Samuel K. Mbugua, Wangoh J. 2005. Enumeration and identification ofmicroflora in suusac, a Kenya traditional fermented camel milk product. Lebensm.-Wiss. u.-Technol. 38: 125–130. Marlina 2008. Identifikasi bakteri Vibrio parahaemolitycus dengan Metode biologi dan deteksi gen ToxR secara PCR. J Sains dan Teknol Farm. 13(1): 1-7. Moat A, Foster GJW. 2002. Microbiology Physiology. John Willey and Sons Inc. Nuraida L. 1988. Studies on microorganism isolated from pozol, a Mexican fermented maize dough. University of Reading : Fakulty of Agriculture and Food Departement of Food science and Technology. Obilie EM, Tano-Debraha K, Amoa-Awuab WK. 2004. Souring and breakdown of cyanogenic glucosides during the processing of cassava into akyeke. Int J of Food Microbiol. 93 : 115– 121. Ogier JC, Casalta E, Farrokh, Saihi A. 2008. Safety assessment of dairy microorganisms: The Leuconostoc genus. International Journal of Food Microbiology. 126: 286–290. Pelczar MJ dan Chan ECS. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. R.S. Hadioetomo, T. Imas, SS Tjitrosomo dan SL Angka (pen.). UI Press. Jakarta. Pirt SJ. 1975. Principles of microbe and cell cultivation. Black well Scientist Publication. Sarwat F, Qader SAU, Aman A, Ahmed N. 2008. Production & Characterization of a Unique Dextran from an Indigenous Leuconostoc mesenteroides CMG713. Int J Bio Scs. 4(6):379-386. Santos EM, Jaimeb I, Rovirab J, Lyhsc U, Korkealac H, Bjorkrothc J.2005 Characterization and identification of lactic acid bacteria in morcilla de Burgos’’. Int J Food Microbiol. 97: 285–296. Santana MA, Valeria V, Juan M, Rafael RA. 2002. Linamarase Expression in Cassava Cultivars with Roots of Low- and High-Cyanide Content. Plant Physiol. 129(4): 1686–1694. Schlegel HG. 1994. Mikrobiologi Umum. Terjemahan Gama Unversity Press. Yogyakarta. Sengun IY, Nielsen DS, Karapinar M, Jakobsen M. 2009. Identification of lactic acid bacteria isolated from Tarhana, a traditional Turkish fermented food Int J Food Microbiol 135:105–111. Tamang B et al. 2008. Phenotypic and genotypic identification of lactic acid bacteria isolated from ethnic fermented bamboo tender shoots of North East India Int J Food Microbiol. 121: 35–40.

34

Yusuf UF et al. 2006. An in vitro inhibition of human malignant cell growth of crude water extract of cassava (Manihot esculenta Crantz) and commercial linamarin. Jl Sci Technol.28 (Suppl.1): 146-155. Zavaglia AG, Kociubinski G, Perez P, De-Antoni G. 1998. Isolation dan Characterization of Bifidobacterium strain for probiotic formulation. Jl Food Protect. 61(7):865-873.