DIPLOMOVÁ PRÁCE. Kultury léčivých rostlin in vitro XII. Martina Janoutová

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMAKOGNOSIE

DIPLOMOVÁ PRÁCE

Kultury léčivých rostlin in vitro – XII.

Martina Janoutová

Datum zadání: 28.12.2010 Vedoucí katedry: Doc. RNDr. Jiřina Spilková, CSc. Vedoucí diplomové práce: Doc. PharmDr. Lenka Tůmová, CSc. Oponent diplomové práce: Termín odevzdání: Počet stran: 75

Na úvod své diplomové práce bych ráda poděkovala Doc. PharmDr. Lence Tůmové, CSc. za poskytnutí cenných rad a pomoci při sestavování mé diplomové práce. Tímto děkuji i PharmDr. Janu Martinovi, PhD. za pomoc při analýze vzorků na kapalinovém chromatografu. 2

Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpal(a), jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. 3

OBSAH 1

ÚVOD .................................................................................................. 7

2

CÍL PRÁCE ........................................................................................ 8

3

TEORETICKÁ ČÁST ....................................................................... 9 3.1

SILYBUM MARIANUM L. – OSTROPESTŘEC MARIÁNSKÝ ...................... 9

3.1.1 Botanický popis rostliny ............................................................. 9 3.1.2 Rozšíření................................................................................... 11 3.1.3 Charakteristika, sběr a úprava drogy ...................................... 11 3.1.4 Obsahové látky ......................................................................... 12 3.1.5 Použití ...................................................................................... 12 3.2

FLAVONOLIGNANY ......................................................................... 13

3.2.1 Flavonolignany ........................................................................ 13 3.2.2 Chemická struktura (21) .......................................................... 13 3.2.3 Biosyntéza (21) ......................................................................... 17 3.2.4 Využití flavonolignanů ............................................................. 21 3.3

FLAVONOIDY .................................................................................. 22

3.3.1 Struktura a význam pro rostlinu............................................... 22 3.3.2 Chemická struktura .................................................................. 22 3.3.3 Využití flavonoidů .................................................................... 24 3.4

EXPLANTÁTOVÉ KUTRURY ROSTLIN ............................................... 25

3.4.1 Definice a základní pojmy ........................................................ 25 3.4.2 Typy a vlastnosti explantátových kultur ................................... 25 3.4.3 Kultivace explantátových kultur in vitro .................................. 26 3.4.3.1 Kultivační fáze ................................................................... 26 3.4.3.1.1 Buněčné suspenzní kultury ......................................... 26 3.4.3.2 Sterilizace .......................................................................... 27 3.4.3.2.1 Autoklávování............................................................. 28 3.4.3.2.2 Sterilizace živných médií ............................................ 28 3.4.3.2.3 Sterilizace rostlinného materiálu ................................ 28 3.4.3.3 Podmínky kultivace ........................................................... 29 3.4.3.3.1 Živná média ................................................................ 29 3.4.3.3.2 Fyzikální podmínky kultivace .................................... 30 3.4.4 Využití explantátových kultur rostlin ....................................... 31 4

3.4.4.1 Produkce sekundárních metabolitů .................................... 31 3.4.4.2 Rozmnožování a šlechtění rostlin ...................................... 32 3.5

ELICITACE....................................................................................... 33

3.5.1 Princip elicitace ....................................................................... 33 3.5.2 Elicitory .................................................................................... 33 3.5.2.1 Dělení elicitorů .................................................................. 33 3.5.2.2 Mechanismus působení elicitorů ....................................... 34 3.5.3 Faktory, které ovlivňují elicitaci .............................................. 35 3.6

ULTRAZVUK ................................................................................... 35

3.6.1 Ultrazvuk .................................................................................. 35 3.6.2 Účinky ultrazvuku..................................................................... 36 3.6.3 Ultrazvuková lázeň ................................................................... 36 3.6.4 Elicitace ultrazvukem ............................................................... 37 4

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ........................................................... 39 4.1

PŘÍSTROJE ....................................................................................... 39

4.2

POUŽITÉ CHEMIKÁLIE ..................................................................... 40

4.3

SUSPENZNÍ KULTURA SILYBUM MARIANUM L. .................................. 41

4.3.1 Živné médium ........................................................................... 41 4.3.2 Použité nádoby a nástroje ke kultivaci..................................... 42 4.3.3 Pasážování a kultivace ............................................................. 42 4.3.4 Elicitace ultrazvukem ............................................................... 43 4.4

STANOVENÍ OBSAHU FLAVONOLIGNANŮ A TAXIFOLINU .................. 44

4.4.1 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie ............................... 44 4.4.2 Využití HPLC ........................................................................... 44 4.4.3 Princip stanovení ..................................................................... 45 4.4.4 Validace HPLC metody ............................................................ 45 4.4.4.1 Test způsobilosti ................................................................ 45 4.4.4.2 Validační parametry........................................................... 46 4.4.5 Postup stanovení ...................................................................... 47 4.4.5.1 Parametry HPLC analýzy .................................................. 47 4.5

KALIBRAČNÍ KŘIVKY ...................................................................... 48

4.5.1 Zhotovení kalibrační křivky ..................................................... 48 4.5.2 Kalibrační křivky jednotlivých flavonolignanů ........................ 50 5

4.6

VÝPOČET OBSAHU FLAVONOLIGNANŮ ............................................ 54

4.7

STATISTICKÉ VYHODNOCENÍ ........................................................... 55

4.7.1 Aritmetický průměr................................................................... 55 4.7.2 Směrodatná odchylka ............................................................... 55 4.7.3 T-test......................................................................................... 56 5

VÝSLEDKY ...................................................................................... 57 5.1

TABULKY ........................................................................................ 57

5.2

GRAFY ............................................................................................ 63

6

DISKUZE .......................................................................................... 65

7

ZÁVĚR .............................................................................................. 69

8

POUŽITÁ LITERATURA .............................................................. 71

9

ABSTRAKT ...................................................................................... 74

6

1 ÚVOD Už od počátku vzniku našeho lidstva byly rostliny prvním a jediným zdrojem jak potravy, tak i prvních léčiv. Lidé postupem času rostliny začaly pojmenovávat, poznávat a tím je v podstatě začaly i studovat. Během několika desítek let se rozvíjejícímu lidstvu povedlo objevit, které rostliny jsou pro ně užitečně a které škodlivé. Svou vychytralostí se naučily používat oboje, větší pozornosti bylo věnováno studium léčivých rostlin. Během let se rozpoznaly účinky u většiny rostlin a začaly se hojně používat. Jak šel čas tak se postupně začaly objevovat nejprve polosyntetická a poté celá syntetická léčiva, která ale většinou vycházela z rostlin. Byla účinnější, tak se jim začala věnovat větší pozornost. V dnešní době se opět obrací zrak k rostlinám, protože syntetická léčiva u mnohých nemocí už nezabírají. Tím pádem se znovu rozvíjí obor přírodních léčiv, hledají se nové indikace pro rostliny, nové účinné látky a také se zvyšuje produkce už známých látek v rostlinách. Náš stále se rozvíjející svět bude jednou potřebovat mnoho léčiv i rostlinného původu, ale bude čím dál míň místa na pěstování rostlin, proto se hledají metody, které by zvyšovaly produkci obsahových látek v rostlinách.

7

2 CÍL PRÁCE Cílem práce bude se seznámit s technikou kultivace rostlinných kutlur in vitro. Dále zjistit vliv ultrazvuku (jako abiotického elicitoru) na produkci flavonolignanů v suspenzní kultuře Silybum marianum. Na základě stanovení obsahu flavonolignanů metodou HPLC zjistit, zda ultrazvuk je schopen ovlivnit produkci těchto obsahových látek.

8

3 TEORETICKÁ ČÁST

3.1 Silybum marianum L. – Ostropestřec mariánský Čeleď Asteraceae – Hvězdnicovité

3.1.1

Botanický popis rostliny

Ostropestřec mariánský je jednoletá až dvouletá, bodlákovitá bylina se silnou a větvenou lodyhou, dosahující výšky 150 – 250 cm. Celá rostlina je pavučinatě chlupatá s bělavými žebry, v horní části řídce větvená. Přízemní listy poskládané v růžici můžou být až 40 cm dlouhé. Lodyžní listy jsou střídavé, tuhé, lesklé, na líci často bíle skvrnité, přisedlé až poloobjímavé, podlouhle eliptické, chobotnatě laločnaté. Květní úbory jsou jednotlivé na konci lodyhy a jejích větví, jsou široce kuželovité, 3 – 7 cm široké, se zákrovními listeny ostnitými, v horní části odstálými, se slámově žlutými až 7 mm dlouhými ostny. Květy jsou 3 – 4 cm dlouhé s dlouhou korunní trubkou, dole bílou, nahoře rozšířenou červenofialovou, s čárkovitými cípy. Plody jsou lesklé nažky. Jsou 7 – 8 cm dlouhé, 3 – 5 cm široké, kuželovité, světle hnědé s tmavými skvrnami. Nažky mají opadavý chmýr. Rostlina kvete od července do září. (13, 14, 15)

9

Obr. 1 Silybum marianum L. (16)

Obr. 2 Silybum marianum L. (17)

10

3.1.2

Rozšíření

Ostropestřec mariánský se vyskytuje na Kanárských ostrovech, ve Středozemí, v Malé Asii. V České republice je pěstovaný, roste na hlinitých a písčitohlinitých půdách bohatých na živiny, někdy se může vyskytovat divoce na návsích, rumištích nebo kamenných stráních. (19)

3.1.3

Charakteristika, sběr a úprava drogy

Z ostropestřce mariánského se sbírá semeno – Fructus cardui marianae. Krátce před dozráním se celé hlavice odřežou. Skladují se v suchých a teplých místnostech, kde dozrávají. Semena se z nich poté vymlátí a zbaví chmýří. Droga je bez pachu s hořkou chutí. (14)

Obr. 3: Fructus cardui marianae (18)

11

3.1.4

Obsahové látky

Plod obsahuje velké množství oleje (20 – 30 %) s vysokým podílem nenasycených mastných kyselin, hořčiny, silice, 0,7 – 3% flavonolignanů, převážně silymarin, což je směs složená ze silybinu A a silybinu B, isosilybinu A a isosilybinu B, silydianinu a silychristinu. Dále obsahuje flavonoidy, jako taxifolin, kvercetin a kempferol a až 30 % bílkovin. (13)

3.1.5

Použití

Účinné látky jsou převážně obsaženy pod osemením, proto se používá celé semeno se slupkou. Hlavním důvodem využití Silybum marianum L. je schopnost flavonolignanů působit hepatoprotektivně. Tato droga zvyšuje tvorbu žluče, díky obsahu hořčin a silic, dále působí také antipyreticky a to pro obsah silybinu, který snižuje oxidaci tuků a tím tlumí produkci prostaglandinů. (13, 14) Byly prokázány i kancerostatické účinky. (23)

12

3.2 Flavonolignany

3.2.1

Flavonolignany

Flavonolignany jsou sekundární metabolity rostlin. Patří do speciální podskupiny derivátů flavonoidů. Nacházejí se ve vysokých koncentracích v některých druzích rostlin, jako v luštěninách, ovoci a zelenině nebo v jejich částech, především v zrnech, semenech. (20)

3.2.2

Chemická struktura (21)

Flavonolignany jsou přírodní fenoly, vznikají kondenzací flavanolu taxifolinu (2,3 – dihydrokvercetin), nejčastěji s koniferylalkoholem. Jejich konečná struktura závisí na orientaci molekul reaktantů při kondenzaci.

koniferylalkohol

taxifolin 13

Cyklizací volných radikálů taxifolinu a konyferylalkoholu vzniká silybin, který se vyskytuje jako směs dvou diastereoizomerů:

silybin A

silybin B

14

Izomer isosilybin se nachází taktéž ve dvou trans diastereoizomerech:

isosilybin A

isosilybin B

15

Silychristin vzniká taktéž z taxifolinu, ale zde je volný elektron v poloze ortho oproti hydroxyskupině v poloze 4:

silychristin

Silydianin je největší molekula, nejprve cyklizuje intramolekulárním atakem enolátového nukleofilu a reakce je dokončena hemiketalovým přesunem:

silydianin

16

3.2.3

Biosyntéza (21)

Flavonolignany vznikají oxidativním spojením flavonoidu, většinou dihydroflavonolu

taxifolinu

a

fenylpropanoidem,

nejčastěji

koniferylalkoholem. Taxifolin a koniferylalkohol reagují jako volné radikály vzniklé oxidací. U silybinu a isosilybinu se nachází volný radikál v poloze 4´.

+

17

+

+

+

18

U silychristinu a silydianinu se volný radikál nachází v poloze 5´.

silychristin

19

silydianin

20

3.2.4

Využití flavonolignanů

Směs flavonolignanů silymarin má prokázané hepatoprotektivní účinky, jeho aktivní látky se navážou na membránu jaterní buňky a nedovolí průchodu toxinu. Tímto chrání játra při poškození toxickými látkami, doporučuje se jako podpůrná léčba při chronickém jaterním onemocnění a jaterní cirhóze. Zvyšují vylučování žluče do střev, jsou proto doporučovány při poruchách trávení, nechutenství, při žlučníkových kolikách a žlučníkových kamenech. Jsou relativně silným antioxidantem, z tohoto důvodu se často používají pro celkovou detoxikaci těla Tlumí činnost sympatického nervového systému a lze ho použít jako sedativum. (22) Mají prokázané účinky při rakovině prostaty. (23) Snižují oxidaci tuků, tím tlumí syntézu prostaglandinu a snižují horečku, můžou i mírně tlumit zánět. Zevně jsou účinné na hemoroidy, bércové vředy a křečové žíly. Jsou velmi ceněny při otravách alkoholem, drogami a houbami, regenerují jaterní tkáň a zvyšují tak šanci na přežití. V jedné německé studii bylo prokázáno, že při intravenózním podání působí jako protijed při otravě muchomůrkou zelenou. Jsou

doporučovány

jako

podpůrný

prostředek

při

dietách

a

chemoterapii. (22)

21

3.3 Flavonoidy

3.3.1

Struktura a význam pro rostlinu

Flavonoidy tvoří velkou skupinu látek nacházející se ve většině rostlin, v některých více, proto jsou pro ně typické. Jsou to sekundární metabolity fenolického charakteru. Obsahují aromatická nebo fenolická jádra. Mohou obsahovat jednu nebo více hydroxylových popřípadě methoxylových skupin. V rostlinách se vyskytují ve formě glykosidů, jako O – glykosidy, kde je cukr vázán přes kyslík, C – glykosidy, kde je cukr vázán přes uhlík nebo ve formě samotných aglykonů. Většina flavonoidů jsou více hydroxylované sloučeniny, jsou proto rozpustné ve vodě, nachází se ve vakuolách buněk. V závislosti na určitém druhu rostlin se nachází buď v epidermis listů nebo v epidermis mezofilu. Méně hydroxylované nebo methoxylované flavonoidy jsou lipofilnější, nachází se v silicích nebo kutikule listů rostlin rostoucích převážně v suchých nebo polosuchých oblastech. (24, 25, 26) Flavonoidy jsou také známy i jako rostlinné pigmenty, zabarvují květy od žluté, přes červenou až po modrou. Tímto zbarvením přitahují rostliny opylovače. Jejich další funkcí je ochrana rostlin před UV zářením a mohou také rostlině pomáhat fixovat dusík. (27, 28)

3.3.2

Chemická struktura

Flavonoidy jsou odvozeny od fenylchromanu. Podle polohy navázaného arylu rozlišujeme tři skupiny flavonoidů. Flavan, kde je fenyl navázán v poloze 2 (2-fenylchroman), isoflavan, kde je navázán v poloze 3 (3fenylchroman) a neoflavan s fenylem navázaným v poloze 4 (4fenylchroman). (25, 27)

22

flavan

isoflavan

neoflavan Oxidací pyranového kruhu vznikají další deriváty: (25)

flavon

flavonol

flavanon

flavanol 23

flavandiol

3.3.3

Využití flavonoidů

Nejznámějším účinkem flavonoidů je jejich venoaktivita, snižují permeabilitu kapilár a snižují také jejich lomivost. Používají se proto při kapilárních

a

žilních

obtížích,

při

léčbě

otoků,

mají

též

antohemorhagickou aktivitu. Flavonoidy mají také antioxidační účinek, vychytávají volné radikály, využívají se proto v léčbě rakoviny. V kombinaci s vitamínem C a vitamínem E působí synergicky, mají zvýšený antioxidační účinek. Flavonoidy mají schopnost vázat do komplexů ionty kovů a měnit tak jejich dostupnost pro oxidačně-redukční reakce. Dále mají účinky antivirové, antibakteriální, antitrombotické, antialergické a mohou také mírně uvolňovat hladké svalstvo. (24, 25)

24

3.4 Explantátové kutrury rostlin

3.4.1

Definice a základní pojmy

Explantátové kultury rostlin neboli tkáňové kultury rostlin in vitro znamenají kultivaci izolovaných částí rostlin za uměle připravených podmínek v aseptickém prostředí. (1) Explantát – cíleně oddělená rostlinná část, buňka nebo pletivo. Kultura explantátů – jsou to explantáty pěstované in vitro po nějakou dobu. Kalus – jedná se o shluk nediferencovaných rostlinných buněk. Primární explantát – rostlinný materiál odebraný přímo z původní rostliny. Primární kultura – po nějakou dobu pěstovaný explantát z původní rostliny. Subkultura neboli pasáž – přenesená menší část buněk na nové médium. Subkulturace neboli pasážování – přenesení části buněk na nové médium, po vyčerpání živin z původního média nebo po nárůstu buněk nad neúnosnou míru. Subkultivační interval – časový úsek mezi jednotlivými pasážemi. Subkultiační číslo – číslo udávající kolikrát byla daná kultura pasážovaná, toto číslo se odvozuje od primokultury. (29)

3.4.2

Typy a vlastnosti explantátových kultur

Explantátové kultury rostlin se dělí do několika skupin dle morfologických vlastností: Orgánová kultura – kultura malých částí nebo celých orgánů na živném médiu bez samovolného uvolňování buněk. Kultura si zachovává svou původní architektoniku a své funkční vlastnosti. Tkáňová (buněčná) kultura – kultura malých částí tkání nebo buněk, kultura si nemusí zachovat svou původní architektoniku, může si zachovat některé své původní funkce. 25

Suspenzní kultura – jednotlivé buňky nebo jejich shluky suspendované v tekutém živném médiu, často promíchávané a provzdušňované. Kalusová kultura – kultura kalusu in vitro. (29)

3.4.3

Kultivace explantátových kultur in vitro

3.4.3.1 Kultivační fáze Kultivaci explantátových kultur lze rozdělit do čtyř fází: Fáze I. – spočívá ve výběru matečné rostliny a získání primokultury. Ze zdravé rostliny pěstované za aseptických podmínek nebo z povrchově sterilizované matečné rostliny se odebere určená část a přenese se na sterilní pevné agarové médium. Po určité době se objeví primární kalus, který se dále rozmnožuje na novém médiu. Fáze II. – namnožení primokultur. Primokultura se opakovaně pasážuje na nové médium, tímto se zvyšuje počet explantátů v kultuře. Tato fáze pokračuje do požadovaného množství explantátů. Fáze III. – vznik suspenzní kultury. Suspenzní kultura vznikne rozmělněním kalusu, buď mechanicky, nebo enzymově, dále je udržována pravidelným pasážováním. Fáze IV. – suspenzní kultury se dále udržují na rollerech nebo třepačkách v malých baňkách. (2)

3.4.3.1.1 Buněčné suspenzní kultury Buněčné suspenzní kultury rostlin jsou tvořeny převážně homogenní populací jak samotných buněk, tak i malých buněčných shluků, kultivované v pohybujícím se tekutém živném médiu za aseptických podmínek. Jednotlivé buňky jsou v přímém kontaktu s živným médiem, proto jsou jednotlivé složky média snadno přístupné do buněk. Kombinace dobré výměny plynů při pohybu média a snadný přístup živin do buněk umožňují kultuře rychlý růst. Rychlý růst buněk ale zároveň způsobuje rychlý úbytek živin z média, proto je nutné tyto kultury velmi často pasážovat.

26

Růst suspenzní kultury velmi dobře charakterizuje růstová křivka. Průběh růstové křivky je charakteristický nejprve velmi pomalým nárůstem buněk těsně po naočkování (lag fáze), poté nastupuje velmi intenzívní nárůst v exponenciální fázi a stacionární fází, kde nárůst buněk je snížen nebo úplně zastaven vzhledem k vyčerpání živin z média v exponenciální fázi. Obr. č. 4:

A – lag fáze, B – exponenciální fáze, C – stacionární fáze c – koncentrace, počet buněk/ml, t – čas, doba kultivace U suspenzní kultury je nutné pasážování vždy na konci exponenciální fáze růstu. V této fázi se mění podmínky kultivace (složení média, hustota buněčné suspenze, atd.). (1)

3.4.3.2 Sterilizace Sterilizace je jednou ze základních podmínek úspěšné kultivace explantátových rostlinných kultur. Pod pojem sterilizace se zahrnuje sterilizace pracovního prostředí (kultivační místnosti a zařízení, nástroje a sklo, autoklávování), sterilizace živných médií, sterilizace rostlinného materiálu a samozřejmě sterilní práce v očkovacím boxu. (1)

27

3.4.3.2.1 Autoklávování Jedná se o sterilizaci horkou parou při 121oC na zvýšeného tlaku 100 kPa nejčastěji po sobu 15 – 20 minut, provádí se v autoklávu. Takto se sterilizují skla, pipety a především média. (1)

3.4.3.2.2 Sterilizace živných médií Živná média lze sterilizovat několika způsoby, nejčastěji se sterilizuje autoklávováním nebo filtrací, méně často se ke sterilizaci používá ultrazvuk, ozáření nebo sterilizace chemickými látkami. Sterilizace autoklávováním se provádí ve skleněných uzavřených nádobách, nejčastěji alobalem, vatou nebo plastem. Sterilizace filtrací se používá u médií, které obsahují termolabilní komponenty (proteiny, některé cukry, vitamíny, aminokyseliny,...). K filtraci se používají speciální membránové filtry s velikostí pórů menší než 0,2 m. (1)

3.4.3.2.3 Sterilizace rostlinného materiálu Pro získání primokultury je nutné mít k dispozici sterilní materiál. Sterilní materiál získáme pomocí různých dezinfekčních postupů. Nelze použít sterilizaci vysokou teplotou, neboť by se rostlinný materiál poškodil, z tohoto důvodu se používá sterilizace určenými desinfekčními roztoky, které ničí plísně a bakterie, nesmí však poškodit rostlinné pletivo. Obvyklý postup této sterilizace zahrnuje opláchnutí explantátu v roztoku detergentu (Tween, Jar), omytí vodou po dobu 10 – 30 minut, ponoření explantátu do dezinfekčního roztoku za sterilních podmínek, vyjmutí z dezinfekčního roztoku a opláchnutí minimálně 3x ve sterilní destilované vodě. (1)

28

3.4.3.3 Podmínky kultivace Pro správný růst explantátové kultury jsou důležité vhodné podmínky kultivace. Nastavením různých podmínek kultivace lze taktéž měnit produkci sekundárních metabolitů. 3.4.3.3.1 Živná média Složení živného média patří k jedněm z nejdůležitějších faktorů, které ovlivňují růst a morfogenezi v explantátových kulturách rostlin. (1) Používaná média obsahují v podstatě několik složek, mezi něž patří: makroelementy, mikroelementy, vitamíny, aminokyseliny, příp. jiný zdroj dusíku, sacharidy, další organické složky, růstové regulátory, destilovanou vodu, v případě tuhých médií také zpevňující složku. (1) Makroelementy – v podstatě zahrnují několik nejdůležitějších prvků, patří mezi ně dusík, fosfor, draslík, vápník, hořčík a síra. Přidávají se ve formě solí a jejich koncentrace se mění v závislosti na požadavky rostlinného druhu. (1) Mikroelementy – železo a zinek v chelátové formě, mangan, bor, měď a molybden, někdy se může dodávat kobalt, jod, sodík a chlór. (1) Zdroj uhlíku – nejčastěji se používá sacharóza, případně je možné zaměnit sacharózu za glukózu nebo fruktózu. (1) Vitamíny – slouží jako katalyzátory mnoha metabolických procesů, mnohdy jsou limitním faktorem pro růst. Mezi nejčastěji používané vitamíny patří thiamin, kyselina nikotinová, pyridoxin a myo-inositol. Někdy se do kultivačních médií přidává biotin, kyselina askorbová, kyselina listová, kyselina panthotenová, riboflavin, atd. (1) Zdroj dusíku – rostlinné buňky jsou samy schopny syntetizovat si důležité aminokyseliny, ale přítomnost některých dalších aminokyselin v živném médiu může stimulovat jejich růst. Dodává se většinou v organické formě než v anorganické, protože rostlina je schopna lépe využít organickou formu. Do médií se přidává kasein hydrolyzát, L-glutamin, L-asparagin, glycin a adenin. Při vysoké koncentraci aminokyselin v médiu však může nastat zastavení růstu. (1) Růstové regulátory – lze je rozdělit do čtyř základních skupin: auxiny, cytokiny, gibereliny a kyselina abscisová. Používají se v různých 29

koncentracích, důležitý je také jejich vzájemný poměr. Do skupiny auxinů řadíme kyselinu indolyloctovou (IAA), kyselinu indolylmáselnou (IBA), kyselinu dichlorfenoxyoctovou (2,4 – D) a kyselinu naftyloctovou (NAA). K cytokininum řadíme benzylaminopurin (BAP), benzyladenin (BA), 6-dimethylaminopurin (2IP či IPA), furfurylaminopurin (kinetin) a zeatin. (1) Nedefinované organické složky médií – slouží ke stimulaci růstu, je však lépe je vynechat z důvodu jejich nedefinovaného složení. Používá se protein (kasein) hydrolyzát, kokosové mléko, kvasniční extrakt, sladový extrakt, extrakt z banánů, pomerančové nebo rajčatové šťávy. (1) Látky zpevňující médium – nejčastěji se využívá agar rozpuštěný ve vodě, tuhne při 45oC, je proto stabilní při kultivační teplotě, nereaguje s ostatními složkami média, nerozkládá se rostlinnými enzymy a jeho tuhost lze měnit použitím jiné koncentrace agaru. (1) Destilovaná voda – prostá pyrogenů, organických nečistot a plynů – vysoká kvalita. (1)

3.4.3.3.2 Fyzikální podmínky kultivace

Fyzikální podmínky kultivace (světlo, teplota, pH živného média a vlhkost vzduchu) jsou nezbytné jednak pro růst explantátové kultury a jednak i pro tvorbu sekundárních metabolitů. (29) Světlo – změna intenzity biosyntézy a akumulace sekundárních metabolitů v explantátových kulturách závisí na délce osvětlení, je proto nutné nalézt pro kultivaci vhodný poměr světla a tmy. Nezáleží pouze na kvantitě, ale i na kvalitě světla. (29) Teplota při kultivaci – velice často je empiricky nastavena kolem 25oC. Nízká teplota způsobuje zastavení růstu a metabolismu, zatímco vysoká teplota poškozuje buňky v kultuře. (29) pH živného média – koncentraci vodíkových iontů je nutné věnovat velikou pozornost, obecně se doporučuje nastavit pH 5,5 – 6,0, některé kultury vyžadují pH 6,0 – 7,0. Hodnota pH se upravuje přidáním hydroxidu draselného nebo kyseliny chlorovodíkové. (1) 30

Vlhkost vzduchu – vlhkost vzduchu v kultivační místnosti se v závislosti na požadavcích rostliny udržuje v rozmezí 20 – 98%.

3.4.4

Využití explantátových kultur rostlin

Explantátové kultury rostlin se využívají v mnoha biologických oborech studujících rostliny, studují se z hlediska produkce sekundárních metabolitů, rozmnožování, ozdravování, ale také i šlechtění rostlin. (1)

3.4.4.1 Produkce sekundárních metabolitů

Rostliny produkují rozmanitou paletu sekundárních metabolitů, které mají uplatnění v mnoha oborech jako je farmacie, potravinářství, zemědělství, ale i kosmetický průmysl. (1) Sekundární metabolity lze získat jednak z intaktních rostlin, ale i chemickou syntézou. Tyto dvě cesty získávání sekundárních metabolitů mají bohužel mnoho překážek (zhoršující se podmínky pěstování, závislost obsahu látek na klimatických podmínkách, postup sušení a skladování, velmi složité a drahé chemické syntézy, vznik izomerů,...), proto je snaha začít využívat explantátové kultury rostlin. (1) Explantátové kultury mají oproti klasickému získávání několik výhod: a) syntéza probíhá za definovaných umělých podmínek nezávislých na půdních a klimatických poměrech, může probíhat nepřetržitě po celý rok. (1, 2) b) je zamezeno negativnímu vlivu biologických faktorů (mikroorganismy, hmyz) měnících produkci sekundárních metabolitů. (1) c) je možné vyselektovat kultury se zvýšenou produkcí sekundárních metabolitů. (1) d) automatickým řízením regulace růstu a metabolických procesů se může snižovat výrobní cena, ale zároveň zvyšovat produkce sekundárních metabolitů. (1)

31

e) explantátové kultury jsou schopny změnou metabolismu produkovat i takové sekundární metabolity, které normálně rostlina neprodukuje. (2)

3.4.4.2 Rozmnožování a šlechtění rostlin

V rozmnožování a šlechtění rostlin mají explantátové kultury rozsáhlé využití: (1, 2) a) kulturu je možné odvodit z kterékoliv části rostliny, postačí malé množství a nevyžaduje velký prostor. b) jsou nastaveny sterilní podmínky, proto je zabráněno mikrobiálním i virovým nákazám. c) množení rostlin je možné po celý rok, nezávislé na klimatických podmínkách. d) rostliny nevyžadují žádnou speciální péči (pletí, chemické ošetření, zálivku,...) e) je možné množit takové druhy rostlin, které se běžnými metodami pěstování množí buď velice pomalu, nebo se vůbec množit nedají. f) při hybridizaci překonáním přirozených bariér taxonomicky vzdálených druhů rostlin s nápomocí kultivace izolovaných embrií. g) vytvoření nových hybridů pomocí řízené fúze protoplastů. h) regulace a ovlivnění oplození, získání haploidů při kultivaci prašníků a mikrospor. i) možnost navození genových a genomových mutací v explantátových kulturách s možností jejich vyselektování z regenerovaných rostlin. j) včlenení odlišného genetického materiálu a tím modifikování rostlinného genomu.

32

3.5 Elicitace

3.5.1

Princip elicitace

Principem elicitace je signálem (elicitorem) indukovaná exprese genů, která posléze vede ke zvýšení syntézy sekundárních metabolitů jak v rostlinách, tak i v explantátových kulturách. (30)

3.5.2

Elicitory

Elicitory jsou nepříznivé podmínky prostředí různého původu, na které mají rostliny schopnost reagovat (aktivovat enzymy v rostlinných pletivech popřípadě mohou stimulovat syntézu těchto enzymů). Jsou tedy stresovým faktorem pro rostliny, který indukuje obrannou reakci buněk založenou na produkci sekundárních metabolitů. (31)

3.5.2.1 Dělení elicitorů

Elicitory dělíme podle původu na biotické a abiotické: Biotické – látky pocházející z živého organismu (viry, bakterie, houby), popřípadě vzniklé za jeho spoluúčasti. Abiotické – všechny látky, které nepochází z živého organismu (bez biologického původu): extrémní teploty, sucho, toxické látky, hypertonický roztok, nadměrné osvětlení, UV záření, změny pH, ionty těžkých kovů, ultrazvuk. (31)

33

3.5.2.2 Mechanismus působení elicitorů

Elicitory (stresové faktory, stresory) spouštějí v rostlinách obranné mechanismy aktivací vhodných genů. Elicitory ovlivňují genovou aktivitu nepřímo pomocí tzv. přenašečů signálů (druhých poslů). Existují dva různé typy poslů: cestou cyklického adenosinmonofosfátu (cAMP) a cestou fosfoinosidovou. Obě dvě cesty přenosu jsou spouštěny navázáním biotického stresoru na receptor v membráně buňky. V cestě adenosinmonofosfátové se mění adenosintrifosfát (ATP) na cAMP, tato přeměna je možná adenylátcyklázou, na kterou je přenesena změna struktury receptoru pomocí guanosintrifosfát - vážícího proteinu (G protein). Ve fosfoinosidové cestě dochází po navázání elicitoru ke štěpení membránového lipidu fosfatidylinositol – 4,5 – bisfosfátu (PIP2) pomocí enzymu fosfolipázy C na dvě signální molekuly inositol – 1,4,5 – trifosfát (IP3), který přestupuje do cytoplazmy a diacylglycerol (DAG), jež zůstává v membráně. Všichni druzí poslové ve výsledku vyvolají změnu fosforylace proteinů. Fosforylace je vyvolána buď přímo aktivací proteinkináz (cAMP, DAG), na kterou navazuje exprese genů, nebo nepřímo uvolněním vápenatých iontů po vazbě na receptor v endoplazmatickém retikulu. Vápenaté ionty jsou následným přenašečem signálu, naváží se na specifickou bílkovinu kalmodulin, vznikne aktivní komplex, který má schopnost aktivovat proteinkinázu a tím spouští i expresi genů. Dalším způsobem přenosu signálu a aktivace genové exprese je tvorba superoxidu a jiných aktivních forem kyslíku. Tento způsob je často používaný a velmi rychlý. Aktivní formy kyslíku mají jak přímý, tak i nepřímý účinek, peroxidací membránových lipidů buněk vyvolají zvýšenou produkci stresových faktorů (kyselina jasmínová) a tyto pak ovlivňují genovou transkripci.

34

Abiotické elicitory působí nepřímo (neváží se na daný receptor). Peroxidací membránových lipidů způsobí zvýšení propustnosti pro ionty vápníku, které způsobí genovou expresi. (30)

3.5.3

Faktory, které ovlivňují elicitaci

Existuje několik faktorů, které mají vliv na působení elicitoru na explantátovou kulturu a tím na produkci sekundárních metabolitů. Zahrnují se mezi ně: Koncentrace elicitoru – odvozuje se empiricky, má vliv na intenzitu odpovědi Specifita elicitoru – jeden elicitor má schopnost ovlivňovat sekundární metabolismus různých explantátových kultur Doba působení elicitoru – zjišťuje se empiricky, má vliv na aktivitu enzymů Načasování elicitace – nejvhodnější doba pro působení elicitoru se jeví exponenciální fáze, v níž je růst a aktivita enzymů nejvíce aktivní, pro dostatečnou odpověď Podmínky kultivace – teplota, složení kultivačního média, osvětlení Stáří explantátové kultury (32)

3.6 Ultrazvuk

3.6.1

Ultrazvuk

Ultrazvuk je akustické vlnění, které má frekvenci vyšší než 20 kHz (nad hranicí slyšitelnosti). Prostředím se šíří stejně rychle jako slyšitelný zvuk (330 m.s-1), má však kratší vlnovou délku, šíří se přímočaře, při střetu s překážkou platí zákon odrazu, kapalinami a pevnými látkami je absorbován pouze z malé části. (5)

35

3.6.2

Účinky ultrazvuku

Účinky tepelné – po absorpci ultrazvukové vlny dochází k předání energie molekulám prostředí, čímž se zvýší jejich kinetická energie a dojde ke zvýšení teploty. Jedná se o přímou úměru, zvýšení frekvence vyvolá zvýšení teploty. Účinky mechanické – procházející ultrazvukové vlny vyvolávají lokální tlakové změny s mechanickými účinky jak na buněčné, tak i na molekulové úrovni, které mohou vézt až k poškození tkání. Účinky fyzikálně - chemické – koagulační a disperzní účinky, urychlení polymerace, štěpení vysokomolekulárních látek, vznik volných radikálů. Účinky biologické – v závislosti na intenzitě ultrazvuku (množství pohlcené energie) má jak pozitivní, tak i negativní účinky. Nízká intenzita ultrazvuku má pozitivní účinky (urychlení fyzikálně – chemických reakcí, zvýšení látkové výměny), ultrazvuk s intenzitou 1,5Wcm-3 má mírně toxické účinky (zvýšení propustnosti buněčných membrán) a ultrazvuk s intenzitou vyšší jak 3Wcm-3 vyvolává nevratné morfologické změny (zničení buněčného jádra, změněné složení protoplazmy, porušení membrán buněk). (5)

3.6.3

Ultrazvuková lázeň

Principem ultrazvukové lázně je šíření ultrazvukových vln v kapalném prostředí. Rozeznáváme

několik

typů

zdroje

ultrazvuku

v kapalinách

(generátorů): Ejektronové generátory – mechanický princip. Kovová destička s břity na obou stranách je umístěna v rychle proudící kapalině, turbulence vzniklé nadkritickým obtékáním destičky kapalinou tuto destičku rozkmitají. Frekvence ultrazvuku je závislá na rezonanční frekvenci destičky. Tímto typem generátoru lze získat ultrazvuk s frekvencí do 50kHz. Magnetostrikční generátory – využívají magnetostrikční jev. Základem je změna rozměrů ferromagnetických látek způsobené magnetizací. Jako 36

ferromagnetické látky se využívá nikl a jeho některé slitiny s kobaltem a železem. Lze získat ultrazvuk s frekvencí až 100kHz. Piezoelektrické generátory – jsou založeny na deformaci vhodných látek v závislosti na elektrickém poli, piezoelektrickém jevu. Sestavují se jednak z výbrusů křemenného krystalu nebo výbrusů keramických látek. Na výbrusy se přivede napětí z vysokofrekvenčních oscilátorů s frekvencí, která odpovídá kmitům výbrusu, tímto se výbrus rozkmitá. Frekvence ultrazvuku závisí na frekvenci přiváděného napětí. Lze získat ultrazvuk s frekvencí až 106kHz. (5)

3.6.4

Elicitace ultrazvukem

Využití ultrazvuku, jako abiotického elicitoru, se jeví jako velice nadějné pro stimulaci produkce sekundárních metabolitů. Dokazuje to studie, ve které byla účinkům ultrazvuku (intenzita 82mW/cm3, frekvence 38,5kHz, doba působení 1 - 4 minuty) vystavena suspenzní kultura Panax ginseng L., u které došlo ke zvýšení produkce sekundárních metabolitů (saponinů) až o 75%. (7) V jiné studii se opět potvrdilo zvýšení produkce saponinů v suspenzní kultuře Panax ginseng L. vystavené ultrazvuku o intenzitě menší nebo rovno 0,1W/cm3, frenvenci 38,5kHz, po dobu 30s - 6 minut. (8) Další studie prokazuje výrazný vzestup aktivity polyfenoloxidázy, peroxidázy, fenylalaninamoniumlyázy a zvýšení produkce polyfenolů a fenolických sloučenin v suspenzní kultuře Panax ginseng L., na kterou se působilo ultrazvukem o intenzitě 13,7 a 61mW/cm3 po dobu 2 minut a o frekvenci 38,5kHz. (9) Jiná studie prokázala, že ultrazvuk (frekvence 40kHZ, doba 2, 3, 5 a 10 min.), kys. salicylová a jejich kombinace mají vliv na zvýšení produkce fenolických látek a zvýšení biosyntézy taxolu v buněčné kultuře Corylus avellana L. (39) Studie na kultuře Echinacea purpurea L. prokazuje, že vliv ultrazvuku má vliv na zvýšení produkce biosyntézy kyseliny kávové a jejích derivátů v kořenové kultuře. (40) 37

Elicitace rostlinných kultur in vitro ultrazvukem vede ke spuštění obranných reakcí v rostlinách podobně jako je tomu při napadení rostliny patogenem. Rostlinná kultura zvýší prostupnost do buňky pro vápenaté ionty, nastane také výměna K+(z buňky)/H+(do buňky) a zvýší se produkce aktivních kyslíkových radikálů. Tento proces nastává po 2 minutách působení ultrazvuku. (7) Účinek ultrazvuku na produkci sekundárních metabolitů je kromě elicitačních podmínek závislý také na intenzitě a délce působení elicitoru na kulturu. Ultrazvuk jako elicitor má několik výhod, obranné mechanismy v rostlinách aktivuje velice rychle a jejich výsledek lze detekovat již několik sekund po elicitaci. (8, 10)

38

4 Experimentální část

4.1 Přístroje 

laboratorní analytické váhy A 200 S, Sartorius, Německo



laminární box Fatran, Výrobné družstvo Pokrok, Slovenská republika



autokláv PS 20 A, Chirana, Česká republika



horkovzdušný sterilizátor SVS/1, Chirana, Česká republika



ultrazvuková lázeň Sonorex RK 100H, Bandelin, Německo



laboratorní třepačka Unimax 2010, Heidolph instruments, Německo



vodní lázeň typ 1042, Gesellshaft für labortechnik, Německo



mikrofiltry Corning NY 14831(velikost pórů 0,2m), Německo

Kapalinový chromatograf 

autosampler Jasco AS-2055, Japonsko



diodový detektor Jasco MD-2015, Japonsko



kolona LiChroCART 250x4mm, sorbent LiChrospher 5m



čerpadlo Jasco PU-2089, Japonsko



vialky, Labicom s.r.o Olomouc, Česká republika



těsnění k vialkám, Labicom s.r.o., Česká republika

39

4.2 Použité chemikálie 

Ajatin, Profarma-Produkt s.r.o., Česká republika



destilovaná voda, Katedra analytické chemie Faf HK UK, Česká

republika 

methanol HPLC Grade, Merk, Německo



Methylalkohol p.a., Penta, Česká republika



standardy: Sigma-Aldrich o taxifolin o silybin A o silybin B o isosilybin A o isosilybin B o silychristin o silydianin



superčistá voda, Katedra analytické chemie Faf HK UK, Česká

republika

40

4.3 Suspenzní kultura Silybum marianum L. K pokusům v této diplomové práci byla použita suspenzní kultura Silybum marianum L., odvozená z rozpadavé kalusové kultury Silybum marianum L. mechanickým rozvolněním. Kalusová kultura byla získána z kořenové části klíční rostliny Silybum marianum L. K pokusům byla použita suspenzní kultura Silybum marianum L., pasáž č. 59-63.

4.3.1

Živné médium

Pro kultivaci suspenzní kultury Silybum marianum L. bylo použito živné médium Murashigeho a Skooga s obsahem ( - NAO) jako růstového regulátoru o složení: (3)

CoCl2 . 6 H2O

0,0252 g/l

CuSO4 . 5 H2O

0,0252 mg/l

H3BO3

6,2 g/l

KI

0,83 g/l

MnSO4 . H2O

16,9 g/l

Na2MoO4 . 2 H2O

0,25 g/l

ZnSO4 . 7 H2O

11,5 g/l

CaCl2

3,325 g/l

KNO3

19,0 g/l

MgSO4 . 7H2O

3,7 g/l

NH4NO3

16,5 g/l

KH2PO4

1,7 g/l

kyselina nikotinová

0,5 g/l

pyridoxin hydrochlorid

0,5 g/l

thiamin hydrochlorid

0,1 g/l

glycin

2 g/l 41

Myo-inositol

0,1 g/l

hydrolyzát kaseinu

1,0 g/l

sacharóza

30,0 g/l

Jednotlivé složky živného média byly naváženy na analytických vahách a postupně rozpuštěny v destilované vodě v 1000 ml odměrné baňce, která byla následně doplněna destilovanou vodou po značku. K živnému médiu byl přidán růstový regulátor  - NAO v lihu o koncentraci 10g/l.

4.3.2

Použité nádoby a nástroje ke kultivaci

Ke kultivaci kalusové i suspenzní kultury byly použity Erlenmeyerovy baňky z varného skla Sial o objemu 100 ml, odolné vůči velkým výkyvům teplot i působení chemikálií. Při kultivaci kalusových kultur byly do Erlenmeyerových baněk vloženy můstky z filtračního papíru a nalito 30 ml živného média. Při kultivaci suspenzní kultury bylo do Erlenmeyerových baněk vlito též 30 ml živného média. Hrdla takto připravených baněk byla překryta alobalem a sterilizována v autoklávu při 121oC po dobu 20 minut a tlaku 100 kPa. Pinzety, které byly používány při pasážování, byly umyty, opláchnuty 96% ethanolem, zabaleny do alobalu a sterilizovány v horkovzdušném sterilizátoru při 200oC po dobu 2 hodin.

4.3.3

Pasážování a kultivace

Kultivační baňky zakryté alobalem byly před manipulací otřeny 96% ethanolem. Odvození kultur a jejich následné pasážování bylo prováděno v laminárním boxu, který byl vytřen roztokem Ajatinu (1:10) a následně 42

vyzářen germicidní zářivkou minimálně po dobu 1 hodiny. Při práci byly dodržovány aseptické podmínky. Pasážování bylo prováděno 6. týden kultivace přenesením buněk do Erlenmeyerových baněk obsahujících živné médium na můstek vytvořený z filtračního papíru. Tyto baňky byly opět překryty alobalem a vráceny do kultivační místnosti. Kultivace probíhala při normálním světelném režimu (16 hodin světlo a 8 hodin tma) při teplotě25oC. Každý 2. týden byla zároveň vytvořena suspenzní kultura mechanickým rozvolněním kalusové kultury přenesené do Erlenmeyerových baněk s novým živným médiem. Tyto baňky byly následně překryty alobalem a kultivovány za stejných podmínek jako kalusové kultury na laboratorní třepačce (150 ot/min).

4.3.4

Elicitace ultrazvukem

K elicitaci suspenzní kultury Silybum marianum L. byl jako abiotický elicitor použit ultrazvuk v podobě ultrazvukové lázně. Jednotlivé baňky se suspenzní kulturou Silybum marianum L. byly vystaveny působení ultrazvuku o intenzitě 0,1 W/cm3 a frekvenci 35 kHz po dobu 1, 2, 3, 4 a 5 minut. Některé vzorky byly následně ihned po elicitaci odebrány, ostatní byly dále kultivovány za normálního osvětlení (16 hodin světlo, 8 hodin tma), při teplotě 25oC na laboratorní třepačce (150 ot/min). Vzorky suspenzní kultury Silybum marianum L. byly odebírány ihned a následně po 6, 12, 24, 48, 72 a 168 hodinách po vystavení vlivu ultrazvuku. Odebrané vzorky byly přefiltrovány přes filtrační papír, zachycené buňky na filtračním papíře se nechaly sušit při pokojové teplotě, vzorek média byl zmražen. Kontrolní vzorky (bez působení ultrazvuku) byly odebrány ihned a po 48 hodinách. Kontrolní vzorky byly odebírány za stejných podmínek jako elicitované vzorky (filtrovány přes filtrační papír, buňky usušeny za pokojové teploty, médium zmraženo). Pro každý odběr vzorku byly odebrány 4 baňky.

43

4.4 Stanovení obsahu flavonolignanů a taxifolinu

4.4.1

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC – High Performance Liquid Chromatography) patří mezi nejrychleji se rozvíjejících analytické metody. Jedná se o separační metodu. Mezi hlavní přednosti patří: kvalitativní i kvantitativní hodnocení složek směsi, rychlost, citlivost stanovení, ke stanovení postačují minimální množství vzorků, možnost úplné automatizace. Principem HPLC je dělení látek mezi dvěma fázemi, z nichž jedna je nepohyblivá (stacionární) a druhá pohyblivá (mobilní). (6)

4.4.2

Využití HPLC

HPLC je v dnešní době nejvíce používanou analytickou separační metodou. Využívá se ke stanovení léčiv a jejich vznikajících metabolitů, steroidů, pesticidů, barviv, cukrů, vitamínů, atd. (6) Vysokoúčinná kapalinová chromatografie je vhodnou metodou pro stanovení flavonolignanů v kultuře Silybum marianum L., touto metodou bylo provedeno stanovení silybinu a isosilybinu ve studii Nam-Cheol Kim, Tyler N. Graf, Charles M. Sparacino, Mansukh C. Wani a Monroe E. Wall. (11) Další studie poukazuje na velmi dobrou separaci mezi jednotlivými flanonolignany, zejména diastereoizomerů silybinu A a B. (12)

44

4.4.3

Princip stanovení

Stanovení obsahu flavonolignanů (silybin A, silybin B, isosilybin A, isosilybin B, silychristin a silydianin) a flavonoidu taxifolinu pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC).

4.4.4

Validace HPLC metody

Validace experimentální metody je určitý proces, kterým se zjišťuje vhodnost metody pro daný účel. Zjišťují se nejdůležitější charakteristiky metody, zda je metoda správná, přesná a selektivní. (33)

4.4.4.1 Test způsobilosti

Nezbytnou součástí validace analytické metody je test způsobilosti analytického systému, tj. zjištění zda je metoda způsobilá k zajištění přiměřené účinnosti. (33) Nejčastěji se sledují se tyto parametry: (33) 

rozlišení



faktor symetrie



účinnost kolony



kapacitní faktor



relativní retence Pokud

jeden

nebo

více

parametrů

nevyhovují,

upraví

se

chromatografické podmínky (poměr jednotlivých složek mobilní fáze, průtoková rychlost kolonou) tak, aby se zajistila způsobilost a nedošlo přitom k velkému pozměnění metody. (33)

45

4.4.4.2 Validační parametry

Správnost - shoda mezi naším získaným výsledkem a správnou hodnotou získanou jinou nezávislou metodou, která má ověřenou správnost nebo přípravou modelového vzorku (směs všech složek přípravku a přesného množství standardu). Vyjadřuje se pomocí rozdílu správné a získané hodnoty nebo výtěžnosti, zjišťuje se z nejméně šesti vzorků. (33) Přesnost – vyjadřuje míru shody mezi opakovaně získanými výsledky s jedním homogenním vzorkem, který se analyzuje šestkrát, vyjadřuje se jako relativní směrodatná odchylka. Rozlišujeme 3 úrovně přesnosti, podle podmínek opakování: opakovatelnost (stejný způsob, jeden pracovník, stejná činidla, stejný přístroj), mezilehlá přesnost (různá činidla, pracovník i přístroje, jiný den, jedna laboratoř, jeden vzorek), reprodukovatelnost (různá činidla, pracovník, přístroje, den, laboratoř, ale jeden vzorek). (33) Selektivita – schopnost metody, změřit správně jednu látku ve směsi jiných látek. (33) Detekční limit – citlivost metody, nejnižší koncentrace látky, kterou je přístroj schopný detekovat. (33) Kvantitativní limit – citlivost metody, schopnost přístroje přijatelně správně a přesně detekovat nejnižší koncentraci látky. (33) Linearita – schopnost poskytovat výsledky přímo úměrné koncentraci stanovované látky. (33) Rozsah – koncentrační rozsah, ve kterém může být metoda použita. (33) Robustnost – vyjadřuje vliv měnících se podmínek na výsledky analýzy (složení a pH (vodné složky) mobilní fáze, teplot na koloně, průtoková rychlost, stabilita analyzovaných vzorků, rozdíl mezi kolonami (šarže, výrobce). (33)

46

4.4.5

Postup stanovení

Usušené vzorky buněk (elicitované i kontrolní) byly postupně upráškovány v třence a zváženy na analytických vahách. Z těchto upráškovaných vzorků byly následně připraveny extrakty pro stanovení obsahu flavonolignanů. Vzorek byl extrahován 10 ml 80% methanolu na vodní lázni pod zpětným chladičem po dobu 10 minut. Po vychladnutí se extrakt zfiltroval přes chomáček vaty do odměrné baňky. Celý postup extrakce se opakoval ještě jednou s použitým chomáčkem vaty se vzorkem. Získané extrakty se spojily a doplnily 80% methanolem na objem 20 ml. Přibližně 1,7 ml takto připraveného výluhu bylo přefiltrováno přes mikrofiltr o velikosti pórů 0,45 m do označené vialky a dále analyzováno na kapalinovém chromatografu Jasco AS-2055.

4.4.5.1 Parametry HPLC analýzy

Kapalinový chromatograf: chromatografická soustava Jasco autosampler AS-2055 čerpadlo Jasco PU-2089 detektory MD-2015 předkolonový filtr kolona

LiChrospher

RP-18

250x4

(5µm)

s ochrannou

předkolonou Objem nástřiku: 20 l Mobilní fáze: fáze A: 0,15% roztok kyseliny fosforečné ve vodě fáze B: 0,15% roztok kyseliny fosforečné v methanolu Eluční profil: 0 – 5 minuta – gradientová eluce (fáze A ze 100% na 50%, fáze B z 0% na 50% 5 – 25 minuta – isokratická eluce (fáze A 50%, fáze B 50%) Standardy: taxifolin, silybin A, silybin B, isosilybin A, isosilybin B, silychristin, silydianin 47

Průtok: 1,4 ml/minutu Detekce: diodový detektor DAD, vlnová délka 200-550 nm Výsledky jsou průměrem 3 stanovení.

4.5 Kalibrační křivky

4.5.1

Zhotovení kalibrační křivky

Standardy byly naředěny 80% methanolem na koncentrace:

taxifolin:

1,27 mg/100ml 2,55 mg/100ml 5,10 mg/100ml 10,20 mg/100ml

silychristin: 6,03 mg/100ml 12,05 mg/100ml 24,10 mg/100ml 48,20 mg/100ml

silydianin: 0,75 mg/100ml 1,50 mg/100ml 3 mg/100ml 6 mg/100ml

silybin A: 5,82 mg/100ml 11,63 mg/100ml 23,25 mg/100ml 46,50 mg/100ml

silybin B: 7,31 mg/100ml 14,62 mg/100ml 48

29,23 mg/100ml 58,46 mg/100ml

isosilybin A: 1,74 mg/100ml 3,48 mg/100ml 6,95 mg/100ml 13,90 mg/100ml

isosylibin B: 0,50 mg/100ml 1,08 mg/100ml 2,15 mg/100ml 4,30 mg/100ml Kalibrační křivky byly zhotoveny dle rovnice: y = bx + a y – plocha x – koncentrace v mg/g a–0 b – jiná hodnota pro každý flavonolignan

49

4.5.2

Kalibrační křivky jednotlivých flavonolignanů

Obr. č. 5: Kalibrační křivka taxifolinu regresivní koeficient = 0,9999 a=0 b = 3,26361

Obr. č. 6: Kalibrační křivka silychristinu regresivní koeficient = 0,9999 a=0 b = 3,26964

50

Obr. č. 7: Kalibrační křivka silydianinu regresivní koeficient = 0,9999 a=0 b = 3,28186

Obr. č. 8: Kalibrační křivka silybinu A regresivní koeficient = 0,9999 a=0 b = 3,26609

51

Obr. č. 9: Kalibrační křivka silybinu B regresivní koeficient = 0,9999 a=0 b = 3,26957

Obr. č. 10: Kalibrační křivka isosilybinu A regresivní koeficient = 0,9999 a=0 b = 3,27665

52

Obr. č. 11: Kalibrační křivka isosilybinu B regresivní koeficient = 0,9992 a=0 b = 3,28158

53

4.6 Výpočet obsahu flavonolignanů Výpočet obsahu jednotlivých flavonolignanů provádí software spojený s HPLC. Tento software stanovil obsah plochy pod křivkou (píku) a vyhodnocení provedl podle kalibrační křivky (předem naměřené plochy pod křivkou standardů). Vzorec pro výpočet flavonolignanů ze vzorku:

C = (AUC/AUCst) x Cst C – koncentrace vzorku Cst – koncentrace standardu AUC – plocha pod píkem vzorku AUCst – plocha pod píkem standardu Při výpočtech se zohlednila navážka vzorku, výsledky jsou uvedeny v procentech.

54

4.7 Statistické vyhodnocení

4.7.1

Aritmetický průměr

Aritmetický průměr je průměrná hodnota, získaná z velkého počtu opakovaných měření. Je přibližně rovna skutečné hodnotě. Vypočítá se ze vzorce: (5)

1 x= n

n

x i 1

i

= aritmetický průměr n = velikost souboru xi = jednotlivé hodnoty

4.7.2

Směrodatná odchylka

Směrodatná odchylka nám udává míru rozptýlenosti jednotlivých hodnot kolem průměru. (34) Vypočítá se ze vzorce: (35)

s=

1 n 2 ( x  x )  i n i 1

s = směrodatná odchylka n = rozsah souboru xi = jednotlivé hodnoty x = aritmetický průměr 55

4.7.3

T-test

T-test slouží k ověření významnosti rozdílů mezi vybranými průměry. (34) Vypočítá se ze vzorce: (35)

x1  x2 T=

n1S12  n2 S 22

n1n2 (n1  n2  2) n1  n2

T = testovací kritérium 1

= aritmetický průměr kontrolního souboru

2

= aritmetický průměr pokusného souboru

n1 = počet členů kontrolního souboru n2 = počet členů pokusného souboru S1 = směrodatná odchylka kontrolního souboru S2 = směrodatná odchylka pokusného souboru Testovací kriterium náleží t rozdělení se stupněm volnosti (v), vypočítá se ze vzorce: v = n1 + n2 – 2 Vypočítaná hodnota testovacího kriteria (t) srovná s náležitou kritickou hodnotou t(v)p pro vypočítaný stupeň volnosti (v) a zvolenou hladinu významnosti (p). Pro tři následující stanovení obsahu platí, že počet členů souboru kontrolního a zkoumaného souboru je shodný n1 = n2 = 3 a počet stupňů volnosti v = 4. Kritická hodnota t(v)p pro p(0,05) = 2,78. (36)

56

obsah flavonolignanů (%) směrodatná odchylka doba kultivace suspenzní kultury po expozici ultrazvuku (hod) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0K 0,01 0 0 0 0 0 0 0,003 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 48 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 48K 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72 0 0,01 0 0 0 0 0 0 0,003 0 0 0 0 168 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

isosilybin B 0 0 0 0 0 0 0 0 0

silydianin

silychristin

taxifolin 5,7735 0 0 5,7735 0 0 5,7735 0 0 5,7735 0 0 0 0 0 0 5,7735 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0

silybin A

T - test

silybin B 0 0 0 0 0 0 0

isosilybin A 0 0 0 0 0 0 0

isosilybin B 0 0 0 0 0 0 0

5 Výsledky

5.1 Tabulky

Tabulka č. 1: Produkce obsahových látek suspenzní kulturou Silybum

marianum L. elicitované ultrazvukem po dobu 1 min

57

isosilybin A

silybin B

silybin A

silydianin

silychristin

taxifolin

isosilybin B

isosilybin A

silybin B

silybin A

silydianin

silychristin

obsah taxifolinu (%)

doba kultivace suspenzní kultury po expozici ultrazvuku (hod) 0 0K 6 12 24 48 48K 72 168 0 0 0 0 0 0 0 0 0

obsah taxifolinu (%)

isosilybin B

isosilybin A

0 0 0 0 0 0 0,04 0 0 0 0 0 0,01 0 0,02 0 0 0 0 0 0 0 0,02 0 0,01 0,01 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,01 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

isosilybin A

silybin A

silydianin

silychristin

taxifolin

0 0 0 0 0 0 0,003 0 0 0 0 0 0,003 0 0,003 0 0 0 0 0 0 0 0,003 0 0,003 0,003 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,003 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

silybin B

silibin B

silibin A

silydianin

silychristin

isosilybin B

0 0 0 0 0 0 0 0 0

T - test isosilybin A silybin B

silychristin

taxifolin

23,094 0 0 0 0 0 12,247 0 11,547 0 0 0 23,094 0 0 0 11,547 0 12,247 5,7735 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5,7735 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

silydianin

směrodatná odchylka

silybin A

obsah flavonolignanů (%)

isosilybin B

0 0 0 0 0 0 0

Tabulka č. 2: Produkce obsahových látek suspenzní kulturou Silybum

marianum L. elicitované ultrazvukem po dobu 2 min

58

obsah flavonolignanů (%) směrodatná odchylka doba kultivace suspenzní kultury po expozici ultrazvuku (hod) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0K 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 24 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 48 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 48K 0,03 0 0 0 0 0 0 0,003 0 0 0 0 0 72 0,02 0 0 0 0 0 0 0,003 0 0 0 0 0 168 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

isosilybin B

0 0 0 0 0 0 0

taxifolin

silydianin

silychristin

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 17,321 0 0 0 4,0825 0 0 17,321 0

0 0 0 0 0 0 0

silybin A

T - test

silybin B 0 0 0 0 0 0 0

isosilybin A 0 0 0 0 0 0 0

isosilybin B 0 0 0 0 0 0 0

Tabulka č. 3: Produkce obsahových látek suspenzní kulturou Silybum

marianum L. elicitované ultrazvukem po dobu 3 min

59

isosilybin A

silybin B

silybin A

silydianin

silychristin

taxifolin

isosilybin B

isosilybin A

silibin B

silibin A

silydianin

silychristin

obsah taxifolinu (%)

doba kultivace suspenzní kultury po expozici ultrazvuku (hod) 0 0K 6 12 24 48 48K 72 168

obsah taxifolinu (%) 0,02 0 0,01 0,02 0,01 0,01 0,01 0 0

silychristin 0 0 0 0 0 0 0 0 0

silydianin 0 0 0 0 0 0 0 0 0

silibin A 0 0 0 0 0 0 0 0 0

silibin B 0 0 0 0 0 0 0 0 0

isosilybin A 0 0 0 0 0 0 0 0 0

isosilybin B 0 0 0 0 0 0 0 0 0

taxifolin 0,003 0 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0 0

silychristin 0 0 0 0 0 0 0 0 0

silydianin 0 0 0 0 0 0 0 0 0

silybin A 0 0 0 0 0 0 0 0 0

silybin B 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

isosilybin A

isosilybin B 0 0 0 0 0 0 0 0 0

taxifolin 11,547 5,7735 11,547 5,7735 0 5,7735 5,7735

silychristin 0 0 0 0 0 0 0

T - test

0 0 0 0 0 0 0

silydianin

směrodatná odchylka

0 0 0 0 0 0 0

silybin A

obsah flavonolignanů (%)

silybin B 0 0 0 0 0 0 0

isosilybin A 0 0 0 0 0 0 0

isosilybin B 0 0 0 0 0 0 0

Tabulka č. 4: Produkce obsahových látek suspenzní kulturou Silybum

marianum L. elicitované ultrazvukem po dobu 4 min

60

doba kultivace suspenzní kultury po expozici ultrazvuku (hod) 0 0K 6 12 24 48 48K 72 168

obsah taxifolinu (%) 0,03 0,05 0,05 0,03 0,03 0,04 0,01 0,03 0

silychristin 0 0 0 0 0 0 0 0 0

silydianin 0 0 0 0 0 0 0 0 0

silibin A 0 0 0 0 0 0 0 0 0

silibin B 0 0 0 0 0 0 0 0 0

isosilybin A 0 0 0 0 0 0 0 0 0

isosilybin B 0 0 0 0 0 0 0 0 0

taxifolin 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003 0

silychrin 0 0 0 0 0 0 0 0 0

silydianin 0 0 0 0 0 0 0 0 0

silybin A 0 0 0 0 0 0 0 0 0

silybin B 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

isosilybin A

silychrin

taxifolin

isosilybin B 0 8,165 0 0 0 0 0 0 8,165 0 0 8,165 0 0 12,247 0 0 0 8,165 0 0 5,7735 0

T- test

0 0 0 0 0 0 0

silydianin

směrodatná odchylka

0 0 0 0 0 0 0

silybin A

obsah flavonolignanů (%)

silybin B 0 0 0 0 0 0 0

isosilybin A 0 0 0 0 0 0 0

isosilybin B 0 0 0 0 0 0 0

Tabulka č. 5: Produkce obsahových látek suspenzní kulturou Silybum

marianum L. elicitované ultrazvukem po dobu 5 min

61

Tabulka č. 6: Produkce obsahových látek suspenzní kulturou Silybum

1

2

3

4

5

0 0 0 0 0 0,02 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,02 0 0,03 0 0 0 0,08 0 0,02 0 0,06 0,12 0,01 0 0 0 0 0 0 0 0

silydianin

silybin B

silybin A

doba kultivace suspenzní kultury po elicitaci (hod) 0 0K 6 12 24 48 48K 72 168 0 0K 6 12 24 48 48K 72 168 0 0K 6 12 24 48 48 K 72 168 0 0K 6 12 24 48 48K 72 168 0 0K 6 12 24 48 48 K 72 168

silychristin

doba elicitace ultrazvukem (min)

taxifolin

marianum L. do média

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,02 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,13 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,06 0 0 0 0,18 0 0 0 0,04 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,02 0 0 0 0 0 0,05 0 0,01 0 0 0,01 0 0,01 0 0 0 0 0,09 0 0 0

62

5.2 Grafy

Graf č. 1: Produkce taxifolinu v suspenzní kultuře Silybum marianum L. elicitované ultrazvukem

Graf č. 2: Produkce silychristinu v suspenzní kultuře Silybum marianum L. elicitované ultrazvukem

63

Graf č. 3: Produkce silydianinu v suspenzní kultuře Silybum marianum L. elicitované ultrazvukem

Graf č. 4: Produkce silybinu B v suspenzní kultuře Silybum marianum L. elicitované ultrazvukem

64

6 Diskuze

Velké množství sekundárních metabolitů je využíváno v terapii. Bohužel někdy polní produkce rostlin, obsahující tyto sekundární metabolity není dostačující. Z tohoto důvodu se nalézají jiné metody získávání a zvyšování produkce sekundárních metabolitů. Jednou z těchto metod vhodnou k získávání sekundárních metabolitů je využití explantátových kultur in vitro. Tyto kultury lze vhodnou metodou elicitovat a tím zvyšovat produkci sekundárních metabolitů. Mnoho prací v dnešní době se proto zabývá výběrem vhodného elicitoru a ideální doby elicitace, která bude zvyšovat produkci sekundárních metabolitů v explantátových kulturách in vitro. V této diplomové práci byl zvolen ultrazvuk jako abiotický elicitor. Byl zjišťován vliv ultrazvuku na produkci sekundárních metabolitů v explantátové kultuře Silybum marianum L. in vitro v různé době působení (1, 2, 3, 4, a 5 min). Ke kultivaci suspenzní kultury Silybum marianum L. bylo použito kultivační médium Murashigeho a Skooga s obsahem  - NAO jako růstového regulátoru. Tato kultura byla kultivována za normální teploty 25oC a světelného režimu 16 hod světlo a 8 hod tma. Jednotlivé vzorky suspenzní kultury byly vystaveny ultrazvuku (intenzita 0,1W/cm3, frekvence 35 kHz) po dobu 1, 2, 3, 4 a 5 min. Vzorky vystavené ultrazvuku byly odebírány v 0, 6, 12, 24, 48, 72 a 168 hod po expozici. Vzorky, které nebyly vystaveny působení ultrazvuku, tj. kontrolní vzorky, byly odebrány v 0 a 48 hod. Kontrolní hodnota obsahu flavonolignanů a taxifolinu v odběru v 0 hod se vztahovala ke vzorkům odebraným v 0, 6, 12 a 24 hod po elicitaci ultrazvukem. Kontrolní hodnota množství flavonolignanů a taxifolinu v odběru ve 48 hod se vztahovala ke vzorkům odebraným ve 48, 72 a 168 hod po elicitaci.

65

Pro stanovení obsahu flavonolignanů (silybin A, silybin B, isosilybin A, isosilybin B, silychristin a silydianin) a flavonoidu taxifolinu ve vzorcích jak elicitovaných, tak i v kontrolních, byla použita vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC). Výsledné hodnoty obsahu flavonolignanů a taxifolinu byly vypočítány pomocí softwaru připojeného k HPLC. Tento software změřil obsah ploch pod křivkou (píkem) a vyhodnotil je podle předem změřených ploch pod křivkou u standardů. U výpočtů byla započítána navážka a ředění, výsledek je uveden v procentech. Z výsledků je patrné, že suspenzní kultura Silybum marianum L. vystavená elicitaci ultrazvukem začala produkovat flavonolignany silybin B (0,02 %) po 2 min elicitaci a odběru po 12 hod, silydianin (0,02 %) po 2 min elicitaci a odběru po 6 hod a silychristin (0,01 % při obou odběrech) po 1 min elicitaci, odběru po 72 hod a 2 min elicitaci a odběru po 24 hod (graf č. 2, 3, 4) (tab. č. 1, 2, 3, 4, 5). Působení ultrazvukem nemělo žádný vliv na produkci ostatních flavonolignanů (silybin A, isosilybin A, isosilybin B). Tyto flavonolignany suspenzní kultura neprodukovala (graf č. 2, 3, 4) (tab. č. 1, 2, 3, 4, 5) Elicitace ultrazvukem měla také pozitivní vliv na zvýšení produkce flavonoidu taxifolinu. Zde došlo k navýšení jeho obsahu po 2 min elicitaci, v odběru po 72 hod (0,01 %). K dalšímu navýšení produkce taxifolinu došlo po 4 min elicitaci a to v odběrech v 0 hod (0,02 %), 6 hod (0,01 %), 12 hod (0,02 %) a 24 hod (0,01%). Nejvyšší nárůst obsahu taxifolinu nastal po 5 min elicitaci a odběru v 48 hod (0,04 %) – 400 %, k dalšímu nárůstu došlo po elicitaci 5 min a odběru v 72 hod (0,03 %). Působení ultrazvuku na suspenzní kulturu Silybum marianum L. po dobu ostatních časů mělo na produkci taxifolinu negativní vliv. Kultura produkovala taxifolin ve stejné nebo nižší koncentraci, nebo neprodukovala taxifolin vůbec. (graf č. 1) (tab. č. 1, 2, 3, 4, 5) Bylo také sledováno uvolňování sekundárních metabolitů do živného média. 66

Taxifolin byl do živného média uvolňován po 1 min elicitaci a odběru po 48 hod (0,02 %), po 3 min elicitaci ultrazvukem v odběru po 168 hod (0,03 %) po elicitaci. Dále byl taxifolin uvolňován po 4 min elicitaci a to v odběru po 12 hod (0,08 %), 48 hod (0,02 %), 72 hod (0,06 %) a nejvíce byl uvolňován po 168 hod odběru (0,12 %). Taxifolin byl dále uvolňován po 5 min elicitaci a odběru v 0 hod (0,01 %). Taxifolin byl též uvolňován kontrolní kulturou (bez elicitace) po 48 hod odběru (0,02 %). (Tab. č. 6) Silychristin byl do živného média uvolňován po 4 min elicitaci ultrazvukem a odběru po 12 hod (0,13 %) a 168 hod (0,06 %). Nejvíce byl silychristin uvolňován po 5 min elicitaci a odběru v 0 hod (0,18 %), dále byl zjištěn i v odběrech po 48 hod (0,05 %) a 168 hod (0,09 %) po elicitaci. Silychristin byl také do živného média uvolňován kontrolní kulturou (bez elicitace) po 48 hod (0,02 %) a v 0 hod (0,04 %). (Tab. č. 6) Silybin A byl uvolňován do živného média u kontrolní kultury (bez elicitace) po odběru po 48 hod (0,01 %). (Tab. č. 6) Silybin B byl do živného média uvolňován po 5 min elicitaci a odběru po 12 hod (0,02 %) a 48 hod (0,01 %). (Tab. č. 6) Silydianin byl uvolňován kontrolní kulturou po 48 hod odběru (0,01 %). (Tab. č. 6) Z výsledků diplomové práce vyplývá, že ultrazvuk je vhodný elicitor pro zvýšení produkce taxifolinu a pro produkci silybinu B, silydianinu a silychristinu

v suspenzní

kultuře

Silybum

marianum

L.

Elicitací

ultrazvukem na suspenzní kulturu in vitro bylo docíleno vyšší produkce obsahových látek oproti kontrole (kultura, která nebyla vystavena účinkům ultrazvuku. K podobnému závěru, že ultrazvuk je schopný zvyšovat produkci sekundárních metabolitů přišel Lin et all, který vystavoval suspenzní kulturu Panax ginseng ultrazvuku. Došlo ke zvýšení produkce sekundárních metabolitů a celkovému zvýšení obsahu saponinů a to o 75 %. (7, 32) Jiná studie zjišťovala vliv ultrazvuku na produkci sekundárních metabolitů v suspenzní kultuře Lithospermum erythrorhizon. Působení

67

ultrazvuku vedlo ke zvýšení aktivity enzymů, které se účastní biosyntézy sekundárních metabolitů, kterým byl shikonin. (32, 38) Ultrazvuk jako abiotický elicitor byl použit i v pokusech Mgr. Gabriely Friedlerové, která sledovala vliv ultrazvuku na suspenzní kulturu Genista tinctoria L., kde došlo ke zvýšení produkce genistinu a daidzeinu. (32) ¨ Při pokuse Jany Řimákové u suspenzní kultury Glycyrrhiza glabra L. se bohužel ultrazvuk jako vhodný elicitor neosvědčil. V kultuře nebyl pozorován žádný ze sledovaných sekundárních metabolitů – saponiny. (37) Jiná studie prokázala, že ultrazvuk jako abiotický elicitor o frekvenci 40 kHZ, po dobu 2, 3, 5 a 10 min., kys. salicylová a jejich kombinace mají vliv na zvýšení produkce fenolických látek a zvýšení biosyntézy taxolu v buněčné kultuře Corylus avellana L. (39) Další studie prokazuje, že ultrazvuk má vliv na zvýšení produkce biosyntézy kyseliny kávové a jejích derivátů v kořenové kultuře Echinacea purpurea L.. (40) Z tohoto vyplývá, že využití ultrazvuku jako abiotického elicitoru může mít jak pozitivní, tak i negativní vliv na produkci sekundárních metabolitů in vitro. Pro úspěšnou elicitaci je důležitý výběr vhodného elicitoru a výběr vhodné doby jeho působení a to pro každou kulturu. (1) Elicitace ultrazvukem u suspezní kultury Silybum marianum L. je výhodná

pro

zvýšení

produkce

sekundárních

metabolitů.

68

7 Závěr

Cílem této diplomové práce bylo seznámit se s technikou kultivace rostlinných kultur in vitro.

A následně zjistit vliv ultrazvuku (jako

abiotického elicitoru) na produkci flavonolignanů v suspenzní kultuře Silybum marianum L. Na základě stanovení obsahu flavonolignanů metodou HPLC zjistit, zda je ultrazvuk schopen ovlivnit produkci těchto obsahových látek. V elicitované

suspenzní

kultuře

se

podařilo

zvýšit

produkci

flavonolignanů silybinu B, silydianinu, silychristinu, které kontrolní kultura neprodukovala. Na ostatní flavonolignany

(silybin A, isosilybin A,

isosilybin B) neměla elicitace ultrazvukem vliv žádný. Dále byla zjištěna zvýšená produkce flavonoidu taxifolinu. Zvýšená produkce silybinu B v suspenzní kultuře Silybum marianum L. byla pozorována při 2 min elicitaci ultrazvukem v odběru po 12 hod. Nárůst obsahu silydianinu byl pozorován při 2 min elicitaci ultrazvukem v odběru po 6 hod. Silychristin produkovala suspenzní kultura při 1 min elicitaci ultrazvukem v odběru po 72 hod a při 2 min elicitaci v odběru po 24 hod. Zvýšená produkce taxifolinu byla zjištěna po 2 min elicitaci a odběru po 72 hod, dále po 4 min elicitaci ultrazvukem a odběru v 0, 6, 12 a 24 hod po elicitaci. Nejvyšší nárůst obsahu taxifolinu (0,04 %) byl zjištěn po 5 min elicitaci a odběru v 48 hod, další nárůst byl pozorován taktéž po 5 min elicitaci ultrazvukem a odběru po 72 hod (0,03%). Bylo také sledováno uvolňování sekundárních metabolitů do živného média. Taxifolin byl do živného média uvolňován po 1 min elicitaci a odběru po 48 hod, po 3 min elicitaci ultrazvukem po 168 hod po expozici. Dále byl taxifolin uvolňován po 4 min elicitaci a to v odběru po 12 hod, 48 hod, 72 69

hod a nejvíce byl uvolňován po 168 hod (0,12 %). Taxifolin byl dále uvolňován po 5 min elicitaci a odběru v 0 hod.Taxifolin byl též uvolňován kontrolní kulturou ve 48 hod. Silychristin byl do živného média uvolňován po 4 min elicitaci ultrazvukem a odběru po 12 hod a 168 hod. Nejvíce byl silychristin uvolňován po 5 min elicitaci a odběru v 0 hod (0,18 %), dále byl zjištěn i v odběrech po 48 hod a 168 hod po expozici. Silychristin byl také do živného média uvolňován kontrolní kulturou po 48 hod a v 0 hod. Silybin A byl uvolňován do živného média u kontrolní kultury po 48 hod odběru. Silybin B byl do živného média uvolňován po 5 min elicitaci a odběru po 12 hod a 48 hod. Silydianin byl uvolňován i kontrolní kulturou po 48 hod odběru. Z výsledků experimentu vyplývá, že u suspenzní kultury Silybum marianum L. je použití ultrazvuku jako abiotického elicitoru vhodné pro zvýšení produkce taxifolinu, silybinu B, silychristinu a silydianinu.

70

8 Použitá literatura 1) Kováč J., Explantátové kultury rostlin, Ústí nad Labem, Univerzita Jana Evangelisty Purkyně, Fakulta pedagogická, 1992, 1, 7-19, 23-24, 47-52, 5962, 82-83 2) Sikyta B., Dušek J., Biotechnologie pro farmaceuty, Praha, Karolinum, 2001, 17-24, 75, 79-81 3) Murashige T., Skoog F., Physiologiae plantarum, 1962, 15, 473 4) Vodrážka Z., Biotechnologie, Praha, Academica, 1992, 63-65, 68-69 5) Ďoubal S., Vybrané kapitoly z biofyziky, Praha, Karolinum, 2006, 148150 6) Klimeš J., Kontrola léčiv I., Praha, Karolinum, 2008, 26, 33 7) Lin LD., Wu JY., Ho KP., Qi SY., Ultrasound-induced physiological effects and secondary metabolite (Saponin) production in Panax ginseng cell cultures, Ultrasound in medicine and biology, 2001, 27/8, 1147-1152 8) Wu J., Lin L., Elicitor-like effects of low-energy ultrasound on plant (Panax ginseng) cells: induction of plant defense responses and secondary metabolite production, Applied microbiology and biotechnology, 2002, 59/1, 51-57 9) Wu JY., Lin LD., Ultrasound-induced stress responses of Panax ginseng cells: Enzymatic browning and phenolics production, Biotechnology progress, 2002, 18/ 4, 862-866 10) Sinisterra J. V., Application of ultrasound to biotechnology: an overview, Ultrasonics, 1992, 30/3, 180-185 11) Nam-Cheol K., Graf T. N., Sparacino Ch. M., Wani M. C., Wall M. E., Complete isolation and characterization of silybins and isosilybins from milk thistle (Silybum marianum ), Organic & biomolecular chemistry, 2003, 1/10, 1684-1689 12) Radjadian T., Rezazadeh SH., Huseini HF., Analysis of silymarin components in the seed extracts of some milk thistle ecotypes from iran by HPLC, Iranian journal of science and technology transaction a-science, 2008, 32/A2, 141-146

71

13) Kresánek J., Krejča J., Atlas liečivých rastlín a lesných plodov, Martin, Osveta, 1988, 66-67, 221-222 14) Korbelář J., Endris Z., Krejča J., Naše rostliny v lékařství, Praha, Avicenum, 1970, 296 15) http://en.wikipedia.org/wiki/Silybum_marianum, 22. 2. 2012 16) http://www.herbalpalace.com/bulk_herbs/Milk_Thistle.html, 22. 2. 2012 17) http://en.wikipedia.org/wiki/File:Illustration_Silybum_marianum0.jpg, 22. 2. 2012 18) http://www.mdidea.com/products/herbextract/silymarin/data01.html, 22. 2. 2012 19) http://botany.cz/cs/silybum-marianum/, 22. 2. 2012 20) Sharma D. K., Pharmacological properties of flavonoids including flavonolignans – Integration of petrocrops with drug development from plants, Journal of Scientific & Industrial Researche, 2006, 65, 477-484 21) Dewick P. M., Medicinal natural products, England, John Wiley & Sons Ltd, 2002, 151-154 22) http://www.topvet.cz/herbar/ostropestrec-mariansky, 10. 1. 2012 23) Davis-Searles P. R., Nakanishi Y., Kim Nam-Cheol, Graf T. N., Oberlies N. H., Wani M. C., Wall M. E., Agarwal R., and Kroll D. J., Milk Thistle and Prostate Cancer: Differential Effects of Pure Flavonolignans from Silybum marianum on Antiproliferative End Points in Human Prostate Carcinoma Cells, Cancer Research, 2005, 65/10, 4448-4457 24) http://www.fytokomplexy.cz/clanky/Flavonoidy.html, 22. 2. 2012 25) Hubík J., Dušek J., Řezáčová A., Štarhová A., Obecná farmakognosie II., Praha, SPN, 1986, 31-34 26) Minařík J., Farmakognosie, Praha, Avicenum, 1979, 140-141 27) Macholán L., Sekundární metabolity, Brno, Masarykova universita, 2003, 76-77 28) http://en.wikipedia.org/wiki/Flavonoid, 22. 2. 2012 29) Sikyta B., Dušek J., Biotechnologie pro farmaceuty, Praha, Karolinum, 1992, 9, 50-55, 84, 87-94 30) Procházka S., Macháčková I., Krekule J., Šebánek J., Fyziologie rostlin, Praha, Academia, 1998, 241-242, 424-425 72

31) Kováč J., Explantátové kultury rostlin, Olomouc, Vydavatelství univerzity Palackého, 1995, 1-3, 17-18, 23-25, 79-82 32) Fiedlerová G., Rigorózní práce, Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, 2010, 33, 61 33) Klimeš J., Sochor J., Mokrý M., Kastner P., Pilařová P., Kontrola léčiv II., Praha, Karolinum, 2007, 74, 79-80 34) http://lekarske.slovniky.cz, 15.3.2012 35) Ištok M., Bakalářská práce, Masarykova univerzita Brno, Fakulta sportovních studií, 2009, 21-22 36) Klemera P., Klemerová V., Základy aplikované farmacie, Praha, Karolinum, 1993, 25, 30, 31 37)

Řimáková

J.,

Disertační

práce,

Univerzita

Karlova

v Praze,

Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, 2005, 66-67, 106-107 38) Lin L., Wu J., Enhancement of shikonin production in single- and twophase suspension cultures of Lithospermum erythrorhizon cells using lowenergy ultrasound, Biotechnology and Bioengineering, 2001, 78/1, 1147 – 1152 39) Rezaei A., Ghanati F., Behmanesh M., Mokhtari-Dizaji M., Ultrasoundpotentiated salicylic acid-induced physiological effects and production of taxol in hazelnut (Corylus avelana L.) cell culture, Ultrasound in medicine and biology 2011, 37/11, 1938-1947 40) Rui Liu, Wei Li, Li-Yang Sun, Chun-Zhao Liu, Improving root growth and cichoric acid derivates production in hairy root culture of Echinacea purpurea L. by ultrasound treatment, Biochemical engineering journal 2012, 60, 62-66

73

9 ABSTRAKT Kultury léčivých rostlin in vitro XII. - Silybum marianum L. Byl sledován vliv ultrazvuku jako abiotického elicitoru na produkci flavonolignanů v suspenzní kultuře Silybum marianum L. Kultura byla kultivována v kultivačním médiu Murashigeho a Skooga s obsahem ( - MAO) jako růstového regulátoru při teplotě 25oC a světelném režimu 16 hod světlo a 8 hod tma. Elicitorem byl ultrazvuk o frekvenci 35 kHz a intenzitě 0,1Wcm-3 po dobu 1, 2, 3,4 a 5min. Vzorky byly odebírány v 0, 6, 12, 24, 48, 72 a 168 hod po expozici. Kontrolní vzorky byly odebrány v 0 a 48 hod. Obsah flavonolignanů byl stanoven pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). K nejvyššímu nárůstu obsahu taxifolinu došlo po 5 min. elicitaci a odběru po 48 hod (0,04%) – 400%, další nárůst byl pozorován po 5 min elicitaci a odběru po 72 hod. Nárůst silychristinu byl pozorován po 1 min elicitaci ultrazvukem a odběru po 72 hod, stejný nárůst byl pozorován po 2 min elicitaci a odběru po 24 hod. Nárůst obsahu silydianinu byl pozorován po 2 min elicitaci ultrazvukem a odběru po 6 hod a silybinu B po 2 min elicitaci a odběru po 12 hod po expozici. Bylo také sledováno uvolňování sekundárních metabolitů do živného média. Taxifolin byl nejvíce uvolňován po 4 min elicitaci kultury ultrazvukem a odběru po 168 hod (0,12 %). Silychristin byl nejvíce uvolňován do živného média po 5 min elicitaci a odběru v 0 hod (0,18 %). Silybin B byl uvolňován po 5 min elicitaci a odběru po 12 a 48 hod. Silybin A a silydianin byly uvolňovány kontrolními kulturami po 48 hod odběru. Elicitace suspenzní kultury Silybum marianum L. ultrazvukem neměla vliv na zvýšení produkce flavonolignanů silybinu A, isosilybinu A, isosilybinu B.

74

ABSTRACT In vitro cultures of medicinal plants - XII. - Silybum marianum L.

The effect of ultrasound (US) as abiotic elicitor on the flavonolignans production in Silybum marianum L suspension culture was investigated. The culture was cultivated in Murashige and Skoog nutritive medium with ( - NAO) (g/l) as growth regulator at 25oC and luminous period 16 h of light and 8 h of darkness. The elicitor - ultrasound by frequency 35kHz and intensity 0,1Wcm-3 for a period 1, 2, 3, 4 and 5 min has been used. The samples were taken in 0, 6, 12, 24, 48, 72 and 168 h after US exposition. The control samples were taken in 0 and 48 h. The quantity of flavonolignans was determined by High performance liquid chromatography (HPLC). The highest increase of taxifolin content was apparent after 5 min of US elicitation and 48 h sampling (0,04%) – 400%, other increase was apparent after 5 min of elicitation and 72 h sampling. The higher content of silychristin was found after 1 min of US elicitation and 72 h sampling, the same level was observed after 2 min of elicitation and 24 h sampling. The higher level of silydianin was detected after 2 min of US elicitation and 6 h sampling and the silybin B after 2 min of elicitation and 12 h sampling after exposition. Taxifolin and flavonolignans release to the nutrient medium was detected. The highest taxifolin release was apparent after 4 min of US elicitation and 168 h sampling (0.12 %). Silychristin highest release was apparent after 5 min of elicitation and 0 h sampling (0.18 %). Silybin B was released after 5 min of elicitation and 12 h and 48 h sampling. Silybin A and silydianin was released by controle culture after 48 h sampling. The ultrasound elicitation of Silybum marianum L. suspension culture didn´t have any effect on the increase of flavonolignans production as silybin A, isosilybin A, isosilybin B.

75